アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法
【課題】擬陽性ないし擬陰性を低減し解析結果の信頼性を向上させたアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法の提供。
【解決手段】［（ａ）同一の複数のプローブ核酸セットに対し、標識された複数の試料核酸を１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程］［（ｂ）同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎの各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程］［（ｃ）Ｆ１とＦ２の比較値からＦ１とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程］［（ｄ）所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを比較し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程］を含むアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。ｎは３以上の整数。
【解決手段】［（ａ）同一の複数のプローブ核酸セットに対し、標識された複数の試料核酸を１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程］［（ｂ）同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎの各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程］［（ｃ）Ｆ１とＦ２の比較値からＦ１とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程］［（ｄ）所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを比較し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程］を含むアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。ｎは３以上の整数。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析結果から擬陽性等の影響を低減し解析結果の信頼性を向上させるアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＣＧＨ）法は、数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノムコピー数異常等のゲノム構造異常を短時間で検出する手段として知られている（例えば非特許文献１、２参照）。
アレイＣＧＨを用い遺伝疾患などの診断アレイの場合、病態に直結するコピー数異常を正確に診断することが必要になる。このため、標準となる核酸は、コピー数変化（ＣＮＶ）を有しないものであることが必要であり、まれなＣＮＶも含めて注意深い選択と確認を行う必要があり、煩雑で再検査を要求される場合が多かった。
また、全ゲノム解析用アレイを含めて、コピー数異常が検出されてきた場合、対象となるゲノムについて正常であることが証明された標準核酸の入手は非常に困難であるため、正常検体での解析例や公共データベースと照合するとともに、両親や同胞の検査を引き続き行い、擬陽性ないしは擬陰性であるのかｄｅ ｎｏｖｏのコピー数異常であるのかを確認するために何度も再検査する必要があった（例えば非特許文献１参照）。擬陽性ないしは擬陰性と判定された場合には再検査の必要が生じ、一回的に診断できない問題が生じていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】稲澤譲治ら編、「アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」、株式会社医薬ジャーナル社
【非特許文献２】井本逸勢、稲澤譲治「マイクロアレイ技術用いたＣＧＨ解析：ＣＧＨアレイ法」、細胞工学， Ｖｏｌ．２３， Ｎｏ．０３， ３５５−３６１， （２００４）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来技術の問題点に鑑み、本発明の目的は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させて再検査の必要がない核酸変異解析法、及びそのデータ処理を実行するプログラムを提供することにある。
また、本発明の目的は、前記核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
【０００６】
１．
（ａ）１つの核酸マイクロアレイ上に複数のスポットがあり、該複数のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化されている同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該ｎセットのプローブ核酸セットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程と、
（ｂ）前記ｎセットのプローブ核酸セットから選ばれた、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個の各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程と、
（ｃ）スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの各標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程と、を有し、
ｎは３以上の整数であり、前記試料核酸は検体核酸又は標準核酸であり、少なくとも前記Ｓ１は検体核酸であり、Ｘ１はＳ１を接触させたスポットである、
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。
【０００７】
２．
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも２種が検体核酸である上記１に記載の核酸変異解析法。
３．
（ｃ’）Ｆ２とＦ１の比較値からＦ２とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ’）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ’）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ２を陽性と判断する工程と、を更に有し、前記スポットＸ２は前記Ｓ１とは異なる試料核酸Ｓ２と接触させたスポットである、上記１又は２に記載の核酸変異解析法。
４．
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも１種が標準核酸である上記１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
５．
前記ｎ種の試料核酸がすべて検体核酸である上記１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
６．
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸である上記１〜５のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【０００８】
７．
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイに備えられ、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
を有する、上記１〜６のいずれか一項に記載の核酸変異解析方法。
【０００９】
８．
前記各試料核酸がすべて同じ標識で標識されている上記１〜７のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
９．
前記工程（ｂ）における前記標識強度Ｆ１〜Ｆｎが補正された値である上記１〜８のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【００１０】
１０．
上記１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
１１．
上記１０に記載されたプログラムであって、手順（ｉ）が下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であるプログラム。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
１２．
上記１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸変異解析法は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。より詳細には、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法では擬陽性ないし擬陰性の影響により再検査の必要があった検体についても、本発明の核酸変異解析法は再検査の必要がない。
本発明のプログラムは前記核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するので、解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特にＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。
本発明の遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法は、前記核酸変異解析法を用いてなるので、擬陽性ないし擬陰性の影響を低減し診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は本発明の１つの実施態様の核酸変異解析法を示すフローチャートである。
【図２】図２は本発明の１つの実施態様の核酸変異解析法の１つの実施態様の一部を示す部分概略図である。
【図３】図３は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と標準であるｍａｌｅのゲノムＤＮＡの蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図４】図４は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．２の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図５】図５は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．３の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図６】図６は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．４の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本実施態様の核酸変異解析法は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による解析法であって、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含むものである。
