本発明は、免疫調節の標的としてのアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）の使用に関する。より具体的には、本発明は、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡の調節による免疫関連障害の治療のための、ＣＡＰ１と相互作用し、結合する化合物、具体的には、抗ＣＡＰ１抗体、及び／又はＣＡＰ１分子若しくはその任意の断片の使用に関する。本発明はさらに、ＣＡＰ１と相互作用する免疫調節化合物のスクリーニング方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節の標的としてのアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）の使用に関する。より具体的には、本発明は、ＣＡＰ１又は組成物中のＣＡＰ１と相互作用する化合物の使用及び免疫障害の治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書で引用するすべての参考文献を含む、本出願を通して言及するすべての刊行物は、参照により本明細書に完全に組み込まれている。
【０００３】
ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の６５ｋＤａ熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６５）は、自己免疫性関節炎の病因において重要な役割を果たしている。その効果は、アジュバント関節炎（ＡＡ）の実験的モデルにおいて十分に実証されている。ＡＡは、フロイントアジュバントに懸濁したマイコバクテリア菌の加熱死菌の皮内接種によってＬｅｗｉｓ又はＷｉｓｔａｒなどの感受性近交系ラットにおいて誘発させることができる。ＡＡは、ＨＳＰ６５の残基１８０〜１８８に応答性のＴ細胞クローンにより受動的に転移させることができる［Ｈｏｌｏｓｈｉｔｚ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１９巻、５６〜５８頁（１９８３年）］。
【０００４】
疾患の防御がＨＳＰ６５に対する細胞応答に起因する可能性があるという証拠が報告され［Ｌｉｄｅｒ Ｏ．ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４巻、４５７７〜４５８０頁（１９８７年）；Ｍｏｕｄｇｉｌ Ｋ．ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８５巻、１３０７〜１３１６頁（１９９７年）］、このタンパク質が病因と抵抗性の獲得とに関与する異なるエピトープを含むことが示唆される。本発明者らは、ＡＡに対する抵抗性を、ＨＳＰ６５に対する抗体によっても付与することができ、関節炎抵抗性系統からの免疫グロブリンの関節炎感受性ラットへの静脈内注入により受動的に転移させることができることを以前に示した［Ｕｌｍａｎｓｋｙ Ｒ．及びＹ．Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５巻、９５２〜９５７頁（１９９５年）］。さらなる分析により、ペプチド６と呼ばれる（配列番号１によっても表示される）アミノ酸残基３１〜４６に対する抗ＨＳＰ防御抗体のエピトープ特異性が定義された［Ｕｌｍａｎｓｋｙ Ｒ．及びＹ．Ｎａｐａｒｓｔｅｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８巻、６４６３〜６４６９頁（２００２年）］このペプチドを用いたＬｅｗｉｓラットのワクチン接種は、全分子に対する抗体の産生並びに疾患の誘導に対する抵抗性をもたらす。
【０００５】
本発明者らは、ペプチド６に対するポリクローナル抗体が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）により産生されるＩＬ−１０を刺激することを以前に示した［Ｕｌｍａｎｓｋｙ（２００２年）、前出］。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、炎症応答の抑制を可能にする、主としてその抑制作用により先天性免疫に重要な役割を果たす。本発明者らが産生させたモノクローナル並びにキメラ及びヒト化抗ペプチド６抗体（プロキシマブ（Ｐｒｏｘｉｍａｂ））は、ＰＢＭＣに結合し、該細胞によるＩＬ−１０分泌を刺激することにより、この防御効果を保持することが示された。
【０００６】
本発明者らは、ペプチド６に対する抗体がペプチド６と相互作用するだけでなく、さらに、単球上の表面リガントとも直接的に交差反応し、この相互作用がこれらの抗体の作用機序の理解の手がかりであることも今回示した。単球への抗ペプチド６抗体の結合の後、炎症過程を減弱させ、抑制することにより、炎症性障害の改善及び治療をもたらすサイトカイン、具体的には抗炎症性サイトカインとしてのＩＬ−１０の産生及び分泌の増加につながるシグナル伝達経路の活性化が存在する。これが、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）などの前炎症性Ｔｈ１サイトカインとＩＬ−１０などの抗炎症性Ｔｈ２サイトカインとの間の均衡を傾ける。したがって、抗ペプチド６抗体によってＴｈ１／Ｔｈ２均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節することが、炎症性障害の治療に適用できると本発明者らによって示された。
【０００７】
本発明により示されたように、抗ペプチド６抗体の細胞標的は、ＣＡＰ１タンパク質である。シクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ）は、アクチン細胞骨格の調節に、またシグナル伝達経路において機能する進化的に保存されたタンパク質である。哺乳動物は、関連するＣＡＰ１及びＣＡＰ２をコードする２つのＣＡＰ遺伝子を有する。ＣＡＰ１は、広い組織分布を示すが、ＣＡＰ２は、脳、心臓及び骨格筋及び皮膚においてのみ顕著に発現する。ヒトＣＡＰ１のｃＤＮＡは、同定され、クローニングされ、酵母ＣＡＰタンパク質と相同である４７５アミノ酸タンパク質をコードすることが示された。
【０００８】
最初のＣＡＰは、栄養シグナル伝達時にＲａｓ／環状ＡＭＰ経路のエフェクターとしての役割を果たすサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アデニリルシクラーゼ複合体の成分として単離された。ＣＡＰは、いくつかの機能に関与するドメインを含む多機能性分子である。ＮＨ２末端は、活性化ＲＡＳタンパク質に対する細胞の応答性に必要且つ十分であるが、ＣＯＯＨ末端は、正常細胞の形態及び成長の制御に必要である。酵母における遺伝学的研究で、ＣＡＰが小胞輸送及びエンドサイトーシスに関係するとみなされた。ＣＡＰは、多細胞生物体の発生上の役割を果たしており、キイロショウジョウバエ属の研究で、眼の発生時及び卵母細胞の極性の確立におけるアクチン細胞骨格の重要性が明らかにされた。
【０００９】
ヒトＣＡＰ１は、アクチン−コフィリン複合体の成分である。ヒトＣＡＰは、Ｒａｓ応答性アデニリルシクラーゼに結合するＮ末端ドメイン及びアクチン重合を阻害するＣ末端ドメインを有する二元機能タンパク質である。ＣＡＰ１及びそのＣ末端ドメインは、反矢じり端におけるフィラメントの伸長を促進し、重合性Ｇアクチンを容易に再生する過程である、球状（Ｇ）（単量体）アクチンサブユニット上のＡＤＰ−ＡＴＰ交換を刺激することが認められた。抗ペプチド６抗体と、多分ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼによるＩＬ−１０の発現の誘導をもたらすと本発明により最初に示されたＣＡＰ１分子との直接的な相互作用は、この新規な経路における重要な要素としてのＣＡＰ１の関与を反映している。これらの所見は、この特定の経路の免疫調節の標的としてＣＡＰ１を用いる可能性を立証するものである。さらに、抗ＣＡＰ１抗体は、ＩＬ−１０の発現を誘導することが示され、ＣＡＰ１結合化合物を免疫調節剤として用いる実現可能性が実証された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、免疫関連障害の治療のための方法及び組成物におけるＣＡＰ１と特異的に結合し、相互作用する化合物の使用を提供することが本発明の目的である。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＣＡＰ１及びその任意の断片の免疫調節化合物としての使用を提供することである。
【００１２】
他の目的において、本発明は、免疫調節化合物の同定のためのスクリーニング方法におけるＣＡＰ１の使用を提供する。そのような化合物は、免疫関連障害に罹患している対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節するのに有用である可能性がある。
【００１３】
本発明のこれら及び他の目的は、記述が進むにつれて明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡の調節用の組成物に関する。本発明の組成物は、免疫調節有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含む。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む。
【００１５】
特定の一実施形態によれば、本発明の組成物は、治療有効量の抗ＣＡＰ１抗体を有効成分として含む。
【００１６】
本発明はまた、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節することにより、免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させる治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、免疫調節有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含む。組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、それを必要とする対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させる方法に関する。本発明の方法は、治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せ若しくはそれらを含む任意の組成物の少なくとも１つを対象に投与するステップを含む。
【００１８】
他の態様において、本発明は、免疫関連障害の治療用の組成物の調製における、治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つの使用に関する。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるのに使用される、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を提供する。
【００２０】
本発明はまた、免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるのに使用される、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する免疫調節化合物のスクリーニング方法に関する。本発明の方法は、（ａ）ＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体に結合する候補化合物を得るステップ、（ｂ）抗炎症性サイトカイン発現の調節に基づいて、ステップ（ａ）で選択された化合物の効果を判定するステップを含む。それにより、候補化合物による抗炎症性又は前炎症性サイトカイン発現の調節は、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節する化合物の能力を示す。
【００２２】
本発明はまた、ＣＡＰ１と相互作用することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する免疫調節化合物であって、本発明によるスクリーニング方法により同定される化合物を提供する。
【００２３】
最後に、本発明は、免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるのに有効な薬剤を調製するための、治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含む医薬単位剤形に関する。本発明の剤形は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、以下の図面により明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】マウス抗ペプチド６抗体がｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−１０分泌を誘導することを示す図である。ネイティブヒト単球をマウス抗ペプチド６モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とともにＲＰＭＩ中でインキュベートし（２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２）、培地へのＩＬ−１０の分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。無処理細胞を対照とした。略語：Ｍｏｎ．ｃｅ（単核細胞）；α−ｐｅｐ６（抗ペプチド６（配列番号１）抗体）Ｕｎ．（単位）；ＩＬ−１０（インターロイキン１０）。
【図２】抗ペプチド６抗体がＩＬ−１０転写の一時的アップレギュレーションを誘発することを示す図である。ヒト単球細胞（ＰＢＭＣ）をマウスＢ２４抗ペプチド６モノクローナル抗体、陰性対照としての全ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ抗体又は陽性対照としてのリポ多糖（ＬＰＳ）とともにインキュベートした。図２Ａ 細胞を、ＬＰＳ、全ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ対照又はＢ２４への曝露の４及び２４時間後に収集し、抽出されたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲを用いてアッセイした。ＬＰＳ及び抗ペプチド６抗体は、無処理及びネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ処理細胞と比較して曝露の４時間後にＩＬ−１０ ｍＲＮＡの増加を誘発した。しかし、ｍＲＮＡレベルが曝露の２４時間後に一定のままであったＬＰＳ処理細胞に反して、抗ペプチド６で処理した細胞における発現レベルが抗体との２４時間のインキュベーションの後に低下した。略語：ＵＴ（無処理）；ＬＰＳ（リポ多糖）；ＩｇＭ（ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ抗体）；α−ｐｅｐ６（抗ペプチド６抗体）；ｈｒ（時間）。図２Ｂ ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを等しい負荷についての対照として用いた。略語：ＵＴ（無処理）；ＬＰＳ（リポ多糖）；ＩｇＭ（ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ抗体）；α−ｐｅｐ６（抗ペプチド６抗体）；ｈｒ（時間）。
【図３】プロキシマブがｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１０の発現を誘導し、アジュバント関節炎を軽減することを示す図である。６〜８週齢の雌近交系Ｌｅｗｉｓラットの尾の基部にＣＦＡ中１ｍｇのＭＴ Ｈ３７Ｒａを皮内注射した。動物にリン酸緩衝液（ＰＢＳ陰性対照）、ステロイド又はプロキシマブを投与した。関節炎の重症度は、アジュバント関節炎（ＡＡ）採点法により評価した。関節炎は、盲検化観測者が隔日に次のように評価した。０、関節炎なし；１、関節の紅化；２、関節の紅化及び腫脹。各足蹠の足根及び足根中足関節を採点した。１６の最大スコアを得ることができた。ＩＬ−１０レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、１群当たり２匹のラットの平均値±ＳＥである。略語：Ｃｏｎｔ．（ＰＢＳ陰性対照）；ＰＲＯＸ（プロキシマブ抗体）；ＳＴＲ（ステロイド）；ＡＡ Ｓｃ．（アジュバント関節炎スコア）；ｐｇ／ｍｌ（ピコグラム／ミリリットル）。
【図４Ａ】キメラ抗ペプチド６抗体が単離ＣＤ１４＋ヒト単球ＰＢＭＣに結合することを示す図である。ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４磁気ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから単離し、染色せずに、細胞を抗体の結合についてＦＡＣＳにより解析した。染色しなかった細胞を陰性対照として用いた。細胞を抗体の結合についてＦＡＣＳにより解析した。
【図４Ｂ】キメラ抗ペプチド６抗体が単離ＣＤ１４＋ヒト単球ＰＢＭＣに結合することを示すための図である。ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４磁気ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから単離し、ＦＩＴＣ標識キメラ抗ペプチド６抗体で染色した。細胞を抗体の結合についてＦＡＣＳにより解析した。
【図４Ｃ】キメラ抗ペプチド６抗体が単離ＣＤ１４＋ヒト単球ＰＢＭＣに結合することを示すための図である。ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４磁気ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから単離し、抗ヒトＣＤ１４−ＰＥで染色した。細胞を抗体の結合についてＦＡＣＳにより解析した。
【図４Ｄ】キメラ抗ペプチド６抗体が単離ＣＤ１４＋ヒト単球ＰＢＭＣに結合することを示す図である。ＣＤ１４＋細胞をＣＤ１４磁気ビーズを用いてヒトＰＢＭＣから単離し、ＦＩＴＣ標識キメラ抗ペプチド６抗体及び抗ヒトＣＤ１４−ＰＥの両方で染色した。細胞を抗体の結合についてＦＡＣＳにより解析した。ＣＤ１４陽性であった細胞の大部分がキメラ抗ペプチド６についても陽性であった。
【図５Ａ】プロキシマブがヒトＣＤ１４＋単球ＰＢＭＣに結合することを示す図である。ヒトＰＢＭＣを健常ヒトドナーから単離し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞を抗ＣＤ１４−ＡＰＣ結合抗体で染色した。略語：α−ＣＤ１４（抗ＣＤ１４抗体）。
【図５Ｂ】プロキシマブがヒトＣＤ１４＋単球ＰＢＭＣに結合することを示す図である。ヒトＰＢＭＣを健常ヒトドナーから単離し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞をＦＩＴＣ標識プロキシマブ及びＡＰＣ結合抗ＣＤ１４抗体の両方で染色した。略語：α−ＣＤ１４（抗ＣＤ１４抗体）；ＰＲＯＸ（抗ペプチド６ヒト化抗体）。
【図５Ｃ】プロキシマブがヒトＣＤ１４＋単球ＰＢＭＣに結合することを示す図である。ＦＩＴＣで染色されたＣＤ１４＋集団からの細胞のパーセントを示す（プロキシマブを含まない−黒色、プロキシマブを含む−灰色）。略語：ＰＲＯＸ（抗ペプチド６ヒト化抗体）。
【図６Ａ】キメラ抗ペプチド６抗体及び抗ＣＤ１４抗体が単球膜に結合することを示す図である。ＣＤ１４＋Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６（ＭＭ６）細胞をキメラ抗ペプチド６抗体（ＣＨＭ抗体）とともにインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合抗体のみで染色した。染色後に、細胞を固定し、スライド上にのせ、共焦点顕微鏡下で観察した。略語：ＣＨＭ（キメラ抗ペプチド６抗体）。
【図６Ｂ】キメラ抗ペプチド６抗体及び抗ＣＤ１４抗体が単球膜に結合することを示す図である。ＣＤ１４＋Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６（ＭＭ６）細胞をキメラ抗ペプチド６抗体（ＣＨＭ抗体）とともにインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合抗体並びにマウス抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣで染色した。染色後に、細胞を固定し、スライド上にのせ、共焦点顕微鏡下で観察した。ＣＨＭ抗体のリガンドは、ＣＤ１４陽性細胞の膜表面上にある。略語：ＣＨＭ（キメラ抗ペプチド６抗体）；ＣＤ１４（抗ＣＤ１４抗体）。
【図７】ヒト化抗ペプチド６抗体がヒト単球Ｆｃ受容体を介して結合しないことを示す図である。ＭＭ６細胞を無処理とするか、又は非標識ヒト化抗ペプチド６抗体変異型ＶＫ３若しくはＣＤ３２及びＣＤ６４に対する抗体とともにプレインキュベートし、次にＦＩＴＣ−ＶＫ３で処理し、結合ＦＩＴＣ−ＶＫ３についてＦＡＣＳによりアッセイした。ＦＩＴＣ−ＶＫ３が細胞の３０％に結合した（左のバー）。非蛍光ＶＫ３抗体とのプレインキュベーションにより、結合がＶＫ３−ＦＩＴＣ結合が完全に阻止された（中央のバー）が、両Ｆｃ受容体に対する抗体とのプレインキュベーションは何らの効果ももたらさなかった（右のバー）。略語：ＶＫ３（ＦＩＴＣ結合ヒト化抗ペプチド６抗体）；ＰＲＩ（ＶＫ３）＋ＶＫ３（非標識ＶＫ３と続いてＦＩＴＣ ＶＫ３とのプレインキュベーション）；ＰＲＩ（ＣＤ３２＋ＣＤ６４）＋ＶＫ３（抗ＣＤ３２及び抗ＣＤ６４と続いてＦＩＴＣ ＶＫ３とのプレインキュベーション）。
【図８Ａ】ラット抗ペプチド６抗体がＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。ヒト前単球ＴＨＰ−１細胞をラット抗ペプチド６モノクローナル抗体（Ｂ２４）とともにインキュベートした後、ＦＩＴＣ染色を行い、次にＦＡＣＳ解析に供した。二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ抗ラット）のみとともにインキュベートした細胞を対照とした。
【図８Ｂ】ラット抗ペプチド６抗体がＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。ヒト前単球ＴＨＰ−１細胞をラット抗ペプチド６モノクローナル抗体（Ｂ２４）とともにインキュベートした後、ＦＩＴＣ染色を行い、次にＦＡＣＳ解析に供した。ラット抗ペプチド６モノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞の７５％がＢ２４抗体に結合した。
【図９】モノクローナル抗ペプチド６の標的が単球親水性膜タンパク質であることを示す図である。親水性膜タンパク質、疎水性膜タンパク質及び細胞質タンパク質をＴＨＰ−１細胞から単離し、マウスＢ２４モノクローナル抗ペプチド６抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した（データは示さず）。対照ブロットは、総ラット免疫グロブリン又は培地のみを用いてブロットした。レーン１−親水性膜タンパク質；レーン２−疎水性膜タンパク質；レーン３−細胞質タンパク質。示したように、Ｂ２４抗体は、親水性膜タンパク質の３つの画分５２、１００及び１２０ＫＤａに結合した。陰性対照ブロットには結合は検出されなかった。略語：ＫＤａ（キロダルトン）。
【図１０】抗ペプチド６タンパク質標的の分析を示す図である。ＴＨＰ−１細胞の親水性膜画分をセファロースビーズに結合させたマウスモノクローナル抗ペプチド６抗体を含むアフィニティーカラムに加えた。結合タンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に加え、続いてクマシーブルー染色を行った。レーン２は、ラット抗ペプチド６カラム上のアフィニティークロマトグラフィーを示し、レーン４は、マウス抗ペプチド６カラム上のアフィニティークロマトグラフィーを示す。レーン１及び６はマーカーを含む。約４０及び５０ＫＤａの２つの二重バンドがレーン２及び４に確認することができる。バンドを切り取り、質量分析により分析した。５２ＫＤａバンドを配列決定したところ、アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）を含むことが認められた。
【図１１】抗ペプチド６が５２ｋＤａ膜タンパク質並びにＭＴ−ＨＳＰ６５に結合することを示す図である。抗ペプチド６アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出したＴＨＰ−１親水性膜タンパク質及びＭＴ−ＨＳＰ６５をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に加え、ラット抗ペプチド６抗体（Ｂ２４）を用いたウエスタンブロット分析に供した。アフィニティーカラムから得られた溶出タンパク質を加えたレーンに認められた５２ＫＤａタンパク質と既知重量のＭＴ−ＨＳＰ６５と一致する６５ＫＤａバンドの２つの異なるバンドが検出された。略語：ＭＴ−ＨＳＰ６５（ヒト結核菌熱ショックタンパク質６５）；ＫＤａ（キロダルトン）。
【図１２Ａ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。染色しなかった細胞を陰性対照とした。
【図１２Ｂ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＦＩＴＣで染色した細胞を陰性対照とした。
【図１２Ｃ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＴＨＰ−１細胞の８７％が抗ＣＡＰ１抗体に結合した。
【図１３Ａ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＨｅＬａ細胞に結合しないことを示す図である。ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。染色しなかった細胞を陰性対照とした。略語：Ｕｓ（無染色）、ｃｅ（細胞）。
【図１３Ｂ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＨｅＬａ細胞に結合しないことを示す図である。ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＦＩＴＣで染色した細胞を陰性対照とした。
【図１３Ｃ】抗ＣＡＰ１抗体が完全ＨｅＬａ細胞に結合しないことを示す図である。ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＨｅＬａ細胞の１．５％未満が抗ＣＡＰ１抗体に結合した。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図１４Ａ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。染色しなかった細胞を陰性対照とした。略語：Ｕｓ（無染色）、ｃｅ（細胞）。
