アデノ随伴ウイルス構築物を含んでなるコンダクティング気道細胞を標的とするための組成物
異種コンダクティング気道ターゲッティング配列を含んでなる人工ＡＡＶキャプシドが提供される。人工ＡＡＶは、それと関連する異種分子の送達のために、ターゲッティング部分として有用である。人工ＡＡＶはまた、人工キャプシドを有するＡＡＶベクターの作製においても有用である。また記述されるのは、コンダクティング気道細胞に形質導入するそれらの能力を改善しそして／もしくは除去することによりベクターの天然の親和性および形質導入効率を改変する方法である。コンダクティング気道細胞を標的としそしてそれに治療および他の分子を送達する方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦支援の研究もしくは開発に関する記述］
本研究は、国立衛生研究所からの財政支援、Ｐ０１−ＨＬ０５１７４６により一部行われた。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス科のメンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型非エンベロープ二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスストックにおける混入物質として発見されたので、該ウイルスはディペンドウイルス属に割り当てられる。ＡＡＶの生活環には、感染後に、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムに組込まれる潜伏期およびアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス感染のいずれかの後に、組込まれたＡＡＶゲノムが次にレスキューされ、複製され、そして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期が包含される。非病原性、非分裂細胞を包含する感染性の広範な宿主範囲および組換えの特性は、ＡＡＶを魅力的な送達媒体にする。
【０００３】
ＡＡＶのキャプシドは、Ｔ＝１正二十面体対称で配置される、１：１：１０の予測比における、６０コピー（合計）の３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有する［非特許文献１］。３つのＶＰは同じｍＲＮＡから翻訳され、ＶＰ１はそのＣ末端領域の全ＶＰ２配列に加えてユニークＮ末端ドメインを含有する［非特許文献１、上記に引用］。ＶＰ２は、そのＣ末端のＶＰ３に加えて追加のＮ末端配列を含有する。ＡＡＶ２［非特許文献２］およびＡＡＶ４［非特許文献３］キャプシドのＸ線結晶構造、ならびにパルボウイルスキャプシドについて決定される全ての他の構造において、ＡＡＶキャプシドタンパク質におけるＣ末端ポリペプチド配列（〜５３０アミノ酸）のみが認められる。ＶＰ１のＮ末端ユニーク領域、ＶＰ１−ＶＰ２重複領域およびＶＰ３の最初の１４〜１６のＮ末端残基は不規則である［非特許文献３および非特許文献２、上記に引用］。低温電子顕微鏡検査および画像再構成データは、完全なＡＡＶキャプシドにおいて、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のＮ末端領域はキャプシドの内部に位置し［非特許文献４；非特許文献２、上記に引用］、そして受容体および抗体結合に利用できない［非特許文献５］ことを示唆する。従って、受容体結合および形質導入表現型は、ＶＰ１〜ＶＰ３の共通のＣ末端ドメイン内のアミノ酸配列により決定されると考えられる［非特許文献１、上記に引用］。ＶＰ１ユニーク領域は、核ターゲッティングのための核局在化配列を含有することに加えて、受容体結合後の核への輸送中のエンドソーム脱出に必要とされる機能性ホスホリパーゼＡ２酵素を保有することが示されている［非特許文献６；非特許文献７］。
【０００４】
長年、異なる配列の６つのＡＡＶのみが当該技術分野において既知であり、大部分は培養下のアデノウイルス調製物の混入物質として単離されている。最近になって、組織から得られる異なる配列の多数のＡＡＶが研究者等により記述されており［非特許文献８；特許文献１］、そしてこれらのＡＡＶは異なる血清型およびクレードに特性化されている［非特許文献９；特許文献２］。異なるＡＡＶは異なるトランスフェクション効率を示し、そしてまた異なる細胞もしくは組織に対する親和性も示すことが報告されている。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）は、マウス肺のコンダクティング（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）気道上皮およびヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養物の両方に効率良く形質導入することができる。非特許文献１０。また、非特許文献１１（ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ
２／３およびＡＡＶ２の様々な偽型を比較する）および非特許文献１２（ＡＡＶ６、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ４からの感染性クローンを比較する）も参照。多数の新規ＡＡＶ配列に基づくベクターの形質導入効率はまた、インビボでマウス気道上皮、そしてインビトロでヒト繊毛気道上皮においても評価されている。［非特許文献１３］。３つのベクターはマウス肺において効率の良い形質導入を示したが、マウスにおいて認められる高い形質導入はベクターの２つのみについてヒト細胞において再現可能であった。
【０００６】
インビボでの罹患気道上皮への治療遺伝子の送達は、嚢胞性線維症（ＣＦ）気道疾患、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患および肺高血圧症を包含する様々な肺疾患の遺伝子治療の有望な選択肢である。［非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６］。しかしながら、現在、安全で且つ有効な治療ベクターは解明されないままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ−２００３−０１３８７７２−Ａ１（Ｊｕｌｙ ２４，２００３）明細書
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈ−Ｊ Ｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，８１（２２）：１２２６０−１２２７１（Ｎｏｖ ２００７）
【非特許文献２】Ｑ．Ｘｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１０４０５−１０４１０（２００２）
【非特許文献３】Ｌ．Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１１５５６−１１５７０
【非特許文献４】Ｅ．Ｐａｄｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７−５０５８（２００５）
【非特許文献５】Ｓ．Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：５２９６−５３０３（２００５）
【非特許文献６】ＪＣ Ｇｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５１９９−５２１０（２００６）
【非特許文献７】Ｆ．，Ｓｏｎｎｔａｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１１０４０−１１０５４（２００６）
【非特許文献８】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１−６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）
【非特許文献９】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）
【非特許文献１０】ＣＬ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ６（ＡＡＶ６）Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌｕｎｇｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｔｈａｔ ｏｆ ＡＡＶ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（１４）：６６１５−６６２４（Ｊｕｌｙ ２００１）
【非特許文献１１】ＣＬ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７４（３）：１５２４−１５３２（Ｆｅｂ ２０００）
【非特許文献１２】ＥＡ Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７２（１）：３０９−３１９（Ｊａｎ １９９８）
【非特許文献１３】ＭＰ Ｌｉｍｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（２）：２９４−３０１（Ｆｅｂ ２００９）
【非特許文献１４】ＭＫ Ａｎｅｊａ ａｎｄ Ｃ Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，８：４３２−４３８（２００６）
【非特許文献１５】ＰＥ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，８：１１９１−１１９８（２００７）
【非特許文献１６】ＴＲ Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１５：２２９−２４１（２００７）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、他の非肺細胞よりもむしろ、肺のコンダクティング気道細胞ならびに肺胞上皮細胞を優先的に標的とするようにＡＡＶキャプシドの改変を可能にする単離されたペプチドを提供する。
【００１０】
１つの態様において、本発明はＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶからのキャプシド領域由来の異種コンダクティング気道（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ａｉｒｗａｙ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシドを提供する。１つの態様において、クレードＡキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６およびｈｕ４８Ｒ３から選択される。
【００１１】
別の態様において、本発明は記載の通りの人工キャプシドおよびキャプシドにパッケージングされた発現カセットを有するＡＡＶベクターを提供する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は定義した通りの人工ＡＡＶキャプシドを含んでなるコンダクティング気道ターゲッティング部分を提供し、ここで、人工ＡＡＶキャプシドは、コンダクティング気道上皮への送達のための分子に連結される。さらに別の態様において、本発明は気道ターゲッティング部分および生理学的に適合する担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、コンダクティング気道細胞を生来標的としない親ＡＡＶの特異性をそれにコンダクティング気道細胞を標的とする能力を与えるように改変する方法を提供する。別の態様において、本発明は、コンダクティング肺胞上皮細胞を生来標的としない親ＡＡＶの特異性をそれにこれらの細胞を標的とする能力を与えるように改変する方法を提供する。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は人工ＡＡＶキャプシドもしくはそれらを含んでなるＡＡＶベクターを含んでなる培養下の宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明はＡＡＶベクターおよび生理学的に適合する担体を含んでなる組成物を提供する。
【００１６】
なおさらなる態様において、本発明は非肺細胞よりもむしろコンダクティング気道細胞および肺胞上皮細胞を優先的に標的とする方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の通りのＡＡＶベクターと細胞を接触させることを含む。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、処置を必要とする患者に本発明に記載の通りの人工キャプシドを有するターゲッティング部分もしくはＡＡＶベクターを送達することにより嚢胞性線維症（ＣＦ）気道疾患、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺高血圧症を処置する方法を提供する。
【００１８】
本発明のこのおよび他の利点は、以下の発明の詳細な記述から容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、ＶＰ１およびＶＰ２ユニーク領域ならびに９つの推定可変ループドメインを示すＡＡＶキャプシド配列の概略図である。行われた交換は、Ａ〜Ｆで示される。図１Ｂは、図１Ａにおいて同定される領域に関連した、ＰＣＲによる個々のフラグメントの作製の概略図である。図１Ｃは、外側プライマーの存在下で図１Ｂにおいて例示した通り作製したフラグメント間で起こった、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）反応の概略図である。
【図２】図２は、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、８つのβ−バレル鎖および９つの可変ループドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの位置を例示する、ＡＡＶ６［配列番号：１］およびＡＡＶ９［配列番号：２］キャプシドのアミノ酸配列のアライメントである。
【発明の詳細な記述】
【００２０】
本発明は、コンダクティング気道親和性をこの親和性を生来有さないＡＡＶキャプシドに与える単離されたペプチドを提供する。コンダクティング気道親和性ペプチドは、非肺細胞および組織よりもむしろコンダクティング気道上皮ならびに肺胞上皮への人工ＡＡＶキャプシドのターゲッティングを可能にする。本明細書に記述される構築物は罹患細胞のより特異的なターゲッティングを可能にしそして非標的、非肺細胞および組織の形質導入を最小限に抑えるかもしくはなくすので、これは治療および安全性の両方の点から望ましい。
【００２１】
１つの態様において、本発明は異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドを含んでなる人工アデノ随伴ウイルスキャプシドを提供する。このペプチドは、可変ループ領域ＩＶおよび可変ループ領域Ｖを含むＡＡＶキャプシド領域由来である。図２において容易に分かるように、可変ループ領域は相互に直接隣接せず、それらの間に他のＡＡＶキャプシド配列を有する。本発明によれば、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、可変ループ領域ＩＶのアミノ末端に位置するが可変ループ領域ＩＩＩを含まない機能性クレードＡ−ＡＡＶからのアミノ酸のいくつかをさらに含むことができる。機能性クレードＡ−ＡＡＶのこの領域には約５７個のアミノ酸が存在するが、ターゲッティングペプチドは、可変ループＩＶのアミノ末端上に０、１〜５個のアミノ酸、もしくはいくつかの他のフラグメントを含有することができる。さらに、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に位置するが可変ループ領域ＶＩの任意のアミノ酸を含まない機能性クレードＡ−ＡＡＶからのアミノ酸のいくつかをさらに含むことができる。機能性クレードＡ−ＡＡＶのループＶおよびＶＩの間のこの領域には約１３個のアミノ酸が存在するが、ペプチドはこの領域の０、１〜５個、もしくはいくつかの他のフラグメントを含有することができる。
【００２２】
１つの態様において、機能性クレードＡ ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３［ＷＯ ２００６／１１０６８９］から選択され、これらの全てはこの領域において同一のアミノ酸配列を共有する。人工ＡＡＶキャプシドは、親ＡＡＶにおいてこの領域に隣接するアミノ酸配列に非相同であるＡＡＶ可変ループＩＶおよび／もしくは可変ループＶ領域のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端上のアミノ酸残基が隣接するこのペプチドを含有する。
【００２３】
１つの態様において、コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、機能性クレードＡ ＡＡＶ以外であるＡＡＶキャプシドの対応する可変ループ領域に設計される。結果は、親（供給源）ＡＡＶの親和性と異なるコンダクティング気道（および場合により肺胞上皮）に対する親和性および／もしくは形質導入効率を有する人工キャプシドであ
る。そのような人工キャプシドは、様々な技術により作製することができる。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「親ＡＡＶキャプシド」は、本明細書に記載の通りの異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドにより改変されるその天然の親和性を有するキャプシドをさす。１つの態様において、クレードＡのメンバーの多くはある程度のコンダクティング気道親和性を示しているので、親ＡＡＶキャプシド配列の供給源はこのクレード以外のＡＡＶである。機能性クレードＡ ＡＡＶには、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３が包含される。他のクレードＡ ＡＡＶには、とりわけ、ｈｕ．４４、ｈｕ．４６、ｈｕ．４３およびｈｕ．４８が包含される［ＷＯ ２００５／０３３３２１およびＷＯ ２００６／１１０６８９］。
【００２５】
他のＡＡＶクレードには、クレードＢ（ＡＡＶ２によって代表される）、クレードＣ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドによって代表される）、クレードＤ（ＡＡＶ７によって代表される）、クレードＥ（ＡＡＶ８によって代表される）およびクレードＦ（ヒトＡＡＶ９によって代表される）が包含される。前述のＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ならびにｒｈ３２／３３およびｒｈ３４は明らかに相互に異なるが、本明細書に記述されるスクリーニングにおいて検出されず、そしてこれらのクレードのいずれにも含まれていない。ＡＡＶクレードのさらなる説明は、Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）および国際特許公開第ＷＯ ２００４／０２８８１７号および第ＷＯ ２００５／０３３３２１号に提供される。後者の文書はまた新規のヒトＡＡＶ配列も提供し、それらは本明細書に引用することにより組み込まれる。
【００２６】
しかしながら、別の態様において、親キャプシド配列は、任意の治療もしくは他の製品のベクターもしくは担体として用いられるＡＡＶの送達を妨げるようなレベルでコンダクティング気道細胞に生来形質導入するＡＡＶからである。
【００２７】
１つの態様において、コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、機能性クレードＡアデノ随伴ウイルスの可変ループ領域ＩＶおよび可変ループ領域Ｖを包含する領域由来である。１つの態様において、機能性クレードＡ−ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択される。１つの態様においてそしてＡＡＶ６キャプシド、配列番号：１の番号付けを参照して、このペプチドは配列番号：１のＡＡＶ６キャプシドの約アミノ酸４４７〜約アミノ酸５２１に対応する。従って、１つの態様において、このターゲッティングペプチドはアミノ酸配列：配列番号：４：ＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧを有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は当該技術分野において既知である方法を用いて配列を整列することにより、そして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００２８】
別の態様において、コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、上記ペプチドのアミノおよび／もしくはカルボキシ末端から欠失させた約１〜約８個の残基を有する。さらに別の態様において、気道コンダクティング細胞ターゲッティングペプチドはこの領域内の機能性フラグメント、すなわち、所望のターゲッティングを与えるこの領域の内部フラグメントである。そのようなフラグメントは、少なくとも約６５アミノ酸の長さ、少なくとも約５０アミノ酸の長さ、少なくとも約４５アミノ酸の長さであるかもしくはより短い可能性がある。好適には、そのようなフラグメントはＡＡＶ６キャプシド（配列番号：１）の番号付けを参照して、アミノ酸４４７〜４６９、アミノ酸４４７〜４７２、アミノ酸４５１〜４６９、アミノ酸４５１〜４７４からの可変ループＩＶ範囲由来である。１つの態様において、これらのフラグメントは、クレードＡ ＡＡＶからの可変ループＶ配
列に連結される。例えば、可変ループＶはクレードＡ ＡＡＶのアミノ酸４８７〜５２１もしくは４８９〜５３２に及ぶことができ、または所望のターゲッティングを与えるそのフラグメントであることができる（例えば、４８７〜５０６；４８７〜５１０；４８９〜５０６、４８７〜５１０）。１つの態様において、可変ループＩＶ〜Ｖ、すなわち、アミノ酸４４７〜５１０の領域範囲はコンダクティング気道コンダクティングペプチドとして用いられる。別の態様において、可変ループＩＶおよびＶ内のフラグメントは、連結するＡＡＶ６アミノ酸配列なしに、キメラ構築物において提供される。１つの態様において、キメラ構築物は他のＡＡＶ６キャプシド配列の不在下で（例えば、可変ループＩＶ配列の不在下で）ＡＡＶもしくは別のクレードＡ ＡＡＶの可変ループ領域Ｖを含有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は、配列を整列することによりそして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００２９】
さらに別の態様において、キメラキャプシドは、クレードＡ ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）の他の可変ループ領域の不在下で、キメラキャプシドにおいて、ＡＡＶ６の可変ループ領域５もしくは本明細書に記述されるようなそのフラグメントを含有する。なおさらなる態様において、キメラキャプシドはＡＡＶ６の可変ループ領域ＩＶおよびＶの両方の少なくともフラグメントを含有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は、配列を整列することによりそして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００３０】
１つの態様において、気道コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、親ＡＡＶのキャプシドタンパク質における対応する領域に挿入することができる。本明細書に提供される情報を考慮して、当業者は別のＡＡＶ（例えば、クレードＡ ＡＡＶ以外）の対応する可変領域を容易に特定することができる。本明細書における可変領域は、Ｈ−Ｊ Ｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８１（２２）：１２２６０−１２２７１（Ｎｏｖ ２００７）に提供されるＡＡＶ８に関する構造情報と一致する。本明細書における図１〜２は、概略図およびＡＡＶ６キャプシドを含む典型的なアライメントを提供する。さらに他のキャプシドタンパク質アライメントは記述されているか［例えば、ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１およびＷＯ ２００５／０３３３２１を参照］もしくは作成することができる。
【００３１】
典型的に、アライメントがＡＡＶキャプシドｖｐ１タンパク質に基づいて作成される場合、アライメントは参照ＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ６）に対してそのように同定される挿入および欠失を含有し、そしてアミノ酸残基の番号付けはアライメントに提供される参照スケールに基づく。しかしながら、任意の既定のＡＡＶ配列は、参照スケールより少ないアミノ酸残基を有し得る。本発明において、親ＡＡＶおよび参照ライブラリーの配列を説明する場合、「同じ位置」もしくは「対応する位置」という用語は、整列配列の参照スケールに関して、配列の各々における同じ残基番号に位置するアミノ酸をさす。しかしながら、アライメントから外される場合、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質の各々は異なる残基番号に位置するこれらのアミノ酸を有し得る。
【００３２】
アライメントは、様々な公的にもしくは商業的に入手可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを用いて行われる。配列アライメントプログラムはアミノ酸配列に使用可能である、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラム。当業者は必要に応じてこれらの設定を改変することができるが、一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で用いられる。あるいはまた、当業者は、参照アルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを
少なくとも提供する別のアルゴリズムもしくはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照。
【００３３】
