アルツハイマー病の予防用及び処置用免疫原性ペプチド組成物
【課題】アルツハイマー病の予防及び処置に有用なペプチド免疫原を有する組成物の提供。
【解決手段】ＭＨＣ結合モチーフの種々のクラスＩＩを有するヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）と結合する、主要な機能性／制御部位、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端フラグメントを有するペプチド免疫原であり、Ａβペプチドの主要な機能性／制御部位に対して、部位配向性免疫応答を導き出し、抗体を生成する、該抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病の患者の脳で形成されるアミロイドプラークと高い交差反応性を有する、ペプチド免疫原。
【効果】可溶性Ａβ１−４２ペプチドと交差反応性である、導き出された抗体は、フィブリル離解を促進し、「可溶性Ａβ由来毒」の免疫中性化を導くフィブリル凝集を抑制し、アミロイドプラークと交差反応性であり、脳からの該プラークの浄化を促進する。
【解決手段】ＭＨＣ結合モチーフの種々のクラスＩＩを有するヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）と結合する、主要な機能性／制御部位、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端フラグメントを有するペプチド免疫原であり、Ａβペプチドの主要な機能性／制御部位に対して、部位配向性免疫応答を導き出し、抗体を生成する、該抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病の患者の脳で形成されるアミロイドプラークと高い交差反応性を有する、ペプチド免疫原。
【効果】可溶性Ａβ１−４２ペプチドと交差反応性である、導き出された抗体は、フィブリル離解を促進し、「可溶性Ａβ由来毒」の免疫中性化を導くフィブリル凝集を抑制し、アミロイドプラークと交差反応性であり、脳からの該プラークの浄化を促進する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び処置に有用なペプチド免疫原を有する組成物に関する。特に、ペプチド免疫原は、ＭＨＣ結合モチーフの種々のクラスＩＩを有するヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）に結合される、主要な機能性／制御部位、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端フラグメントを有する。ペプチド免疫原は、Ａβペプチドの主要な機能性／制御部位に対して、部位配向性（site-directed）の免疫応答を導き出し、抗体を生成する。該抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病の患者の脳で形成されるアミロイドプラークと高い交差反応性を有する。可溶性Ａβ１−４２ペプチドと交差反応性である、導き出された抗体は、フィブリル離解（disaggregation）を促進し、「可溶性Ａβ由来毒」の免疫中性化（immunoneutoralization）を導くフィブリル凝集を抑制し、アミロイドプラークと交差反応性であり、脳からの該プラークの浄化を促進する。したがって、ペプチド免疫原を有する本発明の組成物は、アルツハイマー病の予防及び処置に有用である。
【発明の背景】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の認識能力の欠損及び重篤な挙動異常性によって特徴づけられ、最後には患者の死を導く、慢性の神経変性疾患である。現在、米国には２５０万人〜４００万人、世界には１７００万人〜２５００万人のＡＤ患者が存在する。西洋社会では、心臓病、ガン、及び発作に次いで、死亡原因の第４位にある。アリセプト（ＡＲＩＣＥＰＴ）（商標）、アセチルコリンステラーゼ抑制剤は、アルツハイマー患者の衰える速度を減速させるものとしてＦＤＡによって認められている。しかしながら、ある限られた期間及びある患者にだけに有効である。現在まで、このひどい病気に対する決定的な処置又は治療法はない。
【０００３】
２種の微小な沈着物、即ち神経細線維もつれ（neurofibrillary tangle）（ＮＦＴ）及び老人性アミロイドプラークは、この病気の病理学上の顕著な特徴としてアロイス・アルツハイマーによって同定された。神経細線維もつれは、互いにねじれている、２つの１０ｎｍ幅のフィラメントからなり、一対のらせんフィラメント（paired helical filaments）（ＰＨＦｓ）と呼ばれており、その主要な成分はリン酸化タウである。タウタンパク質の２６２位のアミノ酸のセリンのリン酸化は、タウの生理学的な機能不全を導く重要な工程である。ＰＨＦｓは、細胞内であり、異常な樹状の工程及び軸索工程、又は老人性アミロイドプラークの周辺を作る神経突起の多くで観察される。老人性アミロイドプラークは、アミロイド沈着物の細胞核と共に、横断面が１５０μｍまでの面積での組織破壊された神経網フィラメントからなる。脳のアミロイドプラークは、ＰＨＦｓとは超構造的に異なり、対をなしてねじれていない、４〜８ｎｍ幅のフィラメントである。プラーク核は、ペプチドの凝集体からなり、初期段階ではＡ４と呼ばれ、相対分子量（Ｍ）が約４０００である（マスターズ（Masters）ら、Proc Natl Acad Sci USA、1985、82：4245-4249）。
【０００４】
現在はアミロイドβペプチド（又はＡβ１−４２）と名前を変えた、Ａ４の一部のアミノ酸配列は、それがアルツハイマー病又はダウン症候群の患者の脳血管から単離されたアミロイドβタンパク質と類似することがわかった（グレンナー（Glenner）及びワン（Wong）、Biochem Biophys Res Comm, 1984; 120: 885-890; 122: 1131-1135）。
【０００５】
Ａβ１−４２は、多くの理由から、ＡＤと関連すると仮説されている。第一に、周辺アミロイド症、例えば原発性Ｌ鎖病又は続発性ＡＡアミロイド症において、大きなアミロイドの負担は、組織及び器官の機能不全に関連する。第二に、アミロイドプラーク密度は、ＡＤの生前痴呆スコア（premortem demetia score）に積極的に関連する。第三に、Ａβ１−４２沈着は、ＡＤ及びダウン症候群などの関連する疾患における神経病理学上の初期的なマーカーであり、それは、ＮＦＴ形成よりも２０〜３０年先んじることができる。第四に、β−アミロイド症は、ＡＤ及び関連する疾患に比較的に特異性である。第五に、Ａβ１−４２は、ニューロンにとって有毒である（ヤンクナー（Yankner）ら、Science, 1990; 250: 279-282）。最後に、構造的なアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子におけるミスセンス突然変異は、家族性ＡＤの初期兆候に生じる（ゲーテ（Goate）ら、Nature, 1991; 349: 704-706；ミュラン（Mullan）ら、Nature Genetics, 1992; 1: 345-347）。特に、そのような突然変異によって劇的なＡβ１−４２過生産が引き起こされる（シトロン（Citron）ら、Nature, 1992; 360: 672-674）。
【０００６】
1987年、カング（Kang）ら（Nature, 1987; 325: 733-737）及び他の３つのグループ（アンダートン（Anderton）の1987年状況報告、Nature, 1987; 325: 658-659及びバーンズ（Barnes）、Science, 1987; 235: 846-847）は、それぞれ独立に、Ａβ１−４２が由来する遺伝子をクローン化した。今やアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）として知られている、この遺伝子は、実質的にすべての組織で発現される、ＭＷ：約７９，０００の６９５個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードする。ＡＰＰのスプライシング可変体は少なくとも５種あり、そのうちの４種は、β−アミロイドペプチド配列を含んでいる。
【０００７】
４種の遺伝子は、ＡＤの家族性形態で、含まれている。この遺伝子の３種、βＡＰＰ、プレセニリン１（presenilin 1）及びプレセニリン２（presenilin 2）は、変異されると、ＡＤの常染色体の支配的な初期形態を生じる。第４種目の遺伝子、アポリポプロテインＥ（Apolipoprotein E）は、天然の多形態、ApoE4を有し、この疾患の進行を主な遺伝学的な危険因子を表す。いくつかの明白な遺伝子における変化によって、当初は４２残基、その後４０残基のペプチドが細胞毒プラークへと結果的に凝集すると共に、Ａβ１−４２産生とその浄化における慢性的なアンバランスをもたらすことができるという概念は、入手可能な証拠によって支持されている。この証拠は、これらの４種の遺伝子の各々における欠陥が、(1) Ａβ１−４２ペプチドの産生及び／又は沈着を増大させることにより、又は(2)組織からのApoE4の浄化を減少させることにより、ＡＤ表現型の素因をつくることをを強く支持している（セルコー（Selkoe）、J. Biol. Chem., 1996; 271: 18295-18298）。
【０００８】
入手データから、多分相互に関連づけられるある範囲のメカニズムにより、凝集するが単量体ではないＡβ１−４２ペプチドが細胞機能不全及びインビトロの細胞死を誘発できることがわかる。これらには、酸化損傷（トーマス（Thomas）ら、Nature, 1996; 380: 168-171；ベール（Behl）ら、Cell, 1994; 77: 817-827）、細胞内カルシウムホメオスタシスの変化（アリスペ（Arispe）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90: 567-571）、及び細胞骨格再構成（ブシグリオ（Busciglio）ら、Neuron, 1995; 14: 879-888）が含まれる。アミロイド誘発カスケードにおける主要な工程のいくつかを十分に知ることは、該カスケード仮説が熱く議論されていたとしても、生じてくる。
【０００９】
アミロイド誘発カスケードの一工程又はその他の工程を阻害することができる小分子を同定する医薬上のアプローチが順調に進行中である。特に興味深いことは、２つのアプローチである。ニューロン細胞又は神経膠細胞からのＡβ１−４２ペプチドの分泌を減少させることによりＡβ１−４２ペプチドの凝集を妨害する試み又はこれらの細胞外凝集体がニューロン細胞又は神経膠細胞及びその方法を産生する毒性を阻害する試みである。第三のアプローチは、凝集化Ａβ１−４２（微小神経膠刺激、古典的な補カスケードの活性、サイトカイン放出、及び反応性星状細胞を含む）によってトリガーされることがわかっている特別な炎症反応を制御する試みは、アルツハイマー患者にとって有益であるものと立証されるかもしれない。
【００１０】
ＡＤ介入の上述の医薬上のアプローチと異なり、免疫学的な介入も試みられている。ソロマン（Soloman）ら（Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Aca. Sci., 1997; 94: 4109-4112）は、ヒトＡβ１−４２ペプチドのＮ末端領域の部位に向けた、３種の特異的なモノクローナル抗体が、前もって形成されたフィブリルに異なる度合いで結合し、神経毒性効果の離解（disaggregation）及び阻害をもたらすことを示した。これらの抗体は、原繊維Ａβ１−４２の形成を防止することもわかった。ソロマンら（ＷＯ０１／１８１６９）は、Ａβ１−４２ペプチドのエピトープのファージディスプレイ（phage display）を調製し、ファージ表示エピトープ又は該エピトープを含有するペプチドをマウスに腹腔内投与し、抗体をＡβ１−４２ペプチドに導き出すことも試みた。ラットのフェノクロモサイトーマ(phenochromocytoma)でのインビトロ試験により、抗血清の１：５希釈物がＡβ１−４２ペプチドの神経毒性を予防することがわかった。１：５及び１：２０での希釈物の抗血清は、フィブリル形態の甚大な悪化と共に、Ａβのフィブリル構造をインビトロで粉砕することもわかった。しかしながら、第一の注入に用いたアジュバントは、フロイント完全アジュバントであり、第二の注入には、フロイント不完全アジュバントであった。用いたアジュバントは全て、ヒトに用いるには不適切である。また、これらの粗いアジュバントを用いたにも関わらず、生成した抗体のレベルは低いので有効ではない。
【００１１】
次に、シェンク（Schenk）ら（Nature, 1999; 400: 173-177）は、Ａβ１−４２ペプチドでの免疫化が、ＡＤのマウスモデルにおいて、アミロイドプラーク及び関連するジストロフィー神経突起の形成を阻害することを示した。しかしながら、Ａβ１−４２ペプチドの低免疫原性のため、使用した方法は、粗い病変形成アジュバントでの抗原の繰り返し投与を要し、プラーク形成に影響を及ぼすのに必要な抗Ａβ１−４２プラーク抗体を高レベルで得た。また、Ａβ１−４２ペプチドでの免疫化は、毒性のアミロイドそのもののさらなる蓄積を誘発するかもしれないことに留意すべきであった（アラウヨ（Araujo, DM）及びコットマン（Cotman, CW）、Brain Res., 1992: 569; 141-145）。
【００１２】
これらの批評にも関わらず、類似の活性免疫化によるトランスジェニックＡＤマウスモデルでのさらなる研究は、ＡＤの免疫予防学的アプローチ及び免疫療法的アプローチに信用を与えた。ジェーナス（Janus）ら（Nature, 2000; 408: 979-982）は、挙動障害及びプラークを減少させる、ＡＤのためのマウスモデルでのＡβ１−４２ペプチド免疫化を記述する。モルガン（Morgan）ら（Nature, 2000; 408: 982-985）は、マウスモデルにおける記憶欠失を予防するＡβ１−４２ペプチドワクチン化を記述する。
【００１３】
免疫治療の有効性を直接的に支持するものは、Ａβ−ペプチドに対する抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の周辺投与がアミロイドの負担を減少させる観察から由来する（ＷＯ９９／２７９４４；バード（Bard）ら、Nature Medicine, 2000; 6: 916-919）。比較的穏やかな血清レベルであるために、これらの受動的に投与された抗体、モノクローナル３Ｄ６（抗Ａβ１−５）及び１０Ｄ５（抗Ａβ１−１２）又はポリクローナル抗Ａβ１−４２、は、中枢神経系に入ることができた。そこで、抗体は、プラークに結合し、存在するアミロイドプラークの浄化を誘発した。バードらは、ＰＤＡＰＰマウス（即ち、血小板由来成長因子プロモータによって導かれるＡＰＰミニ遺伝子でトランスジェニックされたマウス）の脳断面又はＡＤ患者の脳組織で生体外（ex vivo）アッセイで検査したとき、Ａβ−ペプチドに対する抗体は、小膠細胞へトリガーを引き、Ｆｃ受容体仲介食菌作用及びそれに続くペプチド崩壊によりプラークを浄化させることを報告した。この研究は、受動的に投与された、Ａβ１−４２ペプチドに対する抗体及びＡβ１−４２Ｎ末端領域が、ＡＤのマウスモデルのプラーク沈着の程度を減少させること；及び部位配向性ワクチンによって導き出されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が治療学上関連性の高いレベルでＣＮＳへ入ることができることを例証した。
【００１４】
ＡＤのためのマウスモデルにおける免疫学上の仲介の見込みのある発見にも関わらず、ヒトに適切な対ＡＤワクチンは、遙か遠くに存在する（チャップマン（Chapman）、Nature, 2000; 408: 915-916）。主要なハードルは、ヒトに有用な免疫原性組成物を設計及び配合するのに必要な熱心な研究にあり、それによりはじめて、ＡＤへの実際的なワクチンを達成できる。ガイドとなる実験データに基づくいくつかの問題として次のものがある。(1)Ａβ内の抗体認識の特異的ターゲット部位はどれであるのか？。(2)免疫原はどんな形態で存在すべきであるのか？。(3)治療学的なレベルにある抗体を導き出す抗原を達成する前に、他のどんな部位を含む必要があるのか？。(4)ヒトへの臨床学上許容可能なアジュバントを用いる有効なワクチン配送システムは何であるのか？。
【００１５】
文献に開示されていることと為すべきとして存在していることとには大きなギャップがある。適切な特異的ターゲット部位（即ち、重合体化Ａβ１−４２プラーク又は単量体可溶性Ａβ１−４２ペプチド）は何なのか、及び特異的部位は、免疫学上の介入にはどのように機能させるべきであるのか。過去１０年間に亘ってＡβ１−４２に関する５，０００もの文献があるにも関わらず、アミロイドカスケード仮説は、熱く語られており、その問題：介入に用いられるべきＡβ１−４２の形態は、議論が続いている。テリー（Terry）及びその仲間によって議論されている、問題の心臓部は、原繊維アミロイド負荷と神経学的な機能不全の測定との間の弱い関連性である（『アルツハイマー病の神経病理学及びその変更の構造的基礎（The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basis of its Alterations）』、テリーら編、アルツハイマー病（Alzheimer Disease）、p.187-206、Lippincott Williams and Wilkins, 1999）。
【００１６】
ＡＤ患者において、アミロイド沈着物はしばしば、ニューロンの損傷部位から離れて形成される。病理学的痴呆との最も関連することは、シナプス末端の欠損である。しかしながら、シナプス末端の欠損は、アミロイド負荷とほとんど関連がない。病気の発現がアミロイド負荷と弱く関連しているならば、Ａβの役割は何であるのか？。クライン（Klein）らの文献、タイトル“Targeting small Ａβ１−４２ oligomers: the solution to an Alzheimer’s desease conumdrum?”（Trends in Neurosciences, 2001; 24: 219-224）は、フィブリルがＡβの毒性形態であるだけでなく、ＡＤに最も関連がある神経毒でも多分あることを示唆している。小オリゴマー及びプロトフィブリルは、Ａβ１−４２由来拡散性リガンドとも呼ばれ、神経学上、潜在的な毒性活性を有しているのかもしれない。
【００１７】
成功裡にある免疫学上の仲介としてのＡＤワクチンは、高い親和性を有する部位配向性抗体を導き出すように設計される免疫原を要する。この抗体は、脳組織の老人性プラークと結合し、神経膠細胞によりプラークの浄化を促進し、可溶性Ａβ由来毒を免疫中性化（immunoneutralize）する。
【００１８】
免疫原性に乏しい部位特異性（site-specific）ペプチドに対する部位配向性抗体の親和性を高く上げる問題は、１０年間知られている。免疫学者及びワクチン学者はしばしば、ＷＯ９９／２７９４４に例証される、古典的なハプテン［ペプチド］キャリアタンパク質共役物（conjugate）アプローチに頼る。ＡＤに対する部位配向性ワクチンの開発に関して、フレンケル（Frenkel）らは、上述したように”ＥＦＲＨ”ファージ投与によるＡβ１−４２プラークに対する免疫化を試みた（Proc. Natl. Acad. Sci., 2000; 97: 11455-11459、ＷＯ０１／１８１６９）。
【００１９】
Ａβ１−４２ペプチド凝集体又はＡβ１−４２ペプチドフラグメント−キャリアタンパク質共役物（ＷＯ９９／２７９４４）を用いるアプローチ、及び試薬として”ＥＦＲＨペプチド”を表示するフィラメントファージを用いて患者のアミロイド沈着に対する免疫応答を誘発するアプローチは、扱いにくく且つ効果的でない。例えば、ＥＦＲＨエピトープを表示する１０１１ファージの４回目の免疫化後、モルモット免疫血清中の抗体の＞９５％が該ファージに対抗する。抗体の少量のみ（＜５％）が、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対抗する（フレンケル（Frenkel）ら、Vaccine 2001, 19: 2615-2619、ＷＯ０１／１８１６９）。
【００２０】
より扱いにくくない方法は、ＥＰ５２６，５１１及びＷＯ９９／２７９４４に記載されている。これらは、既に確立されたＡＤの患者を処置するためにＡβ１−４２ペプチドを投与すること、及びＡＤ患者の“有効な”免疫応答を発生する条件下でＡβ１−４２又は他の免疫原を患者に投与することを開示する。しかしながら、ＷＯ９９／２７９４４を見ると、そこに開示されるワクチン設計には欠陥があることがわかる。
【００２１】
特に、医薬上許容可能な且つ有効なワクチン配送システムの欠如に問題がある。ＷＯ９９／２７９４４は、活性ワクチン成分として、Ａβ１−４２ペプチド又はコレラ毒のようなキャリア分子に共役するＡβ１−４２の活性フラグメントを開示する。ＷＯ ９９／２７９４４の４頁を参照のこと。免疫原を含有する医薬組成物は、フロイント完全アジュバント［ＣＦＡ］を含むべきではないことを第５頁は示唆しているが、トランスジェニックマウスのＡＤの処置のためのＡβ１−４２ワクチンの効験を示す実施例のみが、ＣＦＡ中に大量の凝集化Ａβ４２ペプチドを用いていた。免疫応答を向上させるのに開示される免疫原性試薬と共に用いられるべき好ましいアジュバントが反復的に詳説されているにも関わらず、ＣＦＡ／ＩＣＦＡを用いる配合物のみが抗体の十分な高力価をもたらすことを実験データは示していた。ＷＯ９９／２７９４４の２５頁を参照のこと。実施例１において、ＡＤに対するＡβ１−４２の予防効験がＰＤＡＰＰマウスにおいて例証されていた。しかしながら、投与された配合物は、マウス当たりフロイント完全アジュバント［ＣＦＡ］でエマルション化された凝集化Ａβ１−４２１００μｇの量（ＷＯ９９／２７９４４の３４頁）、次いで、フロイント不完全アジュバントでエマルション化した同一のＡβ１−４２ペプチドの多数の追加投与（booster）を含む。実施例ＩＸにおいて、異なるアジュバントに対するマウスでの免疫応答が研究された。潜在的な免疫原と称されるＡＮ１７９２（即ち凝集化ヒトＡβ４２）と共にアジュバント：ＭＰＬ、ミョウバン（Alum）、ＱＳ２１、及びＣＦＡ／ＩＣＦＡを用いたとき、Ａβ１−４に対する抗体のレベルは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡワクチンを受けたマウスと比較して統計学上著しく減少した。ＷＯ９９／２７９４４の表９及び５９〜６４頁を参照のこと。
