アジュバント添加されたグルカン
真菌に対する免疫処置のための抗原としてのβ−グルカンの使用が公知である。本発明によれば、β−グルカンをアジュバントとともに投与する。アジュバントにより免疫応答が改善される。グルカンは、通常、担体に結合体化させる。好適なグルカンとしては、ラミナリンおよびカードランが挙げられる。一実施形態において、（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバント（ただし、成分（ｂ）は完全フロイントアジュバントではなく、コレラ毒素でもない）を含む免疫原性組成物が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１１月２６日に出願された米国仮出願第６１／００４，３９６号および２００８年７月１日に出願された米国仮出願第６１／１３３，７３８号（これらの両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明はワクチンに関し、より詳しくは、真菌による感染症および疾患に対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
β−グルカンの抗真菌ワクチンとしての使用は、参考文献１（非特許文献１）に概説されている。
【０００４】
参考文献２（特許文献１）には、免疫処置試験における種々のβ−グルカン、例えば、ラミナリン、プスツランおよび「ＧＧ−ｚｙｍ」（グルカンゴーストをβ−１，３−グルカナーゼで消化することにより得られる可溶性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルカン）の使用が報告されている。ＧＧ−ｚｙｍおよびラミナリングルカンは、どちらも、その免疫原性を改善するために担体タンパク質に結合体化された。結合体化したラミナリンに関する情報は、参考文献３（非特許文献２）に報告されている。
【０００５】
参考文献２（特許文献１）では、ＧＧ−ｚｙｍ結合体は、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントの両方とともに投与された。より一般的には、β−グルカン含有組成物は、任意選択でアジュバントを含むものとして開示されている。参考文献３（非特許文献２）では、ラミナリン結合体は、完全フロイントアジュバントまたはコレラ毒素アジュバントとともに投与された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０３／０９７０９１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＣａｓｓｏｎｅおよびＴｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００６）５：８５９〜６７
【非特許文献２】Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００５）２０２：５９７〜６０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、感染症に対して防御的および／または治療的免疫応答を誘発するためのさらに良好なグルカン系組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバント（ただし、成分（ｂ）は完全フロイントアジュバントではなく、コレラ毒素でもない）を含む免疫原性組成物に関する。グルカンは単一の分子種であり得る。一実施形態において、グルカンを担体タンパク質に結合体化させる。特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質に直接結合体化させる。別の特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質にリンカーによって結合体化させる。
【００１０】
また、本発明は、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物に関し、前記グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化させたものである。一実施形態において、グルカンを担体タンパク質に結合体化させる。特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質に直接結合体化させる。別の特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質にリンカーによって結合体化させる。
【００１１】
本発明の免疫原性組成物における担体タンパク質は、細菌毒素もしくはトキソイド、またはその変異体であり得る。特定の実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００１２】
特定の実施形態において、グルカンは、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する。他の実施形態において、グルカンは６０個以下のグルコース単糖単位を有するものである。
【００１３】
グルカンは、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンであり得る。特定の実施形態では、グルカンはラミナリンである。別の特定の実施形態では、グルカンのβ−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基において、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する。例えば、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基とβ−１，６−結合グルコース残基との両方を含み、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比は少なくとも８：１である。
【００１４】
グルカンは、排他的にβ−１，３結合を有するものであってもよい。特定の実施形態では、グルカンは、カードランである。本発明の免疫原性組成物に薬学的に許容され得る担体を含めてもよい。
【００１５】
アジュバントは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含み得る。アジュバントは、外膜小胞（ＯＭＶ）を含むものであってもよい。アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオンオリゴペプチドとを含むものであってもよい。
【００１６】
また、本発明は、哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法に関する。
【００１７】
また、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンに関する。
【００１８】
また、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこのような方法によって得られる結合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、糖および結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）ＣＲＭ１９７；（２）ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン；（３）ＣＲＭ１９７に結合体化させた水解型カードラン；（４）破傷風トキソイド単量体、Ｔｔ；（５）Ｔｔに結合体化させたラミナリン；（６）Ｔｔに結合体化させた水解型カードランである。
【図２】図２は、結合体のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。図２Ａは、ＣＲＭ１９７結合体のプロフィールを示し、図２Ｂは、Ｔｔ結合体のプロフィールを示す。両方の場合において、最も右側のピークは、結合体化されていない担体のプロフィールである。最小ピークはカードラン結合体である。第３のピークはラミナリン結合体である。
【図３】図３は、ラミナリンに対する結合体化前および結合体化後のＣＲＭ１９７のＨＰＬＣ−ＳＥＣ解析を示す。
【図４】図４は、合成グルカンの結合体化の概要である。
【図５】図５は、合成グルカンの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図６】図６は、ラミナリン結合体のロット９および１０のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図７】図７は、アジュバントとして左から右に：（１）水酸化アルミニウム；（２）水酸化アルミニウム＋ＣｐＧオリゴ；（３）ＭＦ５９；（４）ＩＣ３１、高用量（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）；（５）ＩＣ３１、低用量（１００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する９０μｌの試料）；（６）α−ガラクトシルセラミド；または（７）α−ガラクトシルセラミド＋水酸化アルミニウムを加えたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図８】図８は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図９】図９は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１０】図１０は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１１】図１１は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１２】図１２は、種々の糖用量のラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１３】図１３は、種々の糖用量のカードラン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたカードラン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１４】図１４は、種々の糖用量のラミナリン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン）を示す。
【図１５】図１５は、腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ＧＧＺｙｍ）を示す。
【図１６】図１６は、腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ラミナリン）を示す。
【図１７】図１７は、種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体で処置したマウス由来の免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を示す。
【図１８】図１８は、ＭＦ５９アジュバントと合わせたラミナリン結合体で処置したマウス由来の免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を示す。
【図１９】図１９は、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出した市販のラミナリンのＵＶスペクトルおよびデプスフィルタを用いて１回、２回または３回の濾過工程後の同じ物質のスペクトルを示す。
【図２０】図２０は、種々のアジュバントと合わせた３７℃におけるグルカン結合体の液状製剤の安定性を示す。
【図２１】図２１は、種々のアジュバントと合わせた２〜８℃におけるグルカン結合体の液状製剤の安定性を示す。
【図２２】図２２は、４、２５または３７℃におけるグルカン結合体の凍結乾燥製剤の安定性を示す。
【図２３】図２３は、腹腔内投与によって投与した、合成グルカンならびにラミナリン結合体単独または種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ラミナリン）を示す。
【図２４】図２４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【図２５】図２５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【図２６】図２６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた２種類の合成グルカン結合体またはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明によれば、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンが、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与される。アジュバントの使用により、アジュバントがない場合よりも強力な免疫応答がもたらされることが示された。グルカンは、好ましくは結合体の形態で使用される。アジュバントは、好ましくは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含むものである。
【００２１】
グルカンがラミナリンならば、アジュバントは完全フロイントアジュバントではない。さらに、グルカンがラミナリンであり、鼻腔内または膣内投与のためのものならば、アジュバントはコレラ毒素ではない。より一般的には、アジュバントは、好ましくは完全フロイントアジュバントでもコレラ毒素でもない。
【００２２】
したがって、本発明は、（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物を提供し、前記グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化させたものである。本発明者らは、単一の分子種であるグルカンは、特に、該組成物がアジュバントもまた含む場合、より多分散系のグルカンよりも免疫原性が大きいことを見い出した。したがって、好ましくは、該組成物はグルカンに加えてアジュバントを含む。
【００２４】
また、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンに関する。グルカンは、本明細書に記載の任意のグルカンであり得る。本発明者らは、既知の方法によって精製したグルカンには、フロロタンニンが混入していることがあり得ることを見い出した。フロロタンニンは、褐藻類および海藻類に見られるポリフェノール化合物である。フロロタンニンは、典型的には、ジベンゾ−１，４−ジオキシン骨格を含むものであるが、多くの異なる形態のフロロタンニンも知られている。フロロタンニンは、さまざまな生物学的効果、例えば、放射線防護効果および抗酸化効果を有することが示されている（［４］および［５］）。特に、フロロタンニンは、免疫機構に対する効果、例えば、抗炎症性効果および抗アレルギー効果を有することが示されている（［５］および［６］）。フロロタンニンの抗免疫効果は、特に、グルカンが免疫原としての使用のためのものである場合、これがグルカン中の望ましくない夾雑物であり得ることを意味する。本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンを提供する。
【００２５】
また、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこの方法によって得られる結合体を提供する。グルカンは、本明細書に記載の任意のグルカンであり得る。本発明者らは、このような方法によって結合体化させたグルカンは、ワクチンとして使用した場合、先行技術の方法（例えば、参考文献２および３に記載の方法）によって結合体化させたグルカンよりも大きな防御がもたらされ得ることを見い出した。理論に拘束されることを望まないが、この効果は、得られる結合体の凝集の低減のためであり得ると考えられる。
【００２６】
グルカン
グルカンは、とりわけ真菌の細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のα−結合を含むものであり、β−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のβ−結合を含むものである。本発明に従って使用されるグルカンはβ結合を含むものであり、β結合のみを含むもの（すなわち、α結合を含まない）であってもよい。
【００２７】
グルカンは１つ以上のβ−１，３−結合および／または１つ以上のβ−１，６−結合を含み得る。また、１つ以上のβ−１，２−結合および／またはβ−１，４−結合を含むものであってもよいが、通常、β結合のみがβ−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合である。
【００２８】
グルカンは、分枝状であっても線状であってもよい。
【００２９】
完全長の天然β−グルカンは不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。本発明の免疫原性組成物には、可溶性グルカンを使用することが好ましい。可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することにより達成され得る。これは加水分解によっても行なわれ得、より簡便には、グルカナーゼ（例えば、β−１，３−グルカナーゼまたはβ−１，６−グルカナーゼ）での消化によっても行なわれ得る。代替法として、短いグルカンを、単糖構成ブロックを連接することにより合成によって調製することもできる。
【００３０】
低分子量グルカンが好ましく、特に、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有するものが好ましい。また、例えば、６０個以下（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個）のグルコース単糖単位を含むオリゴ糖を使用することも可能である。この範囲において、１０〜５０個または２０〜４０個の単糖単位を有するオリゴ糖が好ましい。
【００３１】
グルカンは真菌グルカンであり得る。「真菌グルカン」は、一般的には真菌から得られるものであるが、特定のグルカン構造が真菌および非真菌（例えば、細菌、下等植物または藻類）の両方に見られる場合は、非真菌生物体を代替供給源として使用してもよい。したがって、グルカンは、カンジダ属（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）の細胞壁、あるいはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、またはＰｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍに由来するものであり得る。
【００３２】
真菌β−グルカンには種々の供給源が存在する。例えば、純粋なβ−グルカンは市販されており、例えば、プスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ ｐａｐｕｌｌｏｓａから精製されたβ−１，６−グルカンである。β−グルカンは、真菌の細胞壁から種々の様式で精製され得る。例えば、参考文献７には、細胞壁マンナンを含まないカンジダ属由来の水溶性β−グルカン抽出物を調製するための、ＮａＣｌＯ酸化とＤＭＳＯ抽出を伴う２工程手順が開示されている。得られる生成物（「カンジダ属可溶性β−Ｄ−グルカン」または「ＣＳＢＧ」）は、主として線状β−１，３−グルカンで構成されており、線状β−１，６−グルカン部分を有する。同様に、参考文献２には、Ｃａｌｂｉｃａｎｓ由来のＧＧ−ｚｙｍの作製が開示されている。かかるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来グルカンとしては、（ａ）β−１，３−グルカン側鎖を有し、平均重合度が約３０のβ−１，６−グルカン、および（ｂ）β−１，６−グルカン側鎖を有し、平均重合度が約４のβ−１，３−グルカンが挙げられる。
【００３３】
本発明の一部の実施形態において、グルカンは、例えばラミナリンに見られるような、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンである。ラミナリンは褐藻類および海藻類に見られる。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比は、種々の供給源の間で変動し、例えば、Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓのラミナリンでは３：２と小さいが、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔｉｔａｔａのラミナリンでは７：１と大きい［８］。したがって、本発明で使用されるグルカンは１．５：１〜７．５：１、例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１または７：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有し得る。任意選択で、グルカンは、末端マンニトールサブユニット、例えば１，１−α−結合マンニトール残基を有するものであってもよい［９］。また、グルカンはマンノースサブユニットを含むものであってもよい。
【００３４】
他の実施形態において、グルカンは、カードランに見られるように、β−１，３結合を排他的に、または主として有するものである。本発明者らは、このようなグルカンの免疫原性が、他の結合を含むグルカンよりも、特に、β−１，３結合を含み、β−１，６結合の割合がより高いグルカンよりも大きくなり得ることを見い出した。したがって、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基のみ（例えば、排他的に１，３結合を有する線状β−Ｄ−グルコピラノース）で構成されたものであってもよい。とはいえ、任意選択で、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基ではない単糖残基を含むものであってもよく、例えば、β−１，６−結合グルコース残基を含むものであってもよい。このような他の残基に対するβ−１，３−結合グルコース残基の比は、少なくとも８：１（例えば、≧９：１、≧１０：１、≧１１：１、≧１２：１、≧１３：１、≧１４：１、≧１５：１、≧１６：１、≧１７：１、≧１８：１、≧１９：１、≧２０：１、≧２５：１、≧３０：１、≧３５：１、≧４０：１、≧４５：１、≧５０：１、≧７５：１、≧１００：１など）であるのがよい、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つ（例えば、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０など）の隣接する非末端残基の配列が１つ以上（例えば、≧１、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２など）存在する。「非末端」により、該残基が、グルカンの遊離端に存在しているものではないことを意図する。一部の実施形態において、隣接する非末端残基は、担体分子、リンカーまたは他のスペーサー（後述）にカップリングされた残基を全く含まないものであってもよい。本発明者らは、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された隣接する５つの非末端残基の存在により、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御的抗体応答がもたらされ得ることを見い出した。
【００３５】
さらなる実施形態において、組成物は、２種類の異なるグルカンを含むものであり得、例えば、第１のグルカンは１．５：１〜７．５：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有するものであり、第２のグルカンはβ−１，３結合を排他的に、または主として有するものである。例えば、組成物は、ラミナリングルカンとカードラングルカンの両方を含み得る。
【００３６】
β−グルカンが、β−１，３結合とβ−１，６結合の両方を所望の比および／または配列で含むものである場合、このグルカンは、天然に見られるものであってもよく（例えば、ラミナリン）、人工的に作製したものであってもよい。例えば、これは、全部または一部が化学合成によって作製されたものであり得る。β−１，３／β−１，６グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献１０〜２０により当該分野において周知である。また、β−１，３結合とβ−１，６結合の両方を所望の比で含むβ−グルカンは、利用可能なグルカンから出発して、これを、β−１，６−グルカナーゼ（グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ、１，６−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼなどとしても知られる；ＥＣ ３．２．１．７５）、またはβ−１，３−グルカナーゼ（エキソ−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．５８）など、またはエンド−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．３９）で、所望の比および／または配列に達するまで処理することにより作製され得る。
【００３７】
β−１，３−結合グルコースのみを含むグルカンが所望される場合、β−１，６−グルカナーゼにより最終的に純粋なβ−１，３グルカンが得られるため、β−１，６−グルカナーゼ処理を最後まで遂行してもよい。しかしながら、より簡便には、純粋なβ−１，３−グルカンを使用するのがよい。これは、例えば、（１→３）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ（そのいくつかは既知であり、多くの生物体（例えば、細菌、酵母、植物および真菌）に由来のものである）を使用し、化学的および／または酵素的合成による合成によって作製され得る。β−１，３グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献２１〜２４により当該分野で周知である。有用な代替的合成例として、天然のβ−１，３−グルカン、例えば、カードラン（以前はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｖａｒ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓとして知られていたアグロバクテリウム属由来の線状β−１，３−グルカン；例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販（カタログＣ７８２１））またはパラミロン（ユーグレナ属由来のβ−１，３−グルカン）などが使用され得る。高レベルのβ−１，３−グルカンをもたらす生物体は当該技術分野で知られており、例えば、参考文献２５および２６のアグロバクテリウム属、または参考文献２７のＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓである。
【００３８】
ラミナリンおよびカードランは、典型的には、天然で、例えば少なくとも１００ｋＤａの分子量を有する高分子量ポリマーとして見られる。これらは、多くの場合、水性媒体に不溶性である。したがって、これらは、その天然形態では免疫処置にあまり適していない。したがって、本発明では、より短いグルカン、例えば、６０個以下のグルコース単糖単位（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個）を含むオリゴ糖が使用され得る。２〜６０の範囲の数のグルコース残基、例えば、１０〜５０個または２０〜４０個のグルコース単位を有するグルカンが使用され得る。２５〜３０個のグルコース残基を有するグルカンが特に有用である。好適なグルカンは、例えば、天然グルカンの酸加水分解によって、または例えば、グルカナーゼ（β−１，３−グルカナーゼなど）での酵素的消化によって形成され得る。１１〜１９個、例えば１３〜１９個、特に１５個または１７個のグルコース単糖単位を有するグルカンもまた有用である。特に、下記の構造（Ａ）または（Ｂ）：
【００３９】
【化１】
（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した）
【００４０】
【化２】
（式中、ｎは、０〜９、例えば１〜７または２〜６の範囲である。好ましくは、ｎは、３〜４または１〜３の範囲である。本発明者らは、ｎ＝２が好適であることを見い出した）
を有するグルカンが、本発明における使用に具体的に想定される。
【００４１】
グルカン（上記に規定のもの）は、好ましくは単一の分子種である。この実施形態において、グルカン分子はすべて、配列に関して同一である。したがって、グルカン分子はすべて、その構造的特性（例えば、分子量など）に関して同一である。典型的には、この形態のグルカンは、例えば、上記の方法を用いて化学合成によって得られる。例えば、参考文献２２には、単一のβ−１，３結合種の合成が記載されている。あるいはまた、他の実施形態では、グルカンは、天然グルカンから、例えば、上記のようなＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ、アグロバクテリウム属またはユーグレナ属由来のグルカンから、必要とされる単一の分子種が得られるまでグルカンを精製して得られるものであり得る。このようにして精製された天然グルカンは市販されている。単一の分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することにより確認され得る。このパラメーターは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって、例えば参考文献２８に記載のようにして簡便に測定され得る。本発明のこの実施形態における使用に好適なグルカンは、約１の（例えば、１．０１またはそれより小さい）多分散性を有するものである。
【００４２】
天然グルカン（カードランなど）の溶解度は、イオン性基を導入することにより増大させることができる（例えば硫酸化によって、特にカードランのＯ−６に）。かかる修飾を本発明で使用してもよいが、グルカンの抗原性が改変されることがあり得るので、理想的には回避する。
【００４３】
グルカンを天然供給源から単離する場合、夾雑物と一緒に単離されることがあり得る。例えば、本発明者らは、グルカンにフロロタンニンが混入していることがあり得ることを見い出した。これは、紫外・可視（ＵＶ／ＶＩＳ）分光法によって確認され得る。この問題は、グルカンを褐藻または海藻から単離する場合、特によく見られる。例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出された市販のラミナリンのＵＶスペクトルは、フロロタンニン夾雑物の存在に起因する吸収ピークを含む（図１６）。同様に、Ａｒｔｉｃ ｌａｍｉｎａｒｉａｌｉｓ、Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ ｄｅｒｍａｔｏｄｅａおよびＡｌａｒｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａから抽出されたグルカンは、フロロタンニン夾雑物に起因する吸収ピークを含むＵＶスペクトルを有する。
【００４４】
グルカン試料中のフロロタンニンの存在は、グルカンの生物学的特性に影響を及ぼし得る。したがって、特に、グルカンが医療または栄養学的用途のためのものである場合は、フロロタンニンを試料から除去することが望ましくあり得る。
【００４５】
別の態様において、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含む、グルカンの精製プロセスを提供する。グルカンは上記の任意のグルカンであり得る。本発明のこのプロセスにより、フロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンが得られる。したがって、別の態様において、本発明はまた、フロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンを提供する。本発明のグルカンは、本発明の該プロセスによって取得されているか、または取得可能であり得る。また、本発明の該プロセスは、他の夾雑物、例えば、グルカン中に存在し得る他の有機分子をグルカンから分離するためにも使用され得る。
【００４６】
フロロタンニンをグルカンから分離する工程は、グルカンを使用のために処理する前に行なわれ得る。例えば、この工程は、担体タンパク質とのグルカンの結合体化（後述）前に行なわれ得る。特に、この工程は、結合体化前にグルカンを活性化または官能性付与する前に行なわれ得る。別の例では、この工程は、グルカンを栄養製品に加工する前に行なわれる。
【００４７】
本発明のこのような態様のグルカンは、フロロタンニン夾雑物を減少させた。典型的には、フロロタンニン夾雑物はＵＶ／ＶＩＳ分光法によって測定される。約２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度ピークは、一般的にフロロタンニン夾雑物を示す。このフロロタンニン夾雑物が存在すると、本発明の方法では、約２７０ｎｍにおける吸光度が小さくなる。同様に、グルカンは、約２７０ｎｍにおける吸光度が小さくなる。好ましくは、グルカンは、２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度がほとんど示されない。これは、約２７０ｎｍにおいて吸収ピークが示される先行技術のグルカンと比べて、特別な利点である。例えば、グルカンは水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有する。＜０．１５、＜０．１０、さらには＜０．０５の吸光度が好ましい。グルカンのＵＶ吸光度スペクトルは、他の様式でも特徴付けられ得る。例えば、２２０ｎｍ〜３００ｎｍのＵＶスペクトルは、２７０ｎｍ付近にショルダーもピークも示さない；２５０ｎｍ〜２７５ｎｍのＵＶスペクトルは増大しない；および／または２５０ｎｍ〜２７５ｎｍのＵＶスペクトルは、最大点も変曲点も有しない。また、２８０〜３２０領域（例えば、約３１０ｎｍ）におけるＵＶ吸光度ピークもフロロタンニン夾雑物を示すものであり得る（［２９］）。このフロロタンニン夾雑物が存在すると、本発明の方法では、２８０〜３２０領域における吸光度が小さくなる。同様に、グルカンは、２８０〜３２０領域における吸光度が小さくなる。好ましくは、グルカンは、この領域におけるＵＶ吸光度がほとんど示されない。例えば、グルカンは水中１ｍｇ／ｍｌで、３１０ｎｍにおいて０．１０未満のＵＶ吸光度を有する。