また、上記のプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いることができる当該技術分野において既知である多数のアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧバージョン６．１におけるプログラム、Ｆａｓｔａを用いて比較することができる。Ｆａｓｔａは、クエリーおよび検索配列間の最良重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、引用することにより本明細書に組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター（ｆａｃｔｏｒ））でＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。同様に、アミノ酸アライメントを行うためにプログラムが利用可能である。当業者は、必要に応じてこれらの設定を改変することができるが、一般に、これらのプログラムはデフォルト設定で用いられる。あるいはまた、当業者は、参照アルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズムもしくはコンピュータープログラムを利用することができる。
【００３４】
上記の通り、気道コンダクティングペプチド配列は、異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域の天然の位置に存在することができる。これは、例えば本明細書の実施例において例示されるかもしくは当該技術分野において既知であるもののような技術を用いて所望の領域を交換することを包含する当業者に既知である様々な技術によって成し遂げることができる。以下の実施例において説明する通り、これは典型的に異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域を除くことを含む。しかしながら、例えば、改変されるアミノ酸のコドンに対する通常の部位特異的突然変異誘発技術を包含する他の適当な技術を用いることができる。典型的に、部位特異的突然変異誘発は、保存アミノ酸残基に所望のコドンを得るために必要とされる程度の少ない工程を用いて行われる。そのような方法は当業者に周知であり、そして公開された方法および／もしくは市販されているキット［例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＰｒｏｍｅｇａから入手可能］を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発は、ＡＡＶゲノム配列に対して行うことができる。ＡＡＶ配列は、便宜上、ベクター（例えばプラスミドバックボーン）により保有され得る。あるいはまた、当業者は当業者に既知である他の技術、例えば化学的に合成されたペプチドを挿入することなどを用いて親ＡＡＶを改変することができる。
【００３５】
１つの態様において、可変ループ領域は機能的に欠失している。場合により、任意のスペーサーが気道コンダクティングターゲッティングペプチド可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する。ある種の態様において、スペーサーは天然に存在しない、すなわち、合成的にもしくは人工的に設計されるかもしくは製造されるポリペプチドであるという意味において非天然である外来アミノ酸配列である。これらのスペーサーは、クレードＡキャプシド以外の供給源もしくはＡＡＶ以外の供給源由来である１〜５個のアミノ酸を含んでなることができる。１つの態様において、機能的欠失は選択した可変ループにおいて行われ、そしてそこに分子は挿入されない。これは様々な理由で、例えばキャプシドにおける他の部分に大きいインサートを入れるために所望され得る。そのような機能的に欠失したＡＡＶは、ＡＡＶビリオンを製造するためにならびに他の用途に利用することができる。
【００３６】
本発明の構築物によって、ＡＡＶもしくはＡＡＶキャプシドの天然の親和性は改変され
る。従って、「改変された親和性」により、改変されたＡＡＶキャプシドもしくはＡＡＶベクターは、改変されるか、もしくはそれが由来する野生型ウイルスのものと異なる標的細胞結合特異性を示すことが意図される。従って、１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の通りの異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドを提供することにより、選択したＡＡＶベクターの特異性をそれがコンダクティング気道細胞を標的とするように改変する方法を提供する。別の態様において、ターゲッティングペプチドは肺胞上皮を標的とする能力をさらに与える。
【００３７】
１つの態様において、キャプシド配列は単一のＡＡＶ供給源により提供される。適当なＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ３２．２２を包含する、通常はいかなる効率でもコンダクティング気道細胞に形質導入しないＡＡＶの中から選択することができる。さらに他のＡＡＶは、記述されているもの［ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１；ＷＯ ２００５／０３３３２１；ＷＯ ２００６／１１０６８９］および特に、クレードＡ以外であるＡＡＶの中から容易に選択することができる。あるいはまた、ＡＡＶキャプシドは１つより多くのＡＡＶ由来であることができる。
【００３８】
１つの態様において、選択したＡＡＶキャプシドはヘアピン結合モチーフを欠く。ＡＡＶは生来ヘアピン結合モチーフを欠くことができ、もしくはヘアピン結合モチーフはＷＯ
２００８／０２７０８４に記載のもののような方法を用いて取り除くことができる。例えば、人工キャプシドタンパク質もしくは人工キャプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターの生産、収量および／もしくは回収を高めるために、野生型ＡＡＶ配列へのさらに他の改変を行うことができる。
【００３９】
「機能性の」という用語は、必ずしも天然産物と同じレベルでではないが、その天然の機能を果たす産物（例えば、タンパク質もしくはペプチド）をさす。「機能性の」という用語はまた、産物をコードしそしてそれから所望の産物を発現することができる遺伝子をさすこともできる。「機能的欠失」は、その天然の機能を果たす産物の能力を損なう欠失をさす。
【００４０】
他に特定されない限り（上記の通り）、フラグメントという用語には少なくとも８アミノ酸の長さ、少なくとも１５アミノ酸の長さ、少なくとも２５アミノ酸の長さのペプチドが包含される。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントを所望の状況により容易に利用することができる。そのようなフラグメントは、組換えでもしくは他の適当な手段により、例えば化学合成により製造することができる。
【００４１】
「同一性パーセント（％）」という用語は、タンパク質の全長もしくはそのフラグメントにわたって、アミノ酸配列に関して容易に決定することができる。好適には、フラグメントは少なくとも約８アミノ酸の長さであり、そして約７００アミノ酸までであることができる。一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」をさす場合、「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」は「整列」配列に関して決定される。「整列」配列もしくは「アライメント」は、参照配列と比較した場合に欠いているかもしくは追加の塩基もしくはアミノ酸の補正を含むことが多い、多数の核酸配列もしくはタンパク質（アミノ酸）配列をさす。
【００４２】
本明細書および請求項を通して用いる場合、「含んでなる」および「含有する」という用語ならびに他のバリアントの中でも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」を包含するそのバリアントは、他の成分、要素、整数、工程などを含む。「からなる」もしくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、他の成分、要素、整数、工程などを含まない。
【００４３】
肺／コンダクティング気道ターゲッティング部分
１つの態様において、本発明は「空キャプシド」、すなわち、その中にパッケージングされた機能性配列を含有しないキャプシドである人工ＡＡＶキャプシドを提供する。言い換えれば、キャプシドはＡＡＶウイルスゲノムを欠きそして／もしくは発現カセットを含有しない。１つの態様において、人工ＡＡＶキャプシドはその中にパッケージングされた機能性ＡＡＶ配列を有さない。別の態様において、ＡＡＶは機能性ＡＡＶ遺伝子コーディング配列および内在性もしくは異種発現カセットを含有しない。
【００４４】
「空」ＡＡＶキャプシドは、異種分子のためのターゲッティングタンパク質として用いることができる。所望の治療もしくは免疫原性もしくは他の分子は、「リンカー」配列によって本発明の人工ＡＡＶキャプシドと結合することができる。
【００４５】
１つの態様において、ＡＡＶキャプシドと分子間の化学架橋は共有結合もしくは非共有結合によってである。しかしながら、当該技術分野において既知であるように、他の親和性結合対を利用することができる。当業者に既知である他の連結の中で、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マレイミドもしくはスクシンイミドエステルベースの架橋剤もしくはＳＡＴＡ−ＳＭＣＣ二官能性架橋剤が包含されるがこれらに限定されるものではない、当該技術分野において既知であるさらに他の共役化学が考えられそして本明細書の態様において用いることができる。さらなる態様において、興味のある分子は、Ｄｅｓｔｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００７ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１４（１０）：１１５２−１１６２（２００７）およびＯｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２００６；１７：７２１−７２７（２００６）に記載の通り、ＰＥＧリンカー（「スペーサー」）により空ＡＡＶキャプシドに連結することができる。
【００４６】
別の態様において、興味のある分子は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ；１５：８０７−８１３（２００４）に記載の通り、マレイミドおよびハロアセトアミド試薬を使用してＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルもしくはスルフヒドリル基を用いてＡＡＶ表面リシン残基の化学修飾によって結合される。さらに別の態様において、表面カルボキシレート基は特異的結合用に改変される。
【００４７】
別の態様において、興味のある分子は免疫グロブリン分子のＡＡＶ結合ドメインによってＡＡＶキャプシドに連結することができる。さらなる態様において、結合ドメインは免疫グロブリン分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２もしくはＦｖフラグメントであることができる。結合ドメインは、上記のものを包含する任意の既知の手段により興味のある分子に連結することができる。１つの態様において、ＰＥＧリンカーは結合ドメインと興味のある分子の間に導入される。
【００４８】
リンカー配列への結合を介した、ＤＮＡもしくはアミノ酸配列の導入のためのそのような構築技術は当該技術分野において既知であり、そしてタンパク質／遺伝子工学者の通常の技量の範囲内である。
【００４９】
ＡＡＶキャプシドに連結しそして標的細胞に送達するための有用な分子には、例えば、嚢胞性線維症、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症、喘息、肺癌のような症状を処置するために有用であるものを包含することができる。適当な分子の例には、遺伝子産物を発現する核酸を保有する非ウイルスベースのベクター（例えば、プラスミド、「裸のＤＮＡ」、コスミドなど）を包含することができる。適当な遺伝子産物の例には、発現カセットと関連して以下に記述するものが包含される。さらに、例えば、ステロイド、ステロイド誘導体、免疫調節分子、酵素、タンパク質、小分子および他の化学部分を包含する、他の非核酸ベースの分子をこの態様において
用いることができる。
【００５０】
別の態様において、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティング配列を含有する人工ＡＡＶキャプシドは、標的化細胞に産物を送達する発現カセットをその中にパッケージングしているベクターの製造において用いられる。
【００５１】
コンダクティング気道ターゲッティングドメインを含有する人工ＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶベクター
１つの態様において、本発明は本発明の新規ＡＡＶキャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作製する方法を提供する。そのような方法は、本明細書に定義した通りの本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最小で、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット；ならびにＡＡＶキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするための十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。
【００５２】
ＡＡＶキャプシドにＡＡＶ発現カセットをパッケージングするために宿主細胞において培養される必要がある成分は、トランスに宿主細胞に提供することができる。あるいはまた、必要とされる成分（例えば、発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／もしくはヘルパー機能）の１つもしくはそれ以上は、当業者に既知である方法を用いて必要とされる成分の１つもしくはそれ以上を含有するように設計されている安定な宿主細胞により提供することができる。最も好適には、そのような安定な宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下で必要とされる成分（１つもしくは複数）を含有する。しかしながら、必要とされる成分（１つもしくは複数）は構成的プロモーターの制御下であることができる。適当な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に適当な調節要素の説明において、本明細書に提供される。さらに別の代替物において、選択した安定な宿主細胞は構成的プロモーターの制御下の選択した成分（１つもしくは複数）および１つもしくはそれ以上の誘導性プロモーターの制御下の他の選択した成分（１つもしくは複数）を含有することができる。例えば、２９３細胞（これは構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／もしくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を作製することができる。さらに他の安定な宿主細胞は、当業者により作製されることができる。
【００５３】
発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および本発明のｒＡＡＶを製造するために必要とされるヘルパー機能は、その上に保有する配列を導入する任意の遺伝要素の形態においてパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択した遺伝要素は、本明細書に記述されるものを包含する任意の適当な方法により送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用する方法は、核酸操作における技量を有する者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術が包含される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は本発明への制約ではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照。
【００５４】
他に特定されない限り、ＡＡＶ ＩＴＲおよび本明細書に記述される他の選択したＡＡＶ成分は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９もしくは別のＡＡＶ配列［例えば、ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１；ＷＯ ２００５／０３３３２１；ＷＯ ２００６／１１０６８９］を包含するがこれらに限定されるものではない、任意のＡＡＶの中から容易に選択する
ことができる。これらのＩＴＲもしくは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ配列から当業者に利用可能な技術を用いて容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的もしくは公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離されるかもしくは得ることができる。あるいはまた、ＡＡＶ配列は、文献においてもしくは例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのようなデータベースにおいて入手可能であるような公開された配列を参照して合成もしくは他の適当な手段によって得ることができる。
【００５５】
Ａ．発現カセット
発現カセットは、最小で、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列、導入遺伝子およびその調節配列からなる。１つの態様において、５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲの両方が発現カセットに含まれる。１つの望ましい態様において、発現カセットは、ＡＡＶキャプシド配列を提供したもの以外のＡＡＶ配列からのＩＴＲを含有する。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有する偽型ベクターを便宜上使用することができる。しかしながら、他の適当な供給源からのＩＴＲを選択することができる。キャプシドタンパク質にパッケージングされそして選択した宿主細胞に送達されるのはこの発現カセットである。
【００５６】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、興味のあるポリペプチド、ペプチド、タンパク質、酵素もしくは他の産物をコードする、導入遺伝子に隣接するベクター配列に非相同である核酸配列である。１つの態様において、発現カセットは核酸配列、例えばＲＮＡを保有する。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが包含される。有用なＲＮＡ配列の１例は、処置した動物において標的化核酸配列の発現を抑制するかもしくは失わせる配列である。典型的に、適当な標的配列には腫瘍標的およびウイルス疾患が包含される。これは、例えば癌治療およびワクチンに有用であり得る。
【００５７】
核酸コーディング配列は、宿主細胞における導入遺伝子転写、翻訳および／もしくは発現を可能にするように調節成分に操作可能に連結される。
【００５８】
本発明の構築物を用いて任意の様々な産物を送達することができるが、本発明はコンダクティング気道細胞と関連する症状の診断、処置およびワクチン接種、ならびにその症候の改善において有用な産物の送達に特に適している。そのような症状には、嚢胞性線維症、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺高血圧症が包含されるがこれらに限定されるものではない。適当な遺伝子産物には、機能性嚢疱性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、α−１−抗トリプシン、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）、ならびに免疫賦活剤、例えば、インターロイキン１２のような例えばインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−βのようなインターフェロン、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を包含することができる。他の遺伝子産物には、とりわけ、例えばｐ５３、ＦＵＳ１を包含する癌治療法、ＲＮＡｉを包含するＲＮＡを包含することができる。さらに他の適当な発現産物は、当業者により容易に選択されることができる。
【００５９】
２．調節要素
発現カセットについて上記に同定した主要要素に加えて、ベクターにはまた、プラスミドベクターでトランスフェクションしたもしくは本発明により製造されるウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／もしくは発現を可能にするように導入遺伝子に操作可能に連結される通常の制御要素も含まれる。本明細書において用いる場合、「操作
可能に連結された」配列には、興味のある遺伝子と隣接する発現制御配列および興味のある遺伝子を制御するためにトランスにもしくは離れて作用する発現制御配列の両方が包含される。
【００６０】
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率の良いＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに必要に応じて、コードされる産物の分泌を高める配列が包含される。天然の、構成的、誘導性および／もしくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が当該技術分野において既知であり、そして利用することができる。
【００６１】
構成的プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が包含されるがこれらに限定されるものではない。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外から供給される化合物、温度のような環境因子、もしくは特定の生理状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、または複製細胞においてのみ調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを包含するがこれらに限定されるものではない、様々な商業的供給源から入手可能である。多数の他の系は記述されており、そして当業者により容易に選択されることができる。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８号］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、また、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）も参照］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］が包含される。これに関連して有用であり得る誘導性プロモーターの他のタイプは、特定の生理状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、もしくは複製細胞においてのみ調節されるものである。
【００６２】
別の態様において、導入遺伝子の天然のプロモーターが用いられる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが所望される場合に好ましい可能性がある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的にもしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に用いることができる。さらなる態様において、他の天然の発現制御要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはコザック共通配列もまた天然の発現を模倣するために用いることができる。
【００６３】
導入遺伝子の別の態様には、組織特異的プロモーターに操作可能に連結された遺伝子が包含される。例えば、肺組織に特異的なそして利用可能な場合、コンダクティング気道細胞に特異的なプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの例には、とりわけ、例えば、フォークヘッドボックスＪ１（ＦＯＸＪ１）プロモーター、ポリユビキチンプロモーターＵｂＣ、ＳＡＭポイント（ｐｏｉｎｔｅｄ）ドメイン含有ＥＴＳ転写因子（ＳＰＤＥＦ）プロモーター、クララ細胞分泌タンパク質／ウテログロビン（ＣＣＳＰ／ＵＧ）プロモーターを包含することができる。他の肺特異的遺伝子プロモーターには、とりわけ、例えばサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）およびサーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰＡ）、外生ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）ならびにヒトサーファクタントタンパク質Ａ１（ｈＳＰＡ１）を包含することができる。
【００６４】
場合により、治療的に有用な導入遺伝子を保有するプラスミドはまた、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含する選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子を含むこともできる。そのような選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子（好ましくは、本発明の方法によりレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）は、細菌細胞におけるプラスミドの存在を示すために用いることができる、例えばアンピシリン耐性。プラスミドの他の成分には、複製起点を包含することができる。これらのおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣例的であり、そして多数のそのような配列が利用可能である。
