アルキルジオールを産生する組換え菌の培養方法
【課題】本発明は、ポリオール化合物、特にアルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を用いた培養過程において、原料炭素源の消費及びアルキルジオール生産を促進する酸化還元電位条件下に調節した上で、当該微生物を培養することによって、目的の化合物をより効率的に生産する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行ったところ、培養液中の酸化還元電位値が−１０〜１００mVとなるように、培養時の通気条件を調整した場合に、従来よりも効率よく1,3-プロパンジオールを製造できることを見出した。
【解決手段】本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行ったところ、培養液中の酸化還元電位値が−１０〜１００mVとなるように、培養時の通気条件を調整した場合に、従来よりも効率よく1,3-プロパンジオールを製造できることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルキルジオール生産機能を付与された遺伝子組換え微生物を用いたアルキルジオールの製法方法に関する。特に、アルキルジオール生産機能を付与された遺伝子組換え微生物を培養する工程において、培地中の炭素源を原料として効率よくアルキルジオールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、繊維、エンプラ、フィルムなどの利用価値のあるポリトリメチレンテレフタレートに代表されるポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとして、また環状化合物の合成用出発原料としてなど、広範な用途を有する化合物である。
【０００３】
１，３−プロパンジオールの製造方法としては、大別して、化学合成による方法と微生物を利用した発酵による方法が知られている。化学合成法としては、アクロレインを出発原料として水和反応を行うことによって１，３−プロパンジオールを製造する方法（下記式３）と、エチレンオキシサイドを出発原料とし、合成ガス（CO及びＨ２）存在下、高温、高圧条件下でヒドロホルミル化する反応を行うことによって１，３−プロパンジオールを製造する方法（下記式４）などが挙げられる。
【０００４】
（式３）
【化１】
【０００５】
（式４）
【化２】
【０００６】
一方、生物学的な方法としては、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができる微生物として、例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属などに属する嫌気性細菌を利用する方法が挙げられる。また、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができるように改良された遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法が挙げられる。
【０００７】
嫌気性菌などを利用する方法としては、非特許文献１に代表されるように、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を培養する工程において、グリセロールを添加して酸素を遮断した嫌気的な条件下で生育させることによって、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換して、１，３−プロパンジオールを得る方法がある。また、非特許文献２に代表されるように、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を嫌気条件下で培養する工程におけるグリセロールから１，３−プロパンジオールを生産する嫌気発酵プロセスにおいて、嫌気状態をモニタリングするパラメーターとして酸化還元電位（ＯＲＰ）を用い、ＯＲＰ値を−１９０ｍＶとした嫌気条件下で培養を制御することによる方法が記載されている。これらのグリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができる嫌気性細菌では、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを経由する2ステップの反応で１，３−プロパンジオールに転換され、この反応に関与する酵素として３つのサブユニットからなるグリセロールデヒドラターゼ（EC４．２．１．３０）、及び、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（EC１．１．１．２０２）が明らかにされている。これらのグリセロールからの１，３−プロパンジオール生産に関わる遺伝子はオペロン構造を形成していることが明らかにされており、２つのサブユニットからなるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、アデノシルトランスフェラーゼ（EC２．５．１．１７）などをコードする遺伝子が含まれる（非特許文献３）。これらの一群の遺伝子によってコードされる酵素が作用する結果、グリセロールから１，３−プロパンジオールが生成し、培養液中に蓄積する。しかし、これらの嫌気性細菌を用いた嫌気発酵プロセスによるグリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産においては、厳密に酸素を遮断する必要があり、工業生産には不向きである。
【０００８】
グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができるように改良された遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法としては、特許文献１に代表されるように、出芽酵母（Ｓａｃｃｈｓｔｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール−３−リン酸への転換を触媒するグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）をコードする遺伝子であるＤＡＲ１、及び、グリセロール−３−リン酸からグリセロールへの転換を触媒するＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子であるＧＰＰ２と、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離されたグリセロールデヒドラターゼの３つのサブユニットをコードする遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、及び、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２つのサブユニットをコードする遺伝子ｏｒｆＸ、ｏｒｆＺ、及び、ｏｒｆＷ、ｏｒｆＹなどを有するプラスミドが導入された大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてグリセロールを生成させ、１，３−プロパンジオールへと転換することによる１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。この方法はグルコースなどの糖類を出発物質とした１，３−プロパンジオールの製造方法であり、溶存酸素濃度（ＤＯ）を調節することによって培養が行われている。
【０００９】
また、特許文献２では、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子、又は、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を有するプラスミドとジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２つのサブユニットをコードする遺伝子を有するプラスミドが導入された大腸菌株を用いて、その培養菌体から抽出した粗酵素液又はトルエン処理菌体を用いてグリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得て、この３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドをパラジウムカーボンを触媒として用いた化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造する方法が記載されている。すなわち、特許文献２に記載の方法では、菌体を予め処理する必要があり、生物学的方法と化学的合成方法の２段階の反応が必要となる。
【００１０】
近年、化石資源の枯渇問題や地球温暖化問題の観点から、再生可能資源としてバイオマス（植物資源）由来の原料からの化学品・エネルギー生産体系の確立に対して社会的に需要が高まってきている。例えば、バイオマス由来のエネルギーの一つとして、植物油由来のトリグリセリドとメタノールのエステル交換反応によって得られる長鎖脂肪酸メチルエステルであるバイオディーゼルが挙げられる。このエステル交換反応では原料のトリグリセリドに由来するグリセロールが副生するため、バイオマス由来燃料としてのバイオディーゼル進展の課題として副生グリセロールの新たな用途が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００４−０３３６４６
【特許文献２】特開２００５−１０２５３３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．２０，８２−８６（１９９７）
【非特許文献２】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９，５５４−５６３（２００６）
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．１９，２６３−２７２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ポリオール化合物、特にアルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を用いた培養過程において、原料炭素源の消費及びアルキルジオール生産を促進する酸化還元電位条件下に調節した上で、当該微生物を培養することによって、目的の化合物をより効率的に生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は上記課題を解決するために、アルキルジオール生産能を有する遺伝子組換え微生物の培養条件に注目し、鋭意研究を行った。
【００１５】
本発明者らは、再生可能資源であるバイオマス（炭素源）を原料としてアルキルジオールを製造するために、まず、アルキルジオール生産能を有する遺伝子組換え微生物の構築を行った。クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子、及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された発現プラスミドベクターpSP-KGR1の構築を行った。さらに、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来のアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子が導入されたプラスミドベクターpMU-KAT1の構築を行った。
【００１６】
次に、本発明者らは、得られたプラスミドベクターpSP-KGR1及びpMU-KAT1で形質転換されたE.coli W3110株を用いて、培養条件を調整することにより、より効率的な1,3-プロパンジオール生産方法の検討を行った。具体的には、培地中に存在するグリセロールを原料として１，３−プロパンジオールを生産させるための培養工程において、培養液の酸化還元電位（ＯＲＰ）が生産菌の良好な生育、及び、１，３−プロパンジオール生産のために重要な因子であることを見出し、培養時の酸化還元電位（ＯＲＰ）値の調整を行い、各条件における、原料炭素源の消費状況及びアルキルジオール生産状況の確認を行った。
【００１７】
その結果、本発明者らは、培養液中の酸化還元電位値が−１０〜１００mV（好ましくは−１０〜５０mV）となるように、培養時の酸化還元電位を調整した場合に、従来よりも効率よく1,3-プロパンジオールを製造できることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、アルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を用いた、アルキルジオールの効率的な生産方法を提供する。
【００１９】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕培養液中の炭素源を利用して下記式１で表されるアルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔式１〕
【化３】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
〔２〕遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養した後に、〔１〕に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とする、アルキルジオールの製造方法。
〔３〕遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、培養液中の酸化還元電位が-10〜100 mVから選択される範囲であるときに、該前培養後に〔１〕に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔４〕前記培養液中の炭素源がグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、酢酸、クエン酸、エタノール、メタノールから選択される少なくとも一つ以上の炭素源を含むことを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔５〕前記遺伝子組換え微生物の宿主がエシャリヒア（Escherichia）属の微生物であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔６〕前記アルキルジオールが1,3-プロパンジオールであることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔７〕前記遺伝子組換え微生物が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のタンパク質又は酵素を発現する遺伝子を少なくとも１つ以上有することを特徴とする、〔６〕に記載の1,3-プロパンジオールの製造方法；
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、及び
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有する酵素。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、再生可能資源由来の原料であるグルコース、グリセロールなどの炭水化物原料から効率よくアルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）を製造する方法が提供された。本発明の方法は、より安価な原料を利用してアルキルジオールを製造することができるという点で工業的に有利である。本発明によって、再生可能資源を原料としたアルキルジオールの生産が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】プラスミドpSP-KGR1及びpMU-KAT1の構造を示す図である。
【図２】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図３】エアー通気を停止したときの酸化還元電位値（ORP値）及び生成した1,3-プロパンジオールの関係を示す図である。縦軸は最終1,3-プロパンジオール蓄積濃度、横軸は酸化還元電位値（mV）を示す。
【図４】酸化還元電位値（ORP値）が12mVにおいて、攪拌を200rpmとし、エアー通気を停止した場合の、E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図５】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。好気条件下で培養を継続した場合（Ａ）、及びDOが0%となった後、ORP約20 mVで攪拌を200 rpmとし、エアー通気を停止して更に培養を継続した場合（Ｂ）の結果をそれぞれ示す。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図６】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。好気条件下で40時間培養した後、ORPを-20 mVで維持しながら培養を継続した場合（Ａ）、及び、好気条件下で40時間培養した後、ORPを10-50 mVに調整するためにDOを2%制御しながら培養を継続した場合（Ｂ）の結果をそれぞれ示す。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、アルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を利用したアルキルジオールの製造方法に関する。より具体的には、アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される少なくとも一つの活性物質と、炭素源を接触させる工程、及び、アルキルジオールを回収する工程を含む、アルキルジオールの製造方法に関する。
【００２３】
本発明において、アルキルジオールは（式２）で表される反応を経て、（式１）で表されるアルキルジオールとして生成されることが好ましい。
【００２４】
〔式２〕
【化４】
【００２５】
〔式１〕
【化５】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
【００２６】
本発明において、式１中、Ｒ基は少なくとも１つ以上の水酸基を有する炭素数１〜４個のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基又はtert-ブチル基）であることが好ましい。
【００２７】
本発明において製造される好ましいアルキルジオールとしては、前記式１において、たとえばＲ基が少なくとも１つ以上の水酸基を有する炭素数１〜４個のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、あるいはイソプロピル基）である化合物を挙げることができる。
【００２８】
より具体的には、本発明において生成されるアルキルジオールとして、1,3-プロパンジオール（式１及び式２においてＲが共にヒドロキシメチルの場合）を好ましい例として挙げることができる。本発明において生成される、1,3-プロパンジオールの光学活性は特に制限されるものではなく、炭素の１位及び３位が(R) 又は (S)（Ｒ体又はＳ体）の光学活性1,3-プロパンジオールが、本発明において生成される1,3-プロパンジオールに包含される。
【００２９】
アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物等を炭素源と接触させることにより、炭素源を遺伝子組換え微生物によって資化せしめ、目的とする酵素反応を行わせることによって、アルキルジオールの製造を行うことができる。なお、遺伝子組換え微生物と発酵性基質の接触形態としては、培養液中における培養方法を例示することができるが、これに限定されるものではない。炭素源は、遺伝子組換え微生物が発酵性基質を資化し、且つ、目的とする酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
【００３０】
アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物、又はその処理物と炭素源を接触せしめてアルキルジオールを製造する際には、遺伝子組換え微生物の生育状況及びアルキルジオール生産に係る酵素活性にとって好ましい条件を選択することができる。
【００３１】
本発明は、アルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法に関する。
【００３２】
本発明における、培養液中の酸化還元電位値は、−１０〜１００mVの範囲であれば特に限定されるものではないが、−１０〜５０mVの範囲がであることが好ましい。
【００３３】
本発明において、培養液中の酸化還元電位値は、エアー通気量、酸素や窒素などのガス比率、攪拌速度などを変化させることにより調節を行うことが可能である。また培養液中の酸化還元電位値は、酸化剤又は還元剤の添加等により調節をしてもよい。
【００３４】
本発明において、上記培養条件でアルキルジオールを遺伝子組換え微生物に生産させる前段階で、遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、遺伝子組換え微生物を増殖させてもよい。本前段階の培養において、培養液中の酸化還元電位値を−１０〜１００mVに調節してもよい。
【００３５】
本発明において、アルキルジオールを生産するための原料である「炭素源」とは、基質が少なくとも１つの炭素原子を含む微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。その種類は限られるものではないが、好ましくはグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類、及び、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類を、より好ましくはグリセロールを挙げることができる。これらの炭素源は、単一種類のものを用いてもよいし、または、複数種類のものを用いてもよい。
【００３６】
本発明において、アルキルジオールを生産するための原料である炭素源の濃度に特に制限はないが、通常０．１〜３０％程度、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％の濃度が用いられる。
【００３７】
また、炭素源は培養開始時に一括して添加することも可能であるが、培養液中に連続的、もしくは間欠的に添加することも可能である。
【００３８】
上記方法に好適に使用される遺伝子組換え微生物としては、式２で示される反応を触媒する好適な酵素を機能的に発現する形質転換体を上げることができる。
【００３９】
１つ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに各遺伝子を導入する方法、一つ、もしくは、それ以上の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００４０】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００４１】
本発明における式２で示される反応を触媒する好適な酵素活性が増強された形質転換体の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したもの、精製酵素、形質転換体や酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物などが含まれる。
【００４２】
また、本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、式２で示される反応を触媒する酵素遺伝子を単離した後、エシャリヒア（Escherichia）属の微生物（例えば大腸菌）などを宿主として活性を増強させた遺伝子組換え大腸菌を用いることができる。本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌は、一般的に大腸菌の培養に用いられる培地で培養することができ、公知の方法によって発現誘導することによって高発現させることができる。例えば、当該酵素活性が増強された大腸菌を２×ＹＴ培地（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中で培養し、イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって発現誘導させ、十分に増殖させた後に、培養液をそのまま、もしくは、菌体を回収してアルキルジオール生産に用いることができる。
【００４３】
アルキルジオール生産に使用する本発明の遺伝子組換え微生物は、炭素源を含むアルキルジオール生産用培養液で生育させながらアルキルジオールを生産させても良く、予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体を用いても良い。
【００４４】
予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体の量は、通常は、発酵性基質を含むアルキルジオール生産用発培養液量に対して０．１〜１００％、好ましくは０．５〜５０％、より好ましくは１〜２０％程度用いることができる（ここで言う「％」は、アルキルジオール生産用培養液に対する植菌率を示しており、「[予め増殖させた培養液]／[アルキルジオール生産用発酵液](ｖ／ｖ)」を意味する）。
【００４５】
アルキルジオール生産用培地液は、アルキルジオールを生産するための炭素源以外にも、必要に応じてアルキルジオールの生産を促進するものが含まれていることが好ましく、本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌の栄養源となる培地成分を含んでいてもよい。具体的には、大腸菌の培養に用いられる培地であるＬＢ（１．０％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、２×ＹＴ（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）にアルキルジオールを生産するための炭素源を添加したものや、Ｍ９Ｇ培地（６０ｇ／Ｌグリセロール、６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）などを挙げることができ、適宜、好ましい炭素源の種類、量の培地を用いることができる。予め培養して十分量の菌体をアルキルジオール生産用培地液に供する場合は、より高濃度の発酵性基質の存在下でアルキルジオールの生産を行うことができ、上記培地を除くこともできる。また、必要に応じて培地液中のｐＨを、アルキルジオール生産に適したｐＨに維持させるための成分、例えば緩衝剤を１０ｍＭ〜８００ｍＭ、好ましくは、５０〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜２５０ｍＭ含んでいてもよく、具体的には、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。発酵温度は本発明の遺伝子組換え微生物が炭素源の資化能力を発現でき、且つ、式２で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、アルキルジオールを生成できる温度であれば良く、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。またｐＨも、式２で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、アルキルジオールを生成できるｐＨであれば良く、通常はｐＨ４〜１２、好ましくは、ｐＨ５〜1１、より好ましくはｐＨ６〜９で行うことができる。また、発酵は攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【００４６】
本発明のアルキルジールの製造は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、バッチ式、流加式、連続式のいずれの生産方式で行うことも可能であり、固定化菌体、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００４７】
反応により生成したアルキルジオールの精製は、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４８】
たとえば、微生物菌体を含む発酵液を遠心分離や膜濾過等によって微生物菌体を除去、タンパク質を除去した後、水溶液中から、濃縮、蒸留などの公知の方法によりアルキルジオールを精製することができる。
【００４９】
本発明の遺伝子組換え微生物は、アルキルジオール生産に係る酵素、すなわち式２で示される反応を触媒する好適な酵素を発現する遺伝子を有している。
【００５０】
本発明において、式２に表される通り、ヒドロキシアルキルジオールからヒドロキシアルキルアルデヒドを生成する酵素としては、IUBMB（INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY）により、脱水反応を触媒するグリセロールデヒドラターゼ（glycerol dehydratase、EC 4.2.1.30)及びジオールデヒドラターゼ（diol dehydratase、EC4.2.1.28)等の酵素を挙げることができる（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/）。
【００５１】
EC番号とは、酵素を反応形式に従って系統的に分類するための４組の数字より成る番号で、国際生化学分子生物学連合の酵素委員会によって定義づけられている酵素の番号である。具体的には、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成を触媒する酵素（例えばグリセロールデヒドラターゼ）を挙げることができる。
【００５２】
より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子産物が挙げられる。
【００５３】
本発明においてグリセロールデヒドラターゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３又は５のいずれかに記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３又は５のいずれかに記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００５４】
本発明において、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素」のホモログは、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素」と表すことができる。当該ホモログは、特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において「機能的に同等」とは、本明細書に記載する、各酵素の酵素活性（触媒反応、化学反応等）と同じ機能を有することを意味する。
【００５５】
ある特定の配列番号に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００５６】
当業者であれば、本明細書において開示された塩基配列からなる各酵素のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、各酵素のホモログを得ることが可能である。
【００５７】
さらに、本発明の各酵素のホモログとは、各酵素に対応した配列番号に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%以上）の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、例えばSWISS-PROT, PIR, DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００５８】
本発明に記載の各酵素は、当該酵素と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明の各酵素あるいはそのホモログは、各酵素と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい。
【００５９】
本発明に記載された各酵素をコードするポリヌクレオチドは、以下のような方法によって単離することができる。例えば、各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより本発明のDNAを得ることができる。さらに、得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、各酵素のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６０】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局）などにより各酵素のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００６１】
なお本発明において、各酵素のポリヌクレオチドとしては、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００６２】
ハイブリダイゼーションにおいては、各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列の相補配列またはその部分配列からなる核酸（DNAまたはRNA）をプローブとして、対象とする核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上（例えば各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列の全長）を用いる。プローブに各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００６３】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００６４】
本発明において、式２に表される通りNADH及び／又はNADPHを補酵素として、３−ヒドロキシアルキルアルデヒドを還元し、アルキルジオール（１，３−アルキルジオール）を生成する酵素としては、IUBMB（INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY）により、アルデヒドを還元する反応を触媒する1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（遺伝子名dhaT、EC1.1.1.202）、又はアルコールデヒドロゲナーゼ（遺伝子名がyqhD、EC1.1.-.-）等の酵素を挙げることができる（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/）。
【００６５】
具体的には、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから１，３−プロパンジオールの生成を触媒する酵素（例えば１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ）を挙げることができる。本酵素もしくは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子は例えばdhaT、yqhDなどが挙げられる。
【００６６】
より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子産物が挙げられる。
【００６７】
本発明において１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１１に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００６８】
更に、式２で示される反応を触媒する好適な酵素を機能的に発現する形質転換体に、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子若しくはジオールデヒドラターゼ再活性化因子（Accession No. AF017781の遺伝子）、及び／又は、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（EC2.5.1.17に分類される数種類の酵素）を同時に導入することによって、より効率的なアルキルジオールの生産を行うことも可能である。
【００６９】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子としては、より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子が挙げられる。
【００７０】
本発明においてグリセロールデヒドラターゼ再活性化活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：８又は１０に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：７又は９に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：７又は９に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００７１】
アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子としては、より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）など由来のアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００７２】
本発明においてアデノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００７３】
本発明において少なくとも各酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、各酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、各酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００７４】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００７５】
微生物菌体内などにおいて、本発明の各酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００７６】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００７７】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００７８】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００７９】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００８０】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101（Mol. Gen. Genet. 196, 175 （1984）等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００８１】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００８２】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 （1979））等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００８３】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である （J. Gen. Microbiol. 138,1003 （1992））。
【００８４】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99 （1991） ）、pUWL-KS （Gene 165,149-150 （1995） ）等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 （1997） ）。
【００８５】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００８６】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 （1981））、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００８７】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 （1986））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 （1987））。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００８８】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 （1985））などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 （1990））等が利用可能である。
【００８９】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 （1991））。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 （1985））、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 （1987））。
【００９０】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 （1987））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００９１】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 （1989））。
【００９２】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology 7, 596-603 （1989））。
【００９３】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 （1985））、菜種、トウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用できる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９５】
〔実施例１〕グリセロールデヒドラターゼ遺伝子高発現プラスミドpSU-KGD1の構築
クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）より、Nucleic. Acids Res. 8, 4321 (1980)の方法に従ってゲノムＤＮＡを精製した。
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来グリセロールデヒドラターゼ遺伝子の塩基配列をもとに、gldA遺伝子の上流部位より、対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGLDA-A1 (5’-gtctcATGAAACGTTCAAAACGTTTTGCAGTACTGGC-3’、配列番号：１５)を合成し、gldC遺伝子の下流部位より、対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGLDC-T1 (5’-gactctagaTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGACGCTGCTG-3’、配列番号：１６)を合成した。 クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素BspHI及びXbaIを用いて2重消化し、NcoI及びXbaIを用いて2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KGD1を得た。
【００９６】
〔実施例２〕グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子高発現プラスミドpSU-KGR1の構築
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の塩基配列をもとに、orf2b(gdrB)遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGDRB-A1 (5’-gaggaattcatacATGTCACTTTCACCTCCAGGTGTACGC-3’、配列番号：１７)及びプライマーKpGDRB-T1 (5’-tttagaattcctctagaTCAGTTTCTCTCACTTAACGGCAGGAC-3’、配列番号：１８)を合成し、dhaB4(gdrA)遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGDRA-A1 (5’-tctagaggaattctaaaATGCCGTTAATAGCCGGGATTGATATC-3’、配列番号：１９)及びプライマーKpGDRA-T1 (5’- gacaagcttctagaTTAATTAGCTTGACCAGCCAGTAGCAG-3’、配列番号：２０)を合成した。クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行い、orf2b(gdrB)及びdhaB4(gdrA)を含むDNA断片を調製した。更に、これらのDNA断片を用いてPrimer KpGdrB-A1及びPrimer KpGdrA-T1のプライマーセットを用いて同様にPCRを行い、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子を含むDNA断片を得た。増幅DNA断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KGR1を得た。
【００９７】
〔実施例３〕1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子高発現プラスミドpSU-KPD1の構築
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、dhaT遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpPDH-A1 (5’-ctgcatATGTCATATCGTATGTTTGATTATCTGGTG-3’、配列番号：２１)及びプライマーKpPDH-T1 (5’-gtcttaaTTAAAATGCTTGACGGAAAATCGCGGCAA-3’、配列番号：２２)を合成した。クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素NdeI及びPacIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KPD1を得た。
【００９８】
〔実施例４〕グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子高発現プラスミドpSD-KGR1の構築
実施例２で得られたプラスミドpSU-KGR1を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、KpGDR遺伝子を含む約2.2 bpのバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSU-KGD1（実施例１）をMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を同時に発現可能なプラスミドであるpSD-KGR1を得た。
【００９９】
〔実施例５〕グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子高発現プラスミドpSP-KGR1の構築
実施例３で得られたプラスミドpSU-KPD1を制限酵素SacI及びPacIを用いて2重消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、KpPDH遺伝子を含む約1.3 bpのバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSD-KGR1（実施例４）をMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼを同時に発現可能なプラスミドであるpSP-KGR1（図１）を得た。
【０１００】
〔実施例６〕アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子高発現プラスミドpMU-KAT1の構築
クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、pduO遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKoADT-A1 (5’- agtacatATGGCaATTTATACCCGtACGGGCGACGC-3’、配列番号：２３)及びプライマーKoADT-T1 (5’- atgattaattaaTtATTGATGAGTTCCCACGTTAATGG-3’、配列番号：２４)を合成した。クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプライマーSE420U-F (5'-CGTGAGCTATGAGAAGTCGACGTTTTTTGCGCCGACATCATAACG-3'、配列番号：２５)及びプライマーSE420U-R (5'-GGAAAACTGTCCATAACGCGTAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCA-3'、配列番号：２６)を合成し、pSE420U（WO 2006-132145）を鋳型として各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。また、オリゴヌクレオチドプライマーMW219-F (5'-TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTA-3'、配列番号：２７)及びプライマーMW219-R (5'-TATGGACAGTTTTCCCTTTGATATGTAACG -3'、配列番号：２８)を合成し、pMW219（Nippon gene製）を鋳型として各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。pME420Uより増幅したDNA断片とpMW219を鋳型として増幅したDNA断片をライゲーションすることによりプラスミドpMW219Uを構築した。
【０１０２】
クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のゲノムDNAよりPCR増幅したDNA断片を制限酵素NdeI及びPacIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpMW219UにMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子をもつプラスミドであるpMU-KAT1（図１）を得た。
【０１０３】
〔実施例７〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-1
実施例５及び６で得られたプラスミドpSP-KGR1及びpMU-KAT1で形質転換されたE. coli W3110株を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地（６０ｇ／Ｌグリセロール、６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。培養中、DO（溶存酸素）が0%となり、OD600が約10に達したところで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止し、さらに培養を継続して計136時間培養した。培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを、HPLCを用いて以下の条件により分析した。その結果、残存グリセロールは22.5 g/L、生成1,3-プロパンジオールは6.62 g/Lであり、グリセロール転換率62.5%、1,3-プロパンジオール モル収率13.4%であった（図２）。
【０１０４】
HPLC分析条件：
カラム：Shodex Ionpak KC-811 (8.0 mm×300 mm) （昭和電工製）
溶離液：10mM 硫酸水溶液
流速：0.7 mL/min
カラム温度：40℃
検出：RI
【０１０５】
〔実施例８〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-2
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。培養中、DO（溶存酸素）が0%となった前後で攪拌を200 rpm、エアー通気を停止して更に培養を継続し、計136時間培養した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、攪拌を200 rpm、エアー通気を停止したときの酸化還元電位値（ORP値）及び生成した1,3-プロパンジオールの関係を図３に示した。図４に示すように、ORP 12 mVで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止した場合に最も高い濃度で1,3-プロパンジオールが生成し、残存グリセロールは17.6 g/L、生成1,3-プロパンジオールは13.6 g/Lであり、グリセロール転換率70.7%、1,3-プロパンジオール モル収率27.6%であった。
【０１０６】
〔実施例９〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-3
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下（即ち、ORPが100 mVよりも十分に高い条件下）で培養を継続して1,3-プロパンジオール生産を行い、62時間培養した結果、残存グリセロールは27.9 g/L、生成1,3-プロパンジオールは3.59 g/Lであり、グリセロール転換率53.5%、1,3-PDモル収率7.24%であった（図５Ａ）。一方、ORP約20 mVで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止して更に培養を継続して1,3-プロパンジオール生産を行い、計62時間培養した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、残存グリセロールは31.7 g/L、生成1,3-プロパンジオールは5.76 g/Lであり、グリセロール転換率47.2%、1,3-PDモル収率11.6%であった（図５Ｂ）。
【０１０７】
〔実施例１０〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-4
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下で培養を継続し、培養中、それぞれDO（溶存酸素）が所定の値となった後、DOを2%、10%、20%で維持しながら培養を継続した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。86時間後の残存グリセロール、生成1,3-プロパンジオール、グリセロール転換率、1,3-PDモル収率を表１に示す。DOを2%で制御したときのORPは33 mVであった。一方、DOを10%、20%で制御したときのORPは何れも100 mVより高い値であった。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
〔実施例１１〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-PD生産-4（嫌気度側バージョン）
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下で40時間培養した後、ORPを-20 mVで維持しながら培養を継続した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、生育、グリセロール消費、1,3-プロパンジオール生産は停止し、計86時間培養した結果、残存グリセロールは42.1 g/L、生成1,3-プロパンジオールは5.0 g/Lであり、グリセロール転換率29.8%、1,3-PDモル収率10.1%であった（図６Ａ）。一方、好気条件下で40時間培養した後、ORPを0-50 mVに調整するためにDOを2%制御しながら培養を継続し、計86時間培養した結果、グリセロールは完全に消費され、生成1,3-プロパンジオールは12.0 g/Lであり、グリセロール転換率100%、1,3-PDモル収率24.2%であった（図６Ｂ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルキルジオール生産機能を付与された遺伝子組換え微生物を用いたアルキルジオールの製法方法に関する。特に、アルキルジオール生産機能を付与された遺伝子組換え微生物を培養する工程において、培地中の炭素源を原料として効率よくアルキルジオールを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，３−プロパンジオールは、繊維、エンプラ、フィルムなどの利用価値のあるポリトリメチレンテレフタレートに代表されるポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとして、また環状化合物の合成用出発原料としてなど、広範な用途を有する化合物である。
【０００３】
１，３−プロパンジオールの製造方法としては、大別して、化学合成による方法と微生物を利用した発酵による方法が知られている。化学合成法としては、アクロレインを出発原料として水和反応を行うことによって１，３−プロパンジオールを製造する方法（下記式３）と、エチレンオキシサイドを出発原料とし、合成ガス（CO及びＨ２）存在下、高温、高圧条件下でヒドロホルミル化する反応を行うことによって１，３−プロパンジオールを製造する方法（下記式４）などが挙げられる。
【０００４】
（式３）
【化１】
【０００５】
（式４）
【化２】
【０００６】
一方、生物学的な方法としては、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができる微生物として、例えば、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属などに属する嫌気性細菌を利用する方法が挙げられる。また、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができるように改良された遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法が挙げられる。
【０００７】
嫌気性菌などを利用する方法としては、非特許文献１に代表されるように、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を培養する工程において、グリセロールを添加して酸素を遮断した嫌気的な条件下で生育させることによって、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換して、１，３−プロパンジオールを得る方法がある。また、非特許文献２に代表されるように、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を嫌気条件下で培養する工程におけるグリセロールから１，３−プロパンジオールを生産する嫌気発酵プロセスにおいて、嫌気状態をモニタリングするパラメーターとして酸化還元電位（ＯＲＰ）を用い、ＯＲＰ値を−１９０ｍＶとした嫌気条件下で培養を制御することによる方法が記載されている。これらのグリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができる嫌気性細菌では、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを経由する2ステップの反応で１，３−プロパンジオールに転換され、この反応に関与する酵素として３つのサブユニットからなるグリセロールデヒドラターゼ（EC４．２．１．３０）、及び、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（EC１．１．１．２０２）が明らかにされている。これらのグリセロールからの１，３−プロパンジオール生産に関わる遺伝子はオペロン構造を形成していることが明らかにされており、２つのサブユニットからなるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子、アデノシルトランスフェラーゼ（EC２．５．１．１７）などをコードする遺伝子が含まれる（非特許文献３）。これらの一群の遺伝子によってコードされる酵素が作用する結果、グリセロールから１，３−プロパンジオールが生成し、培養液中に蓄積する。しかし、これらの嫌気性細菌を用いた嫌気発酵プロセスによるグリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産においては、厳密に酸素を遮断する必要があり、工業生産には不向きである。
【０００８】
グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産することができるように改良された遺伝子組み換え大腸菌を利用する方法としては、特許文献１に代表されるように、出芽酵母（Ｓａｃｃｈｓｔｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール−３−リン酸への転換を触媒するグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）をコードする遺伝子であるＤＡＲ１、及び、グリセロール−３−リン酸からグリセロールへの転換を触媒するＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子であるＧＰＰ２と、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）から単離されたグリセロールデヒドラターゼの３つのサブユニットをコードする遺伝子ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３、及び、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の２つのサブユニットをコードする遺伝子ｏｒｆＸ、ｏｒｆＺ、及び、ｏｒｆＷ、ｏｒｆＹなどを有するプラスミドが導入された大腸菌株を用いて、グルコースを原料としてグリセロールを生成させ、１，３−プロパンジオールへと転換することによる１，３−プロパンジオールを得る方法が記載されている。この方法はグルコースなどの糖類を出発物質とした１，３−プロパンジオールの製造方法であり、溶存酸素濃度（ＤＯ）を調節することによって培養が行われている。
【０００９】
また、特許文献２では、クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のジオールデヒドラターゼをコードする遺伝子、又は、グリセロールデヒドラターゼをコードする遺伝子を有するプラスミドとジオールデヒドラターゼ再活性化因子の２つのサブユニットをコードする遺伝子を有するプラスミドが導入された大腸菌株を用いて、その培養菌体から抽出した粗酵素液又はトルエン処理菌体を用いてグリセロールを脱水して３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを得て、この３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドをパラジウムカーボンを触媒として用いた化学合成法により水素添加して、１，３−プロパンジオールを製造する方法が記載されている。すなわち、特許文献２に記載の方法では、菌体を予め処理する必要があり、生物学的方法と化学的合成方法の２段階の反応が必要となる。
【００１０】
近年、化石資源の枯渇問題や地球温暖化問題の観点から、再生可能資源としてバイオマス（植物資源）由来の原料からの化学品・エネルギー生産体系の確立に対して社会的に需要が高まってきている。例えば、バイオマス由来のエネルギーの一つとして、植物油由来のトリグリセリドとメタノールのエステル交換反応によって得られる長鎖脂肪酸メチルエステルであるバイオディーゼルが挙げられる。このエステル交換反応では原料のトリグリセリドに由来するグリセロールが副生するため、バイオマス由来燃料としてのバイオディーゼル進展の課題として副生グリセロールの新たな用途が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００４−０３３６４６
【特許文献２】特開２００５−１０２５３３号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．２０，８２−８６（１９９７）
【非特許文献２】Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９，５５４−５６３（２００６）
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．１９，２６３−２７２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、ポリオール化合物、特にアルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を用いた培養過程において、原料炭素源の消費及びアルキルジオール生産を促進する酸化還元電位条件下に調節した上で、当該微生物を培養することによって、目的の化合物をより効率的に生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は上記課題を解決するために、アルキルジオール生産能を有する遺伝子組換え微生物の培養条件に注目し、鋭意研究を行った。
【００１５】
本発明者らは、再生可能資源であるバイオマス（炭素源）を原料としてアルキルジオールを製造するために、まず、アルキルジオール生産能を有する遺伝子組換え微生物の構築を行った。クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子、及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された発現プラスミドベクターpSP-KGR1の構築を行った。さらに、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来のアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子が導入されたプラスミドベクターpMU-KAT1の構築を行った。
【００１６】
次に、本発明者らは、得られたプラスミドベクターpSP-KGR1及びpMU-KAT1で形質転換されたE.coli W3110株を用いて、培養条件を調整することにより、より効率的な1,3-プロパンジオール生産方法の検討を行った。具体的には、培地中に存在するグリセロールを原料として１，３−プロパンジオールを生産させるための培養工程において、培養液の酸化還元電位（ＯＲＰ）が生産菌の良好な生育、及び、１，３−プロパンジオール生産のために重要な因子であることを見出し、培養時の酸化還元電位（ＯＲＰ）値の調整を行い、各条件における、原料炭素源の消費状況及びアルキルジオール生産状況の確認を行った。
【００１７】
その結果、本発明者らは、培養液中の酸化還元電位値が−１０〜１００mV（好ましくは−１０〜５０mV）となるように、培養時の酸化還元電位を調整した場合に、従来よりも効率よく1,3-プロパンジオールを製造できることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、アルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を用いた、アルキルジオールの効率的な生産方法を提供する。
【００１９】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。
〔１〕培養液中の炭素源を利用して下記式１で表されるアルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔式１〕
【化３】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
〔２〕遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養した後に、〔１〕に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とする、アルキルジオールの製造方法。
〔３〕遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、培養液中の酸化還元電位が-10〜100 mVから選択される範囲であるときに、該前培養後に〔１〕に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔４〕前記培養液中の炭素源がグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、酢酸、クエン酸、エタノール、メタノールから選択される少なくとも一つ以上の炭素源を含むことを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔５〕前記遺伝子組換え微生物の宿主がエシャリヒア（Escherichia）属の微生物であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔６〕前記アルキルジオールが1,3-プロパンジオールであることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
〔７〕前記遺伝子組換え微生物が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のタンパク質又は酵素を発現する遺伝子を少なくとも１つ以上有することを特徴とする、〔６〕に記載の1,3-プロパンジオールの製造方法；
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、及び
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有する酵素。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によって、再生可能資源由来の原料であるグルコース、グリセロールなどの炭水化物原料から効率よくアルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）を製造する方法が提供された。本発明の方法は、より安価な原料を利用してアルキルジオールを製造することができるという点で工業的に有利である。本発明によって、再生可能資源を原料としたアルキルジオールの生産が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】プラスミドpSP-KGR1及びpMU-KAT1の構造を示す図である。
【図２】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図３】エアー通気を停止したときの酸化還元電位値（ORP値）及び生成した1,3-プロパンジオールの関係を示す図である。縦軸は最終1,3-プロパンジオール蓄積濃度、横軸は酸化還元電位値（mV）を示す。
【図４】酸化還元電位値（ORP値）が12mVにおいて、攪拌を200rpmとし、エアー通気を停止した場合の、E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図５】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。好気条件下で培養を継続した場合（Ａ）、及びDOが0%となった後、ORP約20 mVで攪拌を200 rpmとし、エアー通気を停止して更に培養を継続した場合（Ｂ）の結果をそれぞれ示す。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【図６】E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産の結果を示す図である。好気条件下で40時間培養した後、ORPを-20 mVで維持しながら培養を継続した場合（Ａ）、及び、好気条件下で40時間培養した後、ORPを10-50 mVに調整するためにDOを2%制御しながら培養を継続した場合（Ｂ）の結果をそれぞれ示す。縦軸は残存グリセロール量（g/L）及び1,3-プロパンジオールの生成量（g/L）を、横軸は培養時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、アルキルジオール（例えば１，３−プロパンジオール）生産能を有する遺伝子組換え微生物を利用したアルキルジオールの製造方法に関する。より具体的には、アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される少なくとも一つの活性物質と、炭素源を接触させる工程、及び、アルキルジオールを回収する工程を含む、アルキルジオールの製造方法に関する。
【００２３】
本発明において、アルキルジオールは（式２）で表される反応を経て、（式１）で表されるアルキルジオールとして生成されることが好ましい。
【００２４】
〔式２〕
【化４】
【００２５】
〔式１〕
【化５】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
【００２６】
本発明において、式１中、Ｒ基は少なくとも１つ以上の水酸基を有する炭素数１〜４個のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、イソブチル基又はtert-ブチル基）であることが好ましい。
【００２７】
本発明において製造される好ましいアルキルジオールとしては、前記式１において、たとえばＲ基が少なくとも１つ以上の水酸基を有する炭素数１〜４個のアルキル基（メチル基、エチル基、プロピル基、あるいはイソプロピル基）である化合物を挙げることができる。
【００２８】
より具体的には、本発明において生成されるアルキルジオールとして、1,3-プロパンジオール（式１及び式２においてＲが共にヒドロキシメチルの場合）を好ましい例として挙げることができる。本発明において生成される、1,3-プロパンジオールの光学活性は特に制限されるものではなく、炭素の１位及び３位が(R) 又は (S)（Ｒ体又はＳ体）の光学活性1,3-プロパンジオールが、本発明において生成される1,3-プロパンジオールに包含される。
【００２９】
アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物等を炭素源と接触させることにより、炭素源を遺伝子組換え微生物によって資化せしめ、目的とする酵素反応を行わせることによって、アルキルジオールの製造を行うことができる。なお、遺伝子組換え微生物と発酵性基質の接触形態としては、培養液中における培養方法を例示することができるが、これに限定されるものではない。炭素源は、遺伝子組換え微生物が発酵性基質を資化し、且つ、目的とする酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
【００３０】
アルキルジオール生産に係る酵素活性を機能的に発現する遺伝子組換え微生物、又はその処理物と炭素源を接触せしめてアルキルジオールを製造する際には、遺伝子組換え微生物の生育状況及びアルキルジオール生産に係る酵素活性にとって好ましい条件を選択することができる。
【００３１】
本発明は、アルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法に関する。
【００３２】
本発明における、培養液中の酸化還元電位値は、−１０〜１００mVの範囲であれば特に限定されるものではないが、−１０〜５０mVの範囲がであることが好ましい。
【００３３】
本発明において、培養液中の酸化還元電位値は、エアー通気量、酸素や窒素などのガス比率、攪拌速度などを変化させることにより調節を行うことが可能である。また培養液中の酸化還元電位値は、酸化剤又は還元剤の添加等により調節をしてもよい。
【００３４】
本発明において、上記培養条件でアルキルジオールを遺伝子組換え微生物に生産させる前段階で、遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、遺伝子組換え微生物を増殖させてもよい。本前段階の培養において、培養液中の酸化還元電位値を−１０〜１００mVに調節してもよい。
【００３５】
本発明において、アルキルジオールを生産するための原料である「炭素源」とは、基質が少なくとも１つの炭素原子を含む微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。その種類は限られるものではないが、好ましくはグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、澱粉加水分解物、糖蜜等の糖類、及び、酢酸、クエン酸等の有機酸、エタノール等のアルコール類を、より好ましくはグリセロールを挙げることができる。これらの炭素源は、単一種類のものを用いてもよいし、または、複数種類のものを用いてもよい。
【００３６】
本発明において、アルキルジオールを生産するための原料である炭素源の濃度に特に制限はないが、通常０．１〜３０％程度、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％の濃度が用いられる。
【００３７】
また、炭素源は培養開始時に一括して添加することも可能であるが、培養液中に連続的、もしくは間欠的に添加することも可能である。
【００３８】
上記方法に好適に使用される遺伝子組換え微生物としては、式２で示される反応を触媒する好適な酵素を機能的に発現する形質転換体を上げることができる。
【００３９】
１つ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに各遺伝子を導入する方法、一つ、もしくは、それ以上の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００４０】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００４１】
本発明における式２で示される反応を触媒する好適な酵素活性が増強された形質転換体の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、凍結乾燥やスプレードライなどにより調製した乾燥菌体、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したもの、精製酵素、形質転換体や酵素を固定化した固定化酵素、固定化微生物などが含まれる。
【００４２】
また、本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、式２で示される反応を触媒する酵素遺伝子を単離した後、エシャリヒア（Escherichia）属の微生物（例えば大腸菌）などを宿主として活性を増強させた遺伝子組換え大腸菌を用いることができる。本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌は、一般的に大腸菌の培養に用いられる培地で培養することができ、公知の方法によって発現誘導することによって高発現させることができる。例えば、当該酵素活性が増強された大腸菌を２×ＹＴ培地（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中で培養し、イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって発現誘導させ、十分に増殖させた後に、培養液をそのまま、もしくは、菌体を回収してアルキルジオール生産に用いることができる。
【００４３】
アルキルジオール生産に使用する本発明の遺伝子組換え微生物は、炭素源を含むアルキルジオール生産用培養液で生育させながらアルキルジオールを生産させても良く、予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体を用いても良い。
【００４４】
予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体の量は、通常は、発酵性基質を含むアルキルジオール生産用発培養液量に対して０．１〜１００％、好ましくは０．５〜５０％、より好ましくは１〜２０％程度用いることができる（ここで言う「％」は、アルキルジオール生産用培養液に対する植菌率を示しており、「[予め増殖させた培養液]／[アルキルジオール生産用発酵液](ｖ／ｖ)」を意味する）。
【００４５】
アルキルジオール生産用培地液は、アルキルジオールを生産するための炭素源以外にも、必要に応じてアルキルジオールの生産を促進するものが含まれていることが好ましく、本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌の栄養源となる培地成分を含んでいてもよい。具体的には、大腸菌の培養に用いられる培地であるＬＢ（１．０％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、２×ＹＴ（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）にアルキルジオールを生産するための炭素源を添加したものや、Ｍ９Ｇ培地（６０ｇ／Ｌグリセロール、６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）などを挙げることができ、適宜、好ましい炭素源の種類、量の培地を用いることができる。予め培養して十分量の菌体をアルキルジオール生産用培地液に供する場合は、より高濃度の発酵性基質の存在下でアルキルジオールの生産を行うことができ、上記培地を除くこともできる。また、必要に応じて培地液中のｐＨを、アルキルジオール生産に適したｐＨに維持させるための成分、例えば緩衝剤を１０ｍＭ〜８００ｍＭ、好ましくは、５０〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜２５０ｍＭ含んでいてもよく、具体的には、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。発酵温度は本発明の遺伝子組換え微生物が炭素源の資化能力を発現でき、且つ、式２で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、アルキルジオールを生成できる温度であれば良く、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。またｐＨも、式２で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、アルキルジオールを生成できるｐＨであれば良く、通常はｐＨ４〜１２、好ましくは、ｐＨ５〜1１、より好ましくはｐＨ６〜９で行うことができる。また、発酵は攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【００４６】
本発明のアルキルジールの製造は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、バッチ式、流加式、連続式のいずれの生産方式で行うことも可能であり、固定化菌体、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００４７】
反応により生成したアルキルジオールの精製は、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４８】
たとえば、微生物菌体を含む発酵液を遠心分離や膜濾過等によって微生物菌体を除去、タンパク質を除去した後、水溶液中から、濃縮、蒸留などの公知の方法によりアルキルジオールを精製することができる。
【００４９】
本発明の遺伝子組換え微生物は、アルキルジオール生産に係る酵素、すなわち式２で示される反応を触媒する好適な酵素を発現する遺伝子を有している。
【００５０】
本発明において、式２に表される通り、ヒドロキシアルキルジオールからヒドロキシアルキルアルデヒドを生成する酵素としては、IUBMB（INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY）により、脱水反応を触媒するグリセロールデヒドラターゼ（glycerol dehydratase、EC 4.2.1.30)及びジオールデヒドラターゼ（diol dehydratase、EC4.2.1.28)等の酵素を挙げることができる（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/）。
【００５１】
EC番号とは、酵素を反応形式に従って系統的に分類するための４組の数字より成る番号で、国際生化学分子生物学連合の酵素委員会によって定義づけられている酵素の番号である。具体的には、グリセロールから３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの生成を触媒する酵素（例えばグリセロールデヒドラターゼ）を挙げることができる。
【００５２】
より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来のグリセロールデヒドラターゼ遺伝子産物が挙げられる。
【００５３】
本発明においてグリセロールデヒドラターゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３又は５のいずれかに記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３又は５のいずれかに記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：２、４又は６のいずれかに記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００５４】
本発明において、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素」のホモログは、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素」と表すことができる。当該ホモログは、特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において「機能的に同等」とは、本明細書に記載する、各酵素の酵素活性（触媒反応、化学反応等）と同じ機能を有することを意味する。
【００５５】
ある特定の配列番号に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００５６】
当業者であれば、本明細書において開示された塩基配列からなる各酵素のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、各酵素のホモログを得ることが可能である。
【００５７】
さらに、本発明の各酵素のホモログとは、各酵素に対応した配列番号に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%以上）の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、例えばSWISS-PROT, PIR, DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００５８】
本発明に記載の各酵素は、当該酵素と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明の各酵素あるいはそのホモログは、各酵素と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい。
【００５９】
本発明に記載された各酵素をコードするポリヌクレオチドは、以下のような方法によって単離することができる。例えば、各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより本発明のDNAを得ることができる。さらに、得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、各酵素のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６０】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局）などにより各酵素のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００６１】
なお本発明において、各酵素のポリヌクレオチドとしては、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００６２】
ハイブリダイゼーションにおいては、各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列の相補配列またはその部分配列からなる核酸（DNAまたはRNA）をプローブとして、対象とする核酸に対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した20塩基以上、好ましくは25塩基以上、さらに好ましくは30塩基以上、さらに好ましくは40塩基以上、さらに好ましくは80塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上（例えば各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列の全長）を用いる。プローブに各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列またはその相補配列以外の無関係な配列（ベクター由来の配列など）が含まれる場合には、ネガティブコントロールとしてその配列だけをプローブにして同様にハイブリダイゼーションを行い、同様の条件下で洗浄後にそのプローブが対象とする配列に有意にハイブリダイズしないことを確認してもよい。ハイブリダイゼーションは、ニトロセルロース膜またはナイロン膜などを用いて慣用の方法にて実施することができる（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories; Ausubel, F.M. et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishe Associates/ John Wiley and Sons, New York. NY）。
【００６３】
ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００６４】
本発明において、式２に表される通りNADH及び／又はNADPHを補酵素として、３−ヒドロキシアルキルアルデヒドを還元し、アルキルジオール（１，３−アルキルジオール）を生成する酵素としては、IUBMB（INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY）により、アルデヒドを還元する反応を触媒する1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（遺伝子名dhaT、EC1.1.1.202）、又はアルコールデヒドロゲナーゼ（遺伝子名がyqhD、EC1.1.-.-）等の酵素を挙げることができる（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/）。
【００６５】
具体的には、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドから１，３−プロパンジオールの生成を触媒する酵素（例えば１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ）を挙げることができる。本酵素もしくは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子は例えばdhaT、yqhDなどが挙げられる。
【００６６】
より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子産物が挙げられる。
【００６７】
本発明において１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１１に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１１に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００６８】
更に、式２で示される反応を触媒する好適な酵素を機能的に発現する形質転換体に、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子若しくはジオールデヒドラターゼ再活性化因子（Accession No. AF017781の遺伝子）、及び／又は、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（EC2.5.1.17に分類される数種類の酵素）を同時に導入することによって、より効率的なアルキルジオールの生産を行うことも可能である。
【００６９】
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子としては、より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）など由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子が挙げられる。
【００７０】
本発明においてグリセロールデヒドラターゼ再活性化活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：８又は１０に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：７又は９に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：７又は９に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：８又は１０に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００７１】
アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子としては、より具体的には、クレブシエラ（Klebsiella）属細菌由来の酵素が挙げられ、例えば、クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）など由来のアデノシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００７２】
本発明においてアデノシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｅ）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質。
【００７３】
本発明において少なくとも各酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、各酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、各酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００７４】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００７５】
微生物菌体内などにおいて、本発明の各酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００７６】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００７７】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００７８】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００７９】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００８０】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101（Mol. Gen. Genet. 196, 175 （1984）等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００８１】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００８２】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 （1979））等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００８３】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である （J. Gen. Microbiol. 138,1003 （1992））。
【００８４】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99 （1991） ）、pUWL-KS （Gene 165,149-150 （1995） ）等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 （1997） ）。
【００８５】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００８６】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 （1981））、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００８７】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 （1986））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 （1987））。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００８８】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 （1985））などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 （1990））等が利用可能である。
【００８９】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 （1991））。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 （1985））、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 （1987））。
【００９０】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 （1987））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００９１】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 （1989））。
【００９２】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology 7, 596-603 （1989））。
【００９３】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 （1985））、菜種、トウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用できる。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００９５】
〔実施例１〕グリセロールデヒドラターゼ遺伝子高発現プラスミドpSU-KGD1の構築
クレブシエラ ニューモニエ （Klebsiella pneumoniae）より、Nucleic. Acids Res. 8, 4321 (1980)の方法に従ってゲノムＤＮＡを精製した。
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来グリセロールデヒドラターゼ遺伝子の塩基配列をもとに、gldA遺伝子の上流部位より、対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGLDA-A1 (5’-gtctcATGAAACGTTCAAAACGTTTTGCAGTACTGGC-3’、配列番号：１５)を合成し、gldC遺伝子の下流部位より、対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGLDC-T1 (5’-gactctagaTTAGCTTCCTTTACGCAGCTTATGACGCTGCTG-3’、配列番号：１６)を合成した。 クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素BspHI及びXbaIを用いて2重消化し、NcoI及びXbaIを用いて2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KGD1を得た。
【００９６】
〔実施例２〕グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子高発現プラスミドpSU-KGR1の構築
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の塩基配列をもとに、orf2b(gdrB)遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGDRB-A1 (5’-gaggaattcatacATGTCACTTTCACCTCCAGGTGTACGC-3’、配列番号：１７)及びプライマーKpGDRB-T1 (5’-tttagaattcctctagaTCAGTTTCTCTCACTTAACGGCAGGAC-3’、配列番号：１８)を合成し、dhaB4(gdrA)遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpGDRA-A1 (5’-tctagaggaattctaaaATGCCGTTAATAGCCGGGATTGATATC-3’、配列番号：１９)及びプライマーKpGDRA-T1 (5’- gacaagcttctagaTTAATTAGCTTGACCAGCCAGTAGCAG-3’、配列番号：２０)を合成した。クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行い、orf2b(gdrB)及びdhaB4(gdrA)を含むDNA断片を調製した。更に、これらのDNA断片を用いてPrimer KpGdrB-A1及びPrimer KpGdrA-T1のプライマーセットを用いて同様にPCRを行い、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子を含むDNA断片を得た。増幅DNA断片を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KGR1を得た。
【００９７】
〔実施例３〕1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子高発現プラスミドpSU-KPD1の構築
クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、dhaT遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKpPDH-A1 (5’-ctgcatATGTCATATCGTATGTTTGATTATCTGGTG-3’、配列番号：２１)及びプライマーKpPDH-T1 (5’-gtcttaaTTAAAATGCTTGACGGAAAATCGCGGCAA-3’、配列番号：２２)を合成した。クレブシエラ ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。増幅DNA断片を制限酵素NdeI及びPacIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpSE420U（WO 2006-132145）にMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子をもつプラスミドであるpSU-KPD1を得た。
【００９８】
〔実施例４〕グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子高発現プラスミドpSD-KGR1の構築
実施例２で得られたプラスミドpSU-KGR1を制限酵素EcoRI及びHindIIIを用いて2重消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、KpGDR遺伝子を含む約2.2 bpのバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSU-KGD1（実施例１）をMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子を同時に発現可能なプラスミドであるpSD-KGR1を得た。
【００９９】
〔実施例５〕グリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子高発現プラスミドpSP-KGR1の構築
実施例３で得られたプラスミドpSU-KPD1を制限酵素SacI及びPacIを用いて2重消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、KpPDH遺伝子を含む約1.3 bpのバンドを切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare製)により精製、回収した。得られたDNA断片と、同制限酵素で消化し、フェノール抽出、フェノール-クロロホルム抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿したプラスミドpSD-KGR1（実施例４）をMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び1,3-プロパンジオールデヒドロゲナーゼを同時に発現可能なプラスミドであるpSP-KGR1（図１）を得た。
【０１００】
〔実施例６〕アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子高発現プラスミドpMU-KAT1の構築
クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）由来アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子の塩基配列をもとに、pduO遺伝子の上流部位及び下流部位より、それぞれ対応するオリゴヌクレオチドプライマーKoADT-A1 (5’- agtacatATGGCaATTTATACCCGtACGGGCGACGC-3’、配列番号：２３)及びプライマーKoADT-T1 (5’- atgattaattaaTtATTGATGAGTTCCCACGTTAATGG-3’、配列番号：２４)を合成した。クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のゲノムDNAを鋳型として、各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプライマーSE420U-F (5'-CGTGAGCTATGAGAAGTCGACGTTTTTTGCGCCGACATCATAACG-3'、配列番号：２５)及びプライマーSE420U-R (5'-GGAAAACTGTCCATAACGCGTAAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGCCA-3'、配列番号：２６)を合成し、pSE420U（WO 2006-132145）を鋳型として各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。また、オリゴヌクレオチドプライマーMW219-F (5'-TTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTA-3'、配列番号：２７)及びプライマーMW219-R (5'-TATGGACAGTTTTCCCTTTGATATGTAACG -3'、配列番号：２８)を合成し、pMW219（Nippon gene製）を鋳型として各10 pmolのプライマーセット、0.2 mMのdNTP、AmpliTaq DNAポリメラーゼ用緩衝液(パーキンエルマー社製)、2.5 UのAmpliTaq DNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社製)を含む50 μLの反応液を用い、変性(94℃、30秒)、アニ−ル(50℃、30秒)、伸張(72℃、1分)を30サイクル、PCR iCycle サーマルサイクラー (BIO-RAD製)を用いてPCRを行った。pME420Uより増幅したDNA断片とpMW219を鋳型として増幅したDNA断片をライゲーションすることによりプラスミドpMW219Uを構築した。
【０１０２】
クレブシエラ オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のゲノムDNAよりPCR増幅したDNA断片を制限酵素NdeI及びPacIを用いて2重消化し、同様に2重消化したpMW219UにMighty Mix Ligation Kit(タカラバイオ製)を用いてライゲーションした。ライゲーションしたDNAによって大腸菌JM109株を形質転換し、アンピシリン(50 mg/L)を含むLB培地で生育させ、得られた形質転換株よりプラスミドをQIAprep spin Miniprep Kit (QIAGEN製)により精製した。結果として、アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子をもつプラスミドであるpMU-KAT1（図１）を得た。
【０１０３】
〔実施例７〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-1
実施例５及び６で得られたプラスミドpSP-KGR1及びpMU-KAT1で形質転換されたE. coli W3110株を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地（６０ｇ／Ｌグリセロール、６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。培養中、DO（溶存酸素）が0%となり、OD600が約10に達したところで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止し、さらに培養を継続して計136時間培養した。培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを、HPLCを用いて以下の条件により分析した。その結果、残存グリセロールは22.5 g/L、生成1,3-プロパンジオールは6.62 g/Lであり、グリセロール転換率62.5%、1,3-プロパンジオール モル収率13.4%であった（図２）。
【０１０４】
HPLC分析条件：
カラム：Shodex Ionpak KC-811 (8.0 mm×300 mm) （昭和電工製）
溶離液：10mM 硫酸水溶液
流速：0.7 mL/min
カラム温度：40℃
検出：RI
【０１０５】
〔実施例８〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-2
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。培養中、DO（溶存酸素）が0%となった前後で攪拌を200 rpm、エアー通気を停止して更に培養を継続し、計136時間培養した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、攪拌を200 rpm、エアー通気を停止したときの酸化還元電位値（ORP値）及び生成した1,3-プロパンジオールの関係を図３に示した。図４に示すように、ORP 12 mVで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止した場合に最も高い濃度で1,3-プロパンジオールが生成し、残存グリセロールは17.6 g/L、生成1,3-プロパンジオールは13.6 g/Lであり、グリセロール転換率70.7%、1,3-プロパンジオール モル収率27.6%であった。
【０１０６】
〔実施例９〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-3
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下（即ち、ORPが100 mVよりも十分に高い条件下）で培養を継続して1,3-プロパンジオール生産を行い、62時間培養した結果、残存グリセロールは27.9 g/L、生成1,3-プロパンジオールは3.59 g/Lであり、グリセロール転換率53.5%、1,3-PDモル収率7.24%であった（図５Ａ）。一方、ORP約20 mVで攪拌を200 rpm、エアー通気を停止して更に培養を継続して1,3-プロパンジオール生産を行い、計62時間培養した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、残存グリセロールは31.7 g/L、生成1,3-プロパンジオールは5.76 g/Lであり、グリセロール転換率47.2%、1,3-PDモル収率11.6%であった（図５Ｂ）。
【０１０７】
〔実施例１０〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-プロパンジオール生産-4
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下で培養を継続し、培養中、それぞれDO（溶存酸素）が所定の値となった後、DOを2%、10%、20%で維持しながら培養を継続した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。86時間後の残存グリセロール、生成1,3-プロパンジオール、グリセロール転換率、1,3-PDモル収率を表１に示す。DOを2%で制御したときのORPは33 mVであった。一方、DOを10%、20%で制御したときのORPは何れも100 mVより高い値であった。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
〔実施例１１〕E. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を用いた1,3-PD生産-4（嫌気度側バージョン）
実施例７と同様の方法によって得られたE. coli W3110 (pSP-KGR1/pMU-KAT1)を、アンピシリン（50 mg/L）及びカナマイシン（50 mg/L）を含む液体LB培地（1.0%バクト−トリプトン、0.5%バクト−酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、試験管中、33℃で終夜振とう培養した。この培養菌体14 mLを、アンピシリン（50 mg/L）、カナマイシン（50 mg/L）、0.02 mM IPTG、20 mg/L CN-Cblを含む1.2 LのＭ９Ｇ培地に植菌し、33℃、pH 7.5に維持し、0.5 vvmでエアー通気下、580 rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。好気条件下で40時間培養した後、ORPを-20 mVで維持しながら培養を継続した。実施例７と同様の方法により、培養液の遠心分離上清中のグリセロール及び1,3-プロパンジオールを分析した。その結果、生育、グリセロール消費、1,3-プロパンジオール生産は停止し、計86時間培養した結果、残存グリセロールは42.1 g/L、生成1,3-プロパンジオールは5.0 g/Lであり、グリセロール転換率29.8%、1,3-PDモル収率10.1%であった（図６Ａ）。一方、好気条件下で40時間培養した後、ORPを0-50 mVに調整するためにDOを2%制御しながら培養を継続し、計86時間培養した結果、グリセロールは完全に消費され、生成1,3-プロパンジオールは12.0 g/Lであり、グリセロール転換率100%、1,3-PDモル収率24.2%であった（図６Ｂ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液中の炭素源を利用して下記式１で表されるアルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔式１〕
【化１】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
【請求項２】
遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養した後に、請求項１に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とする、アルキルジオールの製造方法。
【請求項３】
遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、培養液中の酸化還元電位が-10〜100 mVから選択される範囲であるときに、該前培養後に請求項１に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
【請求項４】
前記培養液中の炭素源がグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、酢酸、クエン酸、エタノール、メタノールから選択される少なくとも一つ以上の炭素源を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子組換え微生物の宿主がエシャリヒア（Escherichia）属の微生物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項６】
前記アルキルジオールが1,3-プロパンジオールであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項７】
前記遺伝子組換え微生物が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のタンパク質又は酵素を発現する遺伝子を少なくとも１つ以上有することを特徴とする、請求項６に記載の1,3-プロパンジオールの製造方法；
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、及び
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有する酵素。
【請求項１】
培養液中の炭素源を利用して下記式１で表されるアルキルジオールを生産するように改変された遺伝子組換え微生物を、培養液中の酸化還元電位値が-10〜100 mVの条件下で培養することを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
〔式１〕
【化１】
（式中、Ｒは、1以上の水酸基を有する炭素数１から４個のアルキル基を表す。）
【請求項２】
遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養した後に、請求項１に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とする、アルキルジオールの製造方法。
【請求項３】
遺伝子組換え微生物を好気条件下で培養し、培養液中の酸化還元電位が-10〜100 mVから選択される範囲であるときに、該前培養後に請求項１に記載の条件下で培養しアルキルジオールを生産させることを特徴とするアルキルジオールの製造方法。
【請求項４】
前記培養液中の炭素源がグリセロール、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、マンノース、キシロース、ガラクトース、酢酸、クエン酸、エタノール、メタノールから選択される少なくとも一つ以上の炭素源を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項５】
前記遺伝子組換え微生物の宿主がエシャリヒア（Escherichia）属の微生物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項６】
前記アルキルジオールが1,3-プロパンジオールであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のアルキルジオールの製造方法。
【請求項７】
前記遺伝子組換え微生物が、下記(a)から(e)のいずれかに記載のタンパク質又は酵素を発現する遺伝子を少なくとも１つ以上有することを特徴とする、請求項６に記載の1,3-プロパンジオールの製造方法；
（ａ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素、
（ｃ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、
（ｄ）配列番号：１、３、５、７、９、１１又は１３に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する酵素、及び
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２又は１４に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有する酵素。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１３−７０６７５（Ｐ２０１３−７０６７５Ａ）
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１２８１５（Ｐ２０１１−２１２８１５）
【出願日】平成２３年９月２８日（２０１１．９．２８）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月２２日（２０１３．４．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月２８日（２０１１．９．２８）
【出願人】（０００００２９０１）株式会社ダイセル (1,236)
【Ｆターム（参考）】
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