γ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法
【課題】食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供すること。
【解決手段】ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔ（γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ）単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定する。本発明において、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせる酵素としては、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔを挙げることができる。本発明のＧＡＢＡの簡易迅速測定方法は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡを、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能である。
【解決手段】ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔ（γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ）単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定する。本発明において、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせる酵素としては、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔを挙げることができる。本発明のＧＡＢＡの簡易迅速測定方法は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡを、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）量を、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素：ＧＡＢＡ−Ｔ）を用いて、簡易、迅速に、しかも正確に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡは哺乳類の中枢神経系における代表的な抑制系の神経伝達物質であり、生理作用として、血圧降下作用、精神安定作用、腎機能活性化作用などが知られており、最近注目されることが多い物質である。ＧＡＢＡは各種発酵生産物や穀物などに比較的多く含まれており、それらを原料として用いた各種食品が開発され、市販されている。
【０００３】
このＧＡＢＡを機能性成分として利用する際には、他の機能性成分同様その含有量を規格して当該機能を担保する必要があることもあり、各種分析方法により定量分析が行われている。分析法の代表的なものとしては、アミノ酸分析計を使用する方法やオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）で誘導体化を行なってから蛍光−ＨＰＬＣで分析する方法が知られている（特開２００４−４５１７４号公報）。これらの方法は、正確な定量分析が可能である一方、他のアミノ酸やペプチドとも反応し、ＧＡＢＡのみを特異的に測定することが難しいという問題があり、更に、高額で精密な機器を使用することから、食品原料或いは食品の製造現場で手軽に簡単に分析するためには不向きであるという問題がある。
【０００４】
最近この問題を解決すべく、食品中のＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、特異的にかつ簡便、迅速に測定する方法として、国際農林水産業研究センターにおいて、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡアミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ−Ｔ）とコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＳＳＡＤＨ）の混合酵素）の作用を利用して測定できるＧＡＢＡの簡易迅速定量法が開発されている。この方法は、試料にＧＡＢＡ−Ｔ、α−ケトグルタル酸及びＮＡＤＰ＋を加えて反応後、生成したＮＡＤＰＨの還元で、ＷＳＴ−８（赤色）を還元して生じる水溶性ホルマザン（黄色）の吸光度測定を行うことにより、食品中のＧＡＢＡを測定するものである。すなわち、この測定法は、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸のＧＡＢＡ−Ｔによる酵素反応によって生じるコハク酸セミアルデヒドを測定することにより、食品中のＧＡＢＡを特異的に定量するものである。
【０００５】
食品中のＧＡＢＡを測定するその他の方法として、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡ−Ｔ）の作用で生成するＮＡＤＰＨを検出する試みとして、固定化酵素を用いたフロースルー型蛍光検出器を用いたＧＡＢＡ含量を定量しようとする試み（Analytica Chimica Acta 546, 154−160, 2005）がある。しかしながら、これの分析において直接的あるいは間接的な分析対象となるＮＡＤＰＨは、生体内反応の多くの酸化還元酵素の補酵素であるため、試料中の夾雑酵素の影響を受ける可能性が高く、定量値に悪影響を与えることが危惧される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−４５１７４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Analytica Chimica Acta 546, 154-160, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸のＧＡＢＡ−Ｔ（γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ：γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素）による酵素反応を利用し、かかる酵素反応に用いる酵素としてＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用できる酵素を用いることにより、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）とα−ケトグルタル酸の酵素反応の結果生じたグルタミン酸を直接定量することによって、ＧＡＢＡ含量の簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能であることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。本発明において、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせる酵素としては、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたＧＡＢＡ−Ｔ（以下、「遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔ」という）を挙げることができる。