【００２２】
Ａβ１−４２ペプチドフラグメントを用いた場合（アミノ酸１〜５、１〜１２、１３〜２８、及び３３〜４２のヒトＡβ１−４２ペプチド）、各フラグメントは、タンパク質キャリアとしてのヒツジ抗マウスＩｇＧと結合した。後述の文献において、Ａβペプチドフラグメントに対する抗体の効験は、モノクローナル抗体での受動的免疫化によってのみ示すことができた（バード（Bard）ら、Nature Medicine 2000; 6: 916-919）。ヒツジ抗マウスＩｇＧと結合した、これらのフラグメントの効験は、示されなかった。よって、有効であると示された唯一の免疫原は、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中の凝集化Ａβ１−４２ペプチドであった。
【００２３】
現在まで、有効であると示されたワクチン配合物はすべて、アジュバントとしてＣＦＡ／ＩＦＡを使用していた。よって、Ａβ１−４２をターゲットとするペプチド免疫原は、ヒツジ抗マウスイムノグロブリンへの様々なＡβ１−４２フラグメントの共役物、抗ＣＤ３抗体へのm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを介した合成Ａβ１３−２８の共役物、又は凝集化Ａβ１−４２ペプチドのみによって調製されている。これらの免疫原、即ちＡβ４２ペプチドそのもの又はＡβ１−４２ペプチド−キャリアタンパク質共役物は、第１の免疫化のために、フロイント完全アジュバントでエマルション化され、次いでフロイント不完全アジュバント中でさらに追加投与した（boost）（ジョンソン-ウッド（Johnson-Wood）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 1550-1555；ジェーナス（Janus）ら、Nature, 2000; 408: 979-982；モルガン（Morgan）ら、Nature, 2000; 408: 982-985）。ＷＯ９９／２７９４４又はＣＦＡ及びＩＣＦＡをアジュバントとして用いるその他の文献に開示される配合物は、障害を引き起こし、ヒトへの使用にはあまりに粗すぎる。したがって、ヒトへの使用に適切なＡＤ用ワクチン組成物は先行技術には開示されていない。
【００２４】
要約すると、クライン（ＥＰ５２６，５１１）の先の開示によると、ＡＤの処置のためのＡβ１−４２ペプチドの潜在能力を示唆する言及があるにも関わらず、ワクチン配合物を解決する課題は、このキーとなる課題を向けたものをＷＯ９９／２７９４４には実際には提供されていない。
【００２５】
ペプチド−キャリアタンパク質共役物及びＡβ１−４２凝集体での他の不利益は、これらの分子が非常に複雑であり且つ同定しにくいことであり、製造方法に関する有効な質的制御工程を開発するのが困難である。さらなる不利益は、Ａβ１−４２ペプチド又はそのフラグメントがヒトに投与されると、それらが自身の分子（self molecule）であることである。よって、ヒトにおいてより免疫原性であるか又はより非免疫原性である。したがって、ヒトに投与するための臨床上利用可能なワクチン配合物を開発することが必要である。
【００２６】
乱雑な（promiscuous）Ｔｈエピトープを用いて、有効なＴ細胞ヘルプを引き起こすことができ、免疫原性に乏しいＢ細胞エピトープと結合して潜在的な免疫原を提供することができる。よく設計された、乱雑なＴｈ／Ｂ細胞エピトープ・キメラペプチドは、Ｔｈ応答及び異なるＭＨＣハプロタイプを発現する遺伝学上異なる母集団の大抵の種において得られる抗体反応を導き出す際において有効であることが分かっている。はしかウイルスＦタンパク質及びＢ型ウイルス性肝炎表面抗原などの多くの病原体由来の乱雑なＴｈが知られている。表１及び表２は、短くて免疫原性の乏しいペプチド、デカペプチドホルモンＬＨＲＨ（ＵＳ５，７５９，５１１及び６，０２５，４６８）を強化するのに有効であることがわかっている既知の乱雑なＴｈの多くをリストアップする。
【００２７】
潜在的なＴｈエピトープは、その大きさが約１５〜４０長のアミノ酸残基の範囲にあり、共通の構造的特徴をしばしば共有し、且つ特異的な目印となる配列を含むことができる。例えば、Ｔｈの共通の特徴は、疎水性アミノ酸残基がらせんの一表面を支配し、荷電及び極性残基が周表面を支配する両親媒性らせん、αらせん構造を含むことにある（シーズ（Cease）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 4249-4253）。Ｔｈエピトープは、Ｇｌｙ又は荷電残基についで２つ又は３つの疎水性残基、さらに１つの荷電又は極性残基が続くような、さらなる第一のアミノ酸パターンを含むことがしばしばである。このパターンは、ロスバード（Rothbard）配列と呼ばれるものである。Ｔｈエピトープはしばしば、正荷電残基が荷電残基後の第４番目、第５番目及び第８番目の位置で疎水性残基に次いであるという、規則１、４、５及び８に従う。これらの構造は全て、共通の疎水性アミノ酸、荷電極性アミノ酸を有してなるので、各構造は単一のＴｈエピトープ内で同時に存在することができる（パーチドス（Partidos）ら、J. Gen. Virol., 1991; 72: 1293）。乱雑なＴ細胞エピトープの全てではないが、ほとんどが、上述の周期性の少なくとも１つにフィットする。これらの特徴は、組合せＴｈエピトープを含む、理想化人工Ｔｈ部位の設計に含むことができる。組合せＴｈ部位の設計に関して、可変可能な位置及び好ましいアミノ酸のリストがＭＨＣ結合モチーフに利用可能である（マイスター（Meister）ら、Vaccine, 1995; 13: 581-591）。なお、組合せＴｈの製造方法は、構造化合成抗原ライブラリーと呼ばれる組合せライブラリーペプチドに開示されている（ワン（Wang）ら、ＷＯ９５／１１９９８）。よって、規則１、４、５及び８は、組合せＴｈ部位における不変且つ縮退した位置を示し、かつ人工Ｔｈの免疫応答性の範囲を大きく広げる縮退部位のための残基を選択する既知の組合せＭＨＣ結合モチーフと共に、適用することができる。表２、ＷＯ９９／６６９５７、及びＷＯ９５／１１９９８を参照のこと。
【００２８】
ワン（Wang）ら（ＵＳ５，７５９，５５１）は、免疫刺激性要素を用いて自身タンパク質アミリン（Amylin）を免疫原性にすることを示唆した。ワンらは、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、アミリンの過産生により引き起こされるアミロイド原性疾患の処置用ワクチンとして免疫原性合成アミリンペプチドを投与することを示唆した（ＵＳ５，７５９，５５１の第19欄９〜39行）。アミリンは、ランゲルハンス島のβ細胞によって産生されるアミノ酸残基３７個のペプチドホルモンである。アミリンの過産生の結果、膵臓内のアミロイド原性疾患を導く不溶性アミロイドの沈着が生じる。アミリンの過産生と同様に、Ａβ１−４２ペプチドの過産生により、ＡＤ患者の脳内に不溶性アミロイドの沈着が導かれる。しかしながら、アミリンとＡβ１−４２ペプチドとでは、限定された配列相同関係しか存在しない。アミリン３２−３５のアミノ酸残基の短い伸縮、ＶＧＳＮだけが、Ａβ２４−２７に相当する。アミリンペプチドに対して産生される抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに交差反応性ではないと予想され、且つＥＦＲＨ配列が重要であることが示されているソロマン（Soloman）ら及びシェンク（Schenk）らによる研究によると、脳内のアミロイドプラークの浄化を促進しないと予想される。
【００２９】
ＡＤ患者の脳内の老人性プラークに対して高い交差反応性を有する、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端機能性部位に対して高い親和性の抗体を高レベルで生成することができる免疫原を開発することが本発明の目的である。Ａβ１−４２ペプチド及び老人性プラークに結合することによって生成する、この抗体は、これらのプラークを脳から浄化することを促進し、フィブリル離解を促進し、繊維原凝集を阻害し、かつ『可溶性Ａβ由来毒』［Ａβ由来拡散性リガンド又はＡＤＤＬｓとも言う］を免疫中性化することが予想される。
【００３０】
また、本発明の目的は、アルツハイマー病の予防及び処置のためのヒト用又は獣医学用に適切であるワクチン配送ビヒクルを開発することにある。
【発明の簡単な説明】
【００３１】
本発明は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳のプラークの双方に高い交差反応性を有する、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対する抗体を誘発できる合成ペプチドを含有する免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、それをＡＤ患者又はＡＤに感染しやすい者に投与すると、脳内のアミロイドプラークの浄化及び可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を促進しＡＤを予防且つ処置することが期待される。特に、本発明のペプチド免疫原は、Ａβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨ、配列番号６５、又はＡβ１−４２ペプチドフラグメントの免疫学上機能性類似体を含有する１０〜２８個のアミノ酸残基からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドの短いフラグメントに結合する配列番号１〜６４からなる群から選ばれるＴｈエピトープ及びそれらの免疫学上機能性類似体を含有する。好ましくは、Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、配列番号６６〜６９又はそれらの免疫学上機能性類似体からなる群から選ばれる。
【００３２】
また、本発明は、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０並びに他のアジュバント及び乳化剤からなる群から選ばれるアジュバント又は乳化剤を含有する医薬上許容可能なワクチン配合物中に免疫学上有効量のペプチド組成物を含有する免疫原性組成物を提供する。
【００３３】
また、本発明は、１種又はそれ以上の免疫原性ペプチドをホ乳類に、ある期間、Ａβ１−４２ペプチドの機能性／調節部位に対する抗体を誘発するのに十分な条件下で投与することにより、アミロイドプラークの浄化促進及び可溶性Ａβ由来毒の中性化を誘発しホ乳類のアルツハイマー病を予防及び処置する方法を提供する。本発明のワクチンの典型例は、医薬上許容可能なアジュバント及び／又はキャリア中の油中水滴型エマルションとして配合されるワクチン中に、ペプチド免疫原を５〜１０００μｇ含有するペプチド組成物である。ワクチンの典型的な投与法は、０、４週間、及び８週間のインターバルの免疫化スケジュールで、１回の投与当たり０．５〜２ｍＬでワクチン配合物を筋内注射するものである。
【００３４】
本発明のさらなる他の面は、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのアミノ酸残基１を含有する、１０〜２８個のアミノ酸からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントに結合するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープからなる約３０〜約６０個のアミノ酸の免疫原性合成ペプチドに関する。Ｄ、アスパラギン酸をアミノ酸残基１と称する、配列番号６５を参照のこと。好ましくは、Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、配列番号６６〜６９又はＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントのペプチド類似体からなる群から選ばれる。免疫原性領域を分離するアミノ酸スペーサを任意に含んでもよい。スペーサにより分離される免疫原性領域の要素は、ペプチドハプテンの免疫反応性が実質的に維持されるか又はＮ末端Ａβペプチドフラグメント、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びプラークへの免疫反応性が発生することを条件として、いかなる順序でも共有結合することができる。
【００３５】
Ｎ末端Ａβ１−４２フラグメント免疫原への合成ペプチドの免疫原性に影響を与える重要な因子は、Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈ）による免疫系への存在である。このようなＴｈは、ターゲットとなるＡβペプチドにとって外来性である離間したＴｈペプチド領域要素上に配置される外来Ｔｈエピトープによるペプチド免疫原へ供給されるのが最も確かである。そのようなペプチド免疫原は、組替えＤＮＡ発現によるハイブリッドポリペプチドとして産生することができる。これらは、ホストに適切な、ＡβペプチドからのターゲットハプテンＢ細胞部位及びＴヘルパーエピトープ（Ｔｈ）を含有する合成ペプチド免疫原として、より簡易により安価に供給される。このようなペプチドは、抗体結合部位に加えて、ヘルパーＴ細胞受容体及びＩＩクラスＭＨＣ分子と反応し（バビット（Babbitt）ら、Nature, 1985; 317: 359）、それによりターゲット抗体結合部位に対する強い部位特異的な抗体反応を刺激する。以前より、このようなＴｈは、凝集化全長Ａβペプチドに内因性Ｔｈによる作業可能なＡβ１−４２ペプチド免疫原のために供給され（ＷＯ９９／６６９５７；ＷＯ９９／２７９４４；ジェーナス（Janus）ら、2000、モルガン（Morgan）ら、2000）、キャリアタンパク質によって供給することができる。全て合成のペプチド免疫原は、生成物が簡単な質量制御により化学的に定義することができるという利点、Ａβ１−４２ペプチド凝集体、キャリア共役物及び組替ポリペプチドを超えた利点を享受する。この合成ペプチド免疫原は安定である。手の込んだ下流プロセシング又は手の込んだ作製の器用さは不要である。したがって、エピトープ抑制などの不所望な応答は避けられる。
【００３６】
合成Ｎ末端機能性部位配向性Ａβペプチド免疫原の免疫原性は、（１）Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントを選択した外来性の乱雑なＴｈ部位であって、母集団の多くはそれに反応性であるＴｈ部位と組合わせること；及び（２）Ａβペプチドフラグメントをそのレパートリーを組合わせ化学により広げたＴｈと組合わせること、により最適化し、それにより、遺伝学上異なる母集団の可変性の免疫反応に適応させることができる。
【００３７】
本発明のペプチド組成物は、可溶性Ａβ１−４２及びＡＤ患者の脳内のプラークと交差反応性を有する、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対する抗体の産生を刺激することにおいて有効であることがわかる。モルモット及びヒヒで得られた免疫原性データ、及び得られた特異的な免疫血清による、ヒトＡＤ脳断面内に存在するアミロイドプラークの免疫ペルオキシダーゼ染色から得られたデータに基づいて、適切に配合された本発明のペプチド免疫原がヒトに有効であることが期待される。ヒヒは、その免疫応答がヒトのそれに非常に似ている種であることにおいて、ヒヒで得られたデータが特に重要であることに注意すべきである。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
本発明は、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対して特異性を有し、可溶性Ａβ１−４２及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳内のプラークと交差反応性を有する、高力価ポリクローナル抗体の生成のための新規なペプチド組成物に関する。ペプチド組成物によって生成した抗体は、非常に部位特異的（site-specific）であり、Ａβ１−４２と結合し且つ脳内のアミロイドプラークと結合する。よって、本発明は、ＡＤの予防及び処置のための、アミロイドプラークの浄化及び脳内の可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を促進する有効な方法を提供する。
【００３９】
１０〜２８個のアミノ酸からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントであって各フラグメントがＡβ１−４２ペプチド（配列番号６５）のＥＦＲＨを有するＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、それ自身によっては非免疫原性である、短い直鎖ペプチドである。この短いＡβ１−４２ペプチドフラグメントは、キャリアタンパク質、例えば、キーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）（ＫＬＨ）と化学結合させることにより、又は組替えＤＮＡ発現、例えばＢ型肝炎表面抗原によるキャリアポリペプチドへの融合化により、免疫潜在化（immunopotentiate）させることができる。このような『Ａβペプチド−キャリアタンパク質』ワクチンの欠陥は、生成される抗体の主要部がキャリアタンパク質に対して非機能性抗体であることである。
【００４０】
本発明の免疫原は、１０〜２８個のアミノ酸から成るＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを含有する、全て合成のペプチド免疫原である。該フラグメントは各々、配列番号１〜６４からなる群から選ばれる乱雑なＴｈエピトープと結合する、Ａβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨを含有する。本発明の免疫原は、Ａβ１−４２ペプチド及びその凝集体と結合し且つ脳内のアミロイドプラークと交差反応性を有する部位特異的な抗体の産生を導き出し、アミロイドプラークの浄化促進及び脳内の可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を提供する。したがって、本発明の免疫原は、ＡＤの予防及び処置に有効である。
【００４１】
本発明に有用なヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）は、多種のＩＩクラスＭＨＣ結合モチーフを含有する。Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントと共有結合するＴｈの特別な例を提供する。本発明の免疫原ペプチドで免疫化した動物からの抗血清の結果から、潜在的な部位配向性Ａβペプチド反応性抗体が、遺伝学上異なる母集団で生成されることが例証される。
【００４２】
一般に、本発明の合成免疫原性ペプチドは、約２０〜１００のアミノ酸長であり、(i)配列番号１〜６４からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ；及び(ii)各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨを有する、約１０〜２８のアミノ酸残基のＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを含有し、(iii)免疫原性領域を分離する少なくとも１つのアミノ酸からなるスペーサを任意に含有する。
【００４３】
好ましくは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントは、配列番号６６〜６９及び免疫学上有効なそれらの類似体からなる群から選ばれる。Ｔｈペプチドは、任意にスペーサを有してもよい、Ａβ１−４２ペプチドのターゲットＮ末端フラグメントのＮ末端又はＣ末端のいずれかに共有結合する（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｎ Ｌｙｓ）。本発明のペプチド免疫原は、次の式のひとつにより表される。
（Ａ）ｎ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ；又は（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｂｏ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｘ。
式中、各Ａは独立にアミノ酸であり；
各Ｂはアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる結合基であり；
各Ｔｈは、ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列、又はそれらの免疫向上（immune enhancing）類似体又はセグメントを有し；
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、合成ペプチドＢ細胞ターゲット部位抗原であり、約１０から約２８個のアミノ酸残基であり、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨ又はその免疫学上機能性類似体を有し；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨ又はα―ＣＯＮＨ２であり；
ｎは０〜約１０であり、ｍは１〜約４であり、ｏは０〜約１０である。
【００４４】
