アスタキサンチンの結晶形
本発明は、以前には非開示の結晶形ＩおよびＩＩと称されるアスタキサンチンの結晶形を記載する。意外なことに、アスタキサンチンの２種の結晶形が、生物学的利用能の改善、特定の有機溶媒中での相対的に高い溶解性、長期安定性の増大を示すことが見出された。例えば、この新規な結晶形は、２０℃〜４０℃の温度で少なくとも９０日間固体形態で安定である。さらに、２種の結晶形は、互いに各々から調製できることが判明した。したがって、本発明はまた、前記結晶形を調製する方法に関する。さらに、本発明は、油または有機溶媒に溶解または懸濁された本発明による２種の結晶形のうちの１種またはそれらの混合物を含む投与形態（以後「製剤」とも呼ばれる）に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンの新規結晶形、前記結晶形を作製する方法、これらの結晶形を含む組成物と製剤および前記修飾物の使用に関する。
【０００２】
飼料産業、特に水産動物養殖産業分野において、アスタキサンチンは、着色とりわけサケ、マスおよびエビの着色に使用される。
【０００３】
アスタキサンチンは、水に不溶性であり、唯一油にわずかに溶解するが、このことは、アスタキサンチンの溶液が直接適用のために利用できないことを意味する。さらに、アスタキサンチンは、酸化および熱処理に極めて弱い。したがって、サケ科における血漿中取り込みおよび肉付着の改善のために、経口による良好な生物学的利用能でアスタキサンチンを供給することは、水産動物飼料生産者および水産動物養殖業者にとって特に関心事である。
【０００４】
この着色剤の生物学的利用能をより高めるために、飼料ペレットへの加工を目的として水に分散性の微粒子アスタキサンチン組成物を調製する幾つかの方法が開発されている。この分散性組成物は、高圧および高温下で溶媒（米国特許第６，８６３，９１４号明細書および米国特許第６，４０６，７３５号明細書）または油類（米国特許第５，３６４，５６３号明細書）に結晶スタキサンチンを溶解した後、ただちにこの有機溶液を水性親水コロイドに分散させることにより調製される。あるいは、カロテノイドを、水性賦形剤−マトリックス中に融解し、溶媒も油も使用することなく圧力下で乳化させる（米国特許第６，０９３，３４８号明細書）。これらの方法は全て、水性分散液から粉末剤または固形剤を調製するためにさらなる加工を必要とする。
【０００５】
先行技術では、アスタキサンチンの特定の結晶形およびアスタキサンチン製剤の調製を目的としたそれらの利用可能性に関して触れていない。本特許出願の発明者は、アスタキサンチンの適切な多形体（＝結晶形）を選択することが飼料添加物産業において非常に重要なことであり、この分子の特定の結晶多形体が、他のものよりもより有用となり得ることを見出した。
【０００６】
「適切な」とは、溶出速度、安定性、溶解度および生物学的利用能などの製品性能に関して重要な問題である最終製剤の最良の物理化学的性質を維持することができるアスタキサンチンの多形体を意味する。
【０００７】
［発明の簡単な説明］
意外なことに、アスタキサンチンの２つの結晶形が、生物学的利用能の改善、特定の有機溶媒中での相対的に高い溶解性、長期安定性の増大を示すことが見出された。例えば、この新規な結晶形は固体形態で、２０℃〜４０℃の温度で少なくとも９０日間安定である。
【０００８】
さらに、２つの結晶形は、互いに各々から調製できることが判明した。したがって、本発明はまた、前記結晶形を調製する方法に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、油または有機溶媒に溶解または懸濁された本発明による２種の結晶形のうちの１種またはそれらの混合物を含む投与形態（以後「製剤」とも呼ばれる）に関する。親水性または親油性分散剤担体中にアスタキサンチンを含む固形剤を調製するために、溶液または分散液を使用することができる。
【００１０】
最後に本発明は、水産動物飼育において投与形態の安定性を改善し、アスタキサンチンの生物学的利用能を改善するために、すなわち、この化合物のより高い経口摂取を提供するために、本発明による２種の結晶形のうちの１種の結晶形またはそれらの混合物を含有する製剤の使用に関する。
【００１１】
特に本発明は、結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩと称されるアスタキサンチンの２種の結晶形に関するものであって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°にピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００１２】
好ましい例において、結晶形Ｉは、２３０．８℃±１に相転移を示すことを特徴とする。別の例において、結晶形Ｉは固体形態で、２０℃〜４０℃の温度で少なくとも５ヶ月間、好ましくは、少なくとも９０日間安定である。
【００１３】
別の好ましい例において、結晶形ＩＩは、２１０℃±１に相転移を示すことを特徴とする。別の例において、結晶形ＩＩは、２０℃の温度で少なくとも９０日間固体形態で安定である。
【００１４】
本発明によれば、以下の定義が適用される：
【００１５】
「アスタキサンチン化合物」には、アスタキサンチンの合成および結晶化の時に、または天然源からのアスタキサンチンの抽出工程の時に得られたアスタキサンチン分子が含まれる。
【００１６】
「モル％」とは、アスタキサンチン化合物の全モルのアスタキサンチン含量に関する結晶形の純度を示す。
【００１７】
「親油性分散剤」とは、室温で５ｍｇ／ｍｌより高い水溶性を有し、アスタキサンチンの分子またはコロイド分散または凝集体を固形組成物中に包埋する性質を有する固形物質である。
【００１８】
「親水性分散剤」とは、室温で５ｍｇ／ｍｌ以上の水溶性を有し、水相中アスタキサンチンの懸濁を増強させるために湿潤剤として作用する性質を有する固形物質である。
【００１９】
「固形組成物」とは、相互溶媒または組合せ溶媒中、カロテノイドと親油性または親水性分散剤とを一緒に溶解し、次いで溶媒または溶媒混合物を除去することによって調製される固形マトリックス中にアスタキサンチンが分布していることを意味する。
【００２０】
「水混和性溶媒」とは、その溶媒が、相分離することなく水と任意の比率で混合することができ、例えば、エタノールを意味する。
【００２１】
「水不混和性溶媒」とは、その溶媒が、相分離することなく水と部分的にのみ混合することができ、例えば、ジクロロメタンを意味する。
【００２２】
「結晶化液体」とは、特定の結晶形の結晶化を生じさせる温度で、オール−トランス−アスタキサンチンを溶解する溶媒と混和性であるが、（アスタキサンチンに対し）低溶解力を有するかまたは殆ど溶解性のない液体である。
【００２３】
本発明によるアスタキサンチンの結晶は、当業者によく知られた化学合成から誘導され、オール−トランス−アスタキサンチンである。
【００２４】
物質の多形性およびその相対的温度安定性を確認するために、多くの技法が用いられている。これらの技法としては、粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、熱重量分析、示差走査熱分析（ＤＳＣ）、ラマン分光法、光学顕微鏡ならびに電気顕微鏡、およびＵＶ−ＶＩＳ技法が挙げられる。
【００２５】
大抵の場合、Ｘ線回折法は、結晶構造における違いを反映させることができる。理想的には、単結晶（典型的な寸法１００×１００×１００μｍ３）上のＸ線回折では、通常、十分に分解されたピークの三次元回折図が得られ、それを位相合わせ後、電子密度に逆変換することができる。実際には、所与の材料から求められる質およびサイズの単結晶を得ることは不可能でないとしても困難なことが多い。粉末回折実験において、サンプルは、５×５×３μｍ３の典型的な寸法を有する膨大な数の結晶から構成される。その粉末は、通常、粉砕または摩砕によって得られる。結晶形ＩおよびＩＩの場合、ＸＲＰＤ図は、粉末回折実験によって得られる。
【００２６】
熱分析法は、検体の性質が外部適用温度に応じて決定される技法として定義される。多くの点で、ＤＳＣは、定量的にルーチンで使用するための簡便な方法であり、この理由から、同定および特性化のための広く受け入れられる方法となっている。熱分析の分野および多形性の理解レベルは双方とも、近年急速に成長している。
【００２７】
本発明によれば、異なる多形体間の熱力学的な関係を調べるために、ＤＳＣ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｐｈｏｅｎｉｘ ２０４）を用いる。ＤＳＣセルは、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃、ΔＨｆｕｓ＝２８．５４Ｊ．ｇ．−１）により較正する。アスタキサンチン（通常３〜６ｍｇ）を、窒素で掃流しながらＡｌ−パン内で２０℃〜２５０℃に一定速度で加熱した。
【００２８】
ラマン分光法は、振動分光法の一種である。ラマン分光法は、振動情報が分子中の化学結合に特異的であることから、化学で一般的に使用される。したがって、ラマン分光法は、分子を同定できるフィンガープリントを提供する。本発明によれば、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＦＴ−ラマン分光ＲＦＳ １００Ｓを用いる。初発レーザーを１２８４ｍｍ−１に設定する。ステンレス製サンプルホルダーを、数マイクログラムの量で用いる。最後にデータを、Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ＯＰＵＳのソフトウェアにより解析する。
【００２９】
本発明により結晶形Ｉは、
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００３０】
さらに結晶形Ｉは、２０℃〜２５℃で０．１〜０．２ｇ／ｍｌのジクロロメタン中の溶解度プロファイルを示す。
【００３１】
本発明により結晶形ＩＩは、
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００３２】
さらに結晶形ＩＩは、２０℃〜２５℃で０．３〜０．４ｇ／ｍｌのジクロロメタン中の溶解度プロファイルを示す。
【００３３】
アスタキサンチン化合物の好ましい一実施形態は、５０重量％から１００重量％の結晶形ＩまたはＩＩから実質的になる。
【００３４】
アスタキサンチン化合物の他の好ましい実施形態は、９５重量％から５重量％の結晶形Ｉおよび５重量％から９５重量％の結晶形ＩＩから実質的になる混合物に関する。
【００３５】
上記のとおり、本発明はまた、アスタキサンチンの結晶形Ｉからアスタキサンチンの結晶形ＩＩへの転化方法および逆への転化方法に関する。
【００３６】
アスタキサンチンの結晶形Ｉから結晶形ＩＩへの転化に関して、その方法は、
（ａ）結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチするか、または
（ｂ）結晶形Ｉを、＞２０ｋＰａの蒸気圧を特徴とする溶媒に溶解してから溶媒を蒸発させるか、または
（ｃ）その転化を、有機溶媒、例えば、クロロホルム中スラリー転化により実施することを特徴とする。
【００３７】
アスタキサンチンの結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化に関して、その方法は、有機溶媒、例えば、ジクロロメタンまたは酢酸エチル中スラリー転化によりその転化を実施することを特徴とする。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、ライフサイエンス産業における使用、特に水産動物用飼料産業における使用に関して結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を含む投与形態である。
【００３９】
この目的のために、アスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を、
・有機溶媒または油もしくはそれらの混合物に溶解し、次いでさらに前記投与形態に加工してもよく；
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解し、次いでさらに親油性分散剤を含む前記投与形態に加工してもよく；