【００１１】
ＧＡＢＡを、α−ケトグルタル酸の存在下で、ＧＡＢＡ−Ｔによって酵素反応させて、グルタミン酸を生成する反応はよく知られている酵素反応であり、飲食品中に含有されるＧＡＢＡの定量に際して、かかる酵素反応によって生成されるグルタミン酸量を測定して、飲食品中に含有されるＧＡＢＡの定量を行うことが考えられる。しかしながら、微生物や植物のような天然物から調製される酵素は、ＧＡＢＡ特異的に反応させることが難しく、他の酵素反応によって生成されるグルタミン酸との区別をつけることが難しい。したがって、例えば、前記国際農林水産業研究センターの方法では、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸をＧＡＢＡ−Ｔによって反応させる酵素反応において、α−ケトグルタル酸から生成されるコハク酸セミアルデヒドを、セミアルデヒド脱水素酵素（ＳＳＡＤＨ）によって変換する還元反応を利用する方法により、ＧＡＢＡ及びα−ケトグルタル酸の反応にかかわったＧＡＢＡを測定し、飲食品中に含まれるＧＡＢＡを特異的に測定する方法が採られている。
【００１２】
しかしながら、上記のとおり、本発明において、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔのような、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用できる酵素を用いることにより、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸の酵素反応の結果生じたグルタミン酸を特異的に測定することができ、該グルタミン酸を直接定量することによって、試料中のＧＡＢＡ含量を簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能になる。
【００１３】
本発明においては、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことにより、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸の酵素反応の前に、試料中に含まれていたグルタミン酸量を測定値から消去することができる。本発明においては、ＧＡＢＡの定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定することができる。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のγ−アミノ酪酸量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（２）γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応させるために用いる酵素が、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼであることを特徴とする上記（１）記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（３）γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことを特徴とする上記（１）又は（２）記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（４）グルタミン酸の定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定するものであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法を用いたＧＡＢＡの定量の実施例において、ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００ｎｍの吸光度の相関について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−ＴのようなＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。
【００１８】
本発明のＧＡＢＡの簡易迅速測定方法が適用される試料（検体）としては、ＧＡＢＡを含む試料であればいずれでも良く、特に限定されない。例えば、発酵培養液、粉体、血清、血漿などの生体試料が挙げられる。本発明の酵素と試料は溶液状態で接触させることが好ましく、そのためには固体試料等では、予め水等の適当な溶媒によってＧＡＢＡを抽出しておくことが望ましい。その際、ＧＡＢＡが抽出されやすいように試料の粉砕、攪拌等を適宜実施すればよい。また、溶液調製の際に生じた沈殿物等の不純物は通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により除去しておくことが望ましい。さらに定量に影響を与えるマトリックス物質が存在する際には、吸着カラム、イオン交換カラム、限外ろ過によりあらかじめ除去しておくことが望ましい。
【００１９】
本発明の測定方法において、Ｌ−グルタミン酸を含む試料であれば、予めＬ−グルタミン酸量を定量し、試料から生成されたグルタミン酸量から差し引くことにより、ＧＡＢＡから生じたグルタミン酸量を正確に算出することができる。また、酵素未添加、酵素の加熱失活等により、ＧＡＢＡ−Ｔとの未反応液をＬ−グルタミン酸量を定量する方法のブランク液として用いることで当初から含まれていたグルタミン酸含量についての影響をなくすことも可能である。Ｌ−グルタミン酸量を定量する方法は酵素法、又は、ＨＰＬＣを用いる方法などが挙げられるが特に限定されないが、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法を、Ｌ−グルタミン酸量の好ましい定量方法として挙げることができる。
【００２０】
［ＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子の組換え］
本発明で使用するＧＡＢＡ−Ｔは、遺伝子組換によって調製された酵素が用いられる。ここで用いられるＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子は、特に限定されるものではなく、ＧＡＢＡ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を好適に用いることができる。遺伝子情報はＤＤＢＪ等の遺伝子データベースから入手することができる。また、任意の生物から該活性を有する遺伝子をクローニングしても良い。遺伝子源として、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae）、動物（ヒト）等を挙げることができる。ＧＡＢＡ−Ｔ活性を有していれば、アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでいてもよい（J. Bacteriol., 172(12), 7035-7042, 1990；Nucleic Acids Res., 18(10), 3049, 1990）。
