がん細胞の検出方法及び装置
【課題】精度が良く信頼性の高い、がん細胞の判定方法を提供する。
【解決手段】リンパ節組織等の生体試料を緩衝液で処理し、組織中のＲＮＡとペプチドを液中に移行させた後、サイトケラチン等の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法。
【解決手段】リンパ節組織等の生体試料を緩衝液で処理し、組織中のＲＮＡとペプチドを液中に移行させた後、サイトケラチン等の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料に含まれるがん細胞を検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体から採取した試料（生体試料）中のがん細胞を検出するために、生体試料中の腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定することが行われている。腫瘍マーカー遺伝子の発現量が正常細胞の発現量よりも大きい（又は小さい）場合は、前記生体試料中にがん細胞が含まれていることが疑われる。
【０００３】
上記のようにして生体試料中のがん細胞を検出することにより、その生体試料におけるがんの発見やその生体試料へのがん転移の有無の判定を行うことができる。例えば特許文献１には、組織又は体液(body tissue or fluid)などの生体試料からＲＮＡ試料を抽出・精製し、このＲＮＡ試料にがん関連配列（腫瘍マーカー遺伝子のｍＲＮＡ）が含まれているか否かを判定することによってがんの転移を判定する方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】米国特許５７６６８８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記のような従来のｍＲＮＡ発現量に基づくがん細胞の検出方法よりも精度が良く信頼性の高い検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段および発明の効果】
【０００６】
本発明は、生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法を提供する。
【０００７】
これにより、精度良く信頼性の高いがん細胞の検出方法を提供することができる。
【０００８】
上記検出方法において、前記生体試料がリンパ節組織であり、前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、前記生体試料から調製された検出用試料を用いて行われることが好ましい。
【０００９】
これにより、がん細胞がリンパ節に転移しているか否かを判定することができる。
【００１０】
上記検出方法において、前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、同じ検出用試料を用いて行われることが好ましい。
【００１１】
これにより、ｍＲＮＡの定量用試料とポリペプチドの定量用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便にがん細胞の検出を行うことができる。
【００１２】
また、本発明は、生体試料と緩衝液とを混合することにより調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出する工程、前記検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを検出する工程、及び前記ｍＲＮＡの検出結果及び前記ポリペプチドの検出結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法を提供する。
【００１３】
本明細書において、検出とは、検出用試料中に測定対象となる分子（ｍＲＮＡやポリペプチド）が含まれているか否かを定性的に判定すること、及びこの分子を定量することを含む。
【００１４】
これにより、ｍＲＮＡの測定用試料とポリペプチドの定量用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便にがん細胞の検出を行うことができる。
【００１５】
また、本発明は、核酸及びポリペプチドを検出するための検出用試料を調製する方法であって、ジメチルスルホキシド及び界面活性剤を含み、ｐＨが２．５〜５．０である緩衝液を用いて生体試料を処理することにより、前記生体試料に含まれる核酸及びポリペプチドを溶液中に移行させて検出用試料を調製することを特徴とする、検出用試料調製方法を提供する。
【００１６】
この方法を用いることにより、核酸及びポリペプチドを含む検出用試料を調製することができ、核酸の測定及びポリペプチドの測定を同一の検出用試料から行うことができる。従って、核酸の測定用試料とポリペプチドの測定用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便に核酸及びポリペプチドの測定を行うことができる。
【００１７】
また、本発明は、生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量手段、前記生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量手段、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する判定手段、を備えたがん細胞の検出装置を提供する。
【００１８】
これにより、高い信頼性で精度良くがん細胞を検出できる装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の一実施形態であるがん細胞の検出方法は、複数の細胞を含む生体試料中のがん細胞を検出する方法であり、
所定の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量工程、
この遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量工程、及び
ｍＲＮＡの定量結果とポリペプチドの定量結果とに基づいて生体試料中のがん細胞を検出する検出工程、を含む。
【００２０】
本明細書におけるがんとは、悪性化した腫瘍のことであり、悪性腫瘍と同義である。がんには、癌腫、肉腫、造血器由来のがんなどが含まれる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸部がん、子宮体部がんなどの上皮細胞由来のがんが例示される。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫などが例示される。造血器由来のがんとしては、白血病や悪性リンパ腫などが例示される。
【００２１】
生体試料としては、ヒト等の動物から採取された複数の細胞を含む試料であれば特に限定されない。例えば、尿や糞便等の排泄物、血液、生検や摘出手術等の外科的手法により採取した組織等が挙げられ、特に生検により採取された組織であることが好ましい。組織を用いて上記方法を実施した場合は、この組織ががん化しているか否か、他の組織に原発巣が認められる場合は原発巣からこの組織にがん細胞が転移しているか否か、等を判定することができる。この判定結果は、治療方針や組織郭清領域を決定する際の指標の１つとして用いることができる。例えば、乳がん患者から腫瘍の近傍のリンパ節組織を生検により採取し、上記方法によってがんのリンパ節転移の有無を判定することは、リンパ節を摘出すべきか、或いはどの程度郭清すべきか等を決定する一助となる。
【００２２】
第１定量工程においては、上記の生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡが定量される。腫瘍マーカー遺伝子とは、上述したようにがん細胞における発現量と正常細胞における発現量が有意に異なる遺伝子であり、用いる生体試料やがんの種類によって異なる。腫瘍マーカー遺伝子の例としては、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０などのＣＫ (サイトケラチン)、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＭＵＣ１、ＭＭＧ (マンマグロビン)、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Prostate specific antigen）、ＣＡ１５−３、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cellular adhesion molecule）等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２３】
ｍＲＮＡの定量に際しては、上記の生体試料から検出用試料を調製し、この検出用試料に含まれるｍＲＮＡを定量することが好ましい。例えば生体試料と緩衝液とを混合し、緩衝液中の細胞に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって細胞中のＲＮＡを液中に移行させ、このＲＮＡを含む溶液を検出用試料とすることができる。
【００２４】
ＲＮＡの分解を抑制するために緩衝液は強酸性であることが好ましい。ｐＨの好ましい範囲は２．５〜５．０であり、より好ましくは３．０〜４．０である。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝液を用いることができる。
【００２５】
また、緩衝液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の核酸が溶液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ６）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。緩衝液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００２６】
また、ｍＲＮＡの定量を後述の核酸増幅により行う場合は、緩衝液にさらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させることが好ましい。生体試料には、核酸増幅における酵素反応を阻害する物質（阻害物質）が含まれていることがあるが、ＤＭＳＯの作用によってこの阻害物質の影響を効果的に低減することができる。また、ＤＭＳＯには核酸増幅酵素の活性の低下を抑制する効果もある。緩衝液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００２７】
検出用試料調製の際には、生体試料に対してホモジナイズ等の物理的処理を施すことが好ましい。これにより、生体試料中の細胞の細胞膜や核膜が物理的に破砕され、細胞内の核酸が溶液中に移行しやすくなる。ホモジナイズは、ペッスルなどによって手動で行ってもよいし、市販の電動ホモジナイザを用いて行ってもよい。得られたホモジネートを数秒〜数分間遠心分離することによってホモジネート中に浮遊していた細胞の破片等を沈殿させることができる。これにより、ＲＮＡ等を含む上清を検出用試料とすることができる。