【図１４Ｂ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＦＩＴＣで染色した細胞を陰性対照とした。
【図１４Ｃ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。透過性化ＴＨＰ−１細胞の９６％が抗ＣＡＰ１抗体に結合した。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）
【図１５Ａ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＨｅＬａ細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。染色しなかった細胞を陰性対照とした。略語：Ｕｓ（無染色）、ｃｅ（細胞）。
【図１５Ｂ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＨｅＬａ細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。ＦＩＴＣで染色した細胞を陰性対照とした。
【図１５Ｃ】抗ＣＡＰ１抗体が透過性化ＨｅＬａ細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ＨｅＬａ細胞（１０^６／ｔｕｂｅ）を１０μｇ／ｍｌ抗ヒトＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、ＦＡＣＳにより解析した。透過性化ＨｅＬａ細胞の９６％が抗ＣＡＰ１抗体に結合した。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図１６Ａ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合しないことを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇのマウス抗ＧＡＰＤＨ（図１６Ｂ）又はマウス抗ＧＡＰＤＨ（図１６Ｃ）とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞（図１６Ａ）と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。略語：Ｃｏｎｔ．（対照）。
【図１６Ｂ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合しないことを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇのマウス抗ＣＡＰ１とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図１６Ｃ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が完全ＴＨＰ−１細胞に結合しないことを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇのマウス抗ＧＡＰＤＨとともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。抗ＧＡＰＤＨ抗体は、抗ＣＡＰ１と対照的に、完全ＴＨＰ−１細胞に結合しなかった。略語：α−ＧＡＰＤＨ（抗ＧＡＰＤＨ抗体）。
【図１７Ａ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇの抗ＣＡＰ１（図１７Ｂ）又は抗ＧＡＰＤＨ抗体（図１７Ｃ）とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞（図１７Ａ）と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。略語：Ｃｏｎｔ．（対照）。
【図１７Ｂ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇの抗ＣＡＰ１とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。抗ＣＡＰ１が透過性化細胞に結合したことから、抗ＣＡＰ１が有効な抗体であることが実証された。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図１７Ｃ】抗ＧＡＰＤＨ抗体が透過性化ＴＨＰ−１細胞に結合することを示す図である。メタノール透過性化ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇの抗ＧＡＰＤＨ抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色し、二次抗体のみで染色した細胞と比較し、ＦＡＣＳにより解析した。抗ＧＡＰＤＨが透過性化細胞に結合したことから、抗ＧＡＰＤＨが有効な抗体であることが実証された。略語：α−ＧＡＰＤＨ（抗ＧＡＰＤＨ抗体）。
【図１８Ａ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体のＣＤ１４＋マウス単球細胞系ＲＡＷ２６４．７への結合を示す図である。マウスＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光標識抗ＣＤ１４−ＡＰＣ結合抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色した。抗体の結合プロファイル（蛍光強度対細胞数）をＦＡＣＳにより解析し、ここに示した（無染色細胞−黒色、染色細胞−灰色）。略語：Ｃｏ．（計数）。
【図１８Ｂ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体のＣＤ１４＋マウス単球細胞系ＲＡＷ２６４．７への結合を示す図である。マウスＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光標識抗プロキシマブ−ＦＩＴＣ結合抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色した。抗体の結合プロファイル（蛍光強度対細胞数）をＦＡＣＳにより解析し、ここに示した（無染色細胞−黒色、染色細胞−灰色）。略語：Ｃｏ．（計数）。
【図１８Ｃ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体のＣＤ１４＋マウス単球細胞系ＲＡＷ２６４．７への結合を示す図である。マウスＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光標識抗ＧＡＰＤＨ抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色した。抗体の結合プロファイル（蛍光強度対細胞数）をＦＡＣＳにより解析し、ここに示した（無染色細胞−黒色、染色細胞−灰色）。略語：Ｃｏ．（計数）。
【図１８Ｄ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体のＣＤ１４＋マウス単球細胞系ＲＡＷ２６４．７への結合を示す図である。マウスＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光標識抗ＣＡＰ１抗体とともにインキュベートし、続いてヤギ抗マウスＦＩＴＣ結合ＩｇＧで染色した。抗体の結合プロファイル（蛍光強度対細胞数）をＦＡＣＳにより解析し、ここに示した（無染色細胞−黒色、染色細胞−灰色）。略語：Ｃｏ．（計数）。
【図１９Ａ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体が同じリガンドについて競合することを示すための陰性対照としての無染色ＴＨＰ−１細胞のＦＡＣＳ解析を示す図である。ＴＨＰ−１細胞をプロキシマブとともにプレインキュベートし、続いて抗ヒトＣＡＰ１（図１９Ｄ）で染色し、ＦＡＣＳ解析により抗ＣＡＰ１抗体のみとともにインキュベートしたＴＨＰ−１細胞と比較した（図１９Ｃ）。染色しなかった細胞を陰性対照とした。
【図１９Ｂ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体が同じリガンドについて競合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞をプロキシマブとともにプレインキュベートし、続いて抗ヒトＣＡＰ１（図１９Ｄ）で染色し、ＦＡＣＳ解析により抗ＣＡＰ１抗体のみとともにインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図１９Ｃ）と比較した。ＦＩＴＣで染色した細胞を陰性対照とした。
【図１９Ｃ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体が同じリガンドについて競合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞をプロキシマブとともにプレインキュベートし、続いて抗ヒトＣＡＰ１（図１９Ｄ）で染色し、ＦＡＣＳ解析により抗ＣＡＰ１抗体のみとともにインキュベートしたＴＨＰ−１細胞（図１９Ｃ）と比較した。
【図１９Ｄ】プロキシマブ及び抗ＣＡＰ１抗体が同じリガンドについて競合することを示す図である。ＴＨＰ−１細胞をプロキシマブとともにプレインキュベートし、続いて抗ヒトＣＡＰ１（図１９Ｄ）で染色し、ＦＡＣＳ解析により抗ＣＡＰ１抗体のみとともにインキュベートしたＴＨＰ−１細胞と比較した（図１９Ｃ）。プロキシマブとのプレインキュベーションにより、抗ＣＡＰ１抗体のみで染色した細胞（図１９Ｃ）と比較して、抗ＣＡＰ１抗体に結合した細胞（図１９Ｄ）の集団の有意な減少がもたらされた。
【図２０】ＴＨＰ−１細胞へのプロキシマブ結合の滴定曲線を示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を様々な濃度のプロキシマブとともにインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＦｃＩｇＧとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによりプロキシマブ結合について解析した。略語：Ａｂ（抗体）；ｂｉｎ．（結合）；ＰＲＯＸ（抗ペプチド６ヒト化プロキシマブ抗体）。
【図２１】ＴＨＰ−１細胞への抗ＣＡＰ１結合の滴定曲線を示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を様々な濃度の抗ＣＡＰ１とともにインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦｃＩｇＧとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによりプロキシマブ結合について解析した。略語：Ａｂ（抗体）；ｂｉｎ．（結合）；α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図２２】ＴＨＰ−１細胞中のＣＡＰ１の特異的ノックダウンを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞にＡｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ又はヒトＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ（それぞれ５０ピコモル／ｍｌ）をトランスフェクトした。４８時間のインキュベーションの後、細胞を収集し、細胞を１０％ＳＤＳタンパク質試料緩衝液を用いて抽出した。電力により細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に転移させた。ニトロセルロース膜をマウス抗ＣＡＰ１抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いてウエスタンブロッティングに供し、抗アルファ−アクチン抗体を用いて再ブロッティングした。ＣＡＰ１タンパク質レベルの特異的減少が認められた。略語：Ｃｏｎｔ．（Ａｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ対照）；α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）；α−Ａｃｔｉｎ（抗アルファ−アクチン抗体）。
【図２３Ａ】ＴＨＰ−１細胞表面への抗ＣＡＰ１及びプロキシマブの結合がＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理により減少することを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞にＡｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、抗ＣＡＰ１抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。フローサイトメトリー解析をヤギ抗マウス及びヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合抗体を用いて行った。略語：Ｃｏｎｔ．（Ａｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ対照）；α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図２３Ｂ】ＴＨＰ−１細胞表面への抗ＣＡＰ１及びプロキシマブの結合がＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理により減少することを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞にＡｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、プロキシマブ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。フローサイトメトリー解析をヤギ抗マウス及びヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合抗体を用いて行った。略語：；ＰＲＯＸ（プロキシマブ抗体）。
【図２３Ｃ】ＴＨＰ−１細胞表面への抗ＣＡＰ１及びプロキシマブの結合がＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理により減少することを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞にヒトＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ（５０ピコモル／ｍｌ）をトランスフェクトし、抗ＣＡＰ１抗体（５００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。フローサイトメトリー解析をヤギ抗マウス及びヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合抗体を用いて行った。対照細胞（図２３Ａ、２３Ｂ）と比較して、ｓｉＲＮＡによるＣＡＰ１発現の減少の後に細胞への抗ＣＡＰ１の結合の有意な減少が認められた。略語：α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）。
【図２３Ｄ】ＴＨＰ−１細胞表面への抗ＣＡＰ１及びプロキシマブの結合がＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理により減少することを示す図である。ヒトＴＨＰ−１細胞にヒトＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ（５０ピコモル／ｍｌ）をトランスフェクトし、プロキシマブ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。フローサイトメトリー解析をヤギ抗マウス及びヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合抗体を用いて行った。対照細胞（図２３Ａ、２３Ｂ）と比較して、ｓｉＲＮＡによるＣＡＰ１発現の減少の後に細胞へのプロキシマブの結合の有意な減少が認められた。略語：ＰＲＯＸ（プロキシマブ抗体）。
【図２４Ａ】抗ペプチド６がＩＬ−１０プロモーターへのＣＲＥＢ転写因子の結合を誘導することを示す図である。ＣＲＥモチーフを有する放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを、Ｂ２４抗ペプチド６抗体又は完全ＬｅｗｉｓラットＩｇＭ抗体とともにインキュベートしたＰＢＭＣ細胞から抽出した核タンパク質とともにインキュベートし、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により分析した。Ｂ２４への細胞の曝露は、無視できるタンパク質結合を示した（最も左のレーン）完全Ｌｅｗｉｓ ＩｇＭによる処理と比較して、ＩＬ−１０遺伝子プロモーター由来のそれらの対応するモチーフへのＣＲＥＢ転写因子の有意な結合をもたらした。突然変異ＣＲＥは、部位へのＢ２４誘導タンパク質結合をほぼ完全に無効にした（最も右のレーン）。略語：ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答配列）；ｍｕｔ（突然変異）；ＡＰ６（Ｂ２４抗ペプチド６抗体）。
【図２４Ｂ】抗ペプチド６がＩＬ−１０プロモーターへのＳＰ１転写因子の結合を誘導することを示す図である。Ｓｐ１モチーフを有する放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを、Ｂ２４抗ペプチド６抗体又は全ＬｅｗｉｓラットＩｇＭ抗体とともにインキュベートしたＰＢＭＣ細胞から抽出した核タンパク質とともにインキュベートし、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により分析した。Ｂ２４への細胞の曝露は、無視できるタンパク質結合を示した（最も左のレーン）全Ｌｅｗｉｓ ＩｇＭによる処理と比較して、ＩＬ−１０遺伝子プロモーター由来のそれらの対応するモチーフへのＳｐ１転写因子の有意な結合をもたらした。突然変異Ｓｐ１は、部位へのＢ２４誘導タンパク質結合をほぼ完全に無効にした（最も右のレーン）。略語：ｍｕｔ（突然変異）；ＡＰ６（Ｂ２４抗ペプチド６抗体）。
【図２５】プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤ＫＴ５７２０の作用部位を示す図である。図に矢印により示すＰＫＡ阻害剤ＫＴ５７２０の作用部位を示す。略語：ＡＣ（アデニリルシクラーゼ）；Ｎｕｃ（核）；Ｐｒｏｔ．（タンパク質）；Ｉｎ．（阻害剤）。
【図２６】ＫＴ５７２０が抗ペプチド６抗体によるＩＬ−１０の誘導を用量依存的に抑制することを示す図である。抗ペプチド６抗体とのインキュベーションの１５分前にＰＢＭＣにＫＴ５７２０を様々な濃度で加えた。これが、ＩＬ−１０分泌の用量依存的な抑制をもたらした。略語：ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＵＴ（無処理）。
【図２７Ａ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片をＤｙｌｉｇｈｔ（商標）抗体標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＦＩＴＣで標識した。ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞を抗ＣＤ１４−ＰＥ結合体のみで染色した。略語：α（抗）。
【図２７Ｂ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片をＤｙｌｉｇｈｔ（商標）抗体標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＦＩＴＣで標識した。ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞を抗ＣＤ１４−ＰＥ結合体並びにプロキシマブＦ（ａｂ）_２−ＦＩＴＣ結合体で染色した。略語：α（抗）；ＰＲＯＸ（プロキシマブ抗体）；Ｆ（ａｂ）_２（プロキシマブＦ（ａｂ）_２）。
【図２７Ｃ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。ＦＩＴＣで染色されたＣＤ１４＋集団からの細胞のパーセント（プロキシマブのＦ（ａｂ）_２を含まない−黒色、プロキシマブのＦ（ａｂ）_２を含む−灰色）を示す。略語：ｃｏ．（計数）。
【図２７Ｄ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞を抗ヒト磁気ビーズ（ＢＤ）を用いてさらに単離した。ＣＤ１４＋単離細胞を不染色のままとした。略語：Ｕｓ．（無染色）；ｃｅ．（細胞）。
【図２７Ｅ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞を抗ヒト磁気ビーズ（ＢＤ）を用いてさらに単離した。ＣＤ１４＋単離細胞をプロキシマブのＦ（ａｂ）_２−ＦＩＴＣ結合体で染色した。プロキシマブのＦ（ａｂ）_２は、有意なパーセントのＣＤ１４＋集団に結合した。略語：ＰＲＯＸ（プロキシマブ抗体）；Ｆ（ａｂ）_２（プロキシマブＦ（ａｂ）_２）。
【図２７Ｆ】プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片がＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞に結合することを示す図である。ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ細胞を抗ヒト磁気ビーズ（ＢＤ）を用いてさらに単離した。ＣＤ１４＋単離細胞を抗ＣＤ１４−ＡＰＣ結合体で染色した。略語：α（抗）。
【図２８】プロキシマブ、プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片及び抗ＣＡＰ１抗体がヒトＰＢＭＣからのＩＬ−１０分泌を誘導することを示す図である。ヒトＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞をプロキシマブ（２００μｇ）、プロキシマブのＦ（ａｂ）_２（１５０μｇ）又は抗ＣＡＰ１抗体（８μｇ）とともにＲＰＭＩ中でインキュベートし（４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２）、培地へのＩＬ−１０分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。無処理細胞を対照とした。略語：ＰＲＯＸ（プロキシマブ、抗ペプチド６ヒト化抗体）；Ｆ（ａｂ）_２（プロキシマブのＦ（ａｂ）_２断片）；α−ＣＡＰ１（抗ＣＡＰ１抗体）；ＵＴ（無処理）
【図２９】作用機序を示す図である。抗ペプチド６抗体が単球細胞膜上のＣＡＰ１に結合することにより、Ｓｐ１及びＣＲＥ結合タンパク質を含む転写因子のｃＡＭＰ／ＰＫＡ依存性活性化を誘発し、ＩＬ−１０の転写及び分泌を増加させ、抗炎症性免疫応答を促進する。略語：ＡＰ６（抗ペプチド６抗体）；Ａｃｔ．（活性化）；Ｓｉｌ．（サイレンシング）；Ｒｅｐ．（リプレッサー）；Ｐａｔｈ．（経路）；Ｓｅｃ．（分泌）
【図３０】ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＡＰ１アミノ酸配列を示す図である。配列番号６としても表示される、ヒトＣＡＰ１タンパク質アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号CAG33690.1により示されるヒトＣＡＰ１遺伝子によりコードされるＧｅｎＢａｎｋアクセス番号NP_001099000.1）
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、ＨＳＰ６５分子内のエピトープを特異的に認識する抗体、すなわち抗ペプチド６抗体とＣＡＰ１分子との直接的相互作用を初めて示すものである。この相互作用は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の誘導をもたらす。本発明はさらに、この抗ペプチド６抗体経路へのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の関与を示している。これらの結果は、この免疫調節経路における重要なメディエーターとしての、また、したがって、免疫調節の可能な標的としてのＣＡＰ１の役割を明確に示している。
【００２７】
本発明はさらに、抗ＣＡＰ１抗体によるＩＬ−１０の活性化を示し、それにより、ＣＡＰ１及び免疫調節剤としてそれと相互作用する化合物を用いる実現可能性を実証している。
【００２８】
したがって、第１の態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡の調節用の組成物に関する。特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、免疫調節有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含む。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む。
【００２９】
上で示したように、本発明は、抗ペプチド６抗体が、ＣＡＰ１に結合し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現の増加と、それによるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡の調節をもたらすシグナル伝達経路を開始させることを示している。
【００３０】
したがって、いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合することにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する化合物を有効成分として含む。
【００３１】
特定の実施形態において、そのようなＣＡＰ１結合化合物は、タンパク質ベース、核酸ベース、炭水化物ベース、脂質ベース、天然有機物ベース、合成により得られる有機物ベース、無機物ベース及びペプチド模倣体ベースの化合物であってよい。１つの特定の実施形態において、ＣＡＰ１と特異的に結合し、相互作用する化合物は、タンパク質ベースの分子、具体的には、免疫グロブリン様分子であってよい。より具体的には、本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物は、抗体であってよい。特定の実施形態によれば、本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物は、抗ＣＡＰ１抗体又はＣＡＰ１を認識し、それに結合する抗体を含み、ただし、抗体は、本発明により記述されるポリクローナル、モノクローナル、キメラ若しくはヒト化抗ペプチド６抗体のいずれか、又はペプチド６（配列番号１）に対する、若しくはそれを認識する他の抗体ではないことをさらに理解されよう。