【００２１】
本発明で使用するＧＡＢＡ−Ｔは、ＧＡＢＡ−Ｔ発現ベクターを生産する形質転換体によって生産される。形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、動物細胞等を挙げることができる。宿主の取り扱いや宿主の形質転換体を得る際に行う必要な操作については、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、或いはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。
【００２２】
本発明において、遺伝子組換によるＧＡＢＡ−Ｔ調製に用いる発現ベクターは、通常、宿主細胞内で転写可能なプロモーター、該プロモーターに結合したＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子、及び転写終結シグナルを構成要素として含む発現カセットを含む。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜発現制御配列を選択して用いればよい。
【００２３】
具体的には、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、Ｔ７ファージプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては薬剤耐性マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ジェネチシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子）、栄養要求性遺伝子相補マーカー（ｕｒａ３、Ｌｅｕ２）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）などが利用可能である。
【００２４】
培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主が大腸菌ＢＬ２１株であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより効率よく生産させることができる。
【００２５】
［ＧＡＢＡ−Ｔの生産］
上記形質転換体の培養物からＧＡＢＡ−Ｔを調製することができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は、培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
具体的には、培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。
【００２６】
本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
【００２７】
分離、精製した酵素溶液は、常法に従い、必要に応じてグリセロール、アルブミン等の安定剤を添加、あるいは無添加で、室温あるいは低温下で保存できる。凍結状態あるいは凍結乾燥状態でも保存できる。使用時には適宜、緩衝液などで所定の濃度に希釈、溶解して用いることができる。
【００２８】
［ＧＡＢＡ−Ｔの活性測定］
ＧＡＢＡ−Ｔの活性はＧＡＢＡを基質としてα−ケトグルタル酸の存在下において、グルタミン酸を生成させ、生成したグルタミン酸の定量値から求める。例えば、大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔの場合、ｐＨ７．５、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成させる活性を１Ｕと定義し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に、一定量のＧＡＢＡとαーケトグルタル酸を添加した上で、測定対象となる酵素溶液を添加して３０℃３０分間反応させ、反応液のグルタミン酸の定量値から活性を求める。
【００２９】
グルタミン酸の定量については、市販の酵素キット（ヤマサ社製ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット、ロッシュ社製Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸）が挙げられる。ヤマサＬ−グルタミン酸測定キットは、グルタミン酸をＬ−グルタミン酸オキシダーゼで反応した際に生じる過酸化水素を４−アミノアンチピリンとＤＡＯＳを基質とするパーオキシダーゼ反応で青色色素に導き、これを比色定量するものである。Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸は、グルタミン酸をＬ−グルタミン酸脱水素酵素で反応した際に生じるＮＡＤＨをＩＮＴを基質とするジアフォラーゼ反応で赤色色素に導き、これを比色定量するものである。
【００３０】
［ＧＡＢＡの定量］
本発明のＧＡＢＡの定量は、試料中のＧＡＢＡにＧＡＢＡ−Ｔをα−ケトグルタル酸の存在下において作用させ、生成されたグルタミン酸を定量することを特徴とする。より具体的には、（１）ＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応を行った後に、その反応液をグルタミン酸定量反応に供する方法、及び（２）ＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応とグルタミン酸定量反応を同時に進行させる方法が可能である。試料に本発明のＧＡＢＡ−Ｔを反応する場合の条件（酵素の添加量、反応時間・温度、ｐＨ条件等）は、基質に対して十分進行し、基質量に応じた活性が検出できれば良く、試料の状態、使用する酵素の種類に応じて適宜設定すればよい。反応に使用する緩衝液として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の、通常使用されるものを用いることができる。グルタミン酸の定量については、前述の通り、市販の酵素キット（ヤマサ社製ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット、ロッシュ社製Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸）が挙げられる。
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［ＧＡＢＡ−Ｔ発現プラスミドの構築］