【００２８】
ｍＲＮＡの定量は、核酸増幅やＤＮＡチップ等を用いて公知の方法により行うことができる。核酸増幅法を用いる場合は、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含むＲＴＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）法やＲＴＬＡＭＰ(Reverse Transcription LAMP：LAMP法については米国特許６４１０２７８号公報参照)法などが好適に用いられる。特に、定量的核酸増幅法としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法やＴａｑＭａｎ（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）法（Linda G. Lee, 1993, Nucleic Acids Research, vol.21, p3761-3766等参照）などの公知の方法を用いることができる。
【００２９】
ｍＲＮＡの定量に用いることのできるＤＮＡチップとしては、上記の腫瘍マーカー遺伝子のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡのポリヌクレオチド及び／又はその断片を固定化した基盤を用いることができる。ＤＮＡチップを用いたＲＮＡの検出は、一般的に用いられる公知の方法により行うことができる。例えば、以下のようにして行うことができる。先ず、検出用試料中のｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列を利用して逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを上記のポリヌクレオチドを固定化した基盤と接触させると、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとが二本鎖を形成する。二本鎖を形成させた後、ｃＤＮＡの蛍光を測定することにより、ｍＲＮＡを定量することができる。
【００３０】
上述の方法によって測定されたｍＲＮＡの定量値は、単位体積当たりのｍＲＮＡの物質量、ｍＲＮＡ重量、コピー数などであってもよいし、反応液の蛍光強度や濁度が所定の値に達するまでの時間、サイクル数（ＰＣＲを用いた場合）などであってもよい。
【００３１】
第２定量工程においては、上述の腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドが定量される。ポリペプチドとしては、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されるタンパク質であってもよいし、その断片であってもよい。
【００３２】
ポリペプチドの定量に際しては、上記の生体試料から検出用試料を調製し、この検出用試料に含まれるポリペプチドを定量することが好ましい。この検出用試料は、ｍＲＮＡを定量する際に用いる検出用試料とは異なるポリペプチド検出用試料であっても良いが、好ましくは、ｍＲＮＡ定量の際に調製された検出用試料と同一ものが用いられる。これによって、ｍＲＮＡ定量用試料とポリペプチド定量用試料の２種類の試料を調製する手間を省くことができ、より簡便・短時間で試料調製を行うことができる。
【００３３】
従来は、ｍＲＮＡを定量する際は、ＲＮＡ抽出用キットなどを用いて生体試料に抽出・精製などの処理を繰り返すことにより、実質的にＲＮＡのみを含む試料を調製し、これを検出用試料としていた。この処理を行うと、生体試料中のポリペプチドや破砕された細胞の破片等は廃棄されるため、同一の生体試料からポリペプチドを定量するためには、ポリペプチド定量用の検出用試料を再び調製する必要があった。しかしながら、上記のｐＨであり上記の様な界面活性剤を含む緩衝液を用いて調製されたｍＲＮＡの検出用試料は、腫瘍マーカー遺伝子のポリペプチドを含んでいるため、同一の試料を用いてｍＲＮＡの定量及びポリペプチドの定量を行うことができる。
【００３４】
ポリペプチドの定量は、公知の方法により行うことができ、特に限定されない。例えば、プロテインチップ等を用いた解析法、ドットブロット法やウェスタンブロット法などのイムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、カウンティングイムノアッセイ法（ＣＩＡ: Sysmex Journal Vol.20 No.1, 77-86(1997)参照）などを用いることができる。これらのうち、ウェスタンブロット法を用いると、検出用試料に含まれるポリペプチドの種類を分子量に基づいて分離することができるため、より特異的に目的とするポリペプチドを定量することができる。
【００３５】
ポリペプチドの定量値は、予め作製された検量線に基づいて算出されることが好ましい。検量線は、既知量のタンパク質を含む試料を用いて検出用試料のポリペプチド測定と同様の条件で測定することにより作成することができる。
【００３６】
上記の様にして測定されたｍＲＮＡの定量結果及びポリペプチドの定量結果に基づいて生体試料中のがん細胞が検出される。この工程では生体試料にがん細胞が含まれるか否かが予測される。これら両方の定量結果の組み合わせに基づいてがん細胞を検出してもよいし、ｍＲＮＡ及びポリペプチドの一方の定量結果に基づいて先ず判定を行い、他方の定量結果を用いて前記判定の結果を確認してもよい。ｍＲＮＡ及びポリペプチドの両方の定量結果に基づいて得られる判定結果は、いずれか一方の定量結果のみを用いた判定結果よりも精度がよく、より信頼性も高い。
【００３７】
生体試料中のがん細胞は、ｍＲＮＡの定量値を対応する第１の閾値と比較した比較結果と、ポリペプチドの定量値を対応する第２の閾値と比較した比較結果とに基づいて検出してもよい。例えば、正常細胞よりもがん細胞において発現量が大きい腫瘍マーカー遺伝子の場合、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上であり、ポリペプチドの定量値が第２の閾値以上である場合は、生体試料中にがん細胞が含まれる、と予測することができる。また、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上であるか、又はポリペプチドの定量値が第２の閾値以上である場合に、生体試料中にがん細胞が含まれる、と予測してもよい。
【００３８】
第１の閾値及び第２の閾値は、がんや腫瘍マーカーの種類に応じて適宜設定される値である。これらの閾値は、がん細胞の存在が確認された生体試料(陽性検体)に含まれる腫瘍マーカー量以下であって、がん細胞が存在しないことが確認された生体試料(陰性検体)に含まれる腫瘍マーカー量よりも高い値に設定することができる。特に、複数の陽性検体の腫瘍マーカー量と複数の陰性検体の腫瘍マーカー量とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００３９】
また、上記の緩衝液で調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定性的に検出し、この検出用試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定性的に検出し、これらの検出結果に基づいて生体試料中のがん細胞を検出してもよい。この場合、例えば検出用試料中にｍＲＮＡが存在すると判定され、且つポリペプチドが存在すると判定された場合は、生体試料中にがん細胞が含まれていると判定される。
【００４０】
ｍＲＮＡの定性的検出方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、上述したＲＴＰＣＲやＲＴＬＡＭＰで核酸増幅を行った反応液を用いてアガロースゲル電気泳動等を行うことにより検出を行うことができる。また、ポリペプチドの定性的検出方法も特に限定されず、上述した公知のイムノアッセイ等を用いることができる。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、上述の方法を実施するためのがん細胞の検出装置である。以下、図面に基づき、この装置について説明する。
【００４２】
図１は、本発明の一実施形態によるがん細胞検出装置１の全体構成を示した斜視図である。この装置１は、核酸定量部１００と、タンパク質定量部１０１と、これらと有線又は無線による通信ができるように接続されたパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成される。パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を分析するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
【００４３】
以下、図２及び図３を用いて、装置１の核酸定量部１００について説明する。図２は、核酸定量部１００の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸定量部の概略平面図である。
【００４４】
核酸定量部１００は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００４５】
また、分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００４６】
また、図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００４７】
また、本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織を上述の処理（ホモジナイズ、ろ過など）を施して調製された可溶化抽出液（検出用試料）が収容された試料容器２２がセットされるとともに、正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００４８】
また、試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールが収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００４９】
また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、ＣＫ１９のｍＲＮＡ（以下、ＣＫ１９ｍＲＮＡともいう）に対応するｃＤＮＡ（以下、ＣＫ１９ｃＤＮＡともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能なプライマを含む試薬（以下、プライマ試薬とする）が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
【００５０】
また、反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図３参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００５１】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００５２】