本発明のペプチド免疫原は、アミノ酸残基を約２０〜約１００、好ましくは約２５〜約６０有する。（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、配列番号６６〜６９からなる群から選ばれるのが好ましく、Ｔｈエピトープは、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、２０、３８〜４０、４７〜５１及び５２〜５４からなる群から選ばれるのが好ましい。ｍ＝１、ｎ＝１、及びＯ＝１又は２であるのが好ましい。
【００４５】
Ａがアミノ酸であるとき、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸として、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン及びシトルリンなどが挙げられるが、これに限定されない。天然のアミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。ｍが１より大であるとき、２つ又はそれ以上のＡがアミノ酸であり、各々のアミノ酸は、独立に、同じであっても異なってもよい。（Ａ）ｎは、スペーサ、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｎ Ｌｙｓを含んでもよい。
【００４６】
Ｂはスペーサであり、上述のように、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよいアミノ酸である。各々のＢは、独立に、同じであっても異なってもよい。Ｂのアミノ酸は、乱雑なＴｈエピトープとＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント（例えば配列番号６６〜６９）又はその免疫学的機能性類似体との間のスペーサ、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｌｙｓ又はリジンを提供することもできる。また、Ｂ細胞エピトープ、即ちＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体からＴｈエピトープを物理的に離間させることにより、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ又はε−Ｌｙｓスペーサは、ＴｈエピトープをＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体に結合することにより生成される人為的な２次構造を中断し、それによりＴｈ及び／又はＢ細胞応答間の相互作用を排除することができる。Ｂのアミノ酸は、ＴｈとＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントの離間を増大させる可撓性ヒンジとして作用するスペーサを形成することもできる。可撓性ヒンジをコードする配列の例は、イムノグロブリン重鎖ヒンジ領域にある。可撓性ヒンジ配列はしばしば、プロリンリッチである。ある特定の有用な可撓性ヒンジは、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７７）によって提供される。ここで、Ｘａａは、あるアミノ酸であり、好ましくはアスパラギン酸であるのがよい。Ｂのアミノ酸によってもたらされる構造的な離間により、ペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞とのより効率的な相互作用が可能となり、Ｔｈエピトープ及び抗体導出エピトープ又はそれらの免疫学的機能性類似体への免疫応答を高めることができる。
【００４７】
Ｔｈは、Ｔｈエピトープを有するアミノ酸（天然又は非天然アミノ酸）の配列である。Ｔｈエピトープは、連続エピトープであっても不連続エピトープであってもよい。不連続エピトープにおいて、Ｔｈのアミノ酸のすべてが必要なわけではない。Ｔｈエピトープ又はその類似体もしくはそのフラグメントは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに対する免疫応答を増大するか又は刺激することができる。免疫支配的であり且つ乱雑なＴｈエピトープは、広く縮退するＭＨＣタイプを有する動物及びヒトの種（population）にわたって広く反応性であり且つ高反応性である（パーチドスら（Partidos）、1991; US 5,759,551）。問題となるペプチドのＴｈエピトープは、約１０〜約５０のアミノ酸、好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸である。多くのＴｈエピトープが存在するとき（即ち、ｍ≧２）、各Ｔｈエピトープは、同じであっても異なってもよい。Ｔｈセグメントは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに対する免疫応答を増大するか又は刺激するのに十分なＴｈエピトープの隣接する（contiguous）部分を有する。
【００４８】
本発明のＴｈエピトープには、表１（配列番号１〜２１）に例示するものを含むが、これらに限定されない外来病原体由来のものが含まれる。また、Ｔｈエピトープとして、ＷＯ９９／６６９５７に開示され且つ配列番号２２〜６４として本願の表２にリストアップした理想化人工Ｔｈ及び人工理想化組合せＴｈが含まれる。組合せＴｈを有するペプチドは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント、Ａ及びＢ、と共に、単一の固相ペプチド合成で同時に産生される。Ｔｈエピトープは、Ｔｈ刺激機能が本質的に修飾されない限り、１〜１０のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を有する、その免疫学的機能性類似体も含む。
【００４９】
本発明の合成ペプチドにおいて、Ｔｈエピトープは、スペーサＢを介して、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体のＮ末端又はＣ末端のいずれかと共有結合する。Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントの免疫学的機能性類似体は、Ａβ１−４２ペプチドとの交差反応である免疫応答が導き出される限り、１〜約４個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含むことができる。保存的置換、付加、及び挿入は、上述した天然又は非天然アミノ酸で達成することができる。
【００５０】
本発明の好ましいペプチド免疫原は、配列番号６６〜６９又はその免疫学的機能性類似体；スペーサ（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｌｙｓ）；ＨＢｓ Ｔｈ（配列番号１）；ＨＢｃ Ｔｈ（配列番号２０）；ＭＶＦ Ｔｈ（配列番号８，９）；ＰＴ Ｔｈ（配列番号４，５，７）；ＴＴ Ｔｈ（配列番号３，４，６）；ＣＴ Ｔｈ（配列番号１２，２１）；ＤＴ Ｔｈ（配列番号１３，１４）；配列番号３８〜４０、４７〜５１からなる群から選ばれる、ＭＶＦ Ｔｈ由来人工Ｔｈ；配列番号５２〜５４からなる群から選ばれる、ＨＢＶ Ｔｈ由来人工Ｔｈ；からなる群から選ばれるＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを有するものである。表１及び２を参照のこと。
【００５１】
２つ又はそれ以上のＴｈエピトープとの本題のペプチド免疫原のカクテルを含むペプチド組成物は、広い種（population）において免疫効験（immunoefficacy）を増大させることができ、これによりＡβ１−４２ペプチド及びそのフラグメントへの免疫応答をもたらすことができる。
【００５２】
本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学合成法により製造することができる。例えば、フィールズ（Fields）ら、合成ペプチド：ユーザーズガイド（Synthetic Peptides: A User’s Guide）の第３章（Grant, W. H. Freeman & Co.編、New York, NY, 1992, p. 77）を参照のこと。したがって、ペプチドは、例えば、アプライド・バイオシステム・ペプチド合成器 モデル４３０Ａ又は４３１上で、側鎖を保護したアミノ酸を用いるｔ−Ｂｏｃ又はＦ−ｍｏｃ化学によりα−ＮＨ２保護化固相合成の自動メリーフィールド法を用いて合成することができる。Ｔｈエピトープのための組合せライブラリーペプチドを有するペプチド構築物の調製は、ある変化させる位置で、カップリングのための代替アミノ酸の混合物を提供することにより達成することができる。所望のペプチド免疫原の集合体の完成後、レジンを標準手続きにしたがって処理し、レジンからペプチドを切断し、アミノ酸側鎖の機能性基を脱保護する。フリーのペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、生化学的、例えばアミノ酸分析又は配列決定によって同定される。ペプチドの精製法及び同定法は、当業者によく知られている。
【００５３】
本発明の免疫原も、分岐鎖ポリ−リシル核レジンに直接所望のペプチド構築物を合成することにより、分岐鎖ポリマーとして調製することができる（ワン（Wang）ら、Science, 1991; 254: 285-288）。
【００５４】
また、長鎖の合成ペプチド免疫原は、既知の組替えＤＮＡ技術により合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコールと共に既知の標準マニュアルに提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードする核酸配列、好ましくは遺伝子が発現される有機体に最適であるコドンと共に該核酸配列を得る。次いで、典型的には、ペプチド、及び、必要ならば制限要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子を産生する。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、ホスト細胞にトランスフェクトする。その後、選択された発現系及びホストにふさわしい適切な条件下で、ペプチドを発現する。ペプチドは、標準の方法により精製及び同定される。
【００５５】
本発明のペプチド組成物の効験は、本発明のペプチドを含有する免疫原組成物を動物、例えばモルモットに注入することによって確認することができる。表４、配列番号７０〜７５を参照のこと。Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント及び可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対する体液免疫応答をモニターする。用いた作業の詳細は、後述の実施例に提供する。
【００５６】
本発明の他の面は、医薬上許容可能な配送系で、１種又はそれ以上の本発明のペプチド免疫原を免疫学上有効量で含有するペプチド組成物を提供する。したがって、対象となるペプチド組成物は、ワクチンの処方に通常用いられる、医薬上許容可能なアジュバント、キャリヤ又は他の成分を用いるワクチンとして配合することができる。本発明において用いることができる成分として、ミョウバン（alum）、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０並びに他の有効なアジュバント及び乳化剤がある。組成物は、速放性（immediate release）又は徐放性（sustained release）のいずれに対しても配合することができる。組成物は、全身性免疫の誘導のため、例えば、微粒子での捕捉（entrapment）又は共投与によって、配合することもできる。そのような配合物は、当業者にとって簡単に利用可能である。
【００５７】
本発明の免疫原は、皮下、経口、筋内、非経口又は腸内経路などの従来の経路のいかなるものによっても投与することができる。免疫原は、単一の投与量であっても多投与量であっても投与することができる。好適な免疫スケジュールは、当業者にとって即座に決定でき、利用可能である。
【００５８】
本発明のペプチド組成物は、１種又はそれ以上の本発明のペプチド免疫原を有効量、及び医薬上利用可能なキャリアを有する。好適な投与単位形態内のこのような組成物は一般に、体重１ｋｇ当たり免疫原を約０．２５μｇ〜約５００μｇ含む。多投与量で配送されるとき、有効量は、投与単位で分けるのが都合よい。例えば、ペプチド免疫原を体重１ｋｇ当たりのペプチド免疫原の初期投与量を例えば０．００２５〜０．５ｍｇ；好ましくは１〜５０μｇで、注射、好ましくは筋内注射で、投与され、同投与量を追加投与すべきである（booster）。投与量は、ワクチン及び治療術において知られているように、患者の年齢、体重及び一般的な健康状態に依存する。
【００５９】
合成Ａβ１−４２ペプチド免疫原の免疫応答は、オヘイガン（O’Hagan）ら（Vaccine, 1991; 9: 768-771）に記載される、あるタイプの生分解性微粒子内又はその上での捕捉を介する配送により証明することができる。免疫原は、生分解性微粒子内のアジュバントと共に又はそれなしでカプセル化することができ、免疫応答を潜在化させ、持続性応答又は周期的な応答のための、及び経口投与のための、時間制御した放出を提供することができる。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。本発明の範囲は、提供される特定のペプチド免疫原及び組成物に限定されない。実施例は、本発明のペプチド免疫原が、Ａβ１−１０フラグメント及びＡβ１−４２フラグメントの双方に対する部位配向性抗体、並びに初期免疫化から４週間と同じほど早くに可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対する交差反応性抗体を導き出すのに有用であることを例証する。
【実施例１】
【００６１】
本発明のＡβペプチド免疫原を合成する典型的な方法
表４（配列番号７０〜７６）にリストアップしたペプチド免疫原を、Ｆｍｏｃ化学物質を用いる、アプライド・バイオシステム・自動ペプチドシンセサイザー（モデル４３０、４３１及び４３３Ａ）によるメリーフィールド固相合成技術により個々に合成した。組合せライブラリーＴｈ、即ちＭｖＦ由来Ｔｈ１−８（配列番号３８〜４０）などの理想化人工Ｔｈ部位を有するペプチド免疫原の調製は、設計において特定したある位置で化学結合させるための所望のアミノ酸の混合物を提供することにより、達成できる。所望のペプチドの集合体の完成後、トリフルオロ酢酸を用いる標準的な方法によりレジンを処理し、レジンからペプチドを切り出し、アミノ酸の側鎖の保護基を脱保護する。切り出され、抽出され、洗浄されたペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、質量分析器及び逆相ＨＰＬＣにより同定された。
【実施例２】
【００６２】
本発明のＡβペプチド免疫原の免疫原性の評価
Ａβ由来ペプチド免疫原を、以下に概説する免疫化プロトコール実験及び免疫原性の測定のための血清学アッセイによって特定されるモルモットのグループに基づいて評価した。
標準実験設計：
免疫原：（１）個々のペプチド免疫原；又は
（２）各実施例で特定されるペプチド免疫原の等モル量の混合物。
投与量：特記しない限り免疫化にあたり０．５ｍＬ中に１００μｇ。
経路：特記しない限り、筋内。
アジュバント：特記しない限り、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）／フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；又は油中水滴型エマルション。ＣＦＡ／ＩＦＡ群は、０週目にＣＦＡ、次週にＩＦＡを受けた。
投与スケジュール：０週、３週間、６週間、または特記する。
採血スケジュール：０週、５週間、８週間、または特記する。
種：ダンカン−ハートリー（Duncan-Hartley）・モルモット、又は特記する。
アッセイ：各免疫血清の抗ペプチド活性に対して特定のＥＬＩＳＡ。固相基質はＡβペプチドフラグメント、例えばＡβ１−１４又は完全長Ａβ１−４２（配列番号６７及び６５）であった。血液を収集し、血清に処理し、ターゲットペプチドでのＥＬＩＳＡ前に貯蔵した。
【００６３】
Ａβペプチド及び可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対して導き出された抗体の免疫活性を、イムノソルベントとしてＡβ１−４２ペプチドフラグメント、配列番号６７又は６５でコーティングした、９６ウエル平板マイクロタイタプレートを用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）で求めた。濃度５μｇ／ｍＬのペプチド免疫原溶液の少量（１００μＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。３％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で３７℃で１時間行う他のインキュベーションにより、プレートをブロック化した。その後、このブロック化プレートを乾燥し、アッセイに用いた。検査用免疫血清の少量（１００μＬ）を、まずは試料用希釈バッファで１：１００に希釈し、その後順次１０倍に希釈して、ペプチドでコーティングしたプレートに添加した。このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００６４】
このプレートを、０．０５％ＰＢＳ／ツゥイーン（Tween（商標））バッファで６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ・ラベル化ヒツジ抗種の特異性抗体１００μＬを適当な希釈度で、共役希釈バッファ（０．５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸バッファ、及び正常ヒツジ血清）内に添加した。このプレートを、上述の洗浄前に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、o-フェニレンジアミン基質溶液を少量（１００μＬ）添加した。５〜１５分間、発色させ、その後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ添加して、酵素色反応を停止させた。各ウエルの内容物のＡ４９２ｎｍをプレートリーダーで読み込ませた。カットオフＡ４９２ｎｍを０．５に設定して、吸光度の線形回帰分析に基づいてＥＬＩＳＡ力価を計算した。選択したカットオフ値は、希釈化ノーマルコントロール試料が０．１５未満である値に対して厳密であった。
【実施例３】
【００６５】
部位配向性Ａβペプチド系合成ワクチンの最適設計のためのＡβ１−４２及びそのＮ末端フラグメントの相対免疫原性の同定
Ａβペプチドに対して高い親和性を有し且つ可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びＡＤ患者の脳内のプラークに高い交差反応性を有する抗体を高レベルで生成する全体的な合成ワクチンを設計するために、Ａβ１−４２及びそのＮ末端フラグメントの相対免疫原性をまず最初に同定した。Ａβ１−４２ペプチド内の種々の領域の相対免疫原性特性を測定するために、ヒト用に適した緩和アジュバント、ミョウバン（Alum）を初期の研究に用いた。Ａβ１−４２ペプチド及びそのＮ末端フラグメント、Ａβ１−２８の相対免疫原性を比較した。免疫原性の評価は、実施例２に記載した手順にしたがって行った。意外にも、Ａβ１−２８は、Ａβ１−４２ペプチドよりもより免疫原性であることがわかり、Ｃ末端Ａβ２９−４２内に免疫抑制があることを示唆している（表５）。
【００６６】
次に、Ａβ１−２８の免疫原性を、Ａβ１−４２のより短鎖のＮ末端フラグメントであるＡβ１−１４と比較した。ワクチンを配合する油中水滴型エマルションの調製に、ヒト用に適する、より潜在的なアジュバントを用いた。表６に示すように、得られたデータに基づいて、３つのＡβペプチド（即ち、Ａβ１−１４、Ａβ１−２８及びＡβ１−４２）の相対免疫原性は、Ａβ１−２８＞Ａβ１−４２＞Ａβ１−１４とランク付けされた。驚くことに、Ａβ１−４２からＣ末端側の１４量体が欠損することは、免疫原性を減少させるよりもむしろ、向上させた。Ａβに対する抗体応答は、ＥＬＩＳＡデータ（表６）が示すように、Ｎ末端領域、特にＡβ１−１４ Ｎ末端フラグメントに主に向けられている。しかしながら、Ａβ１−２８フラグメントのＣ末端をさらに短くしてＡβ１−１４フラグメントを形成すると、免疫原性が落ちる結果となった。
【００６７】
この短鎖Ａβ１−１４フラグメントは、ソロモン（Solomon）らによって報告されるように、Ａβ１−４２ペプチドの位置３〜６に位置する、主要な機能性／制限部位、ＥＦＲＨを含む。このエピトープを抗体によってブロック化することにより、凝集体の動向（dynamics）及び既に形成された凝集体の再溶解が調節される（ソロマン（Soloman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Acad. Sci., 1997; 94: 4109-4112）。抗Ａβ１−２８及びＡβ１−４２抗体の多くは、このエピトープを含むＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに向けられている（表６）。しかしながら、Ａβ１−１４フラグメントはそれ自身、免疫原性が低い。この実験結果から、Ａβ１５−２８セグメント内の内因性Ｔｈエピトープの存在が示唆される。この内因性Ｔｈエピトープにより、モルモットでのＡβ１−２８及びＡβ１−４２ペプチドの控えめな免疫原性が説明される。
【００６８】