【００６５】
導入遺伝子、プロモーター／エンハンサーおよびＡＡＶ ＩＴＲの組み合わせは、本明細書において参照しやすいように発現カセットと呼ばれる。本明細書における教示が提供されていると、そのような発現カセットの設計は通常の技術を用いることにより行うことができる。
【００６６】
３．パッケージング宿主細胞への発現カセットの送達
発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の適当なベクター、例えばプラスミド上に保有することができる。本発明において有用なプラスミドは、それらが原核細胞、哺乳類細胞もしくは両方における複製および場合により組込みに適当であるように設計することができる。これらのプラスミド（もしくは５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ ＩＴＲを保有する他のベクター）は、真核生物および／もしくは原核生物における発現カセットの複製を可能にする配列ならびにこれらの系の選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子には、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含することができる。プラスミドはまた、アンピシリン耐性のような、細菌細胞におけるベクターの存在を示すために用いることができるある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子を含有することもできる。プラスミドの他の成分には、複製起点およびアンプリコン、例えばエプスタイン・バーウイルス核抗原を用いるアンプリコン系を包含することができる。このアンプリコン系もしくは他の同様のアンプリコン成分は、細胞における高コピーエピソーム複製を可能にする。好ましくは、発現カセットを保有する分子は細胞にトランスフェクションされ、そこでそれは一時的に存在し得る。あるいはまた、発現カセット（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを保有する）は、染色体にもしくはエピソームとしてのいずれかで、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれることができる。ある種の態様において、発現カセットは、場合により頭−頭、頭−尾もしくは尾−尾コンカテマーにおいて、多コピーで存在することができる。適当なトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞に発現カセットを送達するために容易に利用することができる。
【００６７】
一般に、トランスフェクションにより発現カセットを含んでなるベクターを送達する場合、ベクターは約１ｘ１０４の細胞〜約１ｘ１０１３の細胞、もしくは約１ｘ１０５の細胞に約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、約１０μｇ〜約５０μｇのＤＮＡの量において送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択したベクター、送達方法および選択した宿主細胞のような因子を考慮に入れることができる当業者により調整されることができる。
【００６８】
Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列
発現カセットに加えて、宿主細胞は宿主細胞において本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（もしくはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を導く配列および発現カセットに存在するＡＡＶ ＩＴＲの供給源と同じ供給源もしくは交差相補供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上記の通りのＡＡＶ供給源から独立して得ることができ、そして上記の通りの当業者に既知である任意の方法において宿主細胞に導入することができる。さらに、ＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、必須のｒｅｐタンパク質の各々をコードする配列は異なるＡＡＶ供給源（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または本明細書に記述されるかもしくは当該技術分野において既知である他のＡＡＶ配列の１つ）により供給されることができる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からであることができ、一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８からであることができる。
【００６９】
１つの態様において、宿主細胞は上記のもののような適当なプロモーターの制御下のキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、キャプシドタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様において、キャプシドタンパク質はトランスに宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達する場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞において選択したキャプシドタンパク質の発現を導くために必要な配列を含有するプラスミドによって送達することができる。最も望ましくは、トランスに宿主細胞に送達する場合、キャプシドタンパク質を保有するプラスミドはまた、ｒＡＡＶをパッケージングするために必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列も保有する。
【００７０】
別の態様において、宿主細胞は上記のもののような適当なプロモーターの制御下のｒｅｐ配列を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、必須のｒｅｐタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様において、ｒｅｐタンパク質はトランスに宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達する場合、ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞において選択したｒｅｐタンパク質の発現を導くために必要な配列を含有するプラスミドによって送達することができる。
【００７１】
従って、１つの態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクションすることができ、そしてエピソームとして細胞において安定に存在する。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体に安定に組込まれる。別の態様は、宿主細胞において一過性発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’に、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に置かれる任意のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【００７２】
場合により、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列は、宿主細胞に導入される他のＤＮＡ配列を含有するベクター上で供給されることができる。例えば、ベクターは、発現カセットを含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有することができる。ベクターは、ヘルパー機能、例えば、アデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６をコードする遺伝子、ならびにＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子の１つもしくはそれ以上を含んでなることができる。
【００７３】
好ましくは、この構築物において使用するプロモーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明した通りの構成的、誘導性もしくは天然のプロモーターのいずれかであることができる。１つの態様において、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列が用いられる。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。
【００７４】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは導入遺伝子調節要素に関連して上記で説明するような誘導性プロモーターである。ｒｅｐ発現のための１つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にトランスフェクションされるかもしくは形質転換される。１９９８年３月１２日に公開された国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８を参照。
【００７５】
スペーサーは、ベクターの設計における任意の要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子ＡＴＧ開始部位との間に置かれるＤＮＡ配列である。スペーサーは任意の所望の設計を有することができ；すなわち、それはヌクレオチドのランダムな配列であることができ、あるいはまた、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは、典型的に開始／終結およびポリＡ部位を含む遺伝子を含有することができる。スペーサーは、原核生物もしくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御のないコーディング配列または転写制御を有するコーディング配列であることができる。スペーサー配列の２つの典型的な供給源はλファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、これらはとりわけ例えばＧｉｂｃｏもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を通常レベルで発現したままで、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を減らすために十分な任意のサイズのものであることができる。従って、スペーサーの長さは約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐ、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲においてであることができる。組換えの可能性を減らすために、スペーサーは好ましくは２ｋｂｐ未満の長さであり；しかしながら、本発明はそのように限定されない。
【００７６】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１つもしくは複数）は一時的に（すなわち、トランスフェクションによって）宿主細胞に存在することができるが、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方もしくは両方ならびにそれらの発現を制御するプロモーター（１つもしくは複数）は、例えばエピソームとしてもしくは宿主細胞の染色体への組込みにより、宿主細胞において安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために用いる方法は、上記の参考文献に記述されるもののような通常の遺伝子工学もしくは組換え工学技術である。本明細書は、本明細書に提供される情報を用いて、特定の構築物の説明に役立つ実例を提供するが、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、ならびに少なくとも１つの翻訳開始および終結シグナル、ならびにポリアデニル化部位の任意の付加を包含する他の要素の選択を用いて、他の適当な構築物を選択しそして設計することができる。
【００７７】
本発明の別の態様において、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供することができる。
【００７８】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞はまた、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能も必要とする。場合により、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給されることができる。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は上記のもののようなヒトもしくは非ヒト霊長類アデノウイルス供給源から各々提供され、そして／もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，
ＶＡ（ＵＳ）を包含する様々な供給源から入手可能である。１つの現在好ましい態様において、宿主細胞はＥ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／もしくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を供給されそして／もしくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ
ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有することができるが、これらの遺伝子は必要とされない。好ましい態様において、他のアデノウイルス遺伝子もしくは遺伝子機能は宿主細胞に存在しない。
【００７９】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物ならびに任意の他の所望のヘルパー機能は、細胞におけるそれらの発現を可能にする任意の手段を用いて提供することができる。これらの産物をコードする配列の各々は別個のベクター上であることができ、または１つもしくはそれ以上の遺伝子は同じベクター上であることができる。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する、当該技術分野において既知であるかもしくは上記に開示される任意のベクターであることができる。ベクターの宿主細胞への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する、当該技術分野において既知であるかもしくは上記に開示した通りの任意の手段により成し遂げることができる。アデノウイルス遺伝子の１つもしくはそれ以上は、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、もしくは一過性発現されることができる。遺伝子産物は全て一過性で、エピソーム上で発現されるかもしくは安定に組込まれることができ、または遺伝子産物のあるものは安定に発現されることができ、一方、あるものは一過性発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子の各々のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは、生物もしくは細胞の特定の生理状態により（例えば、分化状態によりまたは複製もしくは静止細胞において）または他の手段により、例えば外から加える因子により調節することができる。
【００８０】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
宿主細胞自体は、原核（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を包含する真核細胞を包含する任意の生物有機体から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２のような細胞ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳類由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を包含するがこれらに限定されるものではない任意の哺乳類種の中から選択される。細胞を提供する哺乳類種の選択は本発明の制約ではなく；また哺乳類細胞のタイプ、すなわち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。使用する細胞の必要条件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ ＯＲＦ６以外のアデノウイルス遺伝子を保有せず；それがｒＡＡＶの製造中に混入ウイルスの相同的組換えをもたらし得る他のウイルス遺伝子を含有せず；そしてそれがＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクションしたＤＮＡの発現ができることである。好ましい態様において、宿主細胞は、細胞に安定にトランスフェクションされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。
【００８１】
本発明において有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡならびに上記の通りの発現カセットを保有する構築物でトランスフェクションされる宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願公開第ＷＯ ９９／１５６８５号）もしくは米国特許第５，６５８，７８５号に記述されるもののような、安定なｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現細胞系もまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ ＯＲＦ６を
発現するために十分である最小のアデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに他の細胞系は、本発明の新規シングルトン−修正（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ＡＡＶ
ｃａｐ配列を用いて構築することができる。
【００８２】
本発明の宿主細胞の製造は、選択したＤＮＡ配列のアセンブリのような技術を伴う。このアセンブリは、通常の技術を利用して成し遂げることができる。そのような技術には、周知でありそして上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、合成方法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の適当な方法が包含される。
【００８３】
宿主細胞への分子（プラスミドもしくはウイルスとして）の導入はまた、当業者に既知でありそして本明細書を通して説明した通りの技術を用いて成し遂げることもできる。好ましい態様において、標準的なトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションもしくは電気穿孔、および／またはヒト胎児腎臓細胞系ＨＥＫ ２９３（トランスに作用するＥ１タンパク質を提供する機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎臓細胞系）のような細胞系へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染が用いられる。
【００８４】
製薬学的組成物およびその使用
気道ターゲッティング分子を含有する製薬学的組成物は本明細書に記述され、それらは気道コンダクティング上皮への送達のための部分に連結された人工ＡＡＶキャプシドおよび生理学的に適合する担体を含んでなる。他の製薬学的組成物は、生理学的に適合する担体と共に本明細書に記載の通りの人工ＡＡＶキャプシドを含有するＡＡＶベクターを含有する。これらの組成物は、非肺細胞よりもむしろ、コンダクティング気道細胞を優先的に標的とするためにそして肺胞上皮を標的とするために適している。１つの態様において、これらの組成物は鼻腔内、経口もしくは気管内送達に適当な担体と調合される。しかしながら、他の調合および送達経路を選択することができる。
【００８５】
人工ＡＡＶキャプシドを含有する組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合する担体に懸濁したｒＡＡＶは、ヒトもしくは非ヒト哺乳類患者に投与することができる。適当な担体は、導入ウイルスが指示される適応を考慮して当業者により容易に選択されることができる。例えば、１つの適当な担体には食塩水が包含され、これは様々な緩衝溶液と調合することができる（例えばリン酸緩衝食塩水）。他の典型的な担体には、滅菌食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水が包含される。
【００８６】
場合により、組成物は、ＡＡＶおよび担体（１つもしくは複数）に加えて、防腐剤もしくは化学安定剤のような他の通常の製薬学的成分を含有することができる。適当な典型的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが包含される。適当な化学安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが包含される。
【００８７】
ベクターもしくはＡＡＶターゲッティング部分は、過度の悪影響なしに、もしくは医学的に許容しうる生理学的効果を有して治療利益を与えるために十分な量において投与され、それは医療分野における当業者により決定されることができる。通常のそして製薬学的に許容しうる投与経路には、所望の臓器（例えば肺）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管支内、動脈内、眼球内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路が
包含されるがこれらに限定されるものではない。投与の経路は、必要に応じて、組み合わせることができる。
【００８８】
ウイルスベクターもしくはターゲッティング部分の投薬量は、処置する症状、患者の年齢、体重および健康のような因子により主に決まり、従って患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投薬量は、一般に、
約１ｘ１０９〜１ｘ１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの溶液の範囲においてである。大きい臓器（例えば、肝臓、筋肉、心臓および肺）への送達のための好ましいヒト投薬量は、約１〜１００ｍＬの容量で、約５ｘ１０１０〜５ｘ１０１３のＡＡＶゲノムであることができる。眼への送達のための好ましい投薬量は、約０．１ｍＬ〜１ｍＬの容量で、約５ｘ１０９〜５ｘ１０１２ゲノムコピーである。例えば、気道コンダクティング細胞ターゲッティング部分の治療的に有効なヒト投薬量は、一般に、約１００μｇ〜約１０ｍｇの部分の範囲においてである。これは溶液中で、例えば約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの溶液中で送達することができる。ウイルスベクターおよびターゲッティング部分の両方について、投薬量は任意の副作用に対する治療効果のバランスを保つように調整することができ、そしてそのような投薬量は、組換えベクターを用いる治療用途により異なり得る。導入遺伝子の発現のレベルおよび／または治療もしくはワクチン分子の循環半減期は、投薬量の頻度を決定するためにモニターすることができる。場合により、治療目的のために記述されるものと同様の投与処方計画を本発明の組成物を用いる免疫に利用することができる。
【００８９】
本発明のＡＡＶ由来の構築物による送達のための治療製品および免疫原性製品の例を以下に提供する。これらの構築物は、本明細書に記載の通り、様々な治療もしくはワクチン処方計画に用いることができる。さらに、これらのベクターは、所望の治療および／もしくはワクチン処方計画において１つもしくはそれ以上の他のベクターもしくは有効成分と組み合わせて送達することができる。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は一例にすぎず、そして本発明への制約ではない。
【実施例１】
【００９１】
ＡＡＶ６／９キメラキャプシドを有するＡＡＶ
Ａ．可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを有するＡＡＶキメラの構築
ＡＡＶ６およびＡＡＶ９キャプシドの特定のドメインをオーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いて交換した（図１Ａ〜Ｃ）。この方法は、各ベクターキャプシドにおいて交換される領域を増幅するためのプライマーの使用を伴う。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の末端が相補的配列を含有するように異種キャプシド配列に相補的な１０〜１５塩基対の５’突出を有するように設計される。これは、キメラキャプシド配列を生じるように外側の５’および３’末端に相補的な１組のプライマーを用いる第二のＰＣＲ反応においてフラグメントが一緒に連結されることを可能にした。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【００９２】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶ〜Ｖ
5’-AGCCTGGACCGRCTATGAATCC-3’ Ｆ 配列番号：５
5’-GCCATAGCAGGTCCAGGGTTGAT-3’ Ｒ 配列番号：６
【００９３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１〜ＶＬ ＩＶ
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：７
5’-GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3’ Ｒ 配列番号：８
【００９４】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖ−末端