図１及び２は本発明の核酸変異解析法の好ましい１つの実施形態を示す概略図である。なお、図１では工程（ｄ）で判断基準となるスポット数を半数とし、図２はｎが４の場合を例示しているが、本実施態様はこれらに制限されるものではない。
まず、工程（ａ）は、核酸マイクロアレイ上のｐ個以上のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化された同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該プローブ核酸セットの各々に対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸を各々１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる。以下、ｐは２以上の整数、ｎは３以上の整数である。
ついで、前記ｎセットのプローブ核酸セットの各々から選ばれた同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎ（スポットＸ１の標識強度Ｆ１、スポットＸ２の標識強度Ｆ２…スポットＸｎの標識強度Ｆｎ）を取得する（工程（ｂ））。
次に、Ｆ１とＦ２の比較値からＦ１とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する（工程（ｃ））。図２においては、工程３のＦ１とＦ２の比較値Ｃ２をＦ１／Ｆ２、Ｆ１とＦ３の比較値Ｃ３をＦ１／Ｆ３としているが、後述のように比較値の計算方法はこれに限定されない。
次に、前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と確定する（工程（ｄ））。
【００１４】
なお、ここでは任意のスポットＸ１に着目して説明しているが、その他のスポットに置き換えて行うことができ、試料核酸Ｓ１をハイブリダイズしたアレイ内のすべてのスポットを上記のＸ１に置き換えて解析を行うことが好ましい。
【００１５】
ここで、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法（以下、アレイＣＧＨ法ということもある）とは、核酸マイクロアレイ上で比較ゲノムハイブリダイゼーション法を行う方法をいい、例えば、稲澤譲治ら編、「アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」（株式会社医薬ジャーナル社）等に詳しく記載されている。
【００１６】
従来のアレイＣＧＨ法では、標準とする核酸と検体とで別種の標識化合物を用い、同一のスポットに同時にハイブリダイズさせる２色法を用いるものが知られていた。
２色法では、標準と検体を同時に同じアレイで同時に評価するが、標準とする核酸のＣＮＶが未知である場合、測定結果として現れる増減が、標準における増減か、或いは検体の影響における増減（いわゆる擬陽性・擬陰性）なのか見分けることが難しかった。このような問題を避けるため、２色法では、標準のＣＮＶを事前に確認することが行われていた。しかし、標準のＣＮＶが分かっていない場合には、標準のＣＮＶを評価するために多くのサンプル及び実験が必要であった。
これに対して本実施態様の方法は、検体とする核酸と対照となる核酸１種とを、互いに同種の核酸が固定化されている別個のスポットにおいて各々ハイブリダイスさせ、各々測定した値を比較するものである。しかしこの方法でもアレイ１に検体の核酸を添加し、アレイ２に対照とする検体の核酸を添加し、それぞれハイブリダイズさせ、同一のプローブ核酸が固定化されたスポットであるスポットＸ１とスポットＸ２における標識強度の比較を行うことで１個の比較値を得て、それに基づき陰陽の判断を行うと、特に対照がＣＮＶ（コピー数変化）を含んでいると、対照の影響による増減（いわゆる擬陽性・擬陰性）が生じ、再検査が必要になる場合や誤判定が生じる場合がある。
そこで、本実施態様においては、標識されたｎ種の試料核酸が用いられる。ｎは３以上の整数である。具体的には、ｎ種の試料核酸の中から１種を判断対象として着目し、残りのｎ−１種を対照として判断対象に関するｎ−１個の比較値を得て、比較値の陰陽について仮の判断を行う。ついで、ｎ−１個の仮の判断結果のうち、所定数以上が仮の陽性である場合に真の陽性と判断し、仮の陽性が所定数より少ない場合には真の陰性と判断する。
前記所定数としては、仮の判断結果総数の３０％〜７０％の間の個数を用いることが好ましく、４０％〜６０％の個数を用いることがより好ましい。
ここで、陽性・陰性とは、従来のアレイＣＧＨ法と同様であり、対象とするスポットに固定化されている核酸配列について、標準核酸と比較して検証核酸に多く存在する場合又は少なく存在する場合若しくは存在しない場合を陽性と呼び、同じ場合を陰性と呼ぶ。
【００１７】
一般に、あるスポットにおいて、検体核酸と対照となる核酸１種との比較で擬陽性ないしは擬陰性（以下、単に擬陽性等という）が発生する確率は、多くても１／１０程度であり、通常は１／１００以下である。よって対照となる核酸をｎ−１種用い、得られたｎ−１個の仮の判断結果のうち、所定数以上が仮の陽性である場合に、真の陽性と判断することにより、上記擬陽性等が発生する確率は大幅に低減される。
以上から本実施態様の核酸変異解析法により測定結果から擬陽性等を低減できる。
また、本実施態様においては上記発生率が極めて低くなることから標準核酸を用いないことも可能となる。
【００１８】
本実施態様に用いられる試料核酸の種類ｎは３以上であり、４以上であることが好ましい。
上述のようにｎは多いほど効果が高く、ｎの上限は制限されないが、データを迅速に得るため、及び計算を簡単にする観点からｎは１００以下であることが好ましい。ｎは４〜１００であることが最も好ましい。
【００１９】
以下、標識されたｎ種の試料核酸は、試料核酸Ｓ１、Ｓ２、…Ｓｎ−１、Ｓｎ（ｎは３以上の整数）とも表す。
なお、以下、スポット（Ｘ１）に着目し、スポット（Ｘ１）おける標識が陽性か否かの検証、即ちスポット（Ｘ１）に接触させた標識された試料核酸（Ｓ１）における核酸変異の有無についての検証として説明しているが、スポット（Ｘ１）は任意のスポットであり、通常、アレイ上のｐ個以上のスポット（ｐは２以上の整数）スポットに対して着目して本実施態様の方法を各々行い、好ましくはアレイ上のすべての試料核酸をハイブリダイズしたスポットについて着目して検証を行う。
また、試料核酸のうち、着目している核酸を判断対象とする核酸とし、比較する相手を対照とする核酸としているが、任意の試料核酸について着目し、判断対象とする核酸とすることができる。試料核酸の少なくとも２種が検体核酸であることが好ましい。即ち、前記Ｓ１とした核酸はｎ種の核酸から任意に選ぶことが可能であり、ｎ種の核酸に含まれる全ての検体核酸を順次Ｓ１として本実施態様を行うことで、信頼性の高い核酸変異解析を行うことができる。
試料核酸についての対応するスポット同士の標識強度を比較することで、複数の検体核酸についての真の陰陽性を判断することができる。
また、ハイブリダイゼーションを行う工程と、標識強度を取得する工程は、通常、アレイ上の全スポットに対して各々一度に行う。
なお、ハイブリダイゼーションした標識強度を予め取得してあるデータに関し、本実施態様の方法で検証を行うことも可能である。
【００２０】
・工程（ａ）
工程（ａ）においては、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種類ずつ接触させて、前記固定化された核酸に前記試料核酸をハイブリダイズさせる。
核酸マイクロアレイとは、固体基板上にプローブ核酸を高密度に結合させた物をいう。前記固体基板に用いる固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料など、プローブ核酸が結合可能な材料である限り特に制限はない。
本実施態様に用いられる前記核酸マイクロアレイとしては、ＢＡＣ−ＤＮＡアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。
なお、本実施態様の核酸変異解析法において、市販品の核酸マイクロアレイを使用してもよいし、通常の方法で作成したものを用いてもよい。
【００２１】
スポットとは、前記核酸マイクロアレイ上に複数存在する、プローブ核酸を多量に高い密度で固定化した領域をいう。
前記核酸マイクロアレイのスポット数はｐ個以上であれば特に制限はないが、一般に５個〜１００万個であることが好ましく、３００個〜５０００個であることが好ましい。
前記核酸マイクロアレイのスポットの配置は特に制限はなく、アレイを複数エリアもち、複数の試料核酸を１枚の基板上で測定できる多検体アレイ、複数のアレイを組み合わせ、多くのスポットを１枚の基板に再現したタイリングアレイなどが挙げられる。
【００２２】
プローブ核酸とは、核酸マイクロアレイの基板上に（好ましくはスポット状に複数個）固定化されている核酸であり、既知の配列を含む核酸であることが好ましい。
前記プローブ核酸の大きさは、１０塩基（ｂ）〜１０ｋｂであることが好ましく、５０ｂ〜５ｋｂであることがより好ましく、１００ｂ〜２ｋｂであることが更に好ましい。
「同一のプローブ核酸」とは、前記プローブ核酸に相補的な核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸をも含むものとする。
【００２３】
本実施態様では、同一のプローブ核酸が固定化されているｎ個のスポットにおいて各々別の試料核酸とハイブリダイズを行う。ここで同種の前記プローブ核酸が固定化されている前記スポットは、スポットＸ１、Ｘ２、…Ｘｎ−１、Ｘｎ（ｎは３以上の整数）と表す。
【００２４】
前記ｎ個のスポットＸ１、Ｘ２、…Ｘｎ−１、Ｘｎは、同一の核酸マイクロアレイ上に存在していてもよいが、各々別のｎ個の核酸マイクロアレイに存在することが好ましい。例えば、前記ｎ個のスポットが、同種のｎ個の核酸マイクロアレイに別々の存在する場合には、ブロック番号、Ｃｏｌｕｍｎ番号、Ｒｏｗ番号が同じであるスポットを前記ｎ個のスポットとすることが好ましい。
前記プローブ核酸の固定量は、１スポットあたり、０．８〜５μｇとすることが好ましく、１．０〜２．０μｇとすることがより好ましい。
【００２５】
工程（ａ）において、「プローブ核酸セット」とは、特定の転写産物についての遺伝子をコードするプローブ核酸の一群をいう。本実施態様において、前記プローブ核酸セットの数は、通常、アレイ上のスポットの数に対応する。
【００２６】
１つのプローブ核酸セットについて、固定化されるプローブ核酸の種類が各スポット間で異なる限り、各スポットには１種のプローブ核酸が固定化されていても複数種のプローブ核酸が固定化されていてもよい。通常、１つのアレイに１つのプローブ核酸セットが固定化されている。
工程（ａ）において、ｎセットのプローブ核酸セットは、ｎセットの同一のプローブ核酸セットをいい、あるプローブ核酸セットに相補的なプローブ核酸セットにストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブ核酸セットをも含むものとする。