【００３２】
さらに、特定の実施形態によれば、抗ＣＡＰ１抗体であってよい、本発明のＣＡＰ１結合化合物は、ＣＡＰ１分子内の抗ペプチド６抗体結合部位と同じである部位を介して、又は異なる部位を介してＣＡＰ１分子と相互作用し得る。
【００３３】
例１１により示されているように、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合する抗ＣＡＰ１抗体は、ＩＬ−１０の発現の顕著な増加をもたらす。したがって、本発明の特定の実施形態は、有効成分としての役割を果たす化合物が、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、ＴＨ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する、単離および精製された抗ＣＡＰ１抗体であってよい、本発明の組成物に関する。
【００３４】
特定の実施形態によれば、Ｔｈ２抗炎症応答は、抗炎症性サイトカインの発現の増加を伴う。そのような抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＩＬ−１受容体アンタゴニストのいずれか１つであってよい。特定の実施形態によれば、Ｔｈ２抗炎症応答は、ＩＬ−１０の発現の増加を伴う。より具体的には、そのような増加は、そのようなサイトカインの発現の約１０％〜１００％、１０％〜９０％、１０％〜８０％、１０％〜７０％、１０％〜６０％又は１０％〜５０％の増加であり得る。特に、適切な対照、具体的には無処理対象又は細胞と比較して発現の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の増加。
【００３５】
上及び他の実施形態によれば、本発明は、本発明の組成物に用いるＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合する抗体を提供する。したがって、「結合特異性」、「ＣＡＰ１に特異的に結合する」、「ＣＡＰ１と特異的に免疫応答する」、「ＣＡＰ１に対して特異的な」又は「特異的に認識する」という用語は、ＣＡＰ１分子内のエピトープについて言及するとき、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団におけるエピトープの存在を決定する結合反応に適用されることに留意されたい。したがって、指定の免疫検定条件下で、特異抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０〜１００倍を超えて特定のエピトープに結合する。
【００３６】
「エピトープ」という用語は、抗体により認識され、結合されることができる分子、具体的にはＣＡＰ１の部分を意味する。エピトープ又は「抗原決定基」は、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面集団から通常なり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有する。
【００３７】
上で示したように、特定の実施形態において、本発明は、単離および精製された抗ＣＡＰ１抗体を提供する。本明細書で用いているように、抗体又は抗体をコードする核酸分子との関連における「単離された」又は「実質的に精製された」は、抗体又は核酸がその自然環境から取り出されたこと、又はその自然の状態から変化させられたことを意味する。したがって、「単離された」は、抗体又は核酸分子が精製された程度を必ずしも反映しない。しかし、ある程度まで精製された抗体又は核酸分子は「単離され」ていると理解されよう。抗体又は核酸分子が自然環境に存在しない、すなわち天然に存在しない場合、この分子は、存在する場所にかかわらず「単離され」ている。
【００３８】
本発明の組成物により使用される抗ＣＡＰ１抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体のいずれか１つであってよいことに留意されたい。タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．の第２章に記載されている。
【００３９】
モノクローナル抗体は、免疫化動物、特にラット又はマウスの脾臓又はリンパ節から採取したＢ細胞からハイブリッド細胞の増殖に有利な条件下で不死化Ｂ細胞との融合により調製することができる。モノクローナル抗体を産生させる技術は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章などの多くの論文及び教科書に記載されている。
【００４０】
本明細書で用いているように、「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。広く認められている免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、エプシロン及びミュー定常領域遺伝子並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子などである。軽鎖は、カッパ又はラムダと分類される。重鎖は、順に免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥをそれぞれ定義するガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はエプシロンと分類される。
【００４１】
抗体は、完全な免疫グロブリンとして、又は例えば、軽鎖及び重鎖可変領域のみを含むＦｖ断片、可変領域及び定常領域の一部を含むＦ（ａｂ）若しくはＦ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体などを含む様々な形の改変体として存在していてよい。抗体は、動物若しくはヒト由来であってよく、又はキメラ若しくはヒト化抗体であってよい。本明細書で用いているように、「抗体」という用語は、これらの様々な形を含む。
【００４２】
具体例としての免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、それぞれの対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する、ポリペプチド鎖の２つの同じ対を含む。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主として関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）及び可変重鎖（Ｖ_Ｈ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を意味する。
【００４３】
本明細書において上で示したように、特定の実施形態によれば、本発明は、免疫調節組成物中の有効成分としての抗ＣＡＰ１抗体及びその抗原結合断片の使用を提供する。「抗原結合断片」という用語は、ＣＡＰ１への結合を保持している抗体の一部を意味する。抗体の機能的断片の例は、完全な抗体分子、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｖ_Ｌ（軽鎖可変領域）、Ｖ_Ｈ（重鎖可変領域）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’_２及びそれらの任意の組合せ又は標的抗原に結合することができる免疫グロブリンペプチドの他の機能部分などの抗体断片を含むが、これらに限定されない。当業者により理解されるように、様々な抗体断片を様々な方法、例えば、ペプシンなどの酵素による完全な抗体の消化又は新規合成により得ることができる。抗体断片は、化学的に又は組換えＤＮＡ法を用いることによりしばしば新規合成される。したがって、抗体という用語は、本明細書で用いているように、全抗体の修飾により生産される抗体断片、又は組換えＤＮＡ法を用いて新規合成されるもの、又はファージディスプレイライブラリーを用いて同定されるものを含む。抗体という用語は、二価分子、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディも含む。
【００４４】
「Ｖ_Ｈ」又は「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）又はＦａｂを含む免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味する。「Ｖ_Ｌ」又は「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ又はＦａｂを含む免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味する。
【００４５】
より具体的には、「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」という句は、伝統的な２本鎖抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインが接合されて１本鎖を形成している抗体を意味する。一般的に、リンカーペプチドが２つの鎖の間に挿入されて、適正な折りたたみ及び活性結合部位の形成を妨害することなく、可変ドメインの安定化を可能にする。本発明により使用される単鎖抗ＣＡＰ１抗体は、単量体として結合し得る。他の具体例としての単鎖抗体は、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディを形成する。
【００４６】
本発明の組成物及び方法により使用される抗ＣＡＰ１抗体は、ヒト化抗体であってよいことは理解されよう。本明細書で用いているように、「ヒト化」という用語は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列など）であり、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む非ヒト（例えば、マウス）抗体の形を意味する。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び容量を有するマウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種の超可変領域の残基（ドナー抗体）により置換されているヒト免疫グロブリンである。いくつかの場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見いだされない残基を含んでいてよい。これらの修飾は、抗体の能力をさらに改良し、最適化するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべて又は実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域に対応する少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメインのすべてを実質的に含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、一般的にヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む。
【００４７】
本明細書で前に示し、以下の実施例により示すように、抗ＣＡＰ１抗体は、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現の顕著な増加をもたらした。特定の実施形態によれば、Ｔｈ２抗炎症応答は、抗炎症性サイトカインの発現の増加を伴う。そのような抗炎症性サイトカインは、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＩＬ−１受容体アンタゴニストのいずれか１つであってよい。特定の実施形態によれば、Ｔｈ２抗炎症応答は、ＩＬ−１０の発現の増加を伴う。より具体的には、そのような増加は、そのようなサイトカインの発現の約１０％〜１００％、１０％〜９０％、１０％〜８０％、１０％〜７０％、１０％〜６０％又は１０％〜５０％の増加であり得る。特に、適切な対照、具体的には無処理対照又は細胞と比較して発現の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の増加。
【００４８】
本発明による免疫調節の重要な標的としてのＣＡＰ１の実証は、免疫調節剤として単離および精製されたＣＡＰ１タンパク質又はその任意の断片の使用を可能にする。したがって、他の実施形態によれば、本発明は、それにより対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を有効成分として含む組成物を提供する。
【００４９】
「単離された」又は「実質的に精製された」という用語は、ＣＡＰ１分子などの核酸又はタンパク質に適用する場合、核酸又はタンパク質が、自然状態でそれが結合している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。それは、乾燥物又は水溶液であり得るが、均一な状態であることが好ましい。純度及び均一性は、一般的に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学手法を用いて測定される。製剤中に存在する優勢な種であるタンパク質は、実質的に精製されている。
【００５０】
本発明の組成物により使用される単離及び精製されたＣＡＰ１分子又はその任意の断片は、精製組換えタンパク質、及びＣＡＰ１分子を発現する形質転換宿主細胞の細胞溶解物又は膜調製物のいずれか１つとして提供することができることに留意されたい。本明細書で用いている断片及び機能的断片という用語は、Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、又はＴｈ１前炎症性サイトカインの活性化により反映されるようなＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡の特異的な調節を誘導することができる、挿入、欠失、置換及び修飾を有するＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異型同族体若しくは誘導体（以後「断片（単数又は複数）」と呼ぶ）を意味する。本明細書及び下の特許請求の範囲の項で用いる特定の実施形態によれば、ＣＡＰ１タンパク質は、ヒトＣＡＰ１のアミノ酸配列、又はその任意の断片、変異型同族体若しくは誘導体を有するタンパク質を意味することは理解されよう。ヒトＣＡＰ１タンパク質の例は、図３０に示すＧｅｎＢａｎｋアクセス番号NP_001099000.1により表示され、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号CAG33690.1により示されるヒトＣＡＰ１遺伝子によりコードされる配列番号６として表示されるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００５１】
アミノ酸配列、例えば、ＣＡＰ１タンパク質、具体的にはヒトＣＡＰ１に関して、当業者は、コードされる配列における単一アミノ酸又はわずかな割合のアミノ酸を変化させ、付加し、又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加は、変化が化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす場合、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を収載した保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体及び対立遺伝子に加えられ、それらを排除しない。
【００５２】
例えば、脂肪族アミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ又はＶ）が当群の他のメンバーにより置換される置換、又はリシンのアルギンによる、アスパラギン酸のグルタミン酸による、アスパラギンのグルタミンによるなどの他の残基の１つの極性残基による置換などの置換を行うことができる。以下の８つの群のそれぞれが互いの保存的置換である他の具体例としてのアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【００５３】
「誘導体」という用語は、アミノ酸配列変異体、及び本発明で使用するポリペプチド、例えば、指定の配列の共有結合修飾を定義するのに用いる。本発明により用いるＣＡＰ１ポリペプチドの、例えば、ＣＡＰ１の指定の配列の機能的誘導体は、上で構造的に定義したＣＡＰ１ポリペプチドの、例えば、指定の配列のアミノ酸配列、より具体的には、配列番号６により表示されるＣＡＰ１のアミノ酸配列との好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の総配列相同性を有する。
【００５４】
天然ＣＡＰ１ポリペプチド及びその機能的誘導体に関する「相同性」は、最大の割合の相同性を得るために必要な場合、配列を整列させ、ギャップを導入した後、また配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合と本明細書において定義する。Ｎ又はＣ末端の伸長も挿入又は欠失も同一性又は相同性を減少させると解釈しなければならない。整列の方法及びコンピュータプログラムは、周知である。「挿入」又は「欠失」という用語は、本明細書で用いているように、１〜５０アミノ酸残基、２０〜１アミノ酸残基、特に、１〜１０アミノ酸残基の、本発明により使用されるＣＡＰ１分子へのアミノ酸残基のそれぞれ付加又は欠失を意味することは理解されよう。より詳細には、挿入又は欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸のいずれか１つのものであってよい。
【００５５】
２つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連での「同一」、「実質的同一性」、「実質的相同性」又は「同一性」の割合という用語は、同じである、又は同じである指定の割合のアミノ酸残基若しくはヌクレオチド（すなわち、指定の領域にわたる約６０％同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はより高い同一性）を有する２つ又はそれ以上の配列若しくは部分配列を意味する。
【００５６】
「アミノ酸（単数又は複数）」は、例えば、Ｄ−アミノ酸を含む、すべての天然に存在するＬ−アミノ酸を意味する。アミノ酸は、周知の一文字又は三文字表記により識別される。
【００５７】
本発明はまた、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡の調節用の治療用組成物であって、免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるための、免疫調節有効量のアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物及びＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含み、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む治療用組成物を提供する。
【００５８】
したがって、一実施形態によれば、本発明は、免疫関連障害の治療用の治療用組成物を提供する。本発明の組成物は、ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合する化合物を有効成分として含む。そのような化合物の非限定的な例は、抗ＣＡＰ１抗体である。
【００５９】
他の態様において、本発明の医薬組成物は、ＣＡＰ１並びにその任意の断片、誘導体及び変異体を有効成分として含む。
【００６０】
したがって、それを必要とする対象における免疫関連障害の治療のための発明の組成物の使用をさらに提供する。
【００６１】
本明細書で用いているように、「障害」又は「状態」という用語は、正常の機能の障害が存在する状態を意味する。「疾患」は、罹患している人又は人と接触している人に不快感、機能障害又は苦痛をもたらす身体及び精神の異常な状態である。時として、この用語は、傷害、身体障害、症候群、症状、逸脱行動並びに構造及び機能の非定型的変化を含むように広く用いられるが、他の状況においては、これらは、区別できるカテゴリーとみなすことができる。「疾患」、「障害」、「状態」及び「疾病」という用語は、本明細書では同等に用いることに留意されたい。「免疫関連障害」という用語は、Ｔｈ１−Ｔｈ２応答の不均衡に関連する。
【００６２】
したがって、ＣＡＰ１と相互作用し、抗炎症性サイトカインの発現を調節する化合物は、そのようなサイトカイン、例えば、ＩＬ−１０の発現を増加する可能性がある。そのような化合物は、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡を抗炎症応答の方に調節することが望ましい状態において有用である可能性がある。例えば、自己免疫疾患（例えば、関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、狼瘡、グレーヴス病及び甲状腺炎、ＩＢＤ）、移植片拒絶病状及び移植片対宿主病、並びに毒素性ショック、敗血性ショック及び重症敗血症などのスーパー抗原により誘発される障害などの免疫関連障害の治療において。
【００６３】
特定の実施形態によれば、本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物、具体的には、抗ＣＡＰ１抗体は、Ｔｈ２抗炎症応答を増強することによって、免疫及び／又は炎症の抑制が有用である疾患、状態若しくは障害における炎症性症状の治療若しくは改善に、例えば、関節、筋骨格及び結合組織の障害における自己免疫及び炎症性症状の、又は過敏性、アレルギー反応、喘息、アテローム動脈硬化症、神経炎症性及び神経変性疾患、炎症性腸疾患、耳炎及び他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎及び他の皮膚疾患、後部及び前部ぶどう膜炎、結膜炎、視神経炎、強膜炎並びに他の免疫及び／又は炎症性眼疾患に関連する自己免疫及び炎症性症状の治療若しくは改善に有用であり得るが、これらに限定されない。
【００６４】
より具体的には、一般的に、ＣＡＰ１に結合する免疫調節化合物を用いる本発明の組成物並びに方法は、例えば、イートン−ランバート症候群、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン−バレー症候群、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、肝炎、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、神経叢障害、例えば、急性上腕神経炎、多腺性欠乏症候群、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強皮症、血小板減少症、甲状腺炎、例えば、橋本病、シェーグレン症候群、アレルギー性紫斑病、乾癬、混合性結合組織病、多発性筋炎、皮膚筋炎、血管炎、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ヴェーゲナー肉芽腫症、ライター症候群、ベヒテレフ症候群、強直性脊髄炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病などであるが、これらに限定されない自己免疫疾患の治療に用いることができる。
【００６５】
或いは、ＣＡＰ１に結合する免疫調節化合物は、抗炎症性サイトカインの発現の減少をもたらす可能性がある。これは、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡をＴｈ１前炎症性反応の方に移動させる可能性がある。前炎症性反応の方に免疫反応を調節する化合物は、増殖性病態などの免疫関連障害の治療に有用である可能性がある。したがって、本発明はさらに、免疫関連障害を治療するための組成物及び方法を提供する。
【００６６】
より具体的には、そのような増殖性状態は、悪性障害であり得る。特定の実施形態によれば、悪性増殖性障害は、癌、肉腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫からなる群から選択される充実性及び非充実性腫瘍であり得る。より詳細には、悪性障害は、黒色腫、肝細胞癌、結腸癌、骨髄腫、急性又は慢性白血病であり得る。
【００６７】
本発明を記述するために本明細書で用いているように、「悪性増殖性障害」、「癌」、「腫瘍」及び「悪性腫瘍」という用語はすべて、組織又は臓器の過形成に同等に関連する。組織がリンパ又は免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環細胞の非充実性腫瘍を含み得る。他の組織又は臓器の悪性腫瘍は、充実性腫瘍を形成し得る。一般的に、本発明の組成物並びに方法は、非充実性及び充実性腫瘍、例えば、癌、黒色腫、白血病及びリンパ腫の治療に用いることができる。
【００６８】
「治療する」という用語は、本明細書で用いているように、特に示さない限り、そのような用語が適用される障害又は状態、又はそのような障害又は状態の１つ若しくは複数の症状を逆転させること、軽減させること、それらの進行を抑制すること、又は予防することを意味する。「治療」という用語は、本明細書で用いているように、特に示さない限り、上で「治療する」を定義しているように、治療する行為を意味する。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、遊離の形の活性化合物を含み、治療する対象に直接投与し得ることに留意されたい。或いは、活性分子のサイズによって、投与の前にそれを担体に結合させることが望ましいことがあり得る。治療用製剤は、従来の投与製剤で投与することができる。製剤は、一般的に上で定義した少なくとも１つの有効成分並びに１つ又は複数のその許容される担体を含む。
【００７０】
各担体は、他の成分と適合性があり、患者に有害でないという意味で薬学的且つ生理学的に許容されるものであるべきである。製剤としては、経口、直腸、鼻又は非経口（皮下、筋肉内、腹腔内（ＩＰ）、静脈内（ＩＶ）及び皮内を含む）投与に適するものなどがある。
【００７１】
注射用に適する医薬剤形としては、滅菌済み水性液剤又は分散製剤及び滅菌済み注射用液剤又は分散製剤の即時調製用の滅菌済み散剤などがある。すべての場合に、医薬剤形は、無菌性でなければならず、容易な注射針通過性が存在する程度まで流動体でなければならない。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【００７２】