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００５３】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００５４】
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による核酸定量部１００の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、手術によって切除された組織中のＣＫ１９ｍＲＮＡ（腫瘍マーカー）に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムの白濁による濁度の変化を測定することによりＣＫ１９ｍＲＮＡの量（コピー数／μＬ）を測定し、これを閾値と比較する。
【００５５】
まず、図２及び図３に示すように、予め切除組織を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された検出用試料（以下、試料ともいう）が収容された試料容器２２を試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする。また、陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ（図３参照）及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌに、それぞれ、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする。また、チップセット部３０に、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
【００５６】
核酸定量部１００の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動された後、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、プライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するように、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１によりプライマ試薬容器２７内のプライマ試薬が吸引される。
【００５７】
プライマ試薬の吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、プライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。
【００５８】
プライマ試薬の吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００５９】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
【００６０】
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりＣＫ１９ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
【００６１】
試料の濁度データは、核酸定量部１００からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、試料の濁度データから単位体積当たりのｍＲＮＡコピー数を算出し、これを予め決められた閾値と比較する。
【００６２】
次に、図４〜６に基づき、タンパク質定量部１０１について説明する。タンパク質定量部１０１では、核酸定量部１００で測定に供された試料に含まれるＣＫ１９タンパク質の量を測定することができる。
図４は、タンパク質定量部１０１の全体構成を示した斜視図であり、図５及び６は、タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【００６３】
タンパク質定量部１０１は、図４に示すように、分注部２１０と、試薬設置部２２０と、反応部２４０と、測定希釈分注部２５０と、試料受け部２６０と、光学検出部２７０と、未使用の反応プレート２０１を収容する反応プレートトレイ２８０と、洗浄部３００ａおよび３００ｂと、制御部３１０とを含んでいる。
【００６４】
分注部２１０は、図４に示すように、水平方向に直交するＸ２軸方向およびＹ２軸方向に移動可能な水平方向移動機構部（図示せず）と、水平方向移動機構部に対して垂直方向（Ｚ２軸方向）に移動可能な検体・ラテックスピペット部２１１と、プレートキャッチャ部２１２とを含んでいる。また、検体・ラテックスピペット部２１１は、試料を分注および吐出する機能を有している。また、検体・ラテックスピペット部２１１は、試薬ビン２０３内のラテックス試薬、緩衝液および検体希釈液を分注および吐出する機能も有している。また、プレートキャッチャ部２１２は、反応プレートトレイ２８０から未使用の反応プレート２０１を反応部２４０に搬送するとともに、使用済みの反応プレート２０１を反応プレート廃棄箱（図示せず）に搬送するために設けられている。なお、反応プレート２０１には、試料や各種試薬を収容可能な２５個のキュベット２０１ａが設けられている。
【００６５】
試薬設置部２２０は、緩衝液、ラテックス試薬および検体希釈液を収容した試薬ビン２０３を載置するために設けられている。この際、試薬ビン２０３内の試薬（緩衝液、ラテックス試薬、検体希釈液）は、所定の温度（１５℃以下）に保たれている。そして、試薬設置部２２０には、装置の奥側から順番に、緩衝液容器セット部２２１、ラテックス試薬容器セット部２２２および検体希釈液容器セット部２２３が設けられている。
【００６６】
反応部２４０は、２枚の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内に収容される試料と、各種試薬（緩衝液、抗ＣＫ１９抗体を感作したラテックス粒子を含むラテックス試薬、検体希釈液）とを反応させるために設けられている。具体的には、上記した分注部２１０により分注された試料および試料と各種試薬（緩衝液、ラテックス試薬、検体希釈液）とを攪拌して混合するとともに、その攪拌して混合された試料と各種試薬とを所定の温度に維持することにより、ラテックス試薬の凝集反応を促進させている。つまり、この反応部２４０では、図５に示すように、抗体が結合したラテックス試薬中のラテックス粒子が、試料中の抗原（ＣＫ１９タンパク質）を媒介として凝集する凝集反応が行われる。
【００６７】
試料中にＣＫ１９タンパク質が存在すると、図５右図のように、抗原抗体反応によりＣＫ１９タンパク質に抗ＣＫ１９抗体を感作したラテックス粒子が複数個結合し、粒子凝集が起こる。ＣＫ１９タンパク質の量が多いほど粒子は凝集するため、試料の凝集度を上記のＣＩＡにより測定することで、ＣＫ１９タンパク質が定量される。
【００６８】
測定希釈分注部２５０は、図４に示すように、分注部２１０の後方に配置されており、反応部２４０の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料を吸引および吐出する機能を有している。この測定希釈分注部２５０は、水平方向に直交するＸ２軸方向およびＹ２軸方向に移動可能な水平方向移動機構部（図示せず）と、水平方向移動機構部に対して垂直方向（Ｚ２軸方向）に移動可能な測定希釈ピペット部２５１とを含んでいる。そして、測定希釈分注部２５０は、吸引した反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料を、免疫凝集測定装置２００の下部に設置されたタンク（図示せず）に収容される測定希釈液とともに試料受け部２６０に吐出する。
【００６９】
試料受け部２６０は、上記した反応部２４０の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料および測定希釈液を受け入れるために設けられている。そして、試料受け部２６０に受け入れられた粒子懸濁液（調製試料および測定希釈液）は、後述する光学検出部２７０のシースフローセル２７４（図６参照）に導かれる。
【００７０】
光学検出部２７０は、図６に示すように、光源としてのレーザダイオード２７１と、コンデンサレンズ２７２およびコレクタレンズ２７３と、シースフローセル２７４と、受光素子としてのフォトダイオード２７５とから構成されている。シースフローセル２７４は、粒子懸濁液（調製試料および測定希釈液）の流れを、粒子懸濁液の両側を流れるシース液の流れで挟み込むことにより、扁平な流れに変換する機能を有している。そして、レーザダイオード２７１からシースフローセル２７４を流れる粒子懸濁液に照射された光は、粒子懸濁液中のラテックス粒子の凝集塊（図５参照）に散乱されて、フォトダイオード２７５により受光されるように構成されている。フォトダイオード２７５により受講された散乱光情報はパーソナルコンピュータ１０２に送信される。
【００７１】
反応プレートトレイ２８０は、最大４つの未使用の反応プレート２０１（図４参照）を収容することが可能である。そして、反応プレートトレイ２８０に収容される反応プレート２０１は、分注部２１０のプレートキャッチャ部２１２（図４参照）により反応部２４０に搬送される。また、反応プレート廃棄箱は、使用済みの反応プレート２０１を貯留することが可能であり、分注部２１０のプレートキャッチャにより反応部２４０から搬送される。
【００７２】
洗浄部３００ａは、分注部２１０の検体・ラテックスピペット部２１１を洗浄するために設けられている。また、洗浄部３００ｂは、測定希釈分注部２５０の測定希釈ピペット部２５１を洗浄するために設けられている。
【００７３】
パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、フォトダイオード２７５から送信された散乱光情報を取得し、これに基づいて試料中のＣＫ１９タンパク質の量を算出する。ＣＰＵ１０２ｄは算出されたＣＫ１９タンパク質定量値を予め設定された対応する閾値と比較する。
【００７４】
ＣＰＵ１０２ｄの処理フローについて、図７に基づき、説明する。上述のように、ＣＰＵ１０２ｄは核酸定量部１００から濁度データを受信し、タンパク質定量部１０１から散乱光情報を受信する（ステップＳ１）。濁度データを基にｍＲＮＡの発現量を算出し、散乱光情報を基にタンパク質の発現量を算出する（ステップＳ２）。次に、ＣＰＵ１０２ｄは、ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量値と予め設定された閾値との比較、及びＣＫ１９タンパク質定量値と予め設定された閾値との比較を行うことにより、試料中のがん細胞の存否を判定する（ステップＳ３）。ＣＰＵ１０２ｄは、判定結果をパーソナルコンピュータ１０２の表示部１０２ｃに出力し、表示させる。
【００７５】
なお、核酸定量部１００及びタンパク質定量部１０１は別々の装置（即ち、核酸定量装置及びタンパク質定量装置）であってもよい。
また、核酸定量部１００及びタンパク質定量部１０１は同一の試料を用いるため、この試料を各定量部に搬送する搬送装置を備えていてもよい。