前記同一のプローブ核酸セットは試料核酸の種類に対応し、ｎセットである。
【００２７】
前記プローブ核酸としては、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＰＡＣ（Ｐ１‐ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、これらを遺伝子工学的な手法等を用いて増幅した物が挙げられる。
更に、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を前記プローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることができる。また、キメラ型核酸を用いることもできる。
前記プローブ核酸を固体基板上に結合させる方法としては、ＧｅｎｅＣｈｉｐを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、１ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などが挙げられる。前記スポット方式については、インクジェット方式、ピンアレイ方式などが挙げられる。
【００２８】
試料核酸は、本実施態様の核酸変異解析法に用いられる一本鎖ないしは二本鎖の核酸をいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ等いずれであってもよい。
【００２９】
試料核酸の由来は特に制限はなく、例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、ゲノムの中のコピー数などを測定しようとしている試料核酸を含有している細胞等の分析対象あるいは診断などの評価を行おうとしている細胞、同時に組織や、器官、一個体などが挙げられ、細胞そのものに制限されるものではない。
特に試料核酸の由来としては、ある疾患を持っていると考えられうるヒト患者、動物等から取得できる細胞等が好ましい。前記疾患としては、癌、遺伝病、感染症等の核酸になんらかの情報を持ちうる疾患が全て該当し特に制限するものではない。本実施態様の方法は、変異の数が比較的少ない、先天性の遺伝病などの検査に好適であり、粘膜・髪の毛・爪といった非侵襲的な部位や、血液・リンパ液・骨髄・精液・羊水などの体液を試料とすることが好ましい。
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸、又は同一個体の異なる細胞に由来する核酸であることが好ましく、ヒトの異なる個体に由来する核酸、又はヒトの同一個体の異なる細胞（例えば、正常細胞及びがん細胞）に由来する核酸であることがより好ましい。ヒトの異なる個体に由来する核酸であることが最も好ましい。
また、本実施態様の方法は、特定の遺伝病を有する可能性等によって選別されていない個体に対する検査(新生児の全数検査など)に用いられることが好ましい。
【００３０】
前記試料核酸を調製（精製及び断片化等）する際には、精製処理を行い、タンパクや脂質等の細胞溶解物を除去することが好ましい。精製を行わないと、蛍光等による標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質等細胞溶解物がバックグラウンドノイズに大きな影響を与え、核酸マイクロアレイの性能を著しく低下させるからである。
【００３１】
前記精製の手法としては、シリカやセルロース化合物などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などが挙げられ、更に、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を有する樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる手法などが挙げられる。前記試料核酸の長さは特に制限されず、例えばホールゲノムであってもよいが、下記の断片化処理後に前記精製処理を行っても良い。
なお、標識された試料核酸の長さは特に制限されないが、通常、標識・複製処理により１０００ｂ塩基（１ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）〜５０００ｂ又はｂｐに断片化されている。
【００３２】
断片化処理としては、酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理等が挙げられる。前記酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素又は核酸分解酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、複数用いることも可能である。
前記機械的破砕処理としては、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのボールを用いて、核酸を切断する手法等が挙げられる。
【００３３】
前記核酸に対しサブトラクション法による処理を行っても良い。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤｓＤＤ（Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）法等を用いることができる。
特に、本実施態様において、がん細胞に由来する試料核酸を用いる場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれているため、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下する場合があるが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことができる。
【００３４】
前記ｎ種の試料核酸として、少なくとも複数種の検体核酸及び少なくとも１種、好ましくは２種以上の標準核酸を含むことが好ましい。
また、本実施態様の別の態様として、試料核酸を用いない、即ちｎ種の試料核酸のすべてを検体核酸とすることもできる。
検体核酸とは、いわゆる検体から得た核酸、即ち、核酸変異について未知であって、本実施態様により核酸変異を解析しようとする標的の核酸をいう。例えば、正常細胞（がん化していない細胞）から抽出した核酸、異常細胞（例えば、がん細胞）から抽出した核酸を検体核酸として使用することができる。
標準核酸とは、上記で検体核酸と比較するためのもので、ユーザー（核酸変異解析法の実行者）が変異等につき予めある程度の情報を有している核酸をいう。具体的には、コピー数変化（ＣＮＶ）などについてコピー数変化が生じている位置とその数が既知の核酸であることが好ましく、塩基配列が既知であることがより好ましい。
また、例えば、ＣＮＶやなんらかのモザイクを持つ患者において癌が発症したとして、同一患者について癌細胞から得られた核酸と癌細胞以外の正常細胞から得られた核酸とを比較した場合、ＣＮＶやなんらかのモザイクについては、相殺されるので、該正常細胞から得られた核酸を標準核酸として用いることになんら障害が無い。そのため、ゲノム中のコピー数がその生物種における一般的な存在量と異なっていたとしても、同一固体の場合など、検体核酸と比較して情報を得られる限り、標準核酸とすることができる。
【００３５】
前記各試料核酸が同じ標識で標識されていることが好ましい。
標識とは、検出可能な物質を核酸に結合することをいう。前記検出可能な物質としては、特に制限はないが、蛍光物質、酵素、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を起こす化合物等を挙げることができ、蛍光物質による蛍光標識であることが好ましい。
【００３６】
前記蛍光物質として特に制限はないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光タンパク（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＤＡＰＩ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、希土類蛍光ラベル剤、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを用いることができ、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５などのＣｙ−ｄｙｅによって蛍光標識することが好ましい。
更に、標識に関し、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎ：ＤＩＧ）、ビオチンなども利用することもできる。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することができる。
また、非酵素的に標識することもできる。例えば、ＵＬＳ ａｒｒａｙＣＧＨ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＢＶ社製）なども用いることができる。
【００３７】
蛍光標識する方法としては、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を用いても良い。直接標識法とは、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）を結合させたヌクレオチド化合物をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で核酸を標識する方法である。間接標識法とは、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）が結合できる置換基を持ったヌクレオチド化合物、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド化合物と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、最初に、この置換基を持った核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介して蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）を結合させ、核酸を標識させる方法である。
【００３８】
蛍光物質等の標識化合物を核酸に導入する方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることができる。特に、本実施態様においてはランダムプライマー法を好適に用いることができる。