Ａβ１５−２８フラグメントにＴｈエピトープが存在することは望ましい。しかしながら、限定されたヒトＭＨＣ分子、適切な投与量及びヒト用に許されるアジュバントのタイプの制限に直面したとき、成功を収めるヒトワクチンのためのより潜在的な免疫原を設計できることが望ましい。したがって、我々は、ＨＢＶ Ｔｈ（配列番号１）由来のＴｈなどの外来又は外因性ＴｈをＡβ１−２８ペプチド（配列番号６６）のＣ末端に結合することを試みた。表６に示すように、外因性Ｔｈエピトープにより、Ａβ１−２８フラグメントの免疫原性が著しく向上した。Ａβ１−２８フラグメントで工学設計した免疫原への抗体応答は、ペプチド免疫原（配列番号７０）の機能性Ｎ末端に向けたままであった。このことは、この構築物が、Ａβ１−２８フラグメント又はＡβ１−２８フラグメントのみよりも、よりよい免疫原であることを示す。このペプチド免疫原（配列番号７０）は、次の式を有するペプチド免疫原である。
（Ａ）ｎ（ＡβペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ。
ここで、ＡはαＮＨ２であり、Ａβ１−２８はＡβ１−４２のＮ末端フラグメントであり；Ｂはグリシンであり；Ｔｈは外来病原体、ＨＢｓＡｇ Ｔｈ（配列番号１）由来のヘルパーＴ細胞エピトープであり、ｎは１であり、ｍは１であり、かつｏは２である。
【実施例４】
【００６９】
ＡＤ用Ａβ系合成ワクチン開発のためのＡβの最低限のＮ末端フラグメント
ＥＦＲＨ残基を有する主要な機能性／調節部位はＡβ１−４２ペプチドの位置３〜６に位置する（ソロマン（Soloman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Acad. Sci., 1997; 94: 4109-4112）ので、本発明の合成免疫原へと含めるためのＡβの最適なＢ細胞ターゲット部位として、Ａβ１−４２ペプチドの最短のＮ末端フラグメントを探索することは有用である。
【００７０】
Ａβの短鎖非免疫原性Ｎ末端フラグメントのいくつか、即ちＡβ１−２８と共にＡβ１−１０、Ａβ１−１２、Ａβ１−１４、の各々を、代表的な理想化人工Ｔｈ（配列番号５１）として設計された免疫原に含めた。結合は、εＮ−Ｌｙｓスペーサを介した。短鎖Ａβフラグメントは低免疫原性であると予想されたので、工学設計構築物を強アジュバントと共に配合した。３つの合成構築物を、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント中に配合し、実施例２に記載する手順に基づいてその免疫原性を検査した。表７に示すように、４つのペプチド免疫原はすべて、Ｌｏｇ１０ＥＬＩＳＡ力価が４．３〜５．６（即ち１０４．３〜１０５．６）の範囲であり且つ初期免疫化後４週間しか経っていないのに完全長Ａβ１−４２ペプチドに対して高交差反応性である高免疫原性であった。より重要なことは、各々が理想化人工Ｔｈ（配列番号５１）と結合したＡβ１−１０、Ａβ１−１２及びＡβ１−１４と同じほど短いフラグメントは、開示する人工Ｔｈエピトープ（表７）との結合後、免疫原性が高いことがわかった。これらのペプチド免疫原は、次の式にしたがって設計されていた。
（Ａ）ｎ−（ＡβペプチドのＮ末端フラグメント）−（Ｂ）ｏ−（Ｔｈ）ｍ。
ここで、ＡはαＮＨ２であり、Ｎ末端フラグメントはＡβ１−１０、Ａβ１−１２、Ａβ１−１４又はＡβ１−２８であり；Ｂは、イプシロンアミノ基を介して次のアミノ酸と結合するスペーサであるεＮリジンであり；Ｔｈは理想化人工Ｔｈ、ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）由来のヘルパーＴ細胞エピトープであり、ｎは１であり、ｍは１であり、かつｏは１である。
【００７１】
ＡβのＮ末端フラグメントの長さを１０量体未満までさらに短くすると、より限定された免疫原性、即ち不所望な免疫原性が得られる結果となることがわかった。１０アミノ酸より短いペプチドは、ＩＩ属ＭＨＣ分子による受容体認識には問題があるようである（免疫学（Immunology）、第５版、ロイト（Roitt）ら編、Mosby International Ltd., London, pp88-89）。
【００７２】
Ａβの本研究に基づき、Ａβ１−４２由来の有用なＢ細胞部位は、その大きさが約１０〜約２８の残基の範囲であるべきである。
【実施例５】
【００７３】
人工Ｔｈエピトープに結合した合成ペプチド免疫原によってターゲットとされる部位配向性免疫反応性
ＡβペプチドのＡβ１−１４などの非免疫原性Ｎ末端フラグメントを、εＮリジンスペーサを介してＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）と名付けた人工Ｔｈペプチドに結合するか、又は標準の化学カップリング手順を介して従来のキャリアタンパク質ＫＬＨに結合した。２つの免疫原性構築物を、実施例２に記載する手順にしたがって、モルモットにおいて、Ａβペプチドに対する相対的『部位配向性』免疫原性、及び各キャリア、即ち人工Ｔｈエピトープ又はＫＬＨキャリアタンパク質、に対する抗体の得られた各反応性に関して評価した。コントロール免疫原として短鎖Ａβ１−１４ペプチドのみ、及び２つの免疫原性構築物を、アジュバントＩＳＡ５１を含む油中水滴型エマルションに配合した。なお、この配合はヒト用に適する。表８に示すように、Ｎ末端Ａβ１−１４フラグメントは、予想通り、それ自身、非免疫原性であった。Ａβ１−１４フラグメント及び人工Ｔｈを含む合成免疫原（配列番号７３）は、Ａβ１−１４に対する部位配向性抗体を導き出す高免疫原性であることがわかった。この抗体は、初期免疫化後４週間と同じ時期に、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対して高交差反応性（初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ４．０９４及び４．１２６）であることがわかった。これらのＡβ反応性が高力価である免疫血清を、ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）でコーティングしたプレート上でＥＬＩＳＡにより検査すると、これらはネガティブ（初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ０．０３８及び０．０６４）であることがわかった。これは、関連しない抗体が産生されていないことを示す。表８に示すように、得られたデータから、本発明のペプチド免疫原の部位配向特性に関する高い特異性が例証された。
【００７４】
キャリアタンパク質ＫＬＨを有する免疫原は、従来のペプチド−キャリア共役物と高い免疫活性（例えば初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ４．９０３及び５．０１８）を有することがわかった。しかしながら、導き出された抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチドとの交差反応性は控えめでしかない（例えば初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ３．３４２及び２．７３６）ことがわかった。これは、配列番号７３よりも約１０倍〜１００倍低い。意外にも、本発明のペプチド免疫原は、部位配向性が高く、注目された。関連しないキャリア部位に向けたものよりもむしろ、ＡβペプチドのＮ末端フラグメント上での抗凝集及び離解（disaggregation）に向けた機能的に重要な抗体が生成された。
【実施例６】
【００７５】
老人性プラークへの交差反応性によるＡβペプチド免疫原の評価
モルモット及びヒヒでＡβペプチド免疫原に対して発生した免疫血清の、ポリマー状老人性プラークへの交差反応性に関する評価のために、プラーク及びもつれ及びアミロイドプラークを含むチロフラビンＳ陽性血管（ＴＳＢＶ）のＡＤ患者の脳を用いた。プラーク及びＴＳＢＶ反応性を、アビジン−ビオチン化抗体複合体（ＡＢＣ）法を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色法、又は特異性抗ＩｇＧ種のローダミン接合化Ｆａｂフラグメントを用いる免疫フルオレセンス染色法により検出した。モルモットの血清はすべて、力価の最終点をいくつかの試料で決定して、１：１００の希釈度で検査した。ヒヒの血清はすべて、１：５０の希釈度で検査した。免疫血清及び予備免疫血清の評価は、記載されるガスキン博士（ガスキン（Gaskin）ら、J. Exp. Med. 165: 245, 1987）のコードの下、行った。
【００７６】
図１において、２人のＡＤ患者からの脳の連続断面図を、まず１０倍の倍率で検査した。断面図（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はＡＤ脳１からであり、断面図（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）はＡＤ脳２からである。初期免疫化後６週目で収集したモルモットからの予備免疫血清及び免疫血清を、プラーク及び神経フィラメントもつれが多いＡＤ側頭皮質からのクリオスタット（cryostat）断面で免疫ペルオキシダーゼ染色法により検査した。図１ａ及び１ｂのスライドで示す最初の研究に用いた免疫血清は、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭｖＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化した動物から得た。これらの結果から、チロフラビンＳ陽性血管（ＴＳＢＶ）の老人性プラーク及びアミロイドプラークの双方に著しく結合することがわかる。ＣＦＡ／ＩＣＦＡで調製した当量の免疫原に対して生じる免疫血清の交差反応性は、図１ｂ及び１ｄのスライドで示される。意外にも、ＩＳＡ５１で配合したワクチンで得た結果と比較して、血管（ＴＳＢＶ）のＡβ１−２８プラークへの優先的な結合は、ＣＦＡ／ＩＣＦＡワクチンに対して生じる血清について観察された。これは、ＩＳＡ５１で配合したワクチンによって導き出される抗体が、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中で配合されるワクチンによって生じる抗体と区別可能であることを意味する。また、本発明にしたがって配合したワクチンによって生成される抗体は、脳組織内の老人性プラークに対して所望の交差反応性を有する抗体を提供した。予備免疫血清は、図１ｃ及び１ｆのスライドに示す、相当する連続断面図において、染色が観察されなかった。
【００７７】
さらに、希釈度１：１００の予備免疫血清及び免疫血清でのＡＤ脳１の連続断面図の免疫ペルオキシダーゼ染色を、４０倍の倍率で、図２ａ〜２ｅに示す。ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化した動物から得た血清は、図２ａ及び２ｄのスライドに示すように、核のパターンを形成するプラークを強く染色した。また、驚くべきことに、対応するＣＦＡ／ＩＣＦＡ配合物に対して調製した免疫血清での染色は、プラークとの反応性において異なる染色パターンを呈した。脳組織におけるプラークよりもむしろ、図２ｂに示す血管において支配的であった。予備免疫血清は、図２ｃに示すように、断面図を染色しなかった。ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中のＡβ１−４２ペプチドのみで免疫化によって生成した超免疫血清は、ＥＬＩＳＡによるＡβ１−２８との反応性は強かったにも関わらず、図２ｅに示す断面図において、驚くべき程に弱い染色パターンしか呈しなかった。
【００７８】
実施例３、４及び５に記載した種々のワクチン配合物で免疫化したモルモットから得た１１種の集めた免疫血清及び予備免疫血清で、ＡＤ脳組織の同様の免疫染色を行った。これらの血清はまた、Ａβ１−１４ＥＬＩＳＡによる機能性部位での抗体反応性、及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡによる可溶性Ａβ１−４２での抗体反応性を評価した（表９）。一般に、３つのアッセイすべてにおいて検査した血清で、並行的な傾向が見られた。表９に示すように、予備免疫血清及びＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中に配合した短鎖ペプチドＡβ１−１４のみに対して生ずる血清の抗ペプチド反応性は低く、プラークへの交差反応性は、無視できるものであった。控えめな反応性が、ミョウバン（Alum）及びＩＳＡ５１中に配合したＡβ１−２８ペプチドのみ、並びにＫＬＭに共役したＡβ１−１４及びＩＳＡ中に配合したＡβ１−１４でワクチン化した動物からの血清に観察された。一方、機能性Ａβ１−１４部位、可溶性Ａβ、及びＡＤ患者の脳組織断面図中のプラーク及びＴＳＢＶへの著しい部位配向性反応性が、本発明の合成Ａβ／Ｔｈ免疫原で免疫化した動物由来の血清で観察された。したがって、これらの研究から得た結果から、外来Ｔｈエピトープに結合する、アミノ酸を１〜２８個から約１〜１０個有するＡβ１−４２のＮ末端フラグメントを有するペプチド免疫原の優れた免疫原性及び有用な免疫原性が例証された。また、この結果から、外来Ｔｈエピトープが存在することにより本発明のペプチド免疫原の免疫原性を驚くべき程度にまで向上させることがわかった。ヒトへの利用が許容可能である臨床上許容可能なワクチン配合物における本発明のペプチド免疫原は、ＡＤ患者の脳組織内の老人性プラークに対して所望の交差反応性を有する抗体を発生した。
【実施例７】
【００７９】
ＡＤへの免疫治療上の効験の予想としてのヒヒにおける代表的なＡβペプチドワクチンの免疫原性
ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルションに、２５μｇ／０．５ｍＬ、１００μｇ／０．５ｍＬ及び４００μｇ／０．５ｍＬの投与量で配合した、代表的な合成免疫原、Ａβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）を、３匹のヒヒ、Ｙ２９９、Ｘ３９８、Ｘ１１９８に、初期免疫化から０週、３週目及び６週目のスケジュールで与えた。初期免疫後５週目及び８週目（ｗｐｉ）での予備免疫血清及び血清を収集した。比較のために、ミョウバン（Alum）、ヒト用に認可されている標準アジュバント、に配合したフリーのペプチドＡβ１−２８及びＡβ１−４２の等モル混合物を１００μｇ／０．５ｍＬの投与量で４匹目のヒヒ、Ｘ７９８に与えた。予備免疫血清を、ネガティブコントロールとして用いた。
【００８０】
４匹の免疫化動物すべてからの血清を収集し、（０、５及び８ｗｐｉで収集した血清について）Ａβ１−１４ＥＬＩＳＡによる機能性部位との抗体反応性、及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡによる可溶性Ａβ１−４２との反応性について評価した。老人性プラーク及びチオフラビンＳ陽性血管中のプラークとの抗血清（８ｗｐｉのみ）の交差反応性を、実施例６に記載したように、免疫染色法により評価した。抗ヒヒＩｇを用いる代わりに、用いた抗体検知器は、ヒトのすべてのアイソタイプを認識し且つヒヒＩｇＧと交差反応性である抗ヒトＩｇＧからのＦａｂフラグメントであった。
【００８１】
３種のアッセイすべてにおいて検査した血清で、再度、並行的な傾向が観察された。表１０に示すように、予備免疫血清は陰性であった。ミョウバン（Alum）に配合したＡβ１−２８及びＡβ１−４２でワクチン化した動物Ｘ７９８からの血清との控えめなＥＬＩＳＡ反応性が観察された。しかしながら、この血清の反応性は、老人性プラークの認識のためには弱かった。比較するに、Ａβ１−１４の機能性部位、可溶性Ａβ１−４２、及びＡＤ患者の脳断面におけるプラーク及びＴＳＢＶに対する、著しい部位配向性の反応性が、１００μｇ／０．５ｍＬ及び４００μｇ／０．５ｍＬの双方の投与量でＩＳＡ５１で配合した、本発明の代表的な組成物（配列番号７４）で免疫化した動物の初期免疫化から８週目で収集した血清に観察された。したがって、このヒヒでの研究から得た結果から、ヒトに適切なワクチン配合物での本発明の免疫原の有用性が例証された。免疫原性の向上（Ａβの機能性部位に対して特定の抗体力価において１０〜１００倍の増大）は、ヒトのそれに非常に類似するヒヒの免疫応答性を有する従来技術のペプチドワクチンと比較して、非常に著しい。
【００８２】
同様に、２〜３種の本発明の合成免疫原を含む混合物を、投与当たり約２５〜１０００μｇでのワクチンへの配合物に用いて、ＡＤの予防及び処置において遺伝学上縮退したヒトの母集団に機能性抗Ａβ１−１４抗体を導くことができる。広いＭＨＣ認識を達成するのに提供される本発明のペプチド免疫原の乱雑なＴｈエピトープの存在により、ヒトにおける広い免疫原性が予想される。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
【表６】
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
【００９１】
【表９】
【００９２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００９３】
図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ及び１ｆは、希釈度１：１００での免疫血清及び予備免疫血清での倍率１０×での、アビジン−ビオチン化抗体複合体（ＡＢＣ）法を用いた、２つのＡＤ脳からの連続断面の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す写真である。図１ａ、及び１ｄは、チオフラビンＳ陽性血管（『ＢＶ』とラベル）上、抗体が老人性プラーク及びＡβプラークの双方（共に『Ｐ』とラベル）に著しく結合することを示す。この抗体は、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）を用いるモルモット中で生成した。図１ｂ及び１ｅは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中の同一のペプチド免疫原に対して生じた抗体の交差反応性を示す。図１ｃ及び１ｆは、予備免疫血清を用いる脳断面を示す。
【００９４】
図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅは、希釈度１：１００での免疫血清及び予備免疫血清での倍率４０×での、ＡＤ脳の連続断面の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す写真である。図２ａ及び２ｄは、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化したモルモット中の抗体が、核のパターンを形成するプラーク（Ｐ）を強く染色したことを示す。図２ｂは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ配合物中の同一の免疫原を用いるＡＤモルモット脳の染色パターンの写真である。この抗血清は、血管（ＢＶ）上のプラークと支配的に反応した。図２ｃは、予備免疫血清でのモルモットの脳断面の写真であり、染色がないことを示している。図２ｅは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中でＡβ１−２８ペプチドのみで免疫化することにより生成した超免疫での脳断面を示す。ＥＬＩＳＡによるＡβ１−２８で強い反応性を示したにも関わらず、驚くべき程弱い染色しか観察されない。
【図１】
【図２】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の予防及び処置に有用なペプチド免疫原を有する組成物に関する。特に、ペプチド免疫原は、ＭＨＣ結合モチーフの種々のクラスＩＩを有するヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）に結合される、主要な機能性／制御部位、アミロイドβ（Ａβ）ペプチドのＮ末端フラグメントを有する。ペプチド免疫原は、Ａβペプチドの主要な機能性／制御部位に対して、部位配向性（site-directed）の免疫応答を導き出し、抗体を生成する。該抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病の患者の脳で形成されるアミロイドプラークと高い交差反応性を有する。可溶性Ａβ１−４２ペプチドと交差反応性である、導き出された抗体は、フィブリル離解（disaggregation）を促進し、「可溶性Ａβ由来毒」の免疫中性化（immunoneutoralization）を導くフィブリル凝集を抑制し、アミロイドプラークと交差反応性であり、脳からの該プラークの浄化を促進する。したがって、ペプチド免疫原を有する本発明の組成物は、アルツハイマー病の予防及び処置に有用である。
【発明の背景】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、患者の認識能力の欠損及び重篤な挙動異常性によって特徴づけられ、最後には患者の死を導く、慢性の神経変性疾患である。現在、米国には２５０万人〜４００万人、世界には１７００万人〜２５００万人のＡＤ患者が存在する。西洋社会では、心臓病、ガン、及び発作に次いで、死亡原因の第４位にある。アリセプト（ＡＲＩＣＥＰＴ）（商標）、アセチルコリンステラーゼ抑制剤は、アルツハイマー患者の衰える速度を減速させるものとしてＦＤＡによって認められている。しかしながら、ある限られた期間及びある患者にだけに有効である。現在まで、このひどい病気に対する決定的な処置又は治療法はない。
【０００３】
２種の微小な沈着物、即ち神経細線維もつれ（neurofibrillary tangle）（ＮＦＴ）及び老人性アミロイドプラークは、この病気の病理学上の顕著な特徴としてアロイス・アルツハイマーによって同定された。神経細線維もつれは、互いにねじれている、２つの１０ｎｍ幅のフィラメントからなり、一対のらせんフィラメント（paired helical filaments）（ＰＨＦｓ）と呼ばれており、その主要な成分はリン酸化タウである。タウタンパク質の２６２位のアミノ酸のセリンのリン酸化は、タウの生理学的な機能不全を導く重要な工程である。ＰＨＦｓは、細胞内であり、異常な樹状の工程及び軸索工程、又は老人性アミロイドプラークの周辺を作る神経突起の多くで観察される。老人性アミロイドプラークは、アミロイド沈着物の細胞核と共に、横断面が１５０μｍまでの面積での組織破壊された神経網フィラメントからなる。脳のアミロイドプラークは、ＰＨＦｓとは超構造的に異なり、対をなしてねじれていない、４〜８ｎｍ幅のフィラメントである。プラーク核は、ペプチドの凝集体からなり、初期段階ではＡ４と呼ばれ、相対分子量（Ｍ）が約４０００である（マスターズ（Masters）ら、Proc Natl Acad Sci USA、1985、82：4245-4249）。