・水産動物飼料用ペレットおよび他の適用形態に直接組み込むために、１００℃と２３０℃との間の温度で食用油および／または魚油に直接溶解してもよい。
【００４０】
特に、栄養産業に使用するために、アスタキサンチンの安定な水分散性投与形態を調製する方法を開示する。この方法は、有機溶媒にアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを溶解し、この溶液を水溶液と混合し、形成された分散液を、溶媒と水を除去し、コーティング材料の存在下、結晶形を変化させることなく乾燥することによって水分散性乾燥粉末に転化させることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩのＸ線回折図を示す。
【図２】アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩのラマンスペクトルを示す。
【図３】対照と比較して５００ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１の範囲での結晶形ＩおよびＩＩの２種の製剤のラマンスペクトルを示す。
【００４２】
［図面および実施例の詳細な説明］
アスタキサンチンを得るための好ましい方法は、米国特許第５，６５４，４８８号明細書に記載されたような化学合成を利用することである。合成アスタキサンチンは、ジアステレオマー（３Ｓ，３’Ｓ）、（３Ｒ，３’Ｓ）および（３Ｒ，３’Ｒ）の１：２：１の混合物である。アスタキサンチンを得るためのさらなる方法によるか、または例えば、国際公開第８９／１９９７号パンフレットおよび欧州特許第３２９７５４号明細書に開示された微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）からの方法、または酵母ファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）からの方法である。
【００４３】
水産動物飼料用のアスタキサンチン製剤を調製する公知の技術には、ラマンスペクトル、有機溶媒中の溶解度などの少なくとも１つの他の物理的パラメータに加えてＸＲＰＤおよびＤＳＣにより明確に特性化された特定の結晶形を調製する可能性が開示されていない。この結晶形は、アスタキサンチン組成物を取り扱い製剤化するための幅広い選択を可能にする有機溶媒類および油類中で種々の溶解度を有する。さらに、本発明による結晶形は、インビボ溶出速度に影響を及ぼし、経口投与後、より高い取り込みおよび生物学的利用能を提供する投与形態におけるより高い（過飽和）濃度を可能にする。
【００４４】
図１に示された粉末Ｘ線回折図は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ４回折計により測定された強度データを集めることによって得られた。このシステムは、Ｃｕ陽極およびＣｕ−Ｋα１放射（λ＝１．５４０５６Å）を提供するモノクロメータを装備している。０．００５°のステップ幅および１ステップ当り４秒の捕捉時間を用いて測定を実施した。
【００４５】
図１は、結晶形Ｉと比較した結晶形ＩＩの図を示している。双方の結晶図は、走査範囲において異なる特性ピークを示している。特に結晶形Ｉにおいて２０．３５°に見られる高強度ピークは、結晶形ＩＩの図に存在しない。また、結晶形ＩＩの２θ＝１１．０７°と１８．３２°とに見られた２本のピークは、結晶形Ｉの図と合致しない。
【００４６】
ＤＳＣを用いて、２種の異なる多形体の熱力学的性質を調べた。ＤＳＣセルは、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃、ΔＨｆｕｓ＝２８．５４Ｊ・ｇ−１）により較正した。
【００４７】
異なる多形体を調べるために、結晶形ＩまたはＩＩの３〜５ｍｇのサンプルをそれぞれ、窒素で掃流（１０ｍｌ・ｍｉｎ−１）しながら、５Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で、２０℃〜２５０℃に加熱した。
【００４８】
ＤＳＣ分析では、結晶形Ｉに関して、２２０℃と２３５℃との間にサンプルの融解として認められる１つの吸熱事象を示し、結晶形ＩＩに関して、２００℃と２２０℃との間の範囲でもう１つの吸熱事象を示す。さらに、２１６．６℃に別の小さな吸熱ピークが、結晶形Ｉの加熱痕跡上にも見られる。
【００４９】
さらに共鳴ラマン分光（ＦＴラマン分光器ＲＦＳ１００／Ｓ、Ｂｒｕｋｅｒ）を用いてアスタキサンチンの多型性を調べた。測定は、ラマン顕微鏡および温度制御ユニットを備えたＦＴラマン分光器上で実施した。レーザーは、後方散乱光学により１０２４ｎｍで操作した。
【００５０】
アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩの共鳴ラマンスペクトルを、図２および表１に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
１５１０ｃｍ−１における最も強いバンドは、ポリエン鎖のＣ＝Ｃ伸縮振動に帰属される。１１５５ｃｍ−１における二番目に強いバンドは、Ｃ−Ｃ伸縮と混合したＣ−Ｈ面内変角振動およびＣ＝Ｃ−Ｃ変角振動にそれぞれ帰することができる２つのモードの重複を表す。１００４ｃｍ−１における３番目に強い線は、ＣＨ３面内横ゆれ振動に帰属させることができる。
【００５３】
多形体を識別するスペクトルバンドの多数のシフトおよび差異を見ることができる。９５０ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１までの領域において、例えば、結晶形ＩＩは、１本の鋭角バンドのみを有するが、一方、結晶形Ｉは２本のバンドを示す。
【００５４】
結晶形ＩおよびＩＩは、高度に純粋なアスタキサンチン（すなわち、９５％超）を有する溶液から調製し、次いで十分な量のアスタキサンチン化合物を形成するために、この溶液を、例えば、熱および／または光で処理して最終的な結晶化後、結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを実質的に得ることができる。当然のことながら、結晶形Ｉまたは結晶形ＩＩのいずれかを調製するために、前述の結晶化法は、合成後に実施することが好ましいことを理解されたい。あるいは、アスタキサンチンの結晶を調製するために少なくとも１回の結晶化ステップ、または溶媒を利用する（再）結晶化法が使用される結晶化法はまた、アスタキサンチンの結晶の精製ステップまたは抽出ステップ（化学合成または天然品からのアスタキサンチン化合物の単離の一部として）において実施することができる。
【００５５】
化合物のプロファイルおよび濃度が異っている溶液（一般に、これらの溶液を調製するための好適な溶媒は、結晶化が開始される際の温度で少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌのアスタキサンチンを溶解させる溶媒である）から出発して、結晶形Ｉ、結晶形ＩＩまたは結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩを含む混合物を調製するために考慮され得る同様の原理に基づいた幾つかの結晶化法がある。当業者によって考慮され得る好適な結晶化法としては、限定はしないが、以下の方法が挙げられる。
【００５６】
温度制御条件下、アスタキサンチンの無極性非プロトン性有機溶液から出発して、溶液からの溶媒の除去により、場合によっては混和性極性結晶化液体との同時交換により、結晶化が誘導される。好ましい無極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタンである。代替の塩素化無極性非プロトン性溶媒は、例えば、クロロホルム、トリクロロエタンである。好適な非塩素化代替溶媒は、ジメトキシメタン、ジエトキシエタンおよびジオキサシクロペンタンである。好ましい極性結晶化液体は、メタノール、またはエタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびｔ−ブタノールなどの他のアルカノール類である。
【００５７】
結晶形ＩまたはＩＩを含む結晶は、極性非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒中のアスタキサンチン溶液から蒸発により溶媒を留去することによっても得ることができる。アスタキサンチンに対する高溶解度を有し、かつ低沸点を有する溶媒が好ましい。
【００５８】
結晶化を誘導する別の方法は、無極性非プロトン性溶媒中、（過）飽和溶液の冷却である。好ましい無極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、トルエンまたは代替の塩素化無極性非プロトン性溶媒である。アスタキサンチンに対して高溶解度を有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）およびピリジンなどの極性溶媒をさらに考慮することができる。所望の結晶形の結晶化速度および収率は、結晶化溶液に純粋形態の種を添加することにより増加させることができる。結晶形ＩまたはＩＩを含む結晶は、無極性非プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒中のオール−トランス−アスタキサンチンの所望の濃度を含有するアスタキサンチン溶液を、極性混和性結晶化液体の添加によって希釈することによっても得ることができる。無極性非プロトン性溶媒の例には、ジクロロメタン、トルエンまたは代替の塩素化溶媒がある。その場合の結晶化液体は、メタノールなどのアルカノールである。好適な極性溶媒の例には、ＴＨＦ、ＮＭＰおよびピリジンがある。
【００５９】
生じた結晶は、例えば、当業界に知られたろ過法、自発的沈降法または遠心分離法により採取し、場合によっては、好適な溶媒、好ましくは、冷アルカノール（好ましくはメタノール）により洗浄し、乾燥、好ましくは減圧下での乾燥により採取する。得られた結晶を、さらなる処理のために粉砕して所望の粒径を得ることができる。
【００６０】
結晶形ＩおよびＩＩの混合物は、５％から９５％の結晶形Ｉおよび９５％から５％の結晶形ＩＩ、または２０％から８０％の結晶形Ｉおよび８０％から２０％の結晶形ＩＩを含有することができる。
【００６１】
結晶形Ｉ、結晶形ＩＩおよび２種の結晶形の混合物は、生物への投与に好適な固形剤、半固形剤および液（油性）剤などとしての取込みに好適である。固体形態の好ましい例には、顆粒剤、ペレット剤、散剤などがある。半固体形態の好ましい例には、懸濁剤がある。それらには、特に、油性媒体中、結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたは結晶形ＩおよびＩＩの混合物のミクロン微粒子懸濁剤が含まれる。
【００６２】
結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを用いて調製することができる好ましい投与形態は、例えば、国際公開第０３／１０２１１６号パンフレットに記載されているような油分散性組成物である。結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたはそれらの混合物は、米国特許第２，８６１，８９１号明細書、米国特許第５，３６４，５６３号明細書および米国特許第６，２９６，８７７号明細書に記載されているように、水分散性組成物を調製するためにも使用することができる。
【００６３】
アスタキサンチンを含む固形の組成物および製剤を調製するための通常の方法は、国際公開第０３／１０２１１６号パンフレットに記載されているように、好適な賦形剤存在下、有機溶媒、水混和性溶媒もしくは水不混和性溶媒またはそれらの混合物中に結晶形Ｉ、結晶形ＩＩまたはそれらの混合物を溶解し、次いで水中希釈または蒸発技法により溶媒を除去することである。結晶形ＩまたはＩＩを、それ自体直接使用し、エネルギーを加えることによりアスタキサンチンの油性溶液に溶解させることができる。
【００６４】