【００７６】
＜実施例１＞
１．測定用試料の調製
乳がん患者から切除したリンパ節３１個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により２２個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、９個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）２２個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）９個を用いて、下記のようにして測定用試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ｐＨ３．４の緩衝液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）２００μＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清を５０〜２００μＬ採取してこれを検出用試料とした。
【００７７】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの検出用試料を核酸増幅装置（ＧＤ−１００、シスメックス製）にセットし、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によってＣＫ１９ｃＤＮＡを増幅させた（測定用試薬として、ＧＤ−１００には核酸増幅用試薬サイトケラチン試薬（シスメックス製）がセットされた）。反応液の濁度をリアルタイムに測定することによってＣＫ１９のｍＲＮＡ（コピー数）を定量した。
【００７８】
３．ＣＫ１９タンパク質の定量
ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量に用いた検出用試料２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Tris HCl(pH6.8)、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％ ブロモフェノールブルー、及び３０％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Tween20、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Tween20を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：Cytokeratin 19 (A53-B/A2):sc-6278（サンタクルズ社製、Lot:#L2403）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ECL anti-mouse IgG HRP linked F(ab')2 fragment（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ECL-Advance Western Blotting Detection Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。LumiAnalyst（ロシュ社製）で酵素反応後のメンブレン画像を取り込み、QuantityOne（バイオラッド社製）によってメンブレン画像の蛍光強度を算出した。上述のようにして測定された蛍光強度を、検量線にあてはめ、ＣＫ１９タンパク質の量を算出した。検量線は、上記と同じゲルで測定用試料を収容したウェルとは別のウェルに濃度既知のＣＫ１９タンパク質を含む試料を収容し、上述の蛍光強度測定を行うことにより作成された。
【００７９】
４．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図８に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図８に示されるように、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。従って、これらの定量結果を用いることにより、測定に供される生体試料が陰性検体であるか、陽性検体であるかを判定することが可能である。
【００８０】
また、ｍＲＮＡ定量値に対応する第１の閾値を５０００コピー／μＬとし、タンパク質定量値に対応する第２の閾値を０．５ｎｇ／μＬとすることも可能である。ｍＲＮＡ定量値及びタンパク質定量値をこれらの閾値と比較することによって、がん転移の有無を判定してもよい。
【００８１】
＜実施例２＞
１．測定用試料の調製
大腸がん患者から切除したリンパ節６３個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により３５個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、２８個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）３５個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）２８個を用いて、実施例１と同様に測定用試料を調製した。
【００８２】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００８３】
３．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図９に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図９に示されるように、大腸がんにおいても、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
【００８４】
＜実施例３＞
１．測定用試料の調製
胃がん患者から切除したリンパ節３０個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により２４個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、６個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）２４個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）６個を用いて、実施例１と同様に測定用試料を調製した。
【００８５】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００８６】
３．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図１０に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図１０に示されるように、胃がんにおいても、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
【００８７】
本実施例は、ｍＲＮＡ定量結果及びタンパク質定量結果に基づいた検出方法であるため、単独の方法による検出結果よりも精度がよく信頼性の高い検出結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の一実施形態によるがん細胞検出装置１の全体構成を示した斜視図である。
【図２】核酸定量部１００の全体構成を示した斜視図である。
【図３】図２の核酸定量部の概略平面図である。
【図４】タンパク質定量部１０１の全体構成を示した斜視図である。
【図５】タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【図６】タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【図７】ＣＰＵ１０２ｄによる処理フローである。
【図８】実施例１の結果を示すグラフである。
【図９】実施例２の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料に含まれるがん細胞を検出する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体から採取した試料（生体試料）中のがん細胞を検出するために、生体試料中の腫瘍マーカー遺伝子の発現量を測定することが行われている。腫瘍マーカー遺伝子の発現量が正常細胞の発現量よりも大きい（又は小さい）場合は、前記生体試料中にがん細胞が含まれていることが疑われる。
【０００３】
上記のようにして生体試料中のがん細胞を検出することにより、その生体試料におけるがんの発見やその生体試料へのがん転移の有無の判定を行うことができる。例えば特許文献１には、組織又は体液(body tissue or fluid)などの生体試料からＲＮＡ試料を抽出・精製し、このＲＮＡ試料にがん関連配列（腫瘍マーカー遺伝子のｍＲＮＡ）が含まれているか否かを判定することによってがんの転移を判定する方法が開示されている。
【０００４】
【特許文献１】米国特許５７６６８８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記のような従来のｍＲＮＡ発現量に基づくがん細胞の検出方法よりも精度が良く信頼性の高い検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段および発明の効果】
【０００６】
本発明は、生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法を提供する。
【０００７】
これにより、精度良く信頼性の高いがん細胞の検出方法を提供することができる。
【０００８】
上記検出方法において、前記生体試料がリンパ節組織であり、前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、前記生体試料から調製された検出用試料を用いて行われることが好ましい。
【０００９】
これにより、がん細胞がリンパ節に転移しているか否かを判定することができる。
【００１０】
上記検出方法において、前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、同じ検出用試料を用いて行われることが好ましい。
【００１１】
これにより、ｍＲＮＡの定量用試料とポリペプチドの定量用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便にがん細胞の検出を行うことができる。
【００１２】
また、本発明は、生体試料と緩衝液とを混合することにより調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出する工程、前記検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを検出する工程、及び前記ｍＲＮＡの検出結果及び前記ポリペプチドの検出結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、を含むがん細胞の検出方法を提供する。