5’-ATCAACCCTGGACCTGCTATGGC-3’ Ｆ 配列番号：９
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：１０
【００９５】
１２のキメラを構築し、それらはＶＰ１およびＶＰ２ユニーク領域ならびにキャプシドの９つの推定表面可変ループ領域の交換を含んだ。
【００９６】
次に、これらのキメラキャプシド配列を制限酵素認識部位消化によりＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を含有するプラスミドにクローン化し、そして次に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現されそしてＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するＧＦＰを含有するプラスミドに加えてＡｄＶヘルパープラスミドと一緒に、２９３細胞にトランスフェクションした。これらのベクターのうち６つをＣＭＶプロモーターからＧＦＰもしくはニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターからｎＬａｃＺのいずれかを発現する大規模製造および精製に進めた。ウイルス力価は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＦ）ポリＡ特異的プライマーおよびプローブを用いてＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲにより決定した。
【００９７】
Ｂ．ヒト気道上皮細胞培養物の形質導入
次に、これらの６つのベクターの形質導入プロフィールをヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養物で調べてヒトコンダクティング気道に形質導入するそれらの能力を決定した［ＴＥ
Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１４：１０４−１２（１９９６）］。初代ＨＡＥ細胞（Ｌｏｎｚａ）を２４ウェルトランスウェルプレート上に〜５０，０００細胞／ウェルでまいた。いったん完全にコンフルエントになると、これらの細胞を気液界面で少なくとも４週間培養し、その後で適切な細胞分化を与えるように実験において使用した。ＨＡＥ細胞のＡＡＶ形質導入を調べるために、ＧＦＰを発現する６つのＡＡＶキメラに加えてコントロールとしてＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９を５０μｌ中１ｘ１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ウェルでＨＡＥ細胞の頂端表面に加えた。ベクターを２時間後に取り除き、そして細胞を気液界面で維持した。ＧＦＰ発現を５日後に評価した。
【００９８】
この実験により、ＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６キャプシドの可変ループ領域ＩＶ〜Ｖ（配列番号：１のアミノ酸４４７〜５２１）を交換すること（ｓｗａｐｐｉｎｇ）（ＡＡＶ２／９−６ＶＬ ＩＶ〜Ｖ）はＡＡＶ６のものと同様の形質導入を与え、一方、ＡＡＶ９は通常はコンダクティング気道に形質導入しないことが示された。逆に、ＡＡＶ６キャプシド中にＡＡＶ９の相同領域を交換すること（ＡＡＶ２／６−９ＶＬ ＩＶ〜Ｖ）は、ＨＡＥ細胞を効率良く形質導入するＡＡＶ６の能力を取り除いた。これは、ＡＡＶ６キャプシドのこのドメインがコンダクティング気道親和性にとって重要であることを示す。さらに、同じ結果は他のキメラでは観察されなかったので、この現象はＡＡＶ６の可変ループ領域ＩＶ〜Ｖに特異的である。
【００９９】
Ｃ．マウス肺のインビボ形質導入
これらのベクターの形質導入プロフィールはまた、鼻腔内点滴後にマウス肺においても調べられた。ｎＬａｃＺを発現する１ｘ１０１１ＧＣの各キメラに加えてコントロールとしてＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９を５０μｌの総容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）においてＣ５７Ｂｌ／６マウスに鼻腔内送達した。２１日後に、肺を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物およびＰＢＳの１：１混合物で膨張させ、取り除き、そして切断およびβ−ｇａｌ発現の染色のためにＯＣＴにおいて凍結させた。
【０１００】
この場合もやはり、ＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６キャプシドの可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを交換することは、コンダクティング気道上皮に対する新規親和性をＡＡＶ９に与え
ることが認められた。そして逆に、ＡＡＶ６キャプシド中にＡＡＶ９の相同領域を交換することはＡＡＶ６形質導入を除去した。
【０１０１】
総合すると、これらの研究によりコンダクティング気道形質導入に重要なＡＡＶ６キャプシドのドメインが同定されたことが示される。可変ループ領域ＩＶ〜Ｖ（ＡＡＶ６のアミノ酸４４７〜５２１）は、キャプシドの正二十面体３回転軸の表面露出突起上に位置し、そして形質導入に必要な細胞相互作用を決定し得る。
【実施例２】
【０１０２】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６ナローＶＬ ＩＶおよびナローＶＬ Ｖを有するＡＡＶ６／９キメラ
Ａ．可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを有するＡＡＶキメラの構築
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域を取り除いたＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＩＶおよび可変ループＶのナローフラグメントを挿入した。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１０３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ ＩＶナロー
5-’AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：１１
5’-TCCGGACTGATTCTG/AGTCTTTGAGAGAT-3’ Ｒ 配列番号：１２
【０１０４】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶナロー
5’-ATCTCTCAAAGACT/CAGAATCAGTCCGGA-3’ Ｆ 配列番号：１３
5’-ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3’ Ｒ 配列番号：１４
【０１０５】
ＡＡＶ９ ＶＬ ＩＶナロー−ＶＬ Ｖナロー
5’-GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3’ Ｆ 配列番号：１５
5’-TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3’ Ｒ 配列番号：１６
【０１０６】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナロー
5’-GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3’ Ｆ 配列番号：１７
5’-CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3’ Ｒ 配列番号：１８
【０１０７】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖナロー−末端
5’-TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3’ Ｆ 配列番号：１９
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：２０
【０１０８】
ナローＡＡＶ６ＶＬ−ＩＶナローは、配列番号：１のアミノ酸配列４５０〜４６９に対応する。ナローＡＡＶ６ＶＬ−Ｖナローは、配列番号：１のアミノ酸配列４８７〜５０５に対応する。得られるキメラキャプシドは、ＡＡＶ６ＶＬ−ＩＶナローのカルボキシ末端とＡＡＶ６ＶＬ−Ｖナローのアミノ末端の間に位置するアミノ酸配列を包含する、ＡＡＶ６可変ループ領域の各々のアミノおよびカルボキシ末端の両方に隣接するＡＡＶ９キャプシド配列を含有する。
【０１０９】
構築したキメラキャプシド配列を制限酵素認識部位消化によりＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を含有するプラスミドにクローン化し、そして次に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現されそしてＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を含有するプラスミドに加えてＡｄＶヘルパープラスミドと一緒に、６ウェルプレートにおいて２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に培地を交換し、そしてトランスフェクションの３日後に細胞溶解物を
集めた。溶解物を３回凍結融解し、そして遠沈して細胞残屑を除いた。次に、ＳＶ４０ポリＡ特異的プライマーおよびプローブを用いて定量的ＰＣＲによりベクターゲノムコピー（ＧＣ）を滴定した。
【０１１０】
ｆｆｌｕｃ発現カセットを保有する得られるキメラＡＡＶウイルス粒子は、約１ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬのレベルで力価を示し、これは同じ発現カセット、しかしそれぞれ完全なＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９キャプシドを含有したＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９コントロールで認められる力価の中間である。
【０１１１】
インビトロ形質導入を調べるために、２９３細胞を９６ウェルプレートにおいて１ｘ１０５細胞／ウェルでまいた。１ｘ１０９ＧＣの各ベクターを１００μｌの総容量の培地において三重反復で細胞に加えた。一晩のインキュベーション後に、ベクターを取り除きそして新しい培地で置き換えた。形質導入後７２時間で、ｆｆｌｕｃ発現を発光イメージングにより調べた。
【０１１２】
上記の通り作製した１つのキメラ構築物、ナロー可変ループＩＶ領域およびナロー可変ループＶ領域（ＡＡＶ６のアミノ酸４８７〜５０５）を有するＡＡＶ２／９を小規模力価でそして２９３細胞におけるインビトロ形質導入について試験した。約１ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬの力価が認められ；これらの力価はＡＡＶ２／６コントロールで認められるものより高いが、認められるＡＡＶ２／９コントロールより低い。ＡＡＶ６可変ループＩＶ領域およびナロー可変ループＶ領域を有するキメラＡＡＶ２／９のインビトロ形質導入レベルは、ＡＡＶ２／６で認められるものより低かったが、ＡＡＶ２／９のものより高かった。
【０１１３】
これらの結果によりナローＩＶおよびナローＶを有するキメラＡＡＶ６の形質導入レベルはＡＡＶ２／９よりわずかに高くそしてＡＡＶ２／６より低いことが示された。
【０１１４】
これらの構築物について大規模製造が行われており、そしてそれらは実施例１に記載の通りマウス肺において評価される。
【実施例３】
【０１１５】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６可変ループＶを有するＡＡＶ６／９キメラ
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域が取り除かれるＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＶのナローフラグメントを挿入した（ＡＡＶ６ループＩＶの不在下で）。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１１６】
キメラキャプシド構築物の１つは、ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６の可変ループＶのナローフラグメントのみを含有する：ＡＡＶ９のアミノ酸１〜４８６、ＡＡＶ６（配列番号：１）のアミノ酸４８７〜５０５およびＡＡＶ９のアミノ酸４８７〜７３６。以下のプライマーをこの構築物に利用する。
【０１１７】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナローのみのキメラ：
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ Ｖナロー
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：２７
5-’TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3’ Ｒ 配列番号：２８
【０１１８】
他のキメラキャプシド構築物は、ＡＡＶ９キャプシドの対応する領域に挿入されたＡＡＶ６の可変ループＶおよび可変ループＩＶの両方のナローフラグメントを含有する。
【０１１９】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナロー（配列番号：１のアミノ酸４８７〜５０５をコードする領域を増幅する）
5’-GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3’ Ｆ 配列番号：２９
5’-CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3’ Ｒ 配列番号：３０
【０１２０】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖナロー−末端
5’-TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3’ Ｆ 配列番号：３１
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：３２
【０１２１】
１つのキメラ構築物、ナロー可変ループＶ領域（ＡＡＶ６のアミノ酸４８７〜５０５）を有するＡＡＶ２／９を小規模力価でそして２９３細胞におけるインビトロ形質導入について試験した。それはＡＡＶ２／６よりわずかに低い力価（〜３ｘ１０１０）、しかしＡＡＶ２／６と同様のインビトロ形質導入を有する。
【実施例４】
【０１２２】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶフラグメントを有するＡＡＶ６／９キメラ
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域が取り除かれるＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＩＶの改変されたナローフラグメントを挿入する。以下のプライマーを利用する。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１２３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ ＩＶブロード
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：３３
5-’GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3’ Ｒ 配列番号：３４
【０１２４】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶブロードＬおよびナローＲ（ＡＡＶ６のアミノ酸４４７〜４６９をコードする領域を増幅する）
5’-AGCCTGGACCGRCTRATGAATCC-3’ Ｆ 配列番号：３５
5’-ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3’ Ｒ 配列番号：３６
【０１２５】
ＡＡＶ９ ＶＬ ＩＶナロー−末端
5’-GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3’ Ｆ 配列番号：３７
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：３８
【０１２６】
ＡＡＶ６可変ループＶの不在下で、ＡＡＶ６可変ループＩＶもしくはそのナローフラグメントのみを含有するキメラ構築物で悪い形質導入結果が認められた。しかしながら、ＶＬ ＩＶ領域のアミノ末端に追加のアミノ酸を含有する別の構築物が作製されている。この構築物はＡＡＶ６アミノ酸４４７〜４６９を含有する。
【０１２７】
本明細書に引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特に好ましい態様に関して記述されているが、本発明の精神から逸脱せずに改変を行えることが理解される。そのような改変は、添付の請求項の範囲内に入るものとする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
［連邦支援の研究もしくは開発に関する記述］
本研究は、国立衛生研究所からの財政支援、Ｐ０１−ＨＬ０５１７４６により一部行われた。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００２】
パルボウイルス科のメンバー、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖線状ＤＮＡゲノムを有する小型非エンベロープ二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、精製されたアデノウイルスストックにおける混入物質として発見されたので、該ウイルスはディペンドウイルス属に割り当てられる。ＡＡＶの生活環には、感染後に、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムに組込まれる潜伏期およびアデノウイルスもしくは単純ヘルペスウイルス感染のいずれかの後に、組込まれたＡＡＶゲノムが次にレスキューされ、複製され、そして感染性ウイルスにパッケージングされる感染期が包含される。非病原性、非分裂細胞を包含する感染性の広範な宿主範囲および組換えの特性は、ＡＡＶを魅力的な送達媒体にする。
【０００３】
ＡＡＶのキャプシドは、Ｔ＝１正二十面体対称で配置される、１：１：１０の予測比における、６０コピー（合計）の３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有する［非特許文献１］。３つのＶＰは同じｍＲＮＡから翻訳され、ＶＰ１はそのＣ末端領域の全ＶＰ２配列に加えてユニークＮ末端ドメインを含有する［非特許文献１、上記に引用］。ＶＰ２は、そのＣ末端のＶＰ３に加えて追加のＮ末端配列を含有する。ＡＡＶ２［非特許文献２］およびＡＡＶ４［非特許文献３］キャプシドのＸ線結晶構造、ならびにパルボウイルスキャプシドについて決定される全ての他の構造において、ＡＡＶキャプシドタンパク質におけるＣ末端ポリペプチド配列（〜５３０アミノ酸）のみが認められる。ＶＰ１のＮ末端ユニーク領域、ＶＰ１−ＶＰ２重複領域およびＶＰ３の最初の１４〜１６のＮ末端残基は不規則である［非特許文献３および非特許文献２、上記に引用］。低温電子顕微鏡検査および画像再構成データは、完全なＡＡＶキャプシドにおいて、ＶＰ１およびＶＰ２タンパク質のＮ末端領域はキャプシドの内部に位置し［非特許文献４；非特許文献２、上記に引用］、そして受容体および抗体結合に利用できない［非特許文献５］ことを示唆する。従って、受容体結合および形質導入表現型は、ＶＰ１〜ＶＰ３の共通のＣ末端ドメイン内のアミノ酸配列により決定されると考えられる［非特許文献１、上記に引用］。ＶＰ１ユニーク領域は、核ターゲッティングのための核局在化配列を含有することに加えて、受容体結合後の核への輸送中のエンドソーム脱出に必要とされる機能性ホスホリパーゼＡ２酵素を保有することが示されている［非特許文献６；非特許文献７］。
【０００４】
長年、異なる配列の６つのＡＡＶのみが当該技術分野において既知であり、大部分は培養下のアデノウイルス調製物の混入物質として単離されている。最近になって、組織から得られる異なる配列の多数のＡＡＶが研究者等により記述されており［非特許文献８；特許文献１］、そしてこれらのＡＡＶは異なる血清型およびクレードに特性化されている［非特許文献９；特許文献２］。異なるＡＡＶは異なるトランスフェクション効率を示し、そしてまた異なる細胞もしくは組織に対する親和性も示すことが報告されている。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）は、マウス肺のコンダクティング（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）気道上皮およびヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養物の両方に効率良く形質導入することができる。非特許文献１０。また、非特許文献１１（ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ
２／３およびＡＡＶ２の様々な偽型を比較する）および非特許文献１２（ＡＡＶ６、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３およびＡＡＶ４からの感染性クローンを比較する）も参照。多数の新規ＡＡＶ配列に基づくベクターの形質導入効率はまた、インビボでマウス気道上皮、そしてインビトロでヒト繊毛気道上皮においても評価されている。［非特許文献１３］。３つのベクターはマウス肺において効率の良い形質導入を示したが、マウスにおいて認められる高い形質導入はベクターの２つのみについてヒト細胞において再現可能であった。
【０００６】
インビボでの罹患気道上皮への治療遺伝子の送達は、嚢胞性線維症（ＣＦ）気道疾患、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患および肺高血圧症を包含する様々な肺疾患の遺伝子治療の有望な選択肢である。［非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６］。しかしながら、現在、安全で且つ有効な治療ベクターは解明されないままである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ−２００３−０１３８７７２−Ａ１（Ｊｕｌｙ ２４，２００３）明細書
【特許文献２】国際特許公開第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈ−Ｊ Ｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，８１（２２）：１２２６０−１２２７１（Ｎｏｖ ２００７）
【非特許文献２】Ｑ．Ｘｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１０４０５−１０４１０（２００２）
【非特許文献３】Ｌ．Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１１５５６−１１５７０
【非特許文献４】Ｅ．Ｐａｄｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７−５０５８（２００５）
【非特許文献５】Ｓ．Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９：５２９６−５３０３（２００５）
【非特許文献６】ＪＣ Ｇｒｉｅｇｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５１９９−５２１０（２００６）
【非特許文献７】Ｆ．，Ｓｏｎｎｔａｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：１１０４０−１１０５４（２００６）
【非特許文献８】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１−６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）
【非特許文献９】Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）
【非特許文献１０】ＣＬ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ６（ＡＡＶ６）Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｌｕｎｇｓ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｔｈａｔ ｏｆ ＡＡＶ２ Ｖｅｃｔｏｒｓ”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（１４）：６６１５−６６２４（Ｊｕｌｙ ２００１）
【非特許文献１１】ＣＬ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７４（３）：１５２４−１５３２（Ｆｅｂ ２０００）
【非特許文献１２】ＥＡ Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７２（１）：３０９−３１９（Ｊａｎ １９９８）
【非特許文献１３】ＭＰ Ｌｉｍｂｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（２）：２９４−３０１（Ｆｅｂ ２００９）
【非特許文献１４】ＭＫ Ａｎｅｊａ ａｎｄ Ｃ Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，８：４３２−４３８（２００６）
【非特許文献１５】ＰＥ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，８：１１９１−１１９８（２００７）
【非特許文献１６】ＴＲ Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，１５：２２９−２４１（２００７）
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、他の非肺細胞よりもむしろ、肺のコンダクティング気道細胞ならびに肺胞上皮細胞を優先的に標的とするようにＡＡＶキャプシドの改変を可能にする単離されたペプチドを提供する。