ランダムプライマー法は、核酸に対して、数ｂｐ（塩基対）から十数ｂｐのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識された核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、ＤｎａｓｅＩでニックを入れた二本鎖核酸に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、ＤＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼ活性により、標識された核酸を合成する方法である。ＰＣＲ法は、二種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識された核酸を得る方法である。末端標識法は、５’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した核酸の５’末端に、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で蛍光物質等の標識化合物を取り込ませる方法である。３’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、蛍光物質等の標識化合物を核酸の３’末端に付加する方法である。
【００３９】
標識された試料核酸等として、それらを含む未精製の溶液を使用することも可能である。その様な未精製溶液を用いる場合、それらの溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。データの再現性に影響を与えるのを防止する観点からである。
酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、キレート剤を添加する方法、６０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方若しくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、６０℃以上が好ましく、６３℃以上が更に好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
また、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた標識方法であれば、ボルテックスミキサー等を用いて酵素の活性を失わせることも可能である。
【００４０】
・ハイブリダイズ
工程（ａ）において、ｎセットの前記プローブ核酸セットの各々に対し、標識されたｎ種の試料核酸Ｓ１〜Ｓｎの各々１種ずつ接触させるために、前記スポット各々に前記試料核酸を各々１種ずつ含有させる手法としては、ピペッティング等任意の手法で行うことができる。
工程（ａ）において、前記プローブ核酸と前記試料核酸とは、ハイブリダイゼーション溶液中インキュベートすることによりハイブリダイズさせることができる。
インキュベートの条件としては特に制限はないが、２５〜５０℃の範囲で行うことが好ましく、３０〜４５℃の範囲で行うことがより好ましく、３７〜４２℃の範囲で行うことが更に好ましい。また、ハイブリダイゼーションの時間は、８〜９６時間とすることが好ましく、１２〜７２時間とすることがより好ましく、１６〜４８時間とすることが更に好ましい。
【００４１】
工程（ａ）のハイブリダイズに用いるハイブリダイゼーション溶液としては該溶液において前記プローブ核酸と該試料核酸とがハイブリダイズする限り特に制限はない。前記プローブ核酸と該試料核酸とが好適にハイブリダイズする性質を有する溶液であることが好ましく、前記プローブ核酸と該試料核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを有する溶液であることがより好ましい。
【００４２】
前記ハイブリダイゼーション溶液は、排除体積効果を有する物質、試料核酸の融点を低下させる物質、及びイオン強度を調整する溶液を含有することが好ましい。
前記排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば特開２０００−３２５０９９号公報参照）やデキストラン硫酸等が挙げられる。
前記試料核酸の融点を低下させる物質としては、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、グアニジン・チオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、ヨウ素などが挙げられる。
イオン強度を調整する溶液としては、ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、ＳＳＰＥ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４）、ＭＥＳ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ等が挙げられる。
【００４３】
前記ハイブリダイゼーション溶液には、ブロッキング剤、界面活性剤等を含有させてもよい。
界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤等が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが挙げられる。
前記ブロッキング剤は、ハイブリダイゼーション時に非特異ハイブリダイゼーションの検出を低減するための物である。例えば、核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、変性サケ精子ＤＮＡ、ｐｏｌｙ Ａ（ポリアデニル酸）、ｐｏｌｙ ｄＡ（ポリデオキシアデニル酸）、スキムミルクなどが挙げられ、一般に販売されているブロッキング剤も用いることができる。
【００４４】
この他に本実施態様において、特開２００５−０８７１０９公報に記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液の組成の一つとして、リン脂質、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）、４級アンモニウム塩であるベタイン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， １３７−１４４（１９９３））、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， １５８５−１５８８ （１９８５））、市販されているハイブリダイゼーション溶液、例えば、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（東洋紡績株式会社製）、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ社製）などを用いることもできる。
【００４５】
ハイブリダイズは、標的核酸とプローブ核酸とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。具体的なハイブリダイズの条件としては、例えば、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄条件として、（１）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、３０秒間、（２）５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、１５分間、（３）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、３０分間、（４）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、５分間の洗浄を行うことが挙げられる。
【００４６】
・工程（ｂ）
工程（ｂ）においては、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個のスポットにおけるハイブリダイズした該試料核酸の標識量値Ｆ１〜Ｆｎを取得する。
工程（ｂ）において、核酸マイクロアレイ上のハイブリダイズ後の標識強度を取得する手法としては標識強度を測定できる限り特に制限はない。
工程（ｂ）において、スポットＸ１の標識強度をＦ１、スポットＸ２の標識強度をＦ２…スポットＸｎ−１の標識強度をＦｎ−１、スポットＸｎの標識強度をＦｎと表す。ｎは３以上の整数である。
例えば、ラジオアイソトープであればＸ線フイルムやＢＡＳＳ（富士フイルム株式会社製）等を用いることができる。
標識物質として蛍光物質を用いた場合、蛍光スキャナーを用いることが好ましい。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡシリーズ（富士フイルム株式会社製）やＧｅｎｅＰｉｘシリーズ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＬＳ Ｒｅｌｏａｄｅｄ（テカン社製）などが挙げられる。
【００４７】
・工程（ｃ）
工程（ｃ）において、スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する。換言すれば、比較値の大小が陽性に相当するか否かについて、仮の判定を行う。工程（ｄ）を含まない従来の方法における陽性・陰性（特にＳ２〜Ｓｎのうちの標準核酸との比較値の判定結果）は、ここでいう仮に判定される陽性・陰性は、に相当する。
比較値とは、２つの同種のスポット同士の標識強度を比較することによって得られた数値であり、標識強度比、標識強度の差等が挙げられ、標識強度比であることが好ましく、標識強度比の対数値（Ｌｏｇ値）であることがより好ましく、標識強度比の底を２とする標識強度比の対数値（Ｌｏｇ２値）であることが更に好ましい。
比較値各々を陽性又は陰性と仮に判定する基準、即ち所定の数値範囲は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法と同等のものでよく、たとえば陽性であることが既知である試料核酸（ポジティブコントロール）と陰性であることが既知である試料核酸（ネガティブコントロール）を用意し、その中間値を閾値として判断することなどができる。
【００４８】
また、ハイブリダイズに供されるｎ種の試料核酸の量が互いに異なる可能性があるので、それを更正する工程を含むことが好ましい。このような工程は特に制限されず、異なるプローブ核酸セットにおいて得られた標識強度を比較する単色法のハイブリダイゼーションにおいて通常用いられている正規化を適用することができ、例えばグローバルノーマライゼーション等を使用することが出来る。
たとえば、各アレイ内のｐ個のスポットにおける標識強度の平均値や中央値を、比較するアレイ間で揃える方法や、後述する（ｃ２）の工程のように、１対のアレイ間の各スポットにおける各比較値を得た後で、該１対のアレイ間のｐ個の比較値の平均値や中央値が、ほかの１対のアレイ間のものと同じになるようにする方法が挙げられる。具体的には、個々の標識強度又は比較値と、各アレイ内のｐ個のスポットにおける標識強度の平均値や中央値で除した比や、標識強度の平均値や中央値を引いた値、あるいは偏差値で表す方法が挙げられる。
このような工程を含むことで、前述したような試料核酸量による差を更正することができる。ここで、更正する方法は特に限定されず、例えば平均値や中央値を標識強度に乗除する、平均値や中央値より一定値以上外れた値を除外するなどの方法が挙げられる。
【００４９】
また上記更正する工程で平均値や中央値で除した比とした場合、得られた値はコピー数に相当する値となる。前述した工程（ｃ）の所定の数値範囲は、各測定値（特に既知の変異を測定した値）を参考に明確に変異していると考えられる領域を除ける値を設定することもできるし、理論的なコピー数としてありえる数値から設定することもできる。後者としては、具体的には、異常のない常染色体上の特定の核酸領域が存在する個数が１コピーであり、１対の前記染色体対のコピー数を１とする場合、理論的にありえるコピー数は、０、０．５、１、１．５、２・・・と０．５おきの値となる。そのため、前記工程（ｃ）における判定を行う基準として、上記間隔の半分、即ち０．２５を閾値として仮の陰陽を判断したり、あるいは中間的な値（たとえば０．２〜０．３）を従来のように擬陽性として判定を行わずに除外したりすることもできる。