【００１３】
本明細書において、検出とは、検出用試料中に測定対象となる分子（ｍＲＮＡやポリペプチド）が含まれているか否かを定性的に判定すること、及びこの分子を定量することを含む。
【００１４】
これにより、ｍＲＮＡの測定用試料とポリペプチドの定量用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便にがん細胞の検出を行うことができる。
【００１５】
また、本発明は、核酸及びポリペプチドを検出するための検出用試料を調製する方法であって、ジメチルスルホキシド及び界面活性剤を含み、ｐＨが２．５〜５．０である緩衝液を用いて生体試料を処理することにより、前記生体試料に含まれる核酸及びポリペプチドを溶液中に移行させて検出用試料を調製することを特徴とする、検出用試料調製方法を提供する。
【００１６】
この方法を用いることにより、核酸及びポリペプチドを含む検出用試料を調製することができ、核酸の測定及びポリペプチドの測定を同一の検出用試料から行うことができる。従って、核酸の測定用試料とポリペプチドの測定用試料とを別々に調製する必要がなく、より簡便に核酸及びポリペプチドの測定を行うことができる。
【００１７】
また、本発明は、生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量手段、前記生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量手段、及び前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する判定手段、を備えたがん細胞の検出装置を提供する。
【００１８】
これにより、高い信頼性で精度良くがん細胞を検出できる装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の一実施形態であるがん細胞の検出方法は、複数の細胞を含む生体試料中のがん細胞を検出する方法であり、
所定の腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量工程、
この遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量工程、及び
ｍＲＮＡの定量結果とポリペプチドの定量結果とに基づいて生体試料中のがん細胞を検出する検出工程、を含む。
【００２０】
本明細書におけるがんとは、悪性化した腫瘍のことであり、悪性腫瘍と同義である。がんには、癌腫、肉腫、造血器由来のがんなどが含まれる。癌腫としては、乳がん、胃がん、大腸がん、前立腺がん、子宮頸部がん、子宮体部がんなどの上皮細胞由来のがんが例示される。肉腫としては、骨肉腫、軟部肉腫などが例示される。造血器由来のがんとしては、白血病や悪性リンパ腫などが例示される。
【００２１】
生体試料としては、ヒト等の動物から採取された複数の細胞を含む試料であれば特に限定されない。例えば、尿や糞便等の排泄物、血液、生検や摘出手術等の外科的手法により採取した組織等が挙げられ、特に生検により採取された組織であることが好ましい。組織を用いて上記方法を実施した場合は、この組織ががん化しているか否か、他の組織に原発巣が認められる場合は原発巣からこの組織にがん細胞が転移しているか否か、等を判定することができる。この判定結果は、治療方針や組織郭清領域を決定する際の指標の１つとして用いることができる。例えば、乳がん患者から腫瘍の近傍のリンパ節組織を生検により採取し、上記方法によってがんのリンパ節転移の有無を判定することは、リンパ節を摘出すべきか、或いはどの程度郭清すべきか等を決定する一助となる。
【００２２】
第１定量工程においては、上記の生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡが定量される。腫瘍マーカー遺伝子とは、上述したようにがん細胞における発現量と正常細胞における発現量が有意に異なる遺伝子であり、用いる生体試料やがんの種類によって異なる。腫瘍マーカー遺伝子の例としては、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０などのＣＫ (サイトケラチン)、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＭＵＣ１、ＭＭＧ (マンマグロビン)、ＰＳＡ（前立腺特異抗原：Prostate specific antigen）、ＣＡ１５−３、ＥｐＣＡＭ（Epithelial cellular adhesion molecule）等をコードする遺伝子が挙げられる。
【００２３】
ｍＲＮＡの定量に際しては、上記の生体試料から検出用試料を調製し、この検出用試料に含まれるｍＲＮＡを定量することが好ましい。例えば生体試料と緩衝液とを混合し、緩衝液中の細胞に対して化学的及び／又は物理的処理を行うことによって細胞中のＲＮＡを液中に移行させ、このＲＮＡを含む溶液を検出用試料とすることができる。
【００２４】
ＲＮＡの分解を抑制するために緩衝液は強酸性であることが好ましい。ｐＨの好ましい範囲は２．５〜５．０であり、より好ましくは３．０〜４．０である。ｐＨをこの範囲に保つために、公知の緩衝液を用いることができる。
【００２５】
また、緩衝液には界面活性剤を含有させることが好ましい。界面活性剤によって細胞膜や核膜が損傷するため、この損傷を通して細胞中の核酸が溶液中に移行しやすくなる。このような作用を有するものであれば界面活性剤の種類は特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がよりこのましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
（ここで、Ｒ１は炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基；Ｒ２は−Ｏ−又は−（Ｃ６Ｈ６）−Ｏ−；ｎは８〜１２０の整数）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。緩衝液中の界面活性剤の濃度は０．１〜６％（ｖ／ｖ）が好ましく、より好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）である。
【００２６】
また、ｍＲＮＡの定量を後述の核酸増幅により行う場合は、緩衝液にさらにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有させることが好ましい。生体試料には、核酸増幅における酵素反応を阻害する物質（阻害物質）が含まれていることがあるが、ＤＭＳＯの作用によってこの阻害物質の影響を効果的に低減することができる。また、ＤＭＳＯには核酸増幅酵素の活性の低下を抑制する効果もある。緩衝液中のＤＭＳＯの濃度としては、１〜５０％（ｖ／ｖ）が好ましく、５〜３０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１０〜２５％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００２７】
検出用試料調製の際には、生体試料に対してホモジナイズ等の物理的処理を施すことが好ましい。これにより、生体試料中の細胞の細胞膜や核膜が物理的に破砕され、細胞内の核酸が溶液中に移行しやすくなる。ホモジナイズは、ペッスルなどによって手動で行ってもよいし、市販の電動ホモジナイザを用いて行ってもよい。得られたホモジネートを数秒〜数分間遠心分離することによってホモジネート中に浮遊していた細胞の破片等を沈殿させることができる。これにより、ＲＮＡ等を含む上清を検出用試料とすることができる。
【００２８】
ｍＲＮＡの定量は、核酸増幅やＤＮＡチップ等を用いて公知の方法により行うことができる。核酸増幅法を用いる場合は、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含むＲＴＰＣＲ（Reverse Transcription PCR）法やＲＴＬＡＭＰ(Reverse Transcription LAMP：LAMP法については米国特許６４１０２７８号公報参照)法などが好適に用いられる。特に、定量的核酸増幅法としては、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法やＴａｑＭａｎ（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）法（Linda G. Lee, 1993, Nucleic Acids Research, vol.21, p3761-3766等参照）などの公知の方法を用いることができる。
【００２９】
ｍＲＮＡの定量に用いることのできるＤＮＡチップとしては、上記の腫瘍マーカー遺伝子のｃＤＮＡとハイブリダイズ可能なＤＮＡのポリヌクレオチド及び／又はその断片を固定化した基盤を用いることができる。ＤＮＡチップを用いたＲＮＡの検出は、一般的に用いられる公知の方法により行うことができる。例えば、以下のようにして行うことができる。先ず、検出用試料中のｍＲＮＡの３’末端に存在するポリＡ配列を利用して逆転写反応を行う。逆転写反応の際に例えばＣｙ３やＣｙ５などの蛍光物質で標識されたヌクレオチドを用いることにより、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成される。これを上記のポリヌクレオチドを固定化した基盤と接触させると、このポリヌクレオチドと標識されたｃＤＮＡとが二本鎖を形成する。二本鎖を形成させた後、ｃＤＮＡの蛍光を測定することにより、ｍＲＮＡを定量することができる。
【００３０】
上述の方法によって測定されたｍＲＮＡの定量値は、単位体積当たりのｍＲＮＡの物質量、ｍＲＮＡ重量、コピー数などであってもよいし、反応液の蛍光強度や濁度が所定の値に達するまでの時間、サイクル数（ＰＣＲを用いた場合）などであってもよい。
【００３１】
第２定量工程においては、上述の腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドが定量される。ポリペプチドとしては、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されるタンパク質であってもよいし、その断片であってもよい。
【００３２】
ポリペプチドの定量に際しては、上記の生体試料から検出用試料を調製し、この検出用試料に含まれるポリペプチドを定量することが好ましい。この検出用試料は、ｍＲＮＡを定量する際に用いる検出用試料とは異なるポリペプチド検出用試料であっても良いが、好ましくは、ｍＲＮＡ定量の際に調製された検出用試料と同一ものが用いられる。これによって、ｍＲＮＡ定量用試料とポリペプチド定量用試料の２種類の試料を調製する手間を省くことができ、より簡便・短時間で試料調製を行うことができる。
【００３３】