【００１０】
１つの態様において、本発明はＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶからのキャプシド領域由来の異種コンダクティング気道（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ
ａｉｒｗａｙ ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシドを提供する。１つの態様において、クレードＡキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６およびｈｕ４８Ｒ３から選択される。
【００１１】
別の態様において、本発明は記載の通りの人工キャプシドおよびキャプシドにパッケージングされた発現カセットを有するＡＡＶベクターを提供する。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は定義した通りの人工ＡＡＶキャプシドを含んでなるコンダクティング気道ターゲッティング部分を提供し、ここで、人工ＡＡＶキャプシドは、コンダクティング気道上皮への送達のための分子に連結される。さらに別の態様において、本発明は気道ターゲッティング部分および生理学的に適合する担体を含んでなる製薬学的組成物を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、コンダクティング気道細胞を生来標的としない親ＡＡＶの特異性をそれにコンダクティング気道細胞を標的とする能力を与えるように改変する方法を提供する。別の態様において、本発明は、コンダクティング肺胞上皮細胞を生来標的としない親ＡＡＶの特異性をそれにこれらの細胞を標的とする能力を与えるように改変する方法を提供する。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は人工ＡＡＶキャプシドもしくはそれらを含んでなるＡＡＶベクターを含んでなる培養下の宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の態様において、本発明はＡＡＶベクターおよび生理学的に適合する担体を含んでなる組成物を提供する。
【００１６】
なおさらなる態様において、本発明は非肺細胞よりもむしろコンダクティング気道細胞および肺胞上皮細胞を優先的に標的とする方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の通りのＡＡＶベクターと細胞を接触させることを含む。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、処置を必要とする患者に本発明に記載の通りの人工キャプシドを有するターゲッティング部分もしくはＡＡＶベクターを送達することにより嚢胞性線維症（ＣＦ）気道疾患、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺高血圧症を処置する方法を提供する。
【００１８】
本発明のこのおよび他の利点は、以下の発明の詳細な記述から容易に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、ＶＰ１およびＶＰ２ユニーク領域ならびに９つの推定可変ループドメインを示すＡＡＶキャプシド配列の概略図である。行われた交換は、Ａ〜Ｆで示される。図１Ｂは、図１Ａにおいて同定される領域に関連した、ＰＣＲによる個々のフラグメントの作製の概略図である。図１Ｃは、外側プライマーの存在下で図１Ｂにおいて例示した通り作製したフラグメント間で起こった、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）反応の概略図である。
【図２】図２は、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、８つのβ−バレル鎖および９つの可変ループドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸの位置を例示する、ＡＡＶ６［配列番号：１］およびＡＡＶ９［配列番号：２］キャプシドのアミノ酸配列のアライメントである。
【発明の詳細な記述】
【００２０】
本発明は、コンダクティング気道親和性をこの親和性を生来有さないＡＡＶキャプシドに与える単離されたペプチドを提供する。コンダクティング気道親和性ペプチドは、非肺細胞および組織よりもむしろコンダクティング気道上皮ならびに肺胞上皮への人工ＡＡＶキャプシドのターゲッティングを可能にする。本明細書に記述される構築物は罹患細胞のより特異的なターゲッティングを可能にしそして非標的、非肺細胞および組織の形質導入を最小限に抑えるかもしくはなくすので、これは治療および安全性の両方の点から望ましい。
【００２１】
１つの態様において、本発明は異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドを含んでなる人工アデノ随伴ウイルスキャプシドを提供する。このペプチドは、可変ループ領域ＩＶおよび可変ループ領域Ｖを含むＡＡＶキャプシド領域由来である。図２において容易に分かるように、可変ループ領域は相互に直接隣接せず、それらの間に他のＡＡＶキャプシド配列を有する。本発明によれば、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、可変ループ領域ＩＶのアミノ末端に位置するが可変ループ領域ＩＩＩを含まない機能性クレードＡ−ＡＡＶからのアミノ酸のいくつかをさらに含むことができる。機能性クレードＡ−ＡＡＶのこの領域には約５７個のアミノ酸が存在するが、ターゲッティングペプチドは、可変ループＩＶのアミノ末端上に０、１〜５個のアミノ酸、もしくはいくつかの他のフラグメントを含有することができる。さらに、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に位置するが可変ループ領域ＶＩの任意のアミノ酸を含まない機能性クレードＡ−ＡＡＶからのアミノ酸のいくつかをさらに含むことができる。機能性クレードＡ−ＡＡＶのループＶおよびＶＩの間のこの領域には約１３個のアミノ酸が存在するが、ペプチドはこの領域の０、１〜５個、もしくはいくつかの他のフラグメントを含有することができる。
【００２２】
１つの態様において、機能性クレードＡ ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３［ＷＯ ２００６／１１０６８９］から選択され、これらの全てはこの領域において同一のアミノ酸配列を共有する。人工ＡＡＶキャプシドは、親ＡＡＶにおいてこの領域に隣接するアミノ酸配列に非相同であるＡＡＶ可変ループＩＶおよび／もしくは可変ループＶ領域のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端上のアミノ酸残基が隣接するこのペプチドを含有する。
【００２３】
１つの態様において、コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドは、機能性クレードＡ ＡＡＶ以外であるＡＡＶキャプシドの対応する可変ループ領域に設計される。結果は、親（供給源）ＡＡＶの親和性と異なるコンダクティング気道（および場合により肺胞上皮）に対する親和性および／もしくは形質導入効率を有する人工キャプシドであ
る。そのような人工キャプシドは、様々な技術により作製することができる。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「親ＡＡＶキャプシド」は、本明細書に記載の通りの異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドにより改変されるその天然の親和性を有するキャプシドをさす。１つの態様において、クレードＡのメンバーの多くはある程度のコンダクティング気道親和性を示しているので、親ＡＡＶキャプシド配列の供給源はこのクレード以外のＡＡＶである。機能性クレードＡ ＡＡＶには、ＡＡＶ６、ＡＡＶ１、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３が包含される。他のクレードＡ ＡＡＶには、とりわけ、ｈｕ．４４、ｈｕ．４６、ｈｕ．４３およびｈｕ．４８が包含される［ＷＯ ２００５／０３３３２１およびＷＯ ２００６／１１０６８９］。
【００２５】
他のＡＡＶクレードには、クレードＢ（ＡＡＶ２によって代表される）、クレードＣ（ＡＡＶ２−ＡＡＶ３ハイブリッドによって代表される）、クレードＤ（ＡＡＶ７によって代表される）、クレードＥ（ＡＡＶ８によって代表される）およびクレードＦ（ヒトＡＡＶ９によって代表される）が包含される。前述のＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ならびにｒｈ３２／３３およびｒｈ３４は明らかに相互に異なるが、本明細書に記述されるスクリーニングにおいて検出されず、そしてこれらのクレードのいずれにも含まれていない。ＡＡＶクレードのさらなる説明は、Ｇ．Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（１２）：６３８１−６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）および国際特許公開第ＷＯ ２００４／０２８８１７号および第ＷＯ ２００５／０３３３２１号に提供される。後者の文書はまた新規のヒトＡＡＶ配列も提供し、それらは本明細書に引用することにより組み込まれる。
【００２６】
しかしながら、別の態様において、親キャプシド配列は、任意の治療もしくは他の製品のベクターもしくは担体として用いられるＡＡＶの送達を妨げるようなレベルでコンダクティング気道細胞に生来形質導入するＡＡＶからである。
【００２７】
１つの態様において、コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、機能性クレードＡアデノ随伴ウイルスの可変ループ領域ＩＶおよび可変ループ領域Ｖを包含する領域由来である。１つの態様において、機能性クレードＡ−ＡＡＶはＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択される。１つの態様においてそしてＡＡＶ６キャプシド、配列番号：１の番号付けを参照して、このペプチドは配列番号：１のＡＡＶ６キャプシドの約アミノ酸４４７〜約アミノ酸５２１に対応する。従って、１つの態様において、このターゲッティングペプチドはアミノ酸配列：配列番号：４：ＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧを有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は当該技術分野において既知である方法を用いて配列を整列することにより、そして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００２８】
別の態様において、コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、上記ペプチドのアミノおよび／もしくはカルボキシ末端から欠失させた約１〜約８個の残基を有する。さらに別の態様において、気道コンダクティング細胞ターゲッティングペプチドはこの領域内の機能性フラグメント、すなわち、所望のターゲッティングを与えるこの領域の内部フラグメントである。そのようなフラグメントは、少なくとも約６５アミノ酸の長さ、少なくとも約５０アミノ酸の長さ、少なくとも約４５アミノ酸の長さであるかもしくはより短い可能性がある。好適には、そのようなフラグメントはＡＡＶ６キャプシド（配列番号：１）の番号付けを参照して、アミノ酸４４７〜４６９、アミノ酸４４７〜４７２、アミノ酸４５１〜４６９、アミノ酸４５１〜４７４からの可変ループＩＶ範囲由来である。１つの態様において、これらのフラグメントは、クレードＡ ＡＡＶからの可変ループＶ配
列に連結される。例えば、可変ループＶはクレードＡ ＡＡＶのアミノ酸４８７〜５２１もしくは４８９〜５３２に及ぶことができ、または所望のターゲッティングを与えるそのフラグメントであることができる（例えば、４８７〜５０６；４８７〜５１０；４８９〜５０６、４８７〜５１０）。１つの態様において、可変ループＩＶ〜Ｖ、すなわち、アミノ酸４４７〜５１０の領域範囲はコンダクティング気道コンダクティングペプチドとして用いられる。別の態様において、可変ループＩＶおよびＶ内のフラグメントは、連結するＡＡＶ６アミノ酸配列なしに、キメラ構築物において提供される。１つの態様において、キメラ構築物は他のＡＡＶ６キャプシド配列の不在下で（例えば、可変ループＩＶ配列の不在下で）ＡＡＶもしくは別のクレードＡ ＡＡＶの可変ループ領域Ｖを含有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は、配列を整列することによりそして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００２９】
さらに別の態様において、キメラキャプシドは、クレードＡ ＡＡＶ（例えばＡＡＶ６）の他の可変ループ領域の不在下で、キメラキャプシドにおいて、ＡＡＶ６の可変ループ領域５もしくは本明細書に記述されるようなそのフラグメントを含有する。なおさらなる態様において、キメラキャプシドはＡＡＶ６の可変ループ領域ＩＶおよびＶの両方の少なくともフラグメントを含有する。ＡＡＶ６アミノ酸位置に関して本明細書に提供される情報に基づいて、当業者は、配列を整列することによりそして／もしくはキャプシドの結晶構造により、他のクレードＡ ＡＡＶキャプシド配列の対応する配列を容易に決定することができる。
【００３０】
１つの態様において、気道コンダクティング気道ターゲッティングペプチドは、親ＡＡＶのキャプシドタンパク質における対応する領域に挿入することができる。本明細書に提供される情報を考慮して、当業者は別のＡＡＶ（例えば、クレードＡ ＡＡＶ以外）の対応する可変領域を容易に特定することができる。本明細書における可変領域は、Ｈ−Ｊ Ｎａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，８１（２２）：１２２６０−１２２７１（Ｎｏｖ ２００７）に提供されるＡＡＶ８に関する構造情報と一致する。本明細書における図１〜２は、概略図およびＡＡＶ６キャプシドを含む典型的なアライメントを提供する。さらに他のキャプシドタンパク質アライメントは記述されているか［例えば、ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１およびＷＯ ２００５／０３３３２１を参照］もしくは作成することができる。
【００３１】
典型的に、アライメントがＡＡＶキャプシドｖｐ１タンパク質に基づいて作成される場合、アライメントは参照ＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ６）に対してそのように同定される挿入および欠失を含有し、そしてアミノ酸残基の番号付けはアライメントに提供される参照スケールに基づく。しかしながら、任意の既定のＡＡＶ配列は、参照スケールより少ないアミノ酸残基を有し得る。本発明において、親ＡＡＶおよび参照ライブラリーの配列を説明する場合、「同じ位置」もしくは「対応する位置」という用語は、整列配列の参照スケールに関して、配列の各々における同じ残基番号に位置するアミノ酸をさす。しかしながら、アライメントから外される場合、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質の各々は異なる残基番号に位置するこれらのアミノ酸を有し得る。
【００３２】
アライメントは、様々な公的にもしくは商業的に入手可能な多配列アライメントプログラムのいずれかを用いて行われる。配列アライメントプログラムはアミノ酸配列に使用可能である、例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」および「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラム。当業者は必要に応じてこれらの設定を改変することができるが、一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で用いられる。あるいはまた、当業者は、参照アルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを
少なくとも提供する別のアルゴリズムもしくはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照。
【００３３】
また、上記のプログラムに含有されるものを包含する、ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いることができる当該技術分野において既知である多数のアルゴリズムも存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列はＧＣＧバージョン６．１におけるプログラム、Ｆａｓｔａを用いて比較することができる。Ｆａｓｔａは、クエリーおよび検索配列間の最良重複の領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、引用することにより本明細書に組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（６のワードサイズおよびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター（ｆａｃｔｏｒ））でＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。同様に、アミノ酸アライメントを行うためにプログラムが利用可能である。当業者は、必要に応じてこれらの設定を改変することができるが、一般に、これらのプログラムはデフォルト設定で用いられる。あるいはまた、当業者は、参照アルゴリズムおよびプログラムにより提供されるもののような同一性もしくはアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズムもしくはコンピュータープログラムを利用することができる。
【００３４】
上記の通り、気道コンダクティングペプチド配列は、異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域の天然の位置に存在することができる。これは、例えば本明細書の実施例において例示されるかもしくは当該技術分野において既知であるもののような技術を用いて所望の領域を交換することを包含する当業者に既知である様々な技術によって成し遂げることができる。以下の実施例において説明する通り、これは典型的に異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域を除くことを含む。しかしながら、例えば、改変されるアミノ酸のコドンに対する通常の部位特異的突然変異誘発技術を包含する他の適当な技術を用いることができる。典型的に、部位特異的突然変異誘発は、保存アミノ酸残基に所望のコドンを得るために必要とされる程度の少ない工程を用いて行われる。そのような方法は当業者に周知であり、そして公開された方法および／もしくは市販されているキット［例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅおよびＰｒｏｍｅｇａから入手可能］を用いて行うことができる。部位特異的突然変異誘発は、ＡＡＶゲノム配列に対して行うことができる。ＡＡＶ配列は、便宜上、ベクター（例えばプラスミドバックボーン）により保有され得る。あるいはまた、当業者は当業者に既知である他の技術、例えば化学的に合成されたペプチドを挿入することなどを用いて親ＡＡＶを改変することができる。
【００３５】
１つの態様において、可変ループ領域は機能的に欠失している。場合により、任意のスペーサーが気道コンダクティングターゲッティングペプチド可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する。ある種の態様において、スペーサーは天然に存在しない、すなわち、合成的にもしくは人工的に設計されるかもしくは製造されるポリペプチドであるという意味において非天然である外来アミノ酸配列である。これらのスペーサーは、クレードＡキャプシド以外の供給源もしくはＡＡＶ以外の供給源由来である１〜５個のアミノ酸を含んでなることができる。１つの態様において、機能的欠失は選択した可変ループにおいて行われ、そしてそこに分子は挿入されない。これは様々な理由で、例えばキャプシドにおける他の部分に大きいインサートを入れるために所望され得る。そのような機能的に欠失したＡＡＶは、ＡＡＶビリオンを製造するためにならびに他の用途に利用することができる。
【００３６】
本発明の構築物によって、ＡＡＶもしくはＡＡＶキャプシドの天然の親和性は改変され
る。従って、「改変された親和性」により、改変されたＡＡＶキャプシドもしくはＡＡＶベクターは、改変されるか、もしくはそれが由来する野生型ウイルスのものと異なる標的細胞結合特異性を示すことが意図される。従って、１つの態様において、本発明は、本明細書に記載の通りの異種コンダクティング気道細胞ターゲッティングペプチドを提供することにより、選択したＡＡＶベクターの特異性をそれがコンダクティング気道細胞を標的とするように改変する方法を提供する。別の態様において、ターゲッティングペプチドは肺胞上皮を標的とする能力をさらに与える。
【００３７】
１つの態様において、キャプシド配列は単一のＡＡＶ供給源により提供される。適当なＡＡＶは、例えば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ３２．２２を包含する、通常はいかなる効率でもコンダクティング気道細胞に形質導入しないＡＡＶの中から選択することができる。さらに他のＡＡＶは、記述されているもの［ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１；ＷＯ ２００５／０３３３２１；ＷＯ ２００６／１１０６８９］および特に、クレードＡ以外であるＡＡＶの中から容易に選択することができる。あるいはまた、ＡＡＶキャプシドは１つより多くのＡＡＶ由来であることができる。
【００３８】
１つの態様において、選択したＡＡＶキャプシドはヘアピン結合モチーフを欠く。ＡＡＶは生来ヘアピン結合モチーフを欠くことができ、もしくはヘアピン結合モチーフはＷＯ
２００８／０２７０８４に記載のもののような方法を用いて取り除くことができる。例えば、人工キャプシドタンパク質もしくは人工キャプシドタンパク質を有するＡＡＶベクターの生産、収量および／もしくは回収を高めるために、野生型ＡＡＶ配列へのさらに他の改変を行うことができる。
【００３９】
「機能性の」という用語は、必ずしも天然産物と同じレベルでではないが、その天然の機能を果たす産物（例えば、タンパク質もしくはペプチド）をさす。「機能性の」という用語はまた、産物をコードしそしてそれから所望の産物を発現することができる遺伝子をさすこともできる。「機能的欠失」は、その天然の機能を果たす産物の能力を損なう欠失をさす。
【００４０】
他に特定されない限り（上記の通り）、フラグメントという用語には少なくとも８アミノ酸の長さ、少なくとも１５アミノ酸の長さ、少なくとも２５アミノ酸の長さのペプチドが包含される。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントを所望の状況により容易に利用することができる。そのようなフラグメントは、組換えでもしくは他の適当な手段により、例えば化学合成により製造することができる。
【００４１】
「同一性パーセント（％）」という用語は、タンパク質の全長もしくはそのフラグメントにわたって、アミノ酸配列に関して容易に決定することができる。好適には、フラグメントは少なくとも約８アミノ酸の長さであり、そして約７００アミノ酸までであることができる。一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」をさす場合、「同一性」、「相同性」もしくは「類似性」は「整列」配列に関して決定される。「整列」配列もしくは「アライメント」は、参照配列と比較した場合に欠いているかもしくは追加の塩基もしくはアミノ酸の補正を含むことが多い、多数の核酸配列もしくはタンパク質（アミノ酸）配列をさす。
【００４２】
本明細書および請求項を通して用いる場合、「含んでなる」および「含有する」という用語ならびに他のバリアントの中でも「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」を包含するそのバリアントは、他の成分、要素、整数、工程などを含む。「からなる」もしくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、他の成分、要素、整数、工程などを含まない。
【００４３】
肺／コンダクティング気道ターゲッティング部分
１つの態様において、本発明は「空キャプシド」、すなわち、その中にパッケージングされた機能性配列を含有しないキャプシドである人工ＡＡＶキャプシドを提供する。言い換えれば、キャプシドはＡＡＶウイルスゲノムを欠きそして／もしくは発現カセットを含有しない。１つの態様において、人工ＡＡＶキャプシドはその中にパッケージングされた機能性ＡＡＶ配列を有さない。別の態様において、ＡＡＶは機能性ＡＡＶ遺伝子コーディング配列および内在性もしくは異種発現カセットを含有しない。
【００４４】
「空」ＡＡＶキャプシドは、異種分子のためのターゲッティングタンパク質として用いることができる。所望の治療もしくは免疫原性もしくは他の分子は、「リンカー」配列によって本発明の人工ＡＡＶキャプシドと結合することができる。
【００４５】
１つの態様において、ＡＡＶキャプシドと分子間の化学架橋は共有結合もしくは非共有結合によってである。しかしながら、当該技術分野において既知であるように、他の親和性結合対を利用することができる。当業者に既知である他の連結の中で、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マレイミドもしくはスクシンイミドエステルベースの架橋剤もしくはＳＡＴＡ−ＳＭＣＣ二官能性架橋剤が包含されるがこれらに限定されるものではない、当該技術分野において既知であるさらに他の共役化学が考えられそして本明細書の態様において用いることができる。さらなる態様において、興味のある分子は、Ｄｅｓｔｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２００７ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１４（１０）：１１５２−１１６２（２００７）およびＯｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２００６；１７：７２１−７２７（２００６）に記載の通り、ＰＥＧリンカー（「スペーサー」）により空ＡＡＶキャプシドに連結することができる。