【０００４】
現在はアミロイドβペプチド（又はＡβ１−４２）と名前を変えた、Ａ４の一部のアミノ酸配列は、それがアルツハイマー病又はダウン症候群の患者の脳血管から単離されたアミロイドβタンパク質と類似することがわかった（グレンナー（Glenner）及びワン（Wong）、Biochem Biophys Res Comm, 1984; 120: 885-890; 122: 1131-1135）。
【０００５】
Ａβ１−４２は、多くの理由から、ＡＤと関連すると仮説されている。第一に、周辺アミロイド症、例えば原発性Ｌ鎖病又は続発性ＡＡアミロイド症において、大きなアミロイドの負担は、組織及び器官の機能不全に関連する。第二に、アミロイドプラーク密度は、ＡＤの生前痴呆スコア（premortem demetia score）に積極的に関連する。第三に、Ａβ１−４２沈着は、ＡＤ及びダウン症候群などの関連する疾患における神経病理学上の初期的なマーカーであり、それは、ＮＦＴ形成よりも２０〜３０年先んじることができる。第四に、β−アミロイド症は、ＡＤ及び関連する疾患に比較的に特異性である。第五に、Ａβ１−４２は、ニューロンにとって有毒である（ヤンクナー（Yankner）ら、Science, 1990; 250: 279-282）。最後に、構造的なアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子におけるミスセンス突然変異は、家族性ＡＤの初期兆候に生じる（ゲーテ（Goate）ら、Nature, 1991; 349: 704-706；ミュラン（Mullan）ら、Nature Genetics, 1992; 1: 345-347）。特に、そのような突然変異によって劇的なＡβ１−４２過生産が引き起こされる（シトロン（Citron）ら、Nature, 1992; 360: 672-674）。
【０００６】
1987年、カング（Kang）ら（Nature, 1987; 325: 733-737）及び他の３つのグループ（アンダートン（Anderton）の1987年状況報告、Nature, 1987; 325: 658-659及びバーンズ（Barnes）、Science, 1987; 235: 846-847）は、それぞれ独立に、Ａβ１−４２が由来する遺伝子をクローン化した。今やアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）として知られている、この遺伝子は、実質的にすべての組織で発現される、ＭＷ：約７９，０００の６９５個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードする。ＡＰＰのスプライシング可変体は少なくとも５種あり、そのうちの４種は、β−アミロイドペプチド配列を含んでいる。
【０００７】
４種の遺伝子は、ＡＤの家族性形態で、含まれている。この遺伝子の３種、βＡＰＰ、プレセニリン１（presenilin 1）及びプレセニリン２（presenilin 2）は、変異されると、ＡＤの常染色体の支配的な初期形態を生じる。第４種目の遺伝子、アポリポプロテインＥ（Apolipoprotein E）は、天然の多形態、ApoE4を有し、この疾患の進行を主な遺伝学的な危険因子を表す。いくつかの明白な遺伝子における変化によって、当初は４２残基、その後４０残基のペプチドが細胞毒プラークへと結果的に凝集すると共に、Ａβ１−４２産生とその浄化における慢性的なアンバランスをもたらすことができるという概念は、入手可能な証拠によって支持されている。この証拠は、これらの４種の遺伝子の各々における欠陥が、(1) Ａβ１−４２ペプチドの産生及び／又は沈着を増大させることにより、又は(2)組織からのApoE4の浄化を減少させることにより、ＡＤ表現型の素因をつくることをを強く支持している（セルコー（Selkoe）、J. Biol. Chem., 1996; 271: 18295-18298）。
【０００８】
入手データから、多分相互に関連づけられるある範囲のメカニズムにより、凝集するが単量体ではないＡβ１−４２ペプチドが細胞機能不全及びインビトロの細胞死を誘発できることがわかる。これらには、酸化損傷（トーマス（Thomas）ら、Nature, 1996; 380: 168-171；ベール（Behl）ら、Cell, 1994; 77: 817-827）、細胞内カルシウムホメオスタシスの変化（アリスペ（Arispe）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993; 90: 567-571）、及び細胞骨格再構成（ブシグリオ（Busciglio）ら、Neuron, 1995; 14: 879-888）が含まれる。アミロイド誘発カスケードにおける主要な工程のいくつかを十分に知ることは、該カスケード仮説が熱く議論されていたとしても、生じてくる。
【０００９】
アミロイド誘発カスケードの一工程又はその他の工程を阻害することができる小分子を同定する医薬上のアプローチが順調に進行中である。特に興味深いことは、２つのアプローチである。ニューロン細胞又は神経膠細胞からのＡβ１−４２ペプチドの分泌を減少させることによりＡβ１−４２ペプチドの凝集を妨害する試み又はこれらの細胞外凝集体がニューロン細胞又は神経膠細胞及びその方法を産生する毒性を阻害する試みである。第三のアプローチは、凝集化Ａβ１−４２（微小神経膠刺激、古典的な補カスケードの活性、サイトカイン放出、及び反応性星状細胞を含む）によってトリガーされることがわかっている特別な炎症反応を制御する試みは、アルツハイマー患者にとって有益であるものと立証されるかもしれない。
【００１０】
ＡＤ介入の上述の医薬上のアプローチと異なり、免疫学的な介入も試みられている。ソロマン（Soloman）ら（Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Aca. Sci., 1997; 94: 4109-4112）は、ヒトＡβ１−４２ペプチドのＮ末端領域の部位に向けた、３種の特異的なモノクローナル抗体が、前もって形成されたフィブリルに異なる度合いで結合し、神経毒性効果の離解（disaggregation）及び阻害をもたらすことを示した。これらの抗体は、原繊維Ａβ１−４２の形成を防止することもわかった。ソロマンら（ＷＯ０１／１８１６９）は、Ａβ１−４２ペプチドのエピトープのファージディスプレイ（phage display）を調製し、ファージ表示エピトープ又は該エピトープを含有するペプチドをマウスに腹腔内投与し、抗体をＡβ１−４２ペプチドに導き出すことも試みた。ラットのフェノクロモサイトーマ(phenochromocytoma)でのインビトロ試験により、抗血清の１：５希釈物がＡβ１−４２ペプチドの神経毒性を予防することがわかった。１：５及び１：２０での希釈物の抗血清は、フィブリル形態の甚大な悪化と共に、Ａβのフィブリル構造をインビトロで粉砕することもわかった。しかしながら、第一の注入に用いたアジュバントは、フロイント完全アジュバントであり、第二の注入には、フロイント不完全アジュバントであった。用いたアジュバントは全て、ヒトに用いるには不適切である。また、これらの粗いアジュバントを用いたにも関わらず、生成した抗体のレベルは低いので有効ではない。
【００１１】
次に、シェンク（Schenk）ら（Nature, 1999; 400: 173-177）は、Ａβ１−４２ペプチドでの免疫化が、ＡＤのマウスモデルにおいて、アミロイドプラーク及び関連するジストロフィー神経突起の形成を阻害することを示した。しかしながら、Ａβ１−４２ペプチドの低免疫原性のため、使用した方法は、粗い病変形成アジュバントでの抗原の繰り返し投与を要し、プラーク形成に影響を及ぼすのに必要な抗Ａβ１−４２プラーク抗体を高レベルで得た。また、Ａβ１−４２ペプチドでの免疫化は、毒性のアミロイドそのもののさらなる蓄積を誘発するかもしれないことに留意すべきであった（アラウヨ（Araujo, DM）及びコットマン（Cotman, CW）、Brain Res., 1992: 569; 141-145）。
【００１２】
これらの批評にも関わらず、類似の活性免疫化によるトランスジェニックＡＤマウスモデルでのさらなる研究は、ＡＤの免疫予防学的アプローチ及び免疫療法的アプローチに信用を与えた。ジェーナス（Janus）ら（Nature, 2000; 408: 979-982）は、挙動障害及びプラークを減少させる、ＡＤのためのマウスモデルでのＡβ１−４２ペプチド免疫化を記述する。モルガン（Morgan）ら（Nature, 2000; 408: 982-985）は、マウスモデルにおける記憶欠失を予防するＡβ１−４２ペプチドワクチン化を記述する。
【００１３】
免疫治療の有効性を直接的に支持するものは、Ａβ−ペプチドに対する抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の周辺投与がアミロイドの負担を減少させる観察から由来する（ＷＯ９９／２７９４４；バード（Bard）ら、Nature Medicine, 2000; 6: 916-919）。比較的穏やかな血清レベルであるために、これらの受動的に投与された抗体、モノクローナル３Ｄ６（抗Ａβ１−５）及び１０Ｄ５（抗Ａβ１−１２）又はポリクローナル抗Ａβ１−４２、は、中枢神経系に入ることができた。そこで、抗体は、プラークに結合し、存在するアミロイドプラークの浄化を誘発した。バードらは、ＰＤＡＰＰマウス（即ち、血小板由来成長因子プロモータによって導かれるＡＰＰミニ遺伝子でトランスジェニックされたマウス）の脳断面又はＡＤ患者の脳組織で生体外（ex vivo）アッセイで検査したとき、Ａβ−ペプチドに対する抗体は、小膠細胞へトリガーを引き、Ｆｃ受容体仲介食菌作用及びそれに続くペプチド崩壊によりプラークを浄化させることを報告した。この研究は、受動的に投与された、Ａβ１−４２ペプチドに対する抗体及びＡβ１−４２Ｎ末端領域が、ＡＤのマウスモデルのプラーク沈着の程度を減少させること；及び部位配向性ワクチンによって導き出されたモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体が治療学上関連性の高いレベルでＣＮＳへ入ることができることを例証した。
【００１４】
ＡＤのためのマウスモデルにおける免疫学上の仲介の見込みのある発見にも関わらず、ヒトに適切な対ＡＤワクチンは、遙か遠くに存在する（チャップマン（Chapman）、Nature, 2000; 408: 915-916）。主要なハードルは、ヒトに有用な免疫原性組成物を設計及び配合するのに必要な熱心な研究にあり、それによりはじめて、ＡＤへの実際的なワクチンを達成できる。ガイドとなる実験データに基づくいくつかの問題として次のものがある。(1)Ａβ内の抗体認識の特異的ターゲット部位はどれであるのか？。(2)免疫原はどんな形態で存在すべきであるのか？。(3)治療学的なレベルにある抗体を導き出す抗原を達成する前に、他のどんな部位を含む必要があるのか？。(4)ヒトへの臨床学上許容可能なアジュバントを用いる有効なワクチン配送システムは何であるのか？。
【００１５】
文献に開示されていることと為すべきとして存在していることとには大きなギャップがある。適切な特異的ターゲット部位（即ち、重合体化Ａβ１−４２プラーク又は単量体可溶性Ａβ１−４２ペプチド）は何なのか、及び特異的部位は、免疫学上の介入にはどのように機能させるべきであるのか。過去１０年間に亘ってＡβ１−４２に関する５，０００もの文献があるにも関わらず、アミロイドカスケード仮説は、熱く語られており、その問題：介入に用いられるべきＡβ１−４２の形態は、議論が続いている。テリー（Terry）及びその仲間によって議論されている、問題の心臓部は、原繊維アミロイド負荷と神経学的な機能不全の測定との間の弱い関連性である（『アルツハイマー病の神経病理学及びその変更の構造的基礎（The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basis of its Alterations）』、テリーら編、アルツハイマー病（Alzheimer Disease）、p.187-206、Lippincott Williams and Wilkins, 1999）。
【００１６】
ＡＤ患者において、アミロイド沈着物はしばしば、ニューロンの損傷部位から離れて形成される。病理学的痴呆との最も関連することは、シナプス末端の欠損である。しかしながら、シナプス末端の欠損は、アミロイド負荷とほとんど関連がない。病気の発現がアミロイド負荷と弱く関連しているならば、Ａβの役割は何であるのか？。クライン（Klein）らの文献、タイトル“Targeting small Ａβ１−４２ oligomers: the solution to an Alzheimer’s desease conumdrum?”（Trends in Neurosciences, 2001; 24: 219-224）は、フィブリルがＡβの毒性形態であるだけでなく、ＡＤに最も関連がある神経毒でも多分あることを示唆している。小オリゴマー及びプロトフィブリルは、Ａβ１−４２由来拡散性リガンドとも呼ばれ、神経学上、潜在的な毒性活性を有しているのかもしれない。
【００１７】
成功裡にある免疫学上の仲介としてのＡＤワクチンは、高い親和性を有する部位配向性抗体を導き出すように設計される免疫原を要する。この抗体は、脳組織の老人性プラークと結合し、神経膠細胞によりプラークの浄化を促進し、可溶性Ａβ由来毒を免疫中性化（immunoneutralize）する。
【００１８】
免疫原性に乏しい部位特異性（site-specific）ペプチドに対する部位配向性抗体の親和性を高く上げる問題は、１０年間知られている。免疫学者及びワクチン学者はしばしば、ＷＯ９９／２７９４４に例証される、古典的なハプテン［ペプチド］キャリアタンパク質共役物（conjugate）アプローチに頼る。ＡＤに対する部位配向性ワクチンの開発に関して、フレンケル（Frenkel）らは、上述したように”ＥＦＲＨ”ファージ投与によるＡβ１−４２プラークに対する免疫化を試みた（Proc. Natl. Acad. Sci., 2000; 97: 11455-11459、ＷＯ０１／１８１６９）。
【００１９】
Ａβ１−４２ペプチド凝集体又はＡβ１−４２ペプチドフラグメント−キャリアタンパク質共役物（ＷＯ９９／２７９４４）を用いるアプローチ、及び試薬として”ＥＦＲＨペプチド”を表示するフィラメントファージを用いて患者のアミロイド沈着に対する免疫応答を誘発するアプローチは、扱いにくく且つ効果的でない。例えば、ＥＦＲＨエピトープを表示する１０１１ファージの４回目の免疫化後、モルモット免疫血清中の抗体の＞９５％が該ファージに対抗する。抗体の少量のみ（＜５％）が、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対抗する（フレンケル（Frenkel）ら、Vaccine 2001, 19: 2615-2619、ＷＯ０１／１８１６９）。
【００２０】
より扱いにくくない方法は、ＥＰ５２６，５１１及びＷＯ９９／２７９４４に記載されている。これらは、既に確立されたＡＤの患者を処置するためにＡβ１−４２ペプチドを投与すること、及びＡＤ患者の“有効な”免疫応答を発生する条件下でＡβ１−４２又は他の免疫原を患者に投与することを開示する。しかしながら、ＷＯ９９／２７９４４を見ると、そこに開示されるワクチン設計には欠陥があることがわかる。
【００２１】
特に、医薬上許容可能な且つ有効なワクチン配送システムの欠如に問題がある。ＷＯ９９／２７９４４は、活性ワクチン成分として、Ａβ１−４２ペプチド又はコレラ毒のようなキャリア分子に共役するＡβ１−４２の活性フラグメントを開示する。ＷＯ ９９／２７９４４の４頁を参照のこと。免疫原を含有する医薬組成物は、フロイント完全アジュバント［ＣＦＡ］を含むべきではないことを第５頁は示唆しているが、トランスジェニックマウスのＡＤの処置のためのＡβ１−４２ワクチンの効験を示す実施例のみが、ＣＦＡ中に大量の凝集化Ａβ４２ペプチドを用いていた。免疫応答を向上させるのに開示される免疫原性試薬と共に用いられるべき好ましいアジュバントが反復的に詳説されているにも関わらず、ＣＦＡ／ＩＣＦＡを用いる配合物のみが抗体の十分な高力価をもたらすことを実験データは示していた。ＷＯ９９／２７９４４の２５頁を参照のこと。実施例１において、ＡＤに対するＡβ１−４２の予防効験がＰＤＡＰＰマウスにおいて例証されていた。しかしながら、投与された配合物は、マウス当たりフロイント完全アジュバント［ＣＦＡ］でエマルション化された凝集化Ａβ１−４２１００μｇの量（ＷＯ９９／２７９４４の３４頁）、次いで、フロイント不完全アジュバントでエマルション化した同一のＡβ１−４２ペプチドの多数の追加投与（booster）を含む。実施例ＩＸにおいて、異なるアジュバントに対するマウスでの免疫応答が研究された。潜在的な免疫原と称されるＡＮ１７９２（即ち凝集化ヒトＡβ４２）と共にアジュバント：ＭＰＬ、ミョウバン（Alum）、ＱＳ２１、及びＣＦＡ／ＩＣＦＡを用いたとき、Ａβ１−４に対する抗体のレベルは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡワクチンを受けたマウスと比較して統計学上著しく減少した。ＷＯ９９／２７９４４の表９及び５９〜６４頁を参照のこと。
【００２２】
Ａβ１−４２ペプチドフラグメントを用いた場合（アミノ酸１〜５、１〜１２、１３〜２８、及び３３〜４２のヒトＡβ１−４２ペプチド）、各フラグメントは、タンパク質キャリアとしてのヒツジ抗マウスＩｇＧと結合した。後述の文献において、Ａβペプチドフラグメントに対する抗体の効験は、モノクローナル抗体での受動的免疫化によってのみ示すことができた（バード（Bard）ら、Nature Medicine 2000; 6: 916-919）。ヒツジ抗マウスＩｇＧと結合した、これらのフラグメントの効験は、示されなかった。よって、有効であると示された唯一の免疫原は、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中の凝集化Ａβ１−４２ペプチドであった。
【００２３】
現在まで、有効であると示されたワクチン配合物はすべて、アジュバントとしてＣＦＡ／ＩＦＡを使用していた。よって、Ａβ１−４２をターゲットとするペプチド免疫原は、ヒツジ抗マウスイムノグロブリンへの様々なＡβ１−４２フラグメントの共役物、抗ＣＤ３抗体へのm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを介した合成Ａβ１３−２８の共役物、又は凝集化Ａβ１−４２ペプチドのみによって調製されている。これらの免疫原、即ちＡβ４２ペプチドそのもの又はＡβ１−４２ペプチド−キャリアタンパク質共役物は、第１の免疫化のために、フロイント完全アジュバントでエマルション化され、次いでフロイント不完全アジュバント中でさらに追加投与した（boost）（ジョンソン-ウッド（Johnson-Wood）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997; 94: 1550-1555；ジェーナス（Janus）ら、Nature, 2000; 408: 979-982；モルガン（Morgan）ら、Nature, 2000; 408: 982-985）。ＷＯ９９／２７９４４又はＣＦＡ及びＩＣＦＡをアジュバントとして用いるその他の文献に開示される配合物は、障害を引き起こし、ヒトへの使用にはあまりに粗すぎる。したがって、ヒトへの使用に適切なＡＤ用ワクチン組成物は先行技術には開示されていない。
【００２４】
要約すると、クライン（ＥＰ５２６，５１１）の先の開示によると、ＡＤの処置のためのＡβ１−４２ペプチドの潜在能力を示唆する言及があるにも関わらず、ワクチン配合物を解決する課題は、このキーとなる課題を向けたものをＷＯ９９／２７９４４には実際には提供されていない。
【００２５】
ペプチド−キャリアタンパク質共役物及びＡβ１−４２凝集体での他の不利益は、これらの分子が非常に複雑であり且つ同定しにくいことであり、製造方法に関する有効な質的制御工程を開発するのが困難である。さらなる不利益は、Ａβ１−４２ペプチド又はそのフラグメントがヒトに投与されると、それらが自身の分子（self molecule）であることである。よって、ヒトにおいてより免疫原性であるか又はより非免疫原性である。したがって、ヒトに投与するための臨床上利用可能なワクチン配合物を開発することが必要である。
【００２６】
乱雑な（promiscuous）Ｔｈエピトープを用いて、有効なＴ細胞ヘルプを引き起こすことができ、免疫原性に乏しいＢ細胞エピトープと結合して潜在的な免疫原を提供することができる。よく設計された、乱雑なＴｈ／Ｂ細胞エピトープ・キメラペプチドは、Ｔｈ応答及び異なるＭＨＣハプロタイプを発現する遺伝学上異なる母集団の大抵の種において得られる抗体反応を導き出す際において有効であることが分かっている。はしかウイルスＦタンパク質及びＢ型ウイルス性肝炎表面抗原などの多くの病原体由来の乱雑なＴｈが知られている。表１及び表２は、短くて免疫原性の乏しいペプチド、デカペプチドホルモンＬＨＲＨ（ＵＳ５，７５９，５１１及び６，０２５，４６８）を強化するのに有効であることがわかっている既知の乱雑なＴｈの多くをリストアップする。
【００２７】