微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらすことができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、一般的にそのオスモル濃度を調節する物質である緩衝剤、並びに場合によって、１つ若しくは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は当技術分野で公知の添加物を含む。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、並びに植物油を含む溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散製剤の場合に必要な粒径を維持することにより、界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持することができる。
【００７４】
本明細書で用いているように、「薬学的に許容される担体」は、いずれか及びすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤などを含む。医薬活性物質用のそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体又は薬剤が有効成分と不適合性である場合を除き、治療用組成物におけるその使用は、予期される。
【００７５】
局所投与用の医薬組成物及び製剤は、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び散剤などであり得る。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、粘稠化剤などは、必要又は望ましいものであり得る。
【００７６】
経口投与用の組成物及び製剤は、散剤又は果粒剤、水中若しくは非水媒体中懸濁剤又は液剤、カプセル剤、サシェ剤又は錠剤などである。粘稠化剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、望ましいものであり得る。
【００７７】
単位剤形で都合よく提供することができる本発明の医薬組成物は、製薬産業で周知の従来技術により調製することができる。そのような技術は、有効成分を医薬担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）と結合させるステップを含む。一般的に、製剤は、有効成分を液体担体又は微細な固体担体又は両方と均一且つ緊密に結合させ、次に、必要な場合、生成物を成形することにより調製する。
【００７８】
本発明の組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤及び浣腸剤などであるが、これらに限定されない、多くの可能な剤形のいずれかに製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中懸濁剤として製剤化することができる。水性懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランなどの懸濁剤の粘度を増加させる物質をさらに含んでいてよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含んでいてよい。本発明の医薬組成物はまた、乳剤及びリポソーム含有製剤を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
対象における望ましい効果をもたらすのに必要な有効量を含むすべてのそのような化合物の性質、入手可能性及び供給元並びに投与は、当技術分野で周知であり、本明細書でさらに記述する必要はない。医薬組成物の調製は、当業者に周知であり、多くの論文及び教科書に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０年、特にその１５２１〜１７１２頁を参照のこと。
【００８０】
ＣＡＰ１に結合する化合物、例えば、本発明により使用される抗ＣＡＰ１抗体又はＣＡＰ１タンパク質又はその任意の断片を含む医薬組成物は、非経口投与、すなわち、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）及び静脈内（ｉ．ｖ．）投与に有用である。非経口投与用組成物は、一般的に抗体の溶液又は許容される担体、好ましくは水性担体に溶解したそのカクテルを含む。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどを用いることができる。これらの溶液は、無菌性であり、一般的に粒子状物質を含まない。組成物は、ｐＨ調整及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの生理的条件を近似するために必要に応じて薬学的に許容される補助物質を含んでいてよい。これらの製剤中のＣＡＰ１結合化合物、例えば、抗ＣＡＰ１抗体の濃度は、広く、すなわち、重量で約０．０１％未満、通常少なくとも約０．１％から５％ほどまで変化し得るものであり、主として、選択される個々の投与方法による液体容積及び粘度に基づいて選択される。
【００８１】
より具体的には、ＣＡＰ１結合化合物、例えば、本発明により使用される抗ＣＡＰ１抗体、又はＣＡＰ１分子又はその任意の断片を含む注射用組成物は、水、生理食塩水、等張性生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸緩衝生理食塩水などに溶解して調製することができ、非毒性界面活性剤と場合によって混合することができる。通常の貯蔵及び使用条件下では、これらの製剤は、微生物の増殖を予防するための保存剤を含んでいてよい。注射又は注入に適する医薬剤形としては、有効成分を含む滅菌水性液剤若しくは分散製剤又は滅菌散剤などであり、散剤は、滅菌注射用又は注入用液剤若しくは分散製剤の即時調製に適応している。好ましくは、最終的な剤形は、滅菌液体であり、製造及び貯蔵条件下で安定である。液剤、懸濁剤又は分散製剤の液体担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール又は液体ポリエチレングリコール等などのポリオール、植物油、非毒性グリセリルエステル及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体分散媒であってよい。液剤、懸濁剤又は分散製剤の適切な流動性は、例えば、リポソームの形成により、分散製剤の場合には所望の粒径の維持により、又は非毒性界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。砂糖、緩衝剤又は塩化ナトリウムなどの等張性物質を含めることができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。溶解度向上剤を加えることができる。
【００８２】
滅菌注射用組成物は、ＣＡＰ１結合化合物、例えば、抗ＣＡＰ１抗体、又はそれに代わるものとして、ＣＡＰ１分子及びその任意の断片を例えば、上で挙げたような様々な他の成分とともに適切な溶媒に所望の量で混入し、続いて、例えば、ろ過滅菌により所望のように滅菌することにより、調製することができる。滅菌注射用液剤の調製用の滅菌散剤の場合、調製方法は、有効成分とあらかじめ滅菌ろ過した溶液中に存在する付加的な所望の成分の粉末を生ずる真空乾燥及び凍結乾燥技術を含む。ろ過滅菌、例えば、０．２２ミクロンフィルター又はナノろ過、ガンマ又は電子線滅菌などの適切な滅菌法を用いることができる。
【００８３】
様々な実施形態において、最終溶液は、約４から約９まで、約５から約７まで、約５．５から約６．５まで、又は約６のｐＨを有するように調節する。組成物のｐＨは、薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤により調整することができる。
【００８４】
さらに、本発明の組成物は、１回の投与当たり所定の量の各有効成分を含む単位剤形で提供することができる。そのような単位は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重のＣＡＰ１結合化合物、例えば、本発明により使用される抗ＣＡＰ１抗体を供給するように構成されている。具体的には、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１５ｍｇ／ｋｇ、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、４０〜８０ｍｇ／ｋｇ又は６０〜１００ｍｇ／ｋｇ。そのような用量は、１回投与で、又は複数回の個々の用量として供給することができる。最終的用量は、もちろん治療する状態、投与経路並びに患者の年齢、体重及び状態に依存し、医師の裁量による。
【００８５】
上で示したように、非経口経路に加えて、本発明の組成物は、他の適切な経路により、例えば、経口（口腔若しくは舌下を含む）、直腸、鼻、局所（口腔、舌下若しくは経皮を含む）又は膣経路により投与するように構成することができる。そのような製剤は、製薬学の分野で公知の方法により、例えば、有効成分を担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）と結合させることにより、調製することができる。
【００８６】
経口投与用に構成された医薬製剤は、カプセル剤若しくは錠剤、散剤若しくは果粒剤、水性若しくは非水性液体中液剤又は懸濁剤、可食発泡体若しくはホイップ体、又は水中油型液体乳剤若しくは油中水型液体乳剤などの個別単位として提供することができる。
【００８７】
経皮投与用に構成された医薬製剤は、長時間にわたりレシピエントの表皮と緊密接触の状態を保持することを意図した個別貼付剤として提供することができる。局所投与用に構成された医薬製剤は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、散剤、液剤、ペースト剤、ゲル剤、噴霧剤、エアゾール剤又は油剤として製剤化することができる。
【００８８】
眼又は他の外部組織、例えば、口及び皮膚への適用については、製剤は、好ましくは局所軟膏剤又はクリーム剤として適用する。軟膏剤に製剤化する場合、有効成分は、パラフィン又は水混和性軟膏基剤とともに用いることができる。或いは、有効成分は、水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤を用いてクリーム剤に製剤化することができる。
【００８９】
眼への局所投与用に構成された医薬製剤は、有効成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁されている、点眼剤などである。
【００９０】
口内への局所投与用に構成された医薬製剤は、トローチ剤、パステル剤及び洗口剤などである。
【００９１】
直腸投与用に構成された医薬製剤は、坐剤又は浣腸剤として提供することができる。
【００９２】
担体が固体である、鼻投与用に構成された医薬製剤は、鼻の近くに保持した粉末の容器から鼻から吸い込む方法で、すなわち、鼻道を介する急速な吸入により投与される例えば２０〜５００ミクロンの範囲内の粒径を有する粗散剤などである。鼻噴霧剤又は点鼻剤としての投与用の担体が液体である適切な製剤は、有効成分の水性又は油性液剤などである。
【００９３】
吸入による投与用に構成された医薬製剤は、様々なタイプの計量加圧エアゾール容器、噴霧器又は吸入器により発生させることができる微粒子ダスト剤又はミスト剤などである。
【００９４】
膣投与用に構成された医薬製剤は、膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、発泡体又は噴霧製剤として提供することができる。
【００９５】
好ましい単位用量製剤は、有効成分の、本明細書で上で挙げた１日量若しくは分割量、又はその適切な一部を含むものである。
【００９６】
上で詳細に言及した成分に加えて、製剤は、問題の製剤の種類を考慮した当技術分野で常用の他の薬剤も含んでいてよく、例えば、経口投与に適するものは、着香剤を含んでいてよいことは理解されよう。
【００９７】
本発明の組成物は、予防及び／又は治療処置のために投与することができることにさらに留意されたい。治療への適用においては、組成物を、免疫関連障害（例えば、関節炎、ＩＢＤ及び糖尿病）に既に罹患している患者に状態及びその合併症を治療又は少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で投与する。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」と定義される。このような使用における有効な量は、状態の重症度及び患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般的に約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲のＣＡＰ１結合タンパク質、具体的には抗ＣＡＰ１抗体であり、体重１ｋｇ当たり０．０１〜５０ｍｇ及び０．１〜１０ｍｇの用量がより一般的に用いられる。毎日、毎週又は毎月のスケジュールでの単回又は反復投与を行うことができ、用量レベル及びパターンは担当医により選択される。
【００９８】
予防への適用においては、抗ＣＡＰ１抗体を含む組成物を、疾患状態を発現するリスクがある患者に患者の抵抗性を高めるために投与する。そのような量は、「予防有効量」と定義される。このような使用においては、正確な量は、再び患者の健康状態及び免疫の一般的レベルに依存するが、一般的に１回の投与当たり０．００１〜１００ｍｇ、特に１回の投与当たり０．０１〜１０ｍｇ、１回の投与当たり０．１〜１０ｍｇ、又は１回の投与当たり或いは体重１ｋｇ当たり１〜１０ｍｇである。
【００９９】
組成物の単回又は反復投与は、患者により要求され、耐えられる用量及び頻度によって行う。いずれにしても、組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量のＣＡＰ１結合タンパク質、具体的には本発明により使用される抗ＣＡＰ１抗体を供給するはずである。好ましくは、該用量は、１回投与するが、治療結果が達成されるまで、又は副作用が療法の中止の正当な理由となるまで、定期的に適用することができる。一般的に、該用量は、患者に許容できない毒性をもたらすことなく、疾患を治療又はその症状若しくは徴候を改善するのに十分である。
【０１００】
本発明の組成物の放出制御非経口製剤は、インプラント、油性注射剤又は微粒子系として製造することができる。
【０１０１】
微粒子系は、ミクロスフェア、ミクロ粒子、ミクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア及びナノ粒子などである。ミクロカプセルは、治療用組成物を中心コアとして含む。ミクロスフェアにおいては、治療薬が粒子全体に分散されている。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフェア及びミクロカプセルは、一般的にそれぞれナノ粒子、ナノスフェア及びナノカプセルと呼ばれる。キャピラリーは、ナノ粒子のみが静脈内投与されるように約５μｍの直径を有する。ミクロ粒子は、一般的に直径が約１００μｍであり、皮下又は筋肉内投与される。
【０１０２】
第２の態様によれば、本発明は、それを必要とする対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させる方法を提供する。本発明の方法は、治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体又はそれらの任意の組合せ若しくはそれらを含む任意の組成物の少なくとも１つを対象に投与するステップを含む。
【０１０３】
１つの特定の実施形態において、本発明の方法は、治療有効量のＣＡＰ１に特異的に相互作用し、結合する化合物又はそれを含む任意の組成物を対象に投与することにより、治療する対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するステップを含む。
【０１０４】
特定の実施形態によれば、そのようなＣＡＰ１結合化合物は、タンパク質ベース、核酸ベース、炭水化物ベース、脂質ベース、天然有機物ベース、合成により得られる有機物ベース、無機物ベース及びペプチド模倣体ベースの化合物であってよい。１つの特定の実施形態において、ＣＡＰ１と特異的に結合し、相互作用する化合物は、タンパク質ベースの分子、具体的には、免疫グロブリン様分子であってよい。より具体的には、本発明の方法及び組成物により使用されるＣＡＰ１結合化合物は、抗体であってよい。そのような抗体の特定の例は、ＣＡＰ１と直接的又は間接的に特異的に相互作用し、ＩＬ−１０の発現の増大をもたらす抗ＣＡＰ１抗体及び抗ペプチド６抗体である。本明細書における下文の例１１は、ＩＬ−１０の発現の誘導のための抗ＣＡＰ１抗体の使用を開示している。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物は、抗ＣＡＰ１抗体又はＣＡＰ１を認識し、それに結合する抗体を含み、ただし、抗体は、本発明若しくは本発明者らの以前の刊行物及び願書により記述されたポリクローナル、モノクローナル、キメラ若しくはヒト化抗ペプチド６抗体のいずれか、又はペプチド６（配列番号１）に対する、若しくはそれを認識する他の抗体ではないことはさらに理解されよう。
【０１０６】
より具体的には、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、対象におけるＴＨ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体である化合物を対象に投与するステップを含む。
【０１０７】
本発明の方法により使用される抗ＣＡＰ１抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体のいずれか１つであってよいことに留意されたい。タンパク質に対するポリクローナル抗体の産生は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．の第２章に記載されている。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、免疫化動物、特にラット又はマウスの脾臓又はリンパ節から採取したＢ細胞からハイブリッド細胞の増殖に有利な条件下で不死化Ｂ細胞との融合により調製することができる。モノクローナル抗体を産生させる技術は、上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの第２章などの多くの論文及び教科書に記載されている。
【０１０９】
「抗体」という用語は、完全な分子並びに例えば、抗原に結合することができる例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２などのその断片を含むことを意味する［Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２４巻、３１６〜３２５頁（１９８３年）］。
【０１１０】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２並びに本発明において有用な抗体の他の断片は、完全な抗体分子について本明細書に開示する方法に従って用いることができることは、理解されるであろう。そのような断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を生成させるため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を生成させるため）などの酵素を用いてタンパク質溶解的切断により一般的に生成させる。
【０１１１】
他の代替実施形態において、本発明の方法は、治療有効量のＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体又はそれらを含む組成物を対象に投与することにより、対象におけるＴＨ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するステップを含む。
【０１１２】
ＣＡＰ１は、本明細書で用いているように、図３０に示すＧｅｎＢａｎｋアクセス番号NP_001099000.1により表示され、またＧｅｎＢａｎｋアクセス番号CAG33690.1により示されるヒトＣＡＰ１遺伝子によりコードされる配列番号６と表示されるアミノ酸配列を含むヒトＣＡＰ１タンパク質を意味することは理解されよう。
【０１１３】
本発明の組成物及び方法により治療される「患者」又は「必要とする対象」とは、上述の状態に罹患している可能性があり、本明細書で述べる治療方法が望ましい、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス及びネコ対象を含む任意の哺乳動物を意味する。患者への本発明の組成物の投与は、自己投与及び他の人による患者への投与を含む。
【０１１４】
他の特定の実施形態によれば、本発明より使用される有効成分又はそれを含む組成物は、任意の投与方法により投与することができる。例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、経皮、経膣、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸若しくは皮下投与、又はそれらの組合せ。
【０１１５】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医学者により求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を引き起こす薬物又は医薬品の量を意味するものとする。特定の実施形態によれば、治療有効量は、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。特定の実施形態は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重のＣＡＰ１結合化合物、例えば、本発明により使用される抗ＣＡＰ１抗体を含む。具体的には、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１５ｍｇ／ｋｇ、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、２５〜５０ｍｇ／ｋｇ、４０〜８０ｍｇ／ｋｇ又は６０〜１００ｍｇ／ｋｇ。
【０１１６】
さらに、特定の実施形態において、本発明の方法により毎日投与されるＣＡＰ１結合化合物又はＣＡＰ１分子のいずれかの治療有効量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重まで、具体的には、約０．０１０〜８又は０．０２０〜６、０．０３０〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。特定の実施形態によれば、有効量は、場合によって１日当たり０．０１、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０及び５００ｍｇのいずれか１つであり得る。具体的には、有効量は、１日当たり約０．０１〜１０００ｍｇ、１日当たり１０〜５００ｍｇ、より具体的には、１日当たり０．０１、０．１、１、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０及び５００ｍｇのいずれか１つであり得る。そのような有効量がマウスに固有のものであることは理解されよう。さらに、一般的に「ヒト用量」は、成人健常志願者における治療薬の最初の臨床試験における最高安全開始用量を推定する産業界向け指針に従って、各ヒト等価用量（ＨＥＤ）（ｍｇ／ｋｇ）を得るためにマウスにおける用量（ｍｇ／ｋｇ）を約１２で割り、さらに１０（マウスからヒトへの外挿に際しての安全係数）で割ることによって計算することができる。ＣＡＰ１結合化合物又は代わりになるべきものとして、ＣＡＰ１分子のこの有効量は、単位剤形内に含まれることが好ましい。さらに、本発明による化合物の投与は、定期的であってよく、例えば、少なくとも約３日間から３ヵ月間にわたり１日２回、１日３回又は少なくとも１日１回の定期的投与が有効であり得る。より低い用量の利点は、当業者に明らかである。これらは、とりわけ、特に長期の使用における副作用のリスクがより低いこと、及び患者が治療に対する感受性が低い状態になるリスクがより低いことなどである。
【０１１７】
他の実施形態によれば、本発明により使用される単位剤形は、単回又は反復投与用であってよい。他の実施形態によれば、前記単位剤形の投与は、治療上十分な期間にわたり１から５、１０又は２４時間ごとに反復する。代替実施形態によれば、単位剤形は、投与後かなりの時間にわたりｐＨ非依存的薬物放出をもたらす徐放性単位剤形であってよい。
【０１１８】
他の不都合な適応症の治療は、１日当たり約０．００１ｍｇから１日当たり約１０００ｍｇまで、１日当たり約０．０１ｍｇから１日当たり約５００ｍｇまで、１日当たり約０．１ｍｇからから１日当たり約５００ｍｇまで、１日当たり約１ｍｇから１日当たり約５００ｍｇまで又は１日当たり約１０ｍｇから１日当たり約５００ｍｇまでの範囲の本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物の用量を用いて行うことができ、且つ／又は少なくとも１日の間の後にほぼ生命の治療まで行うことができることに留意されたい。他の実施形態において、本発明のＣＡＰ１結合化合物を用いた治療は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１４、３０、６０、９０日の治療後に行うことができ、生命治療まで進む。
【０１１９】
異なる状態の治療は、異なる用量又は異なる期間の使用を示すことがあることに留意されたい。これらは、熟練した開業医には明らかである。
【０１２０】
上で示したように、本発明は、免疫関連障害、例えば、自己免疫又は炎症性障害を治療するのに特に適する方法及び医薬組成物を提供する。
【０１２１】
以下の実施例は、確定された炎症性関節炎の治療に対する本発明の組成物及び方法の適用性を実証している。より具体的には、ＡＡについて誘発し、同時に、ＣＡＰ１と相互作用することが示された本発明の抗ペプチド６ヒト化抗体により治療したＬｅｗｉｓラットは、関節炎の有意な減少を示した。
【０１２２】
ＣＡＰ１と相互作用する他の化合物、例えば、抗ＣＡＰ１抗体は、ＩＬ−１０の発現の増大によって示されたように、抗炎症応答の明らかな誘導を示した。したがって、これらの化合物は、免疫関連障害を治療するための免疫調節剤として適用できる可能性がある。
【０１２３】
Ｂｅｒｅｎｔ Ｊ．ら［Ｂｅｒｅｎｔ Ｊ．ら、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．、２５巻、７〜６３頁（２００３年）］により示されたように、アジュバント関節炎（ＡＡ）は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）及び敗血症性関節炎の十分に確立された動物モデルであることに留意されたい。