大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔ発現プラスミドを構築した。大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔをコードする遺伝子配列は登録番号ＡＢ２００３２１の配列を参照した。大腸菌ＤＨ５α株（BioDynamics Laboratory）よりPrepMan Ultra Reagent（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡプライマー（GA-Nd5:5’-AAACATATGAGCAACAATGAATTCCATCAGCGTCG-3’（配列表の配列番号１）、GA-H3:5’-AACTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCTCAGCGCATCCTGCAAAATTTTCATTGC-3’（ 配列表の配列番号２））を用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃９０秒間の反応を３０サイクル行う条件にてＰＣＲ反応を行った。なお、ＧＡ−Ｎｄ５プライマーには５’端側にはＮｄｅＩ認識配列、ＧＡ−Ｈ３プライマーにはＣ末端側のＨｉｓタグをコードする配列を有し、３’端側にはＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００３３】
アガロースゲル電気泳動後、ＰＣＲで増幅されたＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をillustra GFX PCR Purification Kit（ＧＥヘルスケア）で単離した。単離したＤＮＡ断片はＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いてｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。組み換えプラスミドＤＮＡはQIAprep Spin Miniprep Kit（QUIAGEN社）を用いて調製した。BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＤＮＡシーケンシング反応を行ない、正しい配列を有するクローン（ｐＣＲ−ＧＡＢＡＴＨ）を取得した。ｐＣＲ−ＧＡＢＡＴＨから１．２ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を切り出し、ｐＥＴ２２ｂ（タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ間に導入し、発現プラスミドｐＥＴ−ＧＡＢＡＴＨを構築した。
【００３４】
［ＧＡＢＡ−Ｔの生産と精製］
ｐＥＴ−ＧＡＢＡＴＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社）に形質転換した。得られた菌株をアンピシリン、Overnight Express Autoinduction System1（Novagen）を含むＬＢ培地２００ｍｌで３７℃１６時間培養した。遠心分離で菌体を集菌し、菌体からＢ−ＰＥＲ ６×His Fusion protein Purification Kit（Thermo SCENTIFIC社）を用いて、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するＧＡＢＡ−Ｔを含む画分を調製した。ＧＡＢＡ−Ｔ活性の確認のために、酵素溶液０．０１ｍｌを含む０．１ｍｌの系で１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００３５】
［ＧＡＢＡの定量（１）］
ＧＡＢＡ−Ｔの活性の定義はＧＡＢＡを基質として、ｐＨ７．５、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成させる酵素活性を１Ｕとする。０．１ｍｌの系で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、０〜２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡ、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、図１（ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００の相関図）に示す。図１に示されるようにＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００には高い相関が見られた。
【００３６】
２種類の純度のＧＡＢＡ粉体試料の純度を測定した。試料を水に溶解し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、６２．５ｐｐｍ試料、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。
【００３７】
反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。標準化合物を用いた上記検量線にて試料中のＧＡＢＡ量を定量し、純度を算出した。ＨＰＬＣ分析法と本発明での分析結果を以下に示す。本手法でＨＰＬＣ分析と同等の分析が可能であることが示された。
＜試料Ａ＞：ＨＰＬＣ：９７．７重量％；本発明方法：９９．３±４．２重量％
＜試料Ｂ＞：ＨＰＬＣ：８７．５重量％；本発明方法：８９．５±２．４重量％
【００３８】
［ＧＡＢＡの定量（２）］
０．１ｍｌの系で１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、０〜２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡ、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液に１ｍｌのヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液を混合し、３０℃３０分間反応させた。６００ｎｍの吸光度を測定した結果、本方法でも前記の方法同様、ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００には高い相関が見られた。この結果からＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応とグルタミン酸定量反応を同時に進行させる方法が可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）量を、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素：ＧＡＢＡ−Ｔ）を用いて、簡易、迅速に、しかも正確に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡは哺乳類の中枢神経系における代表的な抑制系の神経伝達物質であり、生理作用として、血圧降下作用、精神安定作用、腎機能活性化作用などが知られており、最近注目されることが多い物質である。ＧＡＢＡは各種発酵生産物や穀物などに比較的多く含まれており、それらを原料として用いた各種食品が開発され、市販されている。
【０００３】
このＧＡＢＡを機能性成分として利用する際には、他の機能性成分同様その含有量を規格して当該機能を担保する必要があることもあり、各種分析方法により定量分析が行われている。分析法の代表的なものとしては、アミノ酸分析計を使用する方法やオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）で誘導体化を行なってから蛍光−ＨＰＬＣで分析する方法が知られている（特開２００４−４５１７４号公報）。これらの方法は、正確な定量分析が可能である一方、他のアミノ酸やペプチドとも反応し、ＧＡＢＡのみを特異的に測定することが難しいという問題があり、更に、高額で精密な機器を使用することから、食品原料或いは食品の製造現場で手軽に簡単に分析するためには不向きであるという問題がある。