溶液を調製するために使用される溶媒、およびアスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を乾燥アスタキサンチン組成物へと処理するために使用される溶媒は、水混和性であってもまたは水不混和性であってもよい。水混和性溶媒および水不混和性溶媒の例としては、上記に挙げる結晶形の結晶化に用いられる溶媒の例が挙げられる。熱／圧力の適用により、常圧および周囲温度下での結晶化の際に使用される結晶化の液体は、アスタキサンチン用溶媒（例えば、イソプロパノール／水）として使用することができる。賦形剤の好ましい例には、親水性であっても親油性であってもよい分散剤、ポリマー類、合成天然ゴム類およびセルロース誘導体がある。
【００６５】
アスタキサンチン固形組成物は、アスタキサンチン総量の２．５重量％から２５重量％の間、好ましくは５重量％から１５重量％の間を占める。組成物に用いられる分散剤の量は、５０重量％から９７．５重量％の間が好ましい。最終形態を作製するための増量剤として、可変量の賦形剤を用いることができる。
【００６６】
好適な親油性分散剤は、エチルセルロース類、合成ならびに天然樹脂類、ロジン類およびゴム類からなる群の特定のメンバーから選択することができる。
【００６７】
好適な親水性分散剤としては、限定はしないが、例えば、ゼラチン、魚ゼラチン、澱粉、デキストリン、植物性タンパク質、ペクチン、アラビアゴム、カゼイン、カゼイン塩、またはそれらの混合物の低分子量および高分子量成分の保護コロイド；タンパク質含有保護コロイドが挙げられ、特に、非ゲル化低分子量タンパク質の加水分解物および高分子量ゲル化ゼラチンが好ましい。さらに親水性分散剤は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン−ポリビニルアセテートコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＭＰＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ポリアクリレート類およびポリメタアクリレート類からなる群のメンバーから選択することができる。
【００６８】
アスタキサンチンの固形剤の好ましい形態は、
（ａ）外（連続）相を形成するマトリックス物質；および
（ｂ）
１）以下２）の封入物質に包埋されるアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩ、
２）室温で固体であり、アスタキサンチンと共に有機溶媒中に均一に可溶性である生理的に許容できる封入物質、
を含む前記マトリックス物質内の内（不連続）相、
を含む。
【００６９】
用語の「封入物質」とは、適用温度で固体であり、活性成分を封入でき、ある一般的な溶媒中、活性成分と共に可溶性である任意の食用物質を意味する。コーティング材料として一般的に用いられる物質を使用することが好ましい。合成または天然のワックスもしくはワックス様物質、または天然または合成の食用ポリマー類を使用することがより好ましい。
【００７０】
ワックスまたはワックス様物質は、例えば、カルナウバ蝋、カンデリラ蝋、蜜蝋、米糠蝋、サトウキビ蝋、コルク蝋、グアルマ蝋（ｇｕａｒｕｍａ ｗａｘ）、オーリカリー蝋、モンタン蝋、鯨蝋、ラノリン、パラフィンワックス、脂肪類、水素化脂肪類、脂肪酸モノグリセリド類、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および脂肪酸エステル類の中から選択されることが好ましい。
【００７１】
天然食用ポリマー類は、修飾（例えば、アルキル化）炭水化物（例えば、澱粉、ペクチン、アルギン酸塩、カラゲナン、フルセララン、キトサン、マルトデキストリン、デキストリン誘導体）、セルロース類およびセルロース誘導体（例えば、セルロースアセテート、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）およびゴム類または修飾（例えば、アルキル化）ゴム類（例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、ガーゴム、ガッティ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、カラヤガム、トラガカントゴム、イナゴマメガム、ゲランガム）から選択されることが好ましい。有機溶媒中の溶解度を改善するために、これらポリマー類の修飾が必要となり得る。
【００７２】
合成ポリマーは、ポリエチレンワックスおよびポリプロピレンワックスなどの合成ワックス類、クマレン−インデン樹脂、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アクリルポリマー類（メタクリル酸コポリマー類およびアンモニオメタクリレートコポリマー類）、ポリオルトエステル類、ポリホスファゼン類、ポリアンヒドリド類、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（γ−エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨイミノカーボネート）、ポリ（ビスフェノールＡイミノカーボネート）およびポリシアノアクリレート、特にアクリルポリマー類の中から選択されることが好ましい。
【００７３】
マトリックス成分は、炭水化物（例えば、セルロース、澱粉、修飾澱粉、デキストリン、ペクチン、アルギン酸塩、カラゲナン、フルセララン、キトサン）、ゴム類（例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、ガーゴム、ガッティ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、カラヤゴム、トラガカントゴム、イナゴマメガム、ゲランガム）、タンパク質（例えば、魚、鶏および哺乳動物のゼラチン、大豆タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ゼイン（トウモロコシ由来）コムギグルテン、ルピナスタンパク質、落花生タンパク質、乳タンパク質または加水分解もしくは修飾乳タンパク質、特にカゼインまたはホエータンパク質）、リグニン類およびリグニン誘導体（例えば、リグノスルホネート類、クラフトリグニン類）、セルロース類およびセルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）の中から選択されることが好ましい。
【００７４】
好ましいマトリックス物質は、ゼラチン、リグノスルホネート類、乳タンパク質または加水分解乳タンパク質、植物性タンパク質または加水分解植物タンパク質、または修飾タンパク質、特にゼラチン、カゼインおよびカゼイン加水分解物、大豆タンパク質、その加水分解物、リグノスルホネート、物理的修飾の大豆タンパク質、澱粉および修飾澱粉、特にオクチルスクシニル澱粉、ペクチン類およびカルボキシメチルセルロースである。
【００７５】
リグノスルホネート、魚ゼラチン、乳タンパク質および加水分解植物タンパク質などの冷水可溶性組成物を提供するマトリックス物質が特に好ましい。
【００７６】
溶媒として、アスタキサンチン化合物を溶解することができる任意の有機溶媒または溶媒の組合せを使用することができる。乳濁液から蒸発し易い揮発性溶媒および溶媒の組合せが好ましい。溶媒の例には、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルエステルがある。
【００７７】
前述のことから明らかであるように、好ましい固形組成物は、封入物質の粒子（液体粒子）が分布している連続相としてマトリックス物質を含む。前記封入物質の粒子（液滴）内に、アスタキサンチンが分布している。このような組成物は、アスタキサンチン粒子がマトリックス物質内に分布している組成物（例えば、欧州特許第５６４ ９８９号明細書を参照）またはアスタキサンチンがコーティング材料でコーティングされている組成物とは区別される。
【００７８】
［実施例］
以下の代表的な実施例は、アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩを調製する方法ならびにアスタキサンチンの結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを投与形態に組み込む方法を例示している。これらの実施例はまた、２種の結晶形が特定の有機溶媒中、相対的に高溶解度を有し、飼料産業において有利である長期の安定性が増加していることを例示している。最後に実施例はまた、結晶形の安定性を改善するため、ならびにアスタキサンチンの生物学的利用能を改善するため、すなわちこの化合物のより高い経口摂取率を提供するために、投与形態中に結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたは規定されたそれらの混合物の使用を例示している。
【００７９】
［実施例１：結晶形Ｉの調製］
上記の方法に従って所望の結晶形を調製するために、Ｓｉｇｍａ（天然アスタキサンチン）およびＥｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ博士（合成アスタキサンチン、分析グレード）からのアスタキサンチンを用いることができる。この化合物の純度は、ＨＰＬＣ測定により決定することができ、Ｘ線回折およびラマンスペクトル法により特性化できる。超純粋アスタキサンチンを、純度のより低いアスタキサンチンから分取ＨＰＬＣにより得ることもできる。
【００８０】
［実施例２：結晶形Ｉから結晶形ＩＩの調製］
アセトンなどの一定の溶媒から熱処理または蒸発により結晶形ＩＩを調製することができる。低溶解度（２０．５℃でアセトン中、およそ８ｍｇ・１００ｍｌ−１）のため、蒸発により得ることができるのは、ごく少量の結晶のみである。したがって結晶調製の主たる方法として熱処理を用いた。
【００８１】
結晶形ＩＩは、結晶形Ｉをその融解温度の直ぐ下まで加熱してからクエンチすることによって生成させた。結晶形Ｉの加熱は、ＤＳＣ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｐｈｏｅｎｉｘ２０４）セル内で実施した。およそ６〜７ｍｇのアスタキサンチンの結晶形Ｉを、Ａｌパン内で２０℃から２００℃まで５Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で加熱してから、２２４℃まで２Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で緩やかに加熱した。この温度に到達した直後に、サンプルを２２４℃から２０℃まで４０Ｋ・ｍｉｎ−１で冷却した。ＤＳＣシステムは、全体を窒素で掃流した。ＸＲＰＤおよびＤＳＣ曲線により、アスタキサンチンの第二の結晶形が確認される。
【００８２】
差動解析技法を用いて多形体を調べた。ＸＲＰＤにより、上記に定義された結晶形ＩＩの存在が証明された。
【００８３】
熱分析により、結晶形Ｉは２３０．４℃で融解し、一方、結晶形ＩＩは２１６．７℃で融解することが示された。最後にラマンスペクトルは、多形体を確認するための十分な情報を提供した。結晶形ＩとＩＩとの間でのラマンバンドのピーク位置およびシフトの相違により、周囲条件での双方の結晶形の識別が可能になる。
【００８４】
［実施例３：溶解度測定］
近年、医薬化合物および栄養化合物に関して、種々の溶媒中での種々の多形体の溶解度に対する関心が増している。
【００８５】
種々の溶媒中、アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩの溶解度を比較した。幾つかの溶媒（イソプロパノールおよびトウモロコシ油）中では、溶解度が極めて低いため、これら２種の溶媒中での実験は、ＵＶ−ＶＩＳメータを用いて測定した。飽和溶液を、二重押し込み容器内で種々の温度で調製し、この溶液の１ｍｌを取り出し、ＵＶ−ＶＩＳメータにより測定した。これらの溶媒中の真の濃度を算出するために、最初に吸光度単位と溶液濃度との間の相関関係を構築することにより較正を行った。
【００８６】
この実験により、溶解度は、溶媒によって著しく異なることが示された。例えば、塩化メチレン（ＤＣＭ）中結晶形ＩＩの溶解度は、２８０ｍｇ・１００ｍｌ−１を超え、一方、イソプロパノール中の溶解度は、３０℃でわずか３．４ｍｇ・１００ｍｌ−１である。これらの溶媒中で結晶形ＩＩのより高い溶解度を見ることができる。
