アルカリケラチナーゼおよびこれをコードするＤＮＡならびにその使用方法
【課題】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株由来のタンパク質を、効率的に大量生産するための技術を提供する。
【解決手段】従来のケラチナーゼに比べて、より高いｐＨ下で、且つ、高い温度でケラチナーゼ活性を有する、特定のアミノ酸配列からなる前記菌株由来のタンパク質、及び前記タンパク質をコードするＤＮＡ。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該形質転換体、該形質転換体培養液、および精製した形質転換体酵素を用いた、羽毛処理および皮革処理方法。
【解決手段】従来のケラチナーゼに比べて、より高いｐＨ下で、且つ、高い温度でケラチナーゼ活性を有する、特定のアミノ酸配列からなる前記菌株由来のタンパク質、及び前記タンパク質をコードするＤＮＡ。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該形質転換体、該形質転換体培養液、および精製した形質転換体酵素を用いた、羽毛処理および皮革処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は産業用酵素として有用なアルカリケラチナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体培養液を用いたケラチン含有物質、特に羽毛および皮革の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界では、年間数百万トン以上の羽毛が家禽工程から副産物として大量に生じている。羽毛はほとんど純粋なケラチンで構成されており、高度のジスルフィド結合、水素結合、疎水性相互作用による架橋の構造により水に不溶性であり、動物・植物および多くの微生物プロテアーゼ等の酵素分解に抵抗性を有する。その結果、羽毛は大量に蓄積されることになり、深刻なゴミ問題となっている。
【０００３】
現在、生じた羽毛は堆肥に混ぜるなどの処理を行っているが、多くは焼却処理されている。羽毛は家畜飼料に粉末として添加する以外に一部物理的または化学的に処理され、肥料・接着剤や燃料などに変換されるか、アミノ酸やペプチドの材料として使用される。しかし、細かくした羽毛を得るための現在の工程は、コストが高いことやアミノ酸を壊してしまうなどの問題点があり、安価でより付加価値の高いものへ変換する処理法が望まれている。
【０００４】
微生物が生産するケラチナーゼは、通常のプロテアーゼでは分解できない強固なタンパク質を分解することができる。羽毛を分解することができるケラチナーゼも知られており、その生産菌として様々な菌類、放線菌、細菌が報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２）。しかし、ほとんどのケラチナーゼは、ｐＨ８．０付近の弱アルカリ、５０℃の中温域で至適活性を有している。より高いｐＨで活性を有するケラチナーゼもあり、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＡＬ−８９株（非特許文献３）が産生するケラチナーゼは、至適活性（ｐＨ, 温度）はｐＨ１１．０, ５０℃で得られている。しかしながらこのケラチナーゼは、熱安定性を確保するのにカルシウムイオンを必要とするため、工業的な用途には向いていない。
【０００５】
本発明者等は先に、養鶏場の土壌サンプルより、羽毛分解酵素産生菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株を単離することに成功した（非特許文献４）。当該株が生産するケラチナーゼは、アゾケラチンに対し、ｐＨ６〜ｐＨ１１．５、３０~８０℃の広い範囲で活性を示し、至適活性は６０℃、至適ｐＨは８．９~１０．３である。図１に示すように、該アルカリケラチナーゼは、６０℃においてもカルシウムイオンを必要としない。該アルカリケラチナーゼを含む粗抽出液と羽毛片とをｐＨ１０．５の緩衝液に入れ、２０℃〜７０℃、２４時間で処理したところ、３０℃〜６０℃で羽毛片が分解されることを確認した（図２）このように、該アルカリケラチナーゼは、カルシウム非依存性であり、かつアルカリ条件下で羽毛分解活性を有し、産業上有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： １２８（３）， ６９３−７０３，２００７
【非特許文献２】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１００（５），１８６８−１８７１，２００９．
【非特許文献３】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５１９−５２４，２００３．
【非特許文献４】Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．１０（３）,２２９−２３５, ２００６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株自体は、精製酵素の収率が７．３％と低く、酵素精製が困難である。そこで、本発明は、該株由来のアルカリケラチナーゼを、効率的に大量生産するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために、該ＤＮＡの単離条件を鋭意検討した結果、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに成功し、その塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該形質転換体、該形質転換体培養液、および精製した形質転換体酵素を、羽毛処理および皮革処理に利用することができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（２）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる、組み換え体ＤＮＡ。
（５）（４）の組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
又、本発明は、上記形質転換体を用いてケラチン含有物質を処理する方法も提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタンパク質は、従来のケラチナーゼに比べて、より高いｐＨ下で、且つ、高い温度でケラチナーゼ活性を有することから、羽毛、皮革等のケラチン含有物質の工業的処理に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のタンパク質の耐熱性と、耐熱性へのカルシウムイオン添加の影響を示すグラフである。
【図２】２０℃〜７０℃、２４時間振とう条件下での、本発明のタンパク質の羽毛分解活性を示す写真である。
【図３】本発明のタンパク質、およびアルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩの、同条件下における至適温度の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明のＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を併記して示す図である。
【図５】本発明のタンパク質と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＨ‐１０１株由来ケラチナーゼとのアミノ酸相同性検索の結果を示す図である。
【図６】本発明のタンパク質と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＫＳ２１株由来プロテアーゼとのアミノ酸相同性検索結果を示す図である。
【図７】本発明のＤＮＡが導入された形質転換体の、スキムミルク溶解斑の有無による本発明のタンパク質の生産確認の結果を示す写真である。
【図８】本発明のＤＮＡが導入された形質転換体の、ケラチナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例６においてアルカリケラチナーゼ生産菌ＦＡ３０‐０１株培養液で処理したウシ皮革の状態を、未処理（比較例１）のものと比較して示す写真である。
【図１０】実施例６においてアルカリケラチナーゼ生産菌ＦＡ３０‐０１株培養液で処理したウシ皮革表面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真と、未処理（比較例１）のもののＳＥＭ写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。該アミノ酸配列は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄらの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２） ２０３： １７３‐１７９）に従って本発明のタンパク質の内部アミノ酸配列の一部を特定後、該内部アミノ酸配列に基づくランダムプライマーを用いた塩基配列解析によって得られた塩基配列に基づき決定した。該塩基配列解析の詳細は、実施例２を参照されたい。
【００１３】
該アミノ酸配列の配列相同性検索の結果、ケラチナーゼの中では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＡＨ−１０１由来のアルカリケラチナーゼとの相同性が最も高く、６０%であった（図５）。さらに検索範囲をプロテアーゼまで広げたところ、該アミノ酸配列は、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩと９６％の高い相同性を有することが分かった。しかし、両者の至適温度を同条件下で判定した結果、本発明のタンパク質の至適温度は３０〜６０℃であり、８０℃で活性がなくなるのに対して、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩの至適温度は３０〜４０℃であり、５０℃で活性がなくなった（図３）。従って、本発明のタンパク質は、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩとは異なるものであり、わずかなアミノ酸配列の違いが、該タンパク質の耐熱性の向上等に寄与しているものと考えられる。
【００１４】
本発明のタンパク質は、アルカリ条件下でケラチンを分解する活性（以下これを単に「アルカリケラチナーゼ活性」と称することがある）を有する。該活性は、アゾケラチンを基質とする反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、または形質転換体培養液を作用させて、アゾケラチン分解速度を測定することにより測定することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列から明らかとなったので、後述するように該タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部をコードする塩基配列をもとにして作成したプローブを用いて、アルカリケラチナーゼ活性を有する任意の微生物からアルカリケラチナーゼをコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、アルカリケラチナーゼ活性を有する微生物、すなわちアルカリケラチナーゼをコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の培養物より精製することもできる。
【００１６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株が、特に本発明のタンパク質の産生能に優れている。
【００１７】
微生物の培養物から本発明のタンパク質を取得する方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物を掘越培地などの放線菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ジチオスレイオール）等の還元剤や、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）のようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製することができる。
【００１８】
例えば、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ（東ソー社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（生化学工業社製）を経て、電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００１９】
このように精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によると約 ２７．５ｋＤａのサブユニット１種からなる。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば以下の方法により得ることができる。まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらにリジルエンドペプチターゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより、複数のアミノ酸配列を決める。
【００２１】
決定されたアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、アルカリケラチナーゼ産生株のＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、該ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。好ましくは、イノシン（Ｉ）を含むランダムプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＲ ＡＣＩ ＧＴＩ ＣＣＩ ＴＧＧ ＧＧＩ ＡＴＩ ＣＣＩ ＴＡＹ ＡＴ−３’）およびランダムプライマー２（配列番号４：５’−ＴＴＩ ＣＣＩ ＡＲＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＧＣＩ ＧＴＫ ＴＧＲ ＴＴＣ ＡＴ−３’）を用いる。
【００２２】
次いで、得られたＤＮＡ断片をプローブ として、アルカリケラチナーゼ産生株のＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリー やｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００２３】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）に準じて行うことができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターとしては、タンパク質発現ベクターであれば特に限定はされないが、プラスミドベクターであることが好ましい。より好ましくは、プラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社）が挙げられる。
【００２５】
本発明の形質転換体の作製に用いられる組み換え用の細胞としては、形質転換可能なグラム陽性菌であれば特に限定はされないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であることが好ましい。より好ましくは、プロテアーゼ活性を欠損したＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌である。さらにより好ましくは、プロテアーゼ欠損株であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＭＷ１０株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｇｓｃ．ｏｒｇ／）が挙げられる。
【００２６】
本発明のＤＮＡを用いて、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を生産することができる。詳細には、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに該ＤＮＡを組み込んだベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。
【００２７】
上記の形質転換の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等が挙げられるが、好ましくはプロトプラスト法（Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ．１６８，１１１−１１５，１９７９）である。
【００２８】
上記の形質転換体の培養は、微生物の資化可能な炭素源・窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２９】
上記の形質転換体が、所望の本発明のタンパク質を発現しているかどうかの検査方法は定法に従って行えばよく、なかでもスキムミルク溶解斑アッセイが好ましい。
【００３０】
上記の形質転換体の培養物より、本発明のタンパク質を含む液を回収する方法としては、上記の形質転換体の培養上清を回収する方法、上記の形質転換体を破砕して可溶性画分を回収する方法、またはこれらを適切なカラムクロマトグラフィーで精製する方法等が挙げられ、なかでも単純に培養液の上清を回収する方法が好ましい。
【００３１】
本発明は、ケラチン含有物質に、配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含む形質転換体、該形質転換体処理物、及び／又はそれを含む培養液（以下、まとめて「形質転換体含有物」という）を作用させるステップを含む、ケラチン含有物質の処理方法も提供する。ここで、形質転換体処理物には、該形質転換体に、破砕、凍結乾燥等の物理的処理を施したもの、及び、該形質転換体中の本発明のタンパク質を粗製物もしくは精製物として取り出したもの等が包含される。
【００３２】
ケラチン含有物質としては、角質化したケラチン含有物質、例えば毛、爪、鱗、嘴、表皮、羽毛、及び角、並びに角質化していないケラチン含有物質、例えば細胞、が包含される。これらのなかでも、毛、特に羽毛、及び、表皮、特に皮革、の処理に、本発明の形質転換体含有物が好適に使用される。
【００３３】
該処理の至適温度は、３０〜８０℃の範囲あり、好ましくは３０〜６０℃の範囲である。また、至適ｐＨは、ｐＨ６~１１．５の範囲であり、好ましくはｐＨ８．９~１０．３の範囲である。処理時間は、処理すべきケラチン含有物質、処理温度等に依存して異なるが、羽毛の場合、１２〜２４時間で、処理することができる。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］配列相同性解析
タンパク質のアミノ酸配列の相同性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２２７, １４３５, （１９８５））によって計算した。詳細には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（Ｖｅｒ．７； ソフトウェア開発）のホモロジー解析（サーチホモロジー）プログラムを用いて算出した。
【００３５】
その結果、配列番号９に示すアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼとして機能する推定成熟タンパク質のアミノ酸配列を含み、またセリンプロテアーゼに高度に保存されたプロテアーゼ活性に必要な領域もしくはアミノ酸配列を保持していた。配列番号９に示すアミノ酸配列と従来公知のケラチナーゼのアミノ酸配列との相同性を調べた結果、配列番号９に示すアミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＡＨ−１０１由来のアルカリケラチナーゼ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（１）, １０１−１０８, １９９２．を参照）と相同性が最も高く、その相同性は６０%であった（図５）。
【００３６】
カテゴリーをプロテアーゼまで拡大して比較した場合、該アミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＮＫＳ２１株の生産するアルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰとの相同性が最も高く、その相同性は９６%（図６）であった。そこで、本発明のタンパク質と、該アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩとを、ｐＨ１０．０、１０分において比較した結果（その他の詳細な測定条件はＣｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（４）, ２０１−２０９, １９９５．に記載）、本発明のタンパク質は該アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩに比べて、至適温度が顕著に高かった（図３）。この結果から、両者は異なるものであることが分かった。
【００３７】
［実施例２］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株由来アルカリケラチナーゼ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓＦＡ３０−０１株由来タンパク質のＮ末端アミノ酸配Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号１）および内部アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号２）を、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２） ２０３： １７３‐１７９）に従って特定した。詳細には、該タンパク質を含むサンプルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥに添加して電気泳動を行った後、目的のバンド部分を含むゲル片を切り出し、洗浄した。上記のゲル片に、トリプシンを含むＴｒｉｓ‐ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、３５℃、２０時間処理した後、上清を逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ‐８０ＴＳ （２．０×２５０ｍｍ， 東ソー社））にインジェクションし、プロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍＣｏｌｕｍｎ，２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２２ｃｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析することにより決定した。得られた内部アミノ酸配列の情報に基づき、これらの領域間を増幅させるように設計したランダムプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＲ ＡＣＩ ＧＴＩ ＣＣＩ ＴＧＧ ＧＧＩ ＡＴＩ ＣＣＩ ＴＡＹ ＡＴ−３’）およびランダムプライマー２（配列番号４：５’−ＴＴＩ ＣＣＩ ＡＲＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＧＣＩ ＧＴＫ ＴＧＲ ＴＴＣ ＡＴ−３’）を合成した。
【００３８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株を０．５% グルコース（和光純薬）、０．５% 可溶性デンプン（和光純薬）、０．５% ポリペプトン（ディフコ）、０．５% 酵母エキス（ディフコ）、０．１% リン酸水素二カリウム（ナカライテスク）、０．０２% 硫酸マグネシウム７水和物（和光純薬）、１．０% 炭酸ナトリウム（和光純薬）を含む培地にて、３０℃、２４時間、好気的に振とう培養を行い、遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， ７２， ６１９−６２９， １９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲは、プライマー１と２を用いて行った。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ ０．４ μｇ、１００ μＭの各プライマーを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で２分間熱変性後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。得られたＰＣＲ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定した。
【００３９】
塩基配列が決定されたＤＮＡ断片に対して、プライマー３（配列番号５：５’−ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ Ｃ−３’）、プライマー４（配列番号６：５’−ＴＴＡＡ ＡＣＴ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ Ｃ−３’）、プライマー５（配列番号７：５’−ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ Ｔ−３’）、プライマー６（配列番号８：５’−ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＴＧＴ Ｔ−３’）を合成した。
【００４０】
続いて、上述ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の上流部分を増幅するために、該株のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ）で消化し、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ キット（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ）中のＥｃｏＲＩカセットに上記消化断片を連結させ、プライマー４と付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片１．０ ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。続いて、得られたＰＣＲ断片について、プライマー３と付属のプライマーＣ２を用いて再度ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は上述の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定し、目的遺伝子の上流側約４５０ｂｐを得た。
【００４１】
下流側は該株のゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．）で消化し、インバースＰＣＲ法により、プライマー５と６を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、Ｓａｕ３ＡＩ切断後、自己連結したＤＮＡ １．０ ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌからなる反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、約３００ｂｐの増幅断片を得た。ＰＣＲ条件は上流側の増幅で用いた上述の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定し、目的遺伝子の下流側を得た。
【００４２】
上記の手法により、該タンパク質［３７４アミノ酸（配列番号９）］をコードする遺伝子［１１２５塩基長の塩基配列（配列番号１０）］を決定した。図４に、両者を併記したものを示す。
【００４３】
［実施例３］本発明のタンパク質の組換え生産
該タンパク質を大量に生産させるために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株由来のアルカリケラチナーゼ遺伝子のプロモーター領域前、ターミネーター後で、それぞれプライマー７（配列番号１１：５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＴＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＧＧＣ ＴＴＡ ＡＣＧ ＡＴＣ ＡＧＴ Ｃ−３’）、プライマー８（配列番号１２：５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＴＣＡ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴＴ−３’）を合成し、ＰＣＲでアルカリケラチナーゼ遺伝子を増幅した。
【００４４】
ＰＣＲの反応条件は、セルフライゲーションしたＤＮＡ １．０ ｎｇ、各プライマー １０ｐｍｏｌを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、約１．６ ｋｂｐの増幅断片を得た。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで切断した後、同様の酵素で処理したｐＨＹ３００ＰＬＫへ連結し、プロテアーゼ欠損株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＭＷ１０株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ， ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｂｇｓｃ．ｏｒｇ／）にプロトプラスト法（Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ．１６８，１１１−１１５，１９７９）で形質転換した。
【００４５】
［実施例４］スキムミルク溶解斑アッセイ
スキムミルク含有アルカリＬＢ培地（０．０５%炭酸ナトリウム並びに１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む）に形質転換体を塗布し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。その結果、３７℃で２日間培養後、形質転換体で溶解斑を確認できた（図７）。
【００４６】
［実施例５］本発明のタンパク質のケラチナーゼ活性の測定
該タンパク質のケラチナーゼ活性の測定は、Ｘ．ｌｉｎらの方法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（１０）， ３２７１−３２７５，１９９２．）に準じて行った。アゾケラチンはＴｏｍａｒｅｌｌｉらの方法（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ，３４，４２８−４３３，１９４９．）に従って調製した。調製アゾケラチン５ｍｇを０．８ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ グリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ， ｐＨ１０．５）に懸濁し、０．５２ｍｇ／ｍｌの該タンパク質を含む培養液上清を０．２ｍｌ加え混合し、５０℃、１６０ｒｐｍで１５分間振とう処理した。振とう機はＢｉｏｃｈａｋｅｒ ＭＢＲ−０２４（タイテック社製）を使用した。反応後、１０%ＴＣＡ溶液（ナカライテスク）を０．２ｍｌ加え、反応を停止し、１５０００Ｇで１５分間遠心し、上清の吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。対照実験として基質と酵素を混合した後、すぐに１０%ＴＣＡを０．２ｍｌ加えた実験群を行った。酵素活性の１Ｕは反応１５分間あたり、４５０ｎｍでの吸光度を０．０１上昇させるのに必要な酵素量と定義した。形質転換体の培養上清を測定したところ、１．３２Ｕ／ｍｇのケラチナーゼ活性を示した（図８）。
【００４７】
［実施例６］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓＦＡ３０‐０１株を用いた皮革の処理方法
市販のウシ皮片を、０．５ｃｍ×１．５ｃｍに切断後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して使用した。
【００４８】
シリコ栓をした２４φガラス試験管に、１０ｍｌの掘越改変培地（グルコース０．５％（和光純薬）、デンプン０．５%（和光純薬）、酵母エキス０．５%（Ｄｉｆｃｏ社）、ポリペプトン０．５%（Ｄｉｆｃｏ社）、Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬）０．１%、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬）０．０５%、Ｎａ２ＣＯ3（和光純薬）１．０％、ｐＨ１０．５を入れ、該株を一晩培養した。
【００４９】
ウシ皮片を上述の培地１０ｍｌに入れた後、該株を一晩培養した培養液を、培地に対し０．２体積％で接種し、３０℃、１６０ｒｐｍの条件下で4日間振とう培養を行った。その後、培養液中の皮を取り出した。
【００５０】
［比較例１］
該株を一晩培養した培養液を添加しない以外は、実施例６と同様に皮革処理を行った。
【００５１】
図９および図１０に、処理後の皮革の外観を示す。該株を接種した実験群（実施例６）では、４日後牛皮がほぼ分解され、牛皮上の毛のみが残っている状態であったのに対し、対照群（比較例１）では目立った変化はなかった。さらにまた、ｐＨ１０．５に調製した溶液中の皮で上記と同様の実験を行い、皮の変化を確認したところ、１日の処理で皮表面上の毛がピンセットで簡単に抜くことができ、ケラチナーゼの効果が確認できた。ＳＥＭ観察では、酵素処理の毛の表面部分の分解も確認できた（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のタンパク質及び組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体は、羽毛の分解、皮のなめし等、ケラチン物質の処理に好適である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は産業用酵素として有用なアルカリケラチナーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体に関し、さらに該形質転換体、該形質転換体培養液を用いたケラチン含有物質、特に羽毛および皮革の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界では、年間数百万トン以上の羽毛が家禽工程から副産物として大量に生じている。羽毛はほとんど純粋なケラチンで構成されており、高度のジスルフィド結合、水素結合、疎水性相互作用による架橋の構造により水に不溶性であり、動物・植物および多くの微生物プロテアーゼ等の酵素分解に抵抗性を有する。その結果、羽毛は大量に蓄積されることになり、深刻なゴミ問題となっている。
【０００３】
現在、生じた羽毛は堆肥に混ぜるなどの処理を行っているが、多くは焼却処理されている。羽毛は家畜飼料に粉末として添加する以外に一部物理的または化学的に処理され、肥料・接着剤や燃料などに変換されるか、アミノ酸やペプチドの材料として使用される。しかし、細かくした羽毛を得るための現在の工程は、コストが高いことやアミノ酸を壊してしまうなどの問題点があり、安価でより付加価値の高いものへ変換する処理法が望まれている。
【０００４】
微生物が生産するケラチナーゼは、通常のプロテアーゼでは分解できない強固なタンパク質を分解することができる。羽毛を分解することができるケラチナーゼも知られており、その生産菌として様々な菌類、放線菌、細菌が報告されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２）。しかし、ほとんどのケラチナーゼは、ｐＨ８．０付近の弱アルカリ、５０℃の中温域で至適活性を有している。より高いｐＨで活性を有するケラチナーゼもあり、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＡＬ−８９株（非特許文献３）が産生するケラチナーゼは、至適活性（ｐＨ, 温度）はｐＨ１１．０, ５０℃で得られている。しかしながらこのケラチナーゼは、熱安定性を確保するのにカルシウムイオンを必要とするため、工業的な用途には向いていない。
【０００５】
本発明者等は先に、養鶏場の土壌サンプルより、羽毛分解酵素産生菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株を単離することに成功した（非特許文献４）。当該株が生産するケラチナーゼは、アゾケラチンに対し、ｐＨ６〜ｐＨ１１．５、３０~８０℃の広い範囲で活性を示し、至適活性は６０℃、至適ｐＨは８．９~１０．３である。図１に示すように、該アルカリケラチナーゼは、６０℃においてもカルシウムイオンを必要としない。該アルカリケラチナーゼを含む粗抽出液と羽毛片とをｐＨ１０．５の緩衝液に入れ、２０℃〜７０℃、２４時間で処理したところ、３０℃〜６０℃で羽毛片が分解されることを確認した（図２）このように、該アルカリケラチナーゼは、カルシウム非依存性であり、かつアルカリ条件下で羽毛分解活性を有し、産業上有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： １２８（３）， ６９３−７０３，２００７
【非特許文献２】Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１００（５），１８６８−１８７１，２００９．
【非特許文献３】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３２：５１９−５２４，２００３．
【非特許文献４】Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．１０（３）,２２９−２３５, ２００６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株自体は、精製酵素の収率が７．３％と低く、酵素精製が困難である。そこで、本発明は、該株由来のアルカリケラチナーゼを、効率的に大量生産するための技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために、該ＤＮＡの単離条件を鋭意検討した結果、配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡを単離することに成功し、その塩基配列を解析した。さらに、該遺伝子の形質転換体を作製し、組換え菌を用いて該遺伝子を発現させた該形質転換体、該形質転換体培養液、および精製した形質転換体酵素を、羽毛処理および皮革処理に利用することができることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（２）配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（３）配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（４）（２）又は（３）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる、組み換え体ＤＮＡ。
（５）（４）の組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
又、本発明は、上記形質転換体を用いてケラチン含有物質を処理する方法も提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のタンパク質は、従来のケラチナーゼに比べて、より高いｐＨ下で、且つ、高い温度でケラチナーゼ活性を有することから、羽毛、皮革等のケラチン含有物質の工業的処理に好適である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のタンパク質の耐熱性と、耐熱性へのカルシウムイオン添加の影響を示すグラフである。
【図２】２０℃〜７０℃、２４時間振とう条件下での、本発明のタンパク質の羽毛分解活性を示す写真である。
【図３】本発明のタンパク質、およびアルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩの、同条件下における至適温度の測定結果を示すグラフである。
【図４】本発明のＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を併記して示す図である。
【図５】本発明のタンパク質と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＡＨ‐１０１株由来ケラチナーゼとのアミノ酸相同性検索の結果を示す図である。
【図６】本発明のタンパク質と、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＮＫＳ２１株由来プロテアーゼとのアミノ酸相同性検索結果を示す図である。
【図７】本発明のＤＮＡが導入された形質転換体の、スキムミルク溶解斑の有無による本発明のタンパク質の生産確認の結果を示す写真である。
【図８】本発明のＤＮＡが導入された形質転換体の、ケラチナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
【図９】実施例６においてアルカリケラチナーゼ生産菌ＦＡ３０‐０１株培養液で処理したウシ皮革の状態を、未処理（比較例１）のものと比較して示す写真である。
【図１０】実施例６においてアルカリケラチナーゼ生産菌ＦＡ３０‐０１株培養液で処理したウシ皮革表面の電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真と、未処理（比較例１）のもののＳＥＭ写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を説明する。
本発明のタンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する。該アミノ酸配列は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄらの方法（Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２） ２０３： １７３‐１７９）に従って本発明のタンパク質の内部アミノ酸配列の一部を特定後、該内部アミノ酸配列に基づくランダムプライマーを用いた塩基配列解析によって得られた塩基配列に基づき決定した。該塩基配列解析の詳細は、実施例２を参照されたい。
【００１３】
該アミノ酸配列の配列相同性検索の結果、ケラチナーゼの中では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＡＨ−１０１由来のアルカリケラチナーゼとの相同性が最も高く、６０%であった（図５）。さらに検索範囲をプロテアーゼまで広げたところ、該アミノ酸配列は、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩと９６％の高い相同性を有することが分かった。しかし、両者の至適温度を同条件下で判定した結果、本発明のタンパク質の至適温度は３０〜６０℃であり、８０℃で活性がなくなるのに対して、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩの至適温度は３０〜４０℃であり、５０℃で活性がなくなった（図３）。従って、本発明のタンパク質は、アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩとは異なるものであり、わずかなアミノ酸配列の違いが、該タンパク質の耐熱性の向上等に寄与しているものと考えられる。
【００１４】
本発明のタンパク質は、アルカリ条件下でケラチンを分解する活性（以下これを単に「アルカリケラチナーゼ活性」と称することがある）を有する。該活性は、アゾケラチンを基質とする反応系において、酵素として、目的のタンパク質、該タンパク質を発現する能力を有する形質転換体、または形質転換体培養液を作用させて、アゾケラチン分解速度を測定することにより測定することができる。
【００１５】
本発明のタンパク質は、本発明によってそのアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする塩基配列から明らかとなったので、後述するように該タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部をコードする塩基配列をもとにして作成したプローブを用いて、アルカリケラチナーゼ活性を有する任意の微生物からアルカリケラチナーゼをコードするＤＮＡを単離した後、それを元に通常の遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。また、本発明を完成するにあたってなされたように、アルカリケラチナーゼ活性を有する微生物、すなわちアルカリケラチナーゼをコードするＤＮＡを有する微生物、例えば、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌の培養物より精製することもできる。
【００１６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株が、特に本発明のタンパク質の産生能に優れている。
【００１７】
微生物の培養物から本発明のタンパク質を取得する方法としては、通常の酵素の精製方法を用いることができ、例えば、以下の方法で行うことができる。上記微生物を掘越培地などの放線菌の培養に用いられる一般的な培地で培養することで十分増殖させた後に回収し、ＤＴＴ（ジチオスレイオール）等の還元剤や、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）のようなプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、タンパク質の溶解度による分画（有機溶媒による沈殿や硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲル濾過、疎水、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、キレート、色素、抗体等を用いたアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより、精製することができる。
【００１８】
例えば、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０ｓ（東ソー社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（生化学工業社製）を経て、電気泳動的にほぼ単一バンドまで精製することが出来る。
【００１９】
このように精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株に由来する本発明のタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によると約 ２７．５ｋＤａのサブユニット１種からなる。
【００２０】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば以下の方法により得ることができる。まず、本発明のタンパク質を上記の方法等にて精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さらにリジルエンドペプチターゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断し、逆相液体クロマトグラフィーなどによりペプチド断片を精製後、プロテインシーケンサーによりアミノ酸配列を解析することにより、複数のアミノ酸配列を決める。
【００２１】
決定されたアミノ酸配列を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、アルカリケラチナーゼ産生株のＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、該ＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡの一部を得ることができる。好ましくは、イノシン（Ｉ）を含むランダムプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＲ ＡＣＩ ＧＴＩ ＣＣＩ ＴＧＧ ＧＧＩ ＡＴＩ ＣＣＩ ＴＡＹ ＡＴ−３’）およびランダムプライマー２（配列番号４：５’−ＴＴＩ ＣＣＩ ＡＲＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＧＣＩ ＧＴＫ ＴＧＲ ＴＴＣ ＡＴ−３’）を用いる。
【００２２】
次いで、得られたＤＮＡ断片をプローブ として、アルカリケラチナーゼ産生株のＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリー やｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のＤＮＡを得ることができる。
【００２３】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築および宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法）に準じて行うことができる。
【００２４】
本発明のＤＮＡが組み込まれるベクターとしては、タンパク質発現ベクターであれば特に限定はされないが、プラスミドベクターであることが好ましい。より好ましくは、プラスミドベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ社）が挙げられる。
【００２５】
本発明の形質転換体の作製に用いられる組み換え用の細胞としては、形質転換可能なグラム陽性菌であれば特に限定はされないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であることが好ましい。より好ましくは、プロテアーゼ活性を欠損したＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌である。さらにより好ましくは、プロテアーゼ欠損株であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＭＷ１０株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｇｓｃ．ｏｒｇ／）が挙げられる。
【００２６】
本発明のＤＮＡを用いて、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質を生産することができる。詳細には、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに該ＤＮＡを組み込んだベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによって生産することができる。
【００２７】
上記の形質転換の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、コンピテントセル法等が挙げられるが、好ましくはプロトプラスト法（Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ．１６８，１１１−１１５，１９７９）である。
【００２８】
上記の形質転換体の培養は、微生物の資化可能な炭素源・窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２９】
上記の形質転換体が、所望の本発明のタンパク質を発現しているかどうかの検査方法は定法に従って行えばよく、なかでもスキムミルク溶解斑アッセイが好ましい。
【００３０】
上記の形質転換体の培養物より、本発明のタンパク質を含む液を回収する方法としては、上記の形質転換体の培養上清を回収する方法、上記の形質転換体を破砕して可溶性画分を回収する方法、またはこれらを適切なカラムクロマトグラフィーで精製する方法等が挙げられ、なかでも単純に培養液の上清を回収する方法が好ましい。
【００３１】
本発明は、ケラチン含有物質に、配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含む形質転換体、該形質転換体処理物、及び／又はそれを含む培養液（以下、まとめて「形質転換体含有物」という）を作用させるステップを含む、ケラチン含有物質の処理方法も提供する。ここで、形質転換体処理物には、該形質転換体に、破砕、凍結乾燥等の物理的処理を施したもの、及び、該形質転換体中の本発明のタンパク質を粗製物もしくは精製物として取り出したもの等が包含される。
【００３２】
ケラチン含有物質としては、角質化したケラチン含有物質、例えば毛、爪、鱗、嘴、表皮、羽毛、及び角、並びに角質化していないケラチン含有物質、例えば細胞、が包含される。これらのなかでも、毛、特に羽毛、及び、表皮、特に皮革、の処理に、本発明の形質転換体含有物が好適に使用される。
【００３３】
該処理の至適温度は、３０〜８０℃の範囲あり、好ましくは３０〜６０℃の範囲である。また、至適ｐＨは、ｐＨ６~１１．５の範囲であり、好ましくはｐＨ８．９~１０．３の範囲である。処理時間は、処理すべきケラチン含有物質、処理温度等に依存して異なるが、羽毛の場合、１２〜２４時間で、処理することができる。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］配列相同性解析
タンパク質のアミノ酸配列の相同性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ, ２２７, １４３５, （１９８５））によって計算した。詳細には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（Ｖｅｒ．７； ソフトウェア開発）のホモロジー解析（サーチホモロジー）プログラムを用いて算出した。
【００３５】
その結果、配列番号９に示すアミノ酸配列は、セリンプロテアーゼとして機能する推定成熟タンパク質のアミノ酸配列を含み、またセリンプロテアーゼに高度に保存されたプロテアーゼ活性に必要な領域もしくはアミノ酸配列を保持していた。配列番号９に示すアミノ酸配列と従来公知のケラチナーゼのアミノ酸配列との相同性を調べた結果、配列番号９に示すアミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＡＨ−１０１由来のアルカリケラチナーゼ（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８（１）, １０１−１０８, １９９２．を参照）と相同性が最も高く、その相同性は６０%であった（図５）。
【００３６】
カテゴリーをプロテアーゼまで拡大して比較した場合、該アミノ酸配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ＮＫＳ２１株の生産するアルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰとの相同性が最も高く、その相同性は９６%（図６）であった。そこで、本発明のタンパク質と、該アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩとを、ｐＨ１０．０、１０分において比較した結果（その他の詳細な測定条件はＣｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（４）, ２０１−２０９, １９９５．に記載）、本発明のタンパク質は該アルカリ性セリンプロテアーゼＡＬＰＩに比べて、至適温度が顕著に高かった（図３）。この結果から、両者は異なるものであることが分かった。
【００３７】
［実施例２］ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株由来アルカリケラチナーゼ遺伝子のクローニングおよび塩基配列の決定
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓＦＡ３０−０１株由来タンパク質のＮ末端アミノ酸配Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（配列番号１）および内部アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号２）を、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２） ２０３： １７３‐１７９）に従って特定した。詳細には、該タンパク質を含むサンプルをＳＤＳ‐ＰＡＧＥに添加して電気泳動を行った後、目的のバンド部分を含むゲル片を切り出し、洗浄した。上記のゲル片に、トリプシンを含むＴｒｉｓ‐ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、３５℃、２０時間処理した後、上清を逆相ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ‐８０ＴＳ （２．０×２５０ｍｍ， 東ソー社））にインジェクションし、プロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９４ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍＣｏｌｕｍｎ，２．１ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２２ｃｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で解析することにより決定した。得られた内部アミノ酸配列の情報に基づき、これらの領域間を増幅させるように設計したランダムプライマー１（配列番号３：５’−ＣＡＲ ＡＣＩ ＧＴＩ ＣＣＩ ＴＧＧ ＧＧＩ ＡＴＩ ＣＣＩ ＴＡＹ ＡＴ−３’）およびランダムプライマー２（配列番号４：５’−ＴＴＩ ＣＣＩ ＡＲＩ ＧＧＩ ＡＣＩ ＧＣＩ ＧＴＫ ＴＧＲ ＴＴＣ ＡＴ−３’）を合成した。
【００３８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株を０．５% グルコース（和光純薬）、０．５% 可溶性デンプン（和光純薬）、０．５% ポリペプトン（ディフコ）、０．５% 酵母エキス（ディフコ）、０．１% リン酸水素二カリウム（ナカライテスク）、０．０２% 硫酸マグネシウム７水和物（和光純薬）、１．０% 炭酸ナトリウム（和光純薬）を含む培地にて、３０℃、２４時間、好気的に振とう培養を行い、遠心分離により菌体を集めた。得られた菌体から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ， ７２， ６１９−６２９， １９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製した。ＰＣＲは、プライマー１と２を用いて行った。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ ０．４ μｇ、１００ μＭの各プライマーを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で２分間熱変性後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。得られたＰＣＲ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ， Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定した。
【００３９】
塩基配列が決定されたＤＮＡ断片に対して、プライマー３（配列番号５：５’−ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＡＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ Ｃ−３’）、プライマー４（配列番号６：５’−ＴＴＡＡ ＡＣＴ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＧＣ ＡＡＴ ＡＴＣ ＣＡＴ Ｃ−３’）、プライマー５（配列番号７：５’−ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＣＣＡ Ｔ−３’）、プライマー６（配列番号８：５’−ＧＡＣ ＧＴＣ ＡＡＴ ＧＧＣ ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＣＡ ＴＧＴ Ｔ−３’）を合成した。
【００４０】
続いて、上述ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の上流部分を増幅するために、該株のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ）で消化し、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇ キット（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ ＩＮＣ）中のＥｃｏＲＩカセットに上記消化断片を連結させ、プライマー４と付属のプライマーＣ１にてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件はカセットに連結されたＤＮＡ断片１．０ ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて、９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。続いて、得られたＰＣＲ断片について、プライマー３と付属のプライマーＣ２を用いて再度ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は上述の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定し、目的遺伝子の上流側約４５０ｂｐを得た。
【００４１】
下流側は該株のゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ，ＩＮＣ．）で消化し、インバースＰＣＲ法により、プライマー５と６を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、Ｓａｕ３ＡＩ切断後、自己連結したＤＮＡ １．０ ｎｇ、各プライマー１０ｐｍｏｌからなる反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、約３００ｂｐの増幅断片を得た。ＰＣＲ条件は上流側の増幅で用いた上述の条件で行った。得られたＤＮＡ断片をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｊａｐａｎ Ｌｔｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて塩基配列を決定し、目的遺伝子の下流側を得た。
【００４２】
上記の手法により、該タンパク質［３７４アミノ酸（配列番号９）］をコードする遺伝子［１１２５塩基長の塩基配列（配列番号１０）］を決定した。図４に、両者を併記したものを示す。
【００４３】
［実施例３］本発明のタンパク質の組換え生産
該タンパク質を大量に生産させるために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＦＡ３０−０１株由来のアルカリケラチナーゼ遺伝子のプロモーター領域前、ターミネーター後で、それぞれプライマー７（配列番号１１：５’−ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＣＧ ＡＴＡ ＧＧＡ ＣＴＴ ＧＧＣ ＴＴＡ ＡＣＧ ＡＴＣ ＡＧＴ Ｃ−３’）、プライマー８（配列番号１２：５’−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＴＣＡ ＴＴＧ ＡＡＡ ＴＴＡ ＡＧＣ ＧＴＴ−３’）を合成し、ＰＣＲでアルカリケラチナーゼ遺伝子を増幅した。
【００４４】
ＰＣＲの反応条件は、セルフライゲーションしたＤＮＡ １．０ ｎｇ、各プライマー １０ｐｍｏｌを含む反応液に対し、サーマルサイクラーを用いて９５℃で２分間の熱変性後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で２分間を１サイクルとし、３０サイクル行い、約１．６ ｋｂｐの増幅断片を得た。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩで切断した後、同様の酵素で処理したｐＨＹ３００ＰＬＫへ連結し、プロテアーゼ欠損株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＭＷ１０株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ， ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｂｇｓｃ．ｏｒｇ／）にプロトプラスト法（Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ．１６８，１１１−１１５，１９７９）で形質転換した。
【００４５】
［実施例４］スキムミルク溶解斑アッセイ
スキムミルク含有アルカリＬＢ培地（０．０５%炭酸ナトリウム並びに１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む）に形質転換体を塗布し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。その結果、３７℃で２日間培養後、形質転換体で溶解斑を確認できた（図７）。
【００４６】
［実施例５］本発明のタンパク質のケラチナーゼ活性の測定
該タンパク質のケラチナーゼ活性の測定は、Ｘ．ｌｉｎらの方法（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（１０）， ３２７１−３２７５，１９９２．）に準じて行った。アゾケラチンはＴｏｍａｒｅｌｌｉらの方法（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ，３４，４２８−４３３，１９４９．）に従って調製した。調製アゾケラチン５ｍｇを０．８ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ グリシン−ＮａＣｌ−ＮａＯＨ， ｐＨ１０．５）に懸濁し、０．５２ｍｇ／ｍｌの該タンパク質を含む培養液上清を０．２ｍｌ加え混合し、５０℃、１６０ｒｐｍで１５分間振とう処理した。振とう機はＢｉｏｃｈａｋｅｒ ＭＢＲ−０２４（タイテック社製）を使用した。反応後、１０%ＴＣＡ溶液（ナカライテスク）を０．２ｍｌ加え、反応を停止し、１５０００Ｇで１５分間遠心し、上清の吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。対照実験として基質と酵素を混合した後、すぐに１０%ＴＣＡを０．２ｍｌ加えた実験群を行った。酵素活性の１Ｕは反応１５分間あたり、４５０ｎｍでの吸光度を０．０１上昇させるのに必要な酵素量と定義した。形質転換体の培養上清を測定したところ、１．３２Ｕ／ｍｇのケラチナーゼ活性を示した（図８）。
【００４７】
［実施例６］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓＦＡ３０‐０１株を用いた皮革の処理方法
市販のウシ皮片を、０．５ｃｍ×１．５ｃｍに切断後、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して使用した。
【００４８】
シリコ栓をした２４φガラス試験管に、１０ｍｌの掘越改変培地（グルコース０．５％（和光純薬）、デンプン０．５%（和光純薬）、酵母エキス０．５%（Ｄｉｆｃｏ社）、ポリペプトン０．５%（Ｄｉｆｃｏ社）、Ｋ２ＨＰＯ４（和光純薬）０．１%、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（和光純薬）０．０５%、Ｎａ２ＣＯ3（和光純薬）１．０％、ｐＨ１０．５を入れ、該株を一晩培養した。
【００４９】
ウシ皮片を上述の培地１０ｍｌに入れた後、該株を一晩培養した培養液を、培地に対し０．２体積％で接種し、３０℃、１６０ｒｐｍの条件下で4日間振とう培養を行った。その後、培養液中の皮を取り出した。
【００５０】
［比較例１］
該株を一晩培養した培養液を添加しない以外は、実施例６と同様に皮革処理を行った。
【００５１】
図９および図１０に、処理後の皮革の外観を示す。該株を接種した実験群（実施例６）では、４日後牛皮がほぼ分解され、牛皮上の毛のみが残っている状態であったのに対し、対照群（比較例１）では目立った変化はなかった。さらにまた、ｐＨ１０．５に調製した溶液中の皮で上記と同様の実験を行い、皮の変化を確認したところ、１日の処理で皮表面上の毛がピンセットで簡単に抜くことができ、ケラチナーゼの効果が確認できた。ＳＥＭ観察では、酵素処理の毛の表面部分の分解も確認できた（図１０）。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のタンパク質及び組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体は、羽毛の分解、皮のなめし等、ケラチン物質の処理に好適である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる、組み換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項６】
ケラチン含有物質に、配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含む形質転換体、該形質転換体処理物、及び／又はそれを含む培養液を作用させるステップを含む、ケラチン含有物質の処理方法。
【請求項７】
前記ステップにおける温度が３０〜６０℃の範囲である、請求項６に記載のケラチン物質の処理方法。
【請求項８】
前記ステップにおけるｐＨが６〜１１．５の範囲である、請求項６に記載のケラチン物質の処理方法。
【請求項９】
前記ケラチン含有物質が羽毛である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１０】
前記ケラチン含有物質が皮革である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１】
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる、組み換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載の組み換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項６】
ケラチン含有物質に、配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを含む形質転換体、該形質転換体処理物、及び／又はそれを含む培養液を作用させるステップを含む、ケラチン含有物質の処理方法。
【請求項７】
前記ステップにおける温度が３０〜６０℃の範囲である、請求項６に記載のケラチン物質の処理方法。
【請求項８】
前記ステップにおけるｐＨが６〜１１．５の範囲である、請求項６に記載のケラチン物質の処理方法。
【請求項９】
前記ケラチン含有物質が羽毛である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１０】
前記ケラチン含有物質が皮革である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の処理方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１５５９３２（Ｐ２０１１−１５５９３２Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２１５９９（Ｐ２０１０−２１５９９）
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２日（２０１０．２．２）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【Ｆターム（参考）】
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