【００４６】
別の態様において、興味のある分子は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ；１５：８０７−８１３（２００４）に記載の通り、マレイミドおよびハロアセトアミド試薬を使用してＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルもしくはスルフヒドリル基を用いてＡＡＶ表面リシン残基の化学修飾によって結合される。さらに別の態様において、表面カルボキシレート基は特異的結合用に改変される。
【００４７】
別の態様において、興味のある分子は免疫グロブリン分子のＡＡＶ結合ドメインによってＡＡＶキャプシドに連結することができる。さらなる態様において、結合ドメインは免疫グロブリン分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２もしくはＦｖフラグメントであることができる。結合ドメインは、上記のものを包含する任意の既知の手段により興味のある分子に連結することができる。１つの態様において、ＰＥＧリンカーは結合ドメインと興味のある分子の間に導入される。
【００４８】
リンカー配列への結合を介した、ＤＮＡもしくはアミノ酸配列の導入のためのそのような構築技術は当該技術分野において既知であり、そしてタンパク質／遺伝子工学者の通常の技量の範囲内である。
【００４９】
ＡＡＶキャプシドに連結しそして標的細胞に送達するための有用な分子には、例えば、嚢胞性線維症、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺高血圧症、喘息、肺癌のような症状を処置するために有用であるものを包含することができる。適当な分子の例には、遺伝子産物を発現する核酸を保有する非ウイルスベースのベクター（例えば、プラスミド、「裸のＤＮＡ」、コスミドなど）を包含することができる。適当な遺伝子産物の例には、発現カセットと関連して以下に記述するものが包含される。さらに、例えば、ステロイド、ステロイド誘導体、免疫調節分子、酵素、タンパク質、小分子および他の化学部分を包含する、他の非核酸ベースの分子をこの態様において
用いることができる。
【００５０】
別の態様において、異種コンダクティング気道細胞ターゲッティング配列を含有する人工ＡＡＶキャプシドは、標的化細胞に産物を送達する発現カセットをその中にパッケージングしているベクターの製造において用いられる。
【００５１】
コンダクティング気道ターゲッティングドメインを含有する人工ＡＡＶキャプシドを有するＡＡＶベクター
１つの態様において、本発明は本発明の新規ＡＡＶキャプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作製する方法を提供する。そのような方法は、本明細書に定義した通りの本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質もしくはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最小で、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット；ならびにＡＡＶキャプシドタンパク質への発現カセットのパッケージングを可能にするための十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。
【００５２】
ＡＡＶキャプシドにＡＡＶ発現カセットをパッケージングするために宿主細胞において培養される必要がある成分は、トランスに宿主細胞に提供することができる。あるいはまた、必要とされる成分（例えば、発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／もしくはヘルパー機能）の１つもしくはそれ以上は、当業者に既知である方法を用いて必要とされる成分の１つもしくはそれ以上を含有するように設計されている安定な宿主細胞により提供することができる。最も好適には、そのような安定な宿主細胞は誘導性プロモーターの制御下で必要とされる成分（１つもしくは複数）を含有する。しかしながら、必要とされる成分（１つもしくは複数）は構成的プロモーターの制御下であることができる。適当な誘導性および構成的プロモーターの例は、導入遺伝子との使用に適当な調節要素の説明において、本明細書に提供される。さらに別の代替物において、選択した安定な宿主細胞は構成的プロモーターの制御下の選択した成分（１つもしくは複数）および１つもしくはそれ以上の誘導性プロモーターの制御下の他の選択した成分（１つもしくは複数）を含有することができる。例えば、２９３細胞（これは構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるが、誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐおよび／もしくはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を作製することができる。さらに他の安定な宿主細胞は、当業者により作製されることができる。
【００５３】
発現カセット、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および本発明のｒＡＡＶを製造するために必要とされるヘルパー機能は、その上に保有する配列を導入する任意の遺伝要素の形態においてパッケージング宿主細胞に送達することができる。選択した遺伝要素は、本明細書に記述されるものを包含する任意の適当な方法により送達することができる。本発明の任意の態様を構築するために使用する方法は、核酸操作における技量を有する者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学および合成技術が包含される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は本発明への制約ではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照。
【００５４】
他に特定されない限り、ＡＡＶ ＩＴＲおよび本明細書に記述される他の選択したＡＡＶ成分は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９もしくは別のＡＡＶ配列［例えば、ＷＯ ０３／０４２３９７ Ａ１；ＷＯ ２００５／０３３３２１；ＷＯ ２００６／１１０６８９］を包含するがこれらに限定されるものではない、任意のＡＡＶの中から容易に選択する
ことができる。これらのＩＴＲもしくは他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶ配列から当業者に利用可能な技術を用いて容易に単離することができる。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的もしくは公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離されるかもしくは得ることができる。あるいはまた、ＡＡＶ配列は、文献においてもしくは例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのようなデータベースにおいて入手可能であるような公開された配列を参照して合成もしくは他の適当な手段によって得ることができる。
【００５５】
Ａ．発現カセット
発現カセットは、最小で、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列、導入遺伝子およびその調節配列からなる。１つの態様において、５’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲの両方が発現カセットに含まれる。１つの望ましい態様において、発現カセットは、ＡＡＶキャプシド配列を提供したもの以外のＡＡＶ配列からのＩＴＲを含有する。例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含有する偽型ベクターを便宜上使用することができる。しかしながら、他の適当な供給源からのＩＴＲを選択することができる。キャプシドタンパク質にパッケージングされそして選択した宿主細胞に送達されるのはこの発現カセットである。
【００５６】
１．導入遺伝子
導入遺伝子は、興味のあるポリペプチド、ペプチド、タンパク質、酵素もしくは他の産物をコードする、導入遺伝子に隣接するベクター配列に非相同である核酸配列である。１つの態様において、発現カセットは核酸配列、例えばＲＮＡを保有する。望ましいＲＮＡ分子には、ｔＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボソームＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、トランス−スプライシングＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡが包含される。有用なＲＮＡ配列の１例は、処置した動物において標的化核酸配列の発現を抑制するかもしくは失わせる配列である。典型的に、適当な標的配列には腫瘍標的およびウイルス疾患が包含される。これは、例えば癌治療およびワクチンに有用であり得る。
【００５７】
核酸コーディング配列は、宿主細胞における導入遺伝子転写、翻訳および／もしくは発現を可能にするように調節成分に操作可能に連結される。
【００５８】
本発明の構築物を用いて任意の様々な産物を送達することができるが、本発明はコンダクティング気道細胞と関連する症状の診断、処置およびワクチン接種、ならびにその症候の改善において有用な産物の送達に特に適している。そのような症状には、嚢胞性線維症、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）欠乏症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）および肺高血圧症が包含されるがこれらに限定されるものではない。適当な遺伝子産物には、機能性嚢疱性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、α−１−抗トリプシン、分泌型白血球プロテアーゼ阻害剤、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）、ならびに免疫賦活剤、例えば、インターロイキン１２のような例えばインターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−βのようなインターフェロン、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を包含することができる。他の遺伝子産物には、とりわけ、例えばｐ５３、ＦＵＳ１を包含する癌治療法、ＲＮＡｉを包含するＲＮＡを包含することができる。さらに他の適当な発現産物は、当業者により容易に選択されることができる。
【００５９】
２．調節要素
発現カセットについて上記に同定した主要要素に加えて、ベクターにはまた、プラスミドベクターでトランスフェクションしたもしくは本発明により製造されるウイルスに感染した細胞におけるその転写、翻訳および／もしくは発現を可能にするように導入遺伝子に操作可能に連結される通常の制御要素も含まれる。本明細書において用いる場合、「操作
可能に連結された」配列には、興味のある遺伝子と隣接する発現制御配列および興味のある遺伝子を制御するためにトランスにもしくは離れて作用する発現制御配列の両方が包含される。
【００６０】
発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率の良いＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；ならびに必要に応じて、コードされる産物の分泌を高める配列が包含される。天然の、構成的、誘導性および／もしくは組織特異的であるプロモーターを包含する多数の発現制御配列が当該技術分野において既知であり、そして利用することができる。
【００６１】
構成的プロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１プロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が包含されるがこれらに限定されるものではない。誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、そして外から供給される化合物、温度のような環境因子、もしくは特定の生理状態、例えば急性期、細胞の特定の分化状態の存在により、または複製細胞においてのみ調節することができる。誘導性プロモーターおよび誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを包含するがこれらに限定されるものではない、様々な商業的供給源から入手可能である。多数の他の系は記述されており、そして当業者により容易に選択されることができる。外から供給される化合物により調節される誘導性プロモーターの例には、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系［国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８号］；エクジソン昆虫プロモーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、また、Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）も参照］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］およびラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］が包含される。これに関連して有用であり得る誘導性プロモーターの他のタイプは、特定の生理状態、例えば温度、急性期、細胞の特定の分化状態により、もしくは複製細胞においてのみ調節されるものである。
【００６２】
別の態様において、導入遺伝子の天然のプロモーターが用いられる。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣することが所望される場合に好ましい可能性がある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が時間的にもしくは発生的に、または組織特異的に、または特定の転写刺激に応答して調節されなければならない場合に用いることができる。さらなる態様において、他の天然の発現制御要素、例えばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位もしくはコザック共通配列もまた天然の発現を模倣するために用いることができる。
【００６３】
導入遺伝子の別の態様には、組織特異的プロモーターに操作可能に連結された遺伝子が包含される。例えば、肺組織に特異的なそして利用可能な場合、コンダクティング気道細胞に特異的なプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターの例には、とりわけ、例えば、フォークヘッドボックスＪ１（ＦＯＸＪ１）プロモーター、ポリユビキチンプロモーターＵｂＣ、ＳＡＭポイント（ｐｏｉｎｔｅｄ）ドメイン含有ＥＴＳ転写因子（ＳＰＤＥＦ）プロモーター、クララ細胞分泌タンパク質／ウテログロビン（ＣＣＳＰ／ＵＧ）プロモーターを包含することができる。他の肺特異的遺伝子プロモーターには、とりわけ、例えばサーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰＢ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）およびサーファクタントタンパク質Ａ（ＳＰＡ）、外生ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、甲状腺転写因子１（ＴＴＦ１）ならびにヒトサーファクタントタンパク質Ａ１（ｈＳＰＡ１）を包含することができる。
【００６４】
場合により、治療的に有用な導入遺伝子を保有するプラスミドはまた、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含する選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子を含むこともできる。そのような選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子（好ましくは、本発明の方法によりレスキューされるウイルスゲノムの外側に位置する）は、細菌細胞におけるプラスミドの存在を示すために用いることができる、例えばアンピシリン耐性。プラスミドの他の成分には、複製起点を包含することができる。これらのおよび他のプロモーターおよびベクター要素の選択は慣例的であり、そして多数のそのような配列が利用可能である。
【００６５】
導入遺伝子、プロモーター／エンハンサーおよびＡＡＶ ＩＴＲの組み合わせは、本明細書において参照しやすいように発現カセットと呼ばれる。本明細書における教示が提供されていると、そのような発現カセットの設計は通常の技術を用いることにより行うことができる。
【００６６】
３．パッケージング宿主細胞への発現カセットの送達
発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の適当なベクター、例えばプラスミド上に保有することができる。本発明において有用なプラスミドは、それらが原核細胞、哺乳類細胞もしくは両方における複製および場合により組込みに適当であるように設計することができる。これらのプラスミド（もしくは５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＡＡＶ ＩＴＲを保有する他のベクター）は、真核生物および／もしくは原核生物における発現カセットの複製を可能にする配列ならびにこれらの系の選択マーカーを含有する。選択可能なマーカーもしくはレポーター遺伝子には、とりわけ、ジェネティシン、ハイグロマイシンもしくはピューロマイシン（ｐｕｒｉｍｙｃｉｎ）耐性をコードする配列を包含することができる。プラスミドはまた、アンピシリン耐性のような、細菌細胞におけるベクターの存在を示すために用いることができるある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子を含有することもできる。プラスミドの他の成分には、複製起点およびアンプリコン、例えばエプスタイン・バーウイルス核抗原を用いるアンプリコン系を包含することができる。このアンプリコン系もしくは他の同様のアンプリコン成分は、細胞における高コピーエピソーム複製を可能にする。好ましくは、発現カセットを保有する分子は細胞にトランスフェクションされ、そこでそれは一時的に存在し得る。あるいはまた、発現カセット（５’ＡＡＶ ＩＴＲ−異種分子−３’ＩＴＲを保有する）は、染色体にもしくはエピソームとしてのいずれかで、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれることができる。ある種の態様において、発現カセットは、場合により頭−頭、頭−尾もしくは尾−尾コンカテマーにおいて、多コピーで存在することができる。適当なトランスフェクション技術は既知であり、そして宿主細胞に発現カセットを送達するために容易に利用することができる。
【００６７】
一般に、トランスフェクションにより発現カセットを含んでなるベクターを送達する場合、ベクターは約１ｘ１０４の細胞〜約１ｘ１０１３の細胞、もしくは約１ｘ１０５の細胞に約５μｇ〜約１００μｇのＤＮＡ、約１０μｇ〜約５０μｇのＤＮＡの量において送達される。しかしながら、宿主細胞に対するベクターＤＮＡの相対量は、選択したベクター、送達方法および選択した宿主細胞のような因子を考慮に入れることができる当業者により調整されることができる。
【００６８】
Ｂ．ＲｅｐおよびＣａｐ配列
発現カセットに加えて、宿主細胞は宿主細胞において本発明の新規ＡＡＶキャプシドタンパク質（もしくはそのフラグメントを含んでなるキャプシドタンパク質）の発現を導く配列および発現カセットに存在するＡＡＶ ＩＴＲの供給源と同じ供給源もしくは交差相補供給源のｒｅｐ配列を含有する。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ配列は、上記の通りのＡＡＶ供給源から独立して得ることができ、そして上記の通りの当業者に既知である任意の方法において宿主細胞に導入することができる。さらに、ＡＡＶベクターをシュードタイピングする場合、必須のｒｅｐタンパク質の各々をコードする配列は異なるＡＡＶ供給源（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、または本明細書に記述されるかもしくは当該技術分野において既知である他のＡＡＶ配列の１つ）により供給されることができる。例えば、ｒｅｐ７８／６８配列はＡＡＶ２からであることができ、一方、ｒｅｐ５２／４０配列はＡＡＶ８からであることができる。
【００６９】
１つの態様において、宿主細胞は上記のもののような適当なプロモーターの制御下のキャプシドタンパク質を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、キャプシドタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様において、キャプシドタンパク質はトランスに宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達する場合、キャプシドタンパク質は、宿主細胞において選択したキャプシドタンパク質の発現を導くために必要な配列を含有するプラスミドによって送達することができる。最も望ましくは、トランスに宿主細胞に送達する場合、キャプシドタンパク質を保有するプラスミドはまた、ｒＡＡＶをパッケージングするために必要とされる他の配列、例えばｒｅｐ配列も保有する。
【００７０】
別の態様において、宿主細胞は上記のもののような適当なプロモーターの制御下のｒｅｐ配列を安定に含有する。最も望ましくは、この態様において、必須のｒｅｐタンパク質は誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の態様において、ｒｅｐタンパク質はトランスに宿主細胞に供給される。トランスに宿主細胞に送達する場合、ｒｅｐタンパク質は、宿主細胞において選択したｒｅｐタンパク質の発現を導くために必要な配列を含有するプラスミドによって送達することができる。
【００７１】
従って、１つの態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は単一の核酸分子上で宿主細胞にトランスフェクションすることができ、そしてエピソームとして細胞において安定に存在する。別の態様において、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は細胞の染色体に安定に組込まれる。別の態様は、宿主細胞において一過性発現されるｒｅｐおよびｃａｐ配列を有する。例えば、そのようなトランスフェクションのための有用な核酸分子は、５’から３’に、プロモーター、プロモーターとｒｅｐ遺伝子配列の開始部位との間に置かれる任意のスペーサー、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子配列およびＡＡＶ ｃａｐ遺伝子配列を含んでなる。
【００７２】
場合により、ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ配列は、宿主細胞に導入される他のＤＮＡ配列を含有するベクター上で供給されることができる。例えば、ベクターは、発現カセットを含んでなるｒＡＡＶ構築物を含有することができる。ベクターは、ヘルパー機能、例えば、アデノウイルスタンパク質Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ４ ＯＲＦ６をコードする遺伝子、ならびにＶＡＩ ＲＮＡの遺伝子の１つもしくはそれ以上を含んでなることができる。
【００７３】
好ましくは、この構築物において使用するプロモーターは、当業者に既知であるかもしくは上記に説明した通りの構成的、誘導性もしくは天然のプロモーターのいずれかであることができる。１つの態様において、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター配列が用いられる。これらの配列のいずれかを提供するためのＡＡＶの選択は、本発明を限定しない。
【００７４】
別の好ましい態様において、ｒｅｐのプロモーターは導入遺伝子調節要素に関連して上記で説明するような誘導性プロモーターである。ｒｅｐ発現のための１つの好ましいプロモーターはＴ７プロモーターである。Ｔ７プロモーターにより調節されるｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含んでなるベクターは、Ｔ７ポリメラーゼを構成的もしくは誘導的のいずれかで発現する細胞にトランスフェクションされるかもしくは形質転換される。１９９８年３月１２日に公開された国際特許公開第ＷＯ ９８／１００８８を参照。
【００７５】
スペーサーは、ベクターの設計における任意の要素である。スペーサーは、プロモーターとｒｅｐ遺伝子ＡＴＧ開始部位との間に置かれるＤＮＡ配列である。スペーサーは任意の所望の設計を有することができ；すなわち、それはヌクレオチドのランダムな配列であることができ、あるいはまた、それはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができる。スペーサーは、典型的に開始／終結およびポリＡ部位を含む遺伝子を含有することができる。スペーサーは、原核生物もしくは真核生物からの非コーディングＤＮＡ配列、反復非コーディング配列、転写制御のないコーディング配列または転写制御を有するコーディング配列であることができる。スペーサー配列の２つの典型的な供給源はλファージラダー配列もしくは酵母ラダー配列であり、これらはとりわけ例えばＧｉｂｃｏもしくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。スペーサーは、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０およびｃａｐ遺伝子産物を通常レベルで発現したままで、ｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８遺伝子産物の発現を減らすために十分な任意のサイズのものであることができる。従って、スペーサーの長さは約１０ｂｐ〜約１０．０ｋｂｐ、好ましくは約１００ｂｐ〜約８．０ｋｂｐの範囲においてであることができる。組換えの可能性を減らすために、スペーサーは好ましくは２ｋｂｐ未満の長さであり；しかしながら、本発明はそのように限定されない。