【００８７】
理想的な溶解度は、測定された融点と融合形のＤＣＳデータの熱との式を用いることにより推定することができる。結果は表２に要約してある。
【００８８】
【表２】
【００８９】
温度が上昇すると、溶解度比は一般に低下する（対象のより高い温度で、溶解度決定の温度間にエナンチオトロピー転移がない限り）。アスタキサンチンの結晶形ＩとＩＩとの間の決定された溶解度の比率は、１．５から１．８の範囲である。
【００９０】
［実施例４：溶媒媒介転化−スラリー転化実験］
溶媒媒介多形体転化は、種々の溶媒中の異なる結晶形の相安定性を調べるための効率的な技法である。この技法において、より安定性の低い結晶形が対象の溶媒の飽和溶液中に懸濁する。次いで、より安定性の低い結晶形を犠牲にして、より安定性の高い結晶形が結晶化する。なぜならば、この準安定性の結晶形の見かけの溶解度は最も安定な結晶形の溶解度よりも高いからである。異なる溶媒中の転化比率は、数分から数年と異なるため、転化を促進するか、または遅らせるために適切な溶媒を選択する必要がある。
【００９１】
現在、溶媒の選択はいまだに試行錯誤によって行われており時間がかかる。本発明により、安定性試験を６種の異なる溶媒中のスラリー転化実験によって実施した。結晶形ＩＩ（１つの場合は結晶形Ｉ）を開始形として懸濁させ、得られた結晶をＸＲＰＤにより分析した。
【００９２】
【表３】
【００９３】
２種の結晶形は溶媒媒介転化によって調製できる。表３に挙げた結果から、結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化はＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）とＤＣＭ（塩化メチレン）中でのみ検出されること、および結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化はクロロホルム中でのみ検出されることが分かる。
【００９４】
［実施例５：結晶形ＩまたはＩＩの油形態］
１０ｇのアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを９０ｇの大豆油と混合する。結晶を粉砕する。得られた微粉化懸濁液は粉末製剤の調製に好適である。もしくはフラッシュ加熱操作を用いて直接油中に溶解させた後、乳化剤を含む過剰の油相または水相により冷却することができる。
【００９５】
［実施例６：結晶形ＩおよびＩＩのコロイド分散製剤］
加熱可能な受入れフラスコ内で、２９ｇのイソプロパノール／水（８８／１２、重量／重量）中１．２ｇのエトキシキンの溶液中に、４ｇのアスタキサンチン結晶形ＩまたはＩＩと１．５ｇの落花生油を３０℃で懸濁させる。この懸濁液を、０．２秒の滞留時間、１７０［μ］の混合温度で、５９ｇのイソプロパノール／水（８８／１２、重量／重量）と混合する。得られた分子分散アスタキサンチン溶液をその後直ちにさらなる混合チャンバー内に入れる。８．４ｇのゼラチンＡ（１００ Ｂｌｏｏｍ、分子量＝９４，０００）に追加して４．２ｇのＧｅｌｉｔａ Ｓｏｌ Ｐ（分子量＝２１，０００）および９．２ｇのスクロースを含有する１１．３ｇのゼラチン水溶液をｐＨ９に調整して加え、４５℃でコロイド分散形態におけるアスタキサンチンを沈殿させる。
【００９６】
［実施例７：粉末組成物］
９０ｇのジクロロメタン（Ｆｌｕｋａ）中、８ｇのエチルセルロースＮ４（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）および１ｇのアルファ−トコフェロールと共に１ｇのアスタキサンチン結晶形Ｉを溶解させ、引き続き溶媒を除去し、スプレー顆粒化を用いて顆粒を作製することによって粉末組成物を調製する。
【００９７】
９０ｇのジクロロメタン（Ｆｌｕｋａ）中、８．４ｇのエチルセルロースＮ４（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）および０．８ｇのアルファ−トコフェロールと共に０．８０ｇのアスタキサンチン結晶形ＩＩを溶解させ、引き続き溶媒を除去し、スプレー顆粒化を用いて顆粒を作製することによって、別の粉末組成物を調製する。
【００９８】
［実施例８：アスタキサンチンのビードレット］
６００ｍｌのクロロホルム中、１５ｇのアスタキサンチン結晶形ＩＩの化合物および１５ｇの蜜蝋を、３ｇのエトキシキンと共に溶解させる。３７５ｍｌの脱イオン水中、７５ｇのＮａ−リグノスルホン酸を溶解させる。２０重量／重量％の水酸化ナトリウム溶液を用いて、この溶液のｐＨを７．５±０．５に調整する。高速混合ならびに高せん断力混合機を用いて油相を徐々に水相に加える。添加終了後、高速せん断混合を１５分間続けながら乳濁液の温度を５０℃に維持する。全てのクロロホルムが蒸発するまで、温度を徐々に上げて混合を続ける。乳濁液の温度が約７５℃に達すると、この蒸発は通常完了する。蒸発操作の間、好適な粘度を維持するために、乳濁液中に蒸留水を加える。
【００９９】
全てのクロロホルムが除去された後、スプレーに好適な乳濁液の固体含量と粘度を得るために、蒸留水を加えて乳濁液と完全に混合する。次いで、ラブスプレーパンを用いて、１ｋｇの流動化澱粉の流動床内に乳濁液をスプレーする。残留澱粉を篩い分けによって除去する。
【０１００】
［実施例９：結晶形ＩおよびＩＩの安定性］
結晶形ＩおよびＩＩの２種の固体製剤を上記の方法により調製した。これらの製剤をラマン分光法によって分析し、安定性に関して、安定性の測定に通常用いられる方法であるＵＶ保持によって分析した。
【０１０１】
この実験に用いられたサンプルは：
サンプルＡ：塩化メチレンにより調製した結晶形Ｉ
サンプルＢ：クロロホルムにより調製した結晶形ＩＩ
双方の製剤とも、Ｈ２Ｏ相（Ｃａ−リグノスルホン酸および黄色デキストリン）および油相（ＣＨ２Ｃｌ２）を用いた。
サンプルＣ：対照市販製品として、ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＬｔｄのＣａｒｏｐｈｙｌｌ Ｐｉｎｋ １０％−ＣＷＳを用いた。
この場合、以下のマトリックス組成を用いた：Ｈ２Ｏ相：Ｃａ−リグノスルホン酸および黄色デキストリン；油相：ＣＨ２Ｃｌ２、＆ｄ，ｌ−ａ−トコフェロール、蜜蝋）。
【０１０２】
図３は、対照と比較して、結晶形ＩおよびＩＩの２種の製剤の５００ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１の範囲にあるラマンスペクトルを示している。これらのプロファイルにより、固体製剤サンプルの調製に用いられた２つの結晶形が最終形にまだ存在していることが明らかに示される。
【０１０３】
安定性試験の結果を表４および表５に示す。これらの結果により、製剤化された結晶形は、２０℃で少なくとも９０日間、固体形態で安定であることが示される。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
［実施例１０：生物学的利用能決定のための実験設計］
種々の製剤からのアスタキサンチンの生物学的利用能決定は、見かけの消化率係数（ＡＤＣ）を算出することによって行うことができる。
【０１０７】
例えば、アスタキサンチンのＡＤＣは、非吸収性指標としての酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）に基づいた食餌からの栄養分の正味の分別吸収として算出することができる。
【０１０８】
ＡＤＣは、以下の式を用いて算出できる：
【０１０９】
栄養分のＡＤＣ＝１００−［１００×（飼料中のＹ２Ｏ３％／糞便中のＹ２Ｏ３％）×（糞便中の栄養分％／飼料中の栄養分％）。
【０１１０】
次いで、消化率データをパーセント値の平方根の逆サイナスにおいて転化してから、一元配置分散分析に供することができる。最後に、ＳｔａｔＢｏｘＰｒｏソフトウェア（Ｇｒｉｍｍｅｒｓｏｆｔ、５．０版）を用いて統計的演算を実施することができる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチンの新規結晶形、前記結晶形を作製する方法、これらの結晶形を含む組成物と製剤および前記修飾物の使用に関する。
【０００２】
飼料産業、特に水産動物養殖産業分野において、アスタキサンチンは、着色とりわけサケ、マスおよびエビの着色に使用される。
【０００３】
アスタキサンチンは、水に不溶性であり、唯一油にわずかに溶解するが、このことは、アスタキサンチンの溶液が直接適用のために利用できないことを意味する。さらに、アスタキサンチンは、酸化および熱処理に極めて弱い。したがって、サケ科における血漿中取り込みおよび肉付着の改善のために、経口による良好な生物学的利用能でアスタキサンチンを供給することは、水産動物飼料生産者および水産動物養殖業者にとって特に関心事である。
【０００４】
この着色剤の生物学的利用能をより高めるために、飼料ペレットへの加工を目的として水に分散性の微粒子アスタキサンチン組成物を調製する幾つかの方法が開発されている。この分散性組成物は、高圧および高温下で溶媒（米国特許第６，８６３，９１４号明細書および米国特許第６，４０６，７３５号明細書）または油類（米国特許第５，３６４，５６３号明細書）に結晶スタキサンチンを溶解した後、ただちにこの有機溶液を水性親水コロイドに分散させることにより調製される。あるいは、カロテノイドを、水性賦形剤−マトリックス中に融解し、溶媒も油も使用することなく圧力下で乳化させる（米国特許第６，０９３，３４８号明細書）。これらの方法は全て、水性分散液から粉末剤または固形剤を調製するためにさらなる加工を必要とする。
【０００５】
先行技術では、アスタキサンチンの特定の結晶形およびアスタキサンチン製剤の調製を目的としたそれらの利用可能性に関して触れていない。本特許出願の発明者は、アスタキサンチンの適切な多形体（＝結晶形）を選択することが飼料添加物産業において非常に重要なことであり、この分子の特定の結晶多形体が、他のものよりもより有用となり得ることを見出した。
【０００６】
「適切な」とは、溶出速度、安定性、溶解度および生物学的利用能などの製品性能に関して重要な問題である最終製剤の最良の物理化学的性質を維持することができるアスタキサンチンの多形体を意味する。
【０００７】
［発明の簡単な説明］
意外なことに、アスタキサンチンの２つの結晶形が、生物学的利用能の改善、特定の有機溶媒中での相対的に高い溶解性、長期安定性の増大を示すことが見出された。例えば、この新規な結晶形は固体形態で、２０℃〜４０℃の温度で少なくとも９０日間安定である。
【０００８】
さらに、２つの結晶形は、互いに各々から調製できることが判明した。したがって、本発明はまた、前記結晶形を調製する方法に関する。
【０００９】
さらに、本発明は、油または有機溶媒に溶解または懸濁された本発明による２種の結晶形のうちの１種またはそれらの混合物を含む投与形態（以後「製剤」とも呼ばれる）に関する。親水性または親油性分散剤担体中にアスタキサンチンを含む固形剤を調製するために、溶液または分散液を使用することができる。
【００１０】
最後に本発明は、水産動物飼育において投与形態の安定性を改善し、アスタキサンチンの生物学的利用能を改善するために、すなわち、この化合物のより高い経口摂取を提供するために、本発明による２種の結晶形のうちの１種の結晶形またはそれらの混合物を含有する製剤の使用に関する。
【００１１】
特に本発明は、結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩと称されるアスタキサンチンの２種の結晶形に関するものであって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°にピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００１２】
好ましい例において、結晶形Ｉは、２３０．８℃±１に相転移を示すことを特徴とする。別の例において、結晶形Ｉは固体形態で、２０℃〜４０℃の温度で少なくとも５ヶ月間、好ましくは、少なくとも９０日間安定である。
【００１３】
別の好ましい例において、結晶形ＩＩは、２１０℃±１に相転移を示すことを特徴とする。別の例において、結晶形ＩＩは、２０℃の温度で少なくとも９０日間固体形態で安定である。