従来は、ｍＲＮＡを定量する際は、ＲＮＡ抽出用キットなどを用いて生体試料に抽出・精製などの処理を繰り返すことにより、実質的にＲＮＡのみを含む試料を調製し、これを検出用試料としていた。この処理を行うと、生体試料中のポリペプチドや破砕された細胞の破片等は廃棄されるため、同一の生体試料からポリペプチドを定量するためには、ポリペプチド定量用の検出用試料を再び調製する必要があった。しかしながら、上記のｐＨであり上記の様な界面活性剤を含む緩衝液を用いて調製されたｍＲＮＡの検出用試料は、腫瘍マーカー遺伝子のポリペプチドを含んでいるため、同一の試料を用いてｍＲＮＡの定量及びポリペプチドの定量を行うことができる。
【００３４】
ポリペプチドの定量は、公知の方法により行うことができ、特に限定されない。例えば、プロテインチップ等を用いた解析法、ドットブロット法やウェスタンブロット法などのイムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、カウンティングイムノアッセイ法（ＣＩＡ: Sysmex Journal Vol.20 No.1, 77-86(1997)参照）などを用いることができる。これらのうち、ウェスタンブロット法を用いると、検出用試料に含まれるポリペプチドの種類を分子量に基づいて分離することができるため、より特異的に目的とするポリペプチドを定量することができる。
【００３５】
ポリペプチドの定量値は、予め作製された検量線に基づいて算出されることが好ましい。検量線は、既知量のタンパク質を含む試料を用いて検出用試料のポリペプチド測定と同様の条件で測定することにより作成することができる。
【００３６】
上記の様にして測定されたｍＲＮＡの定量結果及びポリペプチドの定量結果に基づいて生体試料中のがん細胞が検出される。この工程では生体試料にがん細胞が含まれるか否かが予測される。これら両方の定量結果の組み合わせに基づいてがん細胞を検出してもよいし、ｍＲＮＡ及びポリペプチドの一方の定量結果に基づいて先ず判定を行い、他方の定量結果を用いて前記判定の結果を確認してもよい。ｍＲＮＡ及びポリペプチドの両方の定量結果に基づいて得られる判定結果は、いずれか一方の定量結果のみを用いた判定結果よりも精度がよく、より信頼性も高い。
【００３７】
生体試料中のがん細胞は、ｍＲＮＡの定量値を対応する第１の閾値と比較した比較結果と、ポリペプチドの定量値を対応する第２の閾値と比較した比較結果とに基づいて検出してもよい。例えば、正常細胞よりもがん細胞において発現量が大きい腫瘍マーカー遺伝子の場合、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上であり、ポリペプチドの定量値が第２の閾値以上である場合は、生体試料中にがん細胞が含まれる、と予測することができる。また、ｍＲＮＡの定量値が第１の閾値以上であるか、又はポリペプチドの定量値が第２の閾値以上である場合に、生体試料中にがん細胞が含まれる、と予測してもよい。
【００３８】
第１の閾値及び第２の閾値は、がんや腫瘍マーカーの種類に応じて適宜設定される値である。これらの閾値は、がん細胞の存在が確認された生体試料(陽性検体)に含まれる腫瘍マーカー量以下であって、がん細胞が存在しないことが確認された生体試料(陰性検体)に含まれる腫瘍マーカー量よりも高い値に設定することができる。特に、複数の陽性検体の腫瘍マーカー量と複数の陰性検体の腫瘍マーカー量とを予め測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値として設定することが好ましい。
【００３９】
また、上記の緩衝液で調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定性的に検出し、この検出用試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定性的に検出し、これらの検出結果に基づいて生体試料中のがん細胞を検出してもよい。この場合、例えば検出用試料中にｍＲＮＡが存在すると判定され、且つポリペプチドが存在すると判定された場合は、生体試料中にがん細胞が含まれていると判定される。
【００４０】
ｍＲＮＡの定性的検出方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができ、例えば、上述したＲＴＰＣＲやＲＴＬＡＭＰで核酸増幅を行った反応液を用いてアガロースゲル電気泳動等を行うことにより検出を行うことができる。また、ポリペプチドの定性的検出方法も特に限定されず、上述した公知のイムノアッセイ等を用いることができる。
【００４１】
本発明の別の実施形態は、上述の方法を実施するためのがん細胞の検出装置である。以下、図面に基づき、この装置について説明する。
【００４２】
図１は、本発明の一実施形態によるがん細胞検出装置１の全体構成を示した斜視図である。この装置１は、核酸定量部１００と、タンパク質定量部１０１と、これらと有線又は無線による通信ができるように接続されたパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成される。パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を分析するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
【００４３】
以下、図２及び図３を用いて、装置１の核酸定量部１００について説明する。図２は、核酸定量部１００の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸定量部の概略平面図である。
【００４４】
核酸定量部１００は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
【００４５】
また、分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
【００４６】
また、図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
【００４７】
また、本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織を上述の処理（ホモジナイズ、ろ過など）を施して調製された可溶化抽出液（検出用試料）が収容された試料容器２２がセットされるとともに、正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
【００４８】
また、試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールが収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
【００４９】
また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、ＣＫ１９のｍＲＮＡ（以下、ＣＫ１９ｍＲＮＡともいう）に対応するｃＤＮＡ（以下、ＣＫ１９ｃＤＮＡともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡにハイブリダイズ可能なプライマを含む試薬（以下、プライマ試薬とする）が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
【００５０】
また、反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図３参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
【００５１】
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
【００５２】
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
【００５３】
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
【００５４】
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による核酸定量部１００の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、手術によって切除された組織中のＣＫ１９ｍＲＮＡ（腫瘍マーカー）に対応するｃＤＮＡをＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いて増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムの白濁による濁度の変化を測定することによりＣＫ１９ｍＲＮＡの量（コピー数／μＬ）を測定し、これを閾値と比較する。
【００５５】
まず、図２及び図３に示すように、予め切除組織を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された検出用試料（以下、試料ともいう）が収容された試料容器２２を試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする。また、陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ（図３参照）及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌに、それぞれ、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９ｃＤＮＡの増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする。また、チップセット部３０に、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
【００５６】
核酸定量部１００の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動された後、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、プライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するように、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１によりプライマ試薬容器２７内のプライマ試薬が吸引される。
【００５７】
プライマ試薬の吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、プライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。
【００５８】
プライマ試薬の吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
【００５９】
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
【００６０】
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりＣＫ１９ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
【００６１】
試料の濁度データは、核酸定量部１００からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、試料の濁度データから単位体積当たりのｍＲＮＡコピー数を算出し、これを予め決められた閾値と比較する。