【０１２４】
それぞれ異なる原因を有する炎症性関節炎及び変性関節炎という２つの主なカテゴリーに一般的に分類することができる関節炎の異なる形が存在する。したがって、１つの特定の実施形態によれば、本発明の方法及び医薬組成物は、炎症性障害、例えば、炎症性関節炎の治療及び／又は改善を明確に目的とし得る。
【０１２５】
炎症性関節炎は、滑膜炎、骨侵食、骨減少症、軟組織腫脹及び均一な関節腔狭窄により特徴付けられる。より具体的には、関節炎症の顕著な特徴は、滑膜炎及び骨の侵食である。後者は、薄く、白色の軟骨下骨板の局所不連続性として最初に出現する。通常、この軟骨下骨板は、重症骨減少症の場合でさえ見ることができるが、その不連続性が侵食を示す。関節周囲骨減少症及び限局性軟骨下骨減少症が真の骨侵食の前に出現し得ることは真実であるが、それは、明確な関節炎症を示す骨侵食の存在である。骨侵食が広がるにつれて、骨の破壊が髄腔内の小柱に及ぶ。炎症性関節炎の１つの重要な特徴は、周縁骨侵食の概念に関連する。この用語は、炎症性滑膜関節の周縁に位置する骨侵食に与えられる。この特定の位置は、関節腔内にあるが、ヒアリン軟骨により覆われていない関節の部分である。したがって、初期の関節炎症は、関節表面の下の軟骨下骨板の侵食の前の周縁侵食をもたらす。骨侵食を探す場合、様々な骨表面を探索するために関節の複数個所の調査が必須である。炎症性関節過程の第２の重要な特性は、均一な関節腔狭窄である。これは、関節軟骨の破壊が関節腔内全域で均一であるために起こる。炎症性関節疾患の第３の所見は、軟組織腫脹である。
【０１２６】
炎症性関節炎は７つのサブグループにさらに分類することができ、したがって、本明細書で述べる本発明の組成物並びに方法は、異なるサブグループのすべての炎症性関節炎状態を治療するのに適用できることは理解されよう。
【０１２７】
より具体的には、単一関節の病変は、敗血症性関節炎を示唆する。敗血症性関節炎の原因は、ブドウ球菌属又は連鎖球菌属微生物による血行性播種に通常関連する。敗血症性関節のＸ線像の特徴は、炎症性関節炎のそれ、すなわち、関節周囲骨減少、均一関節腔狭窄、軟組織腫脹及び骨侵食を含む。すべての所見が同時に存在するとは限らず、急性では、骨侵食が認められないことがある。したがって、一実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、敗血症性関節炎の治療及び／又は改善のために用いることができる。
【０１２８】
全身性関節炎は、対照的に、複数の関節の病変によって特徴付けられ、２つの主なカテゴリー、すなわち、関節リウマチ及び血清陰性脊椎関節症を含む。
【０１２９】
一実施形態によれば、本発明の組成物並びに方法は、関節リウマチの治療及び／又は改善のために用いることができる。関節リウマチ（ＲＡ）は、最も一般的には関節（関節炎）及び腱鞘における炎症及び組織損傷、並びに貧血を引き起こす慢性全身性自己免疫障害である。関節リウマチは、肺、心膜、胸膜及び眼の強膜におけるび漫性炎症、また、最も一般的には皮膚の下の皮下組織における小結節性病変ももたらし得る。関節リウマチは、機能及び運動性の実質的な喪失をもたらし得る身体障害を引き起こす有痛性の状態であり得る。リウマトイド因子及び環状シトルリン化ペプチドに対する抗体などの血清学的マーカーは、関節リウマチの重要なインジケーターである。関節リウマチのＸ線像の特徴は、関節炎症のそれであり、特有の骨減少症、均一関節腔喪失、骨侵食及び軟組織腫脹を含む。炎症の慢性的性質のため、関節不全脱臼及び軟骨下嚢胞などの付加的な所見も認められることがある。
【０１３０】
血清陰性脊椎関節症カテゴリーは、乾癬性関節炎、反応性関節炎及び強直性脊椎炎を含み、炎症、多発性関節病変並びに骨増殖の付加的特徴を伴う手及び足における遠位病変の徴候によって特徴付けられる。したがって、一実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、血清陰性脊椎関節症の状態の治療及び／又は改善のために用いることができる。
【０１３１】
より具体的には、一実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、乾癬性関節炎の治療及び／又は改善のために用いることができる。乾癬性関節炎は、皮膚（乾癬）及び関節（関節炎）の炎症によって特徴付けられる。米国におけるほぼ３０６０００人が乾癬性関節炎に罹患しており、さらに３０８０００人がヨーロッパにおける５つの主要な市場において当疾患に罹患していると考えられている。乾癬及び関節炎は、しばしば別個に出現する。実際、患者のほぼ８０％において乾癬が関節炎に先行する。関節炎は、患者の最大１５％において関節炎が乾癬に先行することがある。
【０１３２】
乾癬性関節炎の特性の１つである乾癬は、落屑を伴う、皮膚の斑点状の隆起した赤色の部位を特徴とする一般的な皮膚の状態である。乾癬は、肘及び膝の先端部、頭皮、へそ及び性器又は肛門の周囲の部位をしばしば侵す。乾癬を有する患者の約１０％が関節の随伴した炎症も発現する。通常、皮膚症状が重症であるほど、乾癬性関節炎を発現する可能性が大きくなる。乾癬性関節炎の原因は、不明であるが、遺伝的、環境及び免疫上の原因の組合せである可能性がある。
【０１３３】
男性と女性は、乾癬に同等に罹患する可能性がある。乾癬性関節炎については、男性は、脊椎炎の形（脊椎が侵される）を有する可能性がより高く、女性は、リウマチ様の形（多くの関節が侵される）を有する可能性がより高い。乾癬性関節炎は、通常３５〜５５歳の人に発生する。しかし、ほぼあらゆる年齢の人に発生し得る。乾癬性関節炎は、強直性脊椎炎、反応性関節炎並びにクローン病及び潰瘍性大腸炎を伴う関節炎などの他のいくつかの関節炎の状態と多くの特徴を共有している。これらの状態のすべてが脊椎及び関節、眼、皮膚、口及び様々な臓器における炎症を引き起こし得る。
【０１３４】
他の実施形態によれば、本発明の組成物並びに方法は、強直性脊椎炎の治療及び／又は改善のために用いることができる。強直性脊椎炎（ＡＳ、以前にはベヒテレフ（Ｂｅｃｈｔｅｒｅｗ’ｓ）病、ベヒテレフ症候群、マリー−ストリュンペル病及び脊椎関節炎の１つの形として公知）は、複数の関節、特徴的には脊椎面関節及び脊椎の底部の仙骨関節の炎症に起因して引き起こされる、通常、慢性及び進行性の形の関節炎である。強直性脊椎炎は、これらの関節及び脊椎周囲の軟組織を侵す傾向があるが、他の関節並びに関節周囲の組織（健靭帯付着部、健及び靭帯が骨に付着する）も侵される可能性がある。強直性脊椎炎は、眼、心臓及び肺などの関節以外の身体の部位も侵す可能性がある。
【０１３５】
この障害は、しばしば骨性強直（又は融合）をもたらし、したがって、ギリシャ語の強直（ａｎｋｙｌｏｓ）に由来する強直性という用語は、関節の硬化を意味する。脊椎（Ｓｐｏｎｄｙｌｏｓ）は、椎骨（又は脊椎）を意味し、１つ又は複数の椎骨の炎症に適用される。
【０１３６】
該疾患は、一般集団の約０．１〜０．２％を罹患させると推定される。強直性脊椎炎は、主として若年男性を罹患させる。男性は、女性より強直性脊椎炎を発現する可能性が４倍から１０倍高い。該疾患を有する大部分の人が１５〜３５歳に該疾患を発症し、発症時の平均年齢は２６歳である。
【０１３７】
正確な原因は不明であるが、強直性脊椎炎は、遺伝的影響と誘発環境因子との組合せに起因すると考えられている。強直性脊椎炎を有する患者の約９０〜９５％が組織抗原ヒト白血球抗原Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）を有するのに対して、一般集団では７％である。強直性脊椎炎を有する人は、該疾患の家族歴をしばしば有する。
【０１３８】
他の実施形態において、本発明の組成物並びに方法は、反応性関節炎（ＲｅＡ）の治療及び／又は改善のために用いることができる。血清陰性脊椎関節症の他のタイプである反応性関節炎は、身体の他の部位における感染に応答して発現する自己免疫状態である。細菌と接触し、感染を発現することが、反応性関節炎を誘発し得る。反応性関節炎は、「関節炎」として総称的に公知のリウマチなどの他の様々な状態と同様な症状を有する。反応性関節炎は、他の感染により引き起こされ、したがって、「反応する」、すなわち、他の状態に依存する。「誘発」感染は、しばしば治癒し、又は慢性の場合には寛解状態となり、したがって、最初の原因の確定が困難となる。
【０１３９】
反応性関節炎の症状は、非常に多くの場合、大関節の炎症性関節炎、眼の炎症（結膜炎及びぶどう膜炎）及び尿道炎といった３つの一見無関係の症状の組合せを含む。ＲｅＡは、ドイツの医師Ｈａｎｓ Ｒｅｉｔｅｒにちなんでライター症候群としても公知であり、また尿道炎性関節炎、性病性関節炎及び腸炎性多発性関節炎としても公知であることを示すべきである。
【０１４０】
若年性特発性関節炎、痛風及び偽性痛風、並びに大腸炎又は乾癬を伴う関節炎などの多くの他の形の炎症性関節炎が存在することは理解されよう。したがって、本発明の組成物並びに方法は、これらの状態にも適用できることは理解されよう。
【０１４１】
したがって、他の実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）の治療及び／又は改善のために用いることができる。ＪＩＡは、小児における持続性関節炎の最も一般的な形である（この状況における若年性は、１６歳前の発症を指し、特発性は、明確な原因のない状態を指し、関節炎は、関節の滑膜の炎症である）。ＪＩＡは、一過性及び自己限定的又は慢性であり得る、小児に見られる関節炎のサブセットである。これは、成人に一般的に見られる関節炎（関節リウマチ）並びに慢性状態である小児に存在する他のタイプの関節炎（例えば、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎）とは著しく異なる。
【０１４２】
他の実施形態によれば、本発明の組成物並びに方法は、痛風の治療及び／又は改善のために用いることができる。痛風（代謝性関節炎）は、尿酸の蓄積によってもたらされる疾患である。この状態においては、尿酸一ナトリウム又は尿酸の結晶が関節の関節軟骨、腱及び周囲組織に沈着する。これらの結晶は、両方とも重度の炎症及び疼痛を引き起こす。無処理の場合、結晶が、著しい組織損傷を引き起こし得る痛風結節を形成する。偽性痛風は、カルシウム結晶によって引き起こされる状態である。カルシウム結晶が腱における炎症の発作を引き起こす場合、それは、「石灰沈着性腱炎」と呼ばれる。本発明は、この障害の治療用の組成物及び方法も提供する。
【０１４３】
一般的に、上でも開示したように、多くの種類の関節炎が存在し、本発明の組成物、並びに方法、複合組成物（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）及びキットは、示したすべての一次性の形の関節炎に加えて、すべての二次性の形の関節炎も治療するのにも適用できることに留意されたい。これらの状態は、紅斑性狼瘡、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、乾癬性関節炎、反応性関節炎、血色素症、肝炎、ウェジナー肉芽腫症（及び多くの他の血管炎症候群）、ライム病、家族性地中海熱、再発性発熱を伴う高免疫グロブリン血Ｄ、ＴＮＦ受容体関連周期熱症候群及び炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎）などであり得る。
【０１４４】
特定の実施形態によれば、関節炎の治療、予防又は改善は、臨床スコア及び組織病理学的スコアの改善に反映される可能性がある。より具体的には、本発明の組成物及び方法による治療は、関節炎の臨床スコア及び組織病理学的スコアの少なくとも１つを少なくとも５％〜９５％、５％〜９０％、５％〜８５％、５％〜８０％、５％〜７５％、５％〜７０％、５％〜６５％、５％〜６０％、５％〜５５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％又は約５％〜１０％低下させ得ることは理解されよう。より具体的には、そのような低下は、治療前の臨床スコアと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも５５若しくは６０％であり得る。
【０１４５】
本発明の方法及び組成物は、免疫関連障害の治療に適用できることは理解されよう。したがって、他の特定の実施形態において、本発明の医薬組成物並びに方法は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば、大腸炎及びクローン病を治療し、改善するために適用できる可能性がある。特定の実施形態によれば、大腸炎又はクローン病の治療、予防又は改善は、臨床スコア及び組織病理学的スコアの改善に反映される可能性がある。例えば、抗ＣＡＰ１抗体であり得る本発明のＣＡＰ１結合化合物による治療は、ＩＢＤの臨床スコア及び組織病理学的スコアの少なくとも１つを少なくとも５％〜９５％、５％〜９０％、５％〜８５％、５％〜８０％、５％〜７５％、５％〜７０％、５％〜６５％、５％〜６０％、５％〜５５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％又は約５％〜１０％低下させ得る。より具体的には、そのような低下は、治療前の臨床スコアと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも５５若しくは６０％であり得る。
【０１４６】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、免疫応答のＴｈ１前炎症性、Ｔｈ１前炎症性及びＴｈ２抗炎症性サブタイプの間の不均衡の結果であると理解することができる一般的な胃腸障害である。
【０１４７】
クローン病は、胃腸（ＧＩ）管とも呼ばれている消化管の炎症を引き起こす持続性障害である。クローン病は、口から肛門までのＧＩ管の任意の部位を侵し得るが、最も一般的には回腸と呼ばれる小腸の下部を侵す。腫脹は、罹患器官の内膜まで深く及ぶ。腫脹は、疼痛を引き起こし、腸を頻繁に空にさせ、下痢をもたらす。
【０１４８】
上で示したように、クローン病は、腸の腫脹を引き起こす疾患の一般名である、炎症性腸疾患である。クローン病の症状が過敏性腸症候群及び潰瘍性大腸炎などの他の腸障害に類似しているため、診断することが困難であり得る。潰瘍性大腸炎は、大腸の内膜の上層における炎症及び潰瘍を引き起こす。クローン病においては、腸の全層が侵される可能性があり、正常で健常な腸は、罹患した腸の区域（ｓｅｃｔｉｏｎ）の間に認めることができる。クローン病は、回腸炎又は腸炎とも呼ばれることがある。
【０１４９】
本発明の組成物は、大腸炎の治療又は予防にも適用できる可能性があることに留意されたい。潰瘍性大腸炎（Ｕ．Ｃ．）は、結腸（大腸）及び直腸の内膜の慢性（長期持続性）炎症である。内膜が炎症を起こし、潰瘍化した状態になる。炎症は、直腸（直腸炎）に限定されるか、又は結腸及び直腸の全体を侵すことがある。
【０１５０】
したがって、本発明の組成物は、臨床スコアを治療前の臨床スコアと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも５５若しくは６０％低下させ得る。
【０１５１】
他の特定の実施形態によれば、本発明の組成物並びに方法は、糖尿病などの自己免疫障害の治療及び／又は改善のために用いることができる。糖尿病は、異常な代謝、及び低レベルのインスリンホルモン、又は補償するのに不十分なレベルのインスリン分泌と相まったインスリンの作用に対する異常な抵抗性に起因する不適切に高い血糖（高血糖）によって特徴付けられる症候群である。特徴的な症状は、過度の尿産生（多尿）、過度の渇き及び液体摂取の増加（多渇症）並びに視力障害であり、血糖が軽度に上昇している場合には、これらの症状は存在しないことがあり得る。
【０１５２】
３つの主な形の糖尿病、すなわち、１型、２型及び妊娠糖尿病（妊娠中に起こる）が存在する。１型糖尿病は、インスリンの欠乏をもたらす、膵臓におけるランゲルハンス島のインスリン産生ベータ細胞の喪失によって特徴付けられる。このベータ細胞の喪失の主な原因は、Ｔ細胞媒介性自己免疫攻撃である。１型糖尿病に対して講ずることができる公知の予防処置は存在しない。ほとんどの罹患者は、発症時に他の点では健康で、健康な体重を有する。インスリンに対する感受性及び応答性は、特に初期段階では通常、正常である。１型糖尿病は、小児又は成人を侵すことがあり得、小児を侵す糖尿病の大部分の場合を表すので、「若年性糖尿病」と伝統的に呼ばれている。
【０１５３】
１型糖尿病の主要な治療法は、最も初期の段階からでさえ、血液検査モニターを用いた血糖値の注意深いモニタリングと組み合わせたインスリンの補充である。インスリンが存在しない場合、糖尿病性ケトアシドーシスが発生することがあり得、これが昏睡又は死亡をもたらし得る。喪失を逆転させることはできないが、生活様式の調節（食事及び運動）にも重点がおかれる。一般的な皮下注射のほかに、事前に設定されたレベルで１日２４時間インスリンの持続注入を可能にし、食事時間に必要に応じてインスリンの用量（ボーラス）をプログラムする能力のあるポンプによりインスリンを供給することも可能である。
【０１５４】
１型の治療は、無期限に続けなければならない。十分な認識、適切な介護と、検査及び薬物適用の訓練を行うならば、治療によって通常の活動に障害は生じない。
【０１５５】
米国における有病率は、人口の０．１２％又はほぼ３４００００人である。発生率は、年間約３００００例、人口の０．０１％である。
【０１５６】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物及び方法は、多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び予防に用いることができる。
【０１５７】
多発性硬化症（略記ＭＳ、以前には散在性硬化症又は散在性脳脊髄炎として公知）は、中枢神経系（ＣＮＳ）を侵す慢性炎症性脱髄疾患である。疾患の発症は、通常若年成人に起こり、女性でより一般的であり、国又は特定の集団によって１０００００人当たり２から１５０人までの範囲にある有病率を有する。
【０１５８】
ＭＳは、白質として公知の脳及び脊髄の部位におけるニューロンを侵す。これらの細胞は、処理が行われる灰白色部の間、及びこれらと身体の残りとの間にシグナルを運ぶ。より具体的には、ＭＳは、ニューロンが電気信号を運ぶことを助けるミエリン鞘として公知の脂肪層を作り、維持することを担う細胞である稀突起神経膠細胞を破壊する。ＭＳは、ミエリンの菲薄化又は完全喪失、並びにさほど頻繁ではないが、ニューロンの延長又は軸索の切断（離断）をもたらす。ミエリンが喪失する場合、ニューロンは、それらの電気信号をもはや効果的に伝導することができない。多発性硬化症という名称は、白質における瘢痕（硬化−プラーク又は病変としてより十分に公知である）を意味する。これらの病変におけるミエリンの喪失は、シグナルが遮断される状態によって広く異なる、いくつかの症状をもたらす。しかし、より高度の形の撮像で、損傷の多くがこれらの領域外で起こっていることを示されている。ほぼあらゆる神経症状が疾患に伴って起こり得る。
【０１５９】
ＭＳは、いくつかの形をとり、新たな症状は、個別的なエピソード（再発型）で又は時間の経過とともに徐々に累積して（進行型）起こる。ほとんどの人が最初に再発寛解型ＭＳと診断されるが、長年の後には二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）を発現する。エピソード又は発作の間に、症状が完全に消失し得るが、永久的な神経学的問題が、特に疾患が進行するときにしばしば持続する。
【０１６０】
疾患過程にかかわる機序に関しては多くが公知であるが、原因は、依然としてとらえどころがない。ほとんどの支持者による理論は、それが自己免疫反応に起因するということである。疾患は治癒を示さないが、いくつかの療法は有用であることが証明された。エピソードの後に機能を元に戻す治療の試みにより、新たな発作が予防され、身体障害が予防される。あらゆる治療と同様に、薬物はいくつかの副作用を有し、多くの療法が依然として研究中である。
【０１６１】
特定の実施形態によれば、ＭＳ疾患又は症状の治療、予防又は改善は、臨床スコアの改善に反映される可能性がある。例えば、抗ＣＡＰ１抗体であり得る本発明のＣＡＰ１結合化合物による治療は、ＭＳの臨床スコア及び組織病理学的スコアの少なくとも１つを少なくとも５％〜９５％、５％〜９０％、５％〜８５％、５％〜８０％、５％〜７５％、５％〜７０％、５％〜６５％、５％〜６０％、５％〜５５％、５％〜５０％、５％〜４５％、５％〜４０％、５％〜３５％、５％〜３０％、５％〜２５％、５％〜２０％、５％〜１５％又は約５％〜１０％低下させ得る。より具体的には、そのような低下は、治療前の臨床スコアと比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％又は少なくとも５５若しくは６０％であり得る。
【０１６２】
本発明の方法及び組成物は、本明細書において前に開示したように免疫関連障害の治療に適用できる可能性があることは理解されよう。
【０１６３】
以下の実施例により開示するように、ＣＡＰ１と相互作用することが示された２つの異なる抗体である、本発明により使用される抗ＣＡＰ１及び抗ペプチド６抗体は、抗炎症性作用を明らかに示す。より具体的には、図２８に、抗ＣＡＰ１抗体、抗ペプチド６ヒト化抗体及びそのＦ（ａｂ）_２断片へのヒトＰＢＭＣの曝露により、最終的にＩＬ−１０遺伝子発現のアップレギュレーションをもたらす連続的事象が誘発されることを示す。炎症部位におけるＩＬ−１０分泌の増加は、局所的サイトカンプロファイルを炎症応答から抗炎症応答に転換することができ、したがって、これらの抗体によりもたらされる炎症に対する防御の機序の説明となり得る。
【０１６４】
したがって、ＣＡＰ１結合化合物、具体的には、本発明により使用される抗体は、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を抗炎症性Ｔｈ２応答の方に調節する免疫調節剤として用いることができる。したがって、本発明は、ＩＬ−１０（インターロイキン１０）の発現及びレベルを増加させる組成物及び方法をさらに提供する。この態様によれば、本発明の組成物及び方法は、有効量の、ＣＡＰ１と相互作用し、結合する少なくとも１つの化合物、具体的には、単離及び精製された抗ＣＡＰ１抗体の使用を含む。本発明の組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によって含んでいてよい。
【０１６５】
抗炎症性サイトカイン、具体的にはＩＬ−１０の発現又はレベルを「増加させること」又は「増大させること」を示す、一実施形態によれば、そのような増加又は増大は、そのようなサイトカインの発現の約１０％〜１００％、２０％〜８０％、３０％〜７０％又は４０〜６０％の増加又は上昇であり得ることを意味する。詳細には、適切な対照と比較して発現の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の増加。増加又は上昇が約２〜１００倍の増加でもあり得ることにさらに留意されたい。より具体的には、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７倍又はそれ以上の増加。さらに、前記ＩＬ−１０のレベル又は発現の増加は、前記サイトカインの転写、翻訳又は安定性であることは理解されよう。
【０１６６】
上で示したように、ＩＬ−１０の発現の増大は、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する可能性がある。したがって、本発明により使用されるＣＡＰ１結合化合物、具体的には、抗ＣＡＰ１抗体は、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡を抗炎症応答の方に調節することが望ましい状態に有用である可能性がある。したがって、一実施形態によれば、本発明の組成物は、それを必要とする対象におけるＩＬ−１０の発現及びレベルを増加させ、それにより、治療対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を抗炎症性Ｔｈ２応答の方に調節するために用いることができる。１つの特定の実施形態によれば、そのような対象は、免疫関連障害に罹患している対象である。例えば、自己免疫疾患（例えば、関節炎、ＩＢＤ、１型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、狼瘡、グレーヴス病及び甲状腺炎）、移植片拒絶病状及び移植片対宿主病、並びに毒素性ショック、敗血性ショック及び重症敗血症などのスーパー抗原により誘発される障害。
【０１６７】
一般的に、本発明の組成物並びに方法は、例えば、イートン−ランバート症候群、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、ギラン−バレー症候群、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、肝炎、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、重症筋無力症、神経叢障害、例えば、急性上腕神経炎、多腺性欠乏症候群、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、強皮症、血小板減少症、甲状腺炎、例えば、橋本病、シェーグレン症候群、アレルギー性紫斑病、乾癬、混合性結合組織病、多発性筋炎、皮膚筋炎、血管炎、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、ヴェーゲナー肉芽腫症、ライター症候群、ベヒテレフ症候群、強直性脊髄炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、インスリン依存性糖尿病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎及びクローン病などであるが、これらに限定されない自己免疫疾患の治療に用いることができることはさらに理解されよう。
【０１６８】
他の態様において、本発明は、免疫関連障害の治療、改善、予防及び抑制用の組成物の調製における治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び／又は（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つの使用に関する。
【０１６９】
いくつかの特定の実施形態において、本発明は、免疫調節組成物の調製のためのＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合することにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する化合物の使用を含む。
【０１７０】
特定の実施形態において、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体は、本発明により使用することができる。