【００１４】
本発明によれば、以下の定義が適用される：
【００１５】
「アスタキサンチン化合物」には、アスタキサンチンの合成および結晶化の時に、または天然源からのアスタキサンチンの抽出工程の時に得られたアスタキサンチン分子が含まれる。
【００１６】
「モル％」とは、アスタキサンチン化合物の全モルのアスタキサンチン含量に関する結晶形の純度を示す。
【００１７】
「親油性分散剤」とは、室温で５ｍｇ／ｍｌより高い水溶性を有し、アスタキサンチンの分子またはコロイド分散または凝集体を固形組成物中に包埋する性質を有する固形物質である。
【００１８】
「親水性分散剤」とは、室温で５ｍｇ／ｍｌ以上の水溶性を有し、水相中アスタキサンチンの懸濁を増強させるために湿潤剤として作用する性質を有する固形物質である。
【００１９】
「固形組成物」とは、相互溶媒または組合せ溶媒中、カロテノイドと親油性または親水性分散剤とを一緒に溶解し、次いで溶媒または溶媒混合物を除去することによって調製される固形マトリックス中にアスタキサンチンが分布していることを意味する。
【００２０】
「水混和性溶媒」とは、その溶媒が、相分離することなく水と任意の比率で混合することができ、例えば、エタノールを意味する。
【００２１】
「水不混和性溶媒」とは、その溶媒が、相分離することなく水と部分的にのみ混合することができ、例えば、ジクロロメタンを意味する。
【００２２】
「結晶化液体」とは、特定の結晶形の結晶化を生じさせる温度で、オール−トランス−アスタキサンチンを溶解する溶媒と混和性であるが、（アスタキサンチンに対し）低溶解力を有するかまたは殆ど溶解性のない液体である。
【００２３】
本発明によるアスタキサンチンの結晶は、当業者によく知られた化学合成から誘導され、オール−トランス−アスタキサンチンである。
【００２４】
物質の多形性およびその相対的温度安定性を確認するために、多くの技法が用いられている。これらの技法としては、粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）、熱重量分析、示差走査熱分析（ＤＳＣ）、ラマン分光法、光学顕微鏡ならびに電気顕微鏡、およびＵＶ−ＶＩＳ技法が挙げられる。
【００２５】
大抵の場合、Ｘ線回折法は、結晶構造における違いを反映させることができる。理想的には、単結晶（典型的な寸法１００×１００×１００μｍ３）上のＸ線回折では、通常、十分に分解されたピークの三次元回折図が得られ、それを位相合わせ後、電子密度に逆変換することができる。実際には、所与の材料から求められる質およびサイズの単結晶を得ることは不可能でないとしても困難なことが多い。粉末回折実験において、サンプルは、５×５×３μｍ３の典型的な寸法を有する膨大な数の結晶から構成される。その粉末は、通常、粉砕または摩砕によって得られる。結晶形ＩおよびＩＩの場合、ＸＲＰＤ図は、粉末回折実験によって得られる。
【００２６】
熱分析法は、検体の性質が外部適用温度に応じて決定される技法として定義される。多くの点で、ＤＳＣは、定量的にルーチンで使用するための簡便な方法であり、この理由から、同定および特性化のための広く受け入れられる方法となっている。熱分析の分野および多形性の理解レベルは双方とも、近年急速に成長している。
【００２７】
本発明によれば、異なる多形体間の熱力学的な関係を調べるために、ＤＳＣ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｐｈｏｅｎｉｘ ２０４）を用いる。ＤＳＣセルは、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃、ΔＨｆｕｓ＝２８．５４Ｊ．ｇ．−１）により較正する。アスタキサンチン（通常３〜６ｍｇ）を、窒素で掃流しながらＡｌ−パン内で２０℃〜２５０℃に一定速度で加熱した。
【００２８】
ラマン分光法は、振動分光法の一種である。ラマン分光法は、振動情報が分子中の化学結合に特異的であることから、化学で一般的に使用される。したがって、ラマン分光法は、分子を同定できるフィンガープリントを提供する。本発明によれば、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＦＴ−ラマン分光ＲＦＳ １００Ｓを用いる。初発レーザーを１２８４ｍｍ−１に設定する。ステンレス製サンプルホルダーを、数マイクログラムの量で用いる。最後にデータを、Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ＯＰＵＳのソフトウェアにより解析する。
【００２９】
本発明により結晶形Ｉは、
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００３０】
さらに結晶形Ｉは、２０℃〜２５℃で０．１〜０．２ｇ／ｍｌのジクロロメタン中の溶解度プロファイルを示す。
【００３１】
本発明により結晶形ＩＩは、
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする。
【００３２】
さらに結晶形ＩＩは、２０℃〜２５℃で０．３〜０．４ｇ／ｍｌのジクロロメタン中の溶解度プロファイルを示す。
【００３３】
アスタキサンチン化合物の好ましい一実施形態は、５０重量％から１００重量％の結晶形ＩまたはＩＩから実質的になる。
【００３４】
アスタキサンチン化合物の他の好ましい実施形態は、９５重量％から５重量％の結晶形Ｉおよび５重量％から９５重量％の結晶形ＩＩから実質的になる混合物に関する。
【００３５】
上記のとおり、本発明はまた、アスタキサンチンの結晶形Ｉからアスタキサンチンの結晶形ＩＩへの転化方法および逆への転化方法に関する。
【００３６】
アスタキサンチンの結晶形Ｉから結晶形ＩＩへの転化に関して、その方法は、
（ａ）結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチするか、または
（ｂ）結晶形Ｉを、＞２０ｋＰａの蒸気圧を特徴とする溶媒に溶解してから溶媒を蒸発させるか、または
（ｃ）その転化を、有機溶媒、例えば、クロロホルム中スラリー転化により実施することを特徴とする。
【００３７】
アスタキサンチンの結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化に関して、その方法は、有機溶媒、例えば、ジクロロメタンまたは酢酸エチル中スラリー転化によりその転化を実施することを特徴とする。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、ライフサイエンス産業における使用、特に水産動物用飼料産業における使用に関して結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を含む投与形態である。
【００３９】
この目的のために、アスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を、
・有機溶媒または油もしくはそれらの混合物に溶解し、次いでさらに前記投与形態に加工してもよく；
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解し、次いでさらに親油性分散剤を含む前記投与形態に加工してもよく；
・水産動物飼料用ペレットおよび他の適用形態に直接組み込むために、１００℃と２３０℃との間の温度で食用油および／または魚油に直接溶解してもよい。
【００４０】
特に、栄養産業に使用するために、アスタキサンチンの安定な水分散性投与形態を調製する方法を開示する。この方法は、有機溶媒にアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを溶解し、この溶液を水溶液と混合し、形成された分散液を、溶媒と水を除去し、コーティング材料の存在下、結晶形を変化させることなく乾燥することによって水分散性乾燥粉末に転化させることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩのＸ線回折図を示す。
【図２】アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩのラマンスペクトルを示す。
【図３】対照と比較して５００ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１の範囲での結晶形ＩおよびＩＩの２種の製剤のラマンスペクトルを示す。
【００４２】
［図面および実施例の詳細な説明］
アスタキサンチンを得るための好ましい方法は、米国特許第５，６５４，４８８号明細書に記載されたような化学合成を利用することである。合成アスタキサンチンは、ジアステレオマー（３Ｓ，３’Ｓ）、（３Ｒ，３’Ｓ）および（３Ｒ，３’Ｒ）の１：２：１の混合物である。アスタキサンチンを得るためのさらなる方法によるか、または例えば、国際公開第８９／１９９７号パンフレットおよび欧州特許第３２９７５４号明細書に開示された微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）からの方法、または酵母ファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）からの方法である。
【００４３】
水産動物飼料用のアスタキサンチン製剤を調製する公知の技術には、ラマンスペクトル、有機溶媒中の溶解度などの少なくとも１つの他の物理的パラメータに加えてＸＲＰＤおよびＤＳＣにより明確に特性化された特定の結晶形を調製する可能性が開示されていない。この結晶形は、アスタキサンチン組成物を取り扱い製剤化するための幅広い選択を可能にする有機溶媒類および油類中で種々の溶解度を有する。さらに、本発明による結晶形は、インビボ溶出速度に影響を及ぼし、経口投与後、より高い取り込みおよび生物学的利用能を提供する投与形態におけるより高い（過飽和）濃度を可能にする。
【００４４】
図１に示された粉末Ｘ線回折図は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ４回折計により測定された強度データを集めることによって得られた。このシステムは、Ｃｕ陽極およびＣｕ−Ｋα１放射（λ＝１．５４０５６Å）を提供するモノクロメータを装備している。０．００５°のステップ幅および１ステップ当り４秒の捕捉時間を用いて測定を実施した。
【００４５】
図１は、結晶形Ｉと比較した結晶形ＩＩの図を示している。双方の結晶図は、走査範囲において異なる特性ピークを示している。特に結晶形Ｉにおいて２０．３５°に見られる高強度ピークは、結晶形ＩＩの図に存在しない。また、結晶形ＩＩの２θ＝１１．０７°と１８．３２°とに見られた２本のピークは、結晶形Ｉの図と合致しない。
【００４６】
ＤＳＣを用いて、２種の異なる多形体の熱力学的性質を調べた。ＤＳＣセルは、インジウム（Ｔｍ＝１５６．６℃、ΔＨｆｕｓ＝２８．５４Ｊ・ｇ−１）により較正した。
【００４７】
異なる多形体を調べるために、結晶形ＩまたはＩＩの３〜５ｍｇのサンプルをそれぞれ、窒素で掃流（１０ｍｌ・ｍｉｎ−１）しながら、５Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で、２０℃〜２５０℃に加熱した。
【００４８】
ＤＳＣ分析では、結晶形Ｉに関して、２２０℃と２３５℃との間にサンプルの融解として認められる１つの吸熱事象を示し、結晶形ＩＩに関して、２００℃と２２０℃との間の範囲でもう１つの吸熱事象を示す。さらに、２１６．６℃に別の小さな吸熱ピークが、結晶形Ｉの加熱痕跡上にも見られる。
【００４９】
さらに共鳴ラマン分光（ＦＴラマン分光器ＲＦＳ１００／Ｓ、Ｂｒｕｋｅｒ）を用いてアスタキサンチンの多型性を調べた。測定は、ラマン顕微鏡および温度制御ユニットを備えたＦＴラマン分光器上で実施した。レーザーは、後方散乱光学により１０２４ｎｍで操作した。
【００５０】
アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩの共鳴ラマンスペクトルを、図２および表１に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