【００４８】
ＵＶ／ＶＩＳ分光法を行なう任意の適当な方法を用いて、グルカンのフロロタンニン夾雑物が測定され得る。例えば、本発明者らは、適当なＵＶ／ＶＩＳスペクトルが、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＡＭＢＤＡＴＭ２５分光測光器を使用し、室温および室内圧で、水中１ｍｇ／ｍｌのグルカンを内包する１ｃｍの光路長を有する石英セルを用いて得られ得ることを見い出した。当業者であれば、ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを得るための他の適当な方法および条件を選択することができよう。
【００４９】
フロロタンニンの他の測定方法は、当該技術分野で知られている。例えば、参考文献３０では、フロロタンニンの検出および定量に高速液体クロマトグラフィーが使用された。当業者であれば、本発明におけるフロロタンニン夾雑物の測定に適した方法を選択することができよう。
【００５０】
本発明のこの態様のプロセスは、さらに、グルカンの残留フロロタンニン夾雑物を測定する後続の工程を含んでいてもよい。このようにして、グルカンのフロロタンニン夾雑物が減少したことが確認され得る。フロロタンニン夾雑物は、任意の適当な方法、例えば、上記の方法によって測定され得る。
【００５１】
フロロタンニンはグルカンから、任意の適当な方法によって分離され得る。例えば、濾過法が使用され得る。当業者であれば、フロロタンニンをグルカンから分離するのに適した特性を有するフィルタを選択することができよう。典型的には、フロロタンニンをグルカンから分離するために使用されるフィルタは、デプスフィルタである。デプスフィルタは当業者に周知である。好適なデプスフィルタとしてはＣｕｎｏＴＭＳＰフィルタが挙げられ、これは、無機フィルタ助剤、セルロースおよびフィルタマトリックスに正の電荷を付与する樹脂で構成されたフィルタ媒体を有するものである。例えば、本発明者らは、ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタが特に有効であることを見い出した。しかしながら、他のデプスフィルタおよび他の濾過方法もまた使用され得る。例えば、ゲル濾過が使用され得る。また、炭素系フィルタも好適であり得る。炭素系フィルタは、当業者に周知である。このフィルタは、典型的には、試料精製のためのフィルタとしての機能を果たすゆるい顆粒状活性炭素床（ｌｏｏｓｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｂｅｄ）または圧縮型もしくは押出型活性炭素ブロック（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｂｌｏｃｋ）で構成されている。あるいはまた、クロマトグラフィー手順を用いてフロロタンニンをグルカンから分離してもよい。例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーが使用され得、この場合、フロロタンニンまたはグルカンが樹脂上に保持される。
【００５２】
グルカンからのフロロタンニンの分離は、１回（もしくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など）またはそれ以上の下位工程（ｓｕｂ−ｓｔｅｐ）で行なわれ得る。例えば、本発明者らは、デプスフィルタ（例えば、ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタ）を用いた３回の濾過下位工程がフロロタンニン夾雑物を減少させるのに特に有効であることを見い出した。
【００５３】
当業者は、必要とされるフロロタンニン夾雑物の低減がもたらされる他の分離手法および条件を特定することができよう。例えば、分離手法および条件は、試験分離工程を行ない、次いで、上記の方法によって残留フロロタンニン夾雑物を測定することにより最適化され得る。
【００５４】
結合体
純粋なβ−グルカンは免疫原として不充分である。したがって、防御的有効性のため、本発明で使用されるβ−グルカンは、好ましくは、担体タンパク質に結合体化させる。炭水化物抗原の免疫原性を高めるための担体タンパク質との結合体化の使用は、よく知られており［例えば、参考文献３１〜３９などに概説］、特に、小児科用ワクチンに使用される［４０］。
【００５５】
本発明は、（ａ）（ｉ）上記規定のグルカンと（ｉｉ）担体分子の結合体；ならびに（ｂ）上記規定のアジュバントを含む組成物を提供する。
【００５６】
担体分子はグルカンに、直接またはリンカーを介して共有結合により結合体化され得る。任意の適当な結合体化反応が使用され得、必要に応じて任意の適当なリンカーが使用され得る。
【００５７】
担体に対するグルカン抗原の結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリジン残基の側鎖内、またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ２基によるものである。グルカンが遊離アルデヒド基を有する場合、これは該担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によって結合体が形成され得る。また、担体に対する結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基によるものであってもよい。あるいはまた、グルカン抗原は担体に、リンカー分子を介して結合され得る。
【００５８】
グルカンは、典型的には、結合体化前に活性化または官能性付与させる。活性化は、例えば、シアニル化試薬（ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［４１，４２など］）など）を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（参考文献４３の序論も参照のこと）を使用するものである。
【００５９】
タンパク質との直接結合は、例えば、参考文献４４および４５に記載のような、グルカンの酸化、続いてタンパク質の還元的アミノ化を含み得る。
【００６０】
リンカー基を介した結合は、任意の既知の手順（例えば、参考文献４６および４７に記載の手順）を用いて行なわれ得る。典型的には、リンカーは、グルカンのアノマー炭素を介して結合される。好ましい型の結合はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にアジピン酸をカップリングさせ（例えば、ジイミド活性化を使用）、次いで、得られた糖−アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングさせることにより形成され得る［３５，４８，４９］。同様に好ましい型の結合はグルタル酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ２基にグルタル酸を同様にしてカップリングさせることにより形成され得る。また、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｄ）およびグルタル酸リンカーは、グルカンとの直接カップリングによって、すなわち、事前に遊離基（例えば、遊離−ＮＨ２基）をグルカンに導入せずに、続けて、得られた糖−アジピン酸／グルタル酸中間体にタンパク質をカップリングさせることによっても形成され得る。別の好ましい型の結合はカルボニルリンカーであり、これは、修飾グルカンの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［５０，５１］後、タンパク質との反応によってカルバメート結合を形成することによっても形成され得る。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［５２］、ニトロフェニルエチルアミン［５３］、ハロゲン化ハロアシル［５４］、グリコシド結合［５５］、６−アミノカプロン酸［５６］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［５７］、アジピン酸ジヒドラジド ＡＤＨ［５８］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５９］などが挙げられる。また、カルボジイミド縮合を使用することもできる［６０］。
【００６１】
二官能性リンカーを使用し、グルカン内のアミン基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にカップリングさせるための第１の基と、担体にカップリングさせる（典型的には、担体内のアミンにカップリングさせる）ための第２の基を提供してもよい。あるいはまた、第１の基は、グルカンに直接（すなわち、事前に基（例えば、アミン基）をグルカンに導入せずに）カップリングできるものである。
【００６２】
一部の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、このように、グルカン上のアミン基（−ＮＨ２）と反応できるものである。この反応は、典型的にはアミン水素の求電子性置換を伴う。他の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、グルカンと直接反応できるものである。どちらの組の実施形態も、二官能性リンカー内の第２の基は、典型的には、担体上のアミン基と反応できるものである。この場合も、この反応は、典型的にはアミンの求電子性置換を伴う。
【００６３】
グルカンと担体の反応がともにアミンを伴う場合、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ２）４−または−（ＣＨ２）３である。
【００６４】
同様に、グルカンとの反応が直接カップリングを伴い、担体との反応がアミンを伴う場合も、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、グルカン／アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、一方はグルカンと反応でき、他方はアミンとでき、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ２）４−または−（ＣＨ２）３−である。
【００６５】
先の２つの段落で記載した二官能性リンカーにおける使用のための他のＸ基は、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと結合させるとエステルを形成するもの、例えば、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００６６】
本発明での使用のためのさらなる二官能性リンカーとしては、アクリロイルハロゲン化物（例えば、塩化物）およびハロアシルハライドが挙げられる。
【００６７】
リンカーは、一般的に、グルカンとのカップリング中に、グルカンに対してモル過剰で添加する。
【００６８】
好ましい担体タンパク質は、細菌毒素（ジフテリアあるいは破傷風毒素など）もしくはトキソイドまたはその変異体である。これらは、結合体ワクチンに一般的に使用されている。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体が特に好ましい［６１］。
【００６９】
他の適当な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［６２］、合成ペプチド［６３，６４］、熱ショックタンパク質［６５，６６］、百日咳タンパク質［６７，６８］、サイトカイン［６９］、リンホカイン［６９］、ホルモン［６９］、増殖因子［６９］、種々の病原体由来の抗原由来の多数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［７０］（Ｎ１９［７１］など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［７２〜７４］、ニューモリシン［７５］またはその非毒性誘導体［７６］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７７］、鉄分取込みタンパク質［７８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［７９］、組換え緑膿菌エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［８０］などが挙げられる。担体タンパク質の混合物を使用することも可能である。単一の担体タンパク質が多数の異なるグルカンを担持していてもよい［８１］。
【００７０】
結合体は、過剰の担体（ｗ／ｗ）または過剰のグルカン（ｗ／ｗ）を有するもの、例えば、１：５〜５：１の比で有し得る。過剰の担体タンパク質を有する結合体が典型的であり、例えば、０．２：１〜０．９：１の範囲であるか、または等重量である。結合体には、少量の遊離（すなわち、結合体化されていない）担体が含まれていてもよい。所与の担体タンパク質が本発明の組成物中に、遊離形態と結合体化形態の両方で存在する場合、結合体化されていない形態は、好ましくは、組成物全体の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２％未満（重量基準）で存在する。
【００７１】
結合体が本発明の免疫原性組成物のグルカン成分を構成する場合、該組成物に、免疫原として遊離担体タンパク質も含まれることがあり得る［８２］。
【００７２】
結合体化後、遊離グルカンと結合体化グルカンを分離してもよい。多くの適当な方法があり、例えば、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などがある［参考文献８３，８４などもまた参照のこと］。タンジェンシャルフロー限外濾過が好ましい。
【００７３】
結合体内のグルカン部分は、好ましくは、上記規定の低分子量グルカンである。オリゴ糖は、典型的には、結合体化前にサイズ調整する。
【００７４】
タンパク質−グルカン結合体は、好ましくは、水および／または生理学的緩衝液に可溶性である。
【００７５】
本発明者らは、グルカンと担体タンパク質間にスペーサーが存在させると、免疫原性が改善され得ることを見い出した。これに関連して、「スペーサー」は、単一の共有結合よりも長い部分である。このスペーサーは、上記のようなリンカーであってもよい。あるいはまた、これは、グルカンとリンカーの間に共有結合された部分であってもよい。典型的には、該部分はグルカンに、リンカーまたは担体とのカップリング前に共有結合させる。例えば、スペーサーは、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）、典型的には１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を有する直鎖アルキルを含むＹ部分である。本発明者らは、６個の炭素原子を有する直鎖アルキル（すなわち、−（ＣＨ２）６）が特に好適であり、短鎖（例えば、−（ＣＨ２）２）のものよりも大きな免疫原性がもたらされ得ることを見い出した。典型的には、Ｙはグルカンのアノマー炭素に、通常、−Ｏ-結合を介して結合される。しかしながら、Ｙは、グルカンの他の部分に連結されていてもよい、および／または他の結合を介して連結されていてもよい。Ｙの他端は、任意の適当な結合によってリンカーに結合させる。典型的には、Ｙは、上記のような二官能性リンカーに対する結合が容易になるようにアミン基で終結させたものである。したがって、このような実施形態では、Ｙはリンカーに−ＮＨ−結合によって結合される。したがって、下記の構造：
【００７６】
【化３】
（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した。Ｙは、上記のとおりである。「ＬＩＮＫＥＲ」は、上記のような任意選択のリンカーであり、「ＣＡＲＲＩＥＲ」は、上記のような担体分子である）
を有する結合体が、本発明における使用に具体的に想定される。
【００７７】
本発明における使用に具体的に想定される別の結合体は、下記の構造：
【００７８】
【化４】
（式中、ｎは、０〜９、例えば１〜７または２〜６の範囲である。好ましくは、ｎは、３〜４または１〜３の範囲である。本発明者らは、ｎ＝２が好適であることを見い出した。Ｙは、上記のとおりである。「ＬＩＮＫＥＲ」は、上記のような任意選択のリンカーであり、「ＣＡＲＲＩＥＲ」は、上記のような担体分子である）
を有するものである。
【００７９】
一態様において、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこの方法によって得られる結合体を提供する。本発明者らは、リン酸ナトリウムが、該緩衝液のリン酸塩の好適な形態であることを見い出した。緩衝液のｐＨは、７．０〜７．５、特に７．２に調整され得る。結合体化工程は、典型的には、２０〜２００ｍＭ、例えば５０〜１５０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる。特に、本発明者らは、９０〜１１０ｍＭ、例えば約１００ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液が好適であることを見い出した。結合体化工程は、通常、室温で行なわれる。同様に、結合体化工程は、通常、室内圧で行なわれる。典型的には、グルカンを上記のようなリンカーに、結合体化工程前に結合させる。特に、グルカンを上記のような二官能性リンカーに結合させるのがよい。リンカーの遊離端は、担体タンパク質との結合体化を容易にする基を含むものであってもよい。例えば、本発明者らは、リンカーの遊離端にエステル基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を含めるのがよいことを見い出した。
【００８０】
アジュバント
β−グルカンそれ自体がアジュバントであると報告されているが、免疫原性組成物は、この組成物を受ける患者において誘起される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する機能を果たし得る別のアジュバントを含んでいてもよい。本発明で使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００８１】
・無機質含有組成物、例えば、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献８５に開示された「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、無機質含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化され得る［８６］。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上のためだけに使用され、存在している実際の化合物の正確な記述でもない（例えば、参考文献１７０の第９章参照）。本発明では、アジュバントとして一般に使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはアルミニウムのオキシ水酸化物塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含まれている（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）。このアジュバントは、沈降によって得られ得、沈降時の反応条件および濃度は、該塩中のヒドロキシルのリン酸塩の置換の程度に影響を及ぼす。本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの混合物を使用してもよい。この場合、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムを多く、例えば、少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在させるのがよい。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００８２】
・サポニン［参考文献１７０の第２２章］、これは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献８７に開示されている。サポニン製剤には、ステロール（コレステロールなど）が含まれることがあり得る［８８］。サポニンとコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る［参考文献１７０の第２３章］。また、ＩＳＣＯＭは、典型的にはリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどを含むものである。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種類以上を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献８８〜９０にさらに説明されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗剤を含まないものであり得る［９１］。サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献９２と９３を見るとよい。
【００８３】
・細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）ならびに、特に、その無毒化誘導体（参考文献３参照）、例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［９４］またはＣＴ−Ｅ２９Ｈ［９５］として知られている変異体毒素など。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献９６に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献９７に記載されている。
【００８４】
・生体接着剤および粘膜接着剤、例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［９８］またはキトサンおよびその誘導体［９９］など。
【００８５】
・生分解性で非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）で形成されたミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、任意選択で処理して、負の電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正の電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤）を有するようにしたもの。
【００８６】
・リポソーム（参考文献１７０の第１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１００−１０２に記載されている。
【００８７】
・ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）など。
【００８８】
・ポリオキシドニウムポリマー［１０３，１０４］または他のＮ−酸化型ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【００８９】
・メチルイノシン５’−モノリン酸塩（「ＭＩＭＰ」）［１０５］。
【００９０】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１０６］、例えば、式：
【００９１】
【化５】
（式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝状の非置換または置換飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）
を有するもの、またはその薬学的に許容され得る塩もしくは誘導体。例としては、限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられる。
【００９２】
・ＣＤｌｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１０７〜１１４］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
【００９３】
・γイヌリン［１１５］またはその誘導体、例えば、アルガムリンなど。
【００９４】
・水中油型乳剤。種々のかかる乳剤が知られており、典型的には、少なくとも１種類の油と、少なくとも１種類の界面活性剤を含むものであり、油類（１種類または複数種）および界面活性剤（１種類または複数種）は生分解性（代謝性）および生体適合性である。乳剤中の油滴は、一般的には５μｍ未満の直径であるが、さらにはサブミクロン直径を有するものであってもよい。このような小サイズは、マイクロフルイダイザーにより得られ、安定な乳剤が得られる。濾過滅菌に供することができるため、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【００９５】
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシン残基に連結された非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列）、またはＣｐＩモチーフ（イノシンに連結されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含むものなど。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド修飾／類似体（ホスホロチオエート修飾）を含むものであってもよく、二本鎖（ＲＮＡを除く）であっても、単鎖であってもよい。参考文献１１６、１１７および１１８には、可能な類似体置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１９〜１２４にさらに論考されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９に対するものである（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）［１２５］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘発に特異的であり得（ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）、あるいは、Ｂ細胞応答の誘発に対してより特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２６〜１２８に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献１２５および１２９〜１３１を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても知られている。他には、ＣｐＧ １８２６がある。ＣｐＧ配列の使用の代替法として、あるいはさらに、ＴｐＧ配列が使用され得［１３２］、このオリゴヌクレオチドには、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、１つより多くの連続チミジンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１３２に開示されたＴＴＴＴ）、および／または＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。例えば、１つより多くの連続シトシンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１３２に開示されたＣＣＣＣ）、および／または＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。これは、１００個より少ないヌクレオチドを含むものであるのがよい。
【００９６】
特に有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチド系アジュバントは、ＩＣ３１ＴＭ［１３３］として知られているものである。したがって、本発明で使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオンポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）の混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオンポリマーは、１１ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドであり得る。
【００９７】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬＴＭ」としても知られている）［１３４〜１３７］。水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズ（例えば、＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍの直径）を有するミセル状の凝集物または粒子を形成し得る。これらのいずれかまたは両方が本発明で使用され得、常套的なアッセイによって、良い方の粒子が選択され得る。より小さい粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液が得られるのに充分に小さい）の方が、活性が優れるため、本発明による使用に好ましい［１３８］。好ましい粒子は２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満の平均直径を有するものであり、さらには、１００ｎｍ未満の平均直径を有するものであってもよい。しかしながら、ほとんどの場合、平均直径は５０ｎｍより小さくない。
【００９８】
・イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１３９，１４０］、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［１４１］など、およびその類似体；ならびにその塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献１４２〜１４６を見るとよい。
【００９９】
・チオセミカルバゾン化合物（参考文献１４７に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４７に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。
【０１００】
・トリプタントリン化合物（参考文献１４８に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４８に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。
【０１０１】
・ヌクレオシド類似体、例えば：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１０２】
【化６】
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１４９〜１５１に開示された化合物ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１５２］など。
【０１０３】
・参考文献１５３に開示された化合物、例えば：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１５４，１５５］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１５６］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンズアゾール化合物［１５７］。
【０１０４】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（ＲＣ−５２９［１５８，１５９］など）。
【０１０５】
・ホスファゼン（例えば、参考文献１６０および１６１に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）など）
・置換型尿素あるいは式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩：
【０１０６】
【化７】
（参考文献１６２に規定、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、ＥＲ８０４０５８）、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、ＥＲ８０３０２２または「ＥＲ８０４０５７」など、例えば：
【０１０７】
【化８】
・ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体（参考文献１６３および１６４に記載）。
【０１０８】
・リン酸基含有非環式主鎖に連結された脂質を含む化合物（ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１６５，１６６］：
【０１０９】
【化９】
など）。
【０１１０】
このようなおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１７０および１７１に、より詳細に論考されている。