【０１７１】
本発明の方法により使用される抗ＣＡＰ１抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体のいずれか１つであってよいことに留意されたい。「抗体」という用語は、完全な分子並びに例えば、抗原に結合することができる、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２などのその断片を含むことを意味する。
【０１７２】
特定の実施形態によれば、ＣＡＰ１結合化合物、具体的には、抗ＣＡＰ１抗体であってよい抗体である、又はＣＡＰ１を認識し、それに結合する抗体であるＣＡＰ１結合化合物であって、該抗体は、ポリクローナル、モノクローナルラット若しくはマウス抗ペプチド６抗体（例えば、Ｂ２４若しくはＦ９モノクローナルと呼ばれる抗体）又はキメラ若しくはキメラ抗体由来のヒト化抗体以外であるか、又はそれらでないという条件であることはさらに理解されよう。
【０１７３】
他の実施形態において、本発明は、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節することによる免疫関連障害の治療のための組成物の調製におけるＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体の使用を含む。
【０１７４】
第５の態様において、本発明は、対象における免疫関連障害の治療に用いる、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を提供する。
【０１７５】
本明細書で用いる前記ＣＡＰ１分子又はその任意の断片は、精製組換えタンパク質、及びＣＡＰ１分子を発現する形質転換宿主細胞の細胞溶解物又は膜調製物のいずれか１つとして提供することができることにさらに留意されたい。本明細書で用いている断片及び機能的断片という用語は、Ｔｈ２抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、或いはＴｈ１前炎症性サイトカインの活性化により反映されるようなＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡の特異的な調節を誘導することができる、挿入、欠失、置換及び修飾を有するＣＡＰ１分子又はその任意の断片（以後「断片（単数又は複数）」と呼ぶ）を意味する。本明細書及び下の特許請求の範囲の項で用いる特定の実施形態によれば、ＣＡＰ１タンパク質は、図３０に示すＧｅｎＢａｎｋアクセス番号NP_001099000.1により表示され、また配列番号６として表示され、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号CAG33690.1により示されるヒトＣＡＰ１遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を含むヒトＣＡＰ１タンパク質を意味することは理解されよう。
【０１７６】
本発明はまた、対象における免疫関連障害の治療に用いる、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体を提供する。
【０１７７】
上で示したように、本発明により開示した結果は、この免疫調節経路における重要な要素として、また、したがって、免疫調節の可能な標的としてのＣＡＰ１の役割を明確に示している。したがって、本発明は、免疫調節化合物の探索のための標的としてのＣＡＰ１の使用を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する免疫調節化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明のスクリーニング方法は、（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体に結合する候補化合物を得るステップと、（ｂ）具体的には抗炎症性又は前炎症性サイトカインの発現を検討することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡の調節に関するステップ（ｂ）で得られた化合物の効果を判定するステップを含む。前記候補化合物による抗炎症性又は前炎症性サイトカインの発現の調節は、前記化合物がＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節する能力を示す。
【０１７８】
「候補化合物」という用語は、ＣＡＰ１に結合することによりＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節する化合物の能力の特徴付けが望まれる化合物を意味する。「調節する」は、いずれか又はすべてのサイトカイン、リンフォカイン及び免疫応答に関連する細胞過程の増加、減少又は他の変化を意味する。この点について、変化は、ＩＬ−１０の発現の増大及びＴｈ１／Ｔｈ２均衡のＴｈ２免疫応答の方への調節の優先を含み得る。
【０１７９】
ＣＡＰ１分子への免疫調節化合物の高親和力結合の高処理能力スクリーニングの適用への鍵は、感度が高く、簡便なスクリーニングアッセイを開発することである。
【０１８０】
ＣＡＰ１に対する親和力による免疫調節化合物の頑健なスクリーニングアッセイの開発は、前記スクリーニング方法の第１のステップである。
【０１８１】
したがって、候補免疫調節化合物は、（ａ）ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を含む混合物を準備するステップ、（ｂ）混合物を前記結合に適する条件下で候補化合物と接触させるステップ、並びに（ｃ）エンドポイント指示（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）に対する候補化合物の作用を判定するステップにより得ることができる。エンドポイントの調節が供試候補化合物へのＣＡＰ１分子の結合を示すものであることに留意されたい。
【０１８２】
１つの特定の実施形態によれば、エンドポイント指示は、視覚的に検出できるシグナルをもたらす、ＣＡＰ１分子への抗ＣＡＰ１抗体の結合であってよい。そのような場合、このエンドポイントの増加は、ＣＡＰ１分子への前記試験化合物の結合を示す。
【０１８３】
「検出できる」という用語は、本明細書で用いているように、観察、計測装置又はフィルムにより即時に検出できる化学反応により発生する検出できるシグナルの存在を意味する。
【０１８４】
より具体的には、「検出できるシグナル」という用語は、本明細書で用いているように、目視観測又は計測装置により直接的又は間接的に検出できる（観測できる）シグナルの発生又は変化を引き起こすシグナルを意味する。一般的に、検出できるシグナルは、波長分布パターン又は吸光度若しくは蛍光の強度の変化或いは光散乱、蛍光寿命、蛍光偏光の変化、或いはそのようなパラメーターの組合せにより反映される光学的特性が検出できる（「光学的に検出できる」）。
【０１８５】
より具体的には、例えば、ペプチド又は任意の小分子であってよい各候補化合物をウエルに入れ、ＣＡＰ１分子又はその任意の断片の直接的結合を好ましくはＣＡＰ１に対して特異的な抗体により検出する。プレート上での候補免疫調節化合物へのＣＡＰ１分子又はその任意の断片の有効結合の条件は、ｐＨ、塩及び緩衝液組成並びにＢＳＡなどの担体タンパク質の試験を必要とし、最適化することができる。この頑健なスクリーニングにより、ＣＡＰ１分子に結合する化合物が得られる。ＣＡＰ１に結合するそのような化合物をプールし、次に下記のようにアッセイする。
【０１８６】
本発明の方法により使用される抗ＣＡＰ１抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体のいずれか１つであってよいことに留意されたい。「抗体」という用語は、完全な分子並びに抗原に結合することができる、例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）_２などのその断片を含むことを意味することにさらに留意されたい。
【０１８７】
特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法のさらなる場合によるステップにおいて、ＣＡＰ１に結合し、上述のように得られた候補免疫調節化合物は、ＣＡＰ１分子内の抗ペプチド６抗体結合部位においてＣＡＰ１に特異的に結合するそれらの能力についてさらに選択することができる。このような選択された化合物は、前記ＣＡＰ１と抗ペプチド６抗体の間の相互作用を予防又は調節できることが望ましい。この特定の実施形態によれば、場合による選択は、（ａ）ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を含む混合物を準備するステップ、（ｂ）抗ペプチド６結合部位を介するＣＡＰ１分子と抗ペプチド６抗体との特異的相互作用に適する条件下で前記混合物を供試候補化合物と接触させるステップ、並びに（ｃ）エンドポイント指示に対する供試候補化合物の作用を判定するステップにより実施することができる。そのようなエンドポイントの調節は、前記抗ペプチド６結合部位を介するＣＡＰ１分子への供試候補化合物の結合を示す。
【０１８８】
他の実施形態によれば、場合による選択段階に用いる混合物は、（ａ）ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、（ｂ）ＣＡＰ１における抗ペプチド６結合部位を介してＣＡＰ１分子に特異的に結合する抗ペプチド６抗体、並びに（ｃ）抗ペプチド６抗体とＣＡＰ１分子との相互作用及び相互作用のエンドポイント指示の検出の適切な条件を与える場合による溶液、緩衝液及び化合物を含む。一実施形態によれば、エンドポイント指示は、視覚的に検出できるシグナルをもたらす、ＣＡＰ１分子への抗ペプチド６抗体の結合であってよい。
【０１８９】
本発明のさらなる実施形態において、そのようなエンドポイントにおいて観測される阻害は、ＣＡＰ１における抗ペプチド６結合部位への供試候補化合物の直接的結合を示す。したがって、候補化合物の結合は、結合部位への抗ペプチド６抗体の結合と競合することにより、前記結合を調節し、且つ／又は阻害する。
【０１９０】
この競合アッセイを実施するために、抗ペプチド６抗体は、例えば、ビオチニル化により、又はフルオレセインの付加により、直接的に標識することができ、或いは、二次抗体により間接的に標識することができる。
【０１９１】
本発明のスクリーニング方法により候補化合物を得るため及び選択するために用いる混合物は、細胞混合物又は無細胞混合物であってよい。
【０１９２】
１つの代替実施形態によれば、本発明の方法により利用される混合物は、無細胞混合物であってよい。そのような混合物は、ペプチド、精製組換えタンパク質、融合タンパク質及び前記ＣＡＰ１分子を発現する形質転換細胞の細胞溶解物又は膜調製物のいずれか１つとして提供することができるＣＡＰ１分子又はその機能的断片（好ましくは、抗ペプチド６抗体結合部位を含む）を含む。
【０１９３】
特定及び非限定的例において、そのような場合による選択を行うことができ、ＣＡＰ１をマイクロプレートのウエル上に結合させる。次に、各ウエルを候補免疫調節化合物の存在下で限られた量の抗ペプチド６抗体とともにインキュベートする。各ウエルから上清を収集する。二次抗体ＥＬＩＳＡにより上清中の非結合抗体を検出する。試験化合物が、抗ペプチド６抗体により認識されるドメインにおけるＣＡＰ１に強固に結合する場合、試験化合物は、ＣＡＰ１への抗ペプチド６抗体の結合について競合し、アッセイの感度を高くするゼロバックグラウンド上で検出することができる遊離の抗ペプチド６抗体を遊離させる。抗ペプチド６抗体／ＣＡＰ１相互作用に関与するドメイン外に結合する候補化合物は、このアプローチにより除外される。
【０１９４】
別のアプローチは、標識抗ペプチド６抗体を用い、プレート上のＣＡＰ１に結合している標識抗体を置換する候補化合物の能力についてアッセイすることである。
【０１９５】
或いは、そのような場合による選択ステップに用いる混合物は、細胞混合物であってよい。この特定の実施形態において、各候補化合物、好ましくはペプチドをウエルに入れ、次にウエルをＢＳＡ又はウシ胎児血清でブロックする。それらの細胞表面上のＣＡＰ１を発現する例えば、ＴＨＰ−１の結合を視覚的に、又は抗ＣＡＰ−１ ＥＬＩＳＡにより計測する。或いは、ＣＡＰ−１発現細胞から調製した細胞膜を用いることができ、抗ＣＡＰ−１抗体を用いて結合を検出する。陽性候補化合物は、次に、競合体としての抗ペプチド６抗体の存在下で再検査する。
【０１９６】
前記抗ペプチド６抗体は、配列番号１のアミノ酸配列による表されるペプチド６を含むアミノ酸配列に対して特異的に誘導された抗体を意味することは理解されよう。抗ペプチド６抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヒト化抗ペプチド６抗体、並びにそのＦ（ａｂ）断片を含むことに留意されたい。プロキシマブという語は、本明細書で用いているように、本発明者らにより調製されたヒト化抗ペプチド６抗体であることに留意されたい。
【０１９７】
混合物中に含まれるＣＡＰ１分子又はその任意の断片は、精製組換えタンパク質、及びＣＡＰ１分子を発現する形質転換細胞の細胞溶解物又は膜調製物のいずれか１つとして提供することができることを留意されたい。本明細書で用いている断片及び機能的断片という用語は、ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの活性化、或いは前炎症性サイトカインの活性化により反映されるような、抗ペプチド６結合部位を含み、この抗体に結合することができ、それによりＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡の特異的な調節を誘導する、挿入、欠失、置換及び修飾を有するＣＡＰ１分子又はその任意の断片（以後「断片（単数又は複数）」と呼ぶ）を意味する。
【０１９８】
他の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法により検討する候補化合物は、タンパク質ベース、核酸ベース、炭水化物ベース、脂質ベース、天然有機物ベース、合成により得られる有機物ベース、無機物ベース及びペプチド模倣体ベースの化合物からなる群から選択することができる。
【０１９９】
他の実施形態によれば、該化合物は、ペプチドのコンビナトリアルライブラリ、環状ペプチド模倣体のライブラリ及びランダム又は専用ファージディスプレイライブラリのポジティブスキャニングのいずれか１つの産物であってよい。
【０２００】
他の特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法の第２段階は、抗炎症性サイトカインの発現を実際に調節する、選択される候補化合物の実現可能性及びそれにより、先天性免疫を調節するそれらの能力のさらなる評価を含む。したがって、上述のように得られ、場合によって選択された候補化合物を、次に、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する、具体的には、Ｔｈ２リンパ球を活性化するそれらの能力について評価する。この評価段階は、（ａ）ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を含む試験系を準備するステップ、（ｂ）試験系を、本発明のスクリーニング方法の前段階により得られ、場合により選択された供試候補化合物と接触させるステップ、並びに（ｃ）対照と比較してエンドポイント指示に対する候補化合物の作用を判定するステップを含み、前記作用は、前炎症性Ｔｈ１又は抗炎症性Ｔｈ２リンパ球の活性化を調節する供試候補の能力を示す。
【０２０１】
本発明のスクリーニング方法により単離された候補免疫調節化合物を評価するのに用いる試験系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養又はｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルであってよい。そのような試験系は、Ｔｈ２細胞の活性化のための、また候補化合物の調節作用を判定するためのエンドポイント指示の検出のための適切な条件を与える内因性及び／又は外因性化合物を場合によってさらに含む。より具体的には、前記活性化又は調節は、ＩＬ−１０及び／又はＩＬ−４遺伝子発現などのＴｈ２サイトカインの誘導によって判定される。
【０２０２】
評価のための本発明のスクリーニング方法により利用される試験系は、内因的に発現するＣＡＰ１分子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ細胞培養であってよい。特定の例において、試験系として用いる細胞培養は、哺乳類ドナーから単離されたＰＢＭＣ培養であってよい。
【０２０３】
この特定の試験系におけるエンドポイント指示は、したがって、視覚的に検出できるシグナルをもたらすＩＬ−１０及び／又はＩＬ−４の抗ＣＡＰ１又は抗ペプチド６抗体誘導性発現であり得る。したがって、前記エンドポイントの調節、阻害又は低減は、具体的には、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の活性化、或いは前炎症性サイトカインの活性化により反映されるような、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡を特異的に調節する候補化合物の能力を示す。ＩＬ−１０の抗ペプチド６抗体誘導性発現は、例えば、定量的ドットブロットハイブリッド形成及びＲＮアーゼ保護アッセイにより検出することができる。
【０２０４】
本発明により使用される試験系は、抗炎症性サイトカインの発現のための、また候補化合物の免疫調節作用を判定するためのエンドポイント指示の検出のための適切な条件を与える内因性及び／又は外因性化合物を場合によってさらに含むことに留意されたい。
【０２０５】
他の好ましい実施形態において、抗炎症性サイトカインの発現の調節は、対照と比較して前記サイトカインの発現の増加又は減少のいずれか１つであり得る。
【０２０６】
特定の実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法は、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４及びＩＬ−６の発現を調節する化合物の同定を特に対象とすることに留意されたい。より具体的には、いくつかの実施形態によれば、本発明のスクリーニング方法は、Ｔｈ２抗炎症応答を活性化する化合物を同定することを対象とする。
【０２０７】
本発明はまた、ＣＡＰ１と相互作用することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節し、本発明によるスクリーニング方法により同定される免疫調節化合物を提供する。
【０２０８】
最後に、さらなる態様において、本発明は、免疫関連障害の治療に有効な薬剤の調製のための治療有効量の（ａ）アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物並びに（ｂ）ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを有効成分として含む医薬単位剤形に関し、該剤形は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む。
【０２０９】
特定の実施形態によれば、本発明の医薬単位剤形は、ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合することにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する化合物を有効成分として含むことができる。
【０２１０】
さらに、他の実施形態において、そのような化合物は、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１であり得る。
【０２１１】
代替実施形態によれば、本発明の医薬単位剤形は、ＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を有効成分として含むことにより、対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する。
【０２１２】
以下の実施例に基づいてより詳細に記述することとする。本発明は、実例となるものにすぎず、本発明を決して限定するものでない。本発明の多くの変更形態及び変形形態は、本教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の範囲内で、本発明を具体的に記述したのと別の方法で実施することができることは理解される。
【０２１３】
開示し、記述したが、本発明は、本明細書で開示した特定の実施例、方法ステップ及び組成物に限定されないことは理解されよう。その理由は、そのような方法ステップ及び組成物は多少変化し得るからである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその同等のものによってのみ限定されるものであるので、本明細書で用いている術語は、特定の実施形態を記述する目的のみのために用いるものであり、限定されるものではないことも理解されよう。
【０２１４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【０２１５】
本明細書並びに続く実施例及び特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べた整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を包含するが、他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の排除しないことを意味することを理解されたい。
【０２１６】
以下の実施例は、本発明の態様を実施するに際して本発明者らにより用いられた技術の代表的なものである。これらの技術は、本発明の実施の好ましい実施形態の例示的なものであるが、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神及び意図した範囲から逸脱することなく、多くの変更を行うことができることを認識することは理解されよう。
【実施例】
【０２１７】
実験手順
抗体
＊マウス抗ペプチド６抗体は、ハイブリドーマ技術によりペプチド６免疫化Ｂａｌｂ／Ｃマウスから産生させたマウスモノクローナル抗体であり、ＩｇＭイソタイプに属する。
【０２１８】
＊ラット抗ペプチド６抗体は、ハイブリドーマ技術によりペプチド６免疫化Ｌｅｗｉｓラットから産生させたラットモノクローナル抗体であり、ＩｇＭイソタイプに属する。
【０２１９】
＊キメラ抗ペプチド６ＩｇＧ１マウス及びラット抗体は、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．が標準的キメラ化技術を用いて産生させた。得られたキメラ抗体は、マウス抗体からのマウス可変領域又はラットモノクローナル抗体からのラット可変領域及びＩｇＧ１イソタイプのヒト定常領域を含む。
【０２２０】
＊マウス参照抗体に基づくヒト化抗ペプチド６抗体は、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．がＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（ＷＯ２００６／０８２４０６に記載）を用いて生産した。
【０２２１】
ＦＩＴＣ標識ヒト化抗体をＦＡＣＳ解析に用いた。いくつかの実施形態において、プロキシマブという用語をＭＴ ＨＳＰ６５のペプチド６エピトープに対するモノクローナルヒト化抗体を記述するのに用いることができる。
＊ＣＤ１４−ＰＥ（Ｓｉｇｍａ）
＊抗ＣＤ３２−ＰＥ結合（ＣＡＬＴＡＧ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
＊抗ＣＤ６４−ＡＰＣ結合（ＣＡＬＴＡＧ（商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
＊ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ１９３９０、ＵＳＡ）
＊抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）
＊ポリクローナルマウス抗ヒトＣＡＰ１（Ａｂｎｏｖａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔａｉｗａｎ）
【０２２２】
細胞培養条件
＊ＭＭ６−Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６（ヒト骨髄性単球細胞系、ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ１２４）
ＭＭ６細胞は、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１％非必須アミノ酸、０．１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１０％ＦＣＳ及び１０μｇ／ｍｌヒトインスリンを添加したＲＰＭＩ培地中で維持した。
【０２２３】
＊ＴＨＰ−１（ヒト急性単球性白血病細胞系、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）
ＴＨＰ−１細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）を添加したＲＰＭＩ培地中で維持した。
【０２２４】
＊ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞系、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２）
ＨｅＬａ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び０．１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加したＤＭＥＭ培地中で維持した。細胞を５％ＣＯ_２で３７℃インキュベーター中で増殖させた。
【０２２５】
キット
＊ＲｅａｄｙＰｒｅｐ（商標）タンパク質抽出キット（膜Ｉ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）
＊ＲｅａｄｙＰｒｅｐ（商標）タンパク質抽出キット（細胞質）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ９４５４７、ＵＳＡ）
＊Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）抗体標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）
＊Ｆ（ａｂ）_２調製キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）
＊ｓｉＲＮＡキットＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）＋Ａｌｌ ｓｔａｒ及びＣＡＰ１＿５ｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）
【０２２６】
モノクローナルマウス及びラット抗ペプチド６産生ハイブリドーマ（Ｂ２４）の産生
６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＬｅｗｉｓラットに完全フロイントアジュバントに懸濁した１００μｇのペプチド６（ＧＰＫＧＲＮＶＶＬＥＫＫＷＧＡＰ、配列番号１により表示）を皮下注射した。動物に不完全フロイントアジュバントのペプチドを３週間間隔でさらに２回注射した。ＥＬＩＳＡによる抗ペプチド６抗体レベルの測定のために血清を採取し、最高レベルを有する動物をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、２ｍＭリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４）中５０μｇのペプチドの２連続腹腔内注射により処置した。翌日、脾臓をＢＡＬＢ／ｃ Ｉｇ非分泌骨髄腫ＮＳＯと融合させた。ペプチド６を特異的に認識する抗体の存在を上清中で特異的ＥＬＩＳＡにより検出し、陽性クローンを拡大した。この研究に対して、ＩｇＭ型の抗体を産生したＢ２４と称するクローンを用いた。これらのモノクローナル抗体は、抗ペプチド６と呼ばれている。ハイブリドーマ細胞の上清から抗ペプチド６抗体を精製した。精製は、チオアドソープション（ｔｈｉｏａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）と続くプロテインＧクロマトグラフィー（Ａｄａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｓｒａｅｌ）により実施した。抗体の精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【０２２７】
キメラ抗ペプチド６抗体の産生
ｍＲＮＡをＢ２４細胞（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｚ５４００）から抽出した。ＲＴ／ＰＣＲは、単一定常領域プライマーを含むマウスシグナル配列の縮重プライマープールを用いて実施した。重鎖可変領域ｍＲＮＡを一組の６縮重プライマープールを用いて増幅し、軽鎖可変領域ｍＲＮＡを一組の８縮重プライマープールを用いて増幅した。各産物をクローニングし、それぞれの数個のクローンの配列を決定した。両抗体について、単機能重及び軽鎖可変領域配列が同定された。Ｂ２４可変領域は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４重鎖について発現ベクターシステム（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．）に転移させた。
【０２２８】
ヒト化抗ペプチド６抗体の調製
本明細書でプロキシマブと呼ぶヒト化抗ペプチド６抗体は、Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．がキメラマウス参照抗体に基づいてＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術（ＷＯ２００６／０８２４０６に記載）を用いて生産した。
【０２２９】
手短に述べると、ヒト可変領域（Ｖ領域）配列のセグメントを非関連ヒト抗体配列データベースから入手した。各選択した配列セグメント（並びにセグメント間の接合部）をｉＴｏｐｅ（商標）分析を用いてＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性について試験し、すべての最終Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）配列変異体を、Ｔ細胞エピトープを回避するようにデザインした。ヒト配列セグメントの組合せをコードする合成オリゴヌクレオチドを用いてＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）Ｖ（可変）領域遺伝子を生成させた。次にこれらをヒト定常領域を含むベクターにクローニングし、抗体を生成させ、競合ＥＬＩＳＡにより標的抗原への結合について試験した。ＶＨ１〜４（可変重鎖１〜４）をＶＫ１〜３（可変軽鎖１〜３）と組み合わせた結果として生ずる抗体変異体、例えば、ＶＨ１／ＶＫ１、ＶＨ２／ＶＫ１等をそれに応じてデザインした。これらの変異体もプロキシマブとして示されることにも留意されたい。
【０２３０】
ヒト化抗ペプチド６抗体のＦ（ａｂ）_２断片の調製
ヒト化ＶＨ２／ＶＫ３変異型抗ペプチド６抗体（プロキシマブ）のＦ（ａｂ）_２断片は、Ｆ（ａｂ）_２調製キットを用いてペプシン消化（製造業者の指示に従って）により生成させた。Ｆ（ａｂ）_２断片をＤｙｌｉｇｈｔ（商標）抗体標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ；製造業者の指示に従って）を用いてＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレセイン、Ｓｉｇｍａ）で標識した。
【０２３１】
ヒト末梢血単核細胞の調製
ヒト静脈血を健常志願者又は血液銀行から入手したバフィーコート（白血球、赤血球及び血小板の大部分を含む密度勾配遠心後の抗凝固血液試料の画分を含む）から収集した。血液をＦｉｃｏｌｌ勾配（Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）−ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で層状にして白血球画分を分離し、濃縮した。細胞を室温で１８０ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核バンドを抽出し、ＰＢＳに４０ｍｌの最終容積に再懸濁し、１１００〜１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ベレットを、２％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したＲＰＭＩに懸濁した（すべての試薬がＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ製である）。細胞を２４ウエルプレートに１〜２×１０^６の濃度で播種した。接着細胞のみが望ましい場合、細胞を１．５〜３時間インキュベートし（３７℃、７％ＣＯ_２）、次に非接着細胞をＰＢＳで４回洗い流した。
【０２３２】
抗ヒトＣＤ１４磁気ビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて製造業者の指示に従って混合物からＣＤ１４＋細胞をさらに単離した。
【０２３３】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析
１０^６個のＣＤ１４＋細胞、１０^６個のＭＭ６細胞又は０．５×１０^６個のＴＨＰ−１細胞をＰＢＳ中１％ＢＳＡ、１％ヤギ血清（ＦＡＣＳ培地）で希釈した一次抗体とともに４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ培地で２回洗浄し、ＦＡＣＳ培地で希釈した２５０ｎｇ／ｔｕｂｅ ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ．Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ１９３９０、ＵＳＡ）とともに室温で３０分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、ＦＣＳ ｅｘｐｒｅｓｓ ３プログラム（Ｄｅ ｎｏｖｏソフトウエア）を用いてＬＳＲＩＩフローサイトメーターにより解析した。
【０２３４】
キメラ抗ペプチド６抗体によるＭＭ６細胞の染色
Ｍｏｎｏ Ｍａｃ ６（ＭＭ６）細胞を１０μｇキメラ（ＣＨＭ）抗ペプチド６抗体で、続いて１：２００二次抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ単独で又は１：２０マウス抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とともに染色した。細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、スライドにのせ、マウント緩衝液で覆い、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡下で観察した。
【０２３５】
アフィニティークロマトグラフィー
セファロースビーズをマウス及びラット抗ペプチド６モノクローナル抗体に結合させ（５ｍｇ抗体／２ｍｌセファロース）、カラムを作製した。ＴＨＰ−１ヒト前単球親水性膜タンパク質をＴｗｅｅｎを用いて２０：０．１で加えた。固体物質を除去した後、試料をカラムに加えた。溶出は、酸性条件下（０．１ＮグリシンｐＨ２．４）で、続いて高塩条件下（３．２Ｍイソチオシアン酸Ｎａ）で行った。１．５ｍｌの画分を収集し、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質検出法を用いてタンパク質含量を検出した。ペレットをＰＢＳに懸濁し、ＰＢＳに対して３回透析した。
【０２３６】
ウエスタンブロット分析
ＴＨＰ−１タンパク質画分（例４）、抗ペプチド６アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出させたＴＨＰ−１前単球親水性膜タンパク質（２０μｇ）、及びヒト結核菌（ＭＴ）熱ショックタンパク質６５（５μｇ）を沸騰し、９％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲル上で分画した後、電力を用いてニトロセルロース膜に転移させた。ウエスタンブロットは、ラット抗ペプチド６モノクローナル抗体Ｂ２４を用いて行った。結合強度をヤギ抗ラットＦｃペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により検出した後、ＨＲＰ基質とともにインキュベートし、化学発光シグナルを検出した。
【０２３７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
総ＲＮＡをＳＶ総ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）により抽出し、逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
ＩＬ−１０：上流−５’ＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧ３’（配列番号２によっても表示される）
下流−５’ＧＡＧＧＴＡＣＡＡＴＡＡＧＧＴＴＴＣＴＣＡＡＧ３’（配列番号３によっても表示される）
ＧＡＰＤＨ：上流−５’ＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧ３’（配列番号４によっても表示される）
下流−５’ＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡ３’（配列番号５によっても表示される）
プライマーはＩＬ−１０及びＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡそれぞれの４６１ｂｐ及び４７６ｂｐの産物を生じさせた。
【０２３８】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
核抽出物を以前に記載されたように調製した［Ｌｅｅ Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、５巻、２２〜３１頁（１９８８年）］。オリゴヌクレオチドを、２０ｎｇの２本鎖オリゴヌクレオチド、１μｌのＫｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼ及び５μｌの１０μＣ／μＬ［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を含む２０μｌの反応混合物中で標識した。２０μｌの最終容積で、２００ｐｇの標識オリゴヌクレオチドを、１２ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．６ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡ、０．６ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び１μｇ ｐｏｌｙ ｄ（Ｉ−Ｃ）を含む緩衝液中核抽出物（１０μｇタンパク質）とともに３０℃で４０分間インキュベートした。反応混合物を０．５ＴＢＥ緩衝液中４％ポリアクリルアミドゲル上で２００Ｖで９０分間電気泳動した。
【０２３９】
ＣＡＰ１発現のｓｉＲＮＡ干渉
ヒトＴＨＰ−１前単球細胞を２４ウエルプレート上に６００００個細胞／１００マイクロリットルＲＰＭＩ培地の濃度で播種した。５ピコモルのａｌｌ ｓｔａｒ陰性ｓｉＲＮＡ又は５ピコモルのＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡを血清不含有で、３マイクロリットルＨｉＰｅｒｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を含む１００マイクロリットルのＲＰＭＩ培地で希釈した。１０分間のインキュベーションの後、ｓｉＲＮＡ溶液を細胞に加えた。細胞を３７℃で７％ＣＯ_２中で６時間インキュベートした後、４００マイクロリットルのＲＰＭＩ培地を加えた。同じ条件で４８時間のインキュベーションの後、細胞を収集し、上述のように蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析に供した。
【０２４０】
ＥＬＩＳＡ−サイトカインレベルの評価
動物の細胞培養及び血清中のサイトカインレベルの評価は、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ、ＵＳＡ製の特異的キットを用いて行った（製造業者の指示に従って）。
【０２４１】
アジュバント誘発性関節炎の誘発及び臨床的評価
６〜８週齢の雌近交系Ｌｅｗｉｓラット（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）の尾の基部にＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）中１ｍｇのヒト結核菌（ＭＴ）Ｈ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を皮内注射した。関節炎の重症度（関節炎指数）を盲検化観測者が隔日に次のように評価した。０、関節炎なし；１、関節の紅化；２、関節の紅化及び腫脹。各足蹠の足根及び足根中足関節を採点した。１６の最大スコアを得ることができた。
【０２４２】
（例１）
抗ペプチド６抗体はＩＬ−１０特異ｍＲＮＡの一時的アップレギュレーション、ＩＬ−１０分泌を誘導し、アジュバント関節炎を軽減する
ＨＳＰ−６５ペプチド６結合抗体の分子的作用機序を検討した。単球に対するマウス抗ペプチド６ｍＡｂｓの作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価したところ、ヒト単球による抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の有意な分泌を誘導することが示された。ネイティブヒト単球をマウス抗ペプチド６ｍＡｂとともにＲＰＭＩ中でインキュベートし（２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２）、培地へのＩＬ−１０の分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。無処理細胞を対照とした。図１は、マウスモノクローナル抗ペプチド６によるＩＬ−１０の誘導を示している。同様な結果がヒト化プロキシマブについて得られた（示さず）。
【０２４３】
本発明者らは、次にＩＬ−１０転写活性に対する抗ペプチド６抗体の作用、したがって、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡレベルに対するＢ２４ラット抗ペプチド６抗体の作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。ヒト単球細胞（ＰＢＭＣ）をＢ２４抗ペプチド６モノクローナル抗体、陰性対照としての全ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ抗体又は陽性対照としてのリポ多糖（ＬＰＳ）とともにインキュベートした。細胞を、ＬＰＳ、全ネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ対照又はＢ２４への曝露の４及び２４時間後に収集した。抽出されたＲＮＡを逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によりＩＬ−１０ ｍＲＮＡについて試験した（図２Ａ）。ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを等しい負荷についての対照として用いた（図２Ｂ）。図２Ａに示すように、ＬＰＳ及び抗ペプチド６抗体は、無処理及びネイティブＬｅｗｉｓ ＩｇＭ処理細胞と比較して曝露の４時間後にＩＬ−１０ ｍＲＮＡの増加を誘発した。しかし、ｍＲＮＡレベルが曝露の２４時間後に一定のままであったＬＰＳ処理細胞に反して、抗ペプチド６で処理した細胞における発現レベルが抗体との２４時間のインキュベーションの後に低下した。これらの結果は、抗ペプチド６が、一時的である、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションを誘導することを示唆するものである。
【０２４４】
確立した関節炎の実験的モデルにおけるＩＬ−１０レベルの誘導に対するプロキシマブ（ヒト化抗ペプチド６ｍＡｂ）の効果を次に評価した。Ｌｅｗｉｓラットを０日目にＣＦＡ中ＭＴで免疫化して関節炎を誘発し、関節炎の重症度を臨床採点法により測定した。動物にＰＢＳ（陰性対照）、ステロイド又はプロキシマブを投与した。図３に示すように、プロキシマブは、媒体（ＰＢＳ）投与陰性対照と比較してマウスにおけるアジュバント関節炎の重症度の低下に有効であることが示され、これらの動物は、高レベルのＩＬ−１０を有することが示された。ステロイドも関節炎の重症度の低下に有効であったが、それらは、ＩＬ−１０分泌の誘導の機序を示さなかった。
【０２４５】
（例２）
抗ペプチド６抗体はヒトＣＤ１４＋細胞に結合する
本発明の目標は、抗ペプチド６抗体の標的タンパク質を同定すること、及びこの相互作用により誘発される細胞内過程の特徴を明らかにすることである。理論に束縛されるものではないが、本発明者の作業仮説は、抗ペプチド６抗体が単球膜リガンドと交差反応し、ＩＬ−１０の転写活性及び分泌の増大につながるシグナル伝達経路を活性化するということである。この仮説をさらに探究するために、本発明者らは、抗ペプチド６抗体の特異的標的細胞を同定することを試みた。磁気ビーズによりＣＤ１４陽性細胞をヒトＰＢＭＣから単離し、ＦＩＴＣ標識キメラ抗ペプチド６抗体（ＣＨＭ、図４Ｂ）又は抗ヒトＣＤ１４−ＰＥ（図４Ｃ）又は両方（図４Ｄ）で染色した。無染色細胞を陰性対照として用いた（図４Ａ）。次に細胞をＦＡＣＳにより抗体の結合について解析した。図４Ｄに示すように、二重染色画分中の細胞の大部分がＣＨＭ及びＣＤ１４＋の両方について陽性であり、ＣＨＭ抗体がＣＤ１４＋細胞に効率よく結合することがわかる。これらの結果は、ＣＨＭ抗体がＣＤ１４＋細胞の細胞外成分と特異的に相互作用することを示唆するものである。
【０２４６】
ヒト化抗ペプチド６抗体、すなわち、プロキシマブが同様な特性で結合するかどうかを確認するために、ＣＨＭの代わりにプロキシマブを用いて同様な実験を実施した。ヒトＰＢＭＣ細胞を健常ドナーから単離し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞を抗ＣＤ１４−ＡＰＣ結合体（図５Ａ）又はＦＩＴＣ標識プロキシマブ及びＡＰＣ結合抗ＣＤ１４抗体の両方で染色した（図５Ｂ）。結果は、プロキシマブがＣＤ１４＋細胞に結合することを示すものである（単球は単離細胞集団の約１０％を構成する、図５Ｂ、上右四半分）。図５ＣにＦＩＴＣにより染色されたＣＤ１４＋集団からの細胞のパーセントを示す（プロキシマブを含まない−黒色、プロキシマブを含む−灰色）が、これにより、プロキシマブが大きいパーセント（７５％）のＣＤ１４＋集団に結合することがわかる。同様な結果がマウス抗ペプチド６ｍＡｂについて得られた。
【０２４７】
抗体がＣＤ１４陽性細胞に結合することが示されたので、本発明者らは、単球細胞系の膜へのＣＨＭの結合をさらに評価した。骨髄単球細胞系由来のＣＤ１４＋Ｍｏｎｏ Ｍａｃ６（ＭＭ６）細胞をこの実験に用い、ＣＨＭ抗体で染色し、次に抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合抗体単独に又はそれとマウス抗ヒトＣＤ１４−ＡＰＣとに曝露した。染色後、細胞を固定し、スライド上にのせ、共焦点顕微鏡下で観察した。図６Ａに明確に示されているように、ＣＨＭ抗体は、ＭＭ６細胞の膜に特異的に結合する。ＣＨＭ−ＦＩＴＣ（緑）及びＣＤ１４（赤）の両方で染色した細胞（図６Ｂ）は、ＣＨＭ抗体の結合がＣＤ１４抗体の染色と同様に、膜全体に分散していることを示しており、ＣＨＭ抗体のリガンドがＣＤ１４陽性細胞の膜表面上にあることがわかる。
【０２４８】
（例３）
ヒト単球細胞への抗ペプチド６抗体の結合はＦｃ受容体により媒介されない
本発明者らは、次に抗ペプチド６抗体の標的としての免疫系の公知の構成要素（Ｆｃ受容体など）の関与の可能性を検討した。ＭＭ６細胞が受容体ＦｃガンマＲＩ（ＣＤ６４）を約７１％、ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）を約９６％発現するが、受容体ＦｃガンマＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を発現しないことが以前に報告された［Ｔｒｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３８巻、１４１４〜１４２２頁（２００８年）］。ＭＭ６細胞へのヒト化抗ペプチド６抗体の結合がこれらの細胞上に存在するＦｃ受容体により媒介されるかどうかを検定するために、本発明者らはＦｃ受容体ＣＤ３２及びＣＤ６４に対する２つの抗体、並びにＦＩＴＣ標識ヒト化抗ペプチド６抗体（ＶＫ３−ＦＩＴＣ）との競合体としての役割を果たす非蛍光ヒト化抗ペプチド６抗体（ＶＫ３）を用いた。解析は、ＦＡＣＳにより実施した。
【０２４９】
図７に細胞を非標識ＶＫ３とともに、又はＣＤ３２及びＣＤ６４に対する抗体とともにプレインキュベートした後のＭＭ６細胞へのＶＫ３−ＦＩＴＣの結合を示す。示したように、ＦＩＴＣ−ＶＫ３は３０％の細胞に結合した（左のバー）。興味深いことに、両Ｆｃ受容体（ＣＤ３２及びＣＤ６４）に対する抗体とのプレインキュベーションにより、これらの細胞へのＶＫ３−ＦＩＴＣの結合が阻害されなかった（右のバー）。これと対照的に、非蛍光ＶＫ３抗体とのプレインキュベーションにより、ＶＫ３−ＦＩＴＣの結合が完全に阻止された（中央のバー）。これらの結果は、ヒト化抗ペプチド６抗体がＭＭ６細胞上に提示されたＦｃ受容体を利用せずに、異なる膜タンパク質を標的にすることを明確に示すものである。
【０２５０】
（例４）
抗ペプチド６抗体は単球親水性膜タンパク質に結合する
本発明の抗体が結合する特異的リガンドをさらに特徴付けるために、本発明者らは、他の細胞系、すなわち、ＴＨＰ−１（ヒト前単球性白血病細胞系）への抗体の結合を最初にアッセイした。ＴＨＰ−１細胞が抗体に結合するかどうかを判断するために、細胞をラット抗ペプチド６モノクローナル抗体（Ｂ２４）とともにインキュベートした後、ＦＩＴＣ染色し、次にＦＡＣＳ解析に供した。二次抗体（ＦＩＴＣ−ヤギ抗ラット）のみとインキュベートした細胞を対照とした。図８Ｂで認められるように、この解析により、７５％の細胞がＢ２４抗体に結合したことが示されたが、対照細胞では結合は検出されなかった（図８Ａ）。Ｂ２４がＴＨＰ−１膜に結合したことが立証されたので、本発明者らは、標的リガンドを濃縮し、同定することを着手した。この目的のために、親水性膜タンパク質、疎水性膜タンパク質及び細胞質タンパク質をＴＨＰ−１細胞から単離し、Ｂ２４モノクローナル抗ペプチド６抗体を用いたウエスタンブロット分析に供した（図９；レーン１−親水性膜タンパク質；レーン２−疎水性膜タンパク質；レーン３−細胞質タンパク質）。対照ブロットは、総ラット免疫グロブリン又は培地のみを用いてブロットした。示したように、Ｂ２４抗体は、親水性膜タンパク質の３つの画分５２、１００及び１２０ＫＤａに結合した。陰性対照ブロットには結合は検出されなかった（データは示さず）。これらの結果は、抗ペプチド６抗体の標的タンパク質が細胞膜上にある親水性タンパク質であることを明確に示すものである。
【０２５１】
（例５）
抗ペプチド６抗体はアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）に結合する
抗ペプチド６抗体の標的タンパク質を具体的に同定するために、ＴＨＰ−１細胞の親水性膜画分を、セファロースビーズに結合させた抗ペプチド６抗体を含むアフィニティーカラムに加えた。結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に加えた後、クマシーブルー染色した。図１０は、レーン２及び４で確認できるように抗ペプチド６アフィニティークロマトグラフィー溶出タンパク質のクマシーブルー染色を示している。ここで、レーン２は、ラット抗ペプチド６カラム上のアフィニティークロマトグラフィーに相当し、レーン４は、マウス抗ペプチド６カラム上のアフィニティークロマトグラフィーに相当する。約４０及び５０ＫＤａの２つの二重バンドが両方の場合に認められた。レーン１及び６は、マーカーを含む。
【０２５２】
その後、得られたバンドをゲルから切り取り、２箇所の施設での質量分析（ＭＳ）のために送った。表１にラット抗ペプチド６アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出した親水性膜タンパク質の配列決定結果を示す。表に示すように、ＭＳ分析により、溶出タンパク質が５２ＫＤａタンパク質であるアデニリルシクラーゼ結合タンパク質１（ＣＡＰ１）を含んでいたことが明らかになった。そのアミノ酸配列を図３０に示し、配列番号６と表示した。この所見は、ペプチド６に対する抗体がＣＡＰ１に特異的に結合することを明確に示すものである。
【０２５３】
【表１】