【００６２】
次に、図４〜６に基づき、タンパク質定量部１０１について説明する。タンパク質定量部１０１では、核酸定量部１００で測定に供された試料に含まれるＣＫ１９タンパク質の量を測定することができる。
図４は、タンパク質定量部１０１の全体構成を示した斜視図であり、図５及び６は、タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【００６３】
タンパク質定量部１０１は、図４に示すように、分注部２１０と、試薬設置部２２０と、反応部２４０と、測定希釈分注部２５０と、試料受け部２６０と、光学検出部２７０と、未使用の反応プレート２０１を収容する反応プレートトレイ２８０と、洗浄部３００ａおよび３００ｂと、制御部３１０とを含んでいる。
【００６４】
分注部２１０は、図４に示すように、水平方向に直交するＸ２軸方向およびＹ２軸方向に移動可能な水平方向移動機構部（図示せず）と、水平方向移動機構部に対して垂直方向（Ｚ２軸方向）に移動可能な検体・ラテックスピペット部２１１と、プレートキャッチャ部２１２とを含んでいる。また、検体・ラテックスピペット部２１１は、試料を分注および吐出する機能を有している。また、検体・ラテックスピペット部２１１は、試薬ビン２０３内のラテックス試薬、緩衝液および検体希釈液を分注および吐出する機能も有している。また、プレートキャッチャ部２１２は、反応プレートトレイ２８０から未使用の反応プレート２０１を反応部２４０に搬送するとともに、使用済みの反応プレート２０１を反応プレート廃棄箱（図示せず）に搬送するために設けられている。なお、反応プレート２０１には、試料や各種試薬を収容可能な２５個のキュベット２０１ａが設けられている。
【００６５】
試薬設置部２２０は、緩衝液、ラテックス試薬および検体希釈液を収容した試薬ビン２０３を載置するために設けられている。この際、試薬ビン２０３内の試薬（緩衝液、ラテックス試薬、検体希釈液）は、所定の温度（１５℃以下）に保たれている。そして、試薬設置部２２０には、装置の奥側から順番に、緩衝液容器セット部２２１、ラテックス試薬容器セット部２２２および検体希釈液容器セット部２２３が設けられている。
【００６６】
反応部２４０は、２枚の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内に収容される試料と、各種試薬（緩衝液、抗ＣＫ１９抗体を感作したラテックス粒子を含むラテックス試薬、検体希釈液）とを反応させるために設けられている。具体的には、上記した分注部２１０により分注された試料および試料と各種試薬（緩衝液、ラテックス試薬、検体希釈液）とを攪拌して混合するとともに、その攪拌して混合された試料と各種試薬とを所定の温度に維持することにより、ラテックス試薬の凝集反応を促進させている。つまり、この反応部２４０では、図５に示すように、抗体が結合したラテックス試薬中のラテックス粒子が、試料中の抗原（ＣＫ１９タンパク質）を媒介として凝集する凝集反応が行われる。
【００６７】
試料中にＣＫ１９タンパク質が存在すると、図５右図のように、抗原抗体反応によりＣＫ１９タンパク質に抗ＣＫ１９抗体を感作したラテックス粒子が複数個結合し、粒子凝集が起こる。ＣＫ１９タンパク質の量が多いほど粒子は凝集するため、試料の凝集度を上記のＣＩＡにより測定することで、ＣＫ１９タンパク質が定量される。
【００６８】
測定希釈分注部２５０は、図４に示すように、分注部２１０の後方に配置されており、反応部２４０の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料を吸引および吐出する機能を有している。この測定希釈分注部２５０は、水平方向に直交するＸ２軸方向およびＹ２軸方向に移動可能な水平方向移動機構部（図示せず）と、水平方向移動機構部に対して垂直方向（Ｚ２軸方向）に移動可能な測定希釈ピペット部２５１とを含んでいる。そして、測定希釈分注部２５０は、吸引した反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料を、免疫凝集測定装置２００の下部に設置されたタンク（図示せず）に収容される測定希釈液とともに試料受け部２６０に吐出する。
【００６９】
試料受け部２６０は、上記した反応部２４０の反応プレート２０１のキュベット２０１ａ内の調製試料および測定希釈液を受け入れるために設けられている。そして、試料受け部２６０に受け入れられた粒子懸濁液（調製試料および測定希釈液）は、後述する光学検出部２７０のシースフローセル２７４（図６参照）に導かれる。
【００７０】
光学検出部２７０は、図６に示すように、光源としてのレーザダイオード２７１と、コンデンサレンズ２７２およびコレクタレンズ２７３と、シースフローセル２７４と、受光素子としてのフォトダイオード２７５とから構成されている。シースフローセル２７４は、粒子懸濁液（調製試料および測定希釈液）の流れを、粒子懸濁液の両側を流れるシース液の流れで挟み込むことにより、扁平な流れに変換する機能を有している。そして、レーザダイオード２７１からシースフローセル２７４を流れる粒子懸濁液に照射された光は、粒子懸濁液中のラテックス粒子の凝集塊（図５参照）に散乱されて、フォトダイオード２７５により受光されるように構成されている。フォトダイオード２７５により受講された散乱光情報はパーソナルコンピュータ１０２に送信される。
【００７１】
反応プレートトレイ２８０は、最大４つの未使用の反応プレート２０１（図４参照）を収容することが可能である。そして、反応プレートトレイ２８０に収容される反応プレート２０１は、分注部２１０のプレートキャッチャ部２１２（図４参照）により反応部２４０に搬送される。また、反応プレート廃棄箱は、使用済みの反応プレート２０１を貯留することが可能であり、分注部２１０のプレートキャッチャにより反応部２４０から搬送される。
【００７２】
洗浄部３００ａは、分注部２１０の検体・ラテックスピペット部２１１を洗浄するために設けられている。また、洗浄部３００ｂは、測定希釈分注部２５０の測定希釈ピペット部２５１を洗浄するために設けられている。
【００７３】
パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、フォトダイオード２７５から送信された散乱光情報を取得し、これに基づいて試料中のＣＫ１９タンパク質の量を算出する。ＣＰＵ１０２ｄは算出されたＣＫ１９タンパク質定量値を予め設定された対応する閾値と比較する。
【００７４】
ＣＰＵ１０２ｄの処理フローについて、図７に基づき、説明する。上述のように、ＣＰＵ１０２ｄは核酸定量部１００から濁度データを受信し、タンパク質定量部１０１から散乱光情報を受信する（ステップＳ１）。濁度データを基にｍＲＮＡの発現量を算出し、散乱光情報を基にタンパク質の発現量を算出する（ステップＳ２）。次に、ＣＰＵ１０２ｄは、ＣＫ１９ｍＲＮＡ定量値と予め設定された閾値との比較、及びＣＫ１９タンパク質定量値と予め設定された閾値との比較を行うことにより、試料中のがん細胞の存否を判定する（ステップＳ３）。ＣＰＵ１０２ｄは、判定結果をパーソナルコンピュータ１０２の表示部１０２ｃに出力し、表示させる。
【００７５】
なお、核酸定量部１００及びタンパク質定量部１０１は別々の装置（即ち、核酸定量装置及びタンパク質定量装置）であってもよい。
また、核酸定量部１００及びタンパク質定量部１０１は同一の試料を用いるため、この試料を各定量部に搬送する搬送装置を備えていてもよい。
【００７６】
＜実施例１＞
１．測定用試料の調製
乳がん患者から切除したリンパ節３１個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により２２個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、９個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）２２個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）９個を用いて、下記のようにして測定用試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ｐＨ３．４の緩衝液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）２００μＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清を５０〜２００μＬ採取してこれを検出用試料とした。
【００７７】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの検出用試料を核酸増幅装置（ＧＤ−１００、シスメックス製）にセットし、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によってＣＫ１９ｃＤＮＡを増幅させた（測定用試薬として、ＧＤ−１００には核酸増幅用試薬サイトケラチン試薬（シスメックス製）がセットされた）。反応液の濁度をリアルタイムに測定することによってＣＫ１９のｍＲＮＡ（コピー数）を定量した。
【００７８】
３．ＣＫ１９タンパク質の定量
ＣＫ１９ｍＲＮＡの定量に用いた検出用試料２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Tris HCl(pH6.8)、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３％ ブロモフェノールブルー、及び３０％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Tween20、及び５％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Tris(pH7.6)、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１％ Tween20を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：Cytokeratin 19 (A53-B/A2):sc-6278（サンタクルズ社製、Lot:#L2403）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ECL anti-mouse IgG HRP linked F(ab')2 fragment（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ECL-Advance Western Blotting Detection Kit（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。LumiAnalyst（ロシュ社製）で酵素反応後のメンブレン画像を取り込み、QuantityOne（バイオラッド社製）によってメンブレン画像の蛍光強度を算出した。上述のようにして測定された蛍光強度を、検量線にあてはめ、ＣＫ１９タンパク質の量を算出した。検量線は、上記と同じゲルで測定用試料を収容したウェルとは別のウェルに濃度既知のＣＫ１９タンパク質を含む試料を収容し、上述の蛍光強度測定を行うことにより作成された。
【００７９】
４．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図８に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図８に示されるように、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。従って、これらの定量結果を用いることにより、測定に供される生体試料が陰性検体であるか、陽性検体であるかを判定することが可能である。
【００８０】
また、ｍＲＮＡ定量値に対応する第１の閾値を５０００コピー／μＬとし、タンパク質定量値に対応する第２の閾値を０．５ｎｇ／μＬとすることも可能である。ｍＲＮＡ定量値及びタンパク質定量値をこれらの閾値と比較することによって、がん転移の有無を判定してもよい。
【００８１】
＜実施例２＞
１．測定用試料の調製
大腸がん患者から切除したリンパ節６３個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により３５個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、２８個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）３５個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）２８個を用いて、実施例１と同様に測定用試料を調製した。
【００８２】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００８３】
３．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図９に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図９に示されるように、大腸がんにおいても、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
【００８４】
＜実施例３＞
１．測定用試料の調製
胃がん患者から切除したリンパ節３０個を用いて測定用試料を調製した。これらのうち、ヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の検鏡により２４個のリンパ節にがん細胞の転移が認められ、６個のリンパ節にがん細胞の転移が認められなかった。
がん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）２４個及びがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）６個を用いて、実施例１と同様に測定用試料を調製した。
【００８５】
２．ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質の定量
上記検出用試料を用い、実施例１と同様にしてＣＫ１９ｍＲＮＡ及びＣＫ１９タンパク質を定量した。
【００８６】
３．結果
測定されたｍＲＮＡ定量値（コピー／μＬ）及びタンパク質定量値（ｎｇ／μＬ）を対数軸に展開し、グラフを作成した。このグラフを図１０に示す。グラフ中、▲は陽性検体であり、■は陰性検体である。図１０に示されるように、胃がんにおいても、ｍＲＮＡの定量結果とタンパク質の定量結果は良好な相関関係を示した。
【００８７】
本実施例は、ｍＲＮＡ定量結果及びタンパク質定量結果に基づいた検出方法であるため、単独の方法による検出結果よりも精度がよく信頼性の高い検出結果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明の一実施形態によるがん細胞検出装置１の全体構成を示した斜視図である。
【図２】核酸定量部１００の全体構成を示した斜視図である。
【図３】図２の核酸定量部の概略平面図である。
【図４】タンパク質定量部１０１の全体構成を示した斜視図である。
【図５】タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【図６】タンパク質定量部１０１によるタンパク質定量の原理を説明するための図である。
【図７】ＣＰＵ１０２ｄによる処理フローである。
【図８】実施例１の結果を示すグラフである。
【図９】実施例２の結果を示すグラフである。
【図１０】実施例３の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、
前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。
【請求項２】
前記生体試料がリンパ節組織であり、
前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、前記生体試料から調製された検出用試料を用いて行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、同じ検出用試料を用いて行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記検出用試料が、前記リンパ節組織を緩衝液中で処理し前記組織中のＲＮＡ及びポリペプチドを液中に移行させることによって得られる溶液である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液が、ｐＨ２．５〜５．０である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝液が、ジメチルスルホキシド及び界面活性剤をさらに含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記がんが乳がん、大腸がん、又は胃がんである、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
生体試料と緩衝液とを混合することにより調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出する工程、
前記検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを検出する工程、及び
前記ｍＲＮＡの検出結果及び前記ポリペプチドの検出結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。
【請求項１０】
核酸及びポリペプチドを検出するための検出用試料を調製する方法であって、
ジメチルスルホキシド及び界面活性剤を含み、ｐＨが２．５〜５．０である緩衝液を用いて生体試料を処理することにより、前記生体試料に含まれる核酸及びポリペプチドを溶液中に移行させて検出用試料を調製することを特徴とする、検出用試料調製方法。
【請求項１１】
生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量手段、
前記生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量手段、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する判定手段、
を備えたがん細胞の検出装置。
【請求項１】
生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する工程、
前記生体試料中の前記腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する工程、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。
【請求項２】
前記生体試料がリンパ節組織であり、
前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、前記生体試料から調製された検出用試料を用いて行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡの定量及び前記ポリペプチドの定量が、同じ検出用試料を用いて行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記検出用試料が、前記リンパ節組織を緩衝液中で処理し前記組織中のＲＮＡ及びポリペプチドを液中に移行させることによって得られる溶液である、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液が、ｐＨ２．５〜５．０である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝液が、ジメチルスルホキシド及び界面活性剤をさらに含む、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記がんが乳がん、大腸がん、又は胃がんである、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
生体試料と緩衝液とを混合することにより調製された検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出する工程、
前記検出用試料に含まれる、腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを検出する工程、及び
前記ｍＲＮＡの検出結果及び前記ポリペプチドの検出結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する工程、
を含むがん細胞の検出方法。
【請求項１０】
核酸及びポリペプチドを検出するための検出用試料を調製する方法であって、
ジメチルスルホキシド及び界面活性剤を含み、ｐＨが２．５〜５．０である緩衝液を用いて生体試料を処理することにより、前記生体試料に含まれる核酸及びポリペプチドを溶液中に移行させて検出用試料を調製することを特徴とする、検出用試料調製方法。
【請求項１１】
生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡを定量する第１定量手段、
前記生体試料に含まれる腫瘍マーカー遺伝子から翻訳されたポリペプチドを定量する第２定量手段、及び
前記ｍＲＮＡの定量結果及び前記ポリペプチドの定量結果に基づいて前記生体試料中のがん細胞を検出する判定手段、
を備えたがん細胞の検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００８−２８９４５６（Ｐ２００８−２８９４５６Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１５３５３６（Ｐ２００７−１５３５３６）
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月１１日（２００７．６．１１）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]