潜在的なＴｈエピトープは、その大きさが約１５〜４０長のアミノ酸残基の範囲にあり、共通の構造的特徴をしばしば共有し、且つ特異的な目印となる配列を含むことができる。例えば、Ｔｈの共通の特徴は、疎水性アミノ酸残基がらせんの一表面を支配し、荷電及び極性残基が周表面を支配する両親媒性らせん、αらせん構造を含むことにある（シーズ（Cease）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987; 84: 4249-4253）。Ｔｈエピトープは、Ｇｌｙ又は荷電残基についで２つ又は３つの疎水性残基、さらに１つの荷電又は極性残基が続くような、さらなる第一のアミノ酸パターンを含むことがしばしばである。このパターンは、ロスバード（Rothbard）配列と呼ばれるものである。Ｔｈエピトープはしばしば、正荷電残基が荷電残基後の第４番目、第５番目及び第８番目の位置で疎水性残基に次いであるという、規則１、４、５及び８に従う。これらの構造は全て、共通の疎水性アミノ酸、荷電極性アミノ酸を有してなるので、各構造は単一のＴｈエピトープ内で同時に存在することができる（パーチドス（Partidos）ら、J. Gen. Virol., 1991; 72: 1293）。乱雑なＴ細胞エピトープの全てではないが、ほとんどが、上述の周期性の少なくとも１つにフィットする。これらの特徴は、組合せＴｈエピトープを含む、理想化人工Ｔｈ部位の設計に含むことができる。組合せＴｈ部位の設計に関して、可変可能な位置及び好ましいアミノ酸のリストがＭＨＣ結合モチーフに利用可能である（マイスター（Meister）ら、Vaccine, 1995; 13: 581-591）。なお、組合せＴｈの製造方法は、構造化合成抗原ライブラリーと呼ばれる組合せライブラリーペプチドに開示されている（ワン（Wang）ら、ＷＯ９５／１１９９８）。よって、規則１、４、５及び８は、組合せＴｈ部位における不変且つ縮退した位置を示し、かつ人工Ｔｈの免疫応答性の範囲を大きく広げる縮退部位のための残基を選択する既知の組合せＭＨＣ結合モチーフと共に、適用することができる。表２、ＷＯ９９／６６９５７、及びＷＯ９５／１１９９８を参照のこと。
【００２８】
ワン（Wang）ら（ＵＳ５，７５９，５５１）は、免疫刺激性要素を用いて自身タンパク質アミリン（Amylin）を免疫原性にすることを示唆した。ワンらは、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、アミリンの過産生により引き起こされるアミロイド原性疾患の処置用ワクチンとして免疫原性合成アミリンペプチドを投与することを示唆した（ＵＳ５，７５９，５５１の第19欄９〜39行）。アミリンは、ランゲルハンス島のβ細胞によって産生されるアミノ酸残基３７個のペプチドホルモンである。アミリンの過産生の結果、膵臓内のアミロイド原性疾患を導く不溶性アミロイドの沈着が生じる。アミリンの過産生と同様に、Ａβ１−４２ペプチドの過産生により、ＡＤ患者の脳内に不溶性アミロイドの沈着が導かれる。しかしながら、アミリンとＡβ１−４２ペプチドとでは、限定された配列相同関係しか存在しない。アミリン３２−３５のアミノ酸残基の短い伸縮、ＶＧＳＮだけが、Ａβ２４−２７に相当する。アミリンペプチドに対して産生される抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに交差反応性ではないと予想され、且つＥＦＲＨ配列が重要であることが示されているソロマン（Soloman）ら及びシェンク（Schenk）らによる研究によると、脳内のアミロイドプラークの浄化を促進しないと予想される。
【００２９】
ＡＤ患者の脳内の老人性プラークに対して高い交差反応性を有する、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端機能性部位に対して高い親和性の抗体を高レベルで生成することができる免疫原を開発することが本発明の目的である。Ａβ１−４２ペプチド及び老人性プラークに結合することによって生成する、この抗体は、これらのプラークを脳から浄化することを促進し、フィブリル離解を促進し、繊維原凝集を阻害し、かつ『可溶性Ａβ由来毒』［Ａβ由来拡散性リガンド又はＡＤＤＬｓとも言う］を免疫中性化することが予想される。
【００３０】
また、本発明の目的は、アルツハイマー病の予防及び処置のためのヒト用又は獣医学用に適切であるワクチン配送ビヒクルを開発することにある。
【発明の簡単な説明】
【００３１】
本発明は、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳のプラークの双方に高い交差反応性を有する、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対する抗体を誘発できる合成ペプチドを含有する免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、それをＡＤ患者又はＡＤに感染しやすい者に投与すると、脳内のアミロイドプラークの浄化及び可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を促進しＡＤを予防且つ処置することが期待される。特に、本発明のペプチド免疫原は、Ａβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨ、配列番号６５、又はＡβ１−４２ペプチドフラグメントの免疫学上機能性類似体を含有する１０〜２８個のアミノ酸残基からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドの短いフラグメントに結合する配列番号１〜６４からなる群から選ばれるＴｈエピトープ及びそれらの免疫学上機能性類似体を含有する。好ましくは、Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、配列番号６６〜６９又はそれらの免疫学上機能性類似体からなる群から選ばれる。
【００３２】
また、本発明は、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０並びに他のアジュバント及び乳化剤からなる群から選ばれるアジュバント又は乳化剤を含有する医薬上許容可能なワクチン配合物中に免疫学上有効量のペプチド組成物を含有する免疫原性組成物を提供する。
【００３３】
また、本発明は、１種又はそれ以上の免疫原性ペプチドをホ乳類に、ある期間、Ａβ１−４２ペプチドの機能性／調節部位に対する抗体を誘発するのに十分な条件下で投与することにより、アミロイドプラークの浄化促進及び可溶性Ａβ由来毒の中性化を誘発しホ乳類のアルツハイマー病を予防及び処置する方法を提供する。本発明のワクチンの典型例は、医薬上許容可能なアジュバント及び／又はキャリア中の油中水滴型エマルションとして配合されるワクチン中に、ペプチド免疫原を５〜１０００μｇ含有するペプチド組成物である。ワクチンの典型的な投与法は、０、４週間、及び８週間のインターバルの免疫化スケジュールで、１回の投与当たり０．５〜２ｍＬでワクチン配合物を筋内注射するものである。
【００３４】
本発明のさらなる他の面は、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのアミノ酸残基１を含有する、１０〜２８個のアミノ酸からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントに結合するヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープからなる約３０〜約６０個のアミノ酸の免疫原性合成ペプチドに関する。Ｄ、アスパラギン酸をアミノ酸残基１と称する、配列番号６５を参照のこと。好ましくは、Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、配列番号６６〜６９又はＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントのペプチド類似体からなる群から選ばれる。免疫原性領域を分離するアミノ酸スペーサを任意に含んでもよい。スペーサにより分離される免疫原性領域の要素は、ペプチドハプテンの免疫反応性が実質的に維持されるか又はＮ末端Ａβペプチドフラグメント、可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びプラークへの免疫反応性が発生することを条件として、いかなる順序でも共有結合することができる。
【００３５】
Ｎ末端Ａβ１−４２フラグメント免疫原への合成ペプチドの免疫原性に影響を与える重要な因子は、Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈ）による免疫系への存在である。このようなＴｈは、ターゲットとなるＡβペプチドにとって外来性である離間したＴｈペプチド領域要素上に配置される外来Ｔｈエピトープによるペプチド免疫原へ供給されるのが最も確かである。そのようなペプチド免疫原は、組替えＤＮＡ発現によるハイブリッドポリペプチドとして産生することができる。これらは、ホストに適切な、ＡβペプチドからのターゲットハプテンＢ細胞部位及びＴヘルパーエピトープ（Ｔｈ）を含有する合成ペプチド免疫原として、より簡易により安価に供給される。このようなペプチドは、抗体結合部位に加えて、ヘルパーＴ細胞受容体及びＩＩクラスＭＨＣ分子と反応し（バビット（Babbitt）ら、Nature, 1985; 317: 359）、それによりターゲット抗体結合部位に対する強い部位特異的な抗体反応を刺激する。以前より、このようなＴｈは、凝集化全長Ａβペプチドに内因性Ｔｈによる作業可能なＡβ１−４２ペプチド免疫原のために供給され（ＷＯ９９／６６９５７；ＷＯ９９／２７９４４；ジェーナス（Janus）ら、2000、モルガン（Morgan）ら、2000）、キャリアタンパク質によって供給することができる。全て合成のペプチド免疫原は、生成物が簡単な質量制御により化学的に定義することができるという利点、Ａβ１−４２ペプチド凝集体、キャリア共役物及び組替ポリペプチドを超えた利点を享受する。この合成ペプチド免疫原は安定である。手の込んだ下流プロセシング又は手の込んだ作製の器用さは不要である。したがって、エピトープ抑制などの不所望な応答は避けられる。
【００３６】
合成Ｎ末端機能性部位配向性Ａβペプチド免疫原の免疫原性は、（１）Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントを選択した外来性の乱雑なＴｈ部位であって、母集団の多くはそれに反応性であるＴｈ部位と組合わせること；及び（２）Ａβペプチドフラグメントをそのレパートリーを組合わせ化学により広げたＴｈと組合わせること、により最適化し、それにより、遺伝学上異なる母集団の可変性の免疫反応に適応させることができる。
【００３７】
本発明のペプチド組成物は、可溶性Ａβ１−４２及びＡＤ患者の脳内のプラークと交差反応性を有する、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対する抗体の産生を刺激することにおいて有効であることがわかる。モルモット及びヒヒで得られた免疫原性データ、及び得られた特異的な免疫血清による、ヒトＡＤ脳断面内に存在するアミロイドプラークの免疫ペルオキシダーゼ染色から得られたデータに基づいて、適切に配合された本発明のペプチド免疫原がヒトに有効であることが期待される。ヒヒは、その免疫応答がヒトのそれに非常に似ている種であることにおいて、ヒヒで得られたデータが特に重要であることに注意すべきである。
【発明の詳細な説明】
【００３８】
本発明は、Ａβペプチドの主要な機能性／調節部位に対して特異性を有し、可溶性Ａβ１−４２及びアルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳内のプラークと交差反応性を有する、高力価ポリクローナル抗体の生成のための新規なペプチド組成物に関する。ペプチド組成物によって生成した抗体は、非常に部位特異的（site-specific）であり、Ａβ１−４２と結合し且つ脳内のアミロイドプラークと結合する。よって、本発明は、ＡＤの予防及び処置のための、アミロイドプラークの浄化及び脳内の可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を促進する有効な方法を提供する。
【００３９】
１０〜２８個のアミノ酸からなる群から選ばれるＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントであって各フラグメントがＡβ１−４２ペプチド（配列番号６５）のＥＦＲＨを有するＮ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントは、それ自身によっては非免疫原性である、短い直鎖ペプチドである。この短いＡβ１−４２ペプチドフラグメントは、キャリアタンパク質、例えば、キーホール・リムペット・ヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）（ＫＬＨ）と化学結合させることにより、又は組替えＤＮＡ発現、例えばＢ型肝炎表面抗原によるキャリアポリペプチドへの融合化により、免疫潜在化（immunopotentiate）させることができる。このような『Ａβペプチド−キャリアタンパク質』ワクチンの欠陥は、生成される抗体の主要部がキャリアタンパク質に対して非機能性抗体であることである。
【００４０】
本発明の免疫原は、１０〜２８個のアミノ酸から成るＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを含有する、全て合成のペプチド免疫原である。該フラグメントは各々、配列番号１〜６４からなる群から選ばれる乱雑なＴｈエピトープと結合する、Ａβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨを含有する。本発明の免疫原は、Ａβ１−４２ペプチド及びその凝集体と結合し且つ脳内のアミロイドプラークと交差反応性を有する部位特異的な抗体の産生を導き出し、アミロイドプラークの浄化促進及び脳内の可溶性Ａβ由来毒の免疫中性化を提供する。したがって、本発明の免疫原は、ＡＤの予防及び処置に有効である。
【００４１】
本発明に有用なヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）は、多種のＩＩクラスＭＨＣ結合モチーフを含有する。Ｎ末端Ａβ１−４２ペプチドフラグメントと共有結合するＴｈの特別な例を提供する。本発明の免疫原ペプチドで免疫化した動物からの抗血清の結果から、潜在的な部位配向性Ａβペプチド反応性抗体が、遺伝学上異なる母集団で生成されることが例証される。
【００４２】
一般に、本発明の合成免疫原性ペプチドは、約２０〜１００のアミノ酸長であり、(i)配列番号１〜６４からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ；及び(ii)各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨを有する、約１０〜２８のアミノ酸残基のＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを含有し、(iii)免疫原性領域を分離する少なくとも１つのアミノ酸からなるスペーサを任意に含有する。
【００４３】
好ましくは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントは、配列番号６６〜６９及び免疫学上有効なそれらの類似体からなる群から選ばれる。Ｔｈペプチドは、任意にスペーサを有してもよい、Ａβ１−４２ペプチドのターゲットＮ末端フラグメントのＮ末端又はＣ末端のいずれかに共有結合する（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｎ Ｌｙｓ）。本発明のペプチド免疫原は、次の式のひとつにより表される。
（Ａ）ｎ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ；又は（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｂｏ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｘ。
式中、各Ａは独立にアミノ酸であり；
各Ｂはアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる結合基であり；
各Ｔｈは、ヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列、又はそれらの免疫向上（immune enhancing）類似体又はセグメントを有し；
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、合成ペプチドＢ細胞ターゲット部位抗原であり、約１０から約２８個のアミノ酸残基であり、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのＥＦＲＨ又はその免疫学上機能性類似体を有し；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨ又はα―ＣＯＮＨ２であり；
ｎは０〜約１０であり、ｍは１〜約４であり、ｏは０〜約１０である。
【００４４】
本発明のペプチド免疫原は、アミノ酸残基を約２０〜約１００、好ましくは約２５〜約６０有する。（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、配列番号６６〜６９からなる群から選ばれるのが好ましく、Ｔｈエピトープは、配列番号１、３、４、５、６、７、８、９、２０、３８〜４０、４７〜５１及び５２〜５４からなる群から選ばれるのが好ましい。ｍ＝１、ｎ＝１、及びＯ＝１又は２であるのが好ましい。
【００４５】
Ａがアミノ酸であるとき、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸として、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン及びシトルリンなどが挙げられるが、これに限定されない。天然のアミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。ｍが１より大であるとき、２つ又はそれ以上のＡがアミノ酸であり、各々のアミノ酸は、独立に、同じであっても異なってもよい。（Ａ）ｎは、スペーサ、例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｎ Ｌｙｓを含んでもよい。
【００４６】
Ｂはスペーサであり、上述のように、天然のアミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよいアミノ酸である。各々のＢは、独立に、同じであっても異なってもよい。Ｂのアミノ酸は、乱雑なＴｈエピトープとＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント（例えば配列番号６６〜６９）又はその免疫学的機能性類似体との間のスペーサ、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｌｙｓ又はリジンを提供することもできる。また、Ｂ細胞エピトープ、即ちＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体からＴｈエピトープを物理的に離間させることにより、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ又はε−Ｌｙｓスペーサは、ＴｈエピトープをＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体に結合することにより生成される人為的な２次構造を中断し、それによりＴｈ及び／又はＢ細胞応答間の相互作用を排除することができる。Ｂのアミノ酸は、ＴｈとＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントの離間を増大させる可撓性ヒンジとして作用するスペーサを形成することもできる。可撓性ヒンジをコードする配列の例は、イムノグロブリン重鎖ヒンジ領域にある。可撓性ヒンジ配列はしばしば、プロリンリッチである。ある特定の有用な可撓性ヒンジは、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７７）によって提供される。ここで、Ｘａａは、あるアミノ酸であり、好ましくはアスパラギン酸であるのがよい。Ｂのアミノ酸によってもたらされる構造的な離間により、ペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞とのより効率的な相互作用が可能となり、Ｔｈエピトープ及び抗体導出エピトープ又はそれらの免疫学的機能性類似体への免疫応答を高めることができる。
【００４７】
Ｔｈは、Ｔｈエピトープを有するアミノ酸（天然又は非天然アミノ酸）の配列である。Ｔｈエピトープは、連続エピトープであっても不連続エピトープであってもよい。不連続エピトープにおいて、Ｔｈのアミノ酸のすべてが必要なわけではない。Ｔｈエピトープ又はその類似体もしくはそのフラグメントは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに対する免疫応答を増大するか又は刺激することができる。免疫支配的であり且つ乱雑なＴｈエピトープは、広く縮退するＭＨＣタイプを有する動物及びヒトの種（population）にわたって広く反応性であり且つ高反応性である（パーチドスら（Partidos）、1991; US 5,759,551）。問題となるペプチドのＴｈエピトープは、約１０〜約５０のアミノ酸、好ましくは約１０〜約３０のアミノ酸である。多くのＴｈエピトープが存在するとき（即ち、ｍ≧２）、各Ｔｈエピトープは、同じであっても異なってもよい。Ｔｈセグメントは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに対する免疫応答を増大するか又は刺激するのに十分なＴｈエピトープの隣接する（contiguous）部分を有する。
【００４８】
本発明のＴｈエピトープには、表１（配列番号１〜２１）に例示するものを含むが、これらに限定されない外来病原体由来のものが含まれる。また、Ｔｈエピトープとして、ＷＯ９９／６６９５７に開示され且つ配列番号２２〜６４として本願の表２にリストアップした理想化人工Ｔｈ及び人工理想化組合せＴｈが含まれる。組合せＴｈを有するペプチドは、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント、Ａ及びＢ、と共に、単一の固相ペプチド合成で同時に産生される。Ｔｈエピトープは、Ｔｈ刺激機能が本質的に修飾されない限り、１〜１０のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を有する、その免疫学的機能性類似体も含む。