前記比較値の所定の数値範囲は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの陽性を判断する基準と同様に設定することができる。例えば蛍光強度比を用いる場合、論理的には０．８〜１．２等の値を挙げることができるが、配列の特定等を考慮して任意に設定可能である。例えば後述する補正を行う場合はその分を乗除することができる。
【００５０】
即ち、本実施態様において前記工程（ｃ）は、ｎセットのプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットに対して、下記（ｃ１）〜（ｃ３）の工程を行う工程であることが好ましい。即ち、全部で（ｎ−１）×ｐ個の比較値が算出される。
［（ｃ１）前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているｐ対のスポット同士における標識強度を各々比較し、ｐ個の比較値を算出する工程］
［（ｃ２）工程（ｃ１）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する工程］
［（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを判定する工程］
より詳しくは、本実施態様においては、下記の工程を含む。
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイを備え、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
【００５１】
工程（ｃ３）において、比較値が標識強度比であって、標識強度比の平均値ないしは中央値の偏差を基準に陽性又は陰性と仮に判定することが好ましい。たとえば、平均値ないしは中央値の偏差に基づき閾値（所定の数値範囲）を設け、平均値ないしは中央値からの偏差が前記閾値を超える場合を陽性（又は陰性）と仮に判定することができる。
工程（ｃ２）・（ｃ３）における比較値の平均値又は中央値を算出する工程及びそれと各比較値を対比する工程は、上述したように比較値とする前に各プローブ核酸セット内のｐ個のスポットにおける各標識強度の平均値又は中央値を算出し、それと各標識強度とを対比することでも行うことができる。即ち、本実施態様において、前記工程（ｃ）が下記工程であってもよい。
［（ｃｃ）前記ｎセットのプローブ核酸セット内の各スポットにおける標識強度の平均値ないしは中央値を算出し、
その平均値ないしは中央値に基づく各スポットの偏差値（Ｆ’１、Ｆ’２…Ｆ’ｎ）をｎセットのプローブ核酸セット各々において算出し、
ｎセットのプローブ核酸セットうちの２個の対の間で同種のスポット同士の標識強度の比較値を算出し、Ｆ’１とＦ’２の対の比較値からＦ’１とＦ’ｎの対の比較値までのｎ−１個の比較値各々について、ｎセットの前記平均値ないしは中央値を基準に所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程］
【００５２】
なお、本実施態様では説明のために各工程について別々に番号をつけて説明しているが、この順番を制限するものではなく、同時に処理することを排除するものでもない。
【００５３】
・工程（ｄ）
工程（ｄ）において、所定の数値範囲に入らないと判定した数が、ｎ−１のうちの所定数を超える場合に前記スポットＸ１を陽性と確定する。該所定数は、ｎ−１の半数であることが好ましく、ｎが４以上かつ該所定数がｎ−１の７０％であることがより好ましい。また、一定数以下であるものについては、陰性と確定することが好ましいが、ある程度の範囲を定めて擬陽性とし、再検査を行うことも好ましい。再検査を行う場合でも、再検査を行う必要が生じる可能性は従来の方法より大幅に減らすことが期待できる。また再検査を行う場合には、比較対照を変えて行うことが好ましい。
なお、比較値が所定の数値範囲に入らないと判定した数が工程（ｄ）におけるｎ−１のうちの所定数を超えない場合は、スポットＸ１におけるデータは信頼性が欠けると判断して再検査を行う等の処理を行うことができる。
また、スポット（Ｘ１）は任意のスポットであり、通常スポットＸ１と同一のアレイ内の複数のスポット（好ましくはすべてのスポット）において、上記（Ｘ１）と置き換えて、本実施態様の（ａ）〜（ｄ）と同様の工程又は（ｉ）〜（ｉｉｉ）処理を行う。
【００５４】
・標識強度の補正
前記工程（ｂ）において取得される前記標識強度が補正された値であることが好ましい。
具体的には、前記工程（ｂ）における前記標識強度の取得が、下記工程から得られた値であることが好ましい。
あるスポットにおいて、標識された前記試料核酸と、固定化された前記プローブ核酸とをハイブリダイズさせる工程、
前記プローブ核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしうる配列を有し、標識された前記試料核酸とは異なる標識で標識されている標識された検証核酸を前記スポットに付与して前記プローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
前記スポットにおいてハイブリダイズした標識された前記試料核酸の標識強度を取得する工程、
前記スポットにおいてハイブリダイズした標識された前記検証核酸の標識強度を測定する工程、及び
前記検証核酸の前記標識強度に基づき、前記スポットにおける固定された前記プローブ核酸の量を検知し、該検知量により前記試料核酸の標識強度を補正する工程を含むことが好ましい。
この補正方法は、例えば特開２０１０‐００４８７３に記載の方法を用いることができる。
【００５５】
ここで、標識された前記試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることが好ましい。
ここで、検証核酸とは、前記プローブ核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしうる配列を有する核酸をいい、複数のスポットにおけるハイブリダイズ能力の大小、具体的には各スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因するばらつきを検知し、更にはプローブ核酸量のスポット間のばらつきを補正するために使用することができる。そのため、検証核酸は、核酸マイクロアレイ上の全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイズ可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全てのスポットとは、同一溶液の検体又は標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
また、ハイブリダイズ可能であれば、どの様な核酸でも良く、ＤＮＡやＲＮＡの様な天然型の核酸や、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸であってもよい。
例えば、ＰＮＡ、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、キメラ型核酸などを用いることができる。
【００５６】
検証核酸として好ましい配列としては、反復配列が挙げられる。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、ｐｏｌｙ ｄ（ＡＴ）やｐｏｌｙ ｄ（ＧＣ）などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることができ、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本実施態様においては、例えばインビトロジェン社で販売されているＣｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることができる。
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアン（哺乳類）から得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸として知られている。
【００５７】
そのＣｏｔ−１ ＤＮＡの少なくとも一部を標識化して未標識のＣｏｔ−１ ＤＮＡとともに用いることによって、特異的なハイブリダイゼーションの検出感度を高め、かつスポット差を低減させることもできる。
【００５８】
検証核酸は、検体の核酸とは異なり、かつ、プローブ核酸セット全てが共通して持っている配列を有する核酸を用いることも好ましい。
例えば、プローブ核酸中に共通に存在する核酸配列部分に実質的に相補的な核酸配列を有する、合成オリゴヌクレオチドを検証核酸として用いることもできる。
また、アレイを作製するときに用いたベクター（プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ウィルスなど）の核酸、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる配列を有する核酸も検証核酸として使用出来る。
【００５９】
本実施態様では、試料核酸に対して、検証核酸の使用量をモル比で１以上用いることが好ましい。モル比を１以上用いることによって、核酸マイクロアレイの性能が向上する。
【００６０】
検証核酸の大きさは、２０ｂｐ以上であることが好ましく、２０ｂｐ〜１Ｍｂｐであることがより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｋｂであることが更に好ましい。
検証核酸の使用量は、検体又は標準の核酸に対して、０．５〜２倍モルの範囲とすることが好ましい。
【００６１】
・自動化
本実施態様の核酸変異解析法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。
自動化を行うことにより、作業者は煩雑な作業から解放され、人件費を低減し、熟練度の違いによる結果の差異を減少させ、ヒューマンエラーを防ぐことが可能となる。
【００６２】
・プログラム
次に、本実施態様のプログラムについて説明する。
本実施態様のプログラムは、以上説明した核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
【００６３】
手順（Ｉ）は下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であることが好ましい。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
【００６４】
本実施態様のプログラムを用いることにより、前述の標識強度を測定し得られたデータを処理する際、効率よくデータ処理を実施することができる。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものである限り特に制限はない。本実施態様の記録媒体は、可搬型又は固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本実施態様のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