１５１０ｃｍ−１における最も強いバンドは、ポリエン鎖のＣ＝Ｃ伸縮振動に帰属される。１１５５ｃｍ−１における二番目に強いバンドは、Ｃ−Ｃ伸縮と混合したＣ−Ｈ面内変角振動およびＣ＝Ｃ−Ｃ変角振動にそれぞれ帰することができる２つのモードの重複を表す。１００４ｃｍ−１における３番目に強い線は、ＣＨ３面内横ゆれ振動に帰属させることができる。
【００５３】
多形体を識別するスペクトルバンドの多数のシフトおよび差異を見ることができる。９５０ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１までの領域において、例えば、結晶形ＩＩは、１本の鋭角バンドのみを有するが、一方、結晶形Ｉは２本のバンドを示す。
【００５４】
結晶形ＩおよびＩＩは、高度に純粋なアスタキサンチン（すなわち、９５％超）を有する溶液から調製し、次いで十分な量のアスタキサンチン化合物を形成するために、この溶液を、例えば、熱および／または光で処理して最終的な結晶化後、結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを実質的に得ることができる。当然のことながら、結晶形Ｉまたは結晶形ＩＩのいずれかを調製するために、前述の結晶化法は、合成後に実施することが好ましいことを理解されたい。あるいは、アスタキサンチンの結晶を調製するために少なくとも１回の結晶化ステップ、または溶媒を利用する（再）結晶化法が使用される結晶化法はまた、アスタキサンチンの結晶の精製ステップまたは抽出ステップ（化学合成または天然品からのアスタキサンチン化合物の単離の一部として）において実施することができる。
【００５５】
化合物のプロファイルおよび濃度が異っている溶液（一般に、これらの溶液を調製するための好適な溶媒は、結晶化が開始される際の温度で少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０ｍｇ／ｍｌのアスタキサンチンを溶解させる溶媒である）から出発して、結晶形Ｉ、結晶形ＩＩまたは結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩを含む混合物を調製するために考慮され得る同様の原理に基づいた幾つかの結晶化法がある。当業者によって考慮され得る好適な結晶化法としては、限定はしないが、以下の方法が挙げられる。
【００５６】
温度制御条件下、アスタキサンチンの無極性非プロトン性有機溶液から出発して、溶液からの溶媒の除去により、場合によっては混和性極性結晶化液体との同時交換により、結晶化が誘導される。好ましい無極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタンである。代替の塩素化無極性非プロトン性溶媒は、例えば、クロロホルム、トリクロロエタンである。好適な非塩素化代替溶媒は、ジメトキシメタン、ジエトキシエタンおよびジオキサシクロペンタンである。好ましい極性結晶化液体は、メタノール、またはエタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノールおよびｔ−ブタノールなどの他のアルカノール類である。
【００５７】
結晶形ＩまたはＩＩを含む結晶は、極性非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒中のアスタキサンチン溶液から蒸発により溶媒を留去することによっても得ることができる。アスタキサンチンに対する高溶解度を有し、かつ低沸点を有する溶媒が好ましい。
【００５８】
結晶化を誘導する別の方法は、無極性非プロトン性溶媒中、（過）飽和溶液の冷却である。好ましい無極性非プロトン性溶媒は、ジクロロメタン、トルエンまたは代替の塩素化無極性非プロトン性溶媒である。アスタキサンチンに対して高溶解度を有するテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）およびピリジンなどの極性溶媒をさらに考慮することができる。所望の結晶形の結晶化速度および収率は、結晶化溶液に純粋形態の種を添加することにより増加させることができる。結晶形ＩまたはＩＩを含む結晶は、無極性非プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒中のオール−トランス−アスタキサンチンの所望の濃度を含有するアスタキサンチン溶液を、極性混和性結晶化液体の添加によって希釈することによっても得ることができる。無極性非プロトン性溶媒の例には、ジクロロメタン、トルエンまたは代替の塩素化溶媒がある。その場合の結晶化液体は、メタノールなどのアルカノールである。好適な極性溶媒の例には、ＴＨＦ、ＮＭＰおよびピリジンがある。
【００５９】
生じた結晶は、例えば、当業界に知られたろ過法、自発的沈降法または遠心分離法により採取し、場合によっては、好適な溶媒、好ましくは、冷アルカノール（好ましくはメタノール）により洗浄し、乾燥、好ましくは減圧下での乾燥により採取する。得られた結晶を、さらなる処理のために粉砕して所望の粒径を得ることができる。
【００６０】
結晶形ＩおよびＩＩの混合物は、５％から９５％の結晶形Ｉおよび９５％から５％の結晶形ＩＩ、または２０％から８０％の結晶形Ｉおよび８０％から２０％の結晶形ＩＩを含有することができる。
【００６１】
結晶形Ｉ、結晶形ＩＩおよび２種の結晶形の混合物は、生物への投与に好適な固形剤、半固形剤および液（油性）剤などとしての取込みに好適である。固体形態の好ましい例には、顆粒剤、ペレット剤、散剤などがある。半固体形態の好ましい例には、懸濁剤がある。それらには、特に、油性媒体中、結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたは結晶形ＩおよびＩＩの混合物のミクロン微粒子懸濁剤が含まれる。
【００６２】
結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを用いて調製することができる好ましい投与形態は、例えば、国際公開第０３／１０２１１６号パンフレットに記載されているような油分散性組成物である。結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたはそれらの混合物は、米国特許第２，８６１，８９１号明細書、米国特許第５，３６４，５６３号明細書および米国特許第６，２９６，８７７号明細書に記載されているように、水分散性組成物を調製するためにも使用することができる。
【００６３】
アスタキサンチンを含む固形の組成物および製剤を調製するための通常の方法は、国際公開第０３／１０２１１６号パンフレットに記載されているように、好適な賦形剤存在下、有機溶媒、水混和性溶媒もしくは水不混和性溶媒またはそれらの混合物中に結晶形Ｉ、結晶形ＩＩまたはそれらの混合物を溶解し、次いで水中希釈または蒸発技法により溶媒を除去することである。結晶形ＩまたはＩＩを、それ自体直接使用し、エネルギーを加えることによりアスタキサンチンの油性溶液に溶解させることができる。
【００６４】
溶液を調製するために使用される溶媒、およびアスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を乾燥アスタキサンチン組成物へと処理するために使用される溶媒は、水混和性であってもまたは水不混和性であってもよい。水混和性溶媒および水不混和性溶媒の例としては、上記に挙げる結晶形の結晶化に用いられる溶媒の例が挙げられる。熱／圧力の適用により、常圧および周囲温度下での結晶化の際に使用される結晶化の液体は、アスタキサンチン用溶媒（例えば、イソプロパノール／水）として使用することができる。賦形剤の好ましい例には、親水性であっても親油性であってもよい分散剤、ポリマー類、合成天然ゴム類およびセルロース誘導体がある。
【００６５】
アスタキサンチン固形組成物は、アスタキサンチン総量の２．５重量％から２５重量％の間、好ましくは５重量％から１５重量％の間を占める。組成物に用いられる分散剤の量は、５０重量％から９７．５重量％の間が好ましい。最終形態を作製するための増量剤として、可変量の賦形剤を用いることができる。
【００６６】
好適な親油性分散剤は、エチルセルロース類、合成ならびに天然樹脂類、ロジン類およびゴム類からなる群の特定のメンバーから選択することができる。
【００６７】
好適な親水性分散剤としては、限定はしないが、例えば、ゼラチン、魚ゼラチン、澱粉、デキストリン、植物性タンパク質、ペクチン、アラビアゴム、カゼイン、カゼイン塩、またはそれらの混合物の低分子量および高分子量成分の保護コロイド；タンパク質含有保護コロイドが挙げられ、特に、非ゲル化低分子量タンパク質の加水分解物および高分子量ゲル化ゼラチンが好ましい。さらに親水性分散剤は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン−ポリビニルアセテートコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＭＰＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ポリアクリレート類およびポリメタアクリレート類からなる群のメンバーから選択することができる。
【００６８】
アスタキサンチンの固形剤の好ましい形態は、
（ａ）外（連続）相を形成するマトリックス物質；および
（ｂ）
１）以下２）の封入物質に包埋されるアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩ、
２）室温で固体であり、アスタキサンチンと共に有機溶媒中に均一に可溶性である生理的に許容できる封入物質、
を含む前記マトリックス物質内の内（不連続）相、
を含む。
【００６９】
用語の「封入物質」とは、適用温度で固体であり、活性成分を封入でき、ある一般的な溶媒中、活性成分と共に可溶性である任意の食用物質を意味する。コーティング材料として一般的に用いられる物質を使用することが好ましい。合成または天然のワックスもしくはワックス様物質、または天然または合成の食用ポリマー類を使用することがより好ましい。
【００７０】
ワックスまたはワックス様物質は、例えば、カルナウバ蝋、カンデリラ蝋、蜜蝋、米糠蝋、サトウキビ蝋、コルク蝋、グアルマ蝋（ｇｕａｒｕｍａ ｗａｘ）、オーリカリー蝋、モンタン蝋、鯨蝋、ラノリン、パラフィンワックス、脂肪類、水素化脂肪類、脂肪酸モノグリセリド類、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および脂肪酸エステル類の中から選択されることが好ましい。
【００７１】
天然食用ポリマー類は、修飾（例えば、アルキル化）炭水化物（例えば、澱粉、ペクチン、アルギン酸塩、カラゲナン、フルセララン、キトサン、マルトデキストリン、デキストリン誘導体）、セルロース類およびセルロース誘導体（例えば、セルロースアセテート、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）およびゴム類または修飾（例えば、アルキル化）ゴム類（例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、ガーゴム、ガッティ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、カラヤガム、トラガカントゴム、イナゴマメガム、ゲランガム）から選択されることが好ましい。有機溶媒中の溶解度を改善するために、これらポリマー類の修飾が必要となり得る。
【００７２】
合成ポリマーは、ポリエチレンワックスおよびポリプロピレンワックスなどの合成ワックス類、クマレン−インデン樹脂、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ（乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、アクリルポリマー類（メタクリル酸コポリマー類およびアンモニオメタクリレートコポリマー類）、ポリオルトエステル類、ポリホスファゼン類、ポリアンヒドリド類、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリジオキサノン、トリメチレンカーボネート、ポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（γ−エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨイミノカーボネート）、ポリ（ビスフェノールＡイミノカーボネート）およびポリシアノアクリレート、特にアクリルポリマー類の中から選択されることが好ましい。