【０００４】
最近この問題を解決すべく、食品中のＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、特異的にかつ簡便、迅速に測定する方法として、国際農林水産業研究センターにおいて、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡアミノ基転移酵素（ＧＡＢＡ−Ｔ）とコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＳＳＡＤＨ）の混合酵素）の作用を利用して測定できるＧＡＢＡの簡易迅速定量法が開発されている。この方法は、試料にＧＡＢＡ−Ｔ、α−ケトグルタル酸及びＮＡＤＰ＋を加えて反応後、生成したＮＡＤＰＨの還元で、ＷＳＴ−８（赤色）を還元して生じる水溶性ホルマザン（黄色）の吸光度測定を行うことにより、食品中のＧＡＢＡを測定するものである。すなわち、この測定法は、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸のＧＡＢＡ−Ｔによる酵素反応によって生じるコハク酸セミアルデヒドを測定することにより、食品中のＧＡＢＡを特異的に定量するものである。
【０００５】
食品中のＧＡＢＡを測定するその他の方法として、ＧＡＢａｓｅ（ＧＡＢＡ−Ｔ）の作用で生成するＮＡＤＰＨを検出する試みとして、固定化酵素を用いたフロースルー型蛍光検出器を用いたＧＡＢＡ含量を定量しようとする試み（Analytica Chimica Acta 546, 154−160, 2005）がある。しかしながら、これの分析において直接的あるいは間接的な分析対象となるＮＡＤＰＨは、生体内反応の多くの酸化還元酵素の補酵素であるため、試料中の夾雑酵素の影響を受ける可能性が高く、定量値に悪影響を与えることが危惧される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−４５１７４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Analytica Chimica Acta 546, 154-160, 2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸のＧＡＢＡ−Ｔ（γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ：γ−アミノ酪酸アミノ基転移酵素）による酵素反応を利用し、かかる酵素反応に用いる酵素としてＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用できる酵素を用いることにより、ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）とα−ケトグルタル酸の酵素反応の結果生じたグルタミン酸を直接定量することによって、ＧＡＢＡ含量の簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能であることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。本発明において、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせる酵素としては、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたＧＡＢＡ−Ｔ（以下、「遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔ」という）を挙げることができる。
【００１１】
ＧＡＢＡを、α−ケトグルタル酸の存在下で、ＧＡＢＡ−Ｔによって酵素反応させて、グルタミン酸を生成する反応はよく知られている酵素反応であり、飲食品中に含有されるＧＡＢＡの定量に際して、かかる酵素反応によって生成されるグルタミン酸量を測定して、飲食品中に含有されるＧＡＢＡの定量を行うことが考えられる。しかしながら、微生物や植物のような天然物から調製される酵素は、ＧＡＢＡ特異的に反応させることが難しく、他の酵素反応によって生成されるグルタミン酸との区別をつけることが難しい。したがって、例えば、前記国際農林水産業研究センターの方法では、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸をＧＡＢＡ−Ｔによって反応させる酵素反応において、α−ケトグルタル酸から生成されるコハク酸セミアルデヒドを、セミアルデヒド脱水素酵素（ＳＳＡＤＨ）によって変換する還元反応を利用する方法により、ＧＡＢＡ及びα−ケトグルタル酸の反応にかかわったＧＡＢＡを測定し、飲食品中に含まれるＧＡＢＡを特異的に測定する方法が採られている。
【００１２】
しかしながら、上記のとおり、本発明において、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−Ｔのような、ＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素として作用できる酵素を用いることにより、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸の酵素反応の結果生じたグルタミン酸を特異的に測定することができ、該グルタミン酸を直接定量することによって、試料中のＧＡＢＡ含量を簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能になる。
【００１３】
本発明においては、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、ＧＡＢＡ−Ｔと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことにより、ＧＡＢＡとα−ケトグルタル酸の酵素反応の前に、試料中に含まれていたグルタミン酸量を測定値から消去することができる。本発明においては、ＧＡＢＡの定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定することができる。