【００６５】
次に、本実施態様の、遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法について説明する。
本実施態様の、遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法は、上記説明した核酸変異解析法を用いてなる。診断の対象となる前記疾患としては、癌、遺伝病、感染症等の核酸になんらかの情報を持ちうる疾患が全て該当し特に制限するものではない。
本実施態様の診断方法において、正常細胞（がん化していない細胞）から抽出した核酸を標準核酸、異常細胞（例えば、癌患者、遺伝病患者、感染症患者に由来する細胞）から抽出した核酸を検体核酸として上記説明した核酸変異解析法に適用することで、検体の提供患者、又は検体とした細胞の病変についてＣＮＶ等の原因に起因する擬陽性ないし擬陰性の影響を受けることなく診断することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の主旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って本発明の範囲は以下の具体例に制限されるものではない。
なお、以下の実施例において、Ｃｙ３−ｍａｌｅとは、ｍａｌｅ ＤＮＡに対して、Ｃｙ３で標識したものを示す。同様に、Ｃｙ５−ｍａｌｅとは、ｍａｌｅ ＤＮＡに対して、Ｃｙ５で標識したものを示す。また、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ等も同様に、それぞれの標識化合物で標識した核酸であることを示す。
【００６７】
〔実施例１〕
１．標識された試料核酸の調製
マイクロチューブに、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅ （プロメガ株式会社製， カタログ番号Ｇ１５２；以下ｍａｌｅのゲノムＤＮＡと呼ぶ）を３μＬ（０．７５μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ， ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、アレイＣＧＨ用のラベリングシステム（ＢｉｏＰｒｉｍｅ （登録商標） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の２．５ｘＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （インビトロジェン株式会社）を２０μＬ入れ、ブロックインキュベータを用いて、９５℃で５分間熱処理、３７℃で１５分間静置した。
【００６８】
前記ラベリングシステムの１０ｘｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ （インビトロジェン株式会社）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ （登録商標） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （インビトロジェン株式会社）を１μＬ添加し、ブロックインキュベータを用いて３７℃で２時間、標識化反応と同時に増幅反応を行った。ついでブロックインキュベータを用いて６５℃に加熱し、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００６９】
上記操作をＣｏｒｉｅｌｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌの細胞株ＧＭ０７１８９（以下検体核酸Ｎｏ．１と呼ぶ）、ＧＭ０７１８９（同検体核酸Ｎｏ．２）、ＧＭ１３４５１（同検体核酸Ｎｏ．３）、及びＧＭ１３４５１（同検体核酸Ｎｏ．４）から、ｐｕｒｅｇｅｎｅ（ＱＩＡｇｅｎ社）のプロトコルに沿ってゲノム抽出を実施した。抽出したＤＮＡについては、ナノドロップ（スクラム社）を用いてＯＤを測定した。このように得られたゲノムに対しても、上記Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅと同様の操作を行って、未精製標識試料核酸を得た。なお、これらに対しても、標識化合物として、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いた。
【００７０】
２．１．標識検証核酸の調製
マイクロチューブにＣｏｔ−１ ＤＮＡ （インビトロジェン株式会社製、カタログ番号１５２７９−０１１）を３μｇ（１３μＬ）用い、標識化合物にＣｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を３μＬ用いた以外は同様にして、標識された検証核酸（未精製）を得た。
【００７１】
２．２．標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製
マイクロチューブに、標識核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２１μＬ、未標識のＣｏｔ−１ ＤＮＡ ６２μＬ（６２μｇ、インビトロジェン株式会社製）を６２μｇ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡを０．３μｇ、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を９μＬ添加し、−２０℃の９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールを３６０μＬ添加し、エタノール沈殿を行った。乾燥後、水８．７μＬ、ホルムアミド６．５μＬ、２０％ ＳＤＳ １６．８μＬを加えた。ここに、デキストラン１ｇ、ホルムアミド５ｍＬ、２０×ＳＳＣ １ｍＬに水を加えて７ｍＬとしておいたデキストラン・ホルムアミド溶液３２μＬを添加し、完全に溶解させた。その後、１つのチューブにまとめ、３０μＬずつチューブに分注した。
ここに、上記標識された試料核酸のゲノム１０μＬずつを添加し良く攪拌した。その後、７５℃１５分インキュベートした後、４２℃に３０分以上保温した。
【００７２】
３．ＢＡＣアレイスライドの作製
ヒトゲノムをインサートとしたＢＡＣライブラリーから、染色体ごとにランダムかつ先天性異常が含まれる遺伝子領域と考えられる領域を含むＢＡＣを選択し、ＬＢ培地５０ｍＬ（＋クロラムフェニコール）で１晩培養した。上記ＢＡＣは染色体ごとにある一定の長さで選んだものであり、最終的に約３４０スポットとしたものである。
これをＱＩＡＧＥＮ社ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｄｉ ｋｉｔを用いて添付されたプロトコール通り抽出した。これを１．５μｇ／１６μＬＴＥに調整し、制限酵素ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩを用いてそれぞれ２時間消化後、８０℃２０分で失活させ、３種を混合させた。更に、配列番号１の配列を有するアダプター：５’−ａａｔｔｃｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｇ−３’及び配列番号２の配列を有するその相補鎖である：５’−Ｐ−ｃａｔｃｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇ−３’（５’末端リン酸化）を添加し、９５℃５分、７０℃１５分、６５℃１５分、６０℃１５分、５５℃１５分、５０℃１５分、４５℃１５分、４０℃１５分、３５℃１５分、３０℃１５分、２５℃１５分でアダプターを制限酵素消化後のＤＮＡ断片に付着させ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液５μＬ及びＴ４リガーゼ２．５μＬを添加し、制限酵素処理後のＤＮＡ断片とアダプターを結合させた。これをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。ＥＸ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）と配列番号３の配列を有する５’末端アミノ化プライマー：５’−ＮＨ２−ｇｇａａｔｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｇ−３’を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは１ｓｔＰＣＲとして１５サイクル、２ｎｄＰＣＲとして１０サイクル実施した。これをマイクロコンカラムにて限外濾過を実施し精製し、最終濃度１μｇ／μＬとし、プローブ核酸とした。これを日本碍子社に送付し、松波ガラスのスライドガラスにピエゾ法によりスポッティングを実施させ、ＢＡＣアレイとした。
更に、このＢＡＣアレイを特開２００２−１７６９７７公報に記載されている手順に準じてブロッキング、熱変性を行なった。
【００７３】
４．ハイブリダイゼーション
アロカ社のハイブリマスターＨＳ３００を用いてハイブリダイゼーションを実施した。
ＢＡＣアレイスライドをいれ、３７度になるように設定し、ハイブリダイゼーション溶液を添加後、１６時間攪拌しながらハイブリダイゼーションを実施した。この際、保湿液としては５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣを用いた。その後、２５℃で５分５ｍＬの２×ＳＳＣ、５分１０ｍＬの２×ＳＳＣで洗浄、５０℃で１４分５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ、３０分５ｍＬの０．１％ＳＤＳ／２×ＳＳＣで洗浄し、５分２５℃の２×ＳＳＣで洗浄した。
【００７４】
５．蛍光画像の取り込み及びデータ処理
ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ（ａｘｏｎ社製）を用いて蛍光画像を取り込んだ。これを数値化したｇｐｒファイルを基に計算を実施した。計算方法は、Ｃｏｔ‐１ ＤＮＡの蛍光値であるｃｙ５を補正の指標として、ｃｙ３で標識した標識ゲノムの蛍光強度に対し補正を実施して比較を行った。蛍光値はバックグラウンド蛍光値を差し引いたものを用いた。
計算方法：ｌｏｇ２（ゲノム検体核酸の蛍光強度／標識ｃｏｔ‐１（検体）／ゲノム標準核酸の蛍光強度×標識ｃｏｔ‐１（標準））
この計算を、このようにして検体核酸Ｎｏ．１をハイブリダイズした全スポットと、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅをハイブリダイズした全スポットにおける同種のスポットの全ての対において行った。
上記計算により得られた全スポット対の値に対して、全スポット対の中央値で除することによりグローバルノーマライゼーションを行った。
このようにして検体核酸Ｎｏ．１と、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅとの比較を行った。しかし、標準核酸のＣＮＶが既知でないため、この比較結果では擬陽性ないし擬陰性を含んでいる可能性がある。
そこで、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅの代わりに検体核酸Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４に変更して同様に検体核酸Ｎｏ．１との比較を各々行った。