【０１１１】
本発明で有用な具体的な水中油型乳剤アジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１１２】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロン乳剤。この乳剤の組成は、容量基準で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量の観点からは、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として知られており［１６７〜１６９］、参考文献１７０の第１０章および参考文献１７１の第１２章に、より詳細に記載されている。ＭＦ５９乳剤は、好都合には、クエン酸イオンを含むもの（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）である。
【０１１３】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。また、これは、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含み得る。この乳剤は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定な乳剤が得られるため、好ましくは≦１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。かかる乳剤の一例は、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解させて２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでこの混合物を微小流動化することにより作製され得る。得られる乳剤は、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロン油滴を有し得る。
【０１１４】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の乳剤。この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）もまた含み得る。この乳剤は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１１５】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含む乳剤。この乳剤は、これらの３種類の成分を、約７５：１１：１０の質量比で含むもの（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）を含み得、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むはずである。また、この乳剤は、スクアレンを含み得る。また、この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含み得る。水相には、リン酸緩衝液が含まれ得る。
【０１１６】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で製剤化され得る。この乳剤は、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、トレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント［１７２］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）に使用されている。また、「ＡＦ」アジュバント［１７３］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用することもできる。微小流動化が好ましい。
【０１１７】
・０．５〜５０％の油類、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン系界面活性剤を有する乳剤。参考文献１７４に記載のように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴のサイズが好都合である。
【０１１８】
・非代謝性の油類（軽鉱油など）と、少なくとも１種類の界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）とのサブミクロン水中油型乳剤。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン脂肪親和性結合体（例えば、ＧＰＩ−０１００（参考文献１７５に記載、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって作製））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を含めてもよい。
【０１１９】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合している乳剤［１７６］。
【０１２０】
好ましい乳剤アジュバントは、≦ｌμｍ、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍまたはより小さい平均液滴サイズを有するものである。このような液滴サイズは、微小流動化などの手法によって簡便に得られ得る。
【０１２１】
一部の実施形態において、特に、β−グルカンがラミナリン型である場合、該組成物は、好ましくは、アジュバントとして完全フロイントアジュバントまたは野生型コレラ毒素を加えたものではない。
【０１２２】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には混合された状態である。
【０１２３】
アルミニウム塩が結合体のアジュバントとして使用される場合、組成物中の結合体の少なくとも５０質量％、例えば、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％または１００％が塩に吸着されることが好ましい。＞９９％の吸着は、水酸化物塩を用いて容易に達成され得る。
【０１２４】
該組成物は、２種類以上の前記アジュバントを含むものであってもよい。実施例に示されるように、かかる併用により、グルカン結合体によって誘起される免疫応答が改善され得る。個々のアジュバントは、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答のいずれかを優先的に誘導するものであり得、有用なアジュバントの組合せは、Ｔｈ２アジュバント（例えば、水中油型乳剤またはアルミニウム塩）と、Ｔｈ１アジュバント（例えば、３ｄＭＰＬ、サポニン、または免疫刺激性オリゴヌクレオチド）の両方を含み得る。例えば、該組成物は、好都合には：アルミニウム塩と免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの両方；アルミニウム塩と式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の両方；水中油型乳剤と式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の両方；水中油型乳剤と免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドのの両方；アルミニウム塩とα−グリコシルセラミドの両方；水中油型乳剤とα−グリコシルセラミドの両方；水中油型乳剤と３ｄＭＰＬの両方；水中油型乳剤とサポニンの両方；などを含み得る。
【０１２５】
医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のグルカンまたは結合体、（ｂ）上記のようなアジュバント、および（ｃ）薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。かかる担体の充分な論考は、参考文献１７７において入手可能である。
【０１２６】
微生物感染症は、身体の種々の領域を侵すため、本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい。該組成物は、局所投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（任意選択でフレーバーを添加）として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを使用し、吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、滴剤、スプレー剤または粉末剤として調製され得る［例えば、１７８］。
【０１２７】
医薬組成物は、好ましくは滅菌されたものである。好ましくは発熱物質を含まない。
【０１２８】
該組成物は、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８、一般的にはｐＨ７前後に緩衝化したものである。該組成物は、水性であってもよく、凍結乾燥させたものであってもよい。本発明者らは、本発明の医薬組成物の液状製剤は不安定であり得ることを見い出した（図１７および１８）。したがって、凍結乾燥製剤が好ましかろう。他方において、本発明者らはまた、水中油型乳剤アジュバント、特にＭＦ５９によって医薬組成物の液状製剤の安定性が改善され得ることを見い出した（図１７および１８）。したがって、医薬組成物を液状製剤として調製する場合、アジュバントに水中油型乳剤を含めることが好ましい。
【０１２９】
また、本発明は、本発明の医薬組成物を内包する送達デバイスを提供する。デバイスは、例えば、シリンジまたは吸入器であり得る。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、免疫学的有効量のグルカン免疫原を含む免疫原性組成物である。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部としての個体への該量の投与が、処置または予防に有効であることを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）の年齢、分類群、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、病状に対する処置担当医師の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲を含むことが予測される。
【０１３１】
製剤化したら、本発明の組成物を被験体に直接投与してもよい。処置対象の被験体は動物であり得る；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１３２】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既に存在する感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来的な感染を予防するため）に使用され得る。治療的免疫処置は、免疫無防備状態の被験体におけるカンジダ感染の処置に特に有用である。
【０１３３】
医療処置および用途
また、本発明は、医薬における使用のための、例えば、哺乳動物の抗体応答を惹起することにおける使用のための、本発明のアジュバント添加グルカンまたは結合体を提供する。
【０１３４】
また、本発明は、本発明のアジュバント添加グルカン、結合体または医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法を提供する。
【０１３５】
また、本発明は、哺乳動物において微生物感染を予防または処置するための医薬の製造における（ｉ）本発明のグルカンまたは結合体および（ｉｉ）アジュバントの使用を提供する。
【０１３６】
これらの方法および使用によってもたらされる免疫応答としては、一般的に抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が挙げられる。糖免疫処置後の抗体応答の評価方法は、当該分野で周知である。抗体応答は、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＧ応答である。免疫応答は、予防的および／または治療的であり得る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【０１３７】
グルカン（特に、β−グルカン）は、ほぼすべての病原性真菌（特に、免疫無防備状態の被験体の感染症に関与するもの）、また細菌病原体および原生動物の必須かつ主要な多糖構成成分であるため、抗グルカン免疫は、広範な病原体および疾患に対して有効性を有し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの免疫処置に生成される抗グルカン血清は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと交差反応性である。このようなヒト感染性真菌因子には化学療法が不充分であるため、抗真菌薬耐性が生じるため、ならびに予防用および治療用ワクチンの必要性の認識が増大しているため、広域スペクトル免疫は特に有用である。
【０１３８】
本発明の使用および方法は、カンジダ属種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）；クリプトコックス属種（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなど）；エンテロコッカス属種（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓなど）；連鎖球菌属種（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなど）；リーシュマニア属種（Ｌ．ｍａｊｏｒなど）；アカントアメーバ属種（Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉなど）；アスペルギルス属種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｌａｖｕｓなど）；ニューモシスティス属種（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉなど）；ミコバクテリウム属種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；シュードモナス属種（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）；ブドウ球菌属種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）；サルモネラ属種（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなど）；コクシジオイデス属種（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓなど）；白癬菌属種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍなど）；ブラストミセス属種（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓなど）；ヒストプラスマ属種（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍなど）；パラコクシジオイデス属種（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど）；フィチウム属種（Ｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍなど）；ならびにエシェリキア属種（大腸菌など）の感染症の処置／防御に特に有用である。
【０１３９】
該使用および方法は、限定されないが：カンジダ症（例えば、肝脾カンジダ症、浸潤性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症および播種性カンジダ症）；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコックス症、皮膚真菌症、スポロトリクス症および他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジウム症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスティス症、鵞口瘡、結核症、ミコバクテリア症、呼吸器系感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、セプシス、敗血症、皮膚および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎ならびに溶血性尿毒症症候群などの疾患の予防／処置に特に有用である。抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ活性は、ＡＩＤＳ患者の感染症の処置に特に有用である。
【０１４０】
免疫処置の有効性は、該組成物の投与後のβ−グルカン（例えば、抗β−グルカン抗体）に対する免疫応答をモニタリングすることにより試験することができる。治療的処置の有効性は、本発明の組成物の投与後の微生物感染をモニタリングすることにより試験することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は、一般的には患者に直接投与する。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に）、または直腸内、経口、膣内、局所、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは肺内投与によって行なわれ得る。注射または鼻腔内投与が好ましい。皮下または腹腔内投与が特に好ましい。また、筋肉内投与も好ましい。
【０１４２】
本発明は、全身性および／または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。
【０１４３】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人両方の処置に使用され得る。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチン接種に好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、または若年齢者（例えば、≦５歳）である。ワクチンは、これらの群のみに適しているのではなく、集団において、より一般的に使用され得る。
【０１４４】
処置は、単回用量スケジュールであってもよく、複数用量スケジュールであってもよい。複数用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび／または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールでは、種々の用量を同じ経路で与えてもよく、異なる経路で与えてもよく、例えば、非経口で初回免疫刺激し、経粘膜で追加免疫刺激する、経粘膜で初回免疫刺激し、非経口で追加免疫刺激するなどである。免疫未処置患者には１回より多くの投与（典型的には２回の投与）が特に有用である。複数用量は、典型的には少なくとも１週間空けて投与する（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。複数用量スケジュールを使用する場合、少なくとも１回の用量にはアジュバント添加グルカンを含めるが、他の用量（典型的には後の方の用量）は、アジュバントなしのグルカンを含むものであってもよい。同様に、少なくとも１回の用量には、結合体化グルカンを含めるのがよいが、他の用量（典型的には後の方）は、結合体化されていないグルカンを含むものであってもよい。
【０１４５】
本発明の結合体を非グルカン抗原と併用し、多様な病原体に対する同時免疫処置のための単一の組成物にしてもよい。併用ワクチンの作製の代替法として、結合体を患者に、他のワクチンと実質的に同時（例えば、同じ医療診察中または健康管理従事者もしくはワクチン接種施設への訪問時）に投与してもよい。このような併用ワクチンにおける使用のため、または同時投与のための抗原としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌免疫原が挙げられる。
【０１４６】
本発明の組成物は、特に患者が既に感染している場合、抗真菌薬とともに使用され得る。抗真菌薬により即時性の治療効果がもたらされ、一方、免疫原性組成物により長期持続性効果がもたらされる。好適な抗真菌薬としては、限定されないが、アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール）、ポリエン（例えば、アンフォテリシンＢ）、フルシトシン、およびスクアレンエポキシダーゼインヒビター（例えば、テルビナフィン）が挙げられる［参考文献１７９も参照のこと］。抗真菌薬と免疫原性組成物は、別々に投与してもよく、併用して投与してもよい。別々に投与する場合、典型的には互いに７日以内に投与する。免疫原性組成物を最初に投与した後、抗真菌薬を１回より多く投与するのがよい。
【０１４７】
定義
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、排他的にＸからなるものであってもよく、何か付加的なものを含むもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）であってもよい。
【０１４８】
文言「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全にないものであり得る。必要に応じて、文言「実質的に」は、本発明の定義で省略されていることがあり得る。
【０１４９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５０】
特に記載のない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、なんら特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いに合わせ、次いで、この組合せを第３の成分と合わせてもよいなどである。
【０１５１】
動物（特にウシ）由来の物質を細胞の培養に使用する場合、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得られたものであるべきである。全般的には、動物由来物質の完全非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０１５２】
化合物を身体に組成物の一部として投与する場合、該化合物を、代替的に、適当なプロドラッグに置き換えてもよい。
【実施例】
【０１５３】
発明を実施するための形態
カードラン結合体化（１）
＞１００ｋＤａの初期ＭＷを有するカードランを、ＤＭＳＯ中ＨＣｌ（０．５Ｍ）を用いた酸加水分解により、８５℃で１０分間処理した。この加水分解生成物は、２５単位前後のＤＰを有していた。
【０１５４】
加水分解された物質をリン酸ナトリウム緩衝液（４００ｍＭ，ｐＨ６．８）で中和し、水で希釈して、出発物質の１０：１希釈液を得た。最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。希釈後、一部沈降が検出され得た。この沈殿物は、おそらく高ＭＷ糖である。
【０１５５】
酢酸アンモニウムを添加し、次いでナトリウムシアノボロヒドリドを添加した。ｐＨを７．０に調整した後、混合物を３７℃で３〜５日間インキュベートした。この処理により、第１級アミノ基がカードラン断片の還元末端に導入された。次いで、このアミノ糖を、３ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。アミノ基をＨａｂｅｅｂ法によって概算した。
【０１５６】
乾燥させたアミノオリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させ、次いで９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを２００ｍＭの最終濃度で添加した。得られた溶液に、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、４８０ｍＭの最終濃度で添加した。このようにして生成したエステル基を、放出されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の解析によって概算した。
【０１５７】
乾燥させた活性化オリゴ糖を、ＣＲＭ１９７含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。
【０１５８】
次いで、この結合体を、３０ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。結合体を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＮＭＲによって特徴付けた。また、この糖（全体および結合体化されていない糖）ならびにタンパク質の含有量を概算した。
【０１５９】
担体としてＣＲＭ１９７の代わりに破傷風トキソイドを使用し、同様の作業を行なった。
【０１６０】
調製した５種類の結合体のロットについて、糖：タンパク質の比は以下のとおりであった（過剰の担体）：
【０１６１】
【数１】
図１は、実施例の結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図２は、そのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【０１６２】
ラミナリン結合体化および吸着（２）
ラミナリン結合体を、ＣＲＭ１９７担体を使用し、参考文献２および３に開示されたようにして調製した。１つのそのような結合体は、糖：タンパク質質量比０．４：１を有するものであった。精製後、０．７％の遊離グルカン（結合体化されていない）が残存していた。図３は、結合体化前の担体タンパク質、および最終結合体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ解析を示す。
【０１６３】
担体としてＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドを使用し結合体を同様にして調製した。
【０１６４】
５種類の結合体の他のロットでは、糖：タンパク質の比は以下のとおりであった（過剰の担体）：
【０１６５】
【数２】
ＣＲＭ１９７結合体（「ＣＲＭ−Ｌａｍ」）を水酸化アルミニウム塩と、最終アジュバント濃度２ｍｇ／ｍｌで合わせた。塩化ナトリウムを９ｍｇ／ｍｌで、およびリン酸ナトリウムを１０ｍＭで含めた。最終組成物はｐＨ７．０を有し、４６．６μｇ／ｍｌのグルカンを含んでおり、したがって、１５０μｌの投与容量で７μｇ／用量を与えた（マウス試験に適する）。
【０１６６】
最終組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。また、吸着の程度を調べるため、遠心分離し、上清みを並行して解析した。また、ＴＣＡ沈降も使用し、この場合も上清みを解析した。比較のため、非吸着物質も解析し、これは、遊離形態および吸着形態両方の結合体化されていないＣＲＭ１９７であった。アジュバントの存在下では、ＣＲＭ−Ｌａｍおよびまたは結合体化されていないＣＲＭいずれの上清みにおいても、バンドは検出されなかった。
【０１６７】
また、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって上清みを解析することにより、吸着を評価した。２１４ｎｍにピークが測定され、ＣＲＭ−Ｌａｍの吸着の程度は９９．７％と算出された。
【０１６８】
結合体化（３）
合成カードラン（１５ｍｅｒ）およびラミナリン（１７ｍｅｒ）の結合体を、図４に記載の方法に従って調製した。簡単には、表示した合成オリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させた。次いで、９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを最終濃度２００ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体では、グルタル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度２４０ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１７ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭの結合体では、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度４８０ｍＭまで添加した。次いで、この活性化オリゴ糖を、８０％ｖ／ｖジオキサンを用いた沈降によって精製した。各反応で生成したエステル基の数を、放出されたＮヒドロキシスクシンイミド基の量を測定することにより概算した。次いで、乾燥させた活性化オリゴ糖を、３０ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。
【０１６９】
次いで、結合体をＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。糖およびタンパク質の含有量は、以下のとおりに概算された。
【０１７０】
【数３】
図５は、これらの結合体の７％ｔｒｉｓ−酢酸ゲル（２０μｇ負荷／ウェル）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【０１７１】
ラミナリン結合体化（４）
ラミナリン結合体のさらなるロットを、緩衝液中のリン酸塩の濃度を、ａ）１０ｍＭ（参考文献２および３のとおり、以下、本明細書において「ロット９」）；ｂ）２５ｍＭ；ｃ）５０ｍＭまたはｄ）１００ｍＭ（「ロット１０」）のいずれかとしたこと以外は、参考文献２および３に開示されたようにして調製した。次いで、結合体をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。ロット９では、その他のロットよりも大きな凝集が観察され、ロット１０では凝集は検出され得なかった（図６）。
【０１７２】
免疫原性試験（１）
免疫原性を試験するため、ラミナリン結合体化および吸着（２）で記載のようにして調製したラミナリン結合体を、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスにおいて試験した。
【０１７３】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量７μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、７および２１日目に投与した。血液試料を第０、２１および３５日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した［２，３］。
【０１７４】
第２群および第３群は、単に比較の目的で、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と組み合わせた結合体を用いて初回抗原刺激した（第１日）。第１群には、ＣＦＡ−アジュバント添加ラミナリンとＣＲＭ１９７を与えたが、これらは結合体化させたものではなかった。第４群は、結合体化されていないラミナリン＋ＣＦＡで初回抗原刺激した。第５群にはＣＦＡ単独を与えた。次いで、これらの５つの群に、アジュバントなしのラミナリンとＣＲＭ１９７の混合物（第１群）、アジュバントなしの結合体（第２群）、アジュバントなしのラミナリン（第３群および第４群）またはＰＢＳ（第５群）を、第７日および第２１日に与えた。
【０１７５】
第７群と第８群および第９群〜第１２群には、３回の同一用量の結合体化したラミナリンを、以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント；（ｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント；（ｃ）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＣｐＧ １８２６；（ｅ）（ａ）と（ｃ）の組み合わせ；（ｆ）（ｂ）と（ｃ）の組み合わせとともに与えた。第６群と第９群には、それぞれ、第７群と第８群と同様に与えたが、ラミナリンとＣＲＭ１９７を結合体化させなかった。
【０１７６】
抗グルカン抗体（ＧＭＴ）および第３５日目の応答マウス（％）の数を表１に報告する。
【０１７７】
【表１】
Ｌａｍ−ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン
Ｌａｍ＋ＣＲＭ＝ラミナリンとＣＲＭ１９７の併用、結合体化なし
Ｌａｍ＝結合体化されていないラミナリン、ＣＲＭ１９７なし
ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
この結果は、至適免疫応答には、結合体化と、少なくとも１種類のアジュバントの存在の両方が必要とされることを示す。Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの併用で、良好な結果が得られた。
【０１７８】
第２群と第１１群のマウスのＩｇＧ応答を、より詳細に試験した。３つの場合すべてにおいて、ＩｇＧサブクラス１と３が存在したが、サブクラス２ａと２ｂは存在しなかった。
【０１７９】
免疫原性試験（２）
さらなる研究において、それぞれ、カードラン結合体化（１）と、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製したカードラン結合体とラミナリン結合体の両方を、マウスに投与した。１つより多くのカードラン結合体のロットを試験した。
【０１８０】