【００７３】
マトリックス成分は、炭水化物（例えば、セルロース、澱粉、修飾澱粉、デキストリン、ペクチン、アルギン酸塩、カラゲナン、フルセララン、キトサン）、ゴム類（例えば、アラビアゴム、キサンタンガム、ガーゴム、ガッティ（ｇｈａｔｔｉ）ガム、カラヤゴム、トラガカントゴム、イナゴマメガム、ゲランガム）、タンパク質（例えば、魚、鶏および哺乳動物のゼラチン、大豆タンパク質、エンドウ豆タンパク質、ゼイン（トウモロコシ由来）コムギグルテン、ルピナスタンパク質、落花生タンパク質、乳タンパク質または加水分解もしくは修飾乳タンパク質、特にカゼインまたはホエータンパク質）、リグニン類およびリグニン誘導体（例えば、リグノスルホネート類、クラフトリグニン類）、セルロース類およびセルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）の中から選択されることが好ましい。
【００７４】
好ましいマトリックス物質は、ゼラチン、リグノスルホネート類、乳タンパク質または加水分解乳タンパク質、植物性タンパク質または加水分解植物タンパク質、または修飾タンパク質、特にゼラチン、カゼインおよびカゼイン加水分解物、大豆タンパク質、その加水分解物、リグノスルホネート、物理的修飾の大豆タンパク質、澱粉および修飾澱粉、特にオクチルスクシニル澱粉、ペクチン類およびカルボキシメチルセルロースである。
【００７５】
リグノスルホネート、魚ゼラチン、乳タンパク質および加水分解植物タンパク質などの冷水可溶性組成物を提供するマトリックス物質が特に好ましい。
【００７６】
溶媒として、アスタキサンチン化合物を溶解することができる任意の有機溶媒または溶媒の組合せを使用することができる。乳濁液から蒸発し易い揮発性溶媒および溶媒の組合せが好ましい。溶媒の例には、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン、アセトン、メチルエチルケトン、塩化メチレン、クロロホルム、トルエン、テトラヒドロフラン、酢酸エチルエステルがある。
【００７７】
前述のことから明らかであるように、好ましい固形組成物は、封入物質の粒子（液体粒子）が分布している連続相としてマトリックス物質を含む。前記封入物質の粒子（液滴）内に、アスタキサンチンが分布している。このような組成物は、アスタキサンチン粒子がマトリックス物質内に分布している組成物（例えば、欧州特許第５６４ ９８９号明細書を参照）またはアスタキサンチンがコーティング材料でコーティングされている組成物とは区別される。
【００７８】
［実施例］
以下の代表的な実施例は、アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩを調製する方法ならびにアスタキサンチンの結晶形Ｉおよび／または結晶形ＩＩを投与形態に組み込む方法を例示している。これらの実施例はまた、２種の結晶形が特定の有機溶媒中、相対的に高溶解度を有し、飼料産業において有利である長期の安定性が増加していることを例示している。最後に実施例はまた、結晶形の安定性を改善するため、ならびにアスタキサンチンの生物学的利用能を改善するため、すなわちこの化合物のより高い経口摂取率を提供するために、投与形態中に結晶形Ｉもしくは結晶形ＩＩまたは規定されたそれらの混合物の使用を例示している。
【００７９】
［実施例１：結晶形Ｉの調製］
上記の方法に従って所望の結晶形を調製するために、Ｓｉｇｍａ（天然アスタキサンチン）およびＥｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ博士（合成アスタキサンチン、分析グレード）からのアスタキサンチンを用いることができる。この化合物の純度は、ＨＰＬＣ測定により決定することができ、Ｘ線回折およびラマンスペクトル法により特性化できる。超純粋アスタキサンチンを、純度のより低いアスタキサンチンから分取ＨＰＬＣにより得ることもできる。
【００８０】
［実施例２：結晶形Ｉから結晶形ＩＩの調製］
アセトンなどの一定の溶媒から熱処理または蒸発により結晶形ＩＩを調製することができる。低溶解度（２０．５℃でアセトン中、およそ８ｍｇ・１００ｍｌ−１）のため、蒸発により得ることができるのは、ごく少量の結晶のみである。したがって結晶調製の主たる方法として熱処理を用いた。
【００８１】
結晶形ＩＩは、結晶形Ｉをその融解温度の直ぐ下まで加熱してからクエンチすることによって生成させた。結晶形Ｉの加熱は、ＤＳＣ（Ｎｅｔｚｓｃｈ Ｐｈｏｅｎｉｘ２０４）セル内で実施した。およそ６〜７ｍｇのアスタキサンチンの結晶形Ｉを、Ａｌパン内で２０℃から２００℃まで５Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で加熱してから、２２４℃まで２Ｋ・ｍｉｎ−１の加熱速度で緩やかに加熱した。この温度に到達した直後に、サンプルを２２４℃から２０℃まで４０Ｋ・ｍｉｎ−１で冷却した。ＤＳＣシステムは、全体を窒素で掃流した。ＸＲＰＤおよびＤＳＣ曲線により、アスタキサンチンの第二の結晶形が確認される。
【００８２】
差動解析技法を用いて多形体を調べた。ＸＲＰＤにより、上記に定義された結晶形ＩＩの存在が証明された。
【００８３】
熱分析により、結晶形Ｉは２３０．４℃で融解し、一方、結晶形ＩＩは２１６．７℃で融解することが示された。最後にラマンスペクトルは、多形体を確認するための十分な情報を提供した。結晶形ＩとＩＩとの間でのラマンバンドのピーク位置およびシフトの相違により、周囲条件での双方の結晶形の識別が可能になる。
【００８４】
［実施例３：溶解度測定］
近年、医薬化合物および栄養化合物に関して、種々の溶媒中での種々の多形体の溶解度に対する関心が増している。
【００８５】
種々の溶媒中、アスタキサンチンの結晶形ＩおよびＩＩの溶解度を比較した。幾つかの溶媒（イソプロパノールおよびトウモロコシ油）中では、溶解度が極めて低いため、これら２種の溶媒中での実験は、ＵＶ−ＶＩＳメータを用いて測定した。飽和溶液を、二重押し込み容器内で種々の温度で調製し、この溶液の１ｍｌを取り出し、ＵＶ−ＶＩＳメータにより測定した。これらの溶媒中の真の濃度を算出するために、最初に吸光度単位と溶液濃度との間の相関関係を構築することにより較正を行った。
【００８６】
この実験により、溶解度は、溶媒によって著しく異なることが示された。例えば、塩化メチレン（ＤＣＭ）中結晶形ＩＩの溶解度は、２８０ｍｇ・１００ｍｌ−１を超え、一方、イソプロパノール中の溶解度は、３０℃でわずか３．４ｍｇ・１００ｍｌ−１である。これらの溶媒中で結晶形ＩＩのより高い溶解度を見ることができる。
【００８７】
理想的な溶解度は、測定された融点と融合形のＤＣＳデータの熱との式を用いることにより推定することができる。結果は表２に要約してある。
【００８８】
【表２】
【００８９】
温度が上昇すると、溶解度比は一般に低下する（対象のより高い温度で、溶解度決定の温度間にエナンチオトロピー転移がない限り）。アスタキサンチンの結晶形ＩとＩＩとの間の決定された溶解度の比率は、１．５から１．８の範囲である。
【００９０】
［実施例４：溶媒媒介転化−スラリー転化実験］
溶媒媒介多形体転化は、種々の溶媒中の異なる結晶形の相安定性を調べるための効率的な技法である。この技法において、より安定性の低い結晶形が対象の溶媒の飽和溶液中に懸濁する。次いで、より安定性の低い結晶形を犠牲にして、より安定性の高い結晶形が結晶化する。なぜならば、この準安定性の結晶形の見かけの溶解度は最も安定な結晶形の溶解度よりも高いからである。異なる溶媒中の転化比率は、数分から数年と異なるため、転化を促進するか、または遅らせるために適切な溶媒を選択する必要がある。
【００９１】
現在、溶媒の選択はいまだに試行錯誤によって行われており時間がかかる。本発明により、安定性試験を６種の異なる溶媒中のスラリー転化実験によって実施した。結晶形ＩＩ（１つの場合は結晶形Ｉ）を開始形として懸濁させ、得られた結晶をＸＲＰＤにより分析した。
【００９２】
【表３】
【００９３】
２種の結晶形は溶媒媒介転化によって調製できる。表３に挙げた結果から、結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化はＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）とＤＣＭ（塩化メチレン）中でのみ検出されること、および結晶形ＩＩから結晶形Ｉへの転化はクロロホルム中でのみ検出されることが分かる。
【００９４】
［実施例５：結晶形ＩまたはＩＩの油形態］
１０ｇのアスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを９０ｇの大豆油と混合する。結晶を粉砕する。得られた微粉化懸濁液は粉末製剤の調製に好適である。もしくはフラッシュ加熱操作を用いて直接油中に溶解させた後、乳化剤を含む過剰の油相または水相により冷却することができる。
【００９５】
［実施例６：結晶形ＩおよびＩＩのコロイド分散製剤］
加熱可能な受入れフラスコ内で、２９ｇのイソプロパノール／水（８８／１２、重量／重量）中１．２ｇのエトキシキンの溶液中に、４ｇのアスタキサンチン結晶形ＩまたはＩＩと１．５ｇの落花生油を３０℃で懸濁させる。この懸濁液を、０．２秒の滞留時間、１７０［μ］の混合温度で、５９ｇのイソプロパノール／水（８８／１２、重量／重量）と混合する。得られた分子分散アスタキサンチン溶液をその後直ちにさらなる混合チャンバー内に入れる。８．４ｇのゼラチンＡ（１００ Ｂｌｏｏｍ、分子量＝９４，０００）に追加して４．２ｇのＧｅｌｉｔａ Ｓｏｌ Ｐ（分子量＝２１，０００）および９．２ｇのスクロースを含有する１１．３ｇのゼラチン水溶液をｐＨ９に調整して加え、４５℃でコロイド分散形態におけるアスタキサンチンを沈殿させる。
【００９６】
［実施例７：粉末組成物］
９０ｇのジクロロメタン（Ｆｌｕｋａ）中、８ｇのエチルセルロースＮ４（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）および１ｇのアルファ−トコフェロールと共に１ｇのアスタキサンチン結晶形Ｉを溶解させ、引き続き溶媒を除去し、スプレー顆粒化を用いて顆粒を作製することによって粉末組成物を調製する。
【００９７】
９０ｇのジクロロメタン（Ｆｌｕｋａ）中、８．４ｇのエチルセルロースＮ４（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）および０．８ｇのアルファ−トコフェロールと共に０．８０ｇのアスタキサンチン結晶形ＩＩを溶解させ、引き続き溶媒を除去し、スプレー顆粒化を用いて顆粒を作製することによって、別の粉末組成物を調製する。
【００９８】
［実施例８：アスタキサンチンのビードレット］
６００ｍｌのクロロホルム中、１５ｇのアスタキサンチン結晶形ＩＩの化合物および１５ｇの蜜蝋を、３ｇのエトキシキンと共に溶解させる。３７５ｍｌの脱イオン水中、７５ｇのＮａ−リグノスルホン酸を溶解させる。２０重量／重量％の水酸化ナトリウム溶液を用いて、この溶液のｐＨを７．５±０．５に調整する。高速混合ならびに高せん断力混合機を用いて油相を徐々に水相に加える。添加終了後、高速せん断混合を１５分間続けながら乳濁液の温度を５０℃に維持する。全てのクロロホルムが蒸発するまで、温度を徐々に上げて混合を続ける。乳濁液の温度が約７５℃に達すると、この蒸発は通常完了する。蒸発操作の間、好適な粘度を維持するために、乳濁液中に蒸留水を加える。
【００９９】
全てのクロロホルムが除去された後、スプレーに好適な乳濁液の固体含量と粘度を得るために、蒸留水を加えて乳濁液と完全に混合する。次いで、ラブスプレーパンを用いて、１ｋｇの流動化澱粉の流動床内に乳濁液をスプレーする。残留澱粉を篩い分けによって除去する。
【０１００】
［実施例９：結晶形ＩおよびＩＩの安定性］
結晶形ＩおよびＩＩの２種の固体製剤を上記の方法により調製した。これらの製剤をラマン分光法によって分析し、安定性に関して、安定性の測定に通常用いられる方法であるＵＶ保持によって分析した。
【０１０１】
この実験に用いられたサンプルは：
サンプルＡ：塩化メチレンにより調製した結晶形Ｉ