【００７５】
６．結果
図３〜６に、上記計算を行った結果を示す。縦軸は蛍光強度比、横軸はスポット番号（プローブ核酸番号）を表す。図３〜６中、◆は閾値内のデータ、□は閾値外のデータ（＋方向に外れたもの）、△は閾値外のデータ（−方向に外れたもの）を表す。閾値は０．８及び１．２と設定した。
図３は、検体核酸 Ｎｏ．１と標準核酸であるｍａｌｅのゲノムＤＮＡの蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図４は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．２の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図５は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．３の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図６は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．４の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【００７６】
各図において常染色体に相当するスポットで、閾値を外れたのは以下のスポットである。
図３：４、１７、８１、１１１、１２７、１３５、１４５、１４６、１４７、１６３、１９７、２０２、２２１、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２４４、２４５、２６４、３１０、３２８
図４：３１、１８１、１９７、２１９、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２８１、２９１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２
図５：１、６、１０、１３、１５、１９、２０、２１、２７、２９、３０、３５、３６、４４、４７、５１、５２、５５、５７、５９、６４、６６、７２、８０、８６、９４、９６、１１３、１３７、１４１、１５７、１６７、１７４、１７８、１８１、１８５、２０４、２１５、２１６、２１７、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２５６、２６７、２６９、２７８、２７９、２８７、２９０、２９１、２９９、３０５、３０７、３３４
図６：１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１７、２９、３１、５２、８６、１１１、１１３、１６３、１７４、１９７、２１６、２１７、２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３６、２４５、２７３、２８７、２９０、３０６、３４２
この結果、１９７、２２５〜２３２の各スポットにおいては、図３〜図６のうちの過半数の結果において閾値を越えているため、陽性であると判定できた。その他の上記閾値を越えたスポットについては、擬陽性又は擬陰性と判定できた。
これにより、Ｎｏ．１の試料は、１９７、２２５〜２３２のスポットに固定化した核酸に対応する遺伝子にコピー数が増加する異常があることがわかった。
また、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．４の試料及び標準としたｍａｌｅについて、上記Ｎｏ．１の試料と置き換えて同様に測定することで、それぞれのコピー数変化を測定することが出来る。
なお、本実施例で該当する例は無かったが、あるスポットについてのアレイ間比較結果で、正の閾値外及び負の閾値外両方の結果が存在する場合（例えば図３、４でｎ番スポットが□、図５、６で同ｎ番スポットが△となった場合）、当該スポットは陽性とは判断しないことが好ましい。
【００７７】
以上の結果から、本発明の方法により擬陽性等の影響を受けることなく陽性又は陰性に確定できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の核酸変異解析法、プログラム及び診断方法は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解析結果から擬陽性等の影響を低減し解析結果の信頼性を向上させるアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ＣＧＨ）法は、数１０ｋｂ〜数Ｍｂレベルで起きたゲノムコピー数異常等のゲノム構造異常を短時間で検出する手段として知られている（例えば非特許文献１、２参照）。
アレイＣＧＨを用い遺伝疾患などの診断アレイの場合、病態に直結するコピー数異常を正確に診断することが必要になる。このため、標準となる核酸は、コピー数変化（ＣＮＶ）を有しないものであることが必要であり、まれなＣＮＶも含めて注意深い選択と確認を行う必要があり、煩雑で再検査を要求される場合が多かった。
また、全ゲノム解析用アレイを含めて、コピー数異常が検出されてきた場合、対象となるゲノムについて正常であることが証明された標準核酸の入手は非常に困難であるため、正常検体での解析例や公共データベースと照合するとともに、両親や同胞の検査を引き続き行い、擬陽性ないしは擬陰性であるのかｄｅ ｎｏｖｏのコピー数異常であるのかを確認するために何度も再検査する必要があった（例えば非特許文献１参照）。擬陽性ないしは擬陰性と判定された場合には再検査の必要が生じ、一回的に診断できない問題が生じていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】稲澤譲治ら編、「アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」、株式会社医薬ジャーナル社
【非特許文献２】井本逸勢、稲澤譲治「マイクロアレイ技術用いたＣＧＨ解析：ＣＧＨアレイ法」、細胞工学， Ｖｏｌ．２３， Ｎｏ．０３， ３５５−３６１， （２００４）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記従来技術の問題点に鑑み、本発明の目的は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させて再検査の必要がない核酸変異解析法、及びそのデータ処理を実行するプログラムを提供することにある。
また、本発明の目的は、前記核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題は下記の手段により達成された。
【０００６】
１．
（ａ）１つの核酸マイクロアレイ上に複数のスポットがあり、該複数のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化されている同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該ｎセットのプローブ核酸セットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程と、
（ｂ）前記ｎセットのプローブ核酸セットから選ばれた、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個の各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程と、
（ｃ）スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの各標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程と、を有し、
ｎは３以上の整数であり、前記試料核酸は検体核酸又は標準核酸であり、少なくとも前記Ｓ１は検体核酸であり、Ｘ１はＳ１を接触させたスポットである、
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。
【０００７】
２．
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも２種が検体核酸である上記１に記載の核酸変異解析法。
３．
（ｃ’）Ｆ２とＦ１の比較値からＦ２とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ’）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ’）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ２を陽性と判断する工程と、を更に有し、前記スポットＸ２は前記Ｓ１とは異なる試料核酸Ｓ２と接触させたスポットである、上記１又は２に記載の核酸変異解析法。
４．
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも１種が標準核酸である上記１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
５．
前記ｎ種の試料核酸がすべて検体核酸である上記１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
６．
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸である上記１〜５のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【０００８】
７．
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイに備えられ、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
を有する、上記１〜６のいずれか一項に記載の核酸変異解析方法。
【０００９】
８．
前記各試料核酸がすべて同じ標識で標識されている上記１〜７のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
９．
前記工程（ｂ）における前記標識強度Ｆ１〜Ｆｎが補正された値である上記１〜８のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【００１０】
１０．
上記１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
１１．
上記１０に記載されたプログラムであって、手順（ｉ）が下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であるプログラム。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
１２．
上記１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の核酸変異解析法は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。より詳細には、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法では擬陽性ないし擬陰性の影響により再検査の必要があった検体についても、本発明の核酸変異解析法は再検査の必要がない。