実験は、結合体を５μｇの糖用量で使用したこと以外は、本質的に最初の試験と同じとした。結合体は、アジュバントなし、または以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント；（ｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント；（ｃ）（ａ）と１０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ １８２６の併用；（ｅ）（ｂ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの併用とともにのいずれかで投与した。
【０１８１】
抗グルカン抗体（ＧＭＴ）および第３５日目の応答マウス（％）の数を表２に報告する。
【０１８２】
【表２】
個々のアジュバントでも、ラミナリンおよびカードランの両方の場合で、ＧＭＴと応答マウスの割合の両方が増大され得たが、アジュバントの併用が特に有効であった。Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの併用で、良好な結果が得られた。
【０１８３】
すべての群においてＩｇＧ応答は、上記のように、主にサブクラス１および３におけるものであった。
【０１８４】
免疫原性試験（３）
さらなる実験では、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製したラミナリン結合体とカードラン結合体に、アジュバントとしてα−ガラクトシルセラミド（１００ｎｇ）またはＬＴ−Ｋ６３（２μｇ）もまた、単独または他のアジュバントとの併用のいずれかで加えた。また、ＣｐＧアジュバントも、３つの異なる用量（０．５μｇ、５μｇおよび１０μｇ）で試験した。詳細は、１群あたり８匹のマウスとしたこと以外は、先の免疫原性試験の場合と同様にした。結果を表３に示す。
【０１８５】
【表３】
この場合も、アジュバントの併用により最良の結果が得られたが、α−ＧａｌＣｅｒがそれ自体でカードラン結合体に対して有用であったことが例外であった。ＣｐＧアジュバントによる最良の結果は、中程度の用量で得られた。
【０１８６】
免疫原性試験（４）
１６匹の群のマウスに、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン（Ｌａｍ−ＣＲＭ、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製）で、異なるアジュバントと組み合わせて３回、腹腔内（ＩＰ）にて免疫処置した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。また、抗ラミナリン抗体レベルも、ＥＬＩＳＡにおいてＧＧ−Ｚｙｍをラミナリンに置き換えることにより、参考文献３に記載のようにして測定した。
【０１８７】
第３５日目におけるカンジダ細胞壁グルカンに対するＩｇＧ ＧＭＴを、図７（抗ＧＧＺｙｍ抗体レベル）と表４（抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベル）に示す。
【０１８８】
【表４】
この結果は、いくつかの異なるアジュバント製剤での糖結合体化ワクチンＬａｍ−ＣＲＭの免疫原性を示す。
【０１８９】
免疫原性試験（５）
さらなる研究において、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンまたはカードランを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに皮下または腹腔内投与によって投与した。結合体は、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０１９０】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に皮下または腹腔内投与によって投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１９１】
第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）；（ｂ）（ａ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ １８２６（１０μｇ）の組み合わせ；および（ｃ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第４群〜第６群は、それぞれ、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は第１群〜第３群と同様に処置した。第７群〜第９群は、それぞれ、ラミナリンをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第１群〜第３群と同様に処置した。同様に、第１０群〜第１２群は、それぞれ、カードランをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第４群〜第６群と同様に処置した。
【０１９２】
マウスへのラミナリン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図８に示す。皮下投与後の対応する結果を図９に示す。結果は、一般的に、結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られたことを示す。さらに、一般的に、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した方が良好な結果が得られた（特に、結合体を皮下投与によって投与した場合）。
【０１９３】
同様に、カードラン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１０に示す。皮下投与後の対応する結果を図１１に示す。ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した場合、結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られた。
【０１９４】
免疫原性試験（６）
別の試験において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランを、異なる用量の糖を用いてマウスに投与した。結合体は、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０１９５】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、８匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１９６】
第１群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、アジュバントなし、および糖用量５μｇで与えた。第２群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに糖用量５μｇで与えた。この群に投与した結合体の精製時には、リン酸緩衝液を使用した。第３群〜第６群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに、それぞれ、糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで与えた。これらの群に投与した結合体の精製時には、参考文献１８０に記載のように、ヒスチジン緩衝液を使用した。
【０１９７】
第７群〜第１２群は、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は、第１群〜第６群と同様に処置した。
【０１９８】
種々の糖用量のラミナリン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１２に示す。結果は、すべての用量で応答が見られ、最良の応答は糖用量５μｇで得られたことを示す。
【０１９９】
カードラン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１３に示す。この場合も、結果は、すべての糖用量で応答が見られたことを示す。最良の応答は、糖用量１０μｇと５μｇで得られた。
【０２００】
ラミナリン結合体投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１４に示す。抗ＧＧＺｙｍ抗体ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を、抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡのものと比較する。抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡを使用した方が高力価が観察された。
【０２０１】
免疫原性試験（７）
さらなる研究において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを種々の個々のアジュバントと合わせ、マウスに腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２０２】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１６匹の８つの群にて試験した。結合体を５μｇの糖用量で投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２０３】
第１群と第２群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを腹腔内投与によって、以下のアジュバント：（ａ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）；ならびに（ｂ）（４）高用量のＩＣ３１（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）とともに与えた。第３群と第４群は、それぞれ、結合体を皮下投与によって投与したこと以外は、第１群と第２群と同様に処置した。第５群と第６群は、それぞれ、結合体を筋肉内投与によって投与したこと以外は、第１群と第２群と同様に処置した。
【０２０４】
ラミナリン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン（抗ＧＧＺｙｍ）抗体（ＧＭＴ）を図１５に示す。結果は、一般的に、結合体をＭＦ５９アジュバントとともに投与した場合の方が良好な応答が見られたことを示す。さらに、結合体をこのアジュバントとともに投与した場合に見られた応答では、投与様式に対して低い依存性が示された：試験した投与様式ではすべて、このアジュバントでは、ほぼ同じ応答が得られた。抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡを用いても同様の結果が得られた（図１６）。
【０２０５】
受動防御試験
別の試験において、水酸化アルミニウム、ＩＣ３１またはＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンによって誘導された抗体が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖をインビボで抑止する能力を試験した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２０６】
別々の血清プールを、上記の免疫原性試験（１）、免疫原性試験（４）および免疫原性試験（７）で用いたマウスから採取した。免疫前マウスからさらなる血清プールを採取した。使用前、血清を５６℃で３０分間の処理によって不活化した。
【０２０７】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、４〜５匹の群にて試験した。０．５ｍｌのプール血清を、各マウスに腹腔内投与によって投与した。２時間後、各マウスを０．２ｍｌの培養Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに、尾静脈からの静脈内投与によって、各マウスが５×１０５ＣＦＵを受けるように感染させた。２日後、各マウスを致死させ、左の腎臓を取り出した。各腎臓を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘを含む０．５ｍｌのＰＢＳの存在下でホモジナイズした。ホモジネートの連続希釈液をＳａｂｏｕｒａｄの寒天上で平板培養し、２８℃で４８時間インキュベートした。
【０２０８】
免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓内のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を図１７および１８に示す。少なくともＩＣ３１またはＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンで免疫処置したマウス由来の免疫処置後の血清で処置したマウス群では、少ない蓄積が観察され得た。したがって、これらのアジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンに対して生成される抗体は、受動免疫を誘発し得る。この効果は、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンに対して生成された抗体で特に明白であった。
【０２０９】
ラミナリン精製
Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出された市販のラミナリン（Ｌ−９６３４、Ｓｉｇｍａ）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液を、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって解析した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＡＭＢＤＡＴＭ２５分光測光器を使用し、室温および室内圧で取得した（１．００ｃｍの光路長を有する石英セルを使用）。同じ物質を、デプスフィルタ（ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタ）を用いた１回、２回または３回の濾過工程後に解析した。結果を図１９に示す。
【０２１０】
フロロタンニン夾雑物（約２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度ピークによって表示）は、各濾過工程後、減少していた。
【０２１１】
安定性解析
種々のアジュバントを用いて液体に製剤化したグルカン結合体の安定性を比較した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。試料を３７℃で４週間（図２０）および２〜８℃で６ヶ月間（図２１）保存した。グルカンの放出を、種々の時点での遊離糖％を測定することによりモニターした。遊離糖の測定は、固相抽出（ＳＰＥ）による結合体からの遊離グルカンの分離、続いて高速アニオン交換クロマトグラフィーパルス型電流滴定検出による全グルカンおよび遊離グルカンの定量的測定に基づいたものとする。以下の製剤：
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（ＭＦ５９中）；および
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ
を試験した。
【０２１２】
結果は、ＭＦ５９と合わせたグルカン結合体は、水酸化アルミニウム（リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液中）と合わせたグルカン結合体よりも安定であることを示す。
【０２１３】
また、グルカン結合体の凍結乾燥製剤の安定性も測定した。試料は、４、２５または３７℃で３ヶ月間まで保存した（図２２）。以下の単位用量製剤：
Ｌａｍ−ＣＲＭ １０μｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム３．５ｍｇ、第一リン酸ナトリウム一水和物０．０９２ｍｇ、第二リン酸ナトリウム二水和物０．４８ｍｇ、マンニトール７．３ｍｇ
を試験した。
【０２１４】
免疫原性試験（８）
別の試験において、結合体化（３）に記載のようにして調製した結合体およびＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに腹腔内投与によって投与した。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンは、結合体化前にアミノ化工程なしで調製したＣＲＭ１９７に対するラミナリンの代替ロット（ロット１１ＡＤ）以外は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２１５】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１６匹の１１の群にて試験した。結合体を５μｇの糖用量で投薬容量１５０μｌにて使用し、腹腔内投与によって第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２１６】
第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてアジュバントなしで与えた。第４群〜第６群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第７群と第８群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）アジュバントなし；またはｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第９群と第１０群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）高用量のＩＣ３１（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）と合わせたＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）；またはｂ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに与えた。第１１群には、３回の同一用量の異なるＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン調製物をＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。
【０２１７】
結合体の投与後、第４２日目の抗ラミナリン抗体（ＧＭＴ）を図２３に示す。結果は、合成カードランおよびラミナリンの結合体は、その他の結合体と同様の免疫原性を有することを示す。アジュバントを存在させた場合、免疫原性は、当該グルカンの合成型を使用することにより改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー７および１１）と比較）。合成グルカンの免疫原性は、より長鎖のスペーサーをグルカンと担体タンパク質の間に使用することにより改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー２および５）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー３および６）と比較）。アジュバントの非存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させないことによって改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー３）を、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー１）と比較）。対照的に、アジュバントの存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させることによって改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー６）と比較）。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンでは、結合体化前のアミノ化工程の省略によって免疫原性は抑制されなかった（バー８と１１とを比較）。
【０２１８】
能動防御試験（１）
別の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７結合体化グルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、ラミナリン結合体化（４）（ロット９と１０）およびカードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０２１９】
雌の４週齢のＣＤ２Ｆ１マウス（Ｈａｒｌａｎ）を、３回の用量にて、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランで免疫処置した。各用量は、マウス１匹あたり１０μｇの多糖（０．２ｍｌのＰＢＳ中）：ＭＦ５９（１：１ ｖ／ｖ）からなるものとした。
【０２２０】
免疫処置スケジュールは：
・第０日目−皮下投与による初回用量
・第１４日目−腹腔内投与による２回目の用量
・第２８日目−腹腔内投与による３回目の用量
・第３５日目−採血
・第４０日目−マウス１匹あたり、静脈内投与による５．０×ｌ０５（ラミナリン結合体での免疫処置後）または２．５×１０５（カードラン結合体での免疫処置後）のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌株ＢＰ細胞（０．２ｍｌのＰＢＳ中）の真菌抗原刺激
とした。
【０２２１】
防御エンドポイントを、死亡率（メジアン生存期間（ＭＳＴ）および死亡例／全抗原刺激マウスの比）に関して測定した。
【０２２２】
図２４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表５においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２３】
【表５】
生存期間は、ロット９を受けたマウスよりもロット１０を受けたマウスの方が長かった。
【０２２４】
図２５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表６においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２５】
【表６】
生存期間は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりも、ＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスの方が長かった。
【０２２６】
能動防御試験（２）
同様の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化された合成グルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、結合体化（３）に記載のようにして調製した。この試験では、真菌抗原刺激は、５．０×ｌ０５細胞の静脈内投与によるものとした。
【０２２７】
図２６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ、ＭＦ５９と合わせた１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表７においても、ＭＳＴに関して、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２８】
【表７】
１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処理により生存期間が長くなったが、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処置は、なんら効果を有しないようであった。この結果は、グルカン内の防御的抗体応答の誘導を担うエピトープが、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された隣接する少なくとも５つの非末端残基を含むことを示唆する。理論に拘束されることを望まないが、この効果が、能動防御試験（１）において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりもＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスで見られた防御的抗体応答が大きかったことに寄与している可能性があると考えられる。ＣＲＭ１９７に結合体化したカードラン（この場合、グルカンはβ−１，３−結合残基のみを含む）は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン（この場合、グルカンは、β−１，３−結合残基とβ−１，６−結合残基を含む）よりも多くの割合の防御的エピトープを含んでいる可能性がある。
【０２２９】
本発明は、一例として説明したにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内で変形が行われ得ることは理解されよう。
【０２３０】
【数４】
【０２３１】
【数５】
【０２３２】
【数６】
【０２３３】
【数７】
【０２３４】
【数８】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１１月２６日に出願された米国仮出願第６１／００４，３９６号および２００８年７月１日に出願された米国仮出願第６１／１３３，７３８号（これらの両方は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明はワクチンに関し、より詳しくは、真菌による感染症および疾患に対するワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
β−グルカンの抗真菌ワクチンとしての使用は、参考文献１（非特許文献１）に概説されている。
【０００４】
参考文献２（特許文献１）には、免疫処置試験における種々のβ−グルカン、例えば、ラミナリン、プスツランおよび「ＧＧ−ｚｙｍ」（グルカンゴーストをβ−１，３−グルカナーゼで消化することにより得られる可溶性Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルカン）の使用が報告されている。ＧＧ−ｚｙｍおよびラミナリングルカンは、どちらも、その免疫原性を改善するために担体タンパク質に結合体化された。結合体化したラミナリンに関する情報は、参考文献３（非特許文献２）に報告されている。
【０００５】
参考文献２（特許文献１）では、ＧＧ−ｚｙｍ結合体は、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバントの両方とともに投与された。より一般的には、β−グルカン含有組成物は、任意選択でアジュバントを含むものとして開示されている。参考文献３（非特許文献２）では、ラミナリン結合体は、完全フロイントアジュバントまたはコレラ毒素アジュバントとともに投与された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０３／０９７０９１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＣａｓｓｏｎｅおよびＴｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００６）５：８５９〜６７
【非特許文献２】Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（２００５）２０２：５９７〜６０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、感染症に対して防御的および／または治療的免疫応答を誘発するためのさらに良好なグルカン系組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は、（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバント（ただし、成分（ｂ）は完全フロイントアジュバントではなく、コレラ毒素でもない）を含む免疫原性組成物に関する。グルカンは単一の分子種であり得る。一実施形態において、グルカンを担体タンパク質に結合体化させる。特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質に直接結合体化させる。別の特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質にリンカーによって結合体化させる。
【００１０】
また、本発明は、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物に関し、前記グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化させたものである。一実施形態において、グルカンを担体タンパク質に結合体化させる。特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質に直接結合体化させる。別の特定の実施形態では、グルカンを担体タンパク質にリンカーによって結合体化させる。
【００１１】
本発明の免疫原性組成物における担体タンパク質は、細菌毒素もしくはトキソイド、またはその変異体であり得る。特定の実施形態では、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００１２】
特定の実施形態において、グルカンは、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する。他の実施形態において、グルカンは６０個以下のグルコース単糖単位を有するものである。
【００１３】
グルカンは、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンであり得る。特定の実施形態では、グルカンはラミナリンである。別の特定の実施形態では、グルカンのβ−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基において、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する。例えば、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基とβ−１，６−結合グルコース残基との両方を含み、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比は少なくとも８：１である。
【００１４】
グルカンは、排他的にβ−１，３結合を有するものであってもよい。特定の実施形態では、グルカンは、カードランである。本発明の免疫原性組成物に薬学的に許容され得る担体を含めてもよい。
【００１５】
アジュバントは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含み得る。アジュバントは、外膜小胞（ＯＭＶ）を含むものであってもよい。アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドとポリカチオンオリゴペプチドとを含むものであってもよい。
【００１６】
また、本発明は、哺乳動物に本発明の組成物を投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法に関する。
【００１７】
また、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンに関する。
【００１８】
また、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこのような方法によって得られる結合体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、糖および結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーンは：（１）ＣＲＭ１９７；（２）ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン；（３）ＣＲＭ１９７に結合体化させた水解型カードラン；（４）破傷風トキソイド単量体、Ｔｔ；（５）Ｔｔに結合体化させたラミナリン；（６）Ｔｔに結合体化させた水解型カードランである。
【図２】図２は、結合体のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。図２Ａは、ＣＲＭ１９７結合体のプロフィールを示し、図２Ｂは、Ｔｔ結合体のプロフィールを示す。両方の場合において、最も右側のピークは、結合体化されていない担体のプロフィールである。最小ピークはカードラン結合体である。第３のピークはラミナリン結合体である。
【図３】図３は、ラミナリンに対する結合体化前および結合体化後のＣＲＭ１９７のＨＰＬＣ−ＳＥＣ解析を示す。
【図４】図４は、合成グルカンの結合体化の概要である。