【００４９】
本発明の合成ペプチドにおいて、Ｔｈエピトープは、スペーサＢを介して、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント又はその免疫学的機能性類似体のＮ末端又はＣ末端のいずれかと共有結合する。Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントの免疫学的機能性類似体は、Ａβ１−４２ペプチドとの交差反応である免疫応答が導き出される限り、１〜約４個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含むことができる。保存的置換、付加、及び挿入は、上述した天然又は非天然アミノ酸で達成することができる。
【００５０】
本発明の好ましいペプチド免疫原は、配列番号６６〜６９又はその免疫学的機能性類似体；スペーサ（例えばＧｌｙ−Ｇｌｙ、ε−Ｌｙｓ）；ＨＢｓ Ｔｈ（配列番号１）；ＨＢｃ Ｔｈ（配列番号２０）；ＭＶＦ Ｔｈ（配列番号８，９）；ＰＴ Ｔｈ（配列番号４，５，７）；ＴＴ Ｔｈ（配列番号３，４，６）；ＣＴ Ｔｈ（配列番号１２，２１）；ＤＴ Ｔｈ（配列番号１３，１４）；配列番号３８〜４０、４７〜５１からなる群から選ばれる、ＭＶＦ Ｔｈ由来人工Ｔｈ；配列番号５２〜５４からなる群から選ばれる、ＨＢＶ Ｔｈ由来人工Ｔｈ；からなる群から選ばれるＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントを有するものである。表１及び２を参照のこと。
【００５１】
２つ又はそれ以上のＴｈエピトープとの本題のペプチド免疫原のカクテルを含むペプチド組成物は、広い種（population）において免疫効験（immunoefficacy）を増大させることができ、これによりＡβ１−４２ペプチド及びそのフラグメントへの免疫応答をもたらすことができる。
【００５２】
本発明のペプチド免疫原は、当業者によく知られている化学合成法により製造することができる。例えば、フィールズ（Fields）ら、合成ペプチド：ユーザーズガイド（Synthetic Peptides: A User’s Guide）の第３章（Grant, W. H. Freeman & Co.編、New York, NY, 1992, p. 77）を参照のこと。したがって、ペプチドは、例えば、アプライド・バイオシステム・ペプチド合成器 モデル４３０Ａ又は４３１上で、側鎖を保護したアミノ酸を用いるｔ−Ｂｏｃ又はＦ−ｍｏｃ化学によりα−ＮＨ２保護化固相合成の自動メリーフィールド法を用いて合成することができる。Ｔｈエピトープのための組合せライブラリーペプチドを有するペプチド構築物の調製は、ある変化させる位置で、カップリングのための代替アミノ酸の混合物を提供することにより達成することができる。所望のペプチド免疫原の集合体の完成後、レジンを標準手続きにしたがって処理し、レジンからペプチドを切断し、アミノ酸側鎖の機能性基を脱保護する。フリーのペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、生化学的、例えばアミノ酸分析又は配列決定によって同定される。ペプチドの精製法及び同定法は、当業者によく知られている。
【００５３】
本発明の免疫原も、分岐鎖ポリ−リシル核レジンに直接所望のペプチド構築物を合成することにより、分岐鎖ポリマーとして調製することができる（ワン（Wang）ら、Science, 1991; 254: 285-288）。
【００５４】
また、長鎖の合成ペプチド免疫原は、既知の組替えＤＮＡ技術により合成することができる。そのような技術は、詳細なプロトコールと共に既知の標準マニュアルに提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードする核酸配列、好ましくは遺伝子が発現される有機体に最適であるコドンと共に該核酸配列を得る。次いで、典型的には、ペプチド、及び、必要ならば制限要素をコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子を産生する。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、ホスト細胞にトランスフェクトする。その後、選択された発現系及びホストにふさわしい適切な条件下で、ペプチドを発現する。ペプチドは、標準の方法により精製及び同定される。
【００５５】
本発明のペプチド組成物の効験は、本発明のペプチドを含有する免疫原組成物を動物、例えばモルモットに注入することによって確認することができる。表４、配列番号７０〜７５を参照のこと。Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント及び可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対する体液免疫応答をモニターする。用いた作業の詳細は、後述の実施例に提供する。
【００５６】
本発明の他の面は、医薬上許容可能な配送系で、１種又はそれ以上の本発明のペプチド免疫原を免疫学上有効量で含有するペプチド組成物を提供する。したがって、対象となるペプチド組成物は、ワクチンの処方に通常用いられる、医薬上許容可能なアジュバント、キャリヤ又は他の成分を用いるワクチンとして配合することができる。本発明において用いることができる成分として、ミョウバン（alum）、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０並びに他の有効なアジュバント及び乳化剤がある。組成物は、速放性（immediate release）又は徐放性（sustained release）のいずれに対しても配合することができる。組成物は、全身性免疫の誘導のため、例えば、微粒子での捕捉（entrapment）又は共投与によって、配合することもできる。そのような配合物は、当業者にとって簡単に利用可能である。
【００５７】
本発明の免疫原は、皮下、経口、筋内、非経口又は腸内経路などの従来の経路のいかなるものによっても投与することができる。免疫原は、単一の投与量であっても多投与量であっても投与することができる。好適な免疫スケジュールは、当業者にとって即座に決定でき、利用可能である。
【００５８】
本発明のペプチド組成物は、１種又はそれ以上の本発明のペプチド免疫原を有効量、及び医薬上利用可能なキャリアを有する。好適な投与単位形態内のこのような組成物は一般に、体重１ｋｇ当たり免疫原を約０．２５μｇ〜約５００μｇ含む。多投与量で配送されるとき、有効量は、投与単位で分けるのが都合よい。例えば、ペプチド免疫原を体重１ｋｇ当たりのペプチド免疫原の初期投与量を例えば０．００２５〜０．５ｍｇ；好ましくは１〜５０μｇで、注射、好ましくは筋内注射で、投与され、同投与量を追加投与すべきである（booster）。投与量は、ワクチン及び治療術において知られているように、患者の年齢、体重及び一般的な健康状態に依存する。
【００５９】
合成Ａβ１−４２ペプチド免疫原の免疫応答は、オヘイガン（O’Hagan）ら（Vaccine, 1991; 9: 768-771）に記載される、あるタイプの生分解性微粒子内又はその上での捕捉を介する配送により証明することができる。免疫原は、生分解性微粒子内のアジュバントと共に又はそれなしでカプセル化することができ、免疫応答を潜在化させ、持続性応答又は周期的な応答のための、及び経口投与のための、時間制御した放出を提供することができる。
【００６０】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。本発明の範囲は、提供される特定のペプチド免疫原及び組成物に限定されない。実施例は、本発明のペプチド免疫原が、Ａβ１−１０フラグメント及びＡβ１−４２フラグメントの双方に対する部位配向性抗体、並びに初期免疫化から４週間と同じほど早くに可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対する交差反応性抗体を導き出すのに有用であることを例証する。
【実施例１】
【００６１】
本発明のＡβペプチド免疫原を合成する典型的な方法
表４（配列番号７０〜７６）にリストアップしたペプチド免疫原を、Ｆｍｏｃ化学物質を用いる、アプライド・バイオシステム・自動ペプチドシンセサイザー（モデル４３０、４３１及び４３３Ａ）によるメリーフィールド固相合成技術により個々に合成した。組合せライブラリーＴｈ、即ちＭｖＦ由来Ｔｈ１−８（配列番号３８〜４０）などの理想化人工Ｔｈ部位を有するペプチド免疫原の調製は、設計において特定したある位置で化学結合させるための所望のアミノ酸の混合物を提供することにより、達成できる。所望のペプチドの集合体の完成後、トリフルオロ酢酸を用いる標準的な方法によりレジンを処理し、レジンからペプチドを切り出し、アミノ酸の側鎖の保護基を脱保護する。切り出され、抽出され、洗浄されたペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、質量分析器及び逆相ＨＰＬＣにより同定された。
【実施例２】
【００６２】
本発明のＡβペプチド免疫原の免疫原性の評価
Ａβ由来ペプチド免疫原を、以下に概説する免疫化プロトコール実験及び免疫原性の測定のための血清学アッセイによって特定されるモルモットのグループに基づいて評価した。
標準実験設計：
免疫原：（１）個々のペプチド免疫原；又は
（２）各実施例で特定されるペプチド免疫原の等モル量の混合物。
投与量：特記しない限り免疫化にあたり０．５ｍＬ中に１００μｇ。
経路：特記しない限り、筋内。
アジュバント：特記しない限り、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）／フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；又は油中水滴型エマルション。ＣＦＡ／ＩＦＡ群は、０週目にＣＦＡ、次週にＩＦＡを受けた。
投与スケジュール：０週、３週間、６週間、または特記する。
採血スケジュール：０週、５週間、８週間、または特記する。
種：ダンカン−ハートリー（Duncan-Hartley）・モルモット、又は特記する。
アッセイ：各免疫血清の抗ペプチド活性に対して特定のＥＬＩＳＡ。固相基質はＡβペプチドフラグメント、例えばＡβ１−１４又は完全長Ａβ１−４２（配列番号６７及び６５）であった。血液を収集し、血清に処理し、ターゲットペプチドでのＥＬＩＳＡ前に貯蔵した。
【００６３】
Ａβペプチド及び可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対して導き出された抗体の免疫活性を、イムノソルベントとしてＡβ１−４２ペプチドフラグメント、配列番号６７又は６５でコーティングした、９６ウエル平板マイクロタイタプレートを用いるＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）で求めた。濃度５μｇ／ｍＬのペプチド免疫原溶液の少量（１００μＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。３％ゼラチン／ＰＢＳ溶液で３７℃で１時間行う他のインキュベーションにより、プレートをブロック化した。その後、このブロック化プレートを乾燥し、アッセイに用いた。検査用免疫血清の少量（１００μＬ）を、まずは試料用希釈バッファで１：１００に希釈し、その後順次１０倍に希釈して、ペプチドでコーティングしたプレートに添加した。このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００６４】
このプレートを、０．０５％ＰＢＳ／ツゥイーン（Tween（商標））バッファで６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ・ラベル化ヒツジ抗種の特異性抗体１００μＬを適当な希釈度で、共役希釈バッファ（０．５Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸バッファ、及び正常ヒツジ血清）内に添加した。このプレートを、上述の洗浄前に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、o-フェニレンジアミン基質溶液を少量（１００μＬ）添加した。５〜１５分間、発色させ、その後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ添加して、酵素色反応を停止させた。各ウエルの内容物のＡ４９２ｎｍをプレートリーダーで読み込ませた。カットオフＡ４９２ｎｍを０．５に設定して、吸光度の線形回帰分析に基づいてＥＬＩＳＡ力価を計算した。選択したカットオフ値は、希釈化ノーマルコントロール試料が０．１５未満である値に対して厳密であった。
【実施例３】
【００６５】
部位配向性Ａβペプチド系合成ワクチンの最適設計のためのＡβ１−４２及びそのＮ末端フラグメントの相対免疫原性の同定
Ａβペプチドに対して高い親和性を有し且つ可溶性Ａβ１−４２ペプチド及びＡＤ患者の脳内のプラークに高い交差反応性を有する抗体を高レベルで生成する全体的な合成ワクチンを設計するために、Ａβ１−４２及びそのＮ末端フラグメントの相対免疫原性をまず最初に同定した。Ａβ１−４２ペプチド内の種々の領域の相対免疫原性特性を測定するために、ヒト用に適した緩和アジュバント、ミョウバン（Alum）を初期の研究に用いた。Ａβ１−４２ペプチド及びそのＮ末端フラグメント、Ａβ１−２８の相対免疫原性を比較した。免疫原性の評価は、実施例２に記載した手順にしたがって行った。意外にも、Ａβ１−２８は、Ａβ１−４２ペプチドよりもより免疫原性であることがわかり、Ｃ末端Ａβ２９−４２内に免疫抑制があることを示唆している（表５）。
【００６６】
次に、Ａβ１−２８の免疫原性を、Ａβ１−４２のより短鎖のＮ末端フラグメントであるＡβ１−１４と比較した。ワクチンを配合する油中水滴型エマルションの調製に、ヒト用に適する、より潜在的なアジュバントを用いた。表６に示すように、得られたデータに基づいて、３つのＡβペプチド（即ち、Ａβ１−１４、Ａβ１−２８及びＡβ１−４２）の相対免疫原性は、Ａβ１−２８＞Ａβ１−４２＞Ａβ１−１４とランク付けされた。驚くことに、Ａβ１−４２からＣ末端側の１４量体が欠損することは、免疫原性を減少させるよりもむしろ、向上させた。Ａβに対する抗体応答は、ＥＬＩＳＡデータ（表６）が示すように、Ｎ末端領域、特にＡβ１−１４ Ｎ末端フラグメントに主に向けられている。しかしながら、Ａβ１−２８フラグメントのＣ末端をさらに短くしてＡβ１−１４フラグメントを形成すると、免疫原性が落ちる結果となった。
【００６７】
この短鎖Ａβ１−１４フラグメントは、ソロモン（Solomon）らによって報告されるように、Ａβ１−４２ペプチドの位置３〜６に位置する、主要な機能性／制限部位、ＥＦＲＨを含む。このエピトープを抗体によってブロック化することにより、凝集体の動向（dynamics）及び既に形成された凝集体の再溶解が調節される（ソロマン（Soloman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Acad. Sci., 1997; 94: 4109-4112）。抗Ａβ１−２８及びＡβ１−４２抗体の多くは、このエピトープを含むＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに向けられている（表６）。しかしながら、Ａβ１−１４フラグメントはそれ自身、免疫原性が低い。この実験結果から、Ａβ１５−２８セグメント内の内因性Ｔｈエピトープの存在が示唆される。この内因性Ｔｈエピトープにより、モルモットでのＡβ１−２８及びＡβ１−４２ペプチドの控えめな免疫原性が説明される。
【００６８】
Ａβ１５−２８フラグメントにＴｈエピトープが存在することは望ましい。しかしながら、限定されたヒトＭＨＣ分子、適切な投与量及びヒト用に許されるアジュバントのタイプの制限に直面したとき、成功を収めるヒトワクチンのためのより潜在的な免疫原を設計できることが望ましい。したがって、我々は、ＨＢＶ Ｔｈ（配列番号１）由来のＴｈなどの外来又は外因性ＴｈをＡβ１−２８ペプチド（配列番号６６）のＣ末端に結合することを試みた。表６に示すように、外因性Ｔｈエピトープにより、Ａβ１−２８フラグメントの免疫原性が著しく向上した。Ａβ１−２８フラグメントで工学設計した免疫原への抗体応答は、ペプチド免疫原（配列番号７０）の機能性Ｎ末端に向けたままであった。このことは、この構築物が、Ａβ１−２８フラグメント又はＡβ１−２８フラグメントのみよりも、よりよい免疫原であることを示す。このペプチド免疫原（配列番号７０）は、次の式を有するペプチド免疫原である。
（Ａ）ｎ（ＡβペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ。
ここで、ＡはαＮＨ２であり、Ａβ１−２８はＡβ１−４２のＮ末端フラグメントであり；Ｂはグリシンであり；Ｔｈは外来病原体、ＨＢｓＡｇ Ｔｈ（配列番号１）由来のヘルパーＴ細胞エピトープであり、ｎは１であり、ｍは１であり、かつｏは２である。
【実施例４】
【００６９】
ＡＤ用Ａβ系合成ワクチン開発のためのＡβの最低限のＮ末端フラグメント
ＥＦＲＨ残基を有する主要な機能性／調節部位はＡβ１−４２ペプチドの位置３〜６に位置する（ソロマン（Soloman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 1996; 93: 452-455；Proc. Natl. Acad. Sci., 1997; 94: 4109-4112）ので、本発明の合成免疫原へと含めるためのＡβの最適なＢ細胞ターゲット部位として、Ａβ１−４２ペプチドの最短のＮ末端フラグメントを探索することは有用である。
【００７０】
Ａβの短鎖非免疫原性Ｎ末端フラグメントのいくつか、即ちＡβ１−２８と共にＡβ１−１０、Ａβ１−１２、Ａβ１−１４、の各々を、代表的な理想化人工Ｔｈ（配列番号５１）として設計された免疫原に含めた。結合は、εＮ−Ｌｙｓスペーサを介した。短鎖Ａβフラグメントは低免疫原性であると予想されたので、工学設計構築物を強アジュバントと共に配合した。３つの合成構築物を、フロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバント中に配合し、実施例２に記載する手順に基づいてその免疫原性を検査した。表７に示すように、４つのペプチド免疫原はすべて、Ｌｏｇ１０ＥＬＩＳＡ力価が４．３〜５．６（即ち１０４．３〜１０５．６）の範囲であり且つ初期免疫化後４週間しか経っていないのに完全長Ａβ１−４２ペプチドに対して高交差反応性である高免疫原性であった。より重要なことは、各々が理想化人工Ｔｈ（配列番号５１）と結合したＡβ１−１０、Ａβ１−１２及びＡβ１−１４と同じほど短いフラグメントは、開示する人工Ｔｈエピトープ（表７）との結合後、免疫原性が高いことがわかった。これらのペプチド免疫原は、次の式にしたがって設計されていた。
（Ａ）ｎ−（ＡβペプチドのＮ末端フラグメント）−（Ｂ）ｏ−（Ｔｈ）ｍ。
ここで、ＡはαＮＨ２であり、Ｎ末端フラグメントはＡβ１−１０、Ａβ１−１２、Ａβ１−１４又はＡβ１−２８であり；Ｂは、イプシロンアミノ基を介して次のアミノ酸と結合するスペーサであるεＮリジンであり；Ｔｈは理想化人工Ｔｈ、ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）由来のヘルパーＴ細胞エピトープであり、ｎは１であり、ｍは１であり、かつｏは１である。
【００７１】
ＡβのＮ末端フラグメントの長さを１０量体未満までさらに短くすると、より限定された免疫原性、即ち不所望な免疫原性が得られる結果となることがわかった。１０アミノ酸より短いペプチドは、ＩＩ属ＭＨＣ分子による受容体認識には問題があるようである（免疫学（Immunology）、第５版、ロイト（Roitt）ら編、Mosby International Ltd., London, pp88-89）。
【００７２】
Ａβの本研究に基づき、Ａβ１−４２由来の有用なＢ細胞部位は、その大きさが約１０〜約２８の残基の範囲であるべきである。
【実施例５】
【００７３】
人工Ｔｈエピトープに結合した合成ペプチド免疫原によってターゲットとされる部位配向性免疫反応性
ＡβペプチドのＡβ１−１４などの非免疫原性Ｎ末端フラグメントを、εＮリジンスペーサを介してＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）と名付けた人工Ｔｈペプチドに結合するか、又は標準の化学カップリング手順を介して従来のキャリアタンパク質ＫＬＨに結合した。２つの免疫原性構築物を、実施例２に記載する手順にしたがって、モルモットにおいて、Ａβペプチドに対する相対的『部位配向性』免疫原性、及び各キャリア、即ち人工Ｔｈエピトープ又はＫＬＨキャリアタンパク質、に対する抗体の得られた各反応性に関して評価した。コントロール免疫原として短鎖Ａβ１−１４ペプチドのみ、及び２つの免疫原性構築物を、アジュバントＩＳＡ５１を含む油中水滴型エマルションに配合した。なお、この配合はヒト用に適する。表８に示すように、Ｎ末端Ａβ１−１４フラグメントは、予想通り、それ自身、非免疫原性であった。Ａβ１−１４フラグメント及び人工Ｔｈを含む合成免疫原（配列番号７３）は、Ａβ１−１４に対する部位配向性抗体を導き出す高免疫原性であることがわかった。この抗体は、初期免疫化後４週間と同じ時期に、可溶性Ａβ１−４２ペプチドに対して高交差反応性（初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ４．０９４及び４．１２６）であることがわかった。これらのＡβ反応性が高力価である免疫血清を、ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号５１）でコーティングしたプレート上でＥＬＩＳＡにより検査すると、これらはネガティブ（初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ０．０３８及び０．０６４）であることがわかった。これは、関連しない抗体が産生されていないことを示す。表８に示すように、得られたデータから、本発明のペプチド免疫原の部位配向特性に関する高い特異性が例証された。