【００７６】
ｒｅｐおよびｃａｐを提供する分子（１つもしくは複数）は一時的に（すなわち、トランスフェクションによって）宿主細胞に存在することができるが、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の一方もしくは両方ならびにそれらの発現を制御するプロモーター（１つもしくは複数）は、例えばエピソームとしてもしくは宿主細胞の染色体への組込みにより、宿主細胞において安定に発現されることが好ましい。本発明の態様を構築するために用いる方法は、上記の参考文献に記述されるもののような通常の遺伝子工学もしくは組換え工学技術である。本明細書は、本明細書に提供される情報を用いて、特定の構築物の説明に役立つ実例を提供するが、当業者は、スペーサー、Ｐ５プロモーター、ならびに少なくとも１つの翻訳開始および終結シグナル、ならびにポリアデニル化部位の任意の付加を包含する他の要素の選択を用いて、他の適当な構築物を選択しそして設計することができる。
【００７７】
本発明の別の態様において、ｒｅｐもしくはｃａｐタンパク質は宿主細胞により安定に提供することができる。
【００７８】
Ｃ．ヘルパー機能
パッケージング宿主細胞はまた、本発明のｒＡＡＶをパッケージングするためにヘルパー機能も必要とする。場合により、これらの機能はヘルペスウイルスにより供給されることができる。最も望ましくは、必要なヘルパー機能は上記のもののようなヒトもしくは非ヒト霊長類アデノウイルス供給源から各々提供され、そして／もしくはＡｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，
ＶＡ（ＵＳ）を包含する様々な供給源から入手可能である。１つの現在好ましい態様において、宿主細胞はＥ１ａ遺伝子産物、Ｅ１ｂ遺伝子産物、Ｅ２ａ遺伝子産物および／もしくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物を供給されそして／もしくは含有する。宿主細胞はＶＡＩ
ＲＮＡのような他のアデノウイルス遺伝子を含有することができるが、これらの遺伝子は必要とされない。好ましい態様において、他のアデノウイルス遺伝子もしくは遺伝子機能は宿主細胞に存在しない。
【００７９】
アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ ＯＲＦ６遺伝子産物ならびに任意の他の所望のヘルパー機能は、細胞におけるそれらの発現を可能にする任意の手段を用いて提供することができる。これらの産物をコードする配列の各々は別個のベクター上であることができ、または１つもしくはそれ以上の遺伝子は同じベクター上であることができる。ベクターは、プラスミド、コスミドおよびウイルスを包含する、当該技術分野において既知であるかもしくは上記に開示される任意のベクターであることができる。ベクターの宿主細胞への導入は、とりわけ、トランスフェクション、感染、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を包含する、当該技術分野において既知であるかもしくは上記に開示した通りの任意の手段により成し遂げることができる。アデノウイルス遺伝子の１つもしくはそれ以上は、宿主細胞のゲノムに安定に組込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、もしくは一過性発現されることができる。遺伝子産物は全て一過性で、エピソーム上で発現されるかもしくは安定に組込まれることができ、または遺伝子産物のあるものは安定に発現されることができ、一方、あるものは一過性発現される。さらに、アデノウイルス遺伝子の各々のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーターもしくは天然のアデノウイルスプロモーターから独立して選択することができる。プロモーターは、生物もしくは細胞の特定の生理状態により（例えば、分化状態によりまたは複製もしくは静止細胞において）または他の手段により、例えば外から加える因子により調節することができる。
【００８０】
Ｄ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
宿主細胞自体は、原核（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を包含する真核細胞を包含する任意の生物有機体から選択することができる。特に望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（これは機能性アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２のような細胞ならびにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギおよびハムスターを包含する哺乳類由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞を包含するがこれらに限定されるものではない任意の哺乳類種の中から選択される。細胞を提供する哺乳類種の選択は本発明の制約ではなく；また哺乳類細胞のタイプ、すなわち、線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などもそうでない。使用する細胞の必要条件は、それがＥ１、Ｅ２ａおよび／もしくはＥ４ ＯＲＦ６以外のアデノウイルス遺伝子を保有せず；それがｒＡＡＶの製造中に混入ウイルスの相同的組換えをもたらし得る他のウイルス遺伝子を含有せず；そしてそれがＤＮＡの感染もしくはトランスフェクションおよびトランスフェクションしたＤＮＡの発現ができることである。好ましい態様において、宿主細胞は、細胞に安定にトランスフェクションされたｒｅｐおよびｃａｐを有するものである。
【００８１】
本発明において有用な１つの宿主細胞は、ｒｅｐおよびｃａｐをコードする配列で安定に形質転換され、そしてアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａおよびＥ４ＯＲＦ６ ＤＮＡならびに上記の通りの発現カセットを保有する構築物でトランスフェクションされる宿主細胞である。Ｂ−５０（国際特許出願公開第ＷＯ ９９／１５６８５号）もしくは米国特許第５，６５８，７８５号に記述されるもののような、安定なｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現細胞系もまた同様に用いることができる。別の望ましい宿主細胞は、Ｅ４ ＯＲＦ６を
発現するために十分である最小のアデノウイルスＤＮＡを含有する。さらに他の細胞系は、本発明の新規シングルトン−修正（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ＡＡＶ
ｃａｐ配列を用いて構築することができる。
【００８２】
本発明の宿主細胞の製造は、選択したＤＮＡ配列のアセンブリのような技術を伴う。このアセンブリは、通常の技術を利用して成し遂げることができる。そのような技術には、周知でありそして上記に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．に記述されるｃＤＮＡおよびゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた、アデノウイルスおよびＡＡＶゲノムの重複するオリゴヌクレオチド配列の使用、合成方法、ならびに所望のヌクレオチド配列を提供する任意の他の適当な方法が包含される。
【００８３】
宿主細胞への分子（プラスミドもしくはウイルスとして）の導入はまた、当業者に既知でありそして本明細書を通して説明した通りの技術を用いて成し遂げることもできる。好ましい態様において、標準的なトランスフェクション技術、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションもしくは電気穿孔、および／またはヒト胎児腎臓細胞系ＨＥＫ ２９３（トランスに作用するＥ１タンパク質を提供する機能性アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎臓細胞系）のような細胞系へのハイブリッドアデノウイルス／ＡＡＶベクターによる感染が用いられる。
【００８４】
製薬学的組成物およびその使用
気道ターゲッティング分子を含有する製薬学的組成物は本明細書に記述され、それらは気道コンダクティング上皮への送達のための部分に連結された人工ＡＡＶキャプシドおよび生理学的に適合する担体を含んでなる。他の製薬学的組成物は、生理学的に適合する担体と共に本明細書に記載の通りの人工ＡＡＶキャプシドを含有するＡＡＶベクターを含有する。これらの組成物は、非肺細胞よりもむしろ、コンダクティング気道細胞を優先的に標的とするためにそして肺胞上皮を標的とするために適している。１つの態様において、これらの組成物は鼻腔内、経口もしくは気管内送達に適当な担体と調合される。しかしながら、他の調合および送達経路を選択することができる。
【００８５】
人工ＡＡＶキャプシドを含有する組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達することができる。好ましくは生理学的に適合する担体に懸濁したｒＡＡＶは、ヒトもしくは非ヒト哺乳類患者に投与することができる。適当な担体は、導入ウイルスが指示される適応を考慮して当業者により容易に選択されることができる。例えば、１つの適当な担体には食塩水が包含され、これは様々な緩衝溶液と調合することができる（例えばリン酸緩衝食塩水）。他の典型的な担体には、滅菌食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水が包含される。
【００８６】
場合により、組成物は、ＡＡＶおよび担体（１つもしくは複数）に加えて、防腐剤もしくは化学安定剤のような他の通常の製薬学的成分を含有することができる。適当な典型的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが包含される。適当な化学安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが包含される。
【００８７】
ベクターもしくはＡＡＶターゲッティング部分は、過度の悪影響なしに、もしくは医学的に許容しうる生理学的効果を有して治療利益を与えるために十分な量において投与され、それは医療分野における当業者により決定されることができる。通常のそして製薬学的に許容しうる投与経路には、所望の臓器（例えば肺）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管支内、動脈内、眼球内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路が
包含されるがこれらに限定されるものではない。投与の経路は、必要に応じて、組み合わせることができる。
【００８８】
ウイルスベクターもしくはターゲッティング部分の投薬量は、処置する症状、患者の年齢、体重および健康のような因子により主に決まり、従って患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト投薬量は、一般に、
約１ｘ１０９〜１ｘ１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含有する約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの溶液の範囲においてである。大きい臓器（例えば、肝臓、筋肉、心臓および肺）への送達のための好ましいヒト投薬量は、約１〜１００ｍＬの容量で、約５ｘ１０１０〜５ｘ１０１３のＡＡＶゲノムであることができる。眼への送達のための好ましい投薬量は、約０．１ｍＬ〜１ｍＬの容量で、約５ｘ１０９〜５ｘ１０１２ゲノムコピーである。例えば、気道コンダクティング細胞ターゲッティング部分の治療的に有効なヒト投薬量は、一般に、約１００μｇ〜約１０ｍｇの部分の範囲においてである。これは溶液中で、例えば約０．１ｍＬ〜約１００ｍＬの溶液中で送達することができる。ウイルスベクターおよびターゲッティング部分の両方について、投薬量は任意の副作用に対する治療効果のバランスを保つように調整することができ、そしてそのような投薬量は、組換えベクターを用いる治療用途により異なり得る。導入遺伝子の発現のレベルおよび／または治療もしくはワクチン分子の循環半減期は、投薬量の頻度を決定するためにモニターすることができる。場合により、治療目的のために記述されるものと同様の投与処方計画を本発明の組成物を用いる免疫に利用することができる。
【００８９】
本発明のＡＡＶ由来の構築物による送達のための治療製品および免疫原性製品の例を以下に提供する。これらの構築物は、本明細書に記載の通り、様々な治療もしくはワクチン処方計画に用いることができる。さらに、これらのベクターは、所望の治療および／もしくはワクチン処方計画において１つもしくはそれ以上の他のベクターもしくは有効成分と組み合わせて送達することができる。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は一例にすぎず、そして本発明への制約ではない。
【実施例１】
【００９１】
ＡＡＶ６／９キメラキャプシドを有するＡＡＶ
Ａ．可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを有するＡＡＶキメラの構築
ＡＡＶ６およびＡＡＶ９キャプシドの特定のドメインをオーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いて交換した（図１Ａ〜Ｃ）。この方法は、各ベクターキャプシドにおいて交換される領域を増幅するためのプライマーの使用を伴う。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の末端が相補的配列を含有するように異種キャプシド配列に相補的な１０〜１５塩基対の５’突出を有するように設計される。これは、キメラキャプシド配列を生じるように外側の５’および３’末端に相補的な１組のプライマーを用いる第二のＰＣＲ反応においてフラグメントが一緒に連結されることを可能にした。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【００９２】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶ〜Ｖ
5’-AGCCTGGACCGRCTATGAATCC-3’ Ｆ 配列番号：５
5’-GCCATAGCAGGTCCAGGGTTGAT-3’ Ｒ 配列番号：６
【００９３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１〜ＶＬ ＩＶ
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：７
5’-GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3’ Ｒ 配列番号：８
【００９４】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖ−末端
5’-ATCAACCCTGGACCTGCTATGGC-3’ Ｆ 配列番号：９
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：１０
【００９５】
１２のキメラを構築し、それらはＶＰ１およびＶＰ２ユニーク領域ならびにキャプシドの９つの推定表面可変ループ領域の交換を含んだ。
【００９６】
次に、これらのキメラキャプシド配列を制限酵素認識部位消化によりＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を含有するプラスミドにクローン化し、そして次に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現されそしてＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するＧＦＰを含有するプラスミドに加えてＡｄＶヘルパープラスミドと一緒に、２９３細胞にトランスフェクションした。これらのベクターのうち６つをＣＭＶプロモーターからＧＦＰもしくはニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターからｎＬａｃＺのいずれかを発現する大規模製造および精製に進めた。ウイルス力価は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＦ）ポリＡ特異的プライマーおよびプローブを用いてＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲにより決定した。
【００９７】
Ｂ．ヒト気道上皮細胞培養物の形質導入
次に、これらの６つのベクターの形質導入プロフィールをヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞培養物で調べてヒトコンダクティング気道に形質導入するそれらの能力を決定した［ＴＥ
Ｇｒａｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１４：１０４−１２（１９９６）］。初代ＨＡＥ細胞（Ｌｏｎｚａ）を２４ウェルトランスウェルプレート上に〜５０，０００細胞／ウェルでまいた。いったん完全にコンフルエントになると、これらの細胞を気液界面で少なくとも４週間培養し、その後で適切な細胞分化を与えるように実験において使用した。ＨＡＥ細胞のＡＡＶ形質導入を調べるために、ＧＦＰを発現する６つのＡＡＶキメラに加えてコントロールとしてＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９を５０μｌ中１ｘ１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）／ウェルでＨＡＥ細胞の頂端表面に加えた。ベクターを２時間後に取り除き、そして細胞を気液界面で維持した。ＧＦＰ発現を５日後に評価した。
【００９８】
この実験により、ＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６キャプシドの可変ループ領域ＩＶ〜Ｖ（配列番号：１のアミノ酸４４７〜５２１）を交換すること（ｓｗａｐｐｉｎｇ）（ＡＡＶ２／９−６ＶＬ ＩＶ〜Ｖ）はＡＡＶ６のものと同様の形質導入を与え、一方、ＡＡＶ９は通常はコンダクティング気道に形質導入しないことが示された。逆に、ＡＡＶ６キャプシド中にＡＡＶ９の相同領域を交換すること（ＡＡＶ２／６−９ＶＬ ＩＶ〜Ｖ）は、ＨＡＥ細胞を効率良く形質導入するＡＡＶ６の能力を取り除いた。これは、ＡＡＶ６キャプシドのこのドメインがコンダクティング気道親和性にとって重要であることを示す。さらに、同じ結果は他のキメラでは観察されなかったので、この現象はＡＡＶ６の可変ループ領域ＩＶ〜Ｖに特異的である。
【００９９】
Ｃ．マウス肺のインビボ形質導入
これらのベクターの形質導入プロフィールはまた、鼻腔内点滴後にマウス肺においても調べられた。ｎＬａｃＺを発現する１ｘ１０１１ＧＣの各キメラに加えてコントロールとしてＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９を５０μｌの総容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）においてＣ５７Ｂｌ／６マウスに鼻腔内送達した。２１日後に、肺を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物およびＰＢＳの１：１混合物で膨張させ、取り除き、そして切断およびβ−ｇａｌ発現の染色のためにＯＣＴにおいて凍結させた。
【０１００】
この場合もやはり、ＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６キャプシドの可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを交換することは、コンダクティング気道上皮に対する新規親和性をＡＡＶ９に与え
ることが認められた。そして逆に、ＡＡＶ６キャプシド中にＡＡＶ９の相同領域を交換することはＡＡＶ６形質導入を除去した。
【０１０１】
総合すると、これらの研究によりコンダクティング気道形質導入に重要なＡＡＶ６キャプシドのドメインが同定されたことが示される。可変ループ領域ＩＶ〜Ｖ（ＡＡＶ６のアミノ酸４４７〜５２１）は、キャプシドの正二十面体３回転軸の表面露出突起上に位置し、そして形質導入に必要な細胞相互作用を決定し得る。
【実施例２】
【０１０２】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６ナローＶＬ ＩＶおよびナローＶＬ Ｖを有するＡＡＶ６／９キメラ
Ａ．可変ループ領域ＩＶ〜Ｖを有するＡＡＶキメラの構築
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域を取り除いたＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＩＶおよび可変ループＶのナローフラグメントを挿入した。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１０３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ ＩＶナロー
5-’AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：１１
5’-TCCGGACTGATTCTG/AGTCTTTGAGAGAT-3’ Ｒ 配列番号：１２
【０１０４】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶナロー
5’-ATCTCTCAAAGACT/CAGAATCAGTCCGGA-3’ Ｆ 配列番号：１３
5’-ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3’ Ｒ 配列番号：１４
【０１０５】
ＡＡＶ９ ＶＬ ＩＶナロー−ＶＬ Ｖナロー
5’-GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3’ Ｆ 配列番号：１５
5’-TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3’ Ｒ 配列番号：１６
【０１０６】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナロー
5’-GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3’ Ｆ 配列番号：１７
5’-CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3’ Ｒ 配列番号：１８
【０１０７】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖナロー−末端
5’-TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3’ Ｆ 配列番号：１９
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：２０
【０１０８】
ナローＡＡＶ６ＶＬ−ＩＶナローは、配列番号：１のアミノ酸配列４５０〜４６９に対応する。ナローＡＡＶ６ＶＬ−Ｖナローは、配列番号：１のアミノ酸配列４８７〜５０５に対応する。得られるキメラキャプシドは、ＡＡＶ６ＶＬ−ＩＶナローのカルボキシ末端とＡＡＶ６ＶＬ−Ｖナローのアミノ末端の間に位置するアミノ酸配列を包含する、ＡＡＶ６可変ループ領域の各々のアミノおよびカルボキシ末端の両方に隣接するＡＡＶ９キャプシド配列を含有する。
【０１０９】
構築したキメラキャプシド配列を制限酵素認識部位消化によりＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子を含有するプラスミドにクローン化し、そして次に、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから発現されそしてＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接するホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）を含有するプラスミドに加えてＡｄＶヘルパープラスミドと一緒に、６ウェルプレートにおいて２９３細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの１日後に培地を交換し、そしてトランスフェクションの３日後に細胞溶解物を
集めた。溶解物を３回凍結融解し、そして遠沈して細胞残屑を除いた。次に、ＳＶ４０ポリＡ特異的プライマーおよびプローブを用いて定量的ＰＣＲによりベクターゲノムコピー（ＧＣ）を滴定した。
【０１１０】
ｆｆｌｕｃ発現カセットを保有する得られるキメラＡＡＶウイルス粒子は、約１ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬのレベルで力価を示し、これは同じ発現カセット、しかしそれぞれ完全なＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９キャプシドを含有したＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／９コントロールで認められる力価の中間である。
【０１１１】
インビトロ形質導入を調べるために、２９３細胞を９６ウェルプレートにおいて１ｘ１０５細胞／ウェルでまいた。１ｘ１０９ＧＣの各ベクターを１００μｌの総容量の培地において三重反復で細胞に加えた。一晩のインキュベーション後に、ベクターを取り除きそして新しい培地で置き換えた。形質導入後７２時間で、ｆｆｌｕｃ発現を発光イメージングにより調べた。
【０１１２】
上記の通り作製した１つのキメラ構築物、ナロー可変ループＩＶ領域およびナロー可変ループＶ領域（ＡＡＶ６のアミノ酸４８７〜５０５）を有するＡＡＶ２／９を小規模力価でそして２９３細胞におけるインビトロ形質導入について試験した。約１ｘ１０１１ゲノムコピー／ｍＬの力価が認められ；これらの力価はＡＡＶ２／６コントロールで認められるものより高いが、認められるＡＡＶ２／９コントロールより低い。ＡＡＶ６可変ループＩＶ領域およびナロー可変ループＶ領域を有するキメラＡＡＶ２／９のインビトロ形質導入レベルは、ＡＡＶ２／６で認められるものより低かったが、ＡＡＶ２／９のものより高かった。