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のγ−アミノ酪酸量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（２）γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応させるために用いる酵素が、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼであることを特徴とする上記（１）記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（３）γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことを特徴とする上記（１）又は（２）記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法や、（４）グルタミン酸の定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定するものであることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法を用いたＧＡＢＡの定量の実施例において、ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００ｎｍの吸光度の相関について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ＧＡＢＡ含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、遺伝子組換によって調製されたＧＡＢＡ−ＴのようなＧＡＢＡ−Ｔ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、ＧＡＢＡ特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のＧＡＢＡ含有量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法からなる。
【００１８】
本発明のＧＡＢＡの簡易迅速測定方法が適用される試料（検体）としては、ＧＡＢＡを含む試料であればいずれでも良く、特に限定されない。例えば、発酵培養液、粉体、血清、血漿などの生体試料が挙げられる。本発明の酵素と試料は溶液状態で接触させることが好ましく、そのためには固体試料等では、予め水等の適当な溶媒によってＧＡＢＡを抽出しておくことが望ましい。その際、ＧＡＢＡが抽出されやすいように試料の粉砕、攪拌等を適宜実施すればよい。また、溶液調製の際に生じた沈殿物等の不純物は通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により除去しておくことが望ましい。さらに定量に影響を与えるマトリックス物質が存在する際には、吸着カラム、イオン交換カラム、限外ろ過によりあらかじめ除去しておくことが望ましい。
【００１９】
本発明の測定方法において、Ｌ−グルタミン酸を含む試料であれば、予めＬ−グルタミン酸量を定量し、試料から生成されたグルタミン酸量から差し引くことにより、ＧＡＢＡから生じたグルタミン酸量を正確に算出することができる。また、酵素未添加、酵素の加熱失活等により、ＧＡＢＡ−Ｔとの未反応液をＬ−グルタミン酸量を定量する方法のブランク液として用いることで当初から含まれていたグルタミン酸含量についての影響をなくすことも可能である。Ｌ−グルタミン酸量を定量する方法は酵素法、又は、ＨＰＬＣを用いる方法などが挙げられるが特に限定されないが、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法を、Ｌ−グルタミン酸量の好ましい定量方法として挙げることができる。
【００２０】
［ＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子の組換え］
本発明で使用するＧＡＢＡ−Ｔは、遺伝子組換によって調製された酵素が用いられる。ここで用いられるＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子は、特に限定されるものではなく、ＧＡＢＡ−Ｔ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を好適に用いることができる。遺伝子情報はＤＤＢＪ等の遺伝子データベースから入手することができる。また、任意の生物から該活性を有する遺伝子をクローニングしても良い。遺伝子源として、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae）、動物（ヒト）等を挙げることができる。ＧＡＢＡ−Ｔ活性を有していれば、アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を含んでいてもよい（J. Bacteriol., 172(12), 7035-7042, 1990；Nucleic Acids Res., 18(10), 3049, 1990）。
【００２１】
本発明で使用するＧＡＢＡ−Ｔは、ＧＡＢＡ−Ｔ発現ベクターを生産する形質転換体によって生産される。形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、動物細胞等を挙げることができる。宿主の取り扱いや宿主の形質転換体を得る際に行う必要な操作については、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、或いはそれを修飾したり、改変した方法を用いることができる。
【００２２】
本発明において、遺伝子組換によるＧＡＢＡ−Ｔ調製に用いる発現ベクターは、通常、宿主細胞内で転写可能なプロモーター、該プロモーターに結合したＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子、及び転写終結シグナルを構成要素として含む発現カセットを含む。発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜発現制御配列を選択して用いればよい。
【００２３】
具体的には、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、Ｔ７ファージプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては薬剤耐性マーカー（アンピシリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ジェネチシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子）、栄養要求性遺伝子相補マーカー（ｕｒａ３、Ｌｅｕ２）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）などが利用可能である。
【００２４】
培地及び培養方法は、宿主の種類と組み換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選べばよい。例えば、宿主が大腸菌ＢＬ２１株であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより効率よく生産させることができる。
【００２５】
［ＧＡＢＡ−Ｔの生産］
上記形質転換体の培養物からＧＡＢＡ−Ｔを調製することができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体若しくは培養細胞、又は、培養菌体若しくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明のタンパク質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
具体的には、培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明のタンパク質の粗抽出液を得ることができる。