サンプルＢ：クロロホルムにより調製した結晶形ＩＩ
双方の製剤とも、Ｈ２Ｏ相（Ｃａ−リグノスルホン酸および黄色デキストリン）および油相（ＣＨ２Ｃｌ２）を用いた。
サンプルＣ：対照市販製品として、ＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＬｔｄのＣａｒｏｐｈｙｌｌ Ｐｉｎｋ １０％−ＣＷＳを用いた。
この場合、以下のマトリックス組成を用いた：Ｈ２Ｏ相：Ｃａ−リグノスルホン酸および黄色デキストリン；油相：ＣＨ２Ｃｌ２、＆ｄ，ｌ−ａ−トコフェロール、蜜蝋）。
【０１０２】
図３は、対照と比較して、結晶形ＩおよびＩＩの２種の製剤の５００ｃｍ−１から１０００ｃｍ−１の範囲にあるラマンスペクトルを示している。これらのプロファイルにより、固体製剤サンプルの調製に用いられた２つの結晶形が最終形にまだ存在していることが明らかに示される。
【０１０３】
安定性試験の結果を表４および表５に示す。これらの結果により、製剤化された結晶形は、２０℃で少なくとも９０日間、固体形態で安定であることが示される。
【０１０４】
【表４】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
［実施例１０：生物学的利用能決定のための実験設計］
種々の製剤からのアスタキサンチンの生物学的利用能決定は、見かけの消化率係数（ＡＤＣ）を算出することによって行うことができる。
【０１０７】
例えば、アスタキサンチンのＡＤＣは、非吸収性指標としての酸化イットリウム（Ｙ２Ｏ３）に基づいた食餌からの栄養分の正味の分別吸収として算出することができる。
【０１０８】
ＡＤＣは、以下の式を用いて算出できる：
【０１０９】
栄養分のＡＤＣ＝１００−［１００×（飼料中のＹ２Ｏ３％／糞便中のＹ２Ｏ３％）×（糞便中の栄養分％／飼料中の栄養分％）。
【０１１０】
次いで、消化率データをパーセント値の平方根の逆サイナスにおいて転化してから、一元配置分散分析に供することができる。最後に、ＳｔａｔＢｏｘＰｒｏソフトウェア（Ｇｒｉｍｍｅｒｓｏｆｔ、５．０版）を用いて統計的演算を実施することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩと称されるアスタキサンチンの結晶形であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする結晶形。
【請求項２】
２３０．８℃±１に相転移を示すことを特徴とする請求項１に記載の結晶形Ｉ。
【請求項３】
２１０℃±１に相転移を示すことを特徴とする請求項１に記載の結晶形ＩＩ。
【請求項４】
２０℃で少なくとも９０日間、固体形体で安定である請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶形。
【請求項５】
安定性および生物学的利用能性が改善された投与形態の調製のために請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶形ＩまたはＩＩの使用。
【請求項６】
水産動物飼料産業における使用のために結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を含む投与形態。
【請求項７】
アスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を、
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解させ、次いで前記投与形態へとさらに加工処理すること；
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解させ、次いで親油性分散剤を含む前記投与形態へとさらに加工処理すること；
・水産動物飼料ペレットおよび他の適用形態に直接組み込むために、１００℃と２３０℃との間の温度で食用油および／または魚油に直接溶解させること、
を特徴とする請求項６に記載の投与形態を製造する方法。
【請求項８】
アスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを有機溶媒に溶解し、この溶液を水溶液と混合し、形成した分散液を、溶媒と水とを除去し、コーティング材料の存在下、前記結晶形を変化させることなく乾燥することによって水分散性乾燥粉末に転化させることにより、栄養産業に使用するための請求項６に記載のアスタキサンチンの安定な水分散性投与形態を調製する方法。
【請求項９】
前記溶液が、アスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを、水−混和性有機溶媒または水と水−混和性有機溶媒との混合物に溶解することにより作製される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アスタキサンチンの生物学的利用能を改善するための請求項６〜９のいずれか一項に記載の投与形態の動物飼育における使用。
【請求項１１】
最終食物または飼料におけるアスタキサンチンの安定性を改善するための請求項６〜９のいずれか一項に記載の投与形態の使用。
【請求項１２】
アスタキサンチンの結晶形Ｉをアスタキサンチンの結晶形ＩＩへと転化するための方法であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とし、
（ａ）結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチするか、または（ｂ）結晶形を、溶媒に溶解してから前記溶媒を蒸発させるか、または（ｃ）前記転化を、有機溶媒中スラリー転化により実施することを特徴とする転化方法。
【請求項１３】
前記結晶形を、＞２０ｋＰａの蒸気圧を特徴とする溶媒中に溶解する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
結晶形Ｉを２０５℃と２１０℃との間まで加熱することを特徴とする、前記結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アスタキサンチンの結晶形ＩＩを、アスタキサンチンの結晶形Ｉへと転化するための方法であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする方法において、
前記転化を、例えば、ジクロロメタンまたは酢酸エチルなどの有機溶媒中のスラリー転化により実施することを特徴とする転化方法。
【請求項１】
結晶形Ｉおよび結晶形ＩＩと称されるアスタキサンチンの結晶形であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする結晶形。
【請求項２】
２３０．８℃±１に相転移を示すことを特徴とする請求項１に記載の結晶形Ｉ。
【請求項３】
２１０℃±１に相転移を示すことを特徴とする請求項１に記載の結晶形ＩＩ。
【請求項４】
２０℃で少なくとも９０日間、固体形体で安定である請求項１〜３のいずれか一項に記載の結晶形。
【請求項５】
安定性および生物学的利用能性が改善された投与形態の調製のために請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶形ＩまたはＩＩの使用。
【請求項６】
水産動物飼料産業における使用のために結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を含む投与形態。
【請求項７】
アスタキサンチンの結晶形ＩもしくはＩＩまたはそれらの混合物を、
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解させ、次いで前記投与形態へとさらに加工処理すること；
・有機溶媒もしくは油またはそれらの混合物に溶解させ、次いで親油性分散剤を含む前記投与形態へとさらに加工処理すること；
・水産動物飼料ペレットおよび他の適用形態に直接組み込むために、１００℃と２３０℃との間の温度で食用油および／または魚油に直接溶解させること、
を特徴とする請求項６に記載の投与形態を製造する方法。
【請求項８】
アスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを有機溶媒に溶解し、この溶液を水溶液と混合し、形成した分散液を、溶媒と水とを除去し、コーティング材料の存在下、前記結晶形を変化させることなく乾燥することによって水分散性乾燥粉末に転化させることにより、栄養産業に使用するための請求項６に記載のアスタキサンチンの安定な水分散性投与形態を調製する方法。
【請求項９】
前記溶液が、アスタキサンチンの結晶形ＩまたはＩＩを、水−混和性有機溶媒または水と水−混和性有機溶媒との混合物に溶解することにより作製される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アスタキサンチンの生物学的利用能を改善するための請求項６〜９のいずれか一項に記載の投与形態の動物飼育における使用。
【請求項１１】
最終食物または飼料におけるアスタキサンチンの安定性を改善するための請求項６〜９のいずれか一項に記載の投与形態の使用。
【請求項１２】
アスタキサンチンの結晶形Ｉをアスタキサンチンの結晶形ＩＩへと転化するための方法であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とし、
（ａ）結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチするか、または（ｂ）結晶形を、溶媒に溶解してから前記溶媒を蒸発させるか、または（ｃ）前記転化を、有機溶媒中スラリー転化により実施することを特徴とする転化方法。
【請求項１３】
前記結晶形を、＞２０ｋＰａの蒸気圧を特徴とする溶媒中に溶解する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
結晶形Ｉを２０５℃と２１０℃との間まで加熱することを特徴とする、前記結晶形Ｉを、その融点未満に加熱してから室温にクエンチする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
アスタキサンチンの結晶形ＩＩを、アスタキサンチンの結晶形Ｉへと転化するための方法であって、
・結晶形Ｉは、以下のパラメータ
ｉ）２０°と２１°との間にピークを含むＸＲＰＤ（粉末Ｘ線回折）図、および
ｉｉ）２２５℃〜２３５℃に相転移を示すＤＳＣ（示差走査熱量計）走査
を特徴とし；
・結晶形ＩＩは、以下のパラメータ
ｉ）およそ１１°と１８°とにピークを含むＸＲＰＤ図、および
ｉｉ）２００℃〜２２０℃に相転移を示すＤＳＣ走査
を特徴とする方法において、
前記転化を、例えば、ジクロロメタンまたは酢酸エチルなどの有機溶媒中のスラリー転化により実施することを特徴とする転化方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１１−５２１９２９（Ｐ２０１１−５２１９２９Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１０３４（Ｐ２０１１−５１１０３４）
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６７４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４４３２９
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月２日（２００９．６．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６７４９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４４３２９
【国際公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【出願人】（５０３２２０３９２）ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． (873)
【Ｆターム（参考）】
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