【０１１３】
これらの結果によりナローＩＶおよびナローＶを有するキメラＡＡＶ６の形質導入レベルはＡＡＶ２／９よりわずかに高くそしてＡＡＶ２／６より低いことが示された。
【０１１４】
これらの構築物について大規模製造が行われており、そしてそれらは実施例１に記載の通りマウス肺において評価される。
【実施例３】
【０１１５】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６可変ループＶを有するＡＡＶ６／９キメラ
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域が取り除かれるＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＶのナローフラグメントを挿入した（ＡＡＶ６ループＩＶの不在下で）。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１１６】
キメラキャプシド構築物の１つは、ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６の可変ループＶのナローフラグメントのみを含有する：ＡＡＶ９のアミノ酸１〜４８６、ＡＡＶ６（配列番号：１）のアミノ酸４８７〜５０５およびＡＡＶ９のアミノ酸４８７〜７３６。以下のプライマーをこの構築物に利用する。
【０１１７】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナローのみのキメラ：
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ Ｖナロー
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：２７
5-’TAGAAACGCGCTGTTGTCGGTAGCTGG-3’ Ｒ 配列番号：２８
【０１１８】
他のキメラキャプシド構築物は、ＡＡＶ９キャプシドの対応する領域に挿入されたＡＡＶ６の可変ループＶおよび可変ループＩＶの両方のナローフラグメントを含有する。
【０１１９】
ＡＡＶ６ ＶＬ Ｖナロー（配列番号：１のアミノ酸４８７〜５０５をコードする領域を増幅する）
5’-GCTACCGACAACAGCGCGTTTCT-3’ Ｆ 配列番号：２９
5’-CCAAGAAGAAGC/ACCAGTCCAGGTA-3’ Ｒ 配列番号：３０
【０１２０】
ＡＡＶ９ ＶＬ Ｖナロー−末端
5’-TACCTGGACTGGT/GCTTCTTCTTGG-3’ Ｆ 配列番号：３１
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：３２
【０１２１】
１つのキメラ構築物、ナロー可変ループＶ領域（ＡＡＶ６のアミノ酸４８７〜５０５）を有するＡＡＶ２／９を小規模力価でそして２９３細胞におけるインビトロ形質導入について試験した。それはＡＡＶ２／６よりわずかに低い力価（〜３ｘ１０１０）、しかしＡＡＶ２／６と同様のインビトロ形質導入を有する。
【実施例４】
【０１２２】
ＡＡＶ９キャプシドにおいてＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶフラグメントを有するＡＡＶ６／９キメラ
実施例１に記載の方法を使用して、オーバーラップ伸長によるＰＣＲスプライシングを用いてＡＡＶ９の対応する領域が取り除かれるＡＡＶ９キャプシド中にＡＡＶ６可変ループＩＶの改変されたナローフラグメントを挿入する。以下のプライマーを利用する。Ｆはフォワードプライマーを、そしてＲはリバースプライマーをさす。
【０１２３】
ＡＡＶ９ ＶＰ１−ＶＬ ＩＶブロード
5’-AGACGCGGAAGCTTCGATCAACTAC-3’ Ｆ 配列番号：３３
5-’GGATTCATYAGYCGGTCCAGGCT-3’ Ｒ 配列番号：３４
【０１２４】
ＡＡＶ６ ＶＬ ＩＶブロードＬおよびナローＲ（ＡＡＶ６のアミノ酸４４７〜４６９をコードする領域を増幅する）
5’-AGCCTGGACCGRCTRATGAATCC-3’ Ｆ 配列番号：３５
5’-ACAGCCATGTT/AGCTGGAGACCC-3’ Ｒ 配列番号：３６
【０１２５】
ＡＡＶ９ ＶＬ ＩＶナロー−末端
5’-GGGTCTCCAGCT/AACATGGCTGT-3’ Ｆ 配列番号：３７
5’-ACCTCTAGTCCTGCAGGTTTAAACG-3’ Ｒ 配列番号：３８
【０１２６】
ＡＡＶ６可変ループＶの不在下で、ＡＡＶ６可変ループＩＶもしくはそのナローフラグメントのみを含有するキメラ構築物で悪い形質導入結果が認められた。しかしながら、ＶＬ ＩＶ領域のアミノ末端に追加のアミノ酸を含有する別の構築物が作製されている。この構築物はＡＡＶ６アミノ酸４４７〜４６９を含有する。
【０１２７】
本明細書に引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特に好ましい態様に関して記述されているが、本発明の精神から逸脱せずに改変を行えることが理解される。そのような改変は、添付の請求項の範囲内に入るものとする。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
別のＡＡＶからのＡＡＶキャプシド配列が隣接するＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４８Ｒ３およびｈｕ４４Ｒ２から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶにおよぶアミノ酸フラグメント由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項２】
可変ループ領域ＩＶおよびＶが異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域の天然の位置にあり、これらの対応する可変ループ領域が機能的に欠失している請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項３】
人工ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ６可変ループ領域のアミノ酸配列のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する任意のスペーサーをさらに含んでなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項４】
任意のスペーサーが１〜５個のアミノ酸を含んでなる請求項３に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項５】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドが、ＡＡＶクレードＡキャプシドの全長可変ループ領域ＩＶおよびＶ、ＡＡＶクレードＡキャプシドの領域ＩＶのアミノ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸ならびにＡＡＶクレードＡキャプシドの領域Ｖのカルボキシ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸からなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項６】
ＡＡＶキャプシド配列が単一のＡＡＶにより提供される請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項７】
単一のＡＡＶがＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ３２．３３よりなる群の中から選択される請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項８】
人工ＡＡＶキャプシドがその中にパッケージングされた機能性ＡＡＶ配列を有さない請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項９】
人工ＡＡＶキャプシドがその中にパッケージングされた機能性配列を有さない請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項１０】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドが配列番号４：ＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷ−ＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧのアミノ酸配列を有する請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項１１】
キャプシドが：
（ａ）ＡＡＶ９キャプシド配列が隣接するＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約４７２ないし（ｔｈｒｏｕｇｈ）約アミノ酸４８９〜約５１０からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント；
（ｂ）ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４６９；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４７６；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４８７〜約アミノ酸５１０を含んでなるＩＶ〜Ｖからなる可変ループにおよぶ領域内のＡＡＶ６キャプシドの少なくとも１つのフラグメント
を含んでなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド
【請求項１２】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶ由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシド、およびキャプシドにパッケージングされた発現カセットを含んでなり、ここで、該発現カセットが少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列およびコンダクティング気道細胞における異種遺伝子の発現を可能にする調節配列に操作可能に連結された異種遺伝子を含んでなるＡＡＶベクター。
【請求項１３】
人工ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ６可変ループ領域のアミノ酸配列のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する任意のスペーサーをさらに含んでなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
任意のスペーサーが１〜５個のアミノ酸を含んでなる請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドがＡＡＶクレードＡキャプシドの全長可変ループ領域ＩＶおよびＶ、ＡＡＶクレードＡキャプシドの領域ＩＶのアミノ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸ならびにＡＡＶクレードＡキャプシドの領域Ｖのカルボキシ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸からなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１６】
異種遺伝子が嚢疱性線維症の症状を処置するかもしくは改善するために有用な産物をコードする請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１７】
異種遺伝子が機能性嚢疱性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、アルファ−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）およびサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）よりなる群から選択される産物をコードする請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１８】
気道ターゲッティングペプチドが：
（ａ）ＡＡＶ９キャプシド配列が隣接するＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約４７２ないし約アミノ酸４８９〜約５１０からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント；
（ｂ）ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４６９；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４７６；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４８７〜約アミノ酸５１０を含んでなるＩＶ〜Ｖからなる可変ループにおよぶ領域内のＡＡＶ６キャプシドの少なくとも１つのフラグメント；
（ｃ）ＡＡＶ６、配列番号：１の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸５２１からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント
を含んでなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１９】
コンダクティング気道上皮への送達のための部分に連結された請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシドを含んでなる気道ターゲッティング分子。
【請求項２０】
薬剤の製造における請求項１９に記載の気道ターゲッティング分子の使用。
【請求項２１】
請求項１２に記載のＡＡＶベクターおよび生理学的に適合する担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２２】
鼻腔内、経口もしくは気管内送達用に調合される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該方法がＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶ由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドをＡＡＶに提供する工程を含んでなる、選択したＡＡＶベクターの特異性をそれがコンダクティング気道細胞を標的とするように改変する方法。
【請求項２４】
選択したクレードＡ ＡＡＶの可変ループ領域ＩＶおよびＶを含んでなる天然のＡＡＶキャプシド領域が除去される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該方法が請求項１２〜１８のいずれかに記載のＡＡＶベクターと細胞を接触させる工程を含んでなる、非肺細胞よりもむしろコンダクティング気道細胞を優先的に標的とする方法。
【請求項２７】
薬剤の製造における請求項２６に記載のＡＡＶベクターの使用。
【請求項１】
別のＡＡＶからのＡＡＶキャプシド配列が隣接するＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４８Ｒ３およびｈｕ４４Ｒ２から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶにおよぶアミノ酸フラグメント由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項２】
可変ループ領域ＩＶおよびＶが異種キャプシド配列の対応する可変ループ領域の天然の位置にあり、これらの対応する可変ループ領域が機能的に欠失している請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項３】
人工ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ６可変ループ領域のアミノ酸配列のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する任意のスペーサーをさらに含んでなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項４】
任意のスペーサーが１〜５個のアミノ酸を含んでなる請求項３に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項５】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドが、ＡＡＶクレードＡキャプシドの全長可変ループ領域ＩＶおよびＶ、ＡＡＶクレードＡキャプシドの領域ＩＶのアミノ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸ならびにＡＡＶクレードＡキャプシドの領域Ｖのカルボキシ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸からなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項６】
ＡＡＶキャプシド配列が単一のＡＡＶにより提供される請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項７】
単一のＡＡＶがＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８およびＡＡＶｒｈ３２．３３よりなる群の中から選択される請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項８】
人工ＡＡＶキャプシドがその中にパッケージングされた機能性ＡＡＶ配列を有さない請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項９】
人工ＡＡＶキャプシドがその中にパッケージングされた機能性配列を有さない請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項１０】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドが配列番号４：ＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷ−ＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧのアミノ酸配列を有する請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド。
【請求項１１】
キャプシドが：
（ａ）ＡＡＶ９キャプシド配列が隣接するＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約４７２ないし（ｔｈｒｏｕｇｈ）約アミノ酸４８９〜約５１０からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント；
（ｂ）ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４６９；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４７６；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４８７〜約アミノ酸５１０を含んでなるＩＶ〜Ｖからなる可変ループにおよぶ領域内のＡＡＶ６キャプシドの少なくとも１つのフラグメント
を含んでなる請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシド
【請求項１２】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶ由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドを含んでなる人工ＡＡＶキャプシド、およびキャプシドにパッケージングされた発現カセットを含んでなり、ここで、該発現カセットが少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復配列およびコンダクティング気道細胞における異種遺伝子の発現を可能にする調節配列に操作可能に連結された異種遺伝子を含んでなるＡＡＶベクター。
【請求項１３】
人工ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ６可変ループ領域のアミノ酸配列のカルボキシおよび／もしくはアミノ末端に隣接する任意のスペーサーをさらに含んでなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
任意のスペーサーが１〜５個のアミノ酸を含んでなる請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドがＡＡＶクレードＡキャプシドの全長可変ループ領域ＩＶおよびＶ、ＡＡＶクレードＡキャプシドの領域ＩＶのアミノ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸ならびにＡＡＶクレードＡキャプシドの領域Ｖのカルボキシ末端に隣接する領域からの少なくとも１〜１２個のアミノ酸からなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１６】
異種遺伝子が嚢疱性線維症の症状を処置するかもしくは改善するために有用な産物をコードする請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１７】
異種遺伝子が機能性嚢疱性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）配列、アルファ−１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰＣ）およびサーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）よりなる群から選択される産物をコードする請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１８】
気道ターゲッティングペプチドが：
（ａ）ＡＡＶ９キャプシド配列が隣接するＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約４７２ないし約アミノ酸４８９〜約５１０からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント；
（ｂ）ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４６９；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸４７６；ＡＡＶ６（配列番号：１）の約アミノ酸４８７〜約アミノ酸５１０を含んでなるＩＶ〜Ｖからなる可変ループにおよぶ領域内のＡＡＶ６キャプシドの少なくとも１つのフラグメント；
（ｃ）ＡＡＶ６、配列番号：１の約アミノ酸４４７〜約アミノ酸５２１からなるＡＡＶ６キャプシドのフラグメント
を含んでなる請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１９】
コンダクティング気道上皮への送達のための部分に連結された請求項１に記載の人工ＡＡＶキャプシドを含んでなる気道ターゲッティング分子。
【請求項２０】
薬剤の製造における請求項１９に記載の気道ターゲッティング分子の使用。
【請求項２１】
請求項１２に記載のＡＡＶベクターおよび生理学的に適合する担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２２】
鼻腔内、経口もしくは気管内送達用に調合される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
該方法がＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ｈｕ４４Ｒ２およびｈｕ４８Ｒ３から選択されるＡＡＶクレードＡキャプシドの可変ループ領域ＩＶおよびＶ由来の異種コンダクティング気道ターゲッティングペプチドをＡＡＶに提供する工程を含んでなる、選択したＡＡＶベクターの特異性をそれがコンダクティング気道細胞を標的とするように改変する方法。
【請求項２４】
選択したクレードＡ ＡＡＶの可変ループ領域ＩＶおよびＶを含んでなる天然のＡＡＶキャプシド領域が除去される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該方法が請求項１２〜１８のいずれかに記載のＡＡＶベクターと細胞を接触させる工程を含んでなる、非肺細胞よりもむしろコンダクティング気道細胞を優先的に標的とする方法。
【請求項２７】
薬剤の製造における請求項２６に記載のＡＡＶベクターの使用。
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５２５１５０（Ｐ２０１２−５２５１５０Ａ）
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０８７２２（Ｐ２０１２−５０８７２２）
【出願日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２９４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７０９７
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０２４０９８１３）ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア (37)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３２９４３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２７０９７
【国際公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【出願人】（５０２４０９８１３）ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア (37)
【Ｆターム（参考）】
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