【００２６】
本発明のタンパク質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明のタンパク質を含む培養上清を得ることができる。このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。
【００２７】
分離、精製した酵素溶液は、常法に従い、必要に応じてグリセロール、アルブミン等の安定剤を添加、あるいは無添加で、室温あるいは低温下で保存できる。凍結状態あるいは凍結乾燥状態でも保存できる。使用時には適宜、緩衝液などで所定の濃度に希釈、溶解して用いることができる。
【００２８】
［ＧＡＢＡ−Ｔの活性測定］
ＧＡＢＡ−Ｔの活性はＧＡＢＡを基質としてα−ケトグルタル酸の存在下において、グルタミン酸を生成させ、生成したグルタミン酸の定量値から求める。例えば、大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔの場合、ｐＨ７．５、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成させる活性を１Ｕと定義し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に、一定量のＧＡＢＡとαーケトグルタル酸を添加した上で、測定対象となる酵素溶液を添加して３０℃３０分間反応させ、反応液のグルタミン酸の定量値から活性を求める。
【００２９】
グルタミン酸の定量については、市販の酵素キット（ヤマサ社製ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット、ロッシュ社製Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸）が挙げられる。ヤマサＬ−グルタミン酸測定キットは、グルタミン酸をＬ−グルタミン酸オキシダーゼで反応した際に生じる過酸化水素を４−アミノアンチピリンとＤＡＯＳを基質とするパーオキシダーゼ反応で青色色素に導き、これを比色定量するものである。Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸は、グルタミン酸をＬ−グルタミン酸脱水素酵素で反応した際に生じるＮＡＤＨをＩＮＴを基質とするジアフォラーゼ反応で赤色色素に導き、これを比色定量するものである。
【００３０】
［ＧＡＢＡの定量］
本発明のＧＡＢＡの定量は、試料中のＧＡＢＡにＧＡＢＡ−Ｔをα−ケトグルタル酸の存在下において作用させ、生成されたグルタミン酸を定量することを特徴とする。より具体的には、（１）ＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応を行った後に、その反応液をグルタミン酸定量反応に供する方法、及び（２）ＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応とグルタミン酸定量反応を同時に進行させる方法が可能である。試料に本発明のＧＡＢＡ−Ｔを反応する場合の条件（酵素の添加量、反応時間・温度、ｐＨ条件等）は、基質に対して十分進行し、基質量に応じた活性が検出できれば良く、試料の状態、使用する酵素の種類に応じて適宜設定すればよい。反応に使用する緩衝液として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の、通常使用されるものを用いることができる。グルタミン酸の定量については、前述の通り、市販の酵素キット（ヤマサ社製ヤマサＬ−グルタミン酸測定キット、ロッシュ社製Ｆ−キット・Ｌ−グルタミン酸）が挙げられる。
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［ＧＡＢＡ−Ｔ発現プラスミドの構築］
大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔ発現プラスミドを構築した。大腸菌ＧＡＢＡ−Ｔをコードする遺伝子配列は登録番号ＡＢ２００３２１の配列を参照した。大腸菌ＤＨ５α株（BioDynamics Laboratory）よりPrepMan Ultra Reagent（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、ゲノムＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡプライマー（GA-Nd5:5’-AAACATATGAGCAACAATGAATTCCATCAGCGTCG-3’（配列表の配列番号１）、GA-H3:5’-AACTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCTCAGCGCATCCTGCAAAATTTTCATTGC-3’（ 配列表の配列番号２））を用いて、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃９０秒間の反応を３０サイクル行う条件にてＰＣＲ反応を行った。なお、ＧＡ−Ｎｄ５プライマーには５’端側にはＮｄｅＩ認識配列、ＧＡ−Ｈ３プライマーにはＣ末端側のＨｉｓタグをコードする配列を有し、３’端側にはＸｈｏＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００３３】
アガロースゲル電気泳動後、ＰＣＲで増幅されたＧＡＢＡ−Ｔ遺伝子を含む約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をillustra GFX PCR Purification Kit（ＧＥヘルスケア）で単離した。単離したＤＮＡ断片はＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いてｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。組み換えプラスミドＤＮＡはQIAprep Spin Miniprep Kit（QUIAGEN社）を用いて調製した。BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社）を用いてＤＮＡシーケンシング反応を行ない、正しい配列を有するクローン（ｐＣＲ−ＧＡＢＡＴＨ）を取得した。ｐＣＲ−ＧＡＢＡＴＨから１．２ｋｂのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ ＤＮＡ断片を切り出し、ｐＥＴ２２ｂ（タカラバイオ社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ間に導入し、発現プラスミドｐＥＴ−ＧＡＢＡＴＨを構築した。
【００３４】
［ＧＡＢＡ−Ｔの生産と精製］
ｐＥＴ−ＧＡＢＡＴＨを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（タカラバイオ社）に形質転換した。得られた菌株をアンピシリン、Overnight Express Autoinduction System1（Novagen）を含むＬＢ培地２００ｍｌで３７℃１６時間培養した。遠心分離で菌体を集菌し、菌体からＢ−ＰＥＲ ６×His Fusion protein Purification Kit（Thermo SCENTIFIC社）を用いて、Ｃ末端にＨｉｓタグを有するＧＡＢＡ−Ｔを含む画分を調製した。ＧＡＢＡ−Ｔ活性の確認のために、酵素溶液０．０１ｍｌを含む０．１ｍｌの系で１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。