【図５】図５は、合成グルカンの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図６】図６は、ラミナリン結合体のロット９および１０のＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図７】図７は、アジュバントとして左から右に：（１）水酸化アルミニウム；（２）水酸化アルミニウム＋ＣｐＧオリゴ；（３）ＭＦ５９；（４）ＩＣ３１、高用量（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）；（５）ＩＣ３１、低用量（１００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する９０μｌの試料）；（６）α−ガラクトシルセラミド；または（７）α−ガラクトシルセラミド＋水酸化アルミニウムを加えたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図８】図８は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図９】図９は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１０】図１０は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて腹腔内投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１１】図１１は、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせて皮下投与によって投与した、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたカードランに対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１２】図１２は、種々の糖用量のラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１３】図１３は、種々の糖用量のカードラン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたカードラン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴを示す。
【図１４】図１４は、種々の糖用量のラミナリン結合体単独または個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン）を示す。
【図１５】図１５は、腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ＧＧＺｙｍ）を示す。
【図１６】図１６は、腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ラミナリン）を示す。
【図１７】図１７は、種々の個々のアジュバントと合わせたラミナリン結合体で処置したマウス由来の免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を示す。
【図１８】図１８は、ＭＦ５９アジュバントと合わせたラミナリン結合体で処置したマウス由来の免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓におけるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を示す。
【図１９】図１９は、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出した市販のラミナリンのＵＶスペクトルおよびデプスフィルタを用いて１回、２回または３回の濾過工程後の同じ物質のスペクトルを示す。
【図２０】図２０は、種々のアジュバントと合わせた３７℃におけるグルカン結合体の液状製剤の安定性を示す。
【図２１】図２１は、種々のアジュバントと合わせた２〜８℃におけるグルカン結合体の液状製剤の安定性を示す。
【図２２】図２２は、４、２５または３７℃におけるグルカン結合体の凍結乾燥製剤の安定性を示す。
【図２３】図２３は、腹腔内投与によって投与した、合成グルカンならびにラミナリン結合体単独または種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせたラミナリン結合体に対するＩｇＧ ＧＭＴ（抗ラミナリン）を示す。
【図２４】図２４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【図２５】図２５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【図２６】図２６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた２種類の合成グルカン結合体またはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明によれば、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンが、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与される。アジュバントの使用により、アジュバントがない場合よりも強力な免疫応答がもたらされることが示された。グルカンは、好ましくは結合体の形態で使用される。アジュバントは、好ましくは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含むものである。
【００２１】
グルカンがラミナリンならば、アジュバントは完全フロイントアジュバントではない。さらに、グルカンがラミナリンであり、鼻腔内または膣内投与のためのものならば、アジュバントはコレラ毒素ではない。より一般的には、アジュバントは、好ましくは完全フロイントアジュバントでもコレラ毒素でもない。
【００２２】
したがって、本発明は、（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物を提供し、前記グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化させたものである。本発明者らは、単一の分子種であるグルカンは、特に、該組成物がアジュバントもまた含む場合、より多分散系のグルカンよりも免疫原性が大きいことを見い出した。したがって、好ましくは、該組成物はグルカンに加えてアジュバントを含む。
【００２４】
また、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンに関する。グルカンは、本明細書に記載の任意のグルカンであり得る。本発明者らは、既知の方法によって精製したグルカンには、フロロタンニンが混入していることがあり得ることを見い出した。フロロタンニンは、褐藻類および海藻類に見られるポリフェノール化合物である。フロロタンニンは、典型的には、ジベンゾ−１，４−ジオキシン骨格を含むものであるが、多くの異なる形態のフロロタンニンも知られている。フロロタンニンは、さまざまな生物学的効果、例えば、放射線防護効果および抗酸化効果を有することが示されている（［４］および［５］）。特に、フロロタンニンは、免疫機構に対する効果、例えば、抗炎症性効果および抗アレルギー効果を有することが示されている（［５］および［６］）。フロロタンニンの抗免疫効果は、特に、グルカンが免疫原としての使用のためのものである場合、これがグルカン中の望ましくない夾雑物であり得ることを意味する。本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含むグルカンの精製プロセス、およびフロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンを提供する。
【００２５】
また、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこの方法によって得られる結合体を提供する。グルカンは、本明細書に記載の任意のグルカンであり得る。本発明者らは、このような方法によって結合体化させたグルカンは、ワクチンとして使用した場合、先行技術の方法（例えば、参考文献２および３に記載の方法）によって結合体化させたグルカンよりも大きな防御がもたらされ得ることを見い出した。理論に拘束されることを望まないが、この効果は、得られる結合体の凝集の低減のためであり得ると考えられる。
【００２６】
グルカン
グルカンは、とりわけ真菌の細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のα−結合を含むものであり、β−グルカンは、グルコースサブユニット間に１つ以上のβ−結合を含むものである。本発明に従って使用されるグルカンはβ結合を含むものであり、β結合のみを含むもの（すなわち、α結合を含まない）であってもよい。
【００２７】
グルカンは１つ以上のβ−１，３−結合および／または１つ以上のβ−１，６−結合を含み得る。また、１つ以上のβ−１，２−結合および／またはβ−１，４−結合を含むものであってもよいが、通常、β結合のみがβ−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合である。
【００２８】
グルカンは、分枝状であっても線状であってもよい。
【００２９】
完全長の天然β−グルカンは不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。本発明の免疫原性組成物には、可溶性グルカンを使用することが好ましい。可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することにより達成され得る。これは加水分解によっても行なわれ得、より簡便には、グルカナーゼ（例えば、β−１，３−グルカナーゼまたはβ−１，６−グルカナーゼ）での消化によっても行なわれ得る。代替法として、短いグルカンを、単糖構成ブロックを連接することにより合成によって調製することもできる。
【００３０】
低分子量グルカンが好ましく、特に、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有するものが好ましい。また、例えば、６０個以下（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個）のグルコース単糖単位を含むオリゴ糖を使用することも可能である。この範囲において、１０〜５０個または２０〜４０個の単糖単位を有するオリゴ糖が好ましい。
【００３１】
グルカンは真菌グルカンであり得る。「真菌グルカン」は、一般的には真菌から得られるものであるが、特定のグルカン構造が真菌および非真菌（例えば、細菌、下等植物または藻類）の両方に見られる場合は、非真菌生物体を代替供給源として使用してもよい。したがって、グルカンは、カンジダ属（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）の細胞壁、あるいはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、またはＰｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍに由来するものであり得る。
【００３２】
真菌β−グルカンには種々の供給源が存在する。例えば、純粋なβ−グルカンは市販されており、例えば、プスツラン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）は、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ ｐａｐｕｌｌｏｓａから精製されたβ−１，６−グルカンである。β−グルカンは、真菌の細胞壁から種々の様式で精製され得る。例えば、参考文献７には、細胞壁マンナンを含まないカンジダ属由来の水溶性β−グルカン抽出物を調製するための、ＮａＣｌＯ酸化とＤＭＳＯ抽出を伴う２工程手順が開示されている。得られる生成物（「カンジダ属可溶性β−Ｄ−グルカン」または「ＣＳＢＧ」）は、主として線状β−１，３−グルカンで構成されており、線状β−１，６−グルカン部分を有する。同様に、参考文献２には、Ｃａｌｂｉｃａｎｓ由来のＧＧ−ｚｙｍの作製が開示されている。かかるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ由来グルカンとしては、（ａ）β−１，３−グルカン側鎖を有し、平均重合度が約３０のβ−１，６−グルカン、および（ｂ）β−１，６−グルカン側鎖を有し、平均重合度が約４のβ−１，３−グルカンが挙げられる。
【００３３】
本発明の一部の実施形態において、グルカンは、例えばラミナリンに見られるような、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンである。ラミナリンは褐藻類および海藻類に見られる。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）比は、種々の供給源の間で変動し、例えば、Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓのラミナリンでは３：２と小さいが、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔｉｔａｔａのラミナリンでは７：１と大きい［８］。したがって、本発明で使用されるグルカンは１．５：１〜７．５：１、例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１または７：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有し得る。任意選択で、グルカンは、末端マンニトールサブユニット、例えば１，１−α−結合マンニトール残基を有するものであってもよい［９］。また、グルカンはマンノースサブユニットを含むものであってもよい。
【００３４】
他の実施形態において、グルカンは、カードランに見られるように、β−１，３結合を排他的に、または主として有するものである。本発明者らは、このようなグルカンの免疫原性が、他の結合を含むグルカンよりも、特に、β−１，３結合を含み、β−１，６結合の割合がより高いグルカンよりも大きくなり得ることを見い出した。したがって、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基のみ（例えば、排他的に１，３結合を有する線状β−Ｄ−グルコピラノース）で構成されたものであってもよい。とはいえ、任意選択で、グルカンは、β−１，３−結合グルコース残基ではない単糖残基を含むものであってもよく、例えば、β−１，６−結合グルコース残基を含むものであってもよい。このような他の残基に対するβ−１，３−結合グルコース残基の比は、少なくとも８：１（例えば、≧９：１、≧１０：１、≧１１：１、≧１２：１、≧１３：１、≧１４：１、≧１５：１、≧１６：１、≧１７：１、≧１８：１、≧１９：１、≧２０：１、≧２５：１、≧３０：１、≧３５：１、≧４０：１、≧４５：１、≧５０：１、≧７５：１、≧１００：１など）であるのがよい、および／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つ（例えば、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、≧１５、≧１６、≧１７、≧１８、≧１９、≧２０、≧３０、≧４０、≧５０、≧６０など）の隣接する非末端残基の配列が１つ以上（例えば、≧１、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２など）存在する。「非末端」により、該残基が、グルカンの遊離端に存在しているものではないことを意図する。一部の実施形態において、隣接する非末端残基は、担体分子、リンカーまたは他のスペーサー（後述）にカップリングされた残基を全く含まないものであってもよい。本発明者らは、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された隣接する５つの非末端残基の存在により、例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御的抗体応答がもたらされ得ることを見い出した。
【００３５】
さらなる実施形態において、組成物は、２種類の異なるグルカンを含むものであり得、例えば、第１のグルカンは１．５：１〜７．５：１のβ（１−３）：β（１−６）比を有するものであり、第２のグルカンはβ−１，３結合を排他的に、または主として有するものである。例えば、組成物は、ラミナリングルカンとカードラングルカンの両方を含み得る。
【００３６】
β−グルカンが、β−１，３結合とβ−１，６結合の両方を所望の比および／または配列で含むものである場合、このグルカンは、天然に見られるものであってもよく（例えば、ラミナリン）、人工的に作製したものであってもよい。例えば、これは、全部または一部が化学合成によって作製されたものであり得る。β−１，３／β−１，６グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献１０〜２０により当該分野において周知である。また、β−１，３結合とβ−１，６結合の両方を所望の比で含むβ−グルカンは、利用可能なグルカンから出発して、これを、β−１，６−グルカナーゼ（グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ、１，６−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼなどとしても知られる；ＥＣ ３．２．１．７５）、またはβ−１，３−グルカナーゼ（エキソ−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．５８）など、またはエンド−１，３−グルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．３９）で、所望の比および／または配列に達するまで処理することにより作製され得る。
【００３７】
β−１，３−結合グルコースのみを含むグルカンが所望される場合、β−１，６−グルカナーゼにより最終的に純粋なβ−１，３グルカンが得られるため、β−１，６−グルカナーゼ処理を最後まで遂行してもよい。しかしながら、より簡便には、純粋なβ−１，３−グルカンを使用するのがよい。これは、例えば、（１→３）−β−Ｄ−グルカンシンターゼ（そのいくつかは既知であり、多くの生物体（例えば、細菌、酵母、植物および真菌）に由来のものである）を使用し、化学的および／または酵素的合成による合成によって作製され得る。β−１，３グルカンの化学合成のための方法は、例えば参考文献２１〜２４により当該分野で周知である。有用な代替的合成例として、天然のβ−１，３−グルカン、例えば、カードラン（以前はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ ｖａｒ．ｍｙｘｏｇｅｎｅｓとして知られていたアグロバクテリウム属由来の線状β−１，３−グルカン；例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販（カタログＣ７８２１））またはパラミロン（ユーグレナ属由来のβ−１，３−グルカン）などが使用され得る。高レベルのβ−１，３−グルカンをもたらす生物体は当該技術分野で知られており、例えば、参考文献２５および２６のアグロバクテリウム属、または参考文献２７のＥｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓである。
【００３８】
ラミナリンおよびカードランは、典型的には、天然で、例えば少なくとも１００ｋＤａの分子量を有する高分子量ポリマーとして見られる。これらは、多くの場合、水性媒体に不溶性である。したがって、これらは、その天然形態では免疫処置にあまり適していない。したがって、本発明では、より短いグルカン、例えば、６０個以下のグルコース単糖単位（例えば、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４個）を含むオリゴ糖が使用され得る。２〜６０の範囲の数のグルコース残基、例えば、１０〜５０個または２０〜４０個のグルコース単位を有するグルカンが使用され得る。２５〜３０個のグルコース残基を有するグルカンが特に有用である。好適なグルカンは、例えば、天然グルカンの酸加水分解によって、または例えば、グルカナーゼ（β−１，３−グルカナーゼなど）での酵素的消化によって形成され得る。１１〜１９個、例えば１３〜１９個、特に１５個または１７個のグルコース単糖単位を有するグルカンもまた有用である。特に、下記の構造（Ａ）または（Ｂ）：
【００３９】
【化１】
（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した）
【００４０】
【化２】
（式中、ｎは、０〜９、例えば１〜７または２〜６の範囲である。好ましくは、ｎは、３〜４または１〜３の範囲である。本発明者らは、ｎ＝２が好適であることを見い出した）
を有するグルカンが、本発明における使用に具体的に想定される。
【００４１】
グルカン（上記に規定のもの）は、好ましくは単一の分子種である。この実施形態において、グルカン分子はすべて、配列に関して同一である。したがって、グルカン分子はすべて、その構造的特性（例えば、分子量など）に関して同一である。典型的には、この形態のグルカンは、例えば、上記の方法を用いて化学合成によって得られる。例えば、参考文献２２には、単一のβ−１，３結合種の合成が記載されている。あるいはまた、他の実施形態では、グルカンは、天然グルカンから、例えば、上記のようなＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ、アグロバクテリウム属またはユーグレナ属由来のグルカンから、必要とされる単一の分子種が得られるまでグルカンを精製して得られるものであり得る。このようにして精製された天然グルカンは市販されている。単一の分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することにより確認され得る。このパラメーターは、ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによって、例えば参考文献２８に記載のようにして簡便に測定され得る。本発明のこの実施形態における使用に好適なグルカンは、約１の（例えば、１．０１またはそれより小さい）多分散性を有するものである。
【００４２】
天然グルカン（カードランなど）の溶解度は、イオン性基を導入することにより増大させることができる（例えば硫酸化によって、特にカードランのＯ−６に）。かかる修飾を本発明で使用してもよいが、グルカンの抗原性が改変されることがあり得るので、理想的には回避する。
【００４３】
グルカンを天然供給源から単離する場合、夾雑物と一緒に単離されることがあり得る。例えば、本発明者らは、グルカンにフロロタンニンが混入していることがあり得ることを見い出した。これは、紫外・可視（ＵＶ／ＶＩＳ）分光法によって確認され得る。この問題は、グルカンを褐藻または海藻から単離する場合、特によく見られる。例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出された市販のラミナリンのＵＶスペクトルは、フロロタンニン夾雑物の存在に起因する吸収ピークを含む（図１６）。同様に、Ａｒｔｉｃ ｌａｍｉｎａｒｉａｌｉｓ、Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ ｄｅｒｍａｔｏｄｅａおよびＡｌａｒｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａから抽出されたグルカンは、フロロタンニン夾雑物に起因する吸収ピークを含むＵＶスペクトルを有する。
【００４４】
グルカン試料中のフロロタンニンの存在は、グルカンの生物学的特性に影響を及ぼし得る。したがって、特に、グルカンが医療または栄養学的用途のためのものである場合は、フロロタンニンを試料から除去することが望ましくあり得る。
【００４５】
別の態様において、本発明は、フロロタンニンをグルカンから分離する工程を含む、グルカンの精製プロセスを提供する。グルカンは上記の任意のグルカンであり得る。本発明のこのプロセスにより、フロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンが得られる。したがって、別の態様において、本発明はまた、フロロタンニン夾雑物を減少させたグルカンを提供する。本発明のグルカンは、本発明の該プロセスによって取得されているか、または取得可能であり得る。また、本発明の該プロセスは、他の夾雑物、例えば、グルカン中に存在し得る他の有機分子をグルカンから分離するためにも使用され得る。
【００４６】
フロロタンニンをグルカンから分離する工程は、グルカンを使用のために処理する前に行なわれ得る。例えば、この工程は、担体タンパク質とのグルカンの結合体化（後述）前に行なわれ得る。特に、この工程は、結合体化前にグルカンを活性化または官能性付与する前に行なわれ得る。別の例では、この工程は、グルカンを栄養製品に加工する前に行なわれる。
【００４７】
本発明のこのような態様のグルカンは、フロロタンニン夾雑物を減少させた。典型的には、フロロタンニン夾雑物はＵＶ／ＶＩＳ分光法によって測定される。約２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度ピークは、一般的にフロロタンニン夾雑物を示す。このフロロタンニン夾雑物が存在すると、本発明の方法では、約２７０ｎｍにおける吸光度が小さくなる。同様に、グルカンは、約２７０ｎｍにおける吸光度が小さくなる。好ましくは、グルカンは、２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度がほとんど示されない。これは、約２７０ｎｍにおいて吸収ピークが示される先行技術のグルカンと比べて、特別な利点である。例えば、グルカンは水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有する。＜０．１５、＜０．１０、さらには＜０．０５の吸光度が好ましい。グルカンのＵＶ吸光度スペクトルは、他の様式でも特徴付けられ得る。例えば、２２０ｎｍ〜３００ｎｍのＵＶスペクトルは、２７０ｎｍ付近にショルダーもピークも示さない；２５０ｎｍ〜２７５ｎｍのＵＶスペクトルは増大しない；および／または２５０ｎｍ〜２７５ｎｍのＵＶスペクトルは、最大点も変曲点も有しない。また、２８０〜３２０領域（例えば、約３１０ｎｍ）におけるＵＶ吸光度ピークもフロロタンニン夾雑物を示すものであり得る（［２９］）。このフロロタンニン夾雑物が存在すると、本発明の方法では、２８０〜３２０領域における吸光度が小さくなる。同様に、グルカンは、２８０〜３２０領域における吸光度が小さくなる。好ましくは、グルカンは、この領域におけるＵＶ吸光度がほとんど示されない。例えば、グルカンは水中１ｍｇ／ｍｌで、３１０ｎｍにおいて０．１０未満のＵＶ吸光度を有する。
【００４８】
ＵＶ／ＶＩＳ分光法を行なう任意の適当な方法を用いて、グルカンのフロロタンニン夾雑物が測定され得る。例えば、本発明者らは、適当なＵＶ／ＶＩＳスペクトルが、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＡＭＢＤＡＴＭ２５分光測光器を使用し、室温および室内圧で、水中１ｍｇ／ｍｌのグルカンを内包する１ｃｍの光路長を有する石英セルを用いて得られ得ることを見い出した。当業者であれば、ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを得るための他の適当な方法および条件を選択することができよう。
【００４９】
フロロタンニンの他の測定方法は、当該技術分野で知られている。例えば、参考文献３０では、フロロタンニンの検出および定量に高速液体クロマトグラフィーが使用された。当業者であれば、本発明におけるフロロタンニン夾雑物の測定に適した方法を選択することができよう。
【００５０】
本発明のこの態様のプロセスは、さらに、グルカンの残留フロロタンニン夾雑物を測定する後続の工程を含んでいてもよい。このようにして、グルカンのフロロタンニン夾雑物が減少したことが確認され得る。フロロタンニン夾雑物は、任意の適当な方法、例えば、上記の方法によって測定され得る。
【００５１】
フロロタンニンはグルカンから、任意の適当な方法によって分離され得る。例えば、濾過法が使用され得る。当業者であれば、フロロタンニンをグルカンから分離するのに適した特性を有するフィルタを選択することができよう。典型的には、フロロタンニンをグルカンから分離するために使用されるフィルタは、デプスフィルタである。デプスフィルタは当業者に周知である。好適なデプスフィルタとしてはＣｕｎｏＴＭＳＰフィルタが挙げられ、これは、無機フィルタ助剤、セルロースおよびフィルタマトリックスに正の電荷を付与する樹脂で構成されたフィルタ媒体を有するものである。例えば、本発明者らは、ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタが特に有効であることを見い出した。しかしながら、他のデプスフィルタおよび他の濾過方法もまた使用され得る。例えば、ゲル濾過が使用され得る。また、炭素系フィルタも好適であり得る。炭素系フィルタは、当業者に周知である。このフィルタは、典型的には、試料精製のためのフィルタとしての機能を果たすゆるい顆粒状活性炭素床（ｌｏｏｓｅ ｇｒａｎｕｌａｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｂｅｄ）または圧縮型もしくは押出型活性炭素ブロック（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｂｌｏｃｋ）で構成されている。あるいはまた、クロマトグラフィー手順を用いてフロロタンニンをグルカンから分離してもよい。例えば、アフィニティー樹脂クロマトグラフィーが使用され得、この場合、フロロタンニンまたはグルカンが樹脂上に保持される。
【００５２】
グルカンからのフロロタンニンの分離は、１回（もしくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０回など）またはそれ以上の下位工程（ｓｕｂ−ｓｔｅｐ）で行なわれ得る。例えば、本発明者らは、デプスフィルタ（例えば、ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタ）を用いた３回の濾過下位工程がフロロタンニン夾雑物を減少させるのに特に有効であることを見い出した。
【００５３】
当業者は、必要とされるフロロタンニン夾雑物の低減がもたらされる他の分離手法および条件を特定することができよう。例えば、分離手法および条件は、試験分離工程を行ない、次いで、上記の方法によって残留フロロタンニン夾雑物を測定することにより最適化され得る。
【００５４】
結合体
純粋なβ−グルカンは免疫原として不充分である。したがって、防御的有効性のため、本発明で使用されるβ−グルカンは、好ましくは、担体タンパク質に結合体化させる。炭水化物抗原の免疫原性を高めるための担体タンパク質との結合体化の使用は、よく知られており［例えば、参考文献３１〜３９などに概説］、特に、小児科用ワクチンに使用される［４０］。
【００５５】
本発明は、（ａ）（ｉ）上記規定のグルカンと（ｉｉ）担体分子の結合体；ならびに（ｂ）上記規定のアジュバントを含む組成物を提供する。
【００５６】
担体分子はグルカンに、直接またはリンカーを介して共有結合により結合体化され得る。任意の適当な結合体化反応が使用され得、必要に応じて任意の適当なリンカーが使用され得る。
【００５７】
担体に対するグルカン抗原の結合は、好ましくは、例えば、担体タンパク質のリジン残基の側鎖内、またはアルギニン残基の側鎖内の−ＮＨ２基によるものである。グルカンが遊離アルデヒド基を有する場合、これは該担体内のアミンと反応し、還元的アミノ化によって結合体が形成され得る。また、担体に対する結合は、例えば、システイン残基の側鎖内の−ＳＨ基によるものであってもよい。あるいはまた、グルカン抗原は担体に、リンカー分子を介して結合され得る。
【００５８】
グルカンは、典型的には、結合体化前に活性化または官能性付与させる。活性化は、例えば、シアニル化試薬（ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［４１，４２など］）など）を伴うものであり得る。他の適当な手法は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵ（参考文献４３の序論も参照のこと）を使用するものである。
【００５９】
タンパク質との直接結合は、例えば、参考文献４４および４５に記載のような、グルカンの酸化、続いてタンパク質の還元的アミノ化を含み得る。
【００６０】
リンカー基を介した結合は、任意の既知の手順（例えば、参考文献４６および４７に記載の手順）を用いて行なわれ得る。典型的には、リンカーは、グルカンのアノマー炭素を介して結合される。好ましい型の結合はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にアジピン酸をカップリングさせ（例えば、ジイミド活性化を使用）、次いで、得られた糖−アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングさせることにより形成され得る［３５，４８，４９］。同様に好ましい型の結合はグルタル酸リンカーであり、これは、遊離−ＮＨ２基にグルタル酸を同様にしてカップリングさせることにより形成され得る。また、アジピン酸（Ａｄｉｐｉｄ）およびグルタル酸リンカーは、グルカンとの直接カップリングによって、すなわち、事前に遊離基（例えば、遊離−ＮＨ２基）をグルカンに導入せずに、続けて、得られた糖−アジピン酸／グルタル酸中間体にタンパク質をカップリングさせることによっても形成され得る。別の好ましい型の結合はカルボニルリンカーであり、これは、修飾グルカンの遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［５０，５１］後、タンパク質との反応によってカルバメート結合を形成することによっても形成され得る。他のリンカーとしては、β−プロピオンアミド［５２］、ニトロフェニルエチルアミン［５３］、ハロゲン化ハロアシル［５４］、グリコシド結合［５５］、６−アミノカプロン酸［５６］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［５７］、アジピン酸ジヒドラジド ＡＤＨ［５８］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５９］などが挙げられる。また、カルボジイミド縮合を使用することもできる［６０］。
【００６１】
二官能性リンカーを使用し、グルカン内のアミン基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入）にカップリングさせるための第１の基と、担体にカップリングさせる（典型的には、担体内のアミンにカップリングさせる）ための第２の基を提供してもよい。あるいはまた、第１の基は、グルカンに直接（すなわち、事前に基（例えば、アミン基）をグルカンに導入せずに）カップリングできるものである。