【００７４】
キャリアタンパク質ＫＬＨを有する免疫原は、従来のペプチド−キャリア共役物と高い免疫活性（例えば初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ４．９０３及び５．０１８）を有することがわかった。しかしながら、導き出された抗体は、可溶性Ａβ１−４２ペプチドとの交差反応性は控えめでしかない（例えば初期免疫化後、４週間及び６週間に対してＬｏｇ１０力価がそれぞれ３．３４２及び２．７３６）ことがわかった。これは、配列番号７３よりも約１０倍〜１００倍低い。意外にも、本発明のペプチド免疫原は、部位配向性が高く、注目された。関連しないキャリア部位に向けたものよりもむしろ、ＡβペプチドのＮ末端フラグメント上での抗凝集及び離解（disaggregation）に向けた機能的に重要な抗体が生成された。
【実施例６】
【００７５】
老人性プラークへの交差反応性によるＡβペプチド免疫原の評価
モルモット及びヒヒでＡβペプチド免疫原に対して発生した免疫血清の、ポリマー状老人性プラークへの交差反応性に関する評価のために、プラーク及びもつれ及びアミロイドプラークを含むチロフラビンＳ陽性血管（ＴＳＢＶ）のＡＤ患者の脳を用いた。プラーク及びＴＳＢＶ反応性を、アビジン−ビオチン化抗体複合体（ＡＢＣ）法を用いる免疫ペルオキシダーゼ染色法、又は特異性抗ＩｇＧ種のローダミン接合化Ｆａｂフラグメントを用いる免疫フルオレセンス染色法により検出した。モルモットの血清はすべて、力価の最終点をいくつかの試料で決定して、１：１００の希釈度で検査した。ヒヒの血清はすべて、１：５０の希釈度で検査した。免疫血清及び予備免疫血清の評価は、記載されるガスキン博士（ガスキン（Gaskin）ら、J. Exp. Med. 165: 245, 1987）のコードの下、行った。
【００７６】
図１において、２人のＡＤ患者からの脳の連続断面図を、まず１０倍の倍率で検査した。断面図（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はＡＤ脳１からであり、断面図（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）はＡＤ脳２からである。初期免疫化後６週目で収集したモルモットからの予備免疫血清及び免疫血清を、プラーク及び神経フィラメントもつれが多いＡＤ側頭皮質からのクリオスタット（cryostat）断面で免疫ペルオキシダーゼ染色法により検査した。図１ａ及び１ｂのスライドで示す最初の研究に用いた免疫血清は、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭｖＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化した動物から得た。これらの結果から、チロフラビンＳ陽性血管（ＴＳＢＶ）の老人性プラーク及びアミロイドプラークの双方に著しく結合することがわかる。ＣＦＡ／ＩＣＦＡで調製した当量の免疫原に対して生じる免疫血清の交差反応性は、図１ｂ及び１ｄのスライドで示される。意外にも、ＩＳＡ５１で配合したワクチンで得た結果と比較して、血管（ＴＳＢＶ）のＡβ１−２８プラークへの優先的な結合は、ＣＦＡ／ＩＣＦＡワクチンに対して生じる血清について観察された。これは、ＩＳＡ５１で配合したワクチンによって導き出される抗体が、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中で配合されるワクチンによって生じる抗体と区別可能であることを意味する。また、本発明にしたがって配合したワクチンによって生成される抗体は、脳組織内の老人性プラークに対して所望の交差反応性を有する抗体を提供した。予備免疫血清は、図１ｃ及び１ｆのスライドに示す、相当する連続断面図において、染色が観察されなかった。
【００７７】
さらに、希釈度１：１００の予備免疫血清及び免疫血清でのＡＤ脳１の連続断面図の免疫ペルオキシダーゼ染色を、４０倍の倍率で、図２ａ〜２ｅに示す。ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化した動物から得た血清は、図２ａ及び２ｄのスライドに示すように、核のパターンを形成するプラークを強く染色した。また、驚くべきことに、対応するＣＦＡ／ＩＣＦＡ配合物に対して調製した免疫血清での染色は、プラークとの反応性において異なる染色パターンを呈した。脳組織におけるプラークよりもむしろ、図２ｂに示す血管において支配的であった。予備免疫血清は、図２ｃに示すように、断面図を染色しなかった。ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中のＡβ１−４２ペプチドのみで免疫化によって生成した超免疫血清は、ＥＬＩＳＡによるＡβ１−２８との反応性は強かったにも関わらず、図２ｅに示す断面図において、驚くべき程に弱い染色パターンしか呈しなかった。
【００７８】
実施例３、４及び５に記載した種々のワクチン配合物で免疫化したモルモットから得た１１種の集めた免疫血清及び予備免疫血清で、ＡＤ脳組織の同様の免疫染色を行った。これらの血清はまた、Ａβ１−１４ＥＬＩＳＡによる機能性部位での抗体反応性、及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡによる可溶性Ａβ１−４２での抗体反応性を評価した（表９）。一般に、３つのアッセイすべてにおいて検査した血清で、並行的な傾向が見られた。表９に示すように、予備免疫血清及びＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中に配合した短鎖ペプチドＡβ１−１４のみに対して生ずる血清の抗ペプチド反応性は低く、プラークへの交差反応性は、無視できるものであった。控えめな反応性が、ミョウバン（Alum）及びＩＳＡ５１中に配合したＡβ１−２８ペプチドのみ、並びにＫＬＭに共役したＡβ１−１４及びＩＳＡ中に配合したＡβ１−１４でワクチン化した動物からの血清に観察された。一方、機能性Ａβ１−１４部位、可溶性Ａβ、及びＡＤ患者の脳組織断面図中のプラーク及びＴＳＢＶへの著しい部位配向性反応性が、本発明の合成Ａβ／Ｔｈ免疫原で免疫化した動物由来の血清で観察された。したがって、これらの研究から得た結果から、外来Ｔｈエピトープに結合する、アミノ酸を１〜２８個から約１〜１０個有するＡβ１−４２のＮ末端フラグメントを有するペプチド免疫原の優れた免疫原性及び有用な免疫原性が例証された。また、この結果から、外来Ｔｈエピトープが存在することにより本発明のペプチド免疫原の免疫原性を驚くべき程度にまで向上させることがわかった。ヒトへの利用が許容可能である臨床上許容可能なワクチン配合物における本発明のペプチド免疫原は、ＡＤ患者の脳組織内の老人性プラークに対して所望の交差反応性を有する抗体を発生した。
【実施例７】
【００７９】
ＡＤへの免疫治療上の効験の予想としてのヒヒにおける代表的なＡβペプチドワクチンの免疫原性
ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルションに、２５μｇ／０．５ｍＬ、１００μｇ／０．５ｍＬ及び４００μｇ／０．５ｍＬの投与量で配合した、代表的な合成免疫原、Ａβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）を、３匹のヒヒ、Ｙ２９９、Ｘ３９８、Ｘ１１９８に、初期免疫化から０週、３週目及び６週目のスケジュールで与えた。初期免疫後５週目及び８週目（ｗｐｉ）での予備免疫血清及び血清を収集した。比較のために、ミョウバン（Alum）、ヒト用に認可されている標準アジュバント、に配合したフリーのペプチドＡβ１−２８及びＡβ１−４２の等モル混合物を１００μｇ／０．５ｍＬの投与量で４匹目のヒヒ、Ｘ７９８に与えた。予備免疫血清を、ネガティブコントロールとして用いた。
【００８０】
４匹の免疫化動物すべてからの血清を収集し、（０、５及び８ｗｐｉで収集した血清について）Ａβ１−１４ＥＬＩＳＡによる機能性部位との抗体反応性、及びＡβ１−４２ＥＬＩＳＡによる可溶性Ａβ１−４２との反応性について評価した。老人性プラーク及びチオフラビンＳ陽性血管中のプラークとの抗血清（８ｗｐｉのみ）の交差反応性を、実施例６に記載したように、免疫染色法により評価した。抗ヒヒＩｇを用いる代わりに、用いた抗体検知器は、ヒトのすべてのアイソタイプを認識し且つヒヒＩｇＧと交差反応性である抗ヒトＩｇＧからのＦａｂフラグメントであった。
【００８１】
３種のアッセイすべてにおいて検査した血清で、再度、並行的な傾向が観察された。表１０に示すように、予備免疫血清は陰性であった。ミョウバン（Alum）に配合したＡβ１−２８及びＡβ１−４２でワクチン化した動物Ｘ７９８からの血清との控えめなＥＬＩＳＡ反応性が観察された。しかしながら、この血清の反応性は、老人性プラークの認識のためには弱かった。比較するに、Ａβ１−１４の機能性部位、可溶性Ａβ１−４２、及びＡＤ患者の脳断面におけるプラーク及びＴＳＢＶに対する、著しい部位配向性の反応性が、１００μｇ／０．５ｍＬ及び４００μｇ／０．５ｍＬの双方の投与量でＩＳＡ５１で配合した、本発明の代表的な組成物（配列番号７４）で免疫化した動物の初期免疫化から８週目で収集した血清に観察された。したがって、このヒヒでの研究から得た結果から、ヒトに適切なワクチン配合物での本発明の免疫原の有用性が例証された。免疫原性の向上（Ａβの機能性部位に対して特定の抗体力価において１０〜１００倍の増大）は、ヒトのそれに非常に類似するヒヒの免疫応答性を有する従来技術のペプチドワクチンと比較して、非常に著しい。
【００８２】
同様に、２〜３種の本発明の合成免疫原を含む混合物を、投与当たり約２５〜１０００μｇでのワクチンへの配合物に用いて、ＡＤの予防及び処置において遺伝学上縮退したヒトの母集団に機能性抗Ａβ１−１４抗体を導くことができる。広いＭＨＣ認識を達成するのに提供される本発明のペプチド免疫原の乱雑なＴｈエピトープの存在により、ヒトにおける広い免疫原性が予想される。
【００８３】
【表１】
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】
【表６】
【００８９】
【表７】
【００９０】
【表８】
【００９１】
【表９】
【００９２】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【００９３】
図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ及び１ｆは、希釈度１：１００での免疫血清及び予備免疫血清での倍率１０×での、アビジン−ビオチン化抗体複合体（ＡＢＣ）法を用いた、２つのＡＤ脳からの連続断面の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す写真である。図１ａ、及び１ｄは、チオフラビンＳ陽性血管（『ＢＶ』とラベル）上、抗体が老人性プラーク及びＡβプラークの双方（共に『Ｐ』とラベル）に著しく結合することを示す。この抗体は、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）を用いるモルモット中で生成した。図１ｂ及び１ｅは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中の同一のペプチド免疫原に対して生じた抗体の交差反応性を示す。図１ｃ及び１ｆは、予備免疫血清を用いる脳断面を示す。
【００９４】
図２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅは、希釈度１：１００での免疫血清及び予備免疫血清での倍率４０×での、ＡＤ脳の連続断面の免疫ペルオキシダーゼ染色を示す写真である。図２ａ及び２ｄは、ＩＳＡ５１の油中水滴型エマルション中で調製したＡβ１−２８−εＫ−ＭＶＦ Ｔｈ１−１６（配列番号７４）で免疫化したモルモット中の抗体が、核のパターンを形成するプラーク（Ｐ）を強く染色したことを示す。図２ｂは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ配合物中の同一の免疫原を用いるＡＤモルモット脳の染色パターンの写真である。この抗血清は、血管（ＢＶ）上のプラークと支配的に反応した。図２ｃは、予備免疫血清でのモルモットの脳断面の写真であり、染色がないことを示している。図２ｅは、ＣＦＡ／ＩＣＦＡ中でＡβ１−２８ペプチドのみで免疫化することにより生成した超免疫での脳断面を示す。ＥＬＩＳＡによるＡβ１−２８で強い反応性を示したにも関わらず、驚くべき程弱い染色しか観察されない。
【図１】
【図２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)ＭＶＦ Ｔｈ１（配列番号２２）及び配列番号２３〜５０からなる群から選ばれるその類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）；
(ii) １０〜２８個のアミノ酸残基からなるアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２ペプチド（（配列番号６５））のＮ末端フラグメントであって、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのアミノ酸残基１を有するＮ末端フラグメント；を有し、且つ
(iii)免疫原性の領域を分離する、少なくとも１つのアミノ酸からなるスペーサを任意に有する、ペプチド免疫原。
【請求項２】
スペーサがアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる請求項１記載のペプチド免疫原。
【請求項３】
スペーサがＧｌｙ−Ｇｌｙである請求項２記載のペプチド免疫原。
【請求項４】
スペーサがε-Ｎ−Ｌｙｓである請求項２記載のペプチド免疫原。
【請求項５】
Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントが配列番号６６〜６９からなる群から選ばれる請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド免疫原。
【請求項６】
式（Ａ）ｎ−（アミロイドβペプチド（Ａβ１−４２ペプチド（（配列番号６５））のＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ；又は式（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｂｏ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｘのうちの１つで表されるペプチド免疫原であって、
各Ａは独立にアミノ酸であり；
各Ｂはアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる結合基であり；
Ｔｈは、ＭＶＦ Ｔｈ１（配列番号２２）及び配列番号２３〜５０からなる群から選ばれるその類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープを構成するアミノ酸配列を有し、；
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、１０個から２８個のアミノ酸残基であり、各フラグメントはＡβ１−４２ペプチドのＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（ＥＦＲＨ）を有し；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨ又はα―ＣＯＮＨ２であり；
ｎは０〜１０であり、ｍは１〜４であり、ｏは０〜１０である、上記ペプチド免疫原。
【請求項７】
スペーサがＧｌｙ−Ｇｌｙである請求項６記載のペプチド免疫原。
【請求項８】
スペーサがε-Ｎ−Ｌｙｓである請求項６記載のペプチド免疫原。
【請求項９】
Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントが、配列番号６６〜６９からなる群から選ばれる請求項６〜８のいずれか１項記載のペプチド免疫原。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のペプチド免疫原並びにミョウバン、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（monophosphyryl lipid A）（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０からなる群から選ばれる製薬上許容可能なアジュバント及び／又はキャリアを有する組成物。
【請求項１】
(i)ＭＶＦ Ｔｈ１（配列番号２２）及び配列番号２３〜５０からなる群から選ばれるその類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）；
(ii) １０〜２８個のアミノ酸残基からなるアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２ペプチド（（配列番号６５））のＮ末端フラグメントであって、各フラグメントがＡβ１−４２ペプチドのアミノ酸残基１を有するＮ末端フラグメント；を有し、且つ
(iii)免疫原性の領域を分離する、少なくとも１つのアミノ酸からなるスペーサを任意に有する、ペプチド免疫原。
【請求項２】
スペーサがアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる請求項１記載のペプチド免疫原。
【請求項３】
スペーサがＧｌｙ−Ｇｌｙである請求項２記載のペプチド免疫原。
【請求項４】
スペーサがε-Ｎ−Ｌｙｓである請求項２記載のペプチド免疫原。
【請求項５】
Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントが配列番号６６〜６９からなる群から選ばれる請求項１〜４のいずれか１項記載のペプチド免疫原。
【請求項６】
式（Ａ）ｎ−（アミロイドβペプチド（Ａβ１−４２ペプチド（（配列番号６５））のＮ末端フラグメント）−Ｂｏ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ；又は式（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｂｏ−（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−Ｘのうちの１つで表されるペプチド免疫原であって、
各Ａは独立にアミノ酸であり；
各Ｂはアミノ酸、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、（α，ε-Ｎ）−Ｌｙｓ、及びＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号７３）からなる群から選ばれる結合基であり；
Ｔｈは、ＭＶＦ Ｔｈ１（配列番号２２）及び配列番号２３〜５０からなる群から選ばれるその類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープを構成するアミノ酸配列を有し、；
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、１０個から２８個のアミノ酸残基であり、各フラグメントはＡβ１−４２ペプチドのＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ（ＥＦＲＨ）を有し；
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨ又はα―ＣＯＮＨ２であり；
ｎは０〜１０であり、ｍは１〜４であり、ｏは０〜１０である、上記ペプチド免疫原。
【請求項７】
スペーサがＧｌｙ−Ｇｌｙである請求項６記載のペプチド免疫原。
【請求項８】
スペーサがε-Ｎ−Ｌｙｓである請求項６記載のペプチド免疫原。
【請求項９】
Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントが、配列番号６６〜６９からなる群から選ばれる請求項６〜８のいずれか１項記載のペプチド免疫原。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のペプチド免疫原並びにミョウバン、リポシン（liposyn）、サポニン（saponin）、スクアレン、Ｌ１２１、エマルジゲン（emulsigen）・モノホスフィリル脂質Ａ（monophosphyryl lipid A）（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、モンタニド（Montanide）ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６及びＩＳＡ７２０からなる群から選ばれる製薬上許容可能なアジュバント及び／又はキャリアを有する組成物。
【公開番号】特開２００９−２２１２１３（Ｐ２００９−２２１２１３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２３６７０（Ｐ２００９−１２３６７０）
【出願日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【分割の表示】特願２００２−５９２８６３（Ｐ２００２−５９２８６３）の分割
【原出願日】平成１４年４月２日（２００２．４．２）
【出願人】（５９１０１５１４２）ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２２日（２００９．５．２２）
【分割の表示】特願２００２−５９２８６３（Ｐ２００２−５９２８６３）の分割
【原出願日】平成１４年４月２日（２００２．４．２）
【出願人】（５９１０１５１４２）ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド (3)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
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