【００３５】
［ＧＡＢＡの定量（１）］
ＧＡＢＡ−Ｔの活性の定義はＧＡＢＡを基質として、ｐＨ７．５、３０℃で１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸を生成させる酵素活性を１Ｕとする。０．１ｍｌの系で１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、０〜２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡ、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、図１（ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００の相関図）に示す。図１に示されるようにＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００には高い相関が見られた。
【００３６】
２種類の純度のＧＡＢＡ粉体試料の純度を測定した。試料を水に溶解し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、６２．５ｐｐｍ試料、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液で３０℃３０分間反応させた。
【００３７】
反応後、０．０５ｍｌをヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液０．５ｍｌと室温で２０分間反応させ、６００ｎｍの吸光度を測定した。標準化合物を用いた上記検量線にて試料中のＧＡＢＡ量を定量し、純度を算出した。ＨＰＬＣ分析法と本発明での分析結果を以下に示す。本手法でＨＰＬＣ分析と同等の分析が可能であることが示された。
＜試料Ａ＞：ＨＰＬＣ：９７．７重量％；本発明方法：９９．３±４．２重量％
＜試料Ｂ＞：ＨＰＬＣ：８７．５重量％；本発明方法：８９．５±２．４重量％
【００３８】
［ＧＡＢＡの定量（２）］
０．１ｍｌの系で１０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１０００ｐｐｍ α−ケトグルタル酸、０〜２５０ｐｐｍ ＧＡＢＡ、２Ｕ／ｍｌ ＧＡＢＡ−Ｔから構成される反応液に１ｍｌのヤマサＬ−グルタミン酸測定キット反応液を混合し、３０℃３０分間反応させた。６００ｎｍの吸光度を測定した結果、本方法でも前記の方法同様、ＧＡＢＡ濃度とＯＤ６００には高い相関が見られた。この結果からＧＡＢＡとＧＡＢＡ−Ｔの反応とグルタミン酸定量反応を同時に進行させる方法が可能であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、食品原料或いは食品中に含まれるＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）を、食品原料或いは食品の製造現場等においても簡易、迅速に、しかも正確に定量することが可能なＧＡＢＡの簡易迅速測定方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のγ−アミノ酪酸量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項２】
γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応させるために用いる酵素が、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項３】
γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことを特徴とする請求項１又は２記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項４】
グルタミン酸の定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定するものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項１】
γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応をさせ、生成するグルタミン酸を測定することにより、試料中のγ−アミノ酪酸量を測定することを特徴とするγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項２】
γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ単一の酵素活性を有する酵素を作用させて、γ−アミノ酪酸特異的に酵素反応させるために用いる酵素が、遺伝子組換によってγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ遺伝子を発現することによって調製されたγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項３】
γ−アミノ酪酸含有試料を、α−ケトグルタル酸の存在下、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼと作用させるに先だって、予め、試料中に含まれるグルタミン酸を測定し、該グルタミン酸量を、酵素反応の後に測定されたグルタミン酸量から差し引くことを特徴とする請求項１又は２記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【請求項４】
グルタミン酸の定量を、グルタミン酸のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ反応を利用した比色定量法、又はグルタミン酸のＬ−グルタミン酸脱水素酵素反応を利用した比色定量法によって測定するものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のγ−アミノ酪酸の簡易迅速測定方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１１−１３０６８８（Ｐ２０１１−１３０６８８Ａ）
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２９１４６２（Ｐ２００９−２９１４６２）
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年７月７日（２０１１．７．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２２日（２００９．１２．２２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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