本発明のプログラムは前記核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するので、解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特にＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。
本発明の遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法は、前記核酸変異解析法を用いてなるので、擬陽性ないし擬陰性の影響を低減し診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は本発明の１つの実施態様の核酸変異解析法を示すフローチャートである。
【図２】図２は本発明の１つの実施態様の核酸変異解析法の１つの実施態様の一部を示す部分概略図である。
【図３】図３は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と標準であるｍａｌｅのゲノムＤＮＡの蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図４】図４は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．２の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図５】図５は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．３の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【図６】図６は、検体ＤＮＡ Ｎｏ．１と検体ＤＮＡ Ｎｏ．４の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本実施態様の核酸変異解析法は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による解析法であって、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含むものである。
図１及び２は本発明の核酸変異解析法の好ましい１つの実施形態を示す概略図である。なお、図１では工程（ｄ）で判断基準となるスポット数を半数とし、図２はｎが４の場合を例示しているが、本実施態様はこれらに制限されるものではない。
まず、工程（ａ）は、核酸マイクロアレイ上のｐ個以上のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化された同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該プローブ核酸セットの各々に対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸を各々１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる。以下、ｐは２以上の整数、ｎは３以上の整数である。
ついで、前記ｎセットのプローブ核酸セットの各々から選ばれた同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎ（スポットＸ１の標識強度Ｆ１、スポットＸ２の標識強度Ｆ２…スポットＸｎの標識強度Ｆｎ）を取得する（工程（ｂ））。
次に、Ｆ１とＦ２の比較値からＦ１とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する（工程（ｃ））。図２においては、工程３のＦ１とＦ２の比較値Ｃ２をＦ１／Ｆ２、Ｆ１とＦ３の比較値Ｃ３をＦ１／Ｆ３としているが、後述のように比較値の計算方法はこれに限定されない。
次に、前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と確定する（工程（ｄ））。
【００１４】
なお、ここでは任意のスポットＸ１に着目して説明しているが、その他のスポットに置き換えて行うことができ、試料核酸Ｓ１をハイブリダイズしたアレイ内のすべてのスポットを上記のＸ１に置き換えて解析を行うことが好ましい。
【００１５】
ここで、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法（以下、アレイＣＧＨ法ということもある）とは、核酸マイクロアレイ上で比較ゲノムハイブリダイゼーション法を行う方法をいい、例えば、稲澤譲治ら編、「アレイＣＧＨ診断活用ガイドブック 知っておきたい染色体微細構造異常症」（株式会社医薬ジャーナル社）等に詳しく記載されている。
【００１６】
従来のアレイＣＧＨ法では、標準とする核酸と検体とで別種の標識化合物を用い、同一のスポットに同時にハイブリダイズさせる２色法を用いるものが知られていた。
２色法では、標準と検体を同時に同じアレイで同時に評価するが、標準とする核酸のＣＮＶが未知である場合、測定結果として現れる増減が、標準における増減か、或いは検体の影響における増減（いわゆる擬陽性・擬陰性）なのか見分けることが難しかった。このような問題を避けるため、２色法では、標準のＣＮＶを事前に確認することが行われていた。しかし、標準のＣＮＶが分かっていない場合には、標準のＣＮＶを評価するために多くのサンプル及び実験が必要であった。
これに対して本実施態様の方法は、検体とする核酸と対照となる核酸１種とを、互いに同種の核酸が固定化されている別個のスポットにおいて各々ハイブリダイスさせ、各々測定した値を比較するものである。しかしこの方法でもアレイ１に検体の核酸を添加し、アレイ２に対照とする検体の核酸を添加し、それぞれハイブリダイズさせ、同一のプローブ核酸が固定化されたスポットであるスポットＸ１とスポットＸ２における標識強度の比較を行うことで１個の比較値を得て、それに基づき陰陽の判断を行うと、特に対照がＣＮＶ（コピー数変化）を含んでいると、対照の影響による増減（いわゆる擬陽性・擬陰性）が生じ、再検査が必要になる場合や誤判定が生じる場合がある。
そこで、本実施態様においては、標識されたｎ種の試料核酸が用いられる。ｎは３以上の整数である。具体的には、ｎ種の試料核酸の中から１種を判断対象として着目し、残りのｎ−１種を対照として判断対象に関するｎ−１個の比較値を得て、比較値の陰陽について仮の判断を行う。ついで、ｎ−１個の仮の判断結果のうち、所定数以上が仮の陽性である場合に真の陽性と判断し、仮の陽性が所定数より少ない場合には真の陰性と判断する。
前記所定数としては、仮の判断結果総数の３０％〜７０％の間の個数を用いることが好ましく、４０％〜６０％の個数を用いることがより好ましい。
ここで、陽性・陰性とは、従来のアレイＣＧＨ法と同様であり、対象とするスポットに固定化されている核酸配列について、標準核酸と比較して検証核酸に多く存在する場合又は少なく存在する場合若しくは存在しない場合を陽性と呼び、同じ場合を陰性と呼ぶ。
【００１７】
一般に、あるスポットにおいて、検体核酸と対照となる核酸１種との比較で擬陽性ないしは擬陰性（以下、単に擬陽性等という）が発生する確率は、多くても１／１０程度であり、通常は１／１００以下である。よって対照となる核酸をｎ−１種用い、得られたｎ−１個の仮の判断結果のうち、所定数以上が仮の陽性である場合に、真の陽性と判断することにより、上記擬陽性等が発生する確率は大幅に低減される。
以上から本実施態様の核酸変異解析法により測定結果から擬陽性等を低減できる。
また、本実施態様においては上記発生率が極めて低くなることから標準核酸を用いないことも可能となる。
【００１８】
本実施態様に用いられる試料核酸の種類ｎは３以上であり、４以上であることが好ましい。
上述のようにｎは多いほど効果が高く、ｎの上限は制限されないが、データを迅速に得るため、及び計算を簡単にする観点からｎは１００以下であることが好ましい。ｎは４〜１００であることが最も好ましい。
【００１９】
以下、標識されたｎ種の試料核酸は、試料核酸Ｓ１、Ｓ２、…Ｓｎ−１、Ｓｎ（ｎは３以上の整数）とも表す。
なお、以下、スポット（Ｘ１）に着目し、スポット（Ｘ１）おける標識が陽性か否かの検証、即ちスポット（Ｘ１）に接触させた標識された試料核酸（Ｓ１）における核酸変異の有無についての検証として説明しているが、スポット（Ｘ１）は任意のスポットであり、通常、アレイ上のｐ個以上のスポット（ｐは２以上の整数）スポットに対して着目して本実施態様の方法を各々行い、好ましくはアレイ上のすべての試料核酸をハイブリダイズしたスポットについて着目して検証を行う。
また、試料核酸のうち、着目している核酸を判断対象とする核酸とし、比較する相手を対照とする核酸としているが、任意の試料核酸について着目し、判断対象とする核酸とすることができる。試料核酸の少なくとも２種が検体核酸であることが好ましい。即ち、前記Ｓ１とした核酸はｎ種の核酸から任意に選ぶことが可能であり、ｎ種の核酸に含まれる全ての検体核酸を順次Ｓ１として本実施態様を行うことで、信頼性の高い核酸変異解析を行うことができる。
試料核酸についての対応するスポット同士の標識強度を比較することで、複数の検体核酸についての真の陰陽性を判断することができる。
また、ハイブリダイゼーションを行う工程と、標識強度を取得する工程は、通常、アレイ上の全スポットに対して各々一度に行う。
なお、ハイブリダイゼーションした標識強度を予め取得してあるデータに関し、本実施態様の方法で検証を行うことも可能である。
【００２０】
・工程（ａ）
工程（ａ）においては、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種類ずつ接触させて、前記固定化された核酸に前記試料核酸をハイブリダイズさせる。
核酸マイクロアレイとは、固体基板上にプローブ核酸を高密度に結合させた物をいう。前記固体基板に用いる固体材料としては、一般的に使用されるスライドガラスなどのガラス素材のほか、プラスチック材料など、プローブ核酸が結合可能な材料である限り特に制限はない。
本実施態様に用いられる前記核酸マイクロアレイとしては、ＢＡＣ−ＤＮＡアレイ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｃ−ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられる。
なお、本実施態様の核酸変異解析法において、市販品の核酸マイクロアレイを使用してもよいし、通常の方法で作成したものを用いてもよい。
【００２１】
スポットとは、前記核酸マイクロアレイ上に複数存在する、プローブ核酸を多量に高い密度で固定化した領域をいう。
前記核酸マイクロアレイのスポット数はｐ個以上であれば特に制限はないが、一般に５個〜１００万個であることが好ましく、３００個〜５０００個であることが好ましい。
前記核酸マイクロアレイのスポットの配置は特に制限はなく、アレイを複数エリアもち、複数の試料核酸を１枚の基板上で測定できる多検体アレイ、複数のアレイを組み合わせ、多くのスポットを１枚の基板に再現したタイリングアレイなどが挙げられる。
【００２２】
プローブ核酸とは、核酸マイクロアレイの基板上に（好ましくはスポット状に複数個）固定化されている核酸であり、既知の配列を含む核酸であることが好ましい。
前記プローブ核酸の大きさは、１０塩基（ｂ）〜１０ｋｂであることが好ましく、５０ｂ〜５ｋｂであることがより好ましく、１００ｂ〜２ｋｂであることが更に好ましい。