アフィニティークロマトグラフィー用吸着体
【課題】 血液成分を構成するタンパク質群を含む試料からＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質（血清アルブミン等）を一度の簡便な操作で選択的に除去することのできる吸着体を提供する。
【解決手段】 プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。この吸着体を用いて血液成分を含む溶液を処理することにより、タンパク質混合物中からＩｇＧおよび既知血中高含量タンパク質を同時にかつ選択的に分離、除去する。
【解決手段】 プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。この吸着体を用いて血液成分を含む溶液を処理することにより、タンパク質混合物中からＩｇＧおよび既知血中高含量タンパク質を同時にかつ選択的に分離、除去する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清などの血液由来試料に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質（例えば、血清アルブミン）を一回の処理で同時に吸着し、他の微量タンパク質と分離するためのアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、該吸着体を用いるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法、ならびに該吸着体を含んで成るＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病気に特有の微量物質を見出し、該微量物質を検出することにより病気の診断に役立てようとする試みが種々行われている。また、かかる微量物質（マーカー）を見出すために、或いは微量物質を検出するために、血液、血漿、血清などの血液由来試料が利用される場合が多い。
しかしながら、上記のような血液由来試料には、血清アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ，アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビンなどのタンパク質が一般に全タンパク質の２％から６０％の高含有率で含まれており、これらの総和の含有率は８０％から９０％に達する。血液由来試料中に微量しか存在しない他のタンパク質を検出・分析する際には、前記のような既知血中高含量タンパク質の存在が障害となる場合が多い。例えば、二次元ゲル電気泳動または質量分析によるタンパク質成分分析において、血清アルブミンやＩｇＧは他のタンパク質の検出を著しく妨害する。そのため、この様な分析に際しては血清アルブミンやＩｇＧを、好ましくはさらにＩｇＡ，アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビンなどの既知血中高含量タンパク質を予め除去することが極めて望ましい。また、血液由来試料から微量物質を精製するに際しても、まず該試料から高含量で含まれる既知タンパク質を予め除去することは、続く精製過程を効率よく進めるために好ましい。
【０００３】
特定のタンパク質を精製あるいは除去する手段として、アフィニティークロマトグラフィーがよく利用される。アフィニティークロマトグラフィーでは、目的物質に対する抗体や目的物質と親和性のある物質（リガンド）を不溶性担体に固定しておき、目的物質をこのリガンドに特異的に吸着させることで、目的物質を夾雑物から分離する。また、吸着された目的物は、リガンドとの親和性を下げることにより溶出され、これを回収することで、精製を行うことが可能である。
【０００４】
プロテインＡはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来のタンパク質であり、様々な動物由来のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合する性質を持っており、血清、細胞培養上清、腹水等からのＩｇＧ精製に広く利用されている。また、プロテインＧは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のタンパク質であり、広い範囲の動物由来のＩｇＧと特異的に結合するため、プロテインＡと同様にＩｇＧの分離精製に利用されている。このため、プロテインＡまたはプロテインＧを不溶性担体に固定化させ、この担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧを特異的に分離精製する手法が広く知られている。[Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４，ｐ１４０−１４７，１９７０年、Ｂｊｏｕｒｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，ｐ９６９−９７４，１９８４年]
また、シバクロンブルーは、血清アルブミンを結合する物質として知られており、これをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーによって血清アルブミンを精製あるいは除去する方法が知られている［Ｇｉａｎａｚｚａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１，ｐ１２９−１３６，１９８２年］。
【０００５】
従来の技術によれば、アフィニティークロマトグラフィーの手法を利用して血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清などの血液由来試料からＩｇＧおよび血清アルブミンをはじめとする高含有率既知タンパク質を除去するためには、除去したいタンパク質それぞれに特異的親和性のあるリガンドを準備し、各リガンドを不溶性単体に固定化した吸着体を用いて除去したいタンパク質を一種類ずつ除去しなくてはならない。例えば、血液由来試料から最も含有率が高い既知タンパク質である血清アルブミンとＩｇＧを除去するためには、まず、プロテインＡあるいはプロテインＧが不溶性担体に固定化された吸着体を用いて、試料中のＩｇＧを除去し、ついでシバクロンブルーが不溶性担体に固定化された吸着体を用いて、試料中のアルブミンを除去することが考えられる。しかしながら、この方法は、吸着操作を少なくとも２回行わなければならず、また時間もかかるため、除去の過程でロスあるいは失活が起こり、目的とする微量タンパク質の検出あるいは回収が効率的に実施できないという難点があった。
【０００６】
この難点を克服するために、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する方法が提案され、実用化されている。例えば、非特許文献１には、抗血清アルブミン抗体を不溶性担体に固定化させた吸着体と抗ＩｇＧ抗体を不溶性担体に固定化させた吸着体の２種類の吸着体を用いる方法が開示されており、かかる吸着体を含むキットがアマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社から、“Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ”の商品名で発売されている。また、非特許文献２には、シバクロンブルーが不溶性担体に固定化された吸着体とプロテインＡが固定化された吸着体の２種類の吸着体を用いる方法が記載されており、かかる吸着体を含むキットがバイオ・ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社から、“Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ”の商品名で発売されている。さらに、特許文献１には、ビオチン化した抗血清アルブミン抗体−アビジン−マトリックスからなる吸着体とビオチン化したプロテインＡ−アビジンーマトリックスからなる吸着体の２種の吸着体を用いる方法が記載されている。
【０００７】
上記の３つの方法は、血清アルブミンおよびＩｇＧを高除去率で除去できる点で優れた方法であるが、非特許文献１の方法は、吸着体の調製に２種類の抗体（すなわち、抗血清アルブミン抗体と抗ＩｇＧ抗体）を用意しなければならないといった問題があった。また、非特許文献２の方法に用いられているシバクロンブルーは血清アルブミン以外のタンパク質、例えば血液凝固因子、インターフェロン等とも結合するため、特異性に欠けるという欠点があった。さらに特許文献１の方法は抗体やプロテインＡをビオチン化する必要があるだけでなく、不溶性担体を使用していないのでこれらの吸着体をさらにアビジンと結合させ、血清アルブミンおよびIｇＧを結合させた後遠心分離して上清を分離する必要があるなど、操作が煩雑であるという欠点があった。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６４１０６９２号明細書
【非特許文献１】ライフ サイエンス ニュース（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ）、２００３年秋号（９月発行）、アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【非特許文献２】プロテオミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２００３、３、１９８０−１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多種類のタンパク質を含む血液由来試料からＩｇＧおよびＩｇＧ以外の他の既知血中高含有量タンパク質を簡便な操作で、しかも選択的にかつ同時に除去できるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を提供することである。また、本発明の他の目的は、このアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を用いたＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法を提供することである。更に、本発明の他の目的は、上記アフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム、あるいは該吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、血液由来試料から簡便な操作でＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知高含量タンパク質を同時にかつ選択的に除去する方法について種々研究を重ねた結果、プロテインＡまたはプロテインＧと、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体の両者を吸着体の表面に呈示するように固定化した吸着体の創生に成功し、この吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用することで上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
（１） プロテインＡまたはプロテインＧとＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体とが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（２） プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合していることを特徴とする前記（１）記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（３） プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合していることを特徴とする前記（１）記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（４） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（５） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（６） 不溶性担体が膜状である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（７） 請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を血液由来試料と接触させて該試料中のＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に該吸着体に吸着させることを特徴とするＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法、
（８） 試料が、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清である前記（７）記載の同時除去方法、
（９） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである前記（７）記載の同時除去方法、
（１０） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである前記（７）記載の同時除去方法、
（１１） 前記（１）〜（６）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム、および
（１２） 前記（１）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の吸着体を使用することによって、血液中に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質（血清アルブミンなど）を簡便な操作で同時にかつ選択的に除去できる。このことによって、血液成分を構成する微量タンパク質の検出、精製が容易となる。さらに、ＩｇＧ以外の既知タンパク質が血清アルブミンのみである場合（すなわち、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する場合）にも２種類の抗体を使用する必要がないため、吸着体の調製が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体は、プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が吸着体表面に呈示（露出）するように不溶性担体に結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体である。このような吸着体としては、（１）プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合しているアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、（２）プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体などがあげられる。
【００１３】
本発明において“既知血中高含量タンパク質”とは、血中に本来含まれている全タンパク質に対して２質量％以上の含有量である既知の血中タンパク質（ＩｇＧ、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等）をいい、人為的な要因から血清などの血液由来試料に混入することがあるケラチンやヘモグロビンも包含される。
【００１４】
プロテインＡまたはプロテインＧに加えて、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質（例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等）に対する抗体を使用することで、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に除去する吸着体を作成できる。例えば、以下に説明する様に、プロテインＡまたはプロテインＧおよび抗血清アルブミン抗体が吸着体表面に呈示（露出）するように不溶性担体に結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を作成することで、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する吸着体を作成できる。以下に、抗体が血清アルブミン抗体である場合の吸着体の製造について説明するが、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が血清アルブミン抗体以外の抗体（トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等に対する抗体）の場合も、血清アルブミン抗体の場合と同様にして目的の吸着体を作製することができる。また、しばしば人為的な要因から血清等に混入する場合があるケラチンやヘモグロビンを除去する場合にも、これらに対する抗体を用いることで、同様の目的が達成できることは言うまでもない。
【００１５】
（血清アルブミン結合リガンド）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体の構成成分たりうる抗血清アルブミン抗体は、特に制限されないが、試料から除去したい血清アルブミンの由来である動物種と同一種の血清アルブミンに対する抗体であるのが望ましい。例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地でヒトの細胞を培養し、この培地に含まれるタンパク質を分析したい場合には、ウシの血清アルブミンおよびＩｇＧを除去することになるので、このときはウシの血清アルブミンに対する抗体を使用することが好ましい。ただし、当該抗体が試料の動物種と親和性のあるものならば、必ずしも同一の動物種のものである必要はない。
【００１６】
また、本発明にかかる抗血清アルブミン抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００１７】
かかる抗血清アルブミン抗体は、種々の業者から販売されている抗体を用いてよく、また、試料の起源となる動物種に由来する血清アルブミンまたは血清アルブミンの部分ペプチドを抗原として用い、公知の抗体製造方法に従って製造することもできる。
【００１８】
具体的には、本発明に係る抗血清アルブミン抗体は、例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法 改訂第２版（堀尾武一編集 南江堂発行 １９９４年）」または「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ、ＩＮＣ．１９９０」などに記載の方法に従って作製することができる。
【００１９】
（ＩｇＧ結合リガンド）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体の構成成分であるプロテインＡまたはプロテインＧは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来のプロテインＡあるいは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のプロテインＧが挙げられる。これらは様々な動物種のＩｇＧのＦｃ領域と結合することが知られており、プロテインＡとプロテインＧのいずれを選択するかについては、除去したいＩｇＧの由来となる動物種によって適宜選択することができる。ヒト、イヌ、ウサギ、ブタ由来のＩｇＧはプロテインＡと高い結合を示すが、ラット、ウマ、ヒツジ、ヤギ等のＩｇＧではプロテインＧに対してより結合性が高い。該プロテインＡまたはプロテインＧは上記した各々の菌を培養し、公知の方法を用いて単離精製することによって得られる。あるいは遺伝子組み換えによるタンパク質の発現方法により得ることができる。遺伝子組み換え技術によりプロテインＡあるいはプロテインＧを生成する方法は、該技術分野において十分に確立されているので、常法に従ってよい。
【００２０】
（不溶性担体の選択およびプロテインＡまたはプロテインＧの結合）
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体としては、プロテインＡまたはプロテインＧを固定化できる、水に不溶性のものであればいずれも使用してよい。例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、シリカゲルおよび多孔性ガラスなどが挙げられる。
【００２１】
抗体およびプロテインＡまたはプロテインＧをリガンドとして不溶性担体に固定化させる方法は公知のものを用いてよい。例えば、上記リガンドに存在するアミノ基またはカルボキシル基、チオール基、水酸基等を介してゲルとリガンドを結合させる方法がよく知られている。ブロモシアン、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド等が典型的な架橋剤となる。例としては、アガロースを架橋剤（例えば、ブロモシアン）で処理し、これとリガンドのアミノ基を結合させることができる。
【００２２】
不溶性担体とリガンドの間には、スペーサーを介在させることができる。上記架橋剤で処理しスペーサーを付加した状態の不溶性担体が各社から市販されており、それらを用いることでリガンド固定化の操作が簡略化できる。リガンド固定化の手順は使用する架橋剤によって異なる。
【００２３】
本発明に用いられる不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）は、各社から市販されており、市販品の例をあげれば、アマシャム バイオサイエンス社製のセファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ、ＡＨ−セファロース、ＣＨ−セファロース、エポキシ−活性化セファロース６Ｂなど、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｃｅｌｌｅｘ、アミノエチル−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＣＭ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅ１０など、和光純薬工業株式会社製のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックスＰ−ＨＺなど、セルバ（ＳＥＲＶＡ）社製のＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース、ＰＡＢセルロースなどが挙げられる。
また、本発明に用いられる不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）の形状は、特に限定されず、粒状であっても、膜状であってもよい。
【００２４】
各リガンドを不溶性担体に結合させる手順としては、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体とを同時に各種架橋剤処理をした不溶性担体と反応させる方法も可能ではあるが、好ましくは、最初にプロテインＡあるいはプロテインＧを架橋剤処理した不溶性担体と反応させ、固定化する。その後固定化プロテインＡあるいはプロテインＧに抗体を作用させて固定化する手順を用いる。このとき、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体のＦｃ領域が特異的に結合するので、該抗体の抗原結合活性の損失を低く抑えることができる。さらに、抗体のプロテインＡからの漏出を防ぐためにプロテインＡまたはプロテインＧと抗体を結合後、両者をジメチルピメリミデート等の二価性架橋試薬で化学的に架橋してもよい。
【００２５】
なお、プロテインＡを固定化した不溶性担体も市販されており、例えば、アマシャム バイオサイエンス社から、商品名
“ｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル”として市販されている。さらに、抗血清アルブミン抗体についても市販された物があり、例として、株式会社 医学生物学研究所から
“抗ヒトアルブミン” の商品名で市販されている。本発明においては、このような市販の不溶性担体に上記方法で市販の抗血清アルブミン抗体を結合させることも可能である。
【００２６】
本発明の吸着体の血清アルブミン結合能およびＩｇＧ結合能は、吸着体表面に呈示（露出）しているプロテインＡまたはプロテインＧと抗血清アルブミン抗体との量および比率によっても変化する。したがって、試料中の血清アルブミンとＩｇＧを効率よく除去するためには、試料の種類に応じて前記リガンドの量および比率を適宜選択すればよい。例えば、吸着体の製造原料であるプロテインＡを固定化した不溶性担体として、上記市販のｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（プロテインＡの結合量：６ｍｇプロテインＡ／ｍｌ膨潤ゲル）を用いる場合には、膨潤ゲル０．１ｍｌに対し、アフィニティー精製された抗血清アルブミン抗体を２〜４ｍｇ用いるのが好ましく、２〜３ｍｇを用いるのがより好ましく、２．４〜２．８ｍｇを用いるのが最も好ましい。抗血清アルブミン抗体を過剰に用いると、不溶性担体に結合しているプロテインＡの殆どが抗体と結合して、ＩｇＧ結合能が失われるので、好ましくない。また、抗血清アルブミン抗体の量が少なすぎると、血清アルブミン結合能が弱くなり、やはり好ましくない。通常、吸着体の表面に呈示しているプロテインＡまたはプロテインＧと抗血清アルブミン抗体との比率（モル比率）は、１：１から３：４であるのが最も好ましい。
【００２７】
かくして得られる本発明の吸着体、すなわちプロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつ抗血清アルブミン抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合してなる吸着体は、これを図式化すると図１−ａに示す通りである。
【００２８】
一方、プロテインＡまたはプロテインＧ、および抗血清アルブミン抗体が不溶性担体に直接結合してなる吸着体は、先ず抗血清アルブミン抗体を不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）に結合させたのち、プロテインＡまたはプロテインＧを該不溶性担体に結合させることにより製造できる。あるいは逆の手順でもよい。また、各リガンドを適切な比率で混合した後同時に不溶性担体に結合させることも可能である。この場合の各リガンドの好ましい比率は上記に従う。かくして得られる吸着体を図式化すると、図１−ｂの通りである。
【００２９】
なお、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体には、プロテインＡまたはプロテインＧのみが不溶性担体に結合した吸着体（図１−ｃ）、ＩｇＧ以外の既知血中高含有タンパク質に対する抗体のみが結合した吸着体（図１−ｄ）、あるいはＩｇＧ以外の既知血中タンパク質に対する抗体のみが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合してなる吸着体（図１−ｅ）が混在していても差し支えない。
【００３０】
（保存条件）
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体およびプロテインＡ（またはプロテインＧ）を固定化した吸着体は、適当な静菌剤を添加した緩衝液中で４〜８℃にて保存することが望ましい。緩衝液は使用する試料によっても異なるが、ヒト血清を用いる場合、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略す）であることが好ましい。静菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウムやマーチオレートが挙げられる。保存の一例を挙げれば、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳにて保存することが好ましい。吸着体を試料と反応させる前に、吸着体ゲルを適切な緩衝液で置換して使用してもよいし、そのまま使用してもよい。
【００３１】
本発明の他の態様は、上記で得られたアフィニティークロマトグラフィー用吸着体に、試料を接触させて、該試料中に含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に除去することからなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法である。
【００３２】
（試料の選択および量）
除去するべきＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質は、典型的に他の微量タンパク質および／または生体分子を伴う試料中に存在する。当該試料としては、血液および血液に由来する加工・精製物（血漿、血清を含む）、血清を含む細胞培養液で培養した細胞、その他血液成分を含む溶液などが挙げられる。
【００３３】
本発明の方法で一度に除去できるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の量は、上記吸着体の作成法、あるいは使用する試料の種類、量、ＩｇＧとＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の含有率などによって異なる。また、使用する試料によっては、希釈が必要となることがある。例えば、正常ヒト血清からＩｇＧおよび血清アルブミンを除去する場合、適当な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）を用いて２〜５倍程度に希釈してから、本発明の方法に供するのが好ましい。この際、上記手順にて作製した吸着体保存液から緩衝液をなるだけ除去したのちに、希釈した試料に添加することが望ましい。また、吸着体保存液中の緩衝液を除去せず、試料を希釈なしでこれに添加してもよい。この場合も試料が正常ヒト血清である場合には試料と緩衝液の比率が１：２〜５であることが好ましい。
【００３４】
（カラムの選択）
クロマトグラフィーの手法としてはバッチ法により、上記吸着体に試料液を接触させ、試料に含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を吸着させたのちに非吸着成分を含む溶液を遠心分離などの方法で回収する。上記方法により作成した吸着体がゲル状である場合、カラムに充填してから使用するのが好ましい。カラムの材質は、ガラス製、プラスチック製、ステンレス製などが挙げられるが、ガラス製またはプラスチック製が好ましい。カラムの容量について特に制限はないが、使用する吸着体の量に応じて選択することが望ましい。少量の試料を処理する際には、マイクロチューブにセットできるタイプのスピンカラムの使用が好ましい。試料を吸着体と混合後、カラムにて両者を分離する前に１０〜３０分程度時間をおくことが好ましく、この間この混合体を５分に１回程度振とう混合することがより好ましく、両者の混合後分離までの間振とうを続けることがもっとも好ましい。
【００３５】
試料と吸着体の混合物から非吸着成分を含む溶液を分離後、さらに吸着体を適切な緩衝液と接触させたのち分離した溶液も素通り溶液とあわせて利用することが好ましい。ここで用いる緩衝液は試料の希釈に用いた物と同じ組成であることが望ましい。
【００３６】
（処理試料の用途）
上記方法で作製した吸着体による血液由来試料のアフィニティークロマトグラフィーで、吸着体と結合せず素通りした試料溶液からは、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の両者が除去されている。使用した吸着体と等容量の緩衝液で吸着体を洗浄することにより、非吸着成分を効率よく回収することができる。このクロマトグラフィー後回収物は、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）や二次元電気泳動をはじめとする電気泳動に供することができる。血液由来試料の上記吸着体を用いたクロマトグラフィーによって、試料溶液中のタンパク質全体の濃度は減少するが除去したＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量たんぱく質を除く他のタンパク質の含量はほとんど変化しない。このため、同じ重量のタンパク質を含む試料溶液を電気泳動に供すれば、より微量のタンパク質を検出することが可能となる。また、１０％トリクロロ酢酸や５倍容量の冷アセトンで処理サンプルのタンパク質を沈澱させることにより濃縮することも可能である。
【００３７】
また、上記試料の上記吸着体によるクロマトグラフィーは、微量タンパク質の精製手段として位置づけることも可能である。例えば、このクロマトグラフィー後回収物をそのまま、あるいは適切な緩衝液で希釈あるいは置換したのちに、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーに供して、微量タンパク質を精製することができる。
さらに、上記吸着体の利用は血液サンプルを用いる臨床検査にも有用である。ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の任意の既知血中高含量タンパク質を除去することで、微量タンパク質の動向を観察することが容易になる。
【００３８】
本発明の更に他の態様は、上記で得られたアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなる、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質除去用キットである。該キットは、通常、該吸着体およびカラムの外に、吸着体を平衡化するための緩衝液、試料希釈液などを含んでいてもよい。カラムは、ガラス製、プラスチック製、ステンレス製などが挙げられる。緩衝液としては、適用する試料によっても異なるが、例えばＰＢＳが好適に挙げられる。
【００３９】
以下本発明の実施例をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、吸着体の血清アルブミン結合能およびＩｇＧ結合能を調節するために、本発明の吸着体は、吸着体表面にプロテインＡ（またはプロテインＧ）のみが呈示（露出）している吸着体あるいは吸着体表面に血清アルブミン抗体のみが呈示（露出）している吸着体と混合使用することもできる。
【実施例１】
【００４０】
（抗血清アルブミン抗体結合プロテインＡゲルの作製法およびヒト血清の処理条件）
［１−１：プロテインAゲルと抗血清アルブミン抗体の比率の検討］
予めＰＢＳにて置換した５０μｌのｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下プロテインＡゲルと称する。）に対し、抗血清アルブミン抗体（抗ヒトアルブミンウサギ免疫グロブリンＧ溶液［株式会社医学生物学研究所］、濃度：２９．８ｍｇ／ｍｌ、力価：４．５ｍｇ／ｍｌ；以下抗アルブミン抗体溶液という）を３０、４０、５０、６０μｌずつ適用し、室温にて１時間攪拌反応させた。その後遠心（２５０×ｇ、３分間）にてゲルと溶液を分離し、上清の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供した。その結果、５０μｌのプロテインＡゲルに対し、５０μｌ以上の抗アルブミン抗体溶液を適用したものでは、未反応の抗体が多く検出された（図２）。このことから、５０μｌのプロテインＡゲルに対し、適当な抗アルブミン抗体溶液の量は４０μｌであると判断した。
【００４１】
［１−２：架橋試薬の濃度検討］
プロテインＡゲルと抗アルブミン抗体溶液を５対４の容量比率で混ぜ、室温にて１時間攪拌反応させた後、０．１５、１．５、１５、７５、１５０、３００、４５０ｍＭのＤＭＰ（ジメチルピメリミデート）溶液（０．２Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ８．３）をそれぞれプロテインＡゲルと等量加え、室温にて１時間攪拌し架橋反応させた。それぞれのＤＭＰ濃度で架橋反応させた抗体結合プロテインＡゲルの一部を、電気泳動用試料緩衝液に加え、９５℃で５分間加熱した後、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、１５ｍＭ以下のＤＭＰで架橋させた抗体結合プロテインＡゲルスラリーの上清からは未架橋の抗体が多く検出された（図３）。この結果から、１５ｍＭ以下のＤＭＰでは架橋反応が不完全であり、より完全な架橋反応には７５ｍＭ以上のＤＭＰが必要であることがわかった。
【００４２】
また、各々の濃度のＤＭＰで架橋反応させた抗体結合プロテインＡゲルを２００μｌとり、３０倍量の洗浄液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で洗浄し、更に３０倍量のＰＢＳで洗浄した。液を完全に除いた抗体結合プロテインＡゲルに５０μｌのＰＢＳと１５μｌのヒト血清を加え、室温にて３０分静置した（この間５分毎に攪拌した）。その後、ゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作（２５０×ｇ、３分間）にて非吸着画分を回収した。さらに２００μｌのＰＢＳをカラムに加えてゲルを洗浄し、遠心操作にて洗液を回収して最初に流出した非吸着画分に加えて混合し、この混合液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図４）。この結果から、１５０ｍＭ以下のＤＭＰ濃度で架橋させた抗体結合プロテインＡゲルでは血清アルブミンを十分除去できていないことがわかり、このことから、架橋反応に使用するＤＭＰ濃度は３００ｍＭが適していると判断した。
【００４３】
［１−３：未架橋抗体の洗浄条件の検討］
３００ｍＭのＤＭＰにて架橋させた抗体結合プロテインＡゲルを１０倍量の洗浄液で洗浄し、これを１０回繰り返した。洗浄回数毎の洗浄液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、未架橋抗体の流出状態を確認した（図５）。この結果から、５回以上の洗浄で未架橋の抗体は十分に除去できることがわかり、架橋させた抗体結合プロテインＡゲルの５０倍量の洗浄液で洗浄すれば、未架橋の抗体は取り除けると判断した。
【００４４】
［１−４：ヒト血清試料を用いた処理条件の検討］
蓋付きチューブに、２００μｌの抗体結合プロテインＡゲルと、５０μｌのＰＢＳを加え、さらに１０、１５、２０μｌのヒト血清をそれぞれ加えた。これらのチューブを室温にて３０分静置した（この間５分毎に攪拌した）。その後、チューブ内のゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作にて溶液を回収した（回収液１）。さらに２００μｌのＰＢＳをそれぞれの抗体結合プロテインＡゲルに加え、遠心操作にて溶液を回収し（回収液２）、カラム処理サンプル（回収液１＋２）とした。それぞれのカラム処理サンプルの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、２０μｌの血清を適用したものでは、残存する血清アルブミンが多かった（図６）。このことから、２００μｌの抗体結合プロテインＡに適用できるヒト血清量は１５μｌ以下であると判断した。
【００４５】
以上の検討の結果、最適な抗血清アルブミン抗体結合プロテインＡゲルの作成法を以下のように決定した。
まず、プロテインＡゲル２００μｌに対し抗アルブミン抗体溶液１６０μｌを適用し、室温にて１時間撹拌反応させた。その後、ゲルと等量の３００ｍＭ ＤＭＰ溶液をこのゲルに加え、室温にて１時間撹拌反応させた。次に、ＤＭＰ架橋後のゲルを１０倍量の洗浄液で１０回洗浄した。さらに１０倍量の０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳにて３回洗浄した後、ゲルの０．２５倍量の０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを加えた。このように作成した抗血清アルブミン結合プロテインＡゲルスラリーを２５０μｌ取り、蓋付きチューブに移した。これに１５μｌのヒト血清を添加し、これらのチューブを室温にて３０分静置した（この間５分毎に撹拌した）。その後、チューブ内のゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作にて溶液を回収した（回収液１）。さらに２００μｌのＰＢＳを血清処理後の抗体結合プロテインＡゲルに加え、遠心操作にて溶液を回収し（回収液２）、カラム処理後の試料（回収液１＋２）とした。
以降の実施例は、上記手順で作製したゲルを用いて試料の処理を行った。
【実施例２】
【００４６】
（シバクロンブルーおよびプロテインＡを用いた手法との血清アルブミン、ＩｇＧ除去効率の比較）
［２−１：タンパク定量］
実施例１で決定した手順に従い作製した本発明のゲル（以下、本発明のゲルという）を用い、実施例１で決定した操作手順に従ってヒト血清を処理し、処理前および処理後の試料に含まれる総タンパク質量を定量した。操作はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）の説明書に従い、分光光度計（Ｕ−ｂｅｓｔ ３０；日本分光）にて５６２ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その結果、処理前ヒト血清１５μｌ中の総タンパク質量１０８７μｇに対して、処理後の血清試料（ｎ＝４）２６５μｌ中には２４０．８±３４．１μｇであった。すなわち、本発明のゲルを用いることによって、血清試料中の総タンパク質量は２２．２±３．１％に減少（７７．８％の除去率）することがわかった。
【００４７】
また、従来技術としてシバクロンブルーＦ３ＧＡ固定化アガロースゲルとプロテインＡ固定化アガロースゲルを混合したアフィニティークロマトグラフィーキットが市販されている（ＢＩＯ−ＲＡＤ社「Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」非特許文献２）。このキットを用いて、該キットに添付の操作方法に従って正常ヒト血清を処理した（以下、この処理をシバクロンブルー使用キットによる処理という）。
【００４８】
さらに上記と同様にこのキットから回収した溶液に含まれる総タンパク質量を定量した。その結果、処理前ヒト血清５０μｌ中の総タンパク質量３６２２μｇに対して、シバクロンブルー使用キットによる処理後の血清サンプル４００μｌ中には９４２．４μｇであった。
すなわち、上記シバクロンブルー使用キットを用いた処理によって、血清試料中の総タンパク質量は２６．０％に減少する（除去率は７４．０％となる）ことがわかった。これは本発明のゲルを用いた際の除去率よりもやや低い値であった。
【００４９】
［２−２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
本発明のゲルとシバクロンブルー使用キットからそれぞれ回収した溶出液および処理前正常ヒト血清のそれぞれを一部取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図７）。
【００５０】
その結果、シバクロンブルー使用キットによる処理（図７ではシバクロンブルーと表示されたレーン）では、本発明のゲルによる処理（図７では、抗血清アルブミン抗体と表示されたレーン）に比べ、血清アルブミン、ＩｇＧ共に素通り画分への溶出量が多く、除去効率が悪いことがわかった。さらに、シバクロンブルー使用キットによる処理後サンプルでは、分子量１１６ｋＤａに位置するバンドが消失していることも確認された。
【００５１】
［２−３ 二次元電気泳動］
さらに、各カラム処理後サンプルを二次元電気泳動に供し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）染色を行った。泳動には処理前正常ヒト血清あるいは各カラム処理後回収液、それぞれ５μｇのタンパク質量のサンプルを用いた。各サンプルを５０ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（９Ｍ ＵＲＥＡ、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ２％ ２−メルカプトエタノール、０．７２％ ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ３〜１０）、２０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）にて変性、溶解したのち、サンプルバッファー［８Ｍ ＵＲＥＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％ ２−メルカプトエタノール、０．７２％ ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ ３〜１０；アマシャムバイオサイエンス）］で１００μｌに希釈してから泳動に供した。一次元目はＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐｓ ｐＨ３〜１０、７ｃｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、二次元目には１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用した。
【００５２】
図８は正常ヒト血清（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面であり、図９は本発明のゲルによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面であり、図１０はシバクロンブルー使用キットによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。これらの図面で、血清アルブミンスポット、ＩｇＧ Ｈ鎖の一部スポットを含む部分については細枠四角で囲み、部分拡大画像も載せた。図９中の丸で囲んだ部分はクロマト前ヒト血清試料泳動時には検出できなかったスポット、図１０中の太枠四角で囲んだ部分はクロマト前ヒト血清試料泳動時には検出できていたスポットの位置を示す。図に記載している血清アルブミンおよびＩｇＧスポットの位置についてはＳＷＩＳＳ−２ＤＰＡＧＥデータベース（ＵＲＬ／http://kr.expasy.org/ch2d/）を参考にした。
【００５３】
これらの結果から、本発明のゲルによる処理で、血清アルブミン、ＩｇＧのスポットが著しく減少していること、このため泳動タンパク質量を増やすことができ、血清中に存在する血清アルブミン、ＩｇＧと近接する位置にあったスポットの検出が容易となっていることが確認できた。また、染色強度が減少したスポットはみられなかった。
一方、シバクロンブルー使用キットによる処理では、本発明のゲルによる処理と比べ血清アルブミンおよびＩｇＧの除去効率が悪いことに加えて、染色強度が減少あるいは消滅したスポットが複数個確認された。
【００５４】
ＳＷＩＳＳ−２ＤＰＡＧＥデータベースからこれらのスポットタンパク質を推定したところ、本発明のゲルにより検出可能あるいは増大したスポットとしてＩｇＤ、ＩｇＭ、Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＤが挙げられた。その他未同定のスポットも多数検出された。一方、シバクロンブルー使用キットを用いた処理で減少したスポットはプラスミノーゲン、ＡｐｏＪ、ＡｐｏＥ、α２−Ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎであると見られる。さらに、複数個の未同定スポットが減少あるいは消失していた。
【実施例３】
【００５５】
（ＰＭＦ（ペプチドマスフィンガープリンティング）解析）
本発明のゲルを用い、処理後および処理前の血清（タンパク質量１．５μｇ）を還元アルキル化処理したのちにそれぞれの溶液を０．５μｇのトリプシンにて酵素消化（３５℃、一晩静置）し、脱塩濃縮処理を行った後、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量分析装置（Voyager-DE STR: Applied Biosystems社）にてＰＭＦ分析を行った（図１１）。
【００５６】
その結果、処理前のヒト血清は、血清アルブミンの量が多い為、検出されたペプチドシグナルの上位２０個中血清アルブミンのシグナルが１７個（８５％）を占め、血清アルブミン以外のシグナルが３個（１５％）しか検出されないのに対して、本発明のゲルを用いた処理後の血清からは血清アルブミンのシグナルが７個（３５％）に減り、血清アルブミン以外のシグナルが１３個（６５％）に増えた。このように本発明のゲルを用いて血清を処理することにより、ＰＭＦ分析において血清アルブミンおよびＩｇＧ以外のタンパク質が検出され易くなることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を使用することによって、血液中に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質を簡便な操作で同時にかつ選択的に除去でき、このことによって、血液成分を構成する微量タンパク質を容易に検出、精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１−（ａ）および（ｂ）は本発明に係る吸着体の模式図であり、図１−（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は本発明に係る吸着体に混在していてもよい吸着体の模式図である。
【図２】プロテインＡと反応させる抗アルブミン抗体溶液の液量を検討した結果であり、反応後上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＣＢＢ染色により抗体タンパク質を検出したときの写真図面である。
【図３】プロテインＡと抗体との架橋反応におけるＤＭＰ濃度を検討した結果であり、反応後のゲルスラリー中に含まれる未架橋の抗体量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図４】プロテインＡと抗体との架橋反応におけるＤＭＰ濃度を検討した結果であり、架橋反応後抗体結合プロテインＡゲルによる血清アルブミンおよびＩｇＧ除去能力をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図５】架橋反応後抗体結合プロテインＡゲルからの未架橋抗体の洗浄条件を検討した結果であり、架橋反応後の洗浄毎に洗浄液を採取し、各洗浄液中に含まれる未架橋の抗体量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図６】２００μｌの本発明のゲルによる、ヒト血清の処理可能量を検討した結果であり、処理後の回収試料中に残存する血清アルブミンおよびＩｇＧの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図７】従来技術のカラムによる処理結果と本発明のゲルによる処理結果とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図８】正常ヒト血清（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図９】本発明のゲルによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図１０】シバクロンブルー使用キットによる処理液（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図１１】ヒト血清を本発明のゲルで処理した溶液（ｂ）と、未処理の溶液（ａ）とを、還元アルキル化後に酵素消化し、ＰＭＦ分析した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１ 不溶性担体
２ プロテインＡまたはプロテインＧ
３ 抗血清アルブミン抗体
Ｍ アプロサイエンス社分子量マーカー（ブロードレンジ）のレーン
Ａ 架橋反応後の反応液を泳動させたレーン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清などの血液由来試料に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質（例えば、血清アルブミン）を一回の処理で同時に吸着し、他の微量タンパク質と分離するためのアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、該吸着体を用いるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法、ならびに該吸着体を含んで成るＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病気に特有の微量物質を見出し、該微量物質を検出することにより病気の診断に役立てようとする試みが種々行われている。また、かかる微量物質（マーカー）を見出すために、或いは微量物質を検出するために、血液、血漿、血清などの血液由来試料が利用される場合が多い。
しかしながら、上記のような血液由来試料には、血清アルブミン、ＩｇＧ、ＩｇＡ，アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビンなどのタンパク質が一般に全タンパク質の２％から６０％の高含有率で含まれており、これらの総和の含有率は８０％から９０％に達する。血液由来試料中に微量しか存在しない他のタンパク質を検出・分析する際には、前記のような既知血中高含量タンパク質の存在が障害となる場合が多い。例えば、二次元ゲル電気泳動または質量分析によるタンパク質成分分析において、血清アルブミンやＩｇＧは他のタンパク質の検出を著しく妨害する。そのため、この様な分析に際しては血清アルブミンやＩｇＧを、好ましくはさらにＩｇＡ，アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビンなどの既知血中高含量タンパク質を予め除去することが極めて望ましい。また、血液由来試料から微量物質を精製するに際しても、まず該試料から高含量で含まれる既知タンパク質を予め除去することは、続く精製過程を効率よく進めるために好ましい。
【０００３】
特定のタンパク質を精製あるいは除去する手段として、アフィニティークロマトグラフィーがよく利用される。アフィニティークロマトグラフィーでは、目的物質に対する抗体や目的物質と親和性のある物質（リガンド）を不溶性担体に固定しておき、目的物質をこのリガンドに特異的に吸着させることで、目的物質を夾雑物から分離する。また、吸着された目的物は、リガンドとの親和性を下げることにより溶出され、これを回収することで、精製を行うことが可能である。
【０００４】
プロテインＡはブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来のタンパク質であり、様々な動物由来のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合する性質を持っており、血清、細胞培養上清、腹水等からのＩｇＧ精製に広く利用されている。また、プロテインＧは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のタンパク質であり、広い範囲の動物由来のＩｇＧと特異的に結合するため、プロテインＡと同様にＩｇＧの分離精製に利用されている。このため、プロテインＡまたはプロテインＧを不溶性担体に固定化させ、この担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧを特異的に分離精製する手法が広く知られている。[Ｋｒｏｎｖａｌｌ，Ｇ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１０４，ｐ１４０−１４７，１９７０年、Ｂｊｏｕｒｃｋ，Ｌ．ｅｔ ａｌ；Ｊ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３，ｐ９６９−９７４，１９８４年]
また、シバクロンブルーは、血清アルブミンを結合する物質として知られており、これをリガンドとしたアフィニティークロマトグラフィーによって血清アルブミンを精製あるいは除去する方法が知られている［Ｇｉａｎａｚｚａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１，ｐ１２９−１３６，１９８２年］。
【０００５】
従来の技術によれば、アフィニティークロマトグラフィーの手法を利用して血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清などの血液由来試料からＩｇＧおよび血清アルブミンをはじめとする高含有率既知タンパク質を除去するためには、除去したいタンパク質それぞれに特異的親和性のあるリガンドを準備し、各リガンドを不溶性単体に固定化した吸着体を用いて除去したいタンパク質を一種類ずつ除去しなくてはならない。例えば、血液由来試料から最も含有率が高い既知タンパク質である血清アルブミンとＩｇＧを除去するためには、まず、プロテインＡあるいはプロテインＧが不溶性担体に固定化された吸着体を用いて、試料中のＩｇＧを除去し、ついでシバクロンブルーが不溶性担体に固定化された吸着体を用いて、試料中のアルブミンを除去することが考えられる。しかしながら、この方法は、吸着操作を少なくとも２回行わなければならず、また時間もかかるため、除去の過程でロスあるいは失活が起こり、目的とする微量タンパク質の検出あるいは回収が効率的に実施できないという難点があった。
【０００６】
この難点を克服するために、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する方法が提案され、実用化されている。例えば、非特許文献１には、抗血清アルブミン抗体を不溶性担体に固定化させた吸着体と抗ＩｇＧ抗体を不溶性担体に固定化させた吸着体の２種類の吸着体を用いる方法が開示されており、かかる吸着体を含むキットがアマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社から、“Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ”の商品名で発売されている。また、非特許文献２には、シバクロンブルーが不溶性担体に固定化された吸着体とプロテインＡが固定化された吸着体の２種類の吸着体を用いる方法が記載されており、かかる吸着体を含むキットがバイオ・ラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社から、“Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ”の商品名で発売されている。さらに、特許文献１には、ビオチン化した抗血清アルブミン抗体−アビジン−マトリックスからなる吸着体とビオチン化したプロテインＡ−アビジンーマトリックスからなる吸着体の２種の吸着体を用いる方法が記載されている。
【０００７】
上記の３つの方法は、血清アルブミンおよびＩｇＧを高除去率で除去できる点で優れた方法であるが、非特許文献１の方法は、吸着体の調製に２種類の抗体（すなわち、抗血清アルブミン抗体と抗ＩｇＧ抗体）を用意しなければならないといった問題があった。また、非特許文献２の方法に用いられているシバクロンブルーは血清アルブミン以外のタンパク質、例えば血液凝固因子、インターフェロン等とも結合するため、特異性に欠けるという欠点があった。さらに特許文献１の方法は抗体やプロテインＡをビオチン化する必要があるだけでなく、不溶性担体を使用していないのでこれらの吸着体をさらにアビジンと結合させ、血清アルブミンおよびIｇＧを結合させた後遠心分離して上清を分離する必要があるなど、操作が煩雑であるという欠点があった。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６４１０６９２号明細書
【非特許文献１】ライフ サイエンス ニュース（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ）、２００３年秋号（９月発行）、アマシャム バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
【非特許文献２】プロテオミックス（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、２００３、３、１９８０−１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、多種類のタンパク質を含む血液由来試料からＩｇＧおよびＩｇＧ以外の他の既知血中高含有量タンパク質を簡便な操作で、しかも選択的にかつ同時に除去できるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を提供することである。また、本発明の他の目的は、このアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を用いたＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法を提供することである。更に、本発明の他の目的は、上記アフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム、あるいは該吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、血液由来試料から簡便な操作でＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知高含量タンパク質を同時にかつ選択的に除去する方法について種々研究を重ねた結果、プロテインＡまたはプロテインＧと、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体の両者を吸着体の表面に呈示するように固定化した吸着体の創生に成功し、この吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用することで上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、
（１） プロテインＡまたはプロテインＧとＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体とが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（２） プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合していることを特徴とする前記（１）記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（３） プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合していることを特徴とする前記（１）記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（４） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（５） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（６） 不溶性担体が膜状である前記（１）〜（５）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、
（７） 請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を血液由来試料と接触させて該試料中のＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に該吸着体に吸着させることを特徴とするＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法、
（８） 試料が、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清である前記（７）記載の同時除去方法、
（９） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである前記（７）記載の同時除去方法、
（１０） ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである前記（７）記載の同時除去方法、
（１１） 前記（１）〜（６）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム、および
（１２） 前記（１）のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の吸着体を使用することによって、血液中に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質（血清アルブミンなど）を簡便な操作で同時にかつ選択的に除去できる。このことによって、血液成分を構成する微量タンパク質の検出、精製が容易となる。さらに、ＩｇＧ以外の既知タンパク質が血清アルブミンのみである場合（すなわち、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する場合）にも２種類の抗体を使用する必要がないため、吸着体の調製が容易である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体は、プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が吸着体表面に呈示（露出）するように不溶性担体に結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体である。このような吸着体としては、（１）プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合しているアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、（２）プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体などがあげられる。
【００１３】
本発明において“既知血中高含量タンパク質”とは、血中に本来含まれている全タンパク質に対して２質量％以上の含有量である既知の血中タンパク質（ＩｇＧ、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等）をいい、人為的な要因から血清などの血液由来試料に混入することがあるケラチンやヘモグロビンも包含される。
【００１４】
プロテインＡまたはプロテインＧに加えて、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質（例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等）に対する抗体を使用することで、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に除去する吸着体を作成できる。例えば、以下に説明する様に、プロテインＡまたはプロテインＧおよび抗血清アルブミン抗体が吸着体表面に呈示（露出）するように不溶性担体に結合してなるアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を作成することで、血清アルブミンとＩｇＧとを同時に除去する吸着体を作成できる。以下に、抗体が血清アルブミン抗体である場合の吸着体の製造について説明するが、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が血清アルブミン抗体以外の抗体（トランスフェリン、ＩｇＡ，ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン等に対する抗体）の場合も、血清アルブミン抗体の場合と同様にして目的の吸着体を作製することができる。また、しばしば人為的な要因から血清等に混入する場合があるケラチンやヘモグロビンを除去する場合にも、これらに対する抗体を用いることで、同様の目的が達成できることは言うまでもない。
【００１５】
（血清アルブミン結合リガンド）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体の構成成分たりうる抗血清アルブミン抗体は、特に制限されないが、試料から除去したい血清アルブミンの由来である動物種と同一種の血清アルブミンに対する抗体であるのが望ましい。例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む培地でヒトの細胞を培養し、この培地に含まれるタンパク質を分析したい場合には、ウシの血清アルブミンおよびＩｇＧを除去することになるので、このときはウシの血清アルブミンに対する抗体を使用することが好ましい。ただし、当該抗体が試料の動物種と親和性のあるものならば、必ずしも同一の動物種のものである必要はない。
【００１６】
また、本発明にかかる抗血清アルブミン抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
【００１７】
かかる抗血清アルブミン抗体は、種々の業者から販売されている抗体を用いてよく、また、試料の起源となる動物種に由来する血清アルブミンまたは血清アルブミンの部分ペプチドを抗原として用い、公知の抗体製造方法に従って製造することもできる。
【００１８】
具体的には、本発明に係る抗血清アルブミン抗体は、例えば、「蛋白質・酵素の基礎実験法 改訂第２版（堀尾武一編集 南江堂発行 １９９４年）」または「Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８２ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ、ＩＮＣ．１９９０」などに記載の方法に従って作製することができる。
【００１９】
（ＩｇＧ結合リガンド）
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体の構成成分であるプロテインＡまたはプロテインＧは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来のプロテインＡあるいは連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来のプロテインＧが挙げられる。これらは様々な動物種のＩｇＧのＦｃ領域と結合することが知られており、プロテインＡとプロテインＧのいずれを選択するかについては、除去したいＩｇＧの由来となる動物種によって適宜選択することができる。ヒト、イヌ、ウサギ、ブタ由来のＩｇＧはプロテインＡと高い結合を示すが、ラット、ウマ、ヒツジ、ヤギ等のＩｇＧではプロテインＧに対してより結合性が高い。該プロテインＡまたはプロテインＧは上記した各々の菌を培養し、公知の方法を用いて単離精製することによって得られる。あるいは遺伝子組み換えによるタンパク質の発現方法により得ることができる。遺伝子組み換え技術によりプロテインＡあるいはプロテインＧを生成する方法は、該技術分野において十分に確立されているので、常法に従ってよい。
【００２０】
（不溶性担体の選択およびプロテインＡまたはプロテインＧの結合）
本発明におけるアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体としては、プロテインＡまたはプロテインＧを固定化できる、水に不溶性のものであればいずれも使用してよい。例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、シリカゲルおよび多孔性ガラスなどが挙げられる。
【００２１】
抗体およびプロテインＡまたはプロテインＧをリガンドとして不溶性担体に固定化させる方法は公知のものを用いてよい。例えば、上記リガンドに存在するアミノ基またはカルボキシル基、チオール基、水酸基等を介してゲルとリガンドを結合させる方法がよく知られている。ブロモシアン、ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、Ｎ−ヒドロキシスクシイミド等が典型的な架橋剤となる。例としては、アガロースを架橋剤（例えば、ブロモシアン）で処理し、これとリガンドのアミノ基を結合させることができる。
【００２２】
不溶性担体とリガンドの間には、スペーサーを介在させることができる。上記架橋剤で処理しスペーサーを付加した状態の不溶性担体が各社から市販されており、それらを用いることでリガンド固定化の操作が簡略化できる。リガンド固定化の手順は使用する架橋剤によって異なる。
【００２３】
本発明に用いられる不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）は、各社から市販されており、市販品の例をあげれば、アマシャム バイオサイエンス社製のセファロース２Ｂ、セファロース４Ｂ、セファロース６Ｂ、ＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ、ＡＨ−セファロース、ＣＨ−セファロース、エポキシ−活性化セファロース６Ｂなど、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｃｅｌｌｅｘ、アミノエチル−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ＣＭ、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ１５、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅ１０など、和光純薬工業株式会社製のクロマゲルＡ、クロマゲルＰ、エンザフィックスＰ−ＨＺなど、セルバ（ＳＥＲＶＡ）社製のＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロース、ＰＡＢセルロースなどが挙げられる。
また、本発明に用いられる不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）の形状は、特に限定されず、粒状であっても、膜状であってもよい。
【００２４】
各リガンドを不溶性担体に結合させる手順としては、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体とを同時に各種架橋剤処理をした不溶性担体と反応させる方法も可能ではあるが、好ましくは、最初にプロテインＡあるいはプロテインＧを架橋剤処理した不溶性担体と反応させ、固定化する。その後固定化プロテインＡあるいはプロテインＧに抗体を作用させて固定化する手順を用いる。このとき、プロテインＡまたはプロテインＧと抗体のＦｃ領域が特異的に結合するので、該抗体の抗原結合活性の損失を低く抑えることができる。さらに、抗体のプロテインＡからの漏出を防ぐためにプロテインＡまたはプロテインＧと抗体を結合後、両者をジメチルピメリミデート等の二価性架橋試薬で化学的に架橋してもよい。
【００２５】
なお、プロテインＡを固定化した不溶性担体も市販されており、例えば、アマシャム バイオサイエンス社から、商品名
“ｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル”として市販されている。さらに、抗血清アルブミン抗体についても市販された物があり、例として、株式会社 医学生物学研究所から
“抗ヒトアルブミン” の商品名で市販されている。本発明においては、このような市販の不溶性担体に上記方法で市販の抗血清アルブミン抗体を結合させることも可能である。
【００２６】
本発明の吸着体の血清アルブミン結合能およびＩｇＧ結合能は、吸着体表面に呈示（露出）しているプロテインＡまたはプロテインＧと抗血清アルブミン抗体との量および比率によっても変化する。したがって、試料中の血清アルブミンとＩｇＧを効率よく除去するためには、試料の種類に応じて前記リガンドの量および比率を適宜選択すればよい。例えば、吸着体の製造原料であるプロテインＡを固定化した不溶性担体として、上記市販のｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（プロテインＡの結合量：６ｍｇプロテインＡ／ｍｌ膨潤ゲル）を用いる場合には、膨潤ゲル０．１ｍｌに対し、アフィニティー精製された抗血清アルブミン抗体を２〜４ｍｇ用いるのが好ましく、２〜３ｍｇを用いるのがより好ましく、２．４〜２．８ｍｇを用いるのが最も好ましい。抗血清アルブミン抗体を過剰に用いると、不溶性担体に結合しているプロテインＡの殆どが抗体と結合して、ＩｇＧ結合能が失われるので、好ましくない。また、抗血清アルブミン抗体の量が少なすぎると、血清アルブミン結合能が弱くなり、やはり好ましくない。通常、吸着体の表面に呈示しているプロテインＡまたはプロテインＧと抗血清アルブミン抗体との比率（モル比率）は、１：１から３：４であるのが最も好ましい。
【００２７】
かくして得られる本発明の吸着体、すなわちプロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつ抗血清アルブミン抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合してなる吸着体は、これを図式化すると図１−ａに示す通りである。
【００２８】
一方、プロテインＡまたはプロテインＧ、および抗血清アルブミン抗体が不溶性担体に直接結合してなる吸着体は、先ず抗血清アルブミン抗体を不溶性担体（架橋剤で処理したものを含む）に結合させたのち、プロテインＡまたはプロテインＧを該不溶性担体に結合させることにより製造できる。あるいは逆の手順でもよい。また、各リガンドを適切な比率で混合した後同時に不溶性担体に結合させることも可能である。この場合の各リガンドの好ましい比率は上記に従う。かくして得られる吸着体を図式化すると、図１−ｂの通りである。
【００２９】
なお、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体には、プロテインＡまたはプロテインＧのみが不溶性担体に結合した吸着体（図１−ｃ）、ＩｇＧ以外の既知血中高含有タンパク質に対する抗体のみが結合した吸着体（図１−ｄ）、あるいはＩｇＧ以外の既知血中タンパク質に対する抗体のみが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合してなる吸着体（図１−ｅ）が混在していても差し支えない。
【００３０】
（保存条件）
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体およびプロテインＡ（またはプロテインＧ）を固定化した吸着体は、適当な静菌剤を添加した緩衝液中で４〜８℃にて保存することが望ましい。緩衝液は使用する試料によっても異なるが、ヒト血清を用いる場合、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、ＰＢＳと略す）であることが好ましい。静菌剤としては、例えば、アジ化ナトリウムやマーチオレートが挙げられる。保存の一例を挙げれば、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳにて保存することが好ましい。吸着体を試料と反応させる前に、吸着体ゲルを適切な緩衝液で置換して使用してもよいし、そのまま使用してもよい。
【００３１】
本発明の他の態様は、上記で得られたアフィニティークロマトグラフィー用吸着体に、試料を接触させて、該試料中に含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に除去することからなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法である。
【００３２】
（試料の選択および量）
除去するべきＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質は、典型的に他の微量タンパク質および／または生体分子を伴う試料中に存在する。当該試料としては、血液および血液に由来する加工・精製物（血漿、血清を含む）、血清を含む細胞培養液で培養した細胞、その他血液成分を含む溶液などが挙げられる。
【００３３】
本発明の方法で一度に除去できるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の量は、上記吸着体の作成法、あるいは使用する試料の種類、量、ＩｇＧとＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の含有率などによって異なる。また、使用する試料によっては、希釈が必要となることがある。例えば、正常ヒト血清からＩｇＧおよび血清アルブミンを除去する場合、適当な緩衝液（例えば、ＰＢＳ）を用いて２〜５倍程度に希釈してから、本発明の方法に供するのが好ましい。この際、上記手順にて作製した吸着体保存液から緩衝液をなるだけ除去したのちに、希釈した試料に添加することが望ましい。また、吸着体保存液中の緩衝液を除去せず、試料を希釈なしでこれに添加してもよい。この場合も試料が正常ヒト血清である場合には試料と緩衝液の比率が１：２〜５であることが好ましい。
【００３４】
（カラムの選択）
クロマトグラフィーの手法としてはバッチ法により、上記吸着体に試料液を接触させ、試料に含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を吸着させたのちに非吸着成分を含む溶液を遠心分離などの方法で回収する。上記方法により作成した吸着体がゲル状である場合、カラムに充填してから使用するのが好ましい。カラムの材質は、ガラス製、プラスチック製、ステンレス製などが挙げられるが、ガラス製またはプラスチック製が好ましい。カラムの容量について特に制限はないが、使用する吸着体の量に応じて選択することが望ましい。少量の試料を処理する際には、マイクロチューブにセットできるタイプのスピンカラムの使用が好ましい。試料を吸着体と混合後、カラムにて両者を分離する前に１０〜３０分程度時間をおくことが好ましく、この間この混合体を５分に１回程度振とう混合することがより好ましく、両者の混合後分離までの間振とうを続けることがもっとも好ましい。
【００３５】
試料と吸着体の混合物から非吸着成分を含む溶液を分離後、さらに吸着体を適切な緩衝液と接触させたのち分離した溶液も素通り溶液とあわせて利用することが好ましい。ここで用いる緩衝液は試料の希釈に用いた物と同じ組成であることが望ましい。
【００３６】
（処理試料の用途）
上記方法で作製した吸着体による血液由来試料のアフィニティークロマトグラフィーで、吸着体と結合せず素通りした試料溶液からは、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の両者が除去されている。使用した吸着体と等容量の緩衝液で吸着体を洗浄することにより、非吸着成分を効率よく回収することができる。このクロマトグラフィー後回収物は、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）や二次元電気泳動をはじめとする電気泳動に供することができる。血液由来試料の上記吸着体を用いたクロマトグラフィーによって、試料溶液中のタンパク質全体の濃度は減少するが除去したＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量たんぱく質を除く他のタンパク質の含量はほとんど変化しない。このため、同じ重量のタンパク質を含む試料溶液を電気泳動に供すれば、より微量のタンパク質を検出することが可能となる。また、１０％トリクロロ酢酸や５倍容量の冷アセトンで処理サンプルのタンパク質を沈澱させることにより濃縮することも可能である。
【００３７】
また、上記試料の上記吸着体によるクロマトグラフィーは、微量タンパク質の精製手段として位置づけることも可能である。例えば、このクロマトグラフィー後回収物をそのまま、あるいは適切な緩衝液で希釈あるいは置換したのちに、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィーに供して、微量タンパク質を精製することができる。
さらに、上記吸着体の利用は血液サンプルを用いる臨床検査にも有用である。ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の任意の既知血中高含量タンパク質を除去することで、微量タンパク質の動向を観察することが容易になる。
【００３８】
本発明の更に他の態様は、上記で得られたアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなる、ＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質除去用キットである。該キットは、通常、該吸着体およびカラムの外に、吸着体を平衡化するための緩衝液、試料希釈液などを含んでいてもよい。カラムは、ガラス製、プラスチック製、ステンレス製などが挙げられる。緩衝液としては、適用する試料によっても異なるが、例えばＰＢＳが好適に挙げられる。
【００３９】
以下本発明の実施例をあげて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、吸着体の血清アルブミン結合能およびＩｇＧ結合能を調節するために、本発明の吸着体は、吸着体表面にプロテインＡ（またはプロテインＧ）のみが呈示（露出）している吸着体あるいは吸着体表面に血清アルブミン抗体のみが呈示（露出）している吸着体と混合使用することもできる。
【実施例１】
【００４０】
（抗血清アルブミン抗体結合プロテインＡゲルの作製法およびヒト血清の処理条件）
［１−１：プロテインAゲルと抗血清アルブミン抗体の比率の検討］
予めＰＢＳにて置換した５０μｌのｒプロテインＡ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ社製、以下プロテインＡゲルと称する。）に対し、抗血清アルブミン抗体（抗ヒトアルブミンウサギ免疫グロブリンＧ溶液［株式会社医学生物学研究所］、濃度：２９．８ｍｇ／ｍｌ、力価：４．５ｍｇ／ｍｌ；以下抗アルブミン抗体溶液という）を３０、４０、５０、６０μｌずつ適用し、室温にて１時間攪拌反応させた。その後遠心（２５０×ｇ、３分間）にてゲルと溶液を分離し、上清の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）に供した。その結果、５０μｌのプロテインＡゲルに対し、５０μｌ以上の抗アルブミン抗体溶液を適用したものでは、未反応の抗体が多く検出された（図２）。このことから、５０μｌのプロテインＡゲルに対し、適当な抗アルブミン抗体溶液の量は４０μｌであると判断した。
【００４１】
［１−２：架橋試薬の濃度検討］
プロテインＡゲルと抗アルブミン抗体溶液を５対４の容量比率で混ぜ、室温にて１時間攪拌反応させた後、０．１５、１．５、１５、７５、１５０、３００、４５０ｍＭのＤＭＰ（ジメチルピメリミデート）溶液（０．２Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ８．３）をそれぞれプロテインＡゲルと等量加え、室温にて１時間攪拌し架橋反応させた。それぞれのＤＭＰ濃度で架橋反応させた抗体結合プロテインＡゲルの一部を、電気泳動用試料緩衝液に加え、９５℃で５分間加熱した後、その上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、１５ｍＭ以下のＤＭＰで架橋させた抗体結合プロテインＡゲルスラリーの上清からは未架橋の抗体が多く検出された（図３）。この結果から、１５ｍＭ以下のＤＭＰでは架橋反応が不完全であり、より完全な架橋反応には７５ｍＭ以上のＤＭＰが必要であることがわかった。
【００４２】
また、各々の濃度のＤＭＰで架橋反応させた抗体結合プロテインＡゲルを２００μｌとり、３０倍量の洗浄液（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．８）で洗浄し、更に３０倍量のＰＢＳで洗浄した。液を完全に除いた抗体結合プロテインＡゲルに５０μｌのＰＢＳと１５μｌのヒト血清を加え、室温にて３０分静置した（この間５分毎に攪拌した）。その後、ゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作（２５０×ｇ、３分間）にて非吸着画分を回収した。さらに２００μｌのＰＢＳをカラムに加えてゲルを洗浄し、遠心操作にて洗液を回収して最初に流出した非吸着画分に加えて混合し、この混合液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図４）。この結果から、１５０ｍＭ以下のＤＭＰ濃度で架橋させた抗体結合プロテインＡゲルでは血清アルブミンを十分除去できていないことがわかり、このことから、架橋反応に使用するＤＭＰ濃度は３００ｍＭが適していると判断した。
【００４３】
［１−３：未架橋抗体の洗浄条件の検討］
３００ｍＭのＤＭＰにて架橋させた抗体結合プロテインＡゲルを１０倍量の洗浄液で洗浄し、これを１０回繰り返した。洗浄回数毎の洗浄液の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、未架橋抗体の流出状態を確認した（図５）。この結果から、５回以上の洗浄で未架橋の抗体は十分に除去できることがわかり、架橋させた抗体結合プロテインＡゲルの５０倍量の洗浄液で洗浄すれば、未架橋の抗体は取り除けると判断した。
【００４４】
［１−４：ヒト血清試料を用いた処理条件の検討］
蓋付きチューブに、２００μｌの抗体結合プロテインＡゲルと、５０μｌのＰＢＳを加え、さらに１０、１５、２０μｌのヒト血清をそれぞれ加えた。これらのチューブを室温にて３０分静置した（この間５分毎に攪拌した）。その後、チューブ内のゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作にて溶液を回収した（回収液１）。さらに２００μｌのＰＢＳをそれぞれの抗体結合プロテインＡゲルに加え、遠心操作にて溶液を回収し（回収液２）、カラム処理サンプル（回収液１＋２）とした。それぞれのカラム処理サンプルの一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果、２０μｌの血清を適用したものでは、残存する血清アルブミンが多かった（図６）。このことから、２００μｌの抗体結合プロテインＡに適用できるヒト血清量は１５μｌ以下であると判断した。
【００４５】
以上の検討の結果、最適な抗血清アルブミン抗体結合プロテインＡゲルの作成法を以下のように決定した。
まず、プロテインＡゲル２００μｌに対し抗アルブミン抗体溶液１６０μｌを適用し、室温にて１時間撹拌反応させた。その後、ゲルと等量の３００ｍＭ ＤＭＰ溶液をこのゲルに加え、室温にて１時間撹拌反応させた。次に、ＤＭＰ架橋後のゲルを１０倍量の洗浄液で１０回洗浄した。さらに１０倍量の０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳにて３回洗浄した後、ゲルの０．２５倍量の０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを加えた。このように作成した抗血清アルブミン結合プロテインＡゲルスラリーを２５０μｌ取り、蓋付きチューブに移した。これに１５μｌのヒト血清を添加し、これらのチューブを室温にて３０分静置した（この間５分毎に撹拌した）。その後、チューブ内のゲルスラリーをマイクロバイオスピンカラムに移し、遠心操作にて溶液を回収した（回収液１）。さらに２００μｌのＰＢＳを血清処理後の抗体結合プロテインＡゲルに加え、遠心操作にて溶液を回収し（回収液２）、カラム処理後の試料（回収液１＋２）とした。
以降の実施例は、上記手順で作製したゲルを用いて試料の処理を行った。
【実施例２】
【００４６】
（シバクロンブルーおよびプロテインＡを用いた手法との血清アルブミン、ＩｇＧ除去効率の比較）
［２−１：タンパク定量］
実施例１で決定した手順に従い作製した本発明のゲル（以下、本発明のゲルという）を用い、実施例１で決定した操作手順に従ってヒト血清を処理し、処理前および処理後の試料に含まれる総タンパク質量を定量した。操作はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）の説明書に従い、分光光度計（Ｕ−ｂｅｓｔ ３０；日本分光）にて５６２ｎｍの吸光度を測定することにより行った。その結果、処理前ヒト血清１５μｌ中の総タンパク質量１０８７μｇに対して、処理後の血清試料（ｎ＝４）２６５μｌ中には２４０．８±３４．１μｇであった。すなわち、本発明のゲルを用いることによって、血清試料中の総タンパク質量は２２．２±３．１％に減少（７７．８％の除去率）することがわかった。
【００４７】
また、従来技術としてシバクロンブルーＦ３ＧＡ固定化アガロースゲルとプロテインＡ固定化アガロースゲルを混合したアフィニティークロマトグラフィーキットが市販されている（ＢＩＯ−ＲＡＤ社「Ａｕｒｕｍ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ」非特許文献２）。このキットを用いて、該キットに添付の操作方法に従って正常ヒト血清を処理した（以下、この処理をシバクロンブルー使用キットによる処理という）。
【００４８】
さらに上記と同様にこのキットから回収した溶液に含まれる総タンパク質量を定量した。その結果、処理前ヒト血清５０μｌ中の総タンパク質量３６２２μｇに対して、シバクロンブルー使用キットによる処理後の血清サンプル４００μｌ中には９４２．４μｇであった。
すなわち、上記シバクロンブルー使用キットを用いた処理によって、血清試料中の総タンパク質量は２６．０％に減少する（除去率は７４．０％となる）ことがわかった。これは本発明のゲルを用いた際の除去率よりもやや低い値であった。
【００４９】
［２−２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
本発明のゲルとシバクロンブルー使用キットからそれぞれ回収した溶出液および処理前正常ヒト血清のそれぞれを一部取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図７）。
【００５０】
その結果、シバクロンブルー使用キットによる処理（図７ではシバクロンブルーと表示されたレーン）では、本発明のゲルによる処理（図７では、抗血清アルブミン抗体と表示されたレーン）に比べ、血清アルブミン、ＩｇＧ共に素通り画分への溶出量が多く、除去効率が悪いことがわかった。さらに、シバクロンブルー使用キットによる処理後サンプルでは、分子量１１６ｋＤａに位置するバンドが消失していることも確認された。
【００５１】
［２−３ 二次元電気泳動］
さらに、各カラム処理後サンプルを二次元電気泳動に供し、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）染色を行った。泳動には処理前正常ヒト血清あるいは各カラム処理後回収液、それぞれ５μｇのタンパク質量のサンプルを用いた。各サンプルを５０ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含むｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（９Ｍ ＵＲＥＡ、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、 ２％ ２−メルカプトエタノール、０．７２％ ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ３〜１０）、２０ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）にて変性、溶解したのち、サンプルバッファー［８Ｍ ＵＲＥＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２％ ２−メルカプトエタノール、０．７２％ ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ｐＨ ３〜１０；アマシャムバイオサイエンス）］で１００μｌに希釈してから泳動に供した。一次元目はＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐｓ ｐＨ３〜１０、７ｃｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、二次元目には１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを使用した。
【００５２】
図８は正常ヒト血清（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面であり、図９は本発明のゲルによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面であり、図１０はシバクロンブルー使用キットによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。これらの図面で、血清アルブミンスポット、ＩｇＧ Ｈ鎖の一部スポットを含む部分については細枠四角で囲み、部分拡大画像も載せた。図９中の丸で囲んだ部分はクロマト前ヒト血清試料泳動時には検出できなかったスポット、図１０中の太枠四角で囲んだ部分はクロマト前ヒト血清試料泳動時には検出できていたスポットの位置を示す。図に記載している血清アルブミンおよびＩｇＧスポットの位置についてはＳＷＩＳＳ−２ＤＰＡＧＥデータベース（ＵＲＬ／http://kr.expasy.org/ch2d/）を参考にした。
【００５３】
これらの結果から、本発明のゲルによる処理で、血清アルブミン、ＩｇＧのスポットが著しく減少していること、このため泳動タンパク質量を増やすことができ、血清中に存在する血清アルブミン、ＩｇＧと近接する位置にあったスポットの検出が容易となっていることが確認できた。また、染色強度が減少したスポットはみられなかった。
一方、シバクロンブルー使用キットによる処理では、本発明のゲルによる処理と比べ血清アルブミンおよびＩｇＧの除去効率が悪いことに加えて、染色強度が減少あるいは消滅したスポットが複数個確認された。
【００５４】
ＳＷＩＳＳ−２ＤＰＡＧＥデータベースからこれらのスポットタンパク質を推定したところ、本発明のゲルにより検出可能あるいは増大したスポットとしてＩｇＤ、ＩｇＭ、Ｈｅｍｏｐｅｘｉｎ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＤが挙げられた。その他未同定のスポットも多数検出された。一方、シバクロンブルー使用キットを用いた処理で減少したスポットはプラスミノーゲン、ＡｐｏＪ、ＡｐｏＥ、α２−Ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎであると見られる。さらに、複数個の未同定スポットが減少あるいは消失していた。
【実施例３】
【００５５】
（ＰＭＦ（ペプチドマスフィンガープリンティング）解析）
本発明のゲルを用い、処理後および処理前の血清（タンパク質量１．５μｇ）を還元アルキル化処理したのちにそれぞれの溶液を０．５μｇのトリプシンにて酵素消化（３５℃、一晩静置）し、脱塩濃縮処理を行った後、マトリクス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間型質量分析装置（Voyager-DE STR: Applied Biosystems社）にてＰＭＦ分析を行った（図１１）。
【００５６】
その結果、処理前のヒト血清は、血清アルブミンの量が多い為、検出されたペプチドシグナルの上位２０個中血清アルブミンのシグナルが１７個（８５％）を占め、血清アルブミン以外のシグナルが３個（１５％）しか検出されないのに対して、本発明のゲルを用いた処理後の血清からは血清アルブミンのシグナルが７個（３５％）に減り、血清アルブミン以外のシグナルが１３個（６５％）に増えた。このように本発明のゲルを用いて血清を処理することにより、ＰＭＦ分析において血清アルブミンおよびＩｇＧ以外のタンパク質が検出され易くなることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を使用することによって、血液中に高含量で含まれるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知タンパク質を簡便な操作で同時にかつ選択的に除去でき、このことによって、血液成分を構成する微量タンパク質を容易に検出、精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１−（ａ）および（ｂ）は本発明に係る吸着体の模式図であり、図１−（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）は本発明に係る吸着体に混在していてもよい吸着体の模式図である。
【図２】プロテインＡと反応させる抗アルブミン抗体溶液の液量を検討した結果であり、反応後上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＣＢＢ染色により抗体タンパク質を検出したときの写真図面である。
【図３】プロテインＡと抗体との架橋反応におけるＤＭＰ濃度を検討した結果であり、反応後のゲルスラリー中に含まれる未架橋の抗体量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図４】プロテインＡと抗体との架橋反応におけるＤＭＰ濃度を検討した結果であり、架橋反応後抗体結合プロテインＡゲルによる血清アルブミンおよびＩｇＧ除去能力をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図５】架橋反応後抗体結合プロテインＡゲルからの未架橋抗体の洗浄条件を検討した結果であり、架橋反応後の洗浄毎に洗浄液を採取し、各洗浄液中に含まれる未架橋の抗体量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図６】２００μｌの本発明のゲルによる、ヒト血清の処理可能量を検討した結果であり、処理後の回収試料中に残存する血清アルブミンおよびＩｇＧの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図７】従来技術のカラムによる処理結果と本発明のゲルによる処理結果とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて比較したときの写真図面である。
【図８】正常ヒト血清（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図９】本発明のゲルによる処理後（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図１０】シバクロンブルー使用キットによる処理液（５μｇタンパク質）の二次元電気泳動の写真図面である。
【図１１】ヒト血清を本発明のゲルで処理した溶液（ｂ）と、未処理の溶液（ａ）とを、還元アルキル化後に酵素消化し、ＰＭＦ分析した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００５９】
１ 不溶性担体
２ プロテインＡまたはプロテインＧ
３ 抗血清アルブミン抗体
Ｍ アプロサイエンス社分子量マーカー（ブロードレンジ）のレーン
Ａ 架橋反応後の反応液を泳動させたレーン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡまたはプロテインＧと、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体とが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項２】
プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合していることを特徴とする請求項１記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項３】
プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合していることを特徴とする請求項１記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項４】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項５】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項６】
不溶性担体が膜状である請求項１〜５のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を血液由来試料と接触させて該試料中のＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に該吸着体に吸着させることを特徴とするＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法。
【請求項８】
試料が、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清である請求項７記載の同時除去方法。
【請求項９】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである請求項７記載の同時除去方法。
【請求項１０】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである請求項７記載の同時除去方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キット。
【請求項１】
プロテインＡまたはプロテインＧと、ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体とが吸着体表面に呈示するように不溶性担体に結合していることを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項２】
プロテインＡまたはプロテインＧが不溶性担体に結合しており、かつＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に結合したプロテインＡまたはプロテインＧの一部に結合していることを特徴とする請求項１記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項３】
プロテインＡまたはプロテインＧ、およびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質に対する抗体が不溶性担体に直接結合していることを特徴とする請求項１記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項４】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項５】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項６】
不溶性担体が膜状である請求項１〜５のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を血液由来試料と接触させて該試料中のＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質を同時に該吸着体に吸着させることを特徴とするＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去方法。
【請求項８】
試料が、血液、血漿、血清、または血清を含む細胞培養液上清である請求項７記載の同時除去方法。
【請求項９】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＡ、ハプトグロビン、アンチトリプシン、フィブリノーゲン、ヘモグロビンまたはケラチンである請求項７記載の同時除去方法。
【請求項１０】
ＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質が血清アルブミンである請求項７記載の同時除去方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を充填してなるアフィニティークロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用吸着体を含んでなるＩｇＧおよびＩｇＧ以外の既知血中高含量タンパク質の同時除去用キット。
【図１】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００６−２６６０７（Ｐ２００６−２６６０７Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２１３２８６（Ｐ２００４−２１３２８６）
【出願日】平成１６年７月２１日（２００４．７．２１）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月２１日（２００４．７．２１）
【出願人】（５０１３８９８００）株式会社アプロサイエンス (7)
【Ｆターム（参考）】
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