【００６２】
一部の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、このように、グルカン上のアミン基（−ＮＨ２）と反応できるものである。この反応は、典型的にはアミン水素の求電子性置換を伴う。他の実施形態において、二官能性リンカー内の第１の基は、グルカンと直接反応できるものである。どちらの組の実施形態も、二官能性リンカー内の第２の基は、典型的には、担体上のアミン基と反応できるものである。この場合も、この反応は、典型的にはアミンの求電子性置換を伴う。
【００６３】
グルカンと担体の反応がともにアミンを伴う場合、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ２）４−または−（ＣＨ２）３である。
【００６４】
同様に、グルカンとの反応が直接カップリングを伴い、担体との反応がアミンを伴う場合も、二官能性リンカーを使用することが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は、互いに同じであり、グルカン／アミンと反応することができ、Ｌは、リンカー内の連結部分であるホモ二官能性リンカーが使用され得る。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘであって、式中、２つのＸ基は異なっており、一方はグルカンと反応でき、他方はアミンとでき、Ｌは、リンカー内の連結部分であるヘテロ二官能性リンカーが使用され得る。好ましいＸ基はＮ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ２−Ｌ’（式中Ｌ’はカルボニルである）を有するものである。好ましいＬ２基は、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）を有する直鎖アルキル、例えば、−（ＣＨ２）４−または−（ＣＨ２）３−である。
【００６５】
先の２つの段落で記載した二官能性リンカーにおける使用のための他のＸ基は、ＨＯ−Ｌ−ＯＨと結合させるとエステルを形成するもの、例えば、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００６６】
本発明での使用のためのさらなる二官能性リンカーとしては、アクリロイルハロゲン化物（例えば、塩化物）およびハロアシルハライドが挙げられる。
【００６７】
リンカーは、一般的に、グルカンとのカップリング中に、グルカンに対してモル過剰で添加する。
【００６８】
好ましい担体タンパク質は、細菌毒素（ジフテリアあるいは破傷風毒素など）もしくはトキソイドまたはその変異体である。これらは、結合体ワクチンに一般的に使用されている。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体が特に好ましい［６１］。
【００６９】
他の適当な担体タンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［６２］、合成ペプチド［６３，６４］、熱ショックタンパク質［６５，６６］、百日咳タンパク質［６７，６８］、サイトカイン［６９］、リンホカイン［６９］、ホルモン［６９］、増殖因子［６９］、種々の病原体由来の抗原由来の多数のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［７０］（Ｎ１９［７１］など）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［７２〜７４］、ニューモリシン［７５］またはその非毒性誘導体［７６］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７７］、鉄分取込みタンパク質［７８］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［７９］、組換え緑膿菌エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［８０］などが挙げられる。担体タンパク質の混合物を使用することも可能である。単一の担体タンパク質が多数の異なるグルカンを担持していてもよい［８１］。
【００７０】
結合体は、過剰の担体（ｗ／ｗ）または過剰のグルカン（ｗ／ｗ）を有するもの、例えば、１：５〜５：１の比で有し得る。過剰の担体タンパク質を有する結合体が典型的であり、例えば、０．２：１〜０．９：１の範囲であるか、または等重量である。結合体には、少量の遊離（すなわち、結合体化されていない）担体が含まれていてもよい。所与の担体タンパク質が本発明の組成物中に、遊離形態と結合体化形態の両方で存在する場合、結合体化されていない形態は、好ましくは、組成物全体の担体タンパク質の総量の５％以下であり、より好ましくは２％未満（重量基準）で存在する。
【００７１】
結合体が本発明の免疫原性組成物のグルカン成分を構成する場合、該組成物に、免疫原として遊離担体タンパク質も含まれることがあり得る［８２］。
【００７２】
結合体化後、遊離グルカンと結合体化グルカンを分離してもよい。多くの適当な方法があり、例えば、疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などがある［参考文献８３，８４などもまた参照のこと］。タンジェンシャルフロー限外濾過が好ましい。
【００７３】
結合体内のグルカン部分は、好ましくは、上記規定の低分子量グルカンである。オリゴ糖は、典型的には、結合体化前にサイズ調整する。
【００７４】
タンパク質−グルカン結合体は、好ましくは、水および／または生理学的緩衝液に可溶性である。
【００７５】
本発明者らは、グルカンと担体タンパク質間にスペーサーが存在させると、免疫原性が改善され得ることを見い出した。これに関連して、「スペーサー」は、単一の共有結合よりも長い部分である。このスペーサーは、上記のようなリンカーであってもよい。あるいはまた、これは、グルカンとリンカーの間に共有結合された部分であってもよい。典型的には、該部分はグルカンに、リンカーまたは担体とのカップリング前に共有結合させる。例えば、スペーサーは、１〜１０個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０）、典型的には１〜６個の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を有する直鎖アルキルを含むＹ部分である。本発明者らは、６個の炭素原子を有する直鎖アルキル（すなわち、−（ＣＨ２）６）が特に好適であり、短鎖（例えば、−（ＣＨ２）２）のものよりも大きな免疫原性がもたらされ得ることを見い出した。典型的には、Ｙはグルカンのアノマー炭素に、通常、−Ｏ-結合を介して結合される。しかしながら、Ｙは、グルカンの他の部分に連結されていてもよい、および／または他の結合を介して連結されていてもよい。Ｙの他端は、任意の適当な結合によってリンカーに結合させる。典型的には、Ｙは、上記のような二官能性リンカーに対する結合が容易になるようにアミン基で終結させたものである。したがって、このような実施形態では、Ｙはリンカーに−ＮＨ−結合によって結合される。したがって、下記の構造：
【００７６】
【化３】
（式中、ｎ＋２は、２〜６０、例えば１０〜５０または２〜４０の範囲である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が好適であることを見い出した。Ｙは、上記のとおりである。「ＬＩＮＫＥＲ」は、上記のような任意選択のリンカーであり、「ＣＡＲＲＩＥＲ」は、上記のような担体分子である）
を有する結合体が、本発明における使用に具体的に想定される。
【００７７】
本発明における使用に具体的に想定される別の結合体は、下記の構造：
【００７８】
【化４】
（式中、ｎは、０〜９、例えば１〜７または２〜６の範囲である。好ましくは、ｎは、３〜４または１〜３の範囲である。本発明者らは、ｎ＝２が好適であることを見い出した。Ｙは、上記のとおりである。「ＬＩＮＫＥＲ」は、上記のような任意選択のリンカーであり、「ＣＡＲＲＩＥＲ」は、上記のような担体分子である）
を有するものである。
【００７９】
一態様において、本発明は、結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化させたグルカンの作製方法；およびこの方法によって得られる結合体を提供する。本発明者らは、リン酸ナトリウムが、該緩衝液のリン酸塩の好適な形態であることを見い出した。緩衝液のｐＨは、７．０〜７．５、特に７．２に調整され得る。結合体化工程は、典型的には、２０〜２００ｍＭ、例えば５０〜１５０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる。特に、本発明者らは、９０〜１１０ｍＭ、例えば約１００ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液が好適であることを見い出した。結合体化工程は、通常、室温で行なわれる。同様に、結合体化工程は、通常、室内圧で行なわれる。典型的には、グルカンを上記のようなリンカーに、結合体化工程前に結合させる。特に、グルカンを上記のような二官能性リンカーに結合させるのがよい。リンカーの遊離端は、担体タンパク質との結合体化を容易にする基を含むものであってもよい。例えば、本発明者らは、リンカーの遊離端にエステル基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を含めるのがよいことを見い出した。
【００８０】
アジュバント
β−グルカンそれ自体がアジュバントであると報告されているが、免疫原性組成物は、この組成物を受ける患者において誘起される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強する機能を果たし得る別のアジュバントを含んでいてもよい。本発明で使用され得るアジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００８１】
・無機質含有組成物、例えば、カルシウム塩およびアルミニウム塩（またはその混合物）。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献８５に開示された「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、該塩には、任意の適当な形態（例えば、ゲル、結晶性、非晶質など）が採用される。このような塩への吸着が好ましい。また、無機質含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化され得る［８６］。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントが使用され得る。これらの名称は慣用的であるが、便宜上のためだけに使用され、存在している実際の化合物の正確な記述でもない（例えば、参考文献１７０の第９章参照）。本発明では、アジュバントとして一般に使用されている任意の「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントが使用され得る。「水酸化アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはアルミニウムのオキシ水酸化物塩であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として知られているアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、多くの場合、少量の硫酸塩も含まれている（すなわち、ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩）。このアジュバントは、沈降によって得られ得、沈降時の反応条件および濃度は、該塩中のヒドロキシルのリン酸塩の置換の程度に影響を及ぼす。本発明では、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの混合物を使用してもよい。この場合、水酸化アルミニウムよりもリン酸アルミニウムを多く、例えば、少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比で存在させるのがよい。患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【００８２】
・サポニン［参考文献１７０の第２２章］、これは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、さらには花にも見られるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。また、サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から商業的に入手することもできる。サポニンアジュバント製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。このような手法が使用された具体的な精製画分が同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の作製方法は、参考文献８７に開示されている。サポニン製剤には、ステロール（コレステロールなど）が含まれることがあり得る［８８］。サポニンとコレステロールの組合せは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と称される特殊な粒子を形成するために使用され得る［参考文献１７０の第２３章］。また、ＩＳＣＯＭは、典型的にはリン脂質、例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどを含むものである。任意の既知のサポニンがＩＳＣＯＭに使用され得る。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種類以上を含むものである。ＩＳＣＯＭは、参考文献８８〜９０にさらに説明されている。任意選択で、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗剤を含まないものであり得る［９１］。サポニン系アジュバントの開発の概説は、参考文献９２と９３を見るとよい。
【００８３】
・細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、または百日咳毒素「ＰＴ」）ならびに、特に、その無毒化誘導体（参考文献３参照）、例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２［９４］またはＣＴ−Ｅ２９Ｈ［９５］として知られている変異体毒素など。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化毒素の使用は、参考文献９６に記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献９７に記載されている。
【００８４】
・生体接着剤および粘膜接着剤、例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［９８］またはキトサンおよびその誘導体［９９］など。
【００８５】
・生分解性で非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）で形成されたミクロ粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、または約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子）。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、任意選択で処理して、負の電荷を有する表面（例えば、ＳＤＳで）または正の電荷を有する表面（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤）を有するようにしたもの。
【００８６】
・リポソーム（参考文献１７０の第１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、参考文献１００−１０２に記載されている。
【００８７】
・ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、または「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）など。
【００８８】
・ポリオキシドニウムポリマー［１０３，１０４］または他のＮ−酸化型ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【００８９】
・メチルイノシン５’−モノリン酸塩（「ＭＩＭＰ」）［１０５］。
【００９０】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物［１０６］、例えば、式：
【００９１】
【化５】
（式中、Ｒは、水素、直鎖または分枝状の非置換または置換飽和または不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）
を有するもの、またはその薬学的に許容され得る塩もしくは誘導体。例としては、限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−ジエピ−カスアリンなどが挙げられる。
【００９２】
・ＣＤｌｄリガンド、例えば、α−グリコシルセラミド［１０７〜１１４］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
【００９３】
・γイヌリン［１１５］またはその誘導体、例えば、アルガムリンなど。
【００９４】
・水中油型乳剤。種々のかかる乳剤が知られており、典型的には、少なくとも１種類の油と、少なくとも１種類の界面活性剤を含むものであり、油類（１種類または複数種）および界面活性剤（１種類または複数種）は生分解性（代謝性）および生体適合性である。乳剤中の油滴は、一般的には５μｍ未満の直径であるが、さらにはサブミクロン直径を有するものであってもよい。このような小サイズは、マイクロフルイダイザーにより得られ、安定な乳剤が得られる。濾過滅菌に供することができるため、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【００９５】
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシン残基に連結された非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列）、またはＣｐＩモチーフ（イノシンに連結されたシトシンを含むジヌクレオチド配列）、または二本鎖ＲＮＡ、またはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドを含むものなど。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド修飾／類似体（ホスホロチオエート修飾）を含むものであってもよく、二本鎖（ＲＮＡを除く）であっても、単鎖であってもよい。参考文献１１６、１１７および１１８には、可能な類似体置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置換）が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１１９〜１２４にさらに論考されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９に対するものである（モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど）［１２５］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘発に特異的であり得（ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）、あるいは、Ｂ細胞応答の誘発に対してより特異的であり得る（ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなど）。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１２６〜１２８に論考されている。好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体の認識に利用可能となるように構築される。任意選択で、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合させ「イムノマー」を形成してもよい。例えば、参考文献１２５および１２９〜１３１を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても知られている。他には、ＣｐＧ １８２６がある。ＣｐＧ配列の使用の代替法として、あるいはさらに、ＴｐＧ配列が使用され得［１３２］、このオリゴヌクレオチドには、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、これは、１つより多くの連続チミジンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１３２に開示されたＴＴＴＴ）、および／または＞２５％のチミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。例えば、１つより多くの連続シトシンヌクレオチドを含み得る（例えば、参考文献１３２に開示されたＣＣＣＣ）、および／または＞２５％のシトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のヌクレオチド組成を有し得る。このようなオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフが含まれていないものであり得る。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。これは、１００個より少ないヌクレオチドを含むものであるのがよい。
【００９６】
特に有用な免疫刺激性オリゴヌクレオチド系アジュバントは、ＩＣ３１ＴＭ［１３３］として知られているものである。したがって、本発明で使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０ヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つ（好ましくは多数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオンポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば、５〜２０アミノ酸）の混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒ配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオンポリマーは、１１ｍｅｒアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号２）を含むペプチドであり得る。
【００９７】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」、「ＭＰＬＴＭ」としても知られている）［１３４〜１３７］。水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズ（例えば、＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍの直径）を有するミセル状の凝集物または粒子を形成し得る。これらのいずれかまたは両方が本発明で使用され得、常套的なアッセイによって、良い方の粒子が選択され得る。より小さい粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁液が得られるのに充分に小さい）の方が、活性が優れるため、本発明による使用に好ましい［１３８］。好ましい粒子は２２０ｎｍ未満、より好ましくは２００ｎｍ未満または１５０ｎｍ未満または１２０ｎｍ未満の平均直径を有するものであり、さらには、１００ｎｍ未満の平均直径を有するものであってもよい。しかしながら、ほとんどの場合、平均直径は５０ｎｍより小さくない。
【００９８】
・イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（「Ｒ−８３７」）［１３９，１４０］、レシキモド（「Ｒ−８４８」）［１４１］など、およびその類似体；ならびにその塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンに関するさらなる詳細は、参考文献１４２〜１４６を見るとよい。
【００９９】
・チオセミカルバゾン化合物（参考文献１４７に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４７に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。
【０１００】
・トリプタントリン化合物（参考文献１４８に開示されたものなど）。また、活性化合物の製剤化、製造およびスクリーニングのための方法も参考文献１４８に記載されている。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカイン生成のためのヒト末梢血単核球の刺激に特に有効である。
【０１０１】
・ヌクレオシド類似体、例えば：（ａ）イサトラビン（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：
【０１０２】
【化６】
およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１４９〜１５１に開示された化合物ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１５２］など。
【０１０３】
・参考文献１５３に開示された化合物、例えば：アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１５４，１５５］、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１５６］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン化合物、およびベンズアゾール化合物［１５７］。
【０１０４】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（ＲＣ−５２９［１５８，１５９］など）。
【０１０５】
・ホスファゼン（例えば、参考文献１６０および１６１に記載のポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）など）
・置換型尿素あるいは式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはその塩：
【０１０６】
【化７】
（参考文献１６２に規定、「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、ＥＲ８０４０５８）、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、ＥＲ８０３０２２または「ＥＲ８０４０５７」など、例えば：
【０１０７】
【化８】
・ＯＭ−１７４などの大腸菌由来のリピドＡの誘導体（参考文献１６３および１６４に記載）。
【０１０８】
・リン酸基含有非環式主鎖に連結された脂質を含む化合物（ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１６５，１６６］：
【０１０９】
【化９】
など）。
【０１１０】
このようなおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１７０および１７１に、より詳細に論考されている。
【０１１１】
本発明で有用な具体的な水中油型乳剤アジュバントとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１１２】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロン乳剤。この乳剤の組成は、容量基準で、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ８５であり得る。重量の観点からは、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として知られており［１６７〜１６９］、参考文献１７０の第１０章および参考文献１７１の第１２章に、より詳細に記載されている。ＭＦ５９乳剤は、好都合には、クエン酸イオンを含むもの（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）である。
【０１１３】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ８０の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。また、これは、Ｓｐａｎ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンを含み得る。この乳剤は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定な乳剤が得られるため、好ましくは≦１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容量比で存在し得る。かかる乳剤の一例は、Ｔｗｅｅｎ８０をＰＢＳに溶解させて２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールと５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合し、次いでこの混合物を微小流動化することにより作製され得る。得られる乳剤は、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロン油滴を有し得る。
【０１１４】
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）の乳剤。この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）もまた含み得る。この乳剤は、リン酸緩衝液を含み得る。
【０１１５】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含む乳剤。この乳剤は、これらの３種類の成分を、約７５：１１：１０の質量比で含むもの（例えば、７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのα−トコフェロールスクシネート）を含み得、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むはずである。また、この乳剤は、スクアレンを含み得る。また、この乳剤は、３ｄ−ＭＰＬ（下記参照）も含み得る。水相には、リン酸緩衝液が含まれ得る。
【０１１６】
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）の乳剤。この乳剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で製剤化され得る。この乳剤は、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、トレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント［１７２］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアラン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）に使用されている。また、「ＡＦ」アジュバント［１７３］（５％のスクアラン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）の場合のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしで使用することもできる。微小流動化が好ましい。
【０１１７】
・０．５〜５０％の油類、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン系界面活性剤を有する乳剤。参考文献１７４に記載のように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴のサイズが好都合である。
【０１１８】
・非代謝性の油類（軽鉱油など）と、少なくとも１種類の界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）とのサブミクロン水中油型乳剤。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン脂肪親和性結合体（例えば、ＧＰＩ−０１００（参考文献１７５に記載、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって作製））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加剤を含めてもよい。
【０１１９】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）とステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合している乳剤［１７６］。
【０１２０】