【０２５４】
抗ペプチド６抗体を作製するのに用いるエピトープである、ペプチド６は、ヒト結核菌熱ショックタンパク質６５（ＭＴ−ＨＳＰ６５）に由来するペプチドである。抗ペプチド６がＣＡＰ１タンパク質に特異的に結合することを確認し、本所見を確認するために、抗ペプチド６アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出したＴＨＰ−１親水性膜タンパク質及びＭＴ−ＨＳＰ６５をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に加え、ラット抗ペプチド６抗体（Ｂ２４）を用いたウエスタンブロット分析に供した。図１１に示すように、抗体は、２つの異なるバンド、すなわち、アフィニティーカラムから得られたタンパク質を加えたレーンに認められた５２ＫＤａタンパク質及びＭＴ−ＨＳＰ６５の既知重量と一致する６５ＫＤａバンドを検出した。これらの結果は、抗ペプチド６抗体とアデニリルシクラーゼ結合タンパク質１との相互作用を支持するさらなる証拠を提供している。
【０２５５】
（例６）
抗ＣＡＰ１抗体は単球の膜に結合する
抗ペプチド６抗体がＣＡＰ１タンパク質に結合するという所見が、本発明者らが、ＣＡＰ１がＴＨＰ−１前単球の完全な膜上に存在するかどうかを検討することにつながった。ＣＡＰ１が単球の完全な膜上に実際に存在する可能性を検討するために、ＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６／ｔｕｂｅ）を抗ヒトＣＡＰ１抗体（Ａｂｎｏｖａ、Ｔａｉｗａｎ、１０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートし、結合の評価のためにＦＡＣＳにより解析した。無染色細胞及びＦＩＴＣ染色細胞を陰性対照とした。図１２Ｃに示す結果は、約８７％の細胞がＣＡＰ１抗体に結合したが、陰性対照細胞（図１２Ａ及び１２Ｂ）は結合を示さなかったことを示している。
【０２５６】
対照的に、図１３Ｃは、表皮細胞を代表する完全なＨｅＬａ細胞は、二次抗体のみとともにインキュベートしたＨｅＬａ細胞（図１３Ｂ）又は無染色（図１３Ａ）と同様に、抗ＣＡＰ１抗体により結合されなかったことを示している。
【０２５７】
透過性化細胞を用いた上の実験を繰り返すことにより、単球におけるＣＡＰ１の固有の細胞外の存在が実証された。予期した通りに、図１４に透過性化のメタノール処理ＴＨＰ−１細胞への抗ＣＡＰ１抗体の結合が示されている。図１４Ｃで明確にわかるように、抗ＣＡＰ１抗体による細胞への著しい結合（９６％）が認められるが、無染色及び二次抗体でのみ染色したＴＨＰ−１細胞では染色は示されていない（それぞれ図１４Ａ及び１３Ｂ）。しかし、完全ＨｅＬａ細胞の場合と対照的に、透過性化のメタノール処理ＨｅＬａ細胞は、図１５Ｃに示すように抗ＣＡＰ１に著しく結合した（９６％）。したがって、透過性化ＨｅＬａ細胞は、透過性化ＴＨＰ−１細胞（９６％）と同様に抗ＣＡＰ１に結合するが、結合は非透過性の完全な細胞では実質的に異なり、それにより、抗ＣＡＰ１抗体は、ＴＨＰ−１細胞のみに結合する。
【０２５８】
したがって、ＣＡＰ１の細胞外の存在は、単球では示されているが、表皮細胞では示されていない。
【０２５９】
上の結果をさらに裏付け、単球の膜への結合がマウス由来の抗体の一般的な作用でないことを確認するために、またさらなる対照として、本発明者らは、抗ＣＡＰ１抗体に加えてマウス抗ヒトＧＡＰＤＨ抗体を用い、フローサイトメトリーによりヒト単球細胞への結合を解析した。ＧＡＰＤＨは、細胞質に存在する細胞内タンパク質である。ヒトＴＨＰ−１細胞を１μｇの抗ＣＡＰ１又は抗ＧＡＰＤＨで染色した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣ結合体で染色した。図１６でわかるように、抗ＣＡＰ１（図１６Ｂ）と対照的に、抗ＧＡＰＤＨ抗体は、完全ＴＨＰ−１細胞に結合しなかった（図１６Ｃ）。予期した通り、メタノールによるＴＨＰ−１細胞の透過性化により、抗ＣＡＰ１抗体（図１７Ｂ）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（図１７Ｃ）の結合がもたらされた。
【０２６０】
ヒト化抗ペプチド６抗体であるプロキシマブがＣＤ１４＋細胞に結合することをさらに立証するために、ＣＤ１４＋を発現するマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７を用いた。ＲＡＷ細胞を蛍光標識抗ＣＤ１４−ＡＰＣ結合体（図１８Ａ）又はプロキシマブ−ＦＩＴＣ結合体（図１８Ｂ）又は抗ＧＡＰＤＨ（図１８Ｃ）又は抗ＣＡＰ１抗体（図１８Ｄ）で染色した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ結合体で染色した。結果から、プロキシマブ抗体が、抗ＣＡＰ１（図１８Ｄ）と同様に大きい割合のマウスＣＤ１４＋細胞に結合することが示されている（図１８Ｃ）。
【０２６１】
この実施例で開示した実験により、ＣＡＰ１タンパク質がＴＨＰ−１細胞の細胞外に存在することが明確に示され、したがって、抗ペプチド６抗体がＣＡＰ１タンパク質との相互作用により細胞膜に直接結合し得るという概念が裏付けられている。
【０２６２】
（例７）
抗ペプチド６抗体はＣＡＰ１タンパク質を介してＴＨＰ−１細胞に結合する
抗ペプチド６抗体が単球膜ＣＡＰ１を認識し、異なる交差反応性膜タンパク質を認識しないことを立証するために、本発明者らは、競合実験を適用し、抗ペプチド６ヒト化抗体プロキシマブが、ＴＨＰ−１細胞への抗ＣＡＰ１抗体の結合を阻害するかどうかを試験した。この目的のために、ＴＨＰ−１をヒト化抗ペプチド６抗体プロキシマブ（２０μｇ／ｍｌ）とともにプレインキュベートした後、抗ヒトＣＡＰ１抗体（０．７５μｇ／ｍｌ）で１時間染色し、ＦＡＣＳ解析により抗ＣＡＰ１抗体のみとともにインキュベートした細胞と比較した。無染色細胞（図１９Ａ）及びＦＩＴＣ染色細胞（図１９Ｂ）を陰性対照として用いた。図１９Ｄに示すように、プロキシマブとのプレインキュベーションにより、抗ＣＡＰ１抗体のみで染色した細胞（８８％結合；図１９Ｃ）と比較して、抗ＣＡＰ１抗体に結合した細胞の集団の著しい減少（４３％結合）がもたらされた。予期した通り、陰性対照試料には蛍光は観測されなかった（図１９Ａ及び１９Ｂ）。
【０２６３】
総合すれば、これらのデータは、細胞外ＣＡＰ１が、抗ペプチド６抗体の特異的標識としての役割を果たし、単球へのその結合を可能にすることを示すものである。
【０２６４】
（例８）
ＣＡＰ１の減少は単球への抗ペプチド６抗体の結合を妨げる
プロキシマブがＣＡＰ１タンパク質を介して単球膜に特異的に結合することを示す、これらの所見をさらにバリデートするために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてＣＡＰ１の発現を妨げ、ＣＡＰ１の発現が減少した状態での単球細胞へのプロキシマブの結合を評価した。
【０２６５】
ｓｉＲＮＡ実験の準備に際して、本発明者らは、フローサイトメトリーによりＴＨＰ−１細胞へのプロキシマブの結合を検定した。ヒトＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６個／ｔｕｂｅ）を様々な濃度の抗ペプチド６抗体プロキシマブとともにインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧとともにインキュベートし、フローサイトメトリーによりプロキシマブ結合について解析した。図２０にＴＨＰ−１細胞に結合するヒト化抗ペプチド６抗体プロキシマブの滴定曲線を示す。
【０２６６】
本発明者らはさらに、フローサイトメトリーによりＴＨＰ−１細胞への抗ＣＡＰ１抗体の結合を検定した。ヒトＴＨＰ−１細胞（０．５×１０^６個／ｔｕｂｅ）を様々な濃度の抗ＣＡＰ１抗体とともにインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＦｃ ＩｇＧとともにインキュベートし、フローサイトメトリーにより抗ＣＡＰ１抗体結合について解析した。得られた抗ＣＡＰ１抗体の滴定曲線を図２１に示す。
【０２６７】
次に、本発明者らは、ＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理の後にＣＡＰ１の発現を分析した。ヒトＴＨＰ−１細胞にＡｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ又はヒトＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ（それぞれ５０ピコモル／ｍｌ）（Ｑｉａｇｅｎ）をトランスフェクトした。４８時間のインキュベーションの後、細胞を収集し、次に１０％ＳＤＳタンパク質試料緩衝液を用いて抽出した。電力によりタンパク質抽出物を９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に転移させた。ニトロセルロース膜をマウス抗ＣＡＰ１抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いてウエスタンブロッティングに供した。ゲル上で分離されたタンパク質のレベルを測定するために、膜をストリップし、抗アルファアクチン抗体を用いてウエスタンブロッティングに再び供した。図２２にＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡによる処理の後のＣＡＰ１発現の特異的減少を示す。
【０２６８】
最後に、ヒトＴＨＰ−１細胞にＡｌｌ Ｓｔａｒ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ又はヒトＣＡＰ１ ｓｉＲＮＡ（それぞれ５０ピコモル／ｍｌ）をトランスフェクトし、抗ＣＡＰ１ ｍＡｂ（５００ｎｇ／ｍｌ）又はプロキシマブ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。ヤギ抗マウス及びヤギ抗ヒトＦＩＴＣ結合抗体を用いてフローサイトメトリー解析を行った。図２３にｓｉＲＮＡによるＣＡＰ１の発現の減少の後の細胞への抗ＣＡＰ１及びプロキシマブ抗体の結合の著しい減少（それぞれ図２３Ｃ及び２３Ｄ）を示す。
【０２６９】
結果は、抗ペプチド６抗体がＣＡＰ１を介して単球膜に結合することを明確に示すものである。
【０２７０】
（例９）
抗ペプチド６抗体の作用機序
抗ペプチド６抗体がＩＬ−１０ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを誘導するという所見（例１を参照）が、本発明者らが抗ペプチド６抗体への曝露後のＩＬ−１０プロモーター領域へのタンパク質結合の変化を検討する促しとなった。この目的のために、ＩＬ−１０転写を促進することが以前に報告された代表的な部位、すなわち、Ｓｐ１［Ｍａ Ｗ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６巻、１３６６４〜１３６７４頁（２００１年）］及びｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）［Ｐｌａｔｚｅｒ Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９巻、３０９８〜３１０４頁（１９９９年）］結合モチーフを用いた。これらの公知のモチーフを有する放射性標識オリゴヌクレオチドプローブを、ラットモノクローナル抗ペプチド６抗体又は全ＬｅｗｉｓラットＩｇＭ抗体とともにインキュベートしたＰＢＭＣ細胞から抽出した核タンパク質とともにインキュベートし、次に電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により分析した。それぞれ図２４Ａ及び２４Ｂにより示されるように、Ｂ２４への細胞の曝露は、無視できるタンパク質結合を示した、全Ｌｅｗｉｓ ＩｇＭによる処理と比較して、ＩＬ−１０遺伝子プロモーター由来のそれらの対応するモチーフへのＣＲＥＢ及びＳＰ１転写因子の有意な結合をもたらした。これらの結合部位へのヌクレオチド変化の導入（突然変異ＣＲＥ及びＳｐ１）は、両部位へのタンパク質結合をほぼ完全に無効にした。これらの結果は、抗ペプチド６抗体への単球の曝露が、ＩＬ−１０遺伝子プロモーターのＣＲＥ及びＳｐ１モチーフへの転写因子の結合を刺激することにより、ｍＲＮＡ転写を誘導することを明確に示すものである。ＣＲＥは、ｃＡＭＰ／ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）シグナル伝達経路により一般的に活性化されるので、本発明者らは、次に抗ペプチド６への曝露後のＩＬ−１０発現におけるｃＡＭＰの役割を検討した。以下の解析には公知のＰＫＡ阻害剤ＫＴ５７２０を利用した。ＫＴ５７２０の作用部位［Ｋａｓｅ Ｈ．ら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．、１４２巻、４３６〜４４０頁（１９８７年）］を図２５に示す。抗ペプチド６抗体とのインキュベーションの１５分前にＫＴ５７２０を種々の濃度でＰＢＭＣに加えた。図２６に明確に示されているように、この介入がＩＬ−１０の分泌の用量依存的な阻害をもたらしたことから、ＰＫＡシグナル伝達経路が、抗ペプチド６によるＩＬ−１０の発現の活性化に重要な役割を果たしていることが立証された。総合すると、得られたデータから、抗ペプチド６抗体がＣＡＰ１との相互作用により、ＩＬ−１０ ｍＲＮＡ転写を誘導し、ひいてはｃＡＭＰ及びＰＫＡ経路の活性化を刺激するという結論が導かれた。
【０２７１】
（例１０）
ヒト化抗ペプチド６抗体のＦ（ａｂ）_２断片はヒト単球に結合し、ＩＬ−１０分泌を誘導する。
単球細胞へのヒト化抗ペプチド６抗体の結合の特異性をさらに立証し、その結合がこれらの細胞上のＦｃ受容体を介するものでないことを確認するために、本発明者らは、ヒト化抗ペプチド６抗体のＦ（ａｂ）_２断片を作製し（Ｐｉｅｒｃｅ Ｆ（ａｂ）_２調製キット）、ＣＤ１４＋精製細胞へのそれらの結合を評価した。
【０２７２】
Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）抗体標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＦ（ａｂ）_２断片をＦＩＴＣで標識した。健常ドナーからのヒトＰＢＭＣ細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞を蛍光標識抗ＣＤ１４−ＰＥ結合体（図２７Ａ）又はヒト化抗ペプチド６抗体Ｆ（ａｂ）_２断片（ＦＩＴＣ結合）とＰＥ−抗ＣＤ１４の両方（図２７Ｂ）で染色した。結果は、全プロキシマブ抗体に関する以前の結果と同様に、ＣＤ１４＋細胞へのヒト化抗ペプチド６抗体（プロキシマブ）Ｆ（ａｂ）_２の著しい結合（図２７Ｂにおける上右四半分）を示すものである。図２７ＣにＦＩＴＣで染色されたＣＤ１４＋集団からの細胞のパーセント（プロキシマブのＦ（ａｂ）_２を含まない−黒色、プロキシマブのＦ（ａｂ）_２を含む−灰色）を示す。ヒト化抗ペプチド６抗体Ｆ（ａｂ）_２が大きいパーセントのＣＤ１４＋集団に結合することが示されている。
【０２７３】
本発明者らは、次にＣＤ１４＋精製細胞へのプロキシマブのＦ（ａｂ）_２の結合を評価した。健常ドナーからのヒトＰＢＭＣ細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。抗ヒトＣＤ１４磁気ビーズ（ＢＤ）を用いてＣＤ１４＋細胞をさらに単離した。プロキシマブのＦ（ａｂ）_２をＦＩＴＣで直接標識した。ＣＤ１４＋単離細胞を抗ＣＤ１４（ＡＰＣ結合）又はプロキシマブＦ（ａｂ）_２（ＦＩＴＣ結合）で染色した。ＰＢＭＣについての以前の所見と同様に、結果は、ＣＤ１４＋集団へのプロキシマブのＦ（ａｂ）_２の著しい結合を示すものである。図２７Ｄに無染色細胞を示し、２７ＥにＦ（ａｂ）_２−ＦＩＴＣによる染色を示し、２７Ｆに抗ＣＤ１４−ＡＰＣによる染色を示す。
【０２７４】
（例１１）
ヒト化プロキシマブＦ（ａｂ）_２及び抗ＣＡＰ１はＩＬ−１０分泌を誘導する
ＩＬ−１０分泌に対する抗ＣＡＰ１抗体及びプロキシマブのＦ（ａｂ）_２の作用についても評価した。健常ドナーからのヒトＰＢＭＣ細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配で分離した。単離細胞をプロキシマブ（２００μｇ）、プロキシマブのＦ（ａｂ）_２（１５０μｇ）又は抗ＣＡＰ１抗体（８μｇ）とともにＲＰＭＩ中でインキュベートし（４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２）、培地へのＩＬ−１０分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。無処理細胞を対照とした。図２８における結果は、プロキシマブと、また抗ＣＡＰ１抗体とも同様に、プロキシマブＦ（ａｂ）_２によるＩＬ−１０分泌の著しい増加を示すものである。したがって、プロキシマブＦ（ａｂ）_２は、単球膜に結合し、完全なプロキシマブ抗体と同じ免疫応答を引き起こす。さらに、これらの結果は、ＣＡＰ１が免疫調節標的であることを明確に示し、ＣＡＰ１に結合する化合物が、前記免疫調節を媒介する抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現の増大を誘導することを示すものである。
【０２７５】
（例１２）
抗ペプチド６、抗ＣＡＰ１、プロキシマブ及びプロキシマブＦ（ａｂ）_２の作用に関する提案モデル
ＩＬ−１０分泌の誘導及び炎症性障害の軽減におけるＣＡＰ１結合抗体の作用に関する本発明者らの提案モデルを図２９に示す。抗ペプチド６並びにＣＡＰ１結合抗体は、ＣＤ１４＋細胞に存在する細胞外ＣＡＰ１に結合し、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ依存性経路を活性化し、ＩＬ−１０の転写を誘導する。ＩＬ−１０分泌が増加し、Ｔｈ１／Ｔｈ２均衡をＴｈ２の方に傾けることによって炎症性表現型を抑制する。
【０２７６】
（例１３）
ＣＡＰ１の細胞局在化及び免疫調節機能のさらなる特徴付け
ＣＡＰ１の免疫調節上の役割をさらに検討するために、ＣＡＰ１タンパク質を発現させ、精製する。最初に、ＣＡＰ１をＮ末端６×Ｈｉｓタグを有するフレームにおけるｐＥＴ２２ｂ＋ベクターにクローニングする。得られたプラスミドをＢｌ２１細胞にトランスフォームし、プラスミドを運ぶ細菌細胞を増殖させ、ＧＡＰ１−６×Ｈｉｓ組換え融合タンパク質を発現するように誘導する。次にタンパク質を天然又は変性条件でＮｉＮｔａカラム上で精製する。抗ＧＡＰ１抗体を用いてウエスタンブロットにより、精製ＧＡＰ１を確認する。ＧＡＰ１とヒト化プロキシマブとの相互作用をウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅを用いて試験する。
【０２７７】
次のステップにおいて、ＣＡＰ１とヒト化抗ペプチド６抗体とを共免疫沈降させる試みをする。細胞溶解物を磁気ビーズに結合させたプロキシマブとともにインキュベートする。次にプロキシマブに結合しているタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、抗ＣＡＰ１を用いたウエスタンブロットにより認識を確認する。最後に、膜局在化シグナルを加えているＣＡＰ１を、ヒト化抗ペプチド６抗体を結合せず、細胞外ＣＡＰ１を発現しない細胞にトランスフェクトする。次に、そのようにトランスフェクトした細胞が両抗体により結合されることを発見することを期待して、細胞を抗ＣＡＰ１又はヒト化抗ペプチド６とともにインキュベートし、ＦＡＣＳにより解析する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡の調節用の組成物であって、免疫調節有効量の
ａ．アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び
ｂ．ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、
又はそれらの任意の組合せ
の少なくとも１つを有効成分として含み、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む、上記組成物。
【請求項２】
ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する化合物を有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を有効成分として含むことにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
それを必要とする対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させる方法であって、治療有効量の
ａ．アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、及び
ｂ．ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せ若しくはそれらを含む任意の組成物
の少なくとも１つを前記対象に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項７】
治療有効量の、ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合する化合物又はそれを含む組成物を前記対象に投与することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物が、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
治療有効量のＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体又はそれらを含む任意の組成物を前記対象に投与することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するステップを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
それを必要とする対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるための組成物の調製における、治療有効量の
ａ．アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、並びに
ｂ．ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体又はそれらの任意の組合せ
のいずれか１つの使用。
【請求項１１】
前記組成物が、ＣＡＰ１と特異的に相互作用し、結合することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する化合物を有効成分として含む、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記化合物が、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記組成物が、ＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を有効成分として含むことにより、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、その発症を遅延させるのに使用される、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡を調節するアデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体。
【請求項１５】
対象における免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、その発症を遅延させるのに使用される、ＣＡＰ１を特異的に認識し、それに結合することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２間の均衡をＴｈ２抗炎症応答の方に調節する抗ＣＡＰ１抗体。
【請求項１６】
それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する免疫調節化合物のスクリーニング方法であって、
ａ．ＣＡＰ１又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体に結合する候補化合物を得るステップ、
ｂ．抗炎症性又は前炎症性サイトカイン発現の調節に基づいて、ステップ（ａ）で選択された化合物の効果を判定するステップ
を含み、それにより、前記候補化合物による抗炎症性又は前炎症性サイトカイン発現の調節が、前記対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２均衡を調節する前記化合物の能力を示す、上記スクリーニング方法。
【請求項１７】
前記免疫調節化合物が、
ａ．前記ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を含む混合物を準備するステップ、
ｂ．前記混合物を前記結合に適する条件下で前記試験化合物と接触させるステップ、並びに
ｃ．エンドポイント指示に対する試験化合物の作用を判定するステップ
により得られ、それにより、前記エンドポイントの調節が前記試験化合物への前記ＣＡＰ１分子の結合を示す、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
Ｔｈ２リンパ球の活性化を調節する前記化合物の能力を判定することにより前記候補化合物を評価し、前記評価が
ａ．ＣＡＰ１分子又はその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体を含む試験系を準備するステップ、
ｂ．前記系を請求項１６に記載の方法により得られた候補化合物と接触させるステップ、並びに
ｃ．対照と比較してエンドポイント指示に対する前記候補化合物の作用を判定するステップ
を含み、前記作用が、それを必要とする対象におけるＴリンパ球の活性化、及びそれによるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する前記候補の能力を示す、請求項１６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
ＣＡＰ１と相互作用することにより、それを必要とする対象におけるＴｈ１／Ｔｈ２細胞均衡を調節する免疫調節化合物であって、請求項１６に記載のスクリーニング方法により同定される、上記免疫調節化合物。
【請求項２０】
免疫関連障害を治療し、予防し、改善し、又はその発症を遅延させるのに有効な薬剤を調製するための、治療有効量の
ａ．アデニリルシクラーゼ結合タンパク質（ＣＡＰ１）と相互作用する化合物、並びに
ｂ．ＣＡＰ１若しくはその任意の断片、変異体、誘導体、同族体及び突然変異体、又はそれらの任意の組合せ
の少なくとも１つを有効成分として含み、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を場合によってさらに含む医薬単位剤形。

【図１】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図７】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１３Ｃ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５Ａ】

【図１５Ｂ】

【図１５Ｃ】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１７Ａ】

【図１７Ｂ】

【図１７Ｃ】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１８Ｄ】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ−２３Ｂ】

【図２３Ｃ−２３Ｄ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２５】

【図２６】

【図２７Ａ】

【図２７Ｂ】

【図２７Ｃ】

【図２７Ｄ】

【図２７Ｅ】

【図２７Ｆ】

【図２８】

【図２９】

【図３０−１】

【図３０−２】

【図２】

【公表番号】特表２０１２−５２２０３９（Ｐ２０１２−５２２０３９Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２８７５（Ｐ２０１２−５０２８７５）
【出願日】平成２２年３月２１日（２０１０．３．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００２３１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１３１４８
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１２３５６６３）プロトエービー　リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】