アルツハイマー・アミロイド−ベータ・ペプチドへの結合が増加した、突然変異体低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質
突然変異体低密度リポタンパク質関連タンパク質−１は、野生型相同体に比較して、より高いアフィニティでアルツハイマー・アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合する。この結合を用いて、Ａβを検出するかまたは被験体の体の残りからＡβを分離することも可能である。アルツハイマー病において、該結合を用いて、Ａβを検出することによって診断結果を提供するか、Ａβを除去することによって治療を提供するか、またはその両方を提供することも可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー・アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドへの結合を改善させる、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１の突然変異に関する。この特異的結合を用いて、Ａβを検出するかまたは被験体の体の残りからＡβを分離することも可能である。アルツハイマー病において、本発明を用いて、Ａβを検出することによって診断結果を提供するか、Ａβを除去することによって治療を提供するか、またはその両方を提供することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）の病態に関与することが知られる。このペプチドは、脳実質および血管系におけるアミロイドの主な構成要素である。老人斑から抽出されるＡβは、主に、ペプチドＡβ１−４０（Ａβ４０）およびＡβ１−４２（Ａβ４２）であり；血管アミロイドは、主に、ペプチドＡβ１−３９およびＡβ４０である。血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、および脳に存在するＡβの主な可溶性型はＡβ４０である。血液、ＣＳＦ、および脳間質液（ＩＳＦ）中に循環している可溶性Ａβは、遊離ペプチドとして存在し、そして／またはアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）、アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ）、他のリポタンパク質、アルブミン、α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、およびトランスサイレチンと会合して存在しうる。
【０００３】
アミロイド仮説によると、脳における神経毒性Ａβ４２の集積が、ＡＤ病変形成を開始する主な事象である（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ， ２００２）。Ａβ４２集積の増加は、ＡＤの家族型におけるように、Ａβの産生増加に、そして／または遅発性ＡＤにおけるように、Ａβクリアランス障害に関連する可能性もある（Ｓｅｌｋｏｅ， ２００１； ＺｌｏｋｏｖｉｃおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， ２００３）。脳におけるＡβレベルの増加は、神経毒性Ａβオリゴマーの形成、および進行性のシナプス、神経突起、およびニューロン機能不全を生じる（Ｗａｌｓｈら， ２００２； Ｄａｈｌｇｒｅｎら， ２００２； Ｋａｙｅｄら， ２００３； Ｇｏｎｇら， ２００３）。Ａβ内のミスセンス突然変異は、主に、オランダ突然変異（コドン６９３でのＧからＣ、２２位でのＧｌｕからＧｌｎ）およびアイオワ突然変異（コドン６９４でのＧからＡ、２３位でのＡｓｐからＡｓｎ）を持つ患者におけるように、主に血管沈着に関連する。血管向性（ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ）オランダ（Ｅ２２Ｑ）またはアイオワ（Ｄ２３Ｎ）突然変異体Ａβは、原線維形成増進および脳血管細胞に対する毒性を示し、一方、オランダ／アイオワ二重突然変異体Ａβ（Ｅ２２Ｑ、Ｄ２３Ｎ）は、オランダおよびアイオワ血管向性突然変異体の両方に比較して加速した病態形成特性を有する（Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄら， ２００１）。
【０００４】
終末糖化産物（ＲＡＧＥ）受容体、スカベンジャーＡ型受容体（ＳＲ−Ａ）、天然ＬＲＰ−１、およびＬＲＰ−２などの細胞表面タンパク質は、低ナノモル濃度で遊離ペプチドとして（例えばＲＡＧＥ、ＳＲ−Ａ）、そして／またはアポＥ、アポＪ、またはα２Ｍとの複合体中で（例えば天然ＬＲＰ−１、ＬＲＰ−２）、Ａβに結合する。しかし、野生型相同体よりも高いアフィニティでＡβに直接結合する突然変異体ＬＲＰ−１は、開示されなかった。
【０００５】
ＷＯ ０１／９０７５８およびＵＳ ２００４／０２５９１５９は、脳からのＡβの血管クリアランスを仲介する際のＬＲＰ−１の役割を記載する。ＬＲＰ−１発現または活性の増加を用いて、Ａβを除去することも可能であり、そしてそれによってアルツハイマー病の被験体または該疾患を発展させるリスクがある被験体を治療することも可能であると解説された。
【０００６】
ＷＯ ２００５／１２２７１２およびＵＳ ２００７／００５４３１８は、Ａβに結合させ、そしてＡβを脳から除去するための可溶性ＬＲＰ−１の使用を記載する。ＬＲＰ−１の可溶性クラスターＩＩまたはＩＶ（それぞれ、ＬＲＰＩＩまたはＬＲＰＩＶ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、他の既知のリガンド（例えば、ｔＰＡ、アポＥ２、アポＥ３、アポＥ４、ＭＭＰ９）よりも一桁から二桁高いアフィニティで、Ａβに結合することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＬＲＰ−１の野生型（ｗｔ）クラスターＩＶ（ｗｔ−ＬＲＰＩＶ）は、強いＡβ末梢シンク活性を発揮し、これは脳からのＡβクリアランスを生じ、トランスジェニックマウスにおいて、アミロイド関連病変を有意に減少させ、そして機能的転帰を改善する。Ａβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤（ＫＰＩ）ドメインを有するが、より短いＡＰＰ６９５（ＫＰＩドメインを欠く、脳中の最も一般的なＡＰＰアイソフォーム）ではないＡＰＰ７７０アイソフォームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＬＲＰ−１に結合し、培養線維芽細胞において、ＡＰＰ分解を生じることが示された。Ｄｅａｎｅら（２００４）およびＳａｇａｒｅら（２００７）を参照されたい。
【０００７】
本明細書において、本発明者らは、ＡＰＰ６９５がｗｔ−ＬＲＰＩＶに結合しないことを示す。さらに、ＫＰＩドメインを含有するＡＰＰアイソフォーム（例えば、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、およびｓＡＰＰβ）は、Ａβ結合部位で、ｗｔ−ＬＲＰＩＶに検出可能に結合しない。ＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォームは、ｗｔ−ＬＲＰＩＶに対して非常に弱い結合を示し、該結合は、Ａβに関するものより二桁低かった。ｗｔ−ＬＲＰＩＶに対するＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォームのこの弱い結合は、ＫＰＩ特異的抗体または組換えＫＰＩペプチドで無効にされ、これらはＡβ結合には影響しなかった（すなわち、結合は、ＬＲＰ−１のＡβ結合ポケットに特異的ではなかった）。本発明者らは、アスパラギン酸からグリシンへの残基３４３での単一突然変異（Ｄ３４３Ｇ）を含有する突然変異体ＬＲＰ−１が、ｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも３倍高いアフィニティでＡβ４２に結合し（Ｋｄ 〜１．５ｎＭ）、そしてｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも、Ａβ４０およびＡβ４２に対して、対照マウスにおけるＡβ末梢シンク作用より３０〜５０％の有意に高い作用を発揮することを見出した。さらに、突然変異体ＬＲＰＩＶは、ＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォーム（すなわち、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、およびｓＡＰＰβ）に検出可能には結合せず、そして血液脳関門を横断しなかった。突然変異体ＬＲＰＩＶおよびｗｔ−ＬＲＰＩＶは、どちらも、脳におけるＡＰＰレベルおよび／または代謝を改変するのに失敗した。したがって、脳または末梢において、ＡＰＰ代謝にいかなる有意な影響も及ぼさずに、ｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも、Ａβに対する高い結合アフィニティを持つ突然変異体ＬＲＰ−１を、特異的Ａβシンク剤として用いることも可能である。
【０００８】
突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質および該タンパク質をコードする核酸、薬剤および組成物、ならびに治療法および診断法におけるその使用は、アミロイドの形成および疾患におけるその役割に適用可能であることを本明細書に解説する。重要なことに、突然変異体ＬＲＰ−１は、血液脳関門を越えて中枢神経系からのＡβ枯渇のため、末梢におけるシンクとして作用する。本発明の他の利点を以下に論じるか、またはこうした利点は、これらの考察から、当業者には明らかであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ ０１／９０７５８
【特許文献２】ＵＳ ２００４／０２５９１５９
【特許文献３】ＷＯ ２００５／１２２７１２
【特許文献４】ＵＳ ２００７／００５４３１８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ， ２００２
【非特許文献２】Ｓｅｌｋｏｅ， ２００１
【非特許文献３】ＺｌｏｋｏｖｉｃおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， ２００３
【非特許文献４】Ｗａｌｓｈら， ２００２
【非特許文献５】Ｄａｈｌｇｒｅｎら， ２００２
【非特許文献６】Ｋａｙｅｄら， ２００３
【非特許文献７】Ｇｏｎｇら， ２００３
【非特許文献８】Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄら， ２００１
【非特許文献９】Ｄｅａｎｅら（２００４）
【非特許文献１０】Ｓａｇａｒｅら（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）の突然変異によって、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに対する結合アフィニティを改善することである。天然ＬＲＰ−１による結合に比較した際、突然変異体ＬＲＰ−１が、Ａβに特異的に結合するより高いアフィニティを有することが好ましい。さらに、１またはそれより多いカルシウム結合断片において少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を含むＬＲＰ−１誘導体が、１またはそれより多いカルシウム結合断片における野生型アスパラギン酸を置換しない以外はすべての突然変異を含むＬＲＰ−１誘導体よりも、少なくとも２倍高いアフィニティで、Ａβに結合することが好ましい。より好ましくは、アスパラギン酸置換は、Ａβに対する少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高いアフィニティを生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、突然変異体ＬＲＰ−１を提供する。突然変異体ＬＲＰ−１は、ＬＲＰ−１由来の１またはそれより多いドメイン、および場合によって、ＬＲＰ−１に由来しない１またはそれより多いドメイン（すなわち、天然タンパク質には存在しない異種ドメイン）で構成されてもよい。少なくともクラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶが含有されることが好ましく；クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶのみから本質的になってもよい。より好ましくは、該ＬＲＰ−１は、少なくともクラスターＩＶを含有するか、またはクラスターＩＶのみから本質的になり；他方が存在するならば、クラスターＩＩまたはクラスターＩＶを含有しなくてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１は、場合による他のドメイン：細胞の外への分泌を指示するシグナルペプチド（例えば新生ポリペプチドを小胞体にターゲティングし、膜を渡ってポリペプチドを転位置させ、そして分泌経路を通じて、任意の修飾を伴うポリペプチドを輸送する、疎水性アミノ酸配列）およびポリペプチドを脂質二重層に付着させるドメイン（例えば、膜を渡るドッキングのための膜貫通ドメインまたは膜内への挿入のための脂質ドメイン）を含有してもまたは含有しなくてもよい。溶液中のＡβに結合するには、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が好ましく、これはおそらく、天然タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインを除去することによる。突然変異体ＬＲＰ−１は、固体支持体に、可逆的にまたは非可逆的に付着してもよい（例えば、それぞれ化学的に不安定または安定である、共有結合を用いる）。これは天然ＬＲＰ−１に同一ではなく、したがって、天然アミノ酸配列の１またはそれより多いドメインが突然変異（例えば置換、付加、欠失）しなければならない一方、Ａβへの結合能が改善される（例えば好ましくは、突然変異を持たない同等のタンパク質に比較して、少なくとも２倍優れた結合）。ヒトまたは別の哺乳動物を供給源として用いることもまた好ましく、そして突然変異体ＬＲＰ−１（例えばヒト患者に注入されるヒトまたはヒト化哺乳動物ＬＲＰ−１突然変異体）を投与した被験体において、検出可能な免疫反応が誘発されないこともまた好ましい。
【００１３】
治療において薬剤として（例えば疾患を有する被験体における療法または疾患を発展させるリスクがある被験体における予防）、または診断においてＡβ検出のための直接結合剤として、突然変異体ＬＲＰ−１を用いてもよい。療法または予防組成物は、突然変異体ＬＲＰ−１および少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアー（例えば生理学的塩および緩衝液の溶液）で構成される。体の循環系を通じて、または機械によって（例えばアフェレーシス、または突然変異体ＬＲＰ−１／Ａβ複合体を形成し、そして該複合体を体から除去する他の体外技術）、被験体からＡβを除去することによって、あるいはアミロイド沈着を減少させることによって、Ａβを不活性化させることも可能である。診断組成物は、突然変異体ＬＲＰ−１および少なくとも１つの検出可能標識（例えば、色、酵素、蛍光、発光、磁性または常磁性、あるいは放射性検出のための部分）で構成される。突然変異体ＬＲＰ−１および検出可能標識は共有結合していてもまたはしていなくてもよい。あるいは、１またはそれより多い特異的結合対を通じて付着していてもよい。結合は、被験体の体内または体外で、溶液中で、または支持体上に固定されたものの１つと起こってもよい。Ａβに直接結合した突然変異体ＬＲＰ−１は、実験室アッセイを用いて（すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法）、あるいは蛍光、磁気共鳴、またはＸ線画像化によって、被験体の体において（すなわちｉｎ ｖｉｖｏ診断法）、体液または組織から調製された標本において、検出可能である。被験体は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、以下の詳細な説明および請求項、ならびにその一般化から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１−１は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図１−２】図１−２は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図１−３】図１−３は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図２】図２は、ＬＲＰＩＶ断片がＡβに高いアフィニティで結合することを示す。グラフは、ヒトＡβ４０（図２Ａ）およびＡβ４２（図２Ｂ）の異なるレベルでのＬＲＰＩＶ断片に対する結合曲線である。Ａβ４０（図２Ｃ）およびＡβ４２（図２Ｄ）への断片結合に関する結合定数（Ｋｄ）を示す。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図３】図３は、突然変異体ＬＲＰＩＶが、ＬＲＰ−１の他のリガンドよりも高いアフィニティでＡβに結合することを示す。グラフは、固定されたＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（図３Ａ）およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ（図３Ｂ）に対するヒトアポＥ２（Ｅ２）、アポＥ３（Ｅ３）、アポＥ４（Ｅ４）、ｔＰＡ、ＭＭＰ９、および因子ＩＸａに関する結合曲線である。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（図３Ｃ）およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ（図３Ｄ）へのリガンド結合に関するＫｄを示す。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図４】図４は、突然変異体ＬＲＰＩＶが野生型ＬＲＰＩＶに比較して低いアフィニティでＡＰＰに結合することを示す。グラフは、可溶性ＫＰＩ（クニッツ型プロテアーゼ阻害剤）ドメインおよび抗ＫＰＩ抗体（ｍＡｂ４．１）の非存在下および存在下での、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ６９５（図４Ａ）、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ７７０（図４Ｂ）およびＡＰＰ７５１（図４Ｃ）、ならびに可溶性ＫＰＩドメインおよびｍＡｂ４．１の非存在下および存在下での、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡβ４０（図４Ｄ）およびＡβ４２（図４Ｅ）に関する結合曲線である。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡβ４０、Ａβ４２、ＡＰＰ７７０、及びＡＰＰ７５１結合に関するＫｄを図４Ｆに示す。図４Ｇにおいて、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶおよびＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ７７０結合に関するＫｄを比較する。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図５】図５は、突然変異体ＬＲＰＩＶが、野生型ＬＲＰＩＶよりも高い、脳Ａβを低下させる能力を有することを示す。治療後の血漿Ａβ４０（図５Ａ）、血漿Ａβ４２（図５Ｂ）、脳Ａβ４０（図５Ｃ）、および脳Ａβ４２（図５Ｄ）を示す。対照（すなわち野生型）マウスをビヒクルおよびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（静脈内、２０μｇ／日）で５日間治療した。治療期間終了時、マウスの血漿および脳試料を収集した。ＡβレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
成熟低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）は、少なくとも５つの異なるタイプのドメインで構成される：（ｉ）リガンド結合性システインリッチ反復、（ｉｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体様システインリッチ反復、（ｉｉｉ）ＹＷＴＤ反復、（ｉｖ）膜貫通ドメイン、および（ｖ）細胞質ドメイン。シグナルペプチドは、分泌経路内に転位置した後、切断される。ＬＲＰ−１におけるリガンド結合型ドメインは、２〜１１の間の断片を含有する４つのクラスター（クラスターＩ〜ＩＶ）で存在する。結合部位がマッピングされているＬＲＰ−１に対するリガンドの大部分は、これらのリガンド結合型ドメインと相互作用する（クラスターＩＩおよびＩＶは、個々に、またはともに、Ａβペプチドの結合に寄与する）。これらの後に、ＥＧＦ前駆体相同ドメインが続き、これは、２つのＥＧＦ反復、プロペラ様構造に配置された６つのＹＷＴＤ反復、および別のＥＧＦ反復で構成される。６つのＥＧＦ反復が膜貫通ドメインに先行する。細胞質ドメインは、エンドサイトーシス機構、ならびに細胞シグナル伝達に関与する細胞質アダプターおよび足場タンパク質のドッキング部位として働く、２つのＮＰｘＹ反復で構成される。ＬＲＰ−１の重鎖（５１５ｋＤａ）は４つのリガンド結合ドメインを含有し、そしてＬＲＰ−１の軽鎖（８５ｋＤａ）は膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する。突然変異体ＬＲＰ−１は、重鎖またはその断片のみで構成されてもよい。可溶性ＬＲＰ−１に関しては、該タンパク質は膜貫通ドメインを欠き、そして好ましくはまた細胞質ドメインも欠いてもよい。
【００１７】
ＬＲＰ−１は、いくつかのタンパク質ファミリーに相当する少なくとも３０の異なるリガンドを認識し、これらには、リポタンパク質、プロテイナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤複合体、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、細菌毒素、ウイルス、および多様な他の細胞内タンパク質が含まれる。ＬＲＰ−１に認識されるリガンドの最大グループは、プロテイナーゼまたはタンパク質分解活性制御に関与する分子である。特定のセリンプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼは、ＬＲＰ−１に直接結合する一方、いくつかの他のプロテイナーゼは、特異的阻害剤と複合体化された場合のみに結合する。これらの阻害剤は、タンパク質分解的切断または小分子アミンとの反応後に生じるコンホメーション変化の後にのみ、ＬＲＰ−１によって認識される。対照的に、ＬＲＰ−１は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の天然および複合体化型の両方を認識する。ＬＲＰ−１はまた、多量体マトリックスタンパク質トロンボスポンジン−１およびトロンボスポンジン−２にも結合し、そしてシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａおよびマイナー群ヒト・ライノウイルスを細胞内に送達する。さらに、ＬＲＰ−１は、ＨＳＰ９６、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ならびにＬＲＰ−１および他のＬＤＬ受容体ファミリーメンバーの分子シャペロンとして機能する小胞体常在タンパク質であるＲＡＰを含む、いくつかの細胞内タンパク質を認識する。
【００１８】
ＬＲＰ−１はどのようにして、この多様なリガンドを特異的に認識するのだろうか？ 個々のリガンド結合ドメインの結晶学および核磁気共鳴によって、各リガンド結合ドメインの短いループ中のアミノ酸配列可変性が、反復のユニークな輪郭表面および電荷密度を生じることが明らかになった。異なるリガンド結合ドメインをＬＲＰ−１軽鎖に融合させ、そして細胞における発現後、個々のリガンドのエンドサイトーシスを仲介する能力を測定することによって、ＬＲＰ−１「ミニ受容体」が作製されてきている。好ましくは、可溶性ＬＲＰ−１断片は、組換え技術によって作製されてもよく、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで、異なるリガンドに結合する能力に関して、異なるリガンド結合ドメインをスクリーニングする。本明細書において、本発明者らは、Ａβの特異的結合において、リガンド結合ドメイン（クラスターＩＶを参照されたい）内のカルシウム結合断片の役割を立証する。これらは、協同で作用して、カルシウムおよびＡβペプチドの結合を協調させている可能性もある。したがって、Ａβ結合を異種ポリペプチド上に移植して（免疫原性を減少させるためのげっ歯類抗体のヒト化を参考にされたい）、突然変異体ＬＲＰ−１を作製してもよい。
【００１９】
「断片」は、全長ＬＲＰ−１の分子量より少ない分子量を持つＬＲＰ−１の特定の突然変異である。突然変異体ＬＲＰ−１のアミノ酸配列の分子量は、ＬＲＰ−１の単一リガンド結合ドメインおよび重鎖（５１５ｋＤａ）の分子量の間であってもよい。例えば、突然変異体ＬＲＰ−１は、約３０ｋＤａ〜約５５ｋＤａであってもよいが、より小さいおよびより大きい断片の両方が可能である。特に、可溶性ＬＲＰ−１のクラスターＩＩ（配列番号２）および／またはクラスターＩＶ（配列番号３）、あるいは１またはそれより多いそのカルシウム結合断片が好ましい。したがって、約６５ｋＤａ（一次アミノ酸配列にグリコシル化配列が加わったもの）未満の相対分子量を有する突然変異体ＬＲＰ−１が可能である。対照的に、突然変異体分子量を最小化することが望ましい場合は、突然変異体ＬＲＰ−１からのクラスターＩＩまたはクラスターＩＶのいずれかの排除（すなわちそれぞれ、クラスターＩＶまたはクラスターＩＩのみを含むもの）が好ましい。野生型ＬＲＰ−１タンパク質および該タンパク質をコードする核酸、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列、またはその成熟型は、ヒト（例えば寄託番号ＣＡＡ３２１１２、ＮＰ ００２３２３、Ｑ０７９５４、またはＳ０２３９２）、他の哺乳動物（例えばウシ、モルモット、マウス、ラット）由来であってもよいし、あるいはその多型および変異体であってもよい。天然ＬＲＰ−１タンパク質を化学的に操作（例えば加水分解的切断または酵素的タンパク質分解）して、ポリペプチド断片を作製してもよいが、細菌、カビまたは酵母、昆虫、あるいは哺乳動物細胞または生物における組換え技術によってこれらの断片を作製することが好ましい。遺伝子キメラを用いて、突然変異体ＬＲＰ−１を１またはそれより多い異種ドメインに融合させてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１をコードする核酸を培養細胞または生物内に導入し（例えば核トランスファー、トランスフェクション、遺伝子組換え、特に体内での幹細胞への、または体内への移植）、そこでポリペプチドが翻訳され、そしてプロセシングされてもよい。例えば、突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質は、ウイルス感染またはトランスフェクションによって細胞内に導入される発現構築物から産生されてもよい。発現構築物は、好ましくは、血管細胞特異的であるか、またはウイルス由来であるか、またはその組み合わせである、制御領域（例えばプロモーター、エンハンサー）から転写される。これらは、キャリアー中でタンパク質および他の核酸と会合してもよい（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレトロウイルス由来のウイルス粒子中にパッケージングされるか、リポソーム中に被包されるか、あるいはポリマーと複合体化される）。ｉｎ ｖｉｖｏ治療には、被験体血管系内への、薬学的組成物（例えばウイルスまたは核酸含有溶液）の直接滴下が含まれる。ｅｘ ｖｉｖｏ治療のため、被験体またはドナー由来の細胞（例えば血管細胞またはその子孫）をｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス感染させるかまたはトランスフェクションし、そして次いで、被験体の血管系内に移植してもよい。細胞は、特に脳、動脈、または網内系の臓器の、そしてより特に、血液脳関門の大脳動脈、肝臓、または幹細胞の、血管細胞（例えば平滑筋細胞）であってもよい。
【００２０】
可溶性ＬＲＰ−１を作製する好ましい方法は、野生型膜貫通ドメインを突然変異させる（例えばミスセンスまたは欠失突然変異）ことを伴う。例えば、膜貫通ドメインの前の部位に停止コドンを導入してもよいし、または膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする部分を欠失させてもよい。クラスターＩＶまたはそのいくつかのカルシウム結合断片を含むミニ受容体もまた産生してもよく（例えば遺伝子スプライシングまたはアダプタープライマーを用いた増幅によって）、そしてＡβ結合に用いてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１を、細胞膜の脂質二重層または別の支持体に付着させ、そして次いで、脱離させ／加水分解して、突然変異体ＬＲＰ−１を作製してもよい。例えば、タンパク質分解酵素は、細胞外部のペプチド結合を加水分解可能であるし、またはリパーゼは、脂質二重層中に挿入されたスフィンゴ糖脂質アンカーを加水分解可能である。あるいは、突然変異体ＬＲＰ−１は、Ａβへの結合前、結合中、または結合後に、支持体上に固定されていてもまたはいなくてもよい。
【００２１】
タンパク質融合体を作製し、そして用いてもよい。天然ＬＲＰ−１シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドを用いて、ＥＲ膜を渡ってタンパク質を転位置させ、そして分泌経路を通じて、これを輸送してもよい。突然変異体ＬＲＰ−１はグリコシル化またはそうでなければ翻訳後修飾されてもよい。局在化ドメイン（例えば抗体または結合対の別のメンバー）を用いて、組織、臓器、または被験体の体の他の部分において、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体の局所濃度を増加させてもよい。例えば、ビオチン化またはストレプトアビジンとの融合は、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、同族結合メンバー（それぞれ、アビジンまたはビオチン）がその中に／またはそこに付着している体の部分に局在化させることも可能である。
【００２２】
例えば、カルシウム結合断片中の少なくとも１つの突然変異は、ヒトまたは他の哺乳動物（例えばウシ、モルモット、マウス、またはラット）由来のＬＲＰスーパーファミリーの任意のメンバー、特にＬＲＰ−１相同体において作製されてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１相同体のアミノ酸またはヌクレオチド配列はまた、他の既知の置換、欠失、挿入、異種ドメインの融合、変異体、または多型も含んでもよい。
【００２３】
本明細書で研究する受容体−リガンド系に関しては、ＬＲＰ−１リガンド（例えばアポＥ、アポＪ、α２Ｍ）およびＲＡＰは、Ａβに結合するのに必要ではない。可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、溶液中に遊離のＡβに結合することも可能であるし、あるいは突然変異体ＬＲＰ−１またはＡβのいずれかが固相に最初に付着していることも可能である。突然変異体ＬＲＰ−１およびＡβ間で結合した後、次いで、結合前、結合中、または結合後の任意の時点で、どちらかまたは両方を支持体（例えば細胞、組織、または人工的固体支持体）上に固定してもよい。突然変異体ＬＲＰ−１／Ａβ複合体を単離してもまたは検出してもよい。アルツハイマー病を治療する候補化合物は、受容体−リガンド系の構成要素である少なくとも１つの遺伝子、転写物、またはタンパク質と相互作用して、受容体活性（すなわちＡβの血管クリアランス）を増加させてもよいし、そして療法または予防を提供する能力に関してスクリーニングされてもよい。これらの産物をアッセイ（例えばｍｔ−ＬＲＰ−１を用いてＡβを検出する診断法）で、または治療に用いてもよいし；好適には、これらは、アッセイキットまたは薬剤形式（例えば単一または多用量パッケージ）中にパッケージングされる。
【００２４】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体のＡβへの直接結合は、溶液中または支持体上で起こってもよい。アッセイ形式は、未結合Ａβからの結合Ａβの分離を必要としてもまたはしなくてもよい（すなわち不均一または均一形式）。検出可能なシグナルは、直接または間接的に、結合複合体の任意の部分に付着してもよく、競合的に、増幅されて、またはその任意の組み合わせで測定されてもよい。ブロッキングまたは洗浄工程を挿入して、感度および／または特異性を改善してもよい。結合前、結合後、または結合中の、支持体への可溶性ＬＲＰ−１突然変異体の付着は、以前付着されなかった受容体の捕捉を生じる。米国特許５，１４３，８５４および５，４１２，０８７を参照されたい。受容体−リガンド系の構成要素のタンパク質および／または転写物レベルで、存在量を測定してもよい。
【００２５】
また、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を支持体に付着させてもよい。支持体は、固体または多孔性であってもよく、そしてシート、ビーズ、または線維として形成されてもよい。支持体は、綿、絹、またはウール；セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、または陽性荷電ナイロン；天然ゴム、ブチルゴム、シリコンゴム、またはスチレンブタジエンゴム；アガロースまたはポリアクリルアミド；ケイ素またはシリコーン；結晶、無定形または不純物シリカ（例えば水晶）またはシリケート（例えばガラス）；ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリエチレン、メタクリル酸ポリメチル、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフロリド、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、またはポリビニルピロリドン；あるいはその組み合わせで作製されてもよい。結合がモニター可能であり、そしてシグナルが光によって伝達可能であるように、光学的に透明である材料が好ましい。こうした試薬は、同族分子間の特異的相互作用によって、溶液中のＡβの捕捉を可能にし、そして次いで、支持体上にＡβを固定可能である。
【００２６】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、反応基、例えばカルボキシ、アミノ、またはヒドロキシラジカルを通じて、支持体に付着させてもよく；付着はまた、支持体上に直接、接触プリンティング、ピンでのスポッティング、ペンでのピペッティング、またはノズルでのスプレーを行うことによっても実行可能である。あるいは、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、特異的結合対（例えば抗体−ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチド、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−グルタチオン、マルトース結合タンパク質−マルトース、ポリヒスチジン−ニッケル、プロテインＡまたはＧ／免疫グロブリン）の相互作用によって、支持体に可逆的に付着してもよく；非可逆的付着が望ましい場合、架橋を用いてもよい。
【００２７】
好適な検出のため、容易にアッセイされるレポーターの可溶性ＬＲＰ−１突然変異体への付着を用いてもよい。レポーターは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、細菌／昆虫／海洋無脊椎動物ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色および赤色蛍光タンパク質（それぞれＧＦＰおよびＲＦＰ）、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ラクタマーゼ、およびその誘導体（例えば青色ＥＢＦＰ、シアンＥＣＦＰ、黄緑色ＥＹＦＰ、脱安定化ＧＦＰ変異体、安定化ＧＦＰ変異体、またはＣｌｏｎｔｅｃｈによるＬＩＶＩＮＧ ＣＯＬＯＲＳ蛍光タンパク質として販売される融合変異体）であってもよい。レポーターは、好ましくは色素原、蛍光、または発光シグナルによってアッセイされる同族基質を用いる。あるいは、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、同族抗体またはアフィニティ樹脂が入手可能な、異種エピトープ（例えばＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＳＶ４０ Ｔ抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ化されていてもよい。
【００２８】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、発現ベクターにおいて、適切なコード領域を遺伝子連結することによって、あるいは化学的架橋による結合メンバー上の反応部分への直接化学的連結によって、特異的結合対の１つのメンバーに連結させてもよい。これらをアフィニティ試薬として用いて、Ａβとの特異的結合に関与する相互作用を同定し、単離し、そして検出することも可能である。これは、溶液中の、または支持体に固定された複合体を生じる。
【００２９】
突然変異体ＬＲＰ−１を、薬剤、診断剤として用いてもよく、あるいは本明細書に開示する１またはそれより多い有用性を持つ療法または診断組成物を配合するために用いてもよい。これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで体液または培養中の組織に投与してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで被験体の体に投与してもよい。あるいはｅｘ ｖｉｖｏで被験体の体外で細胞に投与して、後に同じ被験体または別の被験体の体に戻してもよい。被験体の体から標本を採取した後、そして実験室アッセイの前に、体液および組織をさらにプロセシングしてもよい。例えば、細胞を脱凝集させるかまたは溶解するか、あるいは固形組織として提供してもよい。標本を、アッセイ前に、乾燥型または凍結型で保存してもよい。
【００３０】
化合物またはその誘導体を用いて、薬剤または他の薬学的組成物を産生してもよい。薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む組成物、および組成物を被験体に送達するのに有用な構成要素をさらに含む組成物が、当該技術分野に知られる。こうしたキャリアーおよび他の構成要素を本発明の組成物に添加することは、十分に当該技術分野の技術レベル内である。
【００３１】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合させるか、または体の循環（例えば網内系）を通じて可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合したＡβを除去することによって、あるいは機械（例えばアフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、ろ過、沈殿）によって、未結合Ａβの濃度を減少させることも可能である。被験体の体からのＡβの除去によって、または被験体の体のアミロイド沈着の減少によって、治療の有効性を評価してもよい。これは可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を用いてその量および／または位置を検出することも可能な、ヒト患者または動物モデルにおいて達成可能である。本明細書記載の治療様式は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のエンドサイトーシスおよび分解における低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の役割を同定する、米国特許６，１５６，３１１に記載される機構とはかなり異なることに注目しなければならない。
【００３２】
標識または他の検出可能部分を、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に付着させてもよいし、または構造画像化：例えばＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、または他の光学検出技術のため、造影剤を含めてもよい。単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などの機能的画像化もまた用いてもよい。脳または血管系におけるアミロイド負荷のＭＲＩ評価のため、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を標識（例えばガドリニウム）してもよい。血液脳関門（ＢＢＢ）透過処理剤を用いた、脳におけるアミロイド負荷のＳＰＥＣＴ評価のため、あるいは、ＢＢＢ透過処理剤を用いたまたは用いない脳アミロイド血管障害評価のため、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を標識してもよい（例えば７６Ｂｒ、１２３Ｉ）。
【００３３】
また、例えば：診断、疾患に対するリスクがあるものまたはすでに罹患しているものの同定、あるいは疾患の段階またはその進行の決定などの方法を実行する際に使用するためのキットにおいて、試薬を提供してもよい。さらに、以下の：疾患の自然経過に介入することが望ましいかどうかの評価、疾患経過の改変、進行を停止させるかまたは遅延させる初期介入、機能の回復または維持の促進、有益な療法または予防のためのターゲットの提供、候補薬剤または医学的措置の比較、あるいは薬剤または医学的措置の有効性の決定などの、疾患の治療に関連する方法において、試薬を用いてもよい。これらの方法を実行するための指示、参照値および陽性／陰性対照、ならびに患者情報（例えば遺伝子型、病歴、疾患症状、遺伝子発現からの転写または翻訳収量、生理学的または病理学的知見）を含有する関係型データベースは、本発明の考慮される側面であってもよい他の産物である。
【００３４】
療法または予防が必要な被験体に投与される治療の量および度合いは、罹患患者を治療するのに有効である。本発明を単独で、または他の既知の方法と組み合わせて、用いてもよい。被験体は任意のヒトまたは動物であってもよい。哺乳動物、特にヒトおよびげっ歯類または霊長類疾患モデルを治療してもよい。したがって、獣医学的方法および医学的方法の両方が可能である。
【００３５】
１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または該タンパク質（単数または複数）をコードする核酸（単数または複数）を含有する薬学的組成物または診断組成物を、血液脳関門を通じた通過のために、または内皮と直接接触させるために順応した配合物として投与してもよい。あるいは、組成物を培地に添加してもよい。突然変異体タンパク質または核酸に加えて、こうした組成物は、生理学的に許容されうるキャリアー、および投与を促進しそして／または取り込みを増進させることが知られる他の成分（例えば生理食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、アフィニティに基づく細胞特異的ターゲティング系）を含有してもよい。組成物を、ゲル、スポンジ、または他の浸透性マトリックス（例えばペレットまたはディスクとして形成される）中に組成物を取り込んでもよいし、そして持続局所放出のため、内皮近傍に配置してもよい。単一用量で、または異なる時点で投与される多数回用量で、投与されてもよい。
【００３６】
１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または該タンパク質（単数または複数）をコードする核酸（単数または複数）を含有する薬学的組成物または診断組成物を、任意の既知の経路によって、体内に投与してもよい。例えば、組成物を粘膜、肺、局部、あるいは他の局所または全身経路（例えば腸内および非経口）によって投与してもよい。用語「非経口」には、限定なしに、皮下、皮内、真皮下、筋内、クモ膜下腔内、動脈内、静脈内、および他の注射または注入技術が含まれる。
【００３７】
用量の量およびタイミング、配合、および投与経路の適切な選択は、アルツハイマー病またはそのリスクにある被験体において、好ましい反応を達成し（すなわち有効性）、そして過度の毒性または他の害を回避する（すなわち安全性）目標とともに実行されうる。したがって、「有効な」は、望ましい効果を達成する条件の日常的な操作を伴う選択を指す。
【００３８】
１日１回短時間に渡って体内に投与される１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１の急速投与（ｂｏｌｕｓ）が、好適な投薬スケジュールである。あるいは、突然変異体タンパク質（単数または複数）または核酸（単数または複数）の有効１日用量を、投与の目的のため、多数の用量に分割してもよく、例えば１日あたり２〜１２の用量に分けてもよい。薬学的組成物中の突然変異体ＬＲＰ−１の投薬量もまた、被験体の体内において、特に脳の血管内皮中およびその周囲で、一過性のまたは持続される濃度を達成し、そして望ましい療法反応または防御を生じるため、多様であってもよい。しかし、望ましい療法効果を達成するために必要であるよりも低い用量レベルで開始し、そして望ましい効果が達成されるまで投薬量を次第に増加させることもまた、当該技術分野の技術範囲内である。同様に、診断組成物中の突然変異体ＬＲＰ−１の投薬レベルは、被験体体内のＡβの検出の望ましい感度および特異性を達成するため、多様であることも可能である。
【００３９】
投与される突然変異体ＬＲＰ−１の量は、タンパク質または核酸投与の生物活性および生物学的利用能（例えば、体内での半減期、安定性、代謝）；化学特性（例えば分子量、疎水性、可溶性）；経路（例えば非経口、特に静脈内）およびスケジューリング（例えば１ヶ月または１年あたりの頻度、連続用量間の期間）等、当業者に知られる要因に応じる。全身投与のため、血液脳関門を通じた突然変異体ＬＲＰ−１の通過が重要である。任意の特定の被験体に関して達成しようとする特定の用量レベルは、年齢、性別、健康状態、病歴、体重、１またはそれより多い他の薬剤との組み合わせ、および疾患の重症度を含む、多様な要因に応じうることもまた理解されるであろう。
【００４０】
用語、アルツハイマー病の「治療」は、とりわけ、被験体において１またはそれより多い症状を減少させるかまたは軽減し、１またはそれより多い症状が悪化するかまたは進行することを防止し、回復を促進するかまたは予後を改善し、そして／または罹患していない被験体において疾患を防止するとともに、存在する疾患の進行を遅延させるかまたは減少させることを指す。所定の被験体に関して、症状の改善、その悪化、退行、または進行は、客観的または主観的尺度によって決定可能である。罹患率または死亡率の改善（例えば選択した集団に関する、生存曲線の延長）として、治療の有効性を測定することも可能である。予防法（例えば再発発生の防止または減少）もまた、治療と見なされる。治療はまた、他の現存する治療様式（例えばＡＲＩＣＥＰＴまたはドネペジル、ＥＸＥＬＯＮまたはリバスチグミン、抗アミロイドワクチン、頭の体操（ｍｅｎｔａｌ ｅｘｅｒｃｉｓｅ）または刺激）との組み合わせを伴ってもよい。したがって、１またはそれより多い他の薬剤および１またはそれより多い他の医学的処置を含む組み合わせ治療を実施してもよい。
【００４１】
被験体に投与される突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または核酸の量は、好ましくは、その投与から生じる利点を上回る毒性または他の有害な影響を誘導しない量である。さらなる目的は、数を減少させ、重症度を減じ、そして／または別の方式で、認識される治療標準に比較した際に、疾患症状の苦痛を軽減させることである。本発明はまた、神経変性障害一般：例えば認知症、抑鬱、錯乱、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動協調性の喪失、多発性硬化症、脳卒中、および失神に対しても有効でありうる。
【００４２】
突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質または核酸の産生は、適切な政府監督官庁によって、医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）、ならびに製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に関して規制されるであろう。これは正確でそして包括的な記録管理、ならびにＱＡ／ＱＣのモニタリングを必要とする。官庁および施設委員会による患者プロトコルの監視は、また、インフォームドコンセントが得られており；製品の安全性、生物活性、適切な投薬量、および有効性が段階的に研究されており；結果が統計的に有意であり；そして道徳的指針に従っていることを確実にするよう想定される。動物モデルを用いたプロトコル、ならびに毒性化学薬品の使用、および法令順守の類似の監視が必要である。
【００４３】
療法的使用のため、適切な監督官庁は、生物製剤に関する純度の許容されうるレベル（例えば外来のタンパク質および核酸の欠如）；無菌性（例えば微生物の欠如）；宿主細胞混入の欠如（例えば１ｍＬあたり０．５内毒素単位未満）；および強度（例えば遺伝子トランスファーおよび発現効率）も特定するであろう。別の目的は、突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質または核酸の一貫したそして再現可能な産生を確実にしうることであり、これは生物製剤の強度を改善しつつ、純粋で、無菌であり、そして発熱物質を含まない製品を確実にするよう用いられる製造管理および品質管理に関する基準に適合することも可能である。
【００４４】
本明細書において、血液脳関門での突然変異体ＬＲＰ−１およびＡβの間の直接または間接的な相互作用は、高いβシート含量およびＡβ内の遺伝的突然変異を含むＡβ種の保持を促進しつつ、可溶性Ａβ４０を一掃することによって、神経毒性および血管向性Ａβ集積に決定的に影響を及ぼしうる。Ａβ内の突然変異は、突然変異体Ａβがｍｔ−ＬＲＰ−１に結合するアフィニティに有意に影響を及ぼさない。ＬＲＰ−１と対照的に、ＲＡＧＥは、脳内への循環Ａβの連続流入を仲介し、そしてトランスジェニックＡＰＰモデルにおいて、そしてＡＤにおいて、脳血管系で過剰発現される（Ｄｅａｎｅら、２００３）。血液脳関門でのまたは血管系における突然変異体ＬＲＰ−１の作用が、直接作用して、ＲＡＧＥが仲介するＡβ取り込みを阻害するか、または間接的に作用して、末梢における遊離Ａβに結合し、それによって脳におけるＡβの濃度低下を生じることによって、ＣＮＳにおけるＡβのレベルを減少させる可能性がある。適用には、脳アミロイド血管疾患（ＣＡＡ）を伴うアルツハイマー病の家族性型（ＦＡＤ）の被験体、例えばオランダまたはアイオワ突然変異を伴う患者（ＦＡＤ／ＣＡＡ）が含まれる。突然変異体ＬＲＰ−１は、野生型および突然変異体Ａβペプチドの両方に結合するため、突然変異体ＬＲＰ−１は、アルツハイマー病、ＦＡＤ／ＣＡＡ、およびダウン症候群において、血管病変に関連する変化を視覚化するため、脳の画像化剤として、診断目的に使用可能である。
【００４５】
突然変異体ＬＲＰ−１は、より高いアフィニティでＡβに結合するため、これらを用いて、脳から血液内へのＡβの放出を促進してもよい。遊離Ａβおよび可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合したＡβのレベルを用いて、アルツハイマー病、ＦＡＤ／ＣＡＡ、およびダウン症候群に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば二重サンドイッチＥＬＩＳＡ血液試験）を開発してもよい。作用機構は、抗Ａβ抗体、ゲルゾリン、ＧＭ１、およびｓＲＡＧＥなどの他の末梢Ａβ結合剤と類似の循環野生型または突然変異体Ａβの隔離であってもよい。全身循環中のＡβを隔離し、そして脳内への血液脳関門を渡るＡβ輸送を防止する、人工的な「シンク」としてｍｔ−ＬＲＰ−１を用いてもよい。１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または核酸（単数または複数）を用いると、（１）これらが、野生型クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶを含む野生型相同体、ゲルゾリン、ＧＭ１、ｓＬＲＰ−１、またはｓＲＡＧＥと比較して、より高いアフィニティでＡβに結合し、そして（２）これらが、クラスターＩＩおよびＩＶを含む可溶性ＬＲＰ−１に比較して、より小さいサイズであるため、治療される被験体によく許容されるはずであり、そしてそれによって、脳および脳血管における免疫または神経炎症反応を回避するはずであるという利点を提供する。
【００４６】
突然変異体ＬＲＰ−１のこれらの特性を用いて、末梢シンク剤として作用させることによって、トランスジェニックＦＡＤ／ＣＡＡマウス、アルツハイマー病の他の動物モデル、またはアルツハイマー病およびＦＡＤ／ＣＡＡ患者の脳におけるＡβのレベルを低下させることも可能である。この目的のため、１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１を単独で、または神経保護剤（例えばＧｕｏら、２００４に記載されるような活性化プロテインＣ）とともに、または被験体における循環Ａβを低下させる他の療法；Ａβに対する免疫またはワクチン接種；ガングリオシド、ゲルゾリン、またはｓＲＡＧＥの投与；アミロイド前駆体タンパク質のベータ／ガンマ・セクレターゼ仲介性プロセシングの阻害；血液脳関門の浸透圧開放（Ｎｅｕｗｅｌｔら、１９８５）；脳脊髄液産生の正常化（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、２００３）；またはその組み合わせとともに用いてもよい。
【００４７】
以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、そしてその実施を制限するかまたは別の方式で限定することを意図されない。
【実施例】
【００４８】
本発明者らは、１３の突然変異体ＬＲＰ−１をスクリーニングし、そしてこれらをクラスターＩＶのリガンド結合ドメインを含むＬＲＰ−１の可溶性誘導体（ＬＲＰＩＶ）に比較した。７つは、天然アミノ酸配列に比較していかなる突然変異も含まずに、ＬＲＰＩＶの異なる断片を含む。６つは、ＬＲＰＩＶ中に点突然変異：配列番号１中のＤ３３５４Ｇ、Ｄ３３９４Ｇ、Ｄ３５５６Ｇ、Ｄ３５９５Ｇ、Ｄ３６３３Ｇ、およびＤ３６７４Ｇを有した。配列番号１中のＤ３６７４Ｇは、クラスターＩＶ（配列番号３）中のＤ３４３Ｇに対応する。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、以下の実施例のリード化合物である。
【００４９】
ＬＲＰＩＶは、１１の補体関連モチーフ（ＣＲ２１〜ＣＲ３１）を含有し、そのうち９つはカルシウム結合断片であり、これは特異的および直接Ａβ結合の推定上の決定因子である。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＣＲ２４〜ＣＲ２８は、ＬＲＰＩＶの最も有効なカルシウム結合断片であることが示された（Ｍｅｉｊｅｒら、２００７）。３つの三重反復、ＣＲ２４〜ＣＲ２６、ＣＲ２５〜ＣＲ２７、およびＣＲ２６〜ＣＲ２８は、ＲＡＰと強く相互作用する。ＣＲ２４〜ＣＲ２６は、活性化α２−マクログロブリン（α２Ｍ＊）および因子ＶＩＩＩ軽鎖（ＦＶＩＩＩ ＬＣ）に対する最高の結合アフィニティを有する一方、ＣＲ２６〜ＣＲ２８は、因子ＩＸａ（ＦＩＸａ）結合の最適な領域であった（Ｍｅｉｊｅｒら、２００７）。ＣＲ２３およびＣＲ３１は、特異的および直接Ａβ結合に寄与しているようではない。本発明者らは、ＣＲ２４〜ＣＲ２８を用いて、ＬＲＰＩＶの可溶性カルシウム結合誘導体を産生し、そして高アフィニティＡβ結合に関してスクリーニングした。少なくとも３つのカルシウム結合断片が、ＲＡＰ、α２Ｍ＊、ＦＶＩＩＩ ＬＣ、およびＦＩＸａに結合するのに必要である一方、Ａβ結合に必要な反復の最小数は明らかでない。したがって、４つのカルシウム結合断片（ＣＲ２４〜ＣＲ２７およびＣＲ２５〜ＣＲ２８）、３つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５〜ＣＲ２７）、２つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５〜ＣＲ２６およびＣＲ２６〜ＣＲ２７）および１つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５およびＣＲ２６）を含有するＬＲＰＩＶ断片を産生した。
【００５０】
ＧＳＴ−ＲＡＰアフィニティクロマトグラフィーを用いて、すべての主なリガンド結合ドメインを含むＬＲＰＩＶを精製した。精製ＬＲＰＩＶのＮ末端アミノ酸配列によって、ＬＲＰＩＶのアミノ酸配列のＮ末端に３つの外来のグリシン−アラニン−アルギニン（ＧＡＲ）アミノ酸が存在することが明らかになった（ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ）。ｔＰＡシグナルペプチドは、フューリン切断部位： −７ＲＦＲＲＧＡＲ−１、式中、エンドプロテアーゼは、ＲＦＲＲ↓ＧＡＲで切断し、突然変異体ＬＲＰ−１のＮ末端に３つの外来アミノ酸を生じる、を含有する。エンドプロテアーゼは、外来アミノ酸を除去しなかった。選択的Ａβ結合に関して、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶをスクリーニングした。
【００５１】
ｃＤＮＡの合成およびクローニング。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒト脾臓総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ヒトＬＲＰ１配列（ＮＭ ００２３３２）に基づいて、プライマーを設計した。Ｐｆｘ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびそのそれぞれのプライマーセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡからＬＲＰＩＶドメインを増幅し、そしてｐｃＤＮＡ３．３ ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。この構築物を用い、ＰＣＲを用いて、ＬＲＰＩＶの１１反復（ＣＲ２１〜ＣＲ３１）、２種類の４反復（ＣＲ２４〜ＣＲ２７およびＣＲ２５〜ＣＲ２８）、１種類の３反復（ＣＲ２５〜ＣＲ２７）、２種類の２反復（ＣＲ２５〜ＣＲ２６、ＣＲ２６〜ＣＲ２７）および２種類の単一反復誘導体を増幅し、そして哺乳動物発現ベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の間にクローニングして、可溶性タンパク質を発現させた。ｐＳｅｃＴａｇ２ Ｂベクターは、Ｎ末端上にＩｇＫリーダーペプチドを、そしてＣ末端上にＭｙｃタグおよびＨｉｓ６タグを有する。１２９ｂｐの順方向プライマー（Ｋｏｚａｋ配列、開始コドン、ｔＰＡシグナルペプチド配列およびＬＲＰＩＶ配列を有する）およびＨｉｎｄＩＩ制限部位を含む逆方向プライマーを用い、いかなるタグも含まない全長分泌ＬＲＰＩＶ（ｗｔ−ＬＲＰＩＶ）を増幅し、そしてｐｃＤＮＡ３．３ ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、６つのカルシウム結合部位で、突然変異体ＬＲＰＩＶ変異体を作製した。それぞれのプライマーセットとともに、ＷＴ−ＬＲＰＩＶをテンプレートとして用いた。突然変異プラスミドの挿入を、配列で検証し、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｗｔ−ＬＲＰＩＶプラスミド内にクローニングした。
【００５２】
タンパク質発現。１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ培地中、振盪装置上、３７℃で、懸濁チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を増殖させた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、各構築物で、ＣＨＯ細胞を安定トランスフェクションした。トランスフェクション５日後、抗生物質を含有する培地内に細胞を移した、ｐＣＤＮＡ ３．３ ＴＯＰＯには７００μｇ／ｍＬジェネティシン、またはｐＳｅｃＴａｇ２には２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン。１２〜１５日後、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）混合物（４０％ Ｃｌｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、５０％ ２ｘＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ、および抗生物質）を含有する１００ｍｍｘ１０ｍｍペトリ皿に、約５０００の抗生物質耐性細胞をプレーティングした。約３週後、５０〜６０の単一クローンを拾い、そして４８ウェルプレート中、ＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ培地内に移した。３日後、ＬＲＰＩＶ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって、発現されたＬＲＰＩＶに関して、培地を試験した。続いて、選択したクローンを１２ウェルおよび６ウェルプレート内に移した。単一の選択クローンをフラスコに移し、そして懸濁培養中で増殖させた。ファーンバックフラスコ中でＬＲＰＩＶ発現を行った。２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０％ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ中、１ｘ１０６／ｍＬ細胞密度で培養を開始した。毎日、血球計算板（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ、ペンシルバニア州ホーシャム）を用いて細胞を計数し、そしてＧｌｕｃＣｅｌｌＴＭ試験ストリップ（ＣＥＳＣＯ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．、台湾・台中）を用いてグルコースレベルを測定した。グルコースレベルが馴化培地中２ｇ／Ｌ未満に落ちたら、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する１０％Ｆｅｅｄ Ａを細胞に補った。通常、培養４日後にフィーディングが必要であった。タンパク質を１０日間発現させ、遠心分離によって培地を採取し、そして０．２μｍフィルターを通じて、上清をろ過した。ＣＲ２５〜ＣＲ２６、ＣＲ２６〜ＣＲ２７、ＣＲ２６、ＣＲ２７、および突然変異体Ｄ３３５１Ｇ、Ｄ３５９２Ｇ、Ｄ３６３０Ｇの分泌は非常に低かった。したがって、これらの変異体はスクリーニングから排除された。
【００５３】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、バッチ中で、Ｈｉｓ６タグを含有するＬＲＰＩＶの異なる断片を精製した。馴化培地を１０％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および洗浄したＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合し、振盪しながら室温で３０分間放置し、そして洗浄緩衝液（１０％グリセロール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールおよび５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８）で洗浄した。結合したタンパク質を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８中の２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶出したタンパク質を５０ＫＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビラリカ）に通過させた。ＧＳＴ−ＲＡＰアフィニティカラムを用いて、単一アフィニティ精製工程によって、ｗｔ−ＬＲＰＩＶを精製した。ＧＳＴ−ＲＡＰを発現させ、Ｂ−ＰＥＲ ＧＳＴ融合タンパク質精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアフィニティ精製し、そしてＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリングキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、アガロースビーズ上に固定した。抗ＬＲＰＩＶ−抗体アフィニティカラムを用いて、一工程で、突然変異体ＬＲＰＩＶ変異体を精製した。ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリングキットを用いて、アガロースビーズに純粋な抗ＬＲＰＩＶ抗体を固定することによって、抗ＬＲＰＩＶ−抗体カラムを調製した。約１００ｍｌの馴化培地を洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３Ｘ希釈し、抗ＬＲＰＩＶ抗体アフィニティカラム上に装填し、９００ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出させ、２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．５）で中和し、そして１０ＫＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。５０ｍＭ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９）に対して、各精製ＬＲＰＩＶ変異体を透析した。これらの純度を銀染色によって確認し、そしてウェスタンブロット分析によって同定した。
【００５４】
タンパク質の発現レベルが低く、そしてＡβ４０への結合が非常に低いため、単一反復（ＣＲ２５およびＣＲ２６）および二重反復（ＣＲ２５〜２６およびＣＲ２６〜２７）をスクリーニングから除去した。
【００５５】
ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、４反復（ＣＲ２４〜２７およびＣＲ２５〜２８）および３反復（ＣＲ２５〜２７）は、４〜８倍低いアフィニティでＡβ４０に結合する（図２Ａ〜２Ｂ）。対照的に、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、４つのＣＲおよび３つのＣＲは、類似のアフィニティでＡβ４２に結合する（図２Ｃ〜２Ｄ）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、ＲＡＰ結合領域外部のカルシウム結合部位に突然変異（Ｄ３４３Ｇ）を有するＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、それぞれ、２．５倍および１．５倍高いアフィニティの選択的結合をＡβ４２およびＡβ４０に対して示した（図２Ａ〜２Ｄ）。Ｄ３４３Ｇ突然変異が、ＬＲＰＩＶにおいてコンホメーション変化を引き起こし、これがＡβの選択的結合を増進させた可能性がある。Ｓａｇａｒｅら（２００７）が用いたタグ化ＬＲＰＩＶに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、Ａβ４２およびＡβ４０に対して、それぞれ、２．６倍および１．４倍高いアフィニティを有した。ＬＲＰ−１は、他のリガンドと相互作用するため、本発明者らはまた、これらに対するＬＲＰＩＶの結合アフィニティも比較した。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、それぞれ、２．５倍および１．５倍高いアフィニティでＡβ４２およびＡβ４０に結合し；２倍低いアフィニティでアポＥに、そしてそれぞれ、２倍、３倍および４倍低いアフィニティでｔＰＡ、ＭＭＰ９、およびＦＩＸａに弱く結合する（図３Ａ〜３Ｄ）。α２Ｍ＊およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ間にはほとんど相互作用がなかった。ＬＲＰ−１はＫＰＩ（クニッツ型プロテアーゼ阻害剤）ドメイン（Ｋｏｕｎｎａｓら、１９９５）を通じてＡＰＰと相互作用するため、本発明者らは、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ、およびＫＰＩドメインを含む（ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１）またはＫＰＩドメインを含まない（ＡＰＰ６９５）ＡＰＰアイソフォーム間の相互作用を決定した。ＡＰＰ６９５は、脳における主なＡＰＰアイソフォームである。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶはＡＰＰ６９５に結合しない（図４Ａ）一方、ＡＰＰ７７０（図４Ｂ）およびＡＰＰ７５１（図４Ｃ）に対する弱い結合があり、これは可溶性ＫＰＩドメインまたは抗ＫＰＩ抗体（ｍＡｂ４．１）で置換された。しかし、Ａβ４０およびＡβ４２に対するＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ結合は、可溶性ＫＰＩまたはｍＡｂ４．１によって影響を受けなかった（図４Ｄ〜４Ｅ）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶおよびＡＰＰ７７０またはＡＰＰ７５１間の結合アフィニティは、Ａβ４０およびＡβ４２のものより、それぞれ、５０倍および２５倍低かった（図４Ｆ）。ＡＰＰ７７０およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ間の結合アフィニティは、ＡＰＰ７７０およびＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ間のものより３倍大きかった（図４Ｇ）。Ａβ４０およびＡβ４２に選択的にそして高アフィニティで結合するため、脳におけるＡβペプチドの末梢シンクとして作用することによってアルツハイマー病を治療するためのリード化合物として、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶを選択した。
【００５６】
脳Ａβレベルを低下させるためのＬＲＰＩＶ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性。野生型マウス（２〜３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６）を、キャリアーのみ（ビヒクル）、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ、またはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（静脈内、２０μｇ）で５日間、毎日治療した。Ｓａｇａｒｅら（２００７）に記載される類似のプロトコルを参照されたい。投薬期間終了時、脳組織および血漿を収集し、そしてＥＬＩＳＡによってＡβレベルを決定した。ビヒクルと比較すると、ＬＲＰＩＶ類似体はどちらもＡβ４０およびＡβ４２の血漿レベルが増加し、そして脳における対応物が減少する一方、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対する反応は有意により高かった（図５Ａ〜５Ｄ）。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは血漿において、Ａβ４０およびＡβ４２と、有意により多く結合し（図５Ａおよび５Ｂ）、そしてＧＡＲ−ＬＲＰＩＶよりも、脳Ａβレベルを低下させる際により有効であった（図５Ｃおよび５Ｄ）。どのくらい迅速にＭＴ００７−ＬＲＰＩＶが脳Ａβレベルを減少させうるかを決定するため、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（１０μｇ）またはビヒクルの単回静脈内急速投与で、同じ年齢のＣ５７Ｂ６マウスを治療した。１２時間後、脳および血漿におけるＡβレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ビヒクルに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、血漿Ａβ４０およびＡβ４２を、それぞれ、１．３３倍および２．８５倍増加させ、そして脳Ａβ４０およびＡβ４２を１．６８倍および１．４５倍減少させた。したがって、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、中枢神経系にあるＡβに関してさえ、Ａβの有効な末梢シンクである。
【００５７】
突然変異体ＬＲＰ−１の免疫原性。免疫原性試験のため、ミリグラム量の突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質が必要である。受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）を含有するカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーは、弱くしかＲＡＰに結合しない突然変異体ＬＲＰＩＶタンパク質の単離には使用不能である。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、ＧＳＴ−ＲＡＰカラムに結合しないため、抗ＬＲＰＩＶ抗体カラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって単離し、その結果、回収は劣っていた。したがって、本発明者らは、イオン交換カラムを用いた別の単離プロセスを開発し、これはより優れた精製および収量を生じた（以下を参照されたい）。精製タンパク質（２．２ｍｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、そして免疫原性試験のため、外部実験室に送った。およそ８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いる。３つの用量（２０、４０、および８０μｇ／ｋｇ）のＭＴ００７−ＬＲＰＩＶを試験した。マウスに隔週で４回注射した。各用量の１週後、血液を収集し、プロセシングし、そしてＱＥＤ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）によるＥＬＩＳＡによって、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対する抗体を用いて試験した。免疫学的応答はなかった。
【００５８】
ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶタンパク質をＣＨＯ細胞において発現させた。単離プロセスは、ＣＨＯ細胞からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）による混入の可能性を残しうる。したがって、本発明者らは、２つの独立の方法によって最終精製タンパク質調製物中のＨＣＰ混入を追った。（Ａ）ウェスタンブロット分析：試料を還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして次いで、ニトロセルロース膜にトランスファーした。非特異的部位をブロッキングした後、ＣＨＯタンパク質不含培地に対して作製したヤギ抗体を含有する溶液に、膜を曝露した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で抗体を標識した。洗浄後、ＥＣＬ法を用いて、タンパク質を検出した。抗体（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はポリクローナルであり、そして多数の潜在的な混入物：すなわち、ＳＤＳ／ＤＴＴ可溶化ＣＨＯ細胞由来の、および馴化ＣＨＯタンパク質不含培地中に見られるＨＣＰ由来の４０を超える異なるＣＨＯ ＨＣＰバンドに対する広い反応性を持って生成された。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ：Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能なキットを用いた。これはウェスタンブロッティングよりもより感受性である。キットは、精製とは独立に、産物に混入しうる本質的にすべてのＨＣＰと反応する。未結合馴化培地中に見られるアフィニティ精製ＣＨＯ ＨＣＰに対して抗体を生成した。ウェスタンブロッティングによって検出可能なシグナルは観察されなかった。ＥＬＩＳＡによって、ＨＣＰ混入は１００ｐｐｍ未満であることが示され、これは一般的に許容されうると見なされる（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００５９】
潜在的な副作用。研究によって、タグ化ＬＲＰＩＶ（１μｇ／日および４０μｇ／ｋｇ、腹腔内）で３ヶ月治療したマウスは潜在的な副作用を持たないことが示された（Ｓａｇａｒｅら、２００７）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（２０μｇ静脈内、毎日５日間）で治療したマウス（Ｃ５７Ｂ６）の組織試料および血漿を潜在的な副作用に関して分析したが、まったく観察されなかった。コレステロール、アポＥ、ｔＰＡ、プロＭＭＰ９、およびグルコースの血漿レベルにおいては有意な変化はなかった。単回静脈内急速投与４０μｇ／ｋｇを投与されたマウスの別個の群（Ｃ５７ＢＬ６、２〜３ヶ月齢）において、２時間後に血液試料を除去し、そして活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）として血漿凝固時間を決定した。これは不変であった。肝臓および脳において、ＬＤＬＲまたはＬＲＰ−１の発現レベルに検出可能な変化はなかった。さらに、リン酸化ＬＲＰ−１レベルは脳において検出可能な変化はなかった。さらに、脳におけるＡＰＰレベルは、ＬＲＰＩＶ治療によって不変であった。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶはＣＳＦに進入しなかった。
【００６０】
参考文献
【００６１】
【化１−１】
【００６２】
【化１−２】
本明細書に引用する特許、特許出願、書籍、および他の刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【００６３】
請求項の意味およびその法律的同等物の範囲内にあるすべての修飾および置換は、その範囲内に含まれるものとする。転換句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いた請求項は、請求項の範囲内に他の要素が含まれることを許す；本発明はまた、「含む」用語の代わりに、転換句「から本質的になる」（すなわち、本発明の運用に実質的に影響を及ぼさないならば、請求項の範囲内に他の要素が含まれることを可能にする）および転換句「からなる」（すなわち、本発明に通常関連する不純物または重要ではない活性以外は、請求項に列挙される要素のみを許す）を用いた請求項によっても記載される。例えば、「クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶから本質的になる」は、他の機能ドメインがＡβの結合に影響を及ぼさないならば、該ドメインの包含を可能にする一方、「クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶからなる」は、他の機能ドメインの包含を禁じるであろう。これらの３つの転換句のいずれを用いて、本発明を請求することも可能である。
【００６４】
本明細書に記載される要素は、請求項に明確に列挙されない限り、請求する発明の限定と見なされてはならないことを理解すべきである。特に、突然変異体ＬＲＰ−１は、好ましくはヒトの、ＬＲＰ−１の天然アミノ酸またはヌクレオチド配列から、欠失させて１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインの単位を単離し、挿入して１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインを互いに分離し、融合させて間に外来のアミノ酸を含みまたは含まずに１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインの単位を連結し、そして天然配列中の１またはそれより多いアミノ酸またはヌクレオチドを置換することによって、想定されうる。したがって、付与される請求項は、法的保護の範囲を決定するための基礎であり、明細書から請求項に限定が読み込まれるのではない。対比して、先行技術は、請求される本発明を予期するかまたは新規性を消滅させる具体的な態様の度合いまで、本発明から排除される。
【００６５】
さらに、請求項の制限間またはその中の特定の関係は、請求項に明らかに列挙されない限り、意図されない（例えば、製品請求項中の構成要素の配置または方法請求項中の工程の順序は、明らかに言及されない限り、請求項の制限ではない）。本明細書に開示する個々の要素のすべてのありうる組み合わせおよび順列は、本発明の側面であると見なされる。同様に、本発明の説明の一般化は、本発明の一部と見なされる。
【００６６】
前述から、当業者には、本発明がその精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で具象化可能であることが明らかであろう。記載される態様は、制限ではなく、例示としてのみ見なされ、これは本発明に提供する法的保護の範囲が、本明細書によるよりも、付随する請求項によって示されるためである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー・アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドへの結合を改善させる、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１の突然変異に関する。この特異的結合を用いて、Ａβを検出するかまたは被験体の体の残りからＡβを分離することも可能である。アルツハイマー病において、本発明を用いて、Ａβを検出することによって診断結果を提供するか、Ａβを除去することによって治療を提供するか、またはその両方を提供することも可能である。
【背景技術】
【０００２】
アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）の病態に関与することが知られる。このペプチドは、脳実質および血管系におけるアミロイドの主な構成要素である。老人斑から抽出されるＡβは、主に、ペプチドＡβ１−４０（Ａβ４０）およびＡβ１−４２（Ａβ４２）であり；血管アミロイドは、主に、ペプチドＡβ１−３９およびＡβ４０である。血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、および脳に存在するＡβの主な可溶性型はＡβ４０である。血液、ＣＳＦ、および脳間質液（ＩＳＦ）中に循環している可溶性Ａβは、遊離ペプチドとして存在し、そして／またはアポリポタンパク質Ｅ（アポＥ）、アポリポタンパク質Ｊ（アポＪ）、他のリポタンパク質、アルブミン、α２−マクログロブリン（α２Ｍ）、およびトランスサイレチンと会合して存在しうる。
【０００３】
アミロイド仮説によると、脳における神経毒性Ａβ４２の集積が、ＡＤ病変形成を開始する主な事象である（ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ， ２００２）。Ａβ４２集積の増加は、ＡＤの家族型におけるように、Ａβの産生増加に、そして／または遅発性ＡＤにおけるように、Ａβクリアランス障害に関連する可能性もある（Ｓｅｌｋｏｅ， ２００１； ＺｌｏｋｏｖｉｃおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， ２００３）。脳におけるＡβレベルの増加は、神経毒性Ａβオリゴマーの形成、および進行性のシナプス、神経突起、およびニューロン機能不全を生じる（Ｗａｌｓｈら， ２００２； Ｄａｈｌｇｒｅｎら， ２００２； Ｋａｙｅｄら， ２００３； Ｇｏｎｇら， ２００３）。Ａβ内のミスセンス突然変異は、主に、オランダ突然変異（コドン６９３でのＧからＣ、２２位でのＧｌｕからＧｌｎ）およびアイオワ突然変異（コドン６９４でのＧからＡ、２３位でのＡｓｐからＡｓｎ）を持つ患者におけるように、主に血管沈着に関連する。血管向性（ｖａｓｃｕｌｏｔｒｏｐｉｃ）オランダ（Ｅ２２Ｑ）またはアイオワ（Ｄ２３Ｎ）突然変異体Ａβは、原線維形成増進および脳血管細胞に対する毒性を示し、一方、オランダ／アイオワ二重突然変異体Ａβ（Ｅ２２Ｑ、Ｄ２３Ｎ）は、オランダおよびアイオワ血管向性突然変異体の両方に比較して加速した病態形成特性を有する（Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄら， ２００１）。
【０００４】
終末糖化産物（ＲＡＧＥ）受容体、スカベンジャーＡ型受容体（ＳＲ−Ａ）、天然ＬＲＰ−１、およびＬＲＰ−２などの細胞表面タンパク質は、低ナノモル濃度で遊離ペプチドとして（例えばＲＡＧＥ、ＳＲ−Ａ）、そして／またはアポＥ、アポＪ、またはα２Ｍとの複合体中で（例えば天然ＬＲＰ−１、ＬＲＰ−２）、Ａβに結合する。しかし、野生型相同体よりも高いアフィニティでＡβに直接結合する突然変異体ＬＲＰ−１は、開示されなかった。
【０００５】
ＷＯ ０１／９０７５８およびＵＳ ２００４／０２５９１５９は、脳からのＡβの血管クリアランスを仲介する際のＬＲＰ−１の役割を記載する。ＬＲＰ−１発現または活性の増加を用いて、Ａβを除去することも可能であり、そしてそれによってアルツハイマー病の被験体または該疾患を発展させるリスクがある被験体を治療することも可能であると解説された。
【０００６】
ＷＯ ２００５／１２２７１２およびＵＳ ２００７／００５４３１８は、Ａβに結合させ、そしてＡβを脳から除去するための可溶性ＬＲＰ−１の使用を記載する。ＬＲＰ−１の可溶性クラスターＩＩまたはＩＶ（それぞれ、ＬＲＰＩＩまたはＬＲＰＩＶ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、他の既知のリガンド（例えば、ｔＰＡ、アポＥ２、アポＥ３、アポＥ４、ＭＭＰ９）よりも一桁から二桁高いアフィニティで、Ａβに結合することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＬＲＰ−１の野生型（ｗｔ）クラスターＩＶ（ｗｔ−ＬＲＰＩＶ）は、強いＡβ末梢シンク活性を発揮し、これは脳からのＡβクリアランスを生じ、トランスジェニックマウスにおいて、アミロイド関連病変を有意に減少させ、そして機能的転帰を改善する。Ａβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）である、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤（ＫＰＩ）ドメインを有するが、より短いＡＰＰ６９５（ＫＰＩドメインを欠く、脳中の最も一般的なＡＰＰアイソフォーム）ではないＡＰＰ７７０アイソフォームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＬＲＰ−１に結合し、培養線維芽細胞において、ＡＰＰ分解を生じることが示された。Ｄｅａｎｅら（２００４）およびＳａｇａｒｅら（２００７）を参照されたい。
【０００７】
本明細書において、本発明者らは、ＡＰＰ６９５がｗｔ−ＬＲＰＩＶに結合しないことを示す。さらに、ＫＰＩドメインを含有するＡＰＰアイソフォーム（例えば、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、およびｓＡＰＰβ）は、Ａβ結合部位で、ｗｔ−ＬＲＰＩＶに検出可能に結合しない。ＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォームは、ｗｔ−ＬＲＰＩＶに対して非常に弱い結合を示し、該結合は、Ａβに関するものより二桁低かった。ｗｔ−ＬＲＰＩＶに対するＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォームのこの弱い結合は、ＫＰＩ特異的抗体または組換えＫＰＩペプチドで無効にされ、これらはＡβ結合には影響しなかった（すなわち、結合は、ＬＲＰ−１のＡβ結合ポケットに特異的ではなかった）。本発明者らは、アスパラギン酸からグリシンへの残基３４３での単一突然変異（Ｄ３４３Ｇ）を含有する突然変異体ＬＲＰ−１が、ｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも３倍高いアフィニティでＡβ４２に結合し（Ｋｄ 〜１．５ｎＭ）、そしてｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも、Ａβ４０およびＡβ４２に対して、対照マウスにおけるＡβ末梢シンク作用より３０〜５０％の有意に高い作用を発揮することを見出した。さらに、突然変異体ＬＲＰＩＶは、ＫＰＩ含有ＡＰＰアイソフォーム（すなわち、ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１、およびｓＡＰＰβ）に検出可能には結合せず、そして血液脳関門を横断しなかった。突然変異体ＬＲＰＩＶおよびｗｔ−ＬＲＰＩＶは、どちらも、脳におけるＡＰＰレベルおよび／または代謝を改変するのに失敗した。したがって、脳または末梢において、ＡＰＰ代謝にいかなる有意な影響も及ぼさずに、ｗｔ−ＬＲＰＩＶよりも、Ａβに対する高い結合アフィニティを持つ突然変異体ＬＲＰ−１を、特異的Ａβシンク剤として用いることも可能である。
【０００８】
突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質および該タンパク質をコードする核酸、薬剤および組成物、ならびに治療法および診断法におけるその使用は、アミロイドの形成および疾患におけるその役割に適用可能であることを本明細書に解説する。重要なことに、突然変異体ＬＲＰ−１は、血液脳関門を越えて中枢神経系からのＡβ枯渇のため、末梢におけるシンクとして作用する。本発明の他の利点を以下に論じるか、またはこうした利点は、これらの考察から、当業者には明らかであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ ０１／９０７５８
【特許文献２】ＵＳ ２００４／０２５９１５９
【特許文献３】ＷＯ ２００５／１２２７１２
【特許文献４】ＵＳ ２００７／００５４３１８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ， ２００２
【非特許文献２】Ｓｅｌｋｏｅ， ２００１
【非特許文献３】ＺｌｏｋｏｖｉｃおよびＦｒａｎｇｉｏｎｅ， ２００３
【非特許文献４】Ｗａｌｓｈら， ２００２
【非特許文献５】Ｄａｈｌｇｒｅｎら， ２００２
【非特許文献６】Ｋａｙｅｄら， ２００３
【非特許文献７】Ｇｏｎｇら， ２００３
【非特許文献８】Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄら， ２００１
【非特許文献９】Ｄｅａｎｅら（２００４）
【非特許文献１０】Ｓａｇａｒｅら（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）の突然変異によって、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに対する結合アフィニティを改善することである。天然ＬＲＰ−１による結合に比較した際、突然変異体ＬＲＰ−１が、Ａβに特異的に結合するより高いアフィニティを有することが好ましい。さらに、１またはそれより多いカルシウム結合断片において少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を含むＬＲＰ−１誘導体が、１またはそれより多いカルシウム結合断片における野生型アスパラギン酸を置換しない以外はすべての突然変異を含むＬＲＰ−１誘導体よりも、少なくとも２倍高いアフィニティで、Ａβに結合することが好ましい。より好ましくは、アスパラギン酸置換は、Ａβに対する少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高いアフィニティを生じる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
１つの態様において、突然変異体ＬＲＰ−１を提供する。突然変異体ＬＲＰ−１は、ＬＲＰ−１由来の１またはそれより多いドメイン、および場合によって、ＬＲＰ−１に由来しない１またはそれより多いドメイン（すなわち、天然タンパク質には存在しない異種ドメイン）で構成されてもよい。少なくともクラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶが含有されることが好ましく；クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶのみから本質的になってもよい。より好ましくは、該ＬＲＰ−１は、少なくともクラスターＩＶを含有するか、またはクラスターＩＶのみから本質的になり；他方が存在するならば、クラスターＩＩまたはクラスターＩＶを含有しなくてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１は、場合による他のドメイン：細胞の外への分泌を指示するシグナルペプチド（例えば新生ポリペプチドを小胞体にターゲティングし、膜を渡ってポリペプチドを転位置させ、そして分泌経路を通じて、任意の修飾を伴うポリペプチドを輸送する、疎水性アミノ酸配列）およびポリペプチドを脂質二重層に付着させるドメイン（例えば、膜を渡るドッキングのための膜貫通ドメインまたは膜内への挿入のための脂質ドメイン）を含有してもまたは含有しなくてもよい。溶液中のＡβに結合するには、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が好ましく、これはおそらく、天然タンパク質の少なくとも膜貫通ドメインを除去することによる。突然変異体ＬＲＰ−１は、固体支持体に、可逆的にまたは非可逆的に付着してもよい（例えば、それぞれ化学的に不安定または安定である、共有結合を用いる）。これは天然ＬＲＰ−１に同一ではなく、したがって、天然アミノ酸配列の１またはそれより多いドメインが突然変異（例えば置換、付加、欠失）しなければならない一方、Ａβへの結合能が改善される（例えば好ましくは、突然変異を持たない同等のタンパク質に比較して、少なくとも２倍優れた結合）。ヒトまたは別の哺乳動物を供給源として用いることもまた好ましく、そして突然変異体ＬＲＰ−１（例えばヒト患者に注入されるヒトまたはヒト化哺乳動物ＬＲＰ−１突然変異体）を投与した被験体において、検出可能な免疫反応が誘発されないこともまた好ましい。
【００１３】
治療において薬剤として（例えば疾患を有する被験体における療法または疾患を発展させるリスクがある被験体における予防）、または診断においてＡβ検出のための直接結合剤として、突然変異体ＬＲＰ−１を用いてもよい。療法または予防組成物は、突然変異体ＬＲＰ−１および少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアー（例えば生理学的塩および緩衝液の溶液）で構成される。体の循環系を通じて、または機械によって（例えばアフェレーシス、または突然変異体ＬＲＰ−１／Ａβ複合体を形成し、そして該複合体を体から除去する他の体外技術）、被験体からＡβを除去することによって、あるいはアミロイド沈着を減少させることによって、Ａβを不活性化させることも可能である。診断組成物は、突然変異体ＬＲＰ−１および少なくとも１つの検出可能標識（例えば、色、酵素、蛍光、発光、磁性または常磁性、あるいは放射性検出のための部分）で構成される。突然変異体ＬＲＰ−１および検出可能標識は共有結合していてもまたはしていなくてもよい。あるいは、１またはそれより多い特異的結合対を通じて付着していてもよい。結合は、被験体の体内または体外で、溶液中で、または支持体上に固定されたものの１つと起こってもよい。Ａβに直接結合した突然変異体ＬＲＰ−１は、実験室アッセイを用いて（すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法）、あるいは蛍光、磁気共鳴、またはＸ線画像化によって、被験体の体において（すなわちｉｎ ｖｉｖｏ診断法）、体液または組織から調製された標本において、検出可能である。被験体は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【００１４】
本発明のさらなる側面は、以下の詳細な説明および請求項、ならびにその一般化から、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】図１−１は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図１−２】図１−２は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図１−３】図１−３は、ＬＲＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＬＲＰＩＩミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ７）における少なくともＤ１８４Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＩ（配列番号２）から本質的になる。ＬＲＰＩＶミニ受容体のカルシウム結合断片（すなわち補体反復モチーフＣＲ２９）における少なくともＤ３４３Ｇ突然変異は、ＬＲＰ−１由来のクラスターＩＶ（配列番号３）から本質的になる。補体反復モチーフのいくつかのみ（ＬＲＰＩＩのＣＲ３〜ＣＲ１０およびＬＲＰＩＶのＣＲ２１〜ＣＲ３１、配列番号４〜２２）がカルシウム結合断片であり、この中で、アスパラギン酸の突然変異が、Ａβペプチドへのミニ受容体の結合に影響を及ぼすであろう。カルシウム結合断片中、Ａβペプチドへの結合に影響を及ぼすように操作されるアスパラギン酸は、システインに続く：すなわちＣＲ３（配列番号４）、ＣＲ４（配列番号５）、ＣＲ７（配列番号８）、ＣＲ２１（配列番号１２）、ＣＲ２２（配列番号１３）、ＣＲ２４（配列番号１５）、ＣＲ２５（配列番号１６）、ＣＲ２６（配列番号１７）、ＣＲ２７（配列番号１８）、ＣＲ２８（配列番号１９）、ＣＲ２９（配列番号２０）、およびＣＲ３０（配列番号２１）。アスパラギン酸（Ｄ）のグリシン（Ｇ）での置換が好ましい。これらの位で作製してもよい他のありうる置換は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）である。
【図２】図２は、ＬＲＰＩＶ断片がＡβに高いアフィニティで結合することを示す。グラフは、ヒトＡβ４０（図２Ａ）およびＡβ４２（図２Ｂ）の異なるレベルでのＬＲＰＩＶ断片に対する結合曲線である。Ａβ４０（図２Ｃ）およびＡβ４２（図２Ｄ）への断片結合に関する結合定数（Ｋｄ）を示す。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図３】図３は、突然変異体ＬＲＰＩＶが、ＬＲＰ−１の他のリガンドよりも高いアフィニティでＡβに結合することを示す。グラフは、固定されたＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（図３Ａ）およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ（図３Ｂ）に対するヒトアポＥ２（Ｅ２）、アポＥ３（Ｅ３）、アポＥ４（Ｅ４）、ｔＰＡ、ＭＭＰ９、および因子ＩＸａに関する結合曲線である。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（図３Ｃ）およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ（図３Ｄ）へのリガンド結合に関するＫｄを示す。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図４】図４は、突然変異体ＬＲＰＩＶが野生型ＬＲＰＩＶに比較して低いアフィニティでＡＰＰに結合することを示す。グラフは、可溶性ＫＰＩ（クニッツ型プロテアーゼ阻害剤）ドメインおよび抗ＫＰＩ抗体（ｍＡｂ４．１）の非存在下および存在下での、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ６９５（図４Ａ）、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ７７０（図４Ｂ）およびＡＰＰ７５１（図４Ｃ）、ならびに可溶性ＫＰＩドメインおよびｍＡｂ４．１の非存在下および存在下での、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡβ４０（図４Ｄ）およびＡβ４２（図４Ｅ）に関する結合曲線である。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに対するＡβ４０、Ａβ４２、ＡＰＰ７７０、及びＡＰＰ７５１結合に関するＫｄを図４Ｆに示す。図４Ｇにおいて、固定されたＧＡＲ−ＬＲＰＩＶおよびＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対するＡＰＰ７７０結合に関するＫｄを比較する。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【図５】図５は、突然変異体ＬＲＰＩＶが、野生型ＬＲＰＩＶよりも高い、脳Ａβを低下させる能力を有することを示す。治療後の血漿Ａβ４０（図５Ａ）、血漿Ａβ４２（図５Ｂ）、脳Ａβ４０（図５Ｃ）、および脳Ａβ４２（図５Ｄ）を示す。対照（すなわち野生型）マウスをビヒクルおよびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（静脈内、２０μｇ／日）で５日間治療した。治療期間終了時、マウスの血漿および脳試料を収集した。ＡβレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．であり、群あたりｎ＝３アッセイである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
成熟低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）は、少なくとも５つの異なるタイプのドメインで構成される：（ｉ）リガンド結合性システインリッチ反復、（ｉｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体様システインリッチ反復、（ｉｉｉ）ＹＷＴＤ反復、（ｉｖ）膜貫通ドメイン、および（ｖ）細胞質ドメイン。シグナルペプチドは、分泌経路内に転位置した後、切断される。ＬＲＰ−１におけるリガンド結合型ドメインは、２〜１１の間の断片を含有する４つのクラスター（クラスターＩ〜ＩＶ）で存在する。結合部位がマッピングされているＬＲＰ−１に対するリガンドの大部分は、これらのリガンド結合型ドメインと相互作用する（クラスターＩＩおよびＩＶは、個々に、またはともに、Ａβペプチドの結合に寄与する）。これらの後に、ＥＧＦ前駆体相同ドメインが続き、これは、２つのＥＧＦ反復、プロペラ様構造に配置された６つのＹＷＴＤ反復、および別のＥＧＦ反復で構成される。６つのＥＧＦ反復が膜貫通ドメインに先行する。細胞質ドメインは、エンドサイトーシス機構、ならびに細胞シグナル伝達に関与する細胞質アダプターおよび足場タンパク質のドッキング部位として働く、２つのＮＰｘＹ反復で構成される。ＬＲＰ−１の重鎖（５１５ｋＤａ）は４つのリガンド結合ドメインを含有し、そしてＬＲＰ−１の軽鎖（８５ｋＤａ）は膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する。突然変異体ＬＲＰ−１は、重鎖またはその断片のみで構成されてもよい。可溶性ＬＲＰ−１に関しては、該タンパク質は膜貫通ドメインを欠き、そして好ましくはまた細胞質ドメインも欠いてもよい。
【００１７】
ＬＲＰ−１は、いくつかのタンパク質ファミリーに相当する少なくとも３０の異なるリガンドを認識し、これらには、リポタンパク質、プロテイナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤複合体、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、細菌毒素、ウイルス、および多様な他の細胞内タンパク質が含まれる。ＬＲＰ−１に認識されるリガンドの最大グループは、プロテイナーゼまたはタンパク質分解活性制御に関与する分子である。特定のセリンプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼは、ＬＲＰ−１に直接結合する一方、いくつかの他のプロテイナーゼは、特異的阻害剤と複合体化された場合のみに結合する。これらの阻害剤は、タンパク質分解的切断または小分子アミンとの反応後に生じるコンホメーション変化の後にのみ、ＬＲＰ−１によって認識される。対照的に、ＬＲＰ−１は、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）の天然および複合体化型の両方を認識する。ＬＲＰ−１はまた、多量体マトリックスタンパク質トロンボスポンジン−１およびトロンボスポンジン−２にも結合し、そしてシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａおよびマイナー群ヒト・ライノウイルスを細胞内に送達する。さらに、ＬＲＰ−１は、ＨＳＰ９６、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ならびにＬＲＰ−１および他のＬＤＬ受容体ファミリーメンバーの分子シャペロンとして機能する小胞体常在タンパク質であるＲＡＰを含む、いくつかの細胞内タンパク質を認識する。
【００１８】
ＬＲＰ−１はどのようにして、この多様なリガンドを特異的に認識するのだろうか？ 個々のリガンド結合ドメインの結晶学および核磁気共鳴によって、各リガンド結合ドメインの短いループ中のアミノ酸配列可変性が、反復のユニークな輪郭表面および電荷密度を生じることが明らかになった。異なるリガンド結合ドメインをＬＲＰ−１軽鎖に融合させ、そして細胞における発現後、個々のリガンドのエンドサイトーシスを仲介する能力を測定することによって、ＬＲＰ−１「ミニ受容体」が作製されてきている。好ましくは、可溶性ＬＲＰ−１断片は、組換え技術によって作製されてもよく、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで、異なるリガンドに結合する能力に関して、異なるリガンド結合ドメインをスクリーニングする。本明細書において、本発明者らは、Ａβの特異的結合において、リガンド結合ドメイン（クラスターＩＶを参照されたい）内のカルシウム結合断片の役割を立証する。これらは、協同で作用して、カルシウムおよびＡβペプチドの結合を協調させている可能性もある。したがって、Ａβ結合を異種ポリペプチド上に移植して（免疫原性を減少させるためのげっ歯類抗体のヒト化を参考にされたい）、突然変異体ＬＲＰ−１を作製してもよい。
【００１９】
「断片」は、全長ＬＲＰ−１の分子量より少ない分子量を持つＬＲＰ−１の特定の突然変異である。突然変異体ＬＲＰ−１のアミノ酸配列の分子量は、ＬＲＰ−１の単一リガンド結合ドメインおよび重鎖（５１５ｋＤａ）の分子量の間であってもよい。例えば、突然変異体ＬＲＰ−１は、約３０ｋＤａ〜約５５ｋＤａであってもよいが、より小さいおよびより大きい断片の両方が可能である。特に、可溶性ＬＲＰ−１のクラスターＩＩ（配列番号２）および／またはクラスターＩＶ（配列番号３）、あるいは１またはそれより多いそのカルシウム結合断片が好ましい。したがって、約６５ｋＤａ（一次アミノ酸配列にグリコシル化配列が加わったもの）未満の相対分子量を有する突然変異体ＬＲＰ−１が可能である。対照的に、突然変異体分子量を最小化することが望ましい場合は、突然変異体ＬＲＰ−１からのクラスターＩＩまたはクラスターＩＶのいずれかの排除（すなわちそれぞれ、クラスターＩＶまたはクラスターＩＩのみを含むもの）が好ましい。野生型ＬＲＰ−１タンパク質および該タンパク質をコードする核酸、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列、またはその成熟型は、ヒト（例えば寄託番号ＣＡＡ３２１１２、ＮＰ ００２３２３、Ｑ０７９５４、またはＳ０２３９２）、他の哺乳動物（例えばウシ、モルモット、マウス、ラット）由来であってもよいし、あるいはその多型および変異体であってもよい。天然ＬＲＰ−１タンパク質を化学的に操作（例えば加水分解的切断または酵素的タンパク質分解）して、ポリペプチド断片を作製してもよいが、細菌、カビまたは酵母、昆虫、あるいは哺乳動物細胞または生物における組換え技術によってこれらの断片を作製することが好ましい。遺伝子キメラを用いて、突然変異体ＬＲＰ−１を１またはそれより多い異種ドメインに融合させてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１をコードする核酸を培養細胞または生物内に導入し（例えば核トランスファー、トランスフェクション、遺伝子組換え、特に体内での幹細胞への、または体内への移植）、そこでポリペプチドが翻訳され、そしてプロセシングされてもよい。例えば、突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質は、ウイルス感染またはトランスフェクションによって細胞内に導入される発現構築物から産生されてもよい。発現構築物は、好ましくは、血管細胞特異的であるか、またはウイルス由来であるか、またはその組み合わせである、制御領域（例えばプロモーター、エンハンサー）から転写される。これらは、キャリアー中でタンパク質および他の核酸と会合してもよい（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはレトロウイルス由来のウイルス粒子中にパッケージングされるか、リポソーム中に被包されるか、あるいはポリマーと複合体化される）。ｉｎ ｖｉｖｏ治療には、被験体血管系内への、薬学的組成物（例えばウイルスまたは核酸含有溶液）の直接滴下が含まれる。ｅｘ ｖｉｖｏ治療のため、被験体またはドナー由来の細胞（例えば血管細胞またはその子孫）をｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルス感染させるかまたはトランスフェクションし、そして次いで、被験体の血管系内に移植してもよい。細胞は、特に脳、動脈、または網内系の臓器の、そしてより特に、血液脳関門の大脳動脈、肝臓、または幹細胞の、血管細胞（例えば平滑筋細胞）であってもよい。
【００２０】
可溶性ＬＲＰ−１を作製する好ましい方法は、野生型膜貫通ドメインを突然変異させる（例えばミスセンスまたは欠失突然変異）ことを伴う。例えば、膜貫通ドメインの前の部位に停止コドンを導入してもよいし、または膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする部分を欠失させてもよい。クラスターＩＶまたはそのいくつかのカルシウム結合断片を含むミニ受容体もまた産生してもよく（例えば遺伝子スプライシングまたはアダプタープライマーを用いた増幅によって）、そしてＡβ結合に用いてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１を、細胞膜の脂質二重層または別の支持体に付着させ、そして次いで、脱離させ／加水分解して、突然変異体ＬＲＰ−１を作製してもよい。例えば、タンパク質分解酵素は、細胞外部のペプチド結合を加水分解可能であるし、またはリパーゼは、脂質二重層中に挿入されたスフィンゴ糖脂質アンカーを加水分解可能である。あるいは、突然変異体ＬＲＰ−１は、Ａβへの結合前、結合中、または結合後に、支持体上に固定されていてもまたはいなくてもよい。
【００２１】
タンパク質融合体を作製し、そして用いてもよい。天然ＬＲＰ−１シグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドを用いて、ＥＲ膜を渡ってタンパク質を転位置させ、そして分泌経路を通じて、これを輸送してもよい。突然変異体ＬＲＰ−１はグリコシル化またはそうでなければ翻訳後修飾されてもよい。局在化ドメイン（例えば抗体または結合対の別のメンバー）を用いて、組織、臓器、または被験体の体の他の部分において、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体の局所濃度を増加させてもよい。例えば、ビオチン化またはストレプトアビジンとの融合は、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、同族結合メンバー（それぞれ、アビジンまたはビオチン）がその中に／またはそこに付着している体の部分に局在化させることも可能である。
【００２２】
例えば、カルシウム結合断片中の少なくとも１つの突然変異は、ヒトまたは他の哺乳動物（例えばウシ、モルモット、マウス、またはラット）由来のＬＲＰスーパーファミリーの任意のメンバー、特にＬＲＰ−１相同体において作製されてもよい。突然変異体ＬＲＰ−１相同体のアミノ酸またはヌクレオチド配列はまた、他の既知の置換、欠失、挿入、異種ドメインの融合、変異体、または多型も含んでもよい。
【００２３】
本明細書で研究する受容体−リガンド系に関しては、ＬＲＰ−１リガンド（例えばアポＥ、アポＪ、α２Ｍ）およびＲＡＰは、Ａβに結合するのに必要ではない。可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、溶液中に遊離のＡβに結合することも可能であるし、あるいは突然変異体ＬＲＰ−１またはＡβのいずれかが固相に最初に付着していることも可能である。突然変異体ＬＲＰ−１およびＡβ間で結合した後、次いで、結合前、結合中、または結合後の任意の時点で、どちらかまたは両方を支持体（例えば細胞、組織、または人工的固体支持体）上に固定してもよい。突然変異体ＬＲＰ−１／Ａβ複合体を単離してもまたは検出してもよい。アルツハイマー病を治療する候補化合物は、受容体−リガンド系の構成要素である少なくとも１つの遺伝子、転写物、またはタンパク質と相互作用して、受容体活性（すなわちＡβの血管クリアランス）を増加させてもよいし、そして療法または予防を提供する能力に関してスクリーニングされてもよい。これらの産物をアッセイ（例えばｍｔ−ＬＲＰ−１を用いてＡβを検出する診断法）で、または治療に用いてもよいし；好適には、これらは、アッセイキットまたは薬剤形式（例えば単一または多用量パッケージ）中にパッケージングされる。
【００２４】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体のＡβへの直接結合は、溶液中または支持体上で起こってもよい。アッセイ形式は、未結合Ａβからの結合Ａβの分離を必要としてもまたはしなくてもよい（すなわち不均一または均一形式）。検出可能なシグナルは、直接または間接的に、結合複合体の任意の部分に付着してもよく、競合的に、増幅されて、またはその任意の組み合わせで測定されてもよい。ブロッキングまたは洗浄工程を挿入して、感度および／または特異性を改善してもよい。結合前、結合後、または結合中の、支持体への可溶性ＬＲＰ−１突然変異体の付着は、以前付着されなかった受容体の捕捉を生じる。米国特許５，１４３，８５４および５，４１２，０８７を参照されたい。受容体−リガンド系の構成要素のタンパク質および／または転写物レベルで、存在量を測定してもよい。
【００２５】
また、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を支持体に付着させてもよい。支持体は、固体または多孔性であってもよく、そしてシート、ビーズ、または線維として形成されてもよい。支持体は、綿、絹、またはウール；セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、または陽性荷電ナイロン；天然ゴム、ブチルゴム、シリコンゴム、またはスチレンブタジエンゴム；アガロースまたはポリアクリルアミド；ケイ素またはシリコーン；結晶、無定形または不純物シリカ（例えば水晶）またはシリケート（例えばガラス）；ポリアクリロニトリル、ポリカーボネート、ポリエチレン、メタクリル酸ポリメチル、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフロリド、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、またはポリビニルピロリドン；あるいはその組み合わせで作製されてもよい。結合がモニター可能であり、そしてシグナルが光によって伝達可能であるように、光学的に透明である材料が好ましい。こうした試薬は、同族分子間の特異的相互作用によって、溶液中のＡβの捕捉を可能にし、そして次いで、支持体上にＡβを固定可能である。
【００２６】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、反応基、例えばカルボキシ、アミノ、またはヒドロキシラジカルを通じて、支持体に付着させてもよく；付着はまた、支持体上に直接、接触プリンティング、ピンでのスポッティング、ペンでのピペッティング、またはノズルでのスプレーを行うことによっても実行可能である。あるいは、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、特異的結合対（例えば抗体−ジゴキシゲニン／ハプテン／ペプチド、ビオチン−アビジン／ストレプトアビジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ−グルタチオン、マルトース結合タンパク質−マルトース、ポリヒスチジン−ニッケル、プロテインＡまたはＧ／免疫グロブリン）の相互作用によって、支持体に可逆的に付着してもよく；非可逆的付着が望ましい場合、架橋を用いてもよい。
【００２７】
好適な検出のため、容易にアッセイされるレポーターの可溶性ＬＲＰ−１突然変異体への付着を用いてもよい。レポーターは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、細菌／昆虫／海洋無脊椎動物ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、緑色および赤色蛍光タンパク質（それぞれＧＦＰおよびＲＦＰ）、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ラクタマーゼ、およびその誘導体（例えば青色ＥＢＦＰ、シアンＥＣＦＰ、黄緑色ＥＹＦＰ、脱安定化ＧＦＰ変異体、安定化ＧＦＰ変異体、またはＣｌｏｎｔｅｃｈによるＬＩＶＩＮＧ ＣＯＬＯＲＳ蛍光タンパク質として販売される融合変異体）であってもよい。レポーターは、好ましくは色素原、蛍光、または発光シグナルによってアッセイされる同族基質を用いる。あるいは、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、同族抗体またはアフィニティ樹脂が入手可能な、異種エピトープ（例えばＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＳＶ４０ Ｔ抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ヘキサヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ化されていてもよい。
【００２８】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体は、発現ベクターにおいて、適切なコード領域を遺伝子連結することによって、あるいは化学的架橋による結合メンバー上の反応部分への直接化学的連結によって、特異的結合対の１つのメンバーに連結させてもよい。これらをアフィニティ試薬として用いて、Ａβとの特異的結合に関与する相互作用を同定し、単離し、そして検出することも可能である。これは、溶液中の、または支持体に固定された複合体を生じる。
【００２９】
突然変異体ＬＲＰ−１を、薬剤、診断剤として用いてもよく、あるいは本明細書に開示する１またはそれより多い有用性を持つ療法または診断組成物を配合するために用いてもよい。これらをｉｎ ｖｉｔｒｏで体液または培養中の組織に投与してもよいし、ｉｎ ｖｉｖｏで被験体の体に投与してもよい。あるいはｅｘ ｖｉｖｏで被験体の体外で細胞に投与して、後に同じ被験体または別の被験体の体に戻してもよい。被験体の体から標本を採取した後、そして実験室アッセイの前に、体液および組織をさらにプロセシングしてもよい。例えば、細胞を脱凝集させるかまたは溶解するか、あるいは固形組織として提供してもよい。標本を、アッセイ前に、乾燥型または凍結型で保存してもよい。
【００３０】
化合物またはその誘導体を用いて、薬剤または他の薬学的組成物を産生してもよい。薬学的に許容されうるキャリアーをさらに含む組成物、および組成物を被験体に送達するのに有用な構成要素をさらに含む組成物が、当該技術分野に知られる。こうしたキャリアーおよび他の構成要素を本発明の組成物に添加することは、十分に当該技術分野の技術レベル内である。
【００３１】
可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合させるか、または体の循環（例えば網内系）を通じて可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合したＡβを除去することによって、あるいは機械（例えばアフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、ろ過、沈殿）によって、未結合Ａβの濃度を減少させることも可能である。被験体の体からのＡβの除去によって、または被験体の体のアミロイド沈着の減少によって、治療の有効性を評価してもよい。これは可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を用いてその量および／または位置を検出することも可能な、ヒト患者または動物モデルにおいて達成可能である。本明細書記載の治療様式は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のエンドサイトーシスおよび分解における低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質の役割を同定する、米国特許６，１５６，３１１に記載される機構とはかなり異なることに注目しなければならない。
【００３２】
標識または他の検出可能部分を、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に付着させてもよいし、または構造画像化：例えばＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、または他の光学検出技術のため、造影剤を含めてもよい。単一光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）などの機能的画像化もまた用いてもよい。脳または血管系におけるアミロイド負荷のＭＲＩ評価のため、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を標識（例えばガドリニウム）してもよい。血液脳関門（ＢＢＢ）透過処理剤を用いた、脳におけるアミロイド負荷のＳＰＥＣＴ評価のため、あるいは、ＢＢＢ透過処理剤を用いたまたは用いない脳アミロイド血管障害評価のため、可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を標識してもよい（例えば７６Ｂｒ、１２３Ｉ）。
【００３３】
また、例えば：診断、疾患に対するリスクがあるものまたはすでに罹患しているものの同定、あるいは疾患の段階またはその進行の決定などの方法を実行する際に使用するためのキットにおいて、試薬を提供してもよい。さらに、以下の：疾患の自然経過に介入することが望ましいかどうかの評価、疾患経過の改変、進行を停止させるかまたは遅延させる初期介入、機能の回復または維持の促進、有益な療法または予防のためのターゲットの提供、候補薬剤または医学的措置の比較、あるいは薬剤または医学的措置の有効性の決定などの、疾患の治療に関連する方法において、試薬を用いてもよい。これらの方法を実行するための指示、参照値および陽性／陰性対照、ならびに患者情報（例えば遺伝子型、病歴、疾患症状、遺伝子発現からの転写または翻訳収量、生理学的または病理学的知見）を含有する関係型データベースは、本発明の考慮される側面であってもよい他の産物である。
【００３４】
療法または予防が必要な被験体に投与される治療の量および度合いは、罹患患者を治療するのに有効である。本発明を単独で、または他の既知の方法と組み合わせて、用いてもよい。被験体は任意のヒトまたは動物であってもよい。哺乳動物、特にヒトおよびげっ歯類または霊長類疾患モデルを治療してもよい。したがって、獣医学的方法および医学的方法の両方が可能である。
【００３５】
１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または該タンパク質（単数または複数）をコードする核酸（単数または複数）を含有する薬学的組成物または診断組成物を、血液脳関門を通じた通過のために、または内皮と直接接触させるために順応した配合物として投与してもよい。あるいは、組成物を培地に添加してもよい。突然変異体タンパク質または核酸に加えて、こうした組成物は、生理学的に許容されうるキャリアー、および投与を促進しそして／または取り込みを増進させることが知られる他の成分（例えば生理食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、アフィニティに基づく細胞特異的ターゲティング系）を含有してもよい。組成物を、ゲル、スポンジ、または他の浸透性マトリックス（例えばペレットまたはディスクとして形成される）中に組成物を取り込んでもよいし、そして持続局所放出のため、内皮近傍に配置してもよい。単一用量で、または異なる時点で投与される多数回用量で、投与されてもよい。
【００３６】
１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または該タンパク質（単数または複数）をコードする核酸（単数または複数）を含有する薬学的組成物または診断組成物を、任意の既知の経路によって、体内に投与してもよい。例えば、組成物を粘膜、肺、局部、あるいは他の局所または全身経路（例えば腸内および非経口）によって投与してもよい。用語「非経口」には、限定なしに、皮下、皮内、真皮下、筋内、クモ膜下腔内、動脈内、静脈内、および他の注射または注入技術が含まれる。
【００３７】
用量の量およびタイミング、配合、および投与経路の適切な選択は、アルツハイマー病またはそのリスクにある被験体において、好ましい反応を達成し（すなわち有効性）、そして過度の毒性または他の害を回避する（すなわち安全性）目標とともに実行されうる。したがって、「有効な」は、望ましい効果を達成する条件の日常的な操作を伴う選択を指す。
【００３８】
１日１回短時間に渡って体内に投与される１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１の急速投与（ｂｏｌｕｓ）が、好適な投薬スケジュールである。あるいは、突然変異体タンパク質（単数または複数）または核酸（単数または複数）の有効１日用量を、投与の目的のため、多数の用量に分割してもよく、例えば１日あたり２〜１２の用量に分けてもよい。薬学的組成物中の突然変異体ＬＲＰ−１の投薬量もまた、被験体の体内において、特に脳の血管内皮中およびその周囲で、一過性のまたは持続される濃度を達成し、そして望ましい療法反応または防御を生じるため、多様であってもよい。しかし、望ましい療法効果を達成するために必要であるよりも低い用量レベルで開始し、そして望ましい効果が達成されるまで投薬量を次第に増加させることもまた、当該技術分野の技術範囲内である。同様に、診断組成物中の突然変異体ＬＲＰ−１の投薬レベルは、被験体体内のＡβの検出の望ましい感度および特異性を達成するため、多様であることも可能である。
【００３９】
投与される突然変異体ＬＲＰ−１の量は、タンパク質または核酸投与の生物活性および生物学的利用能（例えば、体内での半減期、安定性、代謝）；化学特性（例えば分子量、疎水性、可溶性）；経路（例えば非経口、特に静脈内）およびスケジューリング（例えば１ヶ月または１年あたりの頻度、連続用量間の期間）等、当業者に知られる要因に応じる。全身投与のため、血液脳関門を通じた突然変異体ＬＲＰ−１の通過が重要である。任意の特定の被験体に関して達成しようとする特定の用量レベルは、年齢、性別、健康状態、病歴、体重、１またはそれより多い他の薬剤との組み合わせ、および疾患の重症度を含む、多様な要因に応じうることもまた理解されるであろう。
【００４０】
用語、アルツハイマー病の「治療」は、とりわけ、被験体において１またはそれより多い症状を減少させるかまたは軽減し、１またはそれより多い症状が悪化するかまたは進行することを防止し、回復を促進するかまたは予後を改善し、そして／または罹患していない被験体において疾患を防止するとともに、存在する疾患の進行を遅延させるかまたは減少させることを指す。所定の被験体に関して、症状の改善、その悪化、退行、または進行は、客観的または主観的尺度によって決定可能である。罹患率または死亡率の改善（例えば選択した集団に関する、生存曲線の延長）として、治療の有効性を測定することも可能である。予防法（例えば再発発生の防止または減少）もまた、治療と見なされる。治療はまた、他の現存する治療様式（例えばＡＲＩＣＥＰＴまたはドネペジル、ＥＸＥＬＯＮまたはリバスチグミン、抗アミロイドワクチン、頭の体操（ｍｅｎｔａｌ ｅｘｅｒｃｉｓｅ）または刺激）との組み合わせを伴ってもよい。したがって、１またはそれより多い他の薬剤および１またはそれより多い他の医学的処置を含む組み合わせ治療を実施してもよい。
【００４１】
被験体に投与される突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または核酸の量は、好ましくは、その投与から生じる利点を上回る毒性または他の有害な影響を誘導しない量である。さらなる目的は、数を減少させ、重症度を減じ、そして／または別の方式で、認識される治療標準に比較した際に、疾患症状の苦痛を軽減させることである。本発明はまた、神経変性障害一般：例えば認知症、抑鬱、錯乱、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動協調性の喪失、多発性硬化症、脳卒中、および失神に対しても有効でありうる。
【００４２】
突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質または核酸の産生は、適切な政府監督官庁によって、医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）、ならびに製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に関して規制されるであろう。これは正確でそして包括的な記録管理、ならびにＱＡ／ＱＣのモニタリングを必要とする。官庁および施設委員会による患者プロトコルの監視は、また、インフォームドコンセントが得られており；製品の安全性、生物活性、適切な投薬量、および有効性が段階的に研究されており；結果が統計的に有意であり；そして道徳的指針に従っていることを確実にするよう想定される。動物モデルを用いたプロトコル、ならびに毒性化学薬品の使用、および法令順守の類似の監視が必要である。
【００４３】
療法的使用のため、適切な監督官庁は、生物製剤に関する純度の許容されうるレベル（例えば外来のタンパク質および核酸の欠如）；無菌性（例えば微生物の欠如）；宿主細胞混入の欠如（例えば１ｍＬあたり０．５内毒素単位未満）；および強度（例えば遺伝子トランスファーおよび発現効率）も特定するであろう。別の目的は、突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質または核酸の一貫したそして再現可能な産生を確実にしうることであり、これは生物製剤の強度を改善しつつ、純粋で、無菌であり、そして発熱物質を含まない製品を確実にするよう用いられる製造管理および品質管理に関する基準に適合することも可能である。
【００４４】
本明細書において、血液脳関門での突然変異体ＬＲＰ−１およびＡβの間の直接または間接的な相互作用は、高いβシート含量およびＡβ内の遺伝的突然変異を含むＡβ種の保持を促進しつつ、可溶性Ａβ４０を一掃することによって、神経毒性および血管向性Ａβ集積に決定的に影響を及ぼしうる。Ａβ内の突然変異は、突然変異体Ａβがｍｔ−ＬＲＰ−１に結合するアフィニティに有意に影響を及ぼさない。ＬＲＰ−１と対照的に、ＲＡＧＥは、脳内への循環Ａβの連続流入を仲介し、そしてトランスジェニックＡＰＰモデルにおいて、そしてＡＤにおいて、脳血管系で過剰発現される（Ｄｅａｎｅら、２００３）。血液脳関門でのまたは血管系における突然変異体ＬＲＰ−１の作用が、直接作用して、ＲＡＧＥが仲介するＡβ取り込みを阻害するか、または間接的に作用して、末梢における遊離Ａβに結合し、それによって脳におけるＡβの濃度低下を生じることによって、ＣＮＳにおけるＡβのレベルを減少させる可能性がある。適用には、脳アミロイド血管疾患（ＣＡＡ）を伴うアルツハイマー病の家族性型（ＦＡＤ）の被験体、例えばオランダまたはアイオワ突然変異を伴う患者（ＦＡＤ／ＣＡＡ）が含まれる。突然変異体ＬＲＰ−１は、野生型および突然変異体Ａβペプチドの両方に結合するため、突然変異体ＬＲＰ−１は、アルツハイマー病、ＦＡＤ／ＣＡＡ、およびダウン症候群において、血管病変に関連する変化を視覚化するため、脳の画像化剤として、診断目的に使用可能である。
【００４５】
突然変異体ＬＲＰ−１は、より高いアフィニティでＡβに結合するため、これらを用いて、脳から血液内へのＡβの放出を促進してもよい。遊離Ａβおよび可溶性ＬＲＰ−１突然変異体に結合したＡβのレベルを用いて、アルツハイマー病、ＦＡＤ／ＣＡＡ、およびダウン症候群に関する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（例えば二重サンドイッチＥＬＩＳＡ血液試験）を開発してもよい。作用機構は、抗Ａβ抗体、ゲルゾリン、ＧＭ１、およびｓＲＡＧＥなどの他の末梢Ａβ結合剤と類似の循環野生型または突然変異体Ａβの隔離であってもよい。全身循環中のＡβを隔離し、そして脳内への血液脳関門を渡るＡβ輸送を防止する、人工的な「シンク」としてｍｔ−ＬＲＰ−１を用いてもよい。１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質（単数または複数）または核酸（単数または複数）を用いると、（１）これらが、野生型クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶを含む野生型相同体、ゲルゾリン、ＧＭ１、ｓＬＲＰ−１、またはｓＲＡＧＥと比較して、より高いアフィニティでＡβに結合し、そして（２）これらが、クラスターＩＩおよびＩＶを含む可溶性ＬＲＰ−１に比較して、より小さいサイズであるため、治療される被験体によく許容されるはずであり、そしてそれによって、脳および脳血管における免疫または神経炎症反応を回避するはずであるという利点を提供する。
【００４６】
突然変異体ＬＲＰ−１のこれらの特性を用いて、末梢シンク剤として作用させることによって、トランスジェニックＦＡＤ／ＣＡＡマウス、アルツハイマー病の他の動物モデル、またはアルツハイマー病およびＦＡＤ／ＣＡＡ患者の脳におけるＡβのレベルを低下させることも可能である。この目的のため、１またはそれより多い突然変異体ＬＲＰ−１を単独で、または神経保護剤（例えばＧｕｏら、２００４に記載されるような活性化プロテインＣ）とともに、または被験体における循環Ａβを低下させる他の療法；Ａβに対する免疫またはワクチン接種；ガングリオシド、ゲルゾリン、またはｓＲＡＧＥの投与；アミロイド前駆体タンパク質のベータ／ガンマ・セクレターゼ仲介性プロセシングの阻害；血液脳関門の浸透圧開放（Ｎｅｕｗｅｌｔら、１９８５）；脳脊髄液産生の正常化（Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら、２００３）；またはその組み合わせとともに用いてもよい。
【００４７】
以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、そしてその実施を制限するかまたは別の方式で限定することを意図されない。
【実施例】
【００４８】
本発明者らは、１３の突然変異体ＬＲＰ−１をスクリーニングし、そしてこれらをクラスターＩＶのリガンド結合ドメインを含むＬＲＰ−１の可溶性誘導体（ＬＲＰＩＶ）に比較した。７つは、天然アミノ酸配列に比較していかなる突然変異も含まずに、ＬＲＰＩＶの異なる断片を含む。６つは、ＬＲＰＩＶ中に点突然変異：配列番号１中のＤ３３５４Ｇ、Ｄ３３９４Ｇ、Ｄ３５５６Ｇ、Ｄ３５９５Ｇ、Ｄ３６３３Ｇ、およびＤ３６７４Ｇを有した。配列番号１中のＤ３６７４Ｇは、クラスターＩＶ（配列番号３）中のＤ３４３Ｇに対応する。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、以下の実施例のリード化合物である。
【００４９】
ＬＲＰＩＶは、１１の補体関連モチーフ（ＣＲ２１〜ＣＲ３１）を含有し、そのうち９つはカルシウム結合断片であり、これは特異的および直接Ａβ結合の推定上の決定因子である。表面プラズモン共鳴分析を用いて、ＣＲ２４〜ＣＲ２８は、ＬＲＰＩＶの最も有効なカルシウム結合断片であることが示された（Ｍｅｉｊｅｒら、２００７）。３つの三重反復、ＣＲ２４〜ＣＲ２６、ＣＲ２５〜ＣＲ２７、およびＣＲ２６〜ＣＲ２８は、ＲＡＰと強く相互作用する。ＣＲ２４〜ＣＲ２６は、活性化α２−マクログロブリン（α２Ｍ＊）および因子ＶＩＩＩ軽鎖（ＦＶＩＩＩ ＬＣ）に対する最高の結合アフィニティを有する一方、ＣＲ２６〜ＣＲ２８は、因子ＩＸａ（ＦＩＸａ）結合の最適な領域であった（Ｍｅｉｊｅｒら、２００７）。ＣＲ２３およびＣＲ３１は、特異的および直接Ａβ結合に寄与しているようではない。本発明者らは、ＣＲ２４〜ＣＲ２８を用いて、ＬＲＰＩＶの可溶性カルシウム結合誘導体を産生し、そして高アフィニティＡβ結合に関してスクリーニングした。少なくとも３つのカルシウム結合断片が、ＲＡＰ、α２Ｍ＊、ＦＶＩＩＩ ＬＣ、およびＦＩＸａに結合するのに必要である一方、Ａβ結合に必要な反復の最小数は明らかでない。したがって、４つのカルシウム結合断片（ＣＲ２４〜ＣＲ２７およびＣＲ２５〜ＣＲ２８）、３つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５〜ＣＲ２７）、２つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５〜ＣＲ２６およびＣＲ２６〜ＣＲ２７）および１つのカルシウム結合断片（ＣＲ２５およびＣＲ２６）を含有するＬＲＰＩＶ断片を産生した。
【００５０】
ＧＳＴ−ＲＡＰアフィニティクロマトグラフィーを用いて、すべての主なリガンド結合ドメインを含むＬＲＰＩＶを精製した。精製ＬＲＰＩＶのＮ末端アミノ酸配列によって、ＬＲＰＩＶのアミノ酸配列のＮ末端に３つの外来のグリシン−アラニン−アルギニン（ＧＡＲ）アミノ酸が存在することが明らかになった（ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ）。ｔＰＡシグナルペプチドは、フューリン切断部位： −７ＲＦＲＲＧＡＲ−１、式中、エンドプロテアーゼは、ＲＦＲＲ↓ＧＡＲで切断し、突然変異体ＬＲＰ−１のＮ末端に３つの外来アミノ酸を生じる、を含有する。エンドプロテアーゼは、外来アミノ酸を除去しなかった。選択的Ａβ結合に関して、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶをスクリーニングした。
【００５１】
ｃＤＮＡの合成およびクローニング。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒト脾臓総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ヒトＬＲＰ１配列（ＮＭ ００２３３２）に基づいて、プライマーを設計した。Ｐｆｘ−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびそのそれぞれのプライマーセットを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡからＬＲＰＩＶドメインを増幅し、そしてｐｃＤＮＡ３．３ ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。この構築物を用い、ＰＣＲを用いて、ＬＲＰＩＶの１１反復（ＣＲ２１〜ＣＲ３１）、２種類の４反復（ＣＲ２４〜ＣＲ２７およびＣＲ２５〜ＣＲ２８）、１種類の３反復（ＣＲ２５〜ＣＲ２７）、２種類の２反復（ＣＲ２５〜ＣＲ２６、ＣＲ２６〜ＣＲ２７）および２種類の単一反復誘導体を増幅し、そして哺乳動物発現ベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２ Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位の間にクローニングして、可溶性タンパク質を発現させた。ｐＳｅｃＴａｇ２ Ｂベクターは、Ｎ末端上にＩｇＫリーダーペプチドを、そしてＣ末端上にＭｙｃタグおよびＨｉｓ６タグを有する。１２９ｂｐの順方向プライマー（Ｋｏｚａｋ配列、開始コドン、ｔＰＡシグナルペプチド配列およびＬＲＰＩＶ配列を有する）およびＨｉｎｄＩＩ制限部位を含む逆方向プライマーを用い、いかなるタグも含まない全長分泌ＬＲＰＩＶ（ｗｔ−ＬＲＰＩＶ）を増幅し、そしてｐｃＤＮＡ３．３ ＴＯＰＯベクター内にクローニングした。Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、６つのカルシウム結合部位で、突然変異体ＬＲＰＩＶ変異体を作製した。それぞれのプライマーセットとともに、ＷＴ−ＬＲＰＩＶをテンプレートとして用いた。突然変異プラスミドの挿入を、配列で検証し、ＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｗｔ−ＬＲＰＩＶプラスミド内にクローニングした。
【００５２】
タンパク質発現。１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ培地中、振盪装置上、３７℃で、懸濁チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を増殖させた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、各構築物で、ＣＨＯ細胞を安定トランスフェクションした。トランスフェクション５日後、抗生物質を含有する培地内に細胞を移した、ｐＣＤＮＡ ３．３ ＴＯＰＯには７００μｇ／ｍＬジェネティシン、またはｐＳｅｃＴａｇ２には２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン。１２〜１５日後、Ｃｌｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）混合物（４０％ Ｃｌｏｎｅ Ｍａｔｒｉｘ、５０％ ２ｘＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ、および抗生物質）を含有する１００ｍｍｘ１０ｍｍペトリ皿に、約５０００の抗生物質耐性細胞をプレーティングした。約３週後、５０〜６０の単一クローンを拾い、そして４８ウェルプレート中、ＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ培地内に移した。３日後、ＬＲＰＩＶ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって、発現されたＬＲＰＩＶに関して、培地を試験した。続いて、選択したクローンを１２ウェルおよび６ウェルプレート内に移した。単一の選択クローンをフラスコに移し、そして懸濁培養中で増殖させた。ファーンバックフラスコ中でＬＲＰＩＶ発現を行った。２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、および１０％ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＣＤＯｐｔｉ ＣＨＯ中、１ｘ１０６／ｍＬ細胞密度で培養を開始した。毎日、血球計算板（Ｈａｕｓｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ、ペンシルバニア州ホーシャム）を用いて細胞を計数し、そしてＧｌｕｃＣｅｌｌＴＭ試験ストリップ（ＣＥＳＣＯ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．、台湾・台中）を用いてグルコースレベルを測定した。グルコースレベルが馴化培地中２ｇ／Ｌ未満に落ちたら、２ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘおよび１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する１０％Ｆｅｅｄ Ａを細胞に補った。通常、培養４日後にフィーディングが必要であった。タンパク質を１０日間発現させ、遠心分離によって培地を採取し、そして０．２μｍフィルターを通じて、上清をろ過した。ＣＲ２５〜ＣＲ２６、ＣＲ２６〜ＣＲ２７、ＣＲ２６、ＣＲ２７、および突然変異体Ｄ３３５１Ｇ、Ｄ３５９２Ｇ、Ｄ３６３０Ｇの分泌は非常に低かった。したがって、これらの変異体はスクリーニングから排除された。
【００５３】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、バッチ中で、Ｈｉｓ６タグを含有するＬＲＰＩＶの異なる断片を精製した。馴化培地を１０％グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および洗浄したＮｉ−ＮＴＡ樹脂と混合し、振盪しながら室温で３０分間放置し、そして洗浄緩衝液（１０％グリセロール、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールおよび５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８）で洗浄した。結合したタンパク質を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８中の２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶出したタンパク質を５０ＫＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州ビラリカ）に通過させた。ＧＳＴ−ＲＡＰアフィニティカラムを用いて、単一アフィニティ精製工程によって、ｗｔ−ＬＲＰＩＶを精製した。ＧＳＴ−ＲＡＰを発現させ、Ｂ−ＰＥＲ ＧＳＴ融合タンパク質精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてアフィニティ精製し、そしてＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリングキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、アガロースビーズ上に固定した。抗ＬＲＰＩＶ−抗体アフィニティカラムを用いて、一工程で、突然変異体ＬＲＰＩＶ変異体を精製した。ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリングキットを用いて、アガロースビーズに純粋な抗ＬＲＰＩＶ抗体を固定することによって、抗ＬＲＰＩＶ−抗体カラムを調製した。約１００ｍｌの馴化培地を洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３Ｘ希釈し、抗ＬＲＰＩＶ抗体アフィニティカラム上に装填し、９００ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出させ、２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ９．５）で中和し、そして１０ＫＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。５０ｍＭ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９）に対して、各精製ＬＲＰＩＶ変異体を透析した。これらの純度を銀染色によって確認し、そしてウェスタンブロット分析によって同定した。
【００５４】
タンパク質の発現レベルが低く、そしてＡβ４０への結合が非常に低いため、単一反復（ＣＲ２５およびＣＲ２６）および二重反復（ＣＲ２５〜２６およびＣＲ２６〜２７）をスクリーニングから除去した。
【００５５】
ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、４反復（ＣＲ２４〜２７およびＣＲ２５〜２８）および３反復（ＣＲ２５〜２７）は、４〜８倍低いアフィニティでＡβ４０に結合する（図２Ａ〜２Ｂ）。対照的に、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、４つのＣＲおよび３つのＣＲは、類似のアフィニティでＡβ４２に結合する（図２Ｃ〜２Ｄ）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、ＲＡＰ結合領域外部のカルシウム結合部位に突然変異（Ｄ３４３Ｇ）を有するＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、それぞれ、２．５倍および１．５倍高いアフィニティの選択的結合をＡβ４２およびＡβ４０に対して示した（図２Ａ〜２Ｄ）。Ｄ３４３Ｇ突然変異が、ＬＲＰＩＶにおいてコンホメーション変化を引き起こし、これがＡβの選択的結合を増進させた可能性がある。Ｓａｇａｒｅら（２００７）が用いたタグ化ＬＲＰＩＶに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、Ａβ４２およびＡβ４０に対して、それぞれ、２．６倍および１．４倍高いアフィニティを有した。ＬＲＰ−１は、他のリガンドと相互作用するため、本発明者らはまた、これらに対するＬＲＰＩＶの結合アフィニティも比較した。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、それぞれ、２．５倍および１．５倍高いアフィニティでＡβ４２およびＡβ４０に結合し；２倍低いアフィニティでアポＥに、そしてそれぞれ、２倍、３倍および４倍低いアフィニティでｔＰＡ、ＭＭＰ９、およびＦＩＸａに弱く結合する（図３Ａ〜３Ｄ）。α２Ｍ＊およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ間にはほとんど相互作用がなかった。ＬＲＰ−１はＫＰＩ（クニッツ型プロテアーゼ阻害剤）ドメイン（Ｋｏｕｎｎａｓら、１９９５）を通じてＡＰＰと相互作用するため、本発明者らは、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ、およびＫＰＩドメインを含む（ＡＰＰ７７０、ＡＰＰ７５１）またはＫＰＩドメインを含まない（ＡＰＰ６９５）ＡＰＰアイソフォーム間の相互作用を決定した。ＡＰＰ６９５は、脳における主なＡＰＰアイソフォームである。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶはＡＰＰ６９５に結合しない（図４Ａ）一方、ＡＰＰ７７０（図４Ｂ）およびＡＰＰ７５１（図４Ｃ）に対する弱い結合があり、これは可溶性ＫＰＩドメインまたは抗ＫＰＩ抗体（ｍＡｂ４．１）で置換された。しかし、Ａβ４０およびＡβ４２に対するＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ結合は、可溶性ＫＰＩまたはｍＡｂ４．１によって影響を受けなかった（図４Ｄ〜４Ｅ）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶおよびＡＰＰ７７０またはＡＰＰ７５１間の結合アフィニティは、Ａβ４０およびＡβ４２のものより、それぞれ、５０倍および２５倍低かった（図４Ｆ）。ＡＰＰ７７０およびＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ間の結合アフィニティは、ＡＰＰ７７０およびＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ間のものより３倍大きかった（図４Ｇ）。Ａβ４０およびＡβ４２に選択的にそして高アフィニティで結合するため、脳におけるＡβペプチドの末梢シンクとして作用することによってアルツハイマー病を治療するためのリード化合物として、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶを選択した。
【００５６】
脳Ａβレベルを低下させるためのＬＲＰＩＶ ｉｎ ｖｉｖｏ有効性。野生型マウス（２〜３ヶ月齢のＣ５７ＢＬ６）を、キャリアーのみ（ビヒクル）、ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶ、またはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（静脈内、２０μｇ）で５日間、毎日治療した。Ｓａｇａｒｅら（２００７）に記載される類似のプロトコルを参照されたい。投薬期間終了時、脳組織および血漿を収集し、そしてＥＬＩＳＡによってＡβレベルを決定した。ビヒクルと比較すると、ＬＲＰＩＶ類似体はどちらもＡβ４０およびＡβ４２の血漿レベルが増加し、そして脳における対応物が減少する一方、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対する反応は有意により高かった（図５Ａ〜５Ｄ）。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは血漿において、Ａβ４０およびＡβ４２と、有意により多く結合し（図５Ａおよび５Ｂ）、そしてＧＡＲ−ＬＲＰＩＶよりも、脳Ａβレベルを低下させる際により有効であった（図５Ｃおよび５Ｄ）。どのくらい迅速にＭＴ００７−ＬＲＰＩＶが脳Ａβレベルを減少させうるかを決定するため、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（１０μｇ）またはビヒクルの単回静脈内急速投与で、同じ年齢のＣ５７Ｂ６マウスを治療した。１２時間後、脳および血漿におけるＡβレベルをＥＬＩＳＡによって決定した。ビヒクルに比較して、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、血漿Ａβ４０およびＡβ４２を、それぞれ、１．３３倍および２．８５倍増加させ、そして脳Ａβ４０およびＡβ４２を１．６８倍および１．４５倍減少させた。したがって、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、中枢神経系にあるＡβに関してさえ、Ａβの有効な末梢シンクである。
【００５７】
突然変異体ＬＲＰ−１の免疫原性。免疫原性試験のため、ミリグラム量の突然変異体ＬＲＰ−１タンパク質が必要である。受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）を含有するカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーは、弱くしかＲＡＰに結合しない突然変異体ＬＲＰＩＶタンパク質の単離には使用不能である。ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶは、ＧＳＴ−ＲＡＰカラムに結合しないため、抗ＬＲＰＩＶ抗体カラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって単離し、その結果、回収は劣っていた。したがって、本発明者らは、イオン交換カラムを用いた別の単離プロセスを開発し、これはより優れた精製および収量を生じた（以下を参照されたい）。精製タンパク質（２．２ｍｇ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、そして免疫原性試験のため、外部実験室に送った。およそ８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスを用いる。３つの用量（２０、４０、および８０μｇ／ｋｇ）のＭＴ００７−ＬＲＰＩＶを試験した。マウスに隔週で４回注射した。各用量の１週後、血液を収集し、プロセシングし、そしてＱＥＤ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）によるＥＬＩＳＡによって、ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶに対する抗体を用いて試験した。免疫学的応答はなかった。
【００５８】
ＭＴ００７−ＬＲＰＩＶタンパク質をＣＨＯ細胞において発現させた。単離プロセスは、ＣＨＯ細胞からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）による混入の可能性を残しうる。したがって、本発明者らは、２つの独立の方法によって最終精製タンパク質調製物中のＨＣＰ混入を追った。（Ａ）ウェスタンブロット分析：試料を還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そして次いで、ニトロセルロース膜にトランスファーした。非特異的部位をブロッキングした後、ＣＨＯタンパク質不含培地に対して作製したヤギ抗体を含有する溶液に、膜を曝露した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で抗体を標識した。洗浄後、ＥＣＬ法を用いて、タンパク質を検出した。抗体（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はポリクローナルであり、そして多数の潜在的な混入物：すなわち、ＳＤＳ／ＤＴＴ可溶化ＣＨＯ細胞由来の、および馴化ＣＨＯタンパク質不含培地中に見られるＨＣＰ由来の４０を超える異なるＣＨＯ ＨＣＰバンドに対する広い反応性を持って生成された。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ：Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手可能なキットを用いた。これはウェスタンブロッティングよりもより感受性である。キットは、精製とは独立に、産物に混入しうる本質的にすべてのＨＣＰと反応する。未結合馴化培地中に見られるアフィニティ精製ＣＨＯ ＨＣＰに対して抗体を生成した。ウェスタンブロッティングによって検出可能なシグナルは観察されなかった。ＥＬＩＳＡによって、ＨＣＰ混入は１００ｐｐｍ未満であることが示され、これは一般的に許容されうると見なされる（Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【００５９】
潜在的な副作用。研究によって、タグ化ＬＲＰＩＶ（１μｇ／日および４０μｇ／ｋｇ、腹腔内）で３ヶ月治療したマウスは潜在的な副作用を持たないことが示された（Ｓａｇａｒｅら、２００７）。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶ（２０μｇ静脈内、毎日５日間）で治療したマウス（Ｃ５７Ｂ６）の組織試料および血漿を潜在的な副作用に関して分析したが、まったく観察されなかった。コレステロール、アポＥ、ｔＰＡ、プロＭＭＰ９、およびグルコースの血漿レベルにおいては有意な変化はなかった。単回静脈内急速投与４０μｇ／ｋｇを投与されたマウスの別個の群（Ｃ５７ＢＬ６、２〜３ヶ月齢）において、２時間後に血液試料を除去し、そして活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）として血漿凝固時間を決定した。これは不変であった。肝臓および脳において、ＬＤＬＲまたはＬＲＰ−１の発現レベルに検出可能な変化はなかった。さらに、リン酸化ＬＲＰ−１レベルは脳において検出可能な変化はなかった。さらに、脳におけるＡＰＰレベルは、ＬＲＰＩＶ治療によって不変であった。ＧＡＲ−ＬＲＰＩＶまたはＭＴ００７−ＬＲＰＩＶはＣＳＦに進入しなかった。
【００６０】
参考文献
【００６１】
【化１−１】
【００６２】
【化１−２】
本明細書に引用する特許、特許出願、書籍、および他の刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【００６３】
請求項の意味およびその法律的同等物の範囲内にあるすべての修飾および置換は、その範囲内に含まれるものとする。転換句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いた請求項は、請求項の範囲内に他の要素が含まれることを許す；本発明はまた、「含む」用語の代わりに、転換句「から本質的になる」（すなわち、本発明の運用に実質的に影響を及ぼさないならば、請求項の範囲内に他の要素が含まれることを可能にする）および転換句「からなる」（すなわち、本発明に通常関連する不純物または重要ではない活性以外は、請求項に列挙される要素のみを許す）を用いた請求項によっても記載される。例えば、「クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶから本質的になる」は、他の機能ドメインがＡβの結合に影響を及ぼさないならば、該ドメインの包含を可能にする一方、「クラスターＩＩおよび／またはクラスターＩＶからなる」は、他の機能ドメインの包含を禁じるであろう。これらの３つの転換句のいずれを用いて、本発明を請求することも可能である。
【００６４】
本明細書に記載される要素は、請求項に明確に列挙されない限り、請求する発明の限定と見なされてはならないことを理解すべきである。特に、突然変異体ＬＲＰ−１は、好ましくはヒトの、ＬＲＰ−１の天然アミノ酸またはヌクレオチド配列から、欠失させて１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインの単位を単離し、挿入して１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインを互いに分離し、融合させて間に外来のアミノ酸を含みまたは含まずに１またはそれより多いＬＲＰ−１ドメインの単位を連結し、そして天然配列中の１またはそれより多いアミノ酸またはヌクレオチドを置換することによって、想定されうる。したがって、付与される請求項は、法的保護の範囲を決定するための基礎であり、明細書から請求項に限定が読み込まれるのではない。対比して、先行技術は、請求される本発明を予期するかまたは新規性を消滅させる具体的な態様の度合いまで、本発明から排除される。
【００６５】
さらに、請求項の制限間またはその中の特定の関係は、請求項に明らかに列挙されない限り、意図されない（例えば、製品請求項中の構成要素の配置または方法請求項中の工程の順序は、明らかに言及されない限り、請求項の制限ではない）。本明細書に開示する個々の要素のすべてのありうる組み合わせおよび順列は、本発明の側面であると見なされる。同様に、本発明の説明の一般化は、本発明の一部と見なされる。
【００６６】
前述から、当業者には、本発明がその精神または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形式で具象化可能であることが明らかであろう。記載される態様は、制限ではなく、例示としてのみ見なされ、これは本発明に提供する法的保護の範囲が、本明細書によるよりも、付随する請求項によって示されるためである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異体低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）であって、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合し、そしてＬＲＰ−１の１またはそれより多いカルシウム結合断片において少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、前記ＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項２】
１またはそれより多いカルシウム結合断片内で、突然変異アスパラギン酸にシステインが先行する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項３】
突然変異が、アラニン、グリシン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸へのアスパラギン酸の置換であり；好ましくはアスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への突然変異がある、請求項１または２のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項４】
突然変異が、ＬＲＰＩＩにおけるＤ２３Ｇ、Ｄ６４Ｇ、Ｄ１８４Ｇ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され；好ましくは少なくともＤ１８４Ｇ突然変異である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項５】
突然変異が、ＬＲＰＩＶにおけるＤ２３Ｇ、Ｄ６３Ｇ、Ｄ１４３Ｇ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ２２５Ｇ、Ｄ２６４Ｇ、Ｄ３０２Ｇ、Ｄ３４３Ｇ、Ｄ３８６Ｇ、およびその組み合わせからなる群より選択され；好ましくは少なくともＤ３４３Ｇ突然変異である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項６】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、およびその組み合わせからなる群より選択される突然変異カルシウム結合断片；好ましくは少なくとも配列番号８および／または配列番号２０を含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項７】
少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９のカルシウム結合断片；好ましくは１２またはそれより少ないカルシウム結合断片を含む、請求項１〜６のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項８】
配列番号２および／または配列番号３を含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項９】
クラスターＩＩから本質的になり、そしてＣＲ３、ＣＲ４、およびＣＲ７からなる群より選択される１またはそれより多いカルシウム結合断片；好ましくは少なくともＣＲ７において、少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１０】
クラスターＩＶから本質的になり、そしてＣＲ２１、ＣＲ２２、ＣＲ２４、ＣＲ２５、ＣＲ２６、ＣＲ２７、ＣＲ２８、ＣＲ２９、およびＣＲ３０からなる群より選択される１またはそれより多いカルシウム結合断片；好ましくは少なくともＣＲ２９において、少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１１】
分泌を仲介する少なくとも１つのドメインで構成される、請求項１〜１０のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１２】
可溶性である請求項１〜１１のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１３】
膜貫通ドメインで構成されない、請求項１２のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１４】
ヒト由来である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１５】
ヒトにおいて免疫反応を誘発しない、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１６】
少なくとも１つの異種ドメインをさらに含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項におけるような突然変異体ＬＲＰ−１および（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアーで構成される、Ａβを不活性化させるための組成物。
【請求項１８】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項におけるような突然変異体ＬＲＰ−１および（ｉｉ）少なくとも１つの検出可能標識で構成される、Ａβを検出するための診断組成物。
【請求項１９】
前記突然変異体ＬＲＰ−１および前記の少なくとも１つの検出可能標識が共有結合している、請求項１８の診断組成物。
【請求項２０】
前記突然変異体ＬＲＰ−１および前記の少なくとも１つの検出可能標識が共有結合していない、請求項１８の診断組成物。
【請求項２１】
前記の少なくとも１つの検出可能標識が、前記突然変異体ＬＲＰ−１の異種ドメインに共有結合している、請求項１８の診断組成物。
【請求項２２】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）の１またはそれより多いカルシウム結合断片においてアスパラギン酸の突然変異を持たないＬＲＰ−１誘導体よりも高いアフィニティでアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合する、薬剤または診断剤の製造のための、ＬＲＰ−１突然変異体誘導体の使用。
【請求項２３】
被験体の体液および／または組織におけるアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合させる方法であって：
（ａ）可溶性低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）突然変異体を提供し、そして
（ｂ）前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、前記Ａβが特異的に結合されるように、前記被験体の少なくとも前記体液および／または組織と接触させる
工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体の体内で、前記Ａβに結合する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体の体外で、前記Ａβに結合する、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、前記被験体の体から除去する、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体体内のアミロイド沈着が減少するように不活性化される、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を検出する工程をさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
Ａβが、血液、血漿、血清、間質液（ＩＳＦ）、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群より選択される体液中で結合している、請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
Ａβが、脳および他の中枢神経系組織、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、およびその組み合わせ；大脳動脈、内膜血管、および側頭動脈からなる群より選択される組織、好ましくは血管内皮中で結合している、請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
天然低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）よりも少なくとも１０倍高いアフィニティで、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合する、突然変異体ＬＲＰ−１突然変異体の使用。
【請求項３２】
被験体の体からＡβを除去するための、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
被験体の体におけるアミロイド沈着を減少させるための、請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
被験体の体におけるＡβを位置決定するための、請求項３１記載の使用。
【請求項３５】
被験体の体におけるアミロイドとしてのＡβの沈着を防止する、請求項３１記載の使用。
【請求項１】
突然変異体低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）であって、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合し、そしてＬＲＰ−１の１またはそれより多いカルシウム結合断片において少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、前記ＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項２】
１またはそれより多いカルシウム結合断片内で、突然変異アスパラギン酸にシステインが先行する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項３】
突然変異が、アラニン、グリシン、セリン、およびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸へのアスパラギン酸の置換であり；好ましくはアスパラギン酸（Ｄ）からグリシン（Ｇ）への突然変異がある、請求項１または２のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項４】
突然変異が、ＬＲＰＩＩにおけるＤ２３Ｇ、Ｄ６４Ｇ、Ｄ１８４Ｇ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され；好ましくは少なくともＤ１８４Ｇ突然変異である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項５】
突然変異が、ＬＲＰＩＶにおけるＤ２３Ｇ、Ｄ６３Ｇ、Ｄ１４３Ｇ、Ｄ１８４Ｇ、Ｄ２２５Ｇ、Ｄ２６４Ｇ、Ｄ３０２Ｇ、Ｄ３４３Ｇ、Ｄ３８６Ｇ、およびその組み合わせからなる群より選択され；好ましくは少なくともＤ３４３Ｇ突然変異である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項６】
配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、およびその組み合わせからなる群より選択される突然変異カルシウム結合断片；好ましくは少なくとも配列番号８および／または配列番号２０を含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項７】
少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、または少なくとも９のカルシウム結合断片；好ましくは１２またはそれより少ないカルシウム結合断片を含む、請求項１〜６のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項８】
配列番号２および／または配列番号３を含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項９】
クラスターＩＩから本質的になり、そしてＣＲ３、ＣＲ４、およびＣＲ７からなる群より選択される１またはそれより多いカルシウム結合断片；好ましくは少なくともＣＲ７において、少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１０】
クラスターＩＶから本質的になり、そしてＣＲ２１、ＣＲ２２、ＣＲ２４、ＣＲ２５、ＣＲ２６、ＣＲ２７、ＣＲ２８、ＣＲ２９、およびＣＲ３０からなる群より選択される１またはそれより多いカルシウム結合断片；好ましくは少なくともＣＲ２９において、少なくとも１つのアスパラギン酸突然変異を有する、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１１】
分泌を仲介する少なくとも１つのドメインで構成される、請求項１〜１０のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１２】
可溶性である請求項１〜１１のいずれか一項のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１３】
膜貫通ドメインで構成されない、請求項１２のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１４】
ヒト由来である、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１５】
ヒトにおいて免疫反応を誘発しない、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１６】
少なくとも１つの異種ドメインをさらに含む、請求項１のＬＲＰ−１突然変異体。
【請求項１７】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項におけるような突然変異体ＬＲＰ−１および（ｉｉ）少なくとも１つの薬学的に許容されうるキャリアーで構成される、Ａβを不活性化させるための組成物。
【請求項１８】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項におけるような突然変異体ＬＲＰ−１および（ｉｉ）少なくとも１つの検出可能標識で構成される、Ａβを検出するための診断組成物。
【請求項１９】
前記突然変異体ＬＲＰ−１および前記の少なくとも１つの検出可能標識が共有結合している、請求項１８の診断組成物。
【請求項２０】
前記突然変異体ＬＲＰ−１および前記の少なくとも１つの検出可能標識が共有結合していない、請求項１８の診断組成物。
【請求項２１】
前記の少なくとも１つの検出可能標識が、前記突然変異体ＬＲＰ−１の異種ドメインに共有結合している、請求項１８の診断組成物。
【請求項２２】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）の１またはそれより多いカルシウム結合断片においてアスパラギン酸の突然変異を持たないＬＲＰ−１誘導体よりも高いアフィニティでアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合する、薬剤または診断剤の製造のための、ＬＲＰ−１突然変異体誘導体の使用。
【請求項２３】
被験体の体液および／または組織におけるアミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合させる方法であって：
（ａ）可溶性低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）突然変異体を提供し、そして
（ｂ）前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、前記Ａβが特異的に結合されるように、前記被験体の少なくとも前記体液および／または組織と接触させる
工程を含む、前記方法。
【請求項２４】
前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体の体内で、前記Ａβに結合する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体の体外で、前記Ａβに結合する、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を、前記被験体の体から除去する、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体が、前記被験体体内のアミロイド沈着が減少するように不活性化される、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
Ａβに結合した可溶性ＬＲＰ−１突然変異体を検出する工程をさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
Ａβが、血液、血漿、血清、間質液（ＩＳＦ）、および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群より選択される体液中で結合している、請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
Ａβが、脳および他の中枢神経系組織、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、およびその組み合わせ；大脳動脈、内膜血管、および側頭動脈からなる群より選択される組織、好ましくは血管内皮中で結合している、請求項２３〜２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
天然低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質−１（ＬＲＰ−１）よりも少なくとも１０倍高いアフィニティで、アミロイド−ベータ（Ａβ）ペプチドに結合する、突然変異体ＬＲＰ−１突然変異体の使用。
【請求項３２】
被験体の体からＡβを除去するための、請求項３１記載の使用。
【請求項３３】
被験体の体におけるアミロイド沈着を減少させるための、請求項３１記載の使用。
【請求項３４】
被験体の体におけるＡβを位置決定するための、請求項３１記載の使用。
【請求項３５】
被験体の体におけるアミロイドとしてのＡβの沈着を防止する、請求項３１記載の使用。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【図１−２】
【図１−３】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図４Ｇ】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５０７９１７（Ｐ２０１３−５０７９１７Ａ）
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３４１７７（Ｐ２０１２−５３４１７７）
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６６２２
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９９３２）ズィーズィー・アルツテック・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月７日（２０１３．３．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１８日（２０１０．１０．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７６９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４６６２２
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９９９３２）ズィーズィー・アルツテック・エルエルシー (1)
【Ｆターム（参考）】
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