好ましい乳剤アジュバントは、≦ｌμｍ、例えば、≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍまたはより小さい平均液滴サイズを有するものである。このような液滴サイズは、微小流動化などの手法によって簡便に得られ得る。
【０１２１】
一部の実施形態において、特に、β−グルカンがラミナリン型である場合、該組成物は、好ましくは、アジュバントとして完全フロイントアジュバントまたは野生型コレラ毒素を加えたものではない。
【０１２２】
組成物中の抗原およびアジュバントは、典型的には混合された状態である。
【０１２３】
アルミニウム塩が結合体のアジュバントとして使用される場合、組成物中の結合体の少なくとも５０質量％、例えば、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、＞９９％または１００％が塩に吸着されることが好ましい。＞９９％の吸着は、水酸化物塩を用いて容易に達成され得る。
【０１２４】
該組成物は、２種類以上の前記アジュバントを含むものであってもよい。実施例に示されるように、かかる併用により、グルカン結合体によって誘起される免疫応答が改善され得る。個々のアジュバントは、Ｔｈ１応答またはＴｈ２応答のいずれかを優先的に誘導するものであり得、有用なアジュバントの組合せは、Ｔｈ２アジュバント（例えば、水中油型乳剤またはアルミニウム塩）と、Ｔｈ１アジュバント（例えば、３ｄＭＰＬ、サポニン、または免疫刺激性オリゴヌクレオチド）の両方を含み得る。例えば、該組成物は、好都合には：アルミニウム塩と免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドの両方；アルミニウム塩と式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の両方；水中油型乳剤と式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物の両方；水中油型乳剤と免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドのの両方；アルミニウム塩とα−グリコシルセラミドの両方；水中油型乳剤とα−グリコシルセラミドの両方；水中油型乳剤と３ｄＭＰＬの両方；水中油型乳剤とサポニンの両方；などを含み得る。
【０１２５】
医薬組成物
本発明は、（ａ）本発明のグルカンまたは結合体、（ｂ）上記のようなアジュバント、および（ｃ）薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。かかる担体の充分な論考は、参考文献１７７において入手可能である。
【０１２６】
微生物感染症は、身体の種々の領域を侵すため、本発明の組成物は種々の形態で調製され得る。例えば、該組成物は注射用剤として、液状の液剤または懸濁剤のいずれかとして調製され得る。また、液状ビヒクル中の液剤または懸濁剤に適した注射前の固形形態を調製してもよい。該組成物は、局所投与のためには、例えば、軟膏、クリーム剤または粉末剤として調製され得る。該組成物は、経口投与のためには、例えば、錠剤もしくはカプセル剤として、またはシロップ剤（任意選択でフレーバーを添加）として調製され得る。該組成物は、肺内投与のためには、例えば、微粉末またはスプレーを使用し、吸入剤として調製され得る。該組成物は、坐剤または膣坐薬として調製され得る。該組成物は、経鼻、経耳または経眼投与のためには、例えば、滴剤、スプレー剤または粉末剤として調製され得る［例えば、１７８］。
【０１２７】
医薬組成物は、好ましくは滅菌されたものである。好ましくは発熱物質を含まない。
【０１２８】
該組成物は、好ましくは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８、一般的にはｐＨ７前後に緩衝化したものである。該組成物は、水性であってもよく、凍結乾燥させたものであってもよい。本発明者らは、本発明の医薬組成物の液状製剤は不安定であり得ることを見い出した（図１７および１８）。したがって、凍結乾燥製剤が好ましかろう。他方において、本発明者らはまた、水中油型乳剤アジュバント、特にＭＦ５９によって医薬組成物の液状製剤の安定性が改善され得ることを見い出した（図１７および１８）。したがって、医薬組成物を液状製剤として調製する場合、アジュバントに水中油型乳剤を含めることが好ましい。
【０１２９】
また、本発明は、本発明の医薬組成物を内包する送達デバイスを提供する。デバイスは、例えば、シリンジまたは吸入器であり得る。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、免疫学的有効量のグルカン免疫原を含む免疫原性組成物である。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部としての個体への該量の投与が、処置または予防に有効であることを意図する。この量は、処置対象の個体の健康状態および体調、処置対象の個体（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）の年齢、分類群、個体の免疫機構が抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ワクチンの配合、病状に対する処置担当医師の評価、ならびに他の関連要素に応じて異なる。この量は、常套的な治験によって決定され得る比較的広い範囲を含むことが予測される。
【０１３１】
製剤化したら、本発明の組成物を被験体に直接投与してもよい。処置対象の被験体は動物であり得る；特に、ヒト被験体が処置され得る。
【０１３２】
本発明の免疫原性組成物は、治療的（すなわち、既に存在する感染を処置するため）または予防的（すなわち、将来的な感染を予防するため）に使用され得る。治療的免疫処置は、免疫無防備状態の被験体におけるカンジダ感染の処置に特に有用である。
【０１３３】
医療処置および用途
また、本発明は、医薬における使用のための、例えば、哺乳動物の抗体応答を惹起することにおける使用のための、本発明のアジュバント添加グルカンまたは結合体を提供する。
【０１３４】
また、本発明は、本発明のアジュバント添加グルカン、結合体または医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法を提供する。
【０１３５】
また、本発明は、哺乳動物において微生物感染を予防または処置するための医薬の製造における（ｉ）本発明のグルカンまたは結合体および（ｉｉ）アジュバントの使用を提供する。
【０１３６】
これらの方法および使用によってもたらされる免疫応答としては、一般的に抗体応答、好ましくは防御的抗体応答が挙げられる。糖免疫処置後の抗体応答の評価方法は、当該分野で周知である。抗体応答は、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＧ応答である。免疫応答は、予防的および／または治療的であり得る。哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【０１３７】
グルカン（特に、β−グルカン）は、ほぼすべての病原性真菌（特に、免疫無防備状態の被験体の感染症に関与するもの）、また細菌病原体および原生動物の必須かつ主要な多糖構成成分であるため、抗グルカン免疫は、広範な病原体および疾患に対して有効性を有し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの免疫処置に生成される抗グルカン血清は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと交差反応性である。このようなヒト感染性真菌因子には化学療法が不充分であるため、抗真菌薬耐性が生じるため、ならびに予防用および治療用ワクチンの必要性の認識が増大しているため、広域スペクトル免疫は特に有用である。
【０１３８】
本発明の使用および方法は、カンジダ属種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓなど）；クリプトコックス属種（Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓなど）；エンテロコッカス属種（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓなど）；連鎖球菌属種（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなど）；リーシュマニア属種（Ｌ．ｍａｊｏｒなど）；アカントアメーバ属種（Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉなど）；アスペルギルス属種（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｌａｖｕｓなど）；ニューモシスティス属種（Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉなど）；ミコバクテリウム属種（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；シュードモナス属種（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）；ブドウ球菌属種（Ｓ．ａｕｒｅｕｓなど）；サルモネラ属種（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなど）；コクシジオイデス属種（Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓなど）；白癬菌属種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍなど）；ブラストミセス属種（Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓなど）；ヒストプラスマ属種（Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍなど）；パラコクシジオイデス属種（Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなど）；フィチウム属種（Ｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍなど）；ならびにエシェリキア属種（大腸菌など）の感染症の処置／防御に特に有用である。
【０１３９】
該使用および方法は、限定されないが：カンジダ症（例えば、肝脾カンジダ症、浸潤性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症および播種性カンジダ症）；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコックス症、皮膚真菌症、スポロトリクス症および他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジウム症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスティス症、鵞口瘡、結核症、ミコバクテリア症、呼吸器系感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、セプシス、敗血症、皮膚および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎ならびに溶血性尿毒症症候群などの疾患の予防／処置に特に有用である。抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ活性は、ＡＩＤＳ患者の感染症の処置に特に有用である。
【０１４０】
免疫処置の有効性は、該組成物の投与後のβ−グルカン（例えば、抗β−グルカン抗体）に対する免疫応答をモニタリングすることにより試験することができる。治療的処置の有効性は、本発明の組成物の投与後の微生物感染をモニタリングすることにより試験することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は、一般的には患者に直接投与する。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、もしくは組織の間隙空間に）、または直腸内、経口、膣内、局所、経皮、皮内、経眼、経鼻、耳内もしくは肺内投与によって行なわれ得る。注射または鼻腔内投与が好ましい。皮下または腹腔内投与が特に好ましい。また、筋肉内投与も好ましい。
【０１４２】
本発明は、全身性および／または粘膜免疫を誘起するために使用され得る。
【０１４３】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人両方の処置に使用され得る。したがって、被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチン接種に好ましい被験体は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、または若年齢者（例えば、≦５歳）である。ワクチンは、これらの群のみに適しているのではなく、集団において、より一般的に使用され得る。
【０１４４】
処置は、単回用量スケジュールであってもよく、複数用量スケジュールであってもよい。複数用量は、初回刺激免疫処置スケジュールおよび／または追加刺激免疫処置スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールでは、種々の用量を同じ経路で与えてもよく、異なる経路で与えてもよく、例えば、非経口で初回免疫刺激し、経粘膜で追加免疫刺激する、経粘膜で初回免疫刺激し、非経口で追加免疫刺激するなどである。免疫未処置患者には１回より多くの投与（典型的には２回の投与）が特に有用である。複数用量は、典型的には少なくとも１週間空けて投与する（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。複数用量スケジュールを使用する場合、少なくとも１回の用量にはアジュバント添加グルカンを含めるが、他の用量（典型的には後の方の用量）は、アジュバントなしのグルカンを含むものであってもよい。同様に、少なくとも１回の用量には、結合体化グルカンを含めるのがよいが、他の用量（典型的には後の方）は、結合体化されていないグルカンを含むものであってもよい。
【０１４５】
本発明の結合体を非グルカン抗原と併用し、多様な病原体に対する同時免疫処置のための単一の組成物にしてもよい。併用ワクチンの作製の代替法として、結合体を患者に、他のワクチンと実質的に同時（例えば、同じ医療診察中または健康管理従事者もしくはワクチン接種施設への訪問時）に投与してもよい。このような併用ワクチンにおける使用のため、または同時投与のための抗原としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、黄色ブドウ球菌および／または緑膿菌免疫原が挙げられる。
【０１４６】
本発明の組成物は、特に患者が既に感染している場合、抗真菌薬とともに使用され得る。抗真菌薬により即時性の治療効果がもたらされ、一方、免疫原性組成物により長期持続性効果がもたらされる。好適な抗真菌薬としては、限定されないが、アゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール）、ポリエン（例えば、アンフォテリシンＢ）、フルシトシン、およびスクアレンエポキシダーゼインヒビター（例えば、テルビナフィン）が挙げられる［参考文献１７９も参照のこと］。抗真菌薬と免疫原性組成物は、別々に投与してもよく、併用して投与してもよい。別々に投与する場合、典型的には互いに７日以内に投与する。免疫原性組成物を最初に投与した後、抗真菌薬を１回より多く投与するのがよい。
【０１４７】
定義
用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む」組成物は、排他的にＸからなるものであってもよく、何か付加的なものを含むもの（例えば、Ｘ＋Ｙ）であってもよい。
【０１４８】
文言「実質的に」は「完全に」を除外せず、例えば、Ｙが「実質的にない」組成物は、Ｙが完全にないものであり得る。必要に応じて、文言「実質的に」は、本発明の定義で省略されていることがあり得る。
【０１４９】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５０】
特に記載のない限り、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、なんら特定の混合順序を必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在する場合は、２つの成分を互いに合わせ、次いで、この組合せを第３の成分と合わせてもよいなどである。
【０１５１】
動物（特にウシ）由来の物質を細胞の培養に使用する場合、感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から得られたものであるべきである。全般的には、動物由来物質の完全非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０１５２】
化合物を身体に組成物の一部として投与する場合、該化合物を、代替的に、適当なプロドラッグに置き換えてもよい。
【実施例】
【０１５３】
発明を実施するための形態
カードラン結合体化（１）
＞１００ｋＤａの初期ＭＷを有するカードランを、ＤＭＳＯ中ＨＣｌ（０．５Ｍ）を用いた酸加水分解により、８５℃で１０分間処理した。この加水分解生成物は、２５単位前後のＤＰを有していた。
【０１５４】
加水分解された物質をリン酸ナトリウム緩衝液（４００ｍＭ，ｐＨ６．８）で中和し、水で希釈して、出発物質の１０：１希釈液を得た。最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。希釈後、一部沈降が検出され得た。この沈殿物は、おそらく高ＭＷ糖である。
【０１５５】
酢酸アンモニウムを添加し、次いでナトリウムシアノボロヒドリドを添加した。ｐＨを７．０に調整した後、混合物を３７℃で３〜５日間インキュベートした。この処理により、第１級アミノ基がカードラン断片の還元末端に導入された。次いで、このアミノ糖を、３ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。アミノ基をＨａｂｅｅｂ法によって概算した。
【０１５６】
乾燥させたアミノオリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させ、次いで９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを２００ｍＭの最終濃度で添加した。得られた溶液に、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、４８０ｍＭの最終濃度で添加した。このようにして生成したエステル基を、放出されたＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の解析によって概算した。
【０１５７】
乾燥させた活性化オリゴ糖を、ＣＲＭ１９７含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。
【０１５８】
次いで、この結合体を、３０ｋＤａカットオフ膜を用いた限外濾過によって精製した。結合体を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＮＭＲによって特徴付けた。また、この糖（全体および結合体化されていない糖）ならびにタンパク質の含有量を概算した。
【０１５９】
担体としてＣＲＭ１９７の代わりに破傷風トキソイドを使用し、同様の作業を行なった。
【０１６０】
調製した５種類の結合体のロットについて、糖：タンパク質の比は以下のとおりであった（過剰の担体）：
【０１６１】
【数１】
図１は、実施例の結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図２は、そのＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィールを示す。
【０１６２】
ラミナリン結合体化および吸着（２）
ラミナリン結合体を、ＣＲＭ１９７担体を使用し、参考文献２および３に開示されたようにして調製した。１つのそのような結合体は、糖：タンパク質質量比０．４：１を有するものであった。精製後、０．７％の遊離グルカン（結合体化されていない）が残存していた。図３は、結合体化前の担体タンパク質、および最終結合体のＨＰＬＣ−ＳＥＣ解析を示す。
【０１６３】
担体としてＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドを使用し結合体を同様にして調製した。
【０１６４】
５種類の結合体の他のロットでは、糖：タンパク質の比は以下のとおりであった（過剰の担体）：
【０１６５】
【数２】
ＣＲＭ１９７結合体（「ＣＲＭ−Ｌａｍ」）を水酸化アルミニウム塩と、最終アジュバント濃度２ｍｇ／ｍｌで合わせた。塩化ナトリウムを９ｍｇ／ｍｌで、およびリン酸ナトリウムを１０ｍＭで含めた。最終組成物はｐＨ７．０を有し、４６．６μｇ／ｍｌのグルカンを含んでおり、したがって、１５０μｌの投与容量で７μｇ／用量を与えた（マウス試験に適する）。
【０１６６】
最終組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。また、吸着の程度を調べるため、遠心分離し、上清みを並行して解析した。また、ＴＣＡ沈降も使用し、この場合も上清みを解析した。比較のため、非吸着物質も解析し、これは、遊離形態および吸着形態両方の結合体化されていないＣＲＭ１９７であった。アジュバントの存在下では、ＣＲＭ−Ｌａｍおよびまたは結合体化されていないＣＲＭいずれの上清みにおいても、バンドは検出されなかった。
【０１６７】
また、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって上清みを解析することにより、吸着を評価した。２１４ｎｍにピークが測定され、ＣＲＭ−Ｌａｍの吸着の程度は９９．７％と算出された。
【０１６８】
結合体化（３）
合成カードラン（１５ｍｅｒ）およびラミナリン（１７ｍｅｒ）の結合体を、図４に記載の方法に従って調製した。簡単には、表示した合成オリゴ糖を蒸留水中で、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化させた。次いで、９容量のＤＭＳＯを添加した後、トリエチルアミンを最終濃度２００ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体では、グルタル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度２４０ｍＭまで添加した。１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１７ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭの結合体では、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、最終濃度４８０ｍＭまで添加した。次いで、この活性化オリゴ糖を、８０％ｖ／ｖジオキサンを用いた沈降によって精製した。各反応で生成したエステル基の数を、放出されたＮヒドロキシスクシンイミド基の量を測定することにより概算した。次いで、乾燥させた活性化オリゴ糖を、３０ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７溶液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中）に添加した。反応液を攪拌下、室温で一晩維持した。最終物質は、タンパク質１ｍｏｌあたりのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのｍｏｌに関して約５０：１の比を有していた。
【０１６９】
次いで、結合体をＳＤＳ−ＰａｇｅおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。糖およびタンパク質の含有量は、以下のとおりに概算された。
【０１７０】
【数３】
図５は、これらの結合体の７％ｔｒｉｓ−酢酸ゲル（２０μｇ負荷／ウェル）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【０１７１】
ラミナリン結合体化（４）
ラミナリン結合体のさらなるロットを、緩衝液中のリン酸塩の濃度を、ａ）１０ｍＭ（参考文献２および３のとおり、以下、本明細書において「ロット９」）；ｂ）２５ｍＭ；ｃ）５０ｍＭまたはｄ）１００ｍＭ（「ロット１０」）のいずれかとしたこと以外は、参考文献２および３に開示されたようにして調製した。次いで、結合体をＳＥＣ−ＨＰＬＣによって特徴付けた。ロット９では、その他のロットよりも大きな凝集が観察され、ロット１０では凝集は検出され得なかった（図６）。
【０１７２】
免疫原性試験（１）
免疫原性を試験するため、ラミナリン結合体化および吸着（２）で記載のようにして調製したラミナリン結合体を、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスにおいて試験した。
【０１７３】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量７μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、７および２１日目に投与した。血液試料を第０、２１および３５日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した［２，３］。
【０１７４】
第２群および第３群は、単に比較の目的で、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と組み合わせた結合体を用いて初回抗原刺激した（第１日）。第１群には、ＣＦＡ−アジュバント添加ラミナリンとＣＲＭ１９７を与えたが、これらは結合体化させたものではなかった。第４群は、結合体化されていないラミナリン＋ＣＦＡで初回抗原刺激した。第５群にはＣＦＡ単独を与えた。次いで、これらの５つの群に、アジュバントなしのラミナリンとＣＲＭ１９７の混合物（第１群）、アジュバントなしの結合体（第２群）、アジュバントなしのラミナリン（第３群および第４群）またはＰＢＳ（第５群）を、第７日および第２１日に与えた。
【０１７５】
第７群と第８群および第９群〜第１２群には、３回の同一用量の結合体化したラミナリンを、以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント；（ｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント；（ｃ）ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ＣｐＧ １８２６；（ｅ）（ａ）と（ｃ）の組み合わせ；（ｆ）（ｂ）と（ｃ）の組み合わせとともに与えた。第６群と第９群には、それぞれ、第７群と第８群と同様に与えたが、ラミナリンとＣＲＭ１９７を結合体化させなかった。
【０１７６】
抗グルカン抗体（ＧＭＴ）および第３５日目の応答マウス（％）の数を表１に報告する。
【０１７７】
【表１】
Ｌａｍ−ＣＲＭ＝ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン
Ｌａｍ＋ＣＲＭ＝ラミナリンとＣＲＭ１９７の併用、結合体化なし
Ｌａｍ＝結合体化されていないラミナリン、ＣＲＭ１９７なし
ＣＦＡ＝完全フロイントアジュバント
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
この結果は、至適免疫応答には、結合体化と、少なくとも１種類のアジュバントの存在の両方が必要とされることを示す。Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの併用で、良好な結果が得られた。
【０１７８】
第２群と第１１群のマウスのＩｇＧ応答を、より詳細に試験した。３つの場合すべてにおいて、ＩｇＧサブクラス１と３が存在したが、サブクラス２ａと２ｂは存在しなかった。
【０１７９】
免疫原性試験（２）
さらなる研究において、それぞれ、カードラン結合体化（１）と、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製したカードラン結合体とラミナリン結合体の両方を、マウスに投与した。１つより多くのカードラン結合体のロットを試験した。
【０１８０】
実験は、結合体を５μｇの糖用量で使用したこと以外は、本質的に最初の試験と同じとした。結合体は、アジュバントなし、または以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント；（ｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント；（ｃ）（ａ）と１０μｇのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ １８２６の併用；（ｅ）（ｂ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの併用とともにのいずれかで投与した。
【０１８１】
抗グルカン抗体（ＧＭＴ）および第３５日目の応答マウス（％）の数を表２に報告する。
【０１８２】
【表２】
個々のアジュバントでも、ラミナリンおよびカードランの両方の場合で、ＧＭＴと応答マウスの割合の両方が増大され得たが、アジュバントの併用が特に有効であった。Ｔｈ１アジュバントとＴｈ２アジュバントの併用で、良好な結果が得られた。
【０１８３】
すべての群においてＩｇＧ応答は、上記のように、主にサブクラス１および３におけるものであった。
【０１８４】
免疫原性試験（３）
さらなる実験では、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製したラミナリン結合体とカードラン結合体に、アジュバントとしてα−ガラクトシルセラミド（１００ｎｇ）またはＬＴ−Ｋ６３（２μｇ）もまた、単独または他のアジュバントとの併用のいずれかで加えた。また、ＣｐＧアジュバントも、３つの異なる用量（０．５μｇ、５μｇおよび１０μｇ）で試験した。詳細は、１群あたり８匹のマウスとしたこと以外は、先の免疫原性試験の場合と同様にした。結果を表３に示す。
【０１８５】
【表３】
この場合も、アジュバントの併用により最良の結果が得られたが、α−ＧａｌＣｅｒがそれ自体でカードラン結合体に対して有用であったことが例外であった。ＣｐＧアジュバントによる最良の結果は、中程度の用量で得られた。
【０１８６】
免疫原性試験（４）
１６匹の群のマウスに、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン（Ｌａｍ−ＣＲＭ、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製）で、異なるアジュバントと組み合わせて３回、腹腔内（ＩＰ）にて免疫処置した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。また、抗ラミナリン抗体レベルも、ＥＬＩＳＡにおいてＧＧ−Ｚｙｍをラミナリンに置き換えることにより、参考文献３に記載のようにして測定した。
【０１８７】
第３５日目におけるカンジダ細胞壁グルカンに対するＩｇＧ ＧＭＴを、図７（抗ＧＧＺｙｍ抗体レベル）と表４（抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベル）に示す。
【０１８８】
【表４】
この結果は、いくつかの異なるアジュバント製剤での糖結合体化ワクチンＬａｍ−ＣＲＭの免疫原性を示す。
【０１８９】
免疫原性試験（５）
さらなる研究において、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイドのいずれかに結合体化させたラミナリンまたはカードランを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに皮下または腹腔内投与によって投与した。結合体は、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０１９０】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１０匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量５μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に皮下または腹腔内投与によって投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１９１】
第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、以下のアジュバント：（ａ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）；（ｂ）（ａ）とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧ １８２６（１０μｇ）の組み合わせ；および（ｃ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第４群〜第６群は、それぞれ、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は第１群〜第３群と同様に処置した。第７群〜第９群は、それぞれ、ラミナリンをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第１群〜第３群と同様に処置した。同様に、第１０群〜第１２群は、それぞれ、カードランをＣＲＭ１９７ではなく破傷風トキソイドに結合体化させたこと以外は、第４群〜第６群と同様に処置した。
【０１９２】
マウスへのラミナリン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図８に示す。皮下投与後の対応する結果を図９に示す。結果は、一般的に、結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られたことを示す。さらに、一般的に、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した方が良好な結果が得られた（特に、結合体を皮下投与によって投与した場合）。
【０１９３】
同様に、カードラン結合体の腹腔内投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１０に示す。皮下投与後の対応する結果を図１１に示す。ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用した場合、結合体を皮下投与によって投与した場合の方が良好な応答が見られた。
【０１９４】
免疫原性試験（６）
別の試験において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランを、異なる用量の糖を用いてマウスに投与した。結合体は、それぞれ、ラミナリン結合体化および吸着（２）と、カードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０１９５】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、８匹の１２の群にて試験した。結合体を糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０１９６】
第１群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、アジュバントなし、および糖用量５μｇで与えた。第２群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに糖用量５μｇで与えた。この群に投与した結合体の精製時には、リン酸緩衝液を使用した。第３群〜第６群には、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに、それぞれ、糖用量１０μｇ、５μｇ、１μｇまたは０．１μｇで与えた。これらの群に投与した結合体の精製時には、参考文献１８０に記載のように、ヒスチジン緩衝液を使用した。
【０１９７】
第７群〜第１２群は、グルカンをラミナリンではなくカードランとしたこと以外は、第１群〜第６群と同様に処置した。
【０１９８】
種々の糖用量のラミナリン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１２に示す。結果は、すべての用量で応答が見られ、最良の応答は糖用量５μｇで得られたことを示す。
【０１９９】
カードラン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１３に示す。この場合も、結果は、すべての糖用量で応答が見られたことを示す。最良の応答は、糖用量１０μｇと５μｇで得られた。
【０２００】
ラミナリン結合体投与後、第４２日目の抗グルカン抗体（ＧＭＴ）を図１４に示す。抗ＧＧＺｙｍ抗体ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を、抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡのものと比較する。抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡを使用した方が高力価が観察された。
【０２０１】
免疫原性試験（７）
さらなる研究において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを種々の個々のアジュバントと合わせ、マウスに腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２０２】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１６匹の８つの群にて試験した。結合体を５μｇの糖用量で投薬容量１５０μｌにて使用し、第１、１４および２８日目に腹腔内、皮下または筋肉内投与によって投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ＧＧＺｙｍおよび抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２０３】
第１群と第２群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを腹腔内投与によって、以下のアジュバント：（ａ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）；ならびに（ｂ）（４）高用量のＩＣ３１（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）とともに与えた。第３群と第４群は、それぞれ、結合体を皮下投与によって投与したこと以外は、第１群と第２群と同様に処置した。第５群と第６群は、それぞれ、結合体を筋肉内投与によって投与したこと以外は、第１群と第２群と同様に処置した。
【０２０４】
ラミナリン結合体の投与後、第４２日目の抗グルカン（抗ＧＧＺｙｍ）抗体（ＧＭＴ）を図１５に示す。結果は、一般的に、結合体をＭＦ５９アジュバントとともに投与した場合の方が良好な応答が見られたことを示す。さらに、結合体をこのアジュバントとともに投与した場合に見られた応答では、投与様式に対して低い依存性が示された：試験した投与様式ではすべて、このアジュバントでは、ほぼ同じ応答が得られた。抗ラミナリン抗体ＥＬＩＳＡを用いても同様の結果が得られた（図１６）。
【０２０５】
受動防御試験
別の試験において、水酸化アルミニウム、ＩＣ３１またはＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンによって誘導された抗体が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの増殖をインビボで抑止する能力を試験した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２０６】
別々の血清プールを、上記の免疫原性試験（１）、免疫原性試験（４）および免疫原性試験（７）で用いたマウスから採取した。免疫前マウスからさらなる血清プールを採取した。使用前、血清を５６℃で３０分間の処理によって不活化した。
【０２０７】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、４〜５匹の群にて試験した。０．５ｍｌのプール血清を、各マウスに腹腔内投与によって投与した。２時間後、各マウスを０．２ｍｌの培養Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに、尾静脈からの静脈内投与によって、各マウスが５×１０５ＣＦＵを受けるように感染させた。２日後、各マウスを致死させ、左の腎臓を取り出した。各腎臓を、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘを含む０．５ｍｌのＰＢＳの存在下でホモジナイズした。ホモジネートの連続希釈液をＳａｂｏｕｒａｄの寒天上で平板培養し、２８℃で４８時間インキュベートした。
【０２０８】
免疫処置前および免疫処置後の血清で処置したマウスの腎臓内のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの蓄積を図１７および１８に示す。少なくともＩＣ３１またはＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンで免疫処置したマウス由来の免疫処置後の血清で処置したマウス群では、少ない蓄積が観察され得た。したがって、これらのアジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンに対して生成される抗体は、受動免疫を誘発し得る。この効果は、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンに対して生成された抗体で特に明白であった。
【０２０９】
ラミナリン精製
Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出された市販のラミナリン（Ｌ−９６３４、Ｓｉｇｍａ）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液を、ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって解析した。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＡＭＢＤＡＴＭ２５分光測光器を使用し、室温および室内圧で取得した（１．００ｃｍの光路長を有する石英セルを使用）。同じ物質を、デプスフィルタ（ＣｕｎｏＴＭ１０ＳＰフィルタ）を用いた１回、２回または３回の濾過工程後に解析した。結果を図１９に示す。
【０２１０】
フロロタンニン夾雑物（約２７０ｎｍにおけるＵＶ吸光度ピークによって表示）は、各濾過工程後、減少していた。
【０２１１】
安定性解析
種々のアジュバントを用いて液体に製剤化したグルカン結合体の安定性を比較した。結合体は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。試料を３７℃で４週間（図２０）および２〜８℃で６ヶ月間（図２１）保存した。グルカンの放出を、種々の時点での遊離糖％を測定することによりモニターした。遊離糖の測定は、固相抽出（ＳＰＥ）による結合体からの遊離グルカンの分離、続いて高速アニオン交換クロマトグラフィーパルス型電流滴定検出による全グルカンおよび遊離グルカンの定量的測定に基づいたものとする。以下の製剤：
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのヒスチジン緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ、２ｍｇ／ｍＬのＡｌ（ＯＨ）３０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（ＭＦ５９中）；および
Ｌａｍ−ＣＲＭ ２０μｇ／ｍＬ（１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中）、０．９％ＮａＣｌ
を試験した。
【０２１２】
結果は、ＭＦ５９と合わせたグルカン結合体は、水酸化アルミニウム（リン酸緩衝液またはヒスチジン緩衝液中）と合わせたグルカン結合体よりも安定であることを示す。
【０２１３】
また、グルカン結合体の凍結乾燥製剤の安定性も測定した。試料は、４、２５または３７℃で３ヶ月間まで保存した（図２２）。以下の単位用量製剤：
Ｌａｍ−ＣＲＭ １０μｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム３．５ｍｇ、第一リン酸ナトリウム一水和物０．０９２ｍｇ、第二リン酸ナトリウム二水和物０．４８ｍｇ、マンニトール７．３ｍｇ
を試験した。
【０２１４】
免疫原性試験（８）
別の試験において、結合体化（３）に記載のようにして調製した結合体およびＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、種々の個々のアジュバントおよび併用アジュバントと合わせ、マウスに腹腔内投与によって投与した。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンは、結合体化前にアミノ化工程なしで調製したＣＲＭ１９７に対するラミナリンの代替ロット（ロット１１ＡＤ）以外は、ラミナリン結合体化および吸着（２）に記載のようにして調製した。
【０２１５】
ＣＤ２Ｆ１マウス（４〜６週齢）を、１６匹の１１の群にて試験した。結合体を５μｇの糖用量で投薬容量１５０μｌにて使用し、腹腔内投与によって第１、１４および２８日目に投与した。血液試料を第０、２８および４２日目に採取し、抗ラミナリン抗体レベルをＥＬＩＳＡによって評価した。
【０２１６】
第１群〜第３群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてアジュバントなしで与えた。第４群〜第６群には、それぞれ、３回の同一用量のａ）１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体；ｂ）１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ結合体；またはｃ）１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体を、すべてＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第７群と第８群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）アジュバントなし；またはｂ）ＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。第９群と第１０群には、それぞれ、３回の同一用量のＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを、ａ）高用量のＩＣ３１（１０００ｎｍｏｌ／ｍｌを超えるオリゴデオキシヌクレオチドおよび４０ｎｍｏｌ／ｍｌのペプチドを有する４９．５μｌの試料）と合わせたＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）；またはｂ）水酸化アルミニウムアジュバント（３００μｇ）とともに与えた。第１１群には、３回の同一用量の異なるＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン調製物をＭＦ５９水中油型乳剤アジュバント（７５μｌ）とともに与えた。
【０２１７】
結合体の投与後、第４２日目の抗ラミナリン抗体（ＧＭＴ）を図２３に示す。結果は、合成カードランおよびラミナリンの結合体は、その他の結合体と同様の免疫原性を有することを示す。アジュバントを存在させた場合、免疫原性は、当該グルカンの合成型を使用することにより改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー７および１１）と比較）。合成グルカンの免疫原性は、より長鎖のスペーサーをグルカンと担体タンパク質の間に使用することにより改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ６β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー２および５）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭおよび１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー３および６）と比較）。アジュバントの非存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させないことによって改善され得る（１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー３）を、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭの投与後に見られた応答（バー１）と比較）。対照的に、アジュバントの存在下では、合成グルカンに対する免疫原性は、β−１，６−分枝を存在させることによって改善され得る（１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー４）を、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ／ＭＦ５９の投与後に見られた応答（バー６）と比較）。ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンでは、結合体化前のアミノ化工程の省略によって免疫原性は抑制されなかった（バー８と１１とを比較）。
【０２１８】
能動防御試験（１）
別の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７結合体化グルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、ラミナリン結合体化（４）（ロット９と１０）およびカードラン結合体化（１）に記載のようにして調製した。
【０２１９】
雌の４週齢のＣＤ２Ｆ１マウス（Ｈａｒｌａｎ）を、３回の用量にて、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはカードランで免疫処置した。各用量は、マウス１匹あたり１０μｇの多糖（０．２ｍｌのＰＢＳ中）：ＭＦ５９（１：１ ｖ／ｖ）からなるものとした。
【０２２０】
免疫処置スケジュールは：
・第０日目−皮下投与による初回用量
・第１４日目−腹腔内投与による２回目の用量
・第２８日目−腹腔内投与による３回目の用量
・第３５日目−採血
・第４０日目−マウス１匹あたり、静脈内投与による５．０×ｌ０５（ラミナリン結合体での免疫処置後）または２．５×１０５（カードラン結合体での免疫処置後）のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ菌株ＢＰ細胞（０．２ｍｌのＰＢＳ中）の真菌抗原刺激
とした。
【０２２１】
防御エンドポイントを、死亡率（メジアン生存期間（ＭＳＴ）および死亡例／全抗原刺激マウスの比）に関して測定した。
【０２２２】
図２４は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンまたはＣＲＭ１９７およびＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表５においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２３】
【表５】
生存期間は、ロット９を受けたマウスよりもロット１０を受けたマウスの方が長かった。
【０２２４】
図２５は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせたＣＲＭ１９７に結合体化したカードランまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表６においても、ＭＳＴに関して、結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２５】
【表６】
生存期間は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりも、ＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスの方が長かった。
【０２２６】
能動防御試験（２）
同様の試験において、ＭＦ５９アジュバントと合わせたＣＲＭ１９７に結合体化された合成グルカンを受けたマウスが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激に対して生存する能力を試験した。結合体は、結合体化（３）に記載のようにして調製した。この試験では、真菌抗原刺激は、５．０×ｌ０５細胞の静脈内投与によるものとした。
【０２２７】
図２６は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの抗原刺激前の、ＭＦ５９と合わせた１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ、ＭＦ５９と合わせた１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭまたはＭＦ５９単独で処置したマウスの生存率を示す。表７においても、ＭＳＴに関して、１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭ結合体で処置したマウスで、長い生存期間が示されている。
【０２２８】
【表７】
１５ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処理により生存期間が長くなったが、１７ｍｅｒ−Ｃ２β（１−３）−ＣＲＭでの処置は、なんら効果を有しないようであった。この結果は、グルカン内の防御的抗体応答の誘導を担うエピトープが、β−１，３結合のみによって他の残基に連結された隣接する少なくとも５つの非末端残基を含むことを示唆する。理論に拘束されることを望まないが、この効果が、能動防御試験（１）において、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリンを受けたマウスよりもＣＲＭ１９７に結合体化したカードランを受けたマウスで見られた防御的抗体応答が大きかったことに寄与している可能性があると考えられる。ＣＲＭ１９７に結合体化したカードラン（この場合、グルカンはβ−１，３−結合残基のみを含む）は、ＣＲＭ１９７に結合体化したラミナリン（この場合、グルカンは、β−１，３−結合残基とβ−１，６−結合残基を含む）よりも多くの割合の防御的エピトープを含んでいる可能性がある。
【０２２９】
本発明は、一例として説明したにすぎず、本発明の範囲および精神の範囲内で変形が行われ得ることは理解されよう。
【０２３０】
【数４】
【０２３１】
【数５】
【０２３２】
【数６】
【０２３３】
【数７】
【０２３４】
【数８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物であって、ただし、成分（ｂ）は完全フロイントアジュバントではなく、コレラ毒素でもない、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記グルカンが単一の分子種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物であって、該グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化されている、免疫原性組成物。
【請求項４】
さらにアジュバントを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルカンが担体タンパク質に結合体化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルカンが前記担体タンパク質に直接結合体化されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記グルカンが前記担体タンパク質にリンカーによって結合体化されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体タンパク質が、細菌毒素もしくはトキソイド、またはその変異体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記グルカンが、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グルカンが、６０個以下のグルコース単糖単位を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記グルカンが、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記グルカンがラミナリンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記グルカンのβ−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基において、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、ならびに／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記グルカンがβ−１，３−結合グルコース残基とβ−１，６−結合グルコース残基との両方を含み、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記グルカンが排他的にβ−１，３結合を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記グルカンがカードランである、請求項１４〜１６いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容され得る担体を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アジュバントが、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンオリゴペプチドを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物に請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法。
【請求項２２】
フロロタンニンをグルカンから分離し、水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有するグルカンを得る工程を含む、グルカンの精製プロセス。
【請求項２３】
前記フロロタンニンが前記グルカンからデプスフィルタを用いた濾過によって分離される、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記グルカンの前記フロロタンニン夾雑物を測定する後続の工程をさらに含む、請求項２２または２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有するグルカン。
【請求項２６】
請求項２２〜２４いずれか１項に記載のプロセスによって取得された、または取得可能なグルカン。
【請求項２７】
結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化されたグルカンの作製方法。
【請求項２８】
前記結合体化工程が、９０〜１１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合体化工程前に前記グルカンをリンカーに結合させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンカーの遊離端がエステル基を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７〜３０いずれか１項に記載の方法によって得られる結合体。
【請求項１】
（ａ）β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカン；ならびに（ｂ）アジュバントを含む免疫原性組成物であって、ただし、成分（ｂ）は完全フロイントアジュバントではなく、コレラ毒素でもない、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記グルカンが単一の分子種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
β−１，３−結合および／またはβ−１，６−結合を含むグルカンを含む免疫原性組成物であって、該グルカンが単一の分子種であり、かつ担体タンパク質に結合体化されている、免疫原性組成物。
【請求項４】
さらにアジュバントを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルカンが担体タンパク質に結合体化されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルカンが前記担体タンパク質に直接結合体化されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記グルカンが前記担体タンパク質にリンカーによって結合体化されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体タンパク質が、細菌毒素もしくはトキソイド、またはその変異体である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記グルカンが、１００ｋＤａ未満（例えば、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グルカンが、６０個以下のグルコース単糖単位を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記グルカンが、一部β−１，６分枝を有するβ−１，３グルカンである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記グルカンがラミナリンである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記グルカンのβ−１，３−結合グルコース残基およびβ−１，６−結合グルコース残基において、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、ならびに／またはβ−１，３結合のみによって他の残基に連結された少なくとも５つの隣接する非末端残基の配列が１つ以上存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記グルカンがβ−１，３−結合グルコース残基とβ−１，６−結合グルコース残基との両方を含み、β−１，６−結合残基に対するβ−１，３結合グルコース残基の比が少なくとも８：１である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記グルカンが排他的にβ−１，３結合を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記グルカンがカードランである、請求項１４〜１６いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
薬学的に許容され得る担体を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アジュバントが、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩；水中油型乳剤；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；および／またはα−グリコシルセラミドの１種類以上を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アジュバントが、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリカチオンオリゴペプチドを含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物に請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法。
【請求項２２】
フロロタンニンをグルカンから分離し、水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有するグルカンを得る工程を含む、グルカンの精製プロセス。
【請求項２３】
前記フロロタンニンが前記グルカンからデプスフィルタを用いた濾過によって分離される、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記グルカンの前記フロロタンニン夾雑物を測定する後続の工程をさらに含む、請求項２２または２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
水中１ｍｇ／ｍｌで、２７０ｎｍにおいて０．１７未満のＵＶ吸光度を有するグルカン。
【請求項２６】
請求項２２〜２４いずれか１項に記載のプロセスによって取得された、または取得可能なグルカン。
【請求項２７】
結合体化工程が、＞１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、担体タンパク質に結合体化されたグルカンの作製方法。
【請求項２８】
前記結合体化工程が、９０〜１１０ｍＭのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で行なわれる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合体化工程前に前記グルカンをリンカーに結合させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リンカーの遊離端がエステル基を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２７〜３０いずれか１項に記載の方法によって得られる結合体。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図４】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図４】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２０１１−５０４４８７（Ｐ２０１１−５０４４８７Ａ）
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３４５６５（Ｐ２０１０−５３４５６５）
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７８５４
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月２６日（２００８．１１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００８／００３５８２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０７７８５４
【国際公開日】平成２１年６月２５日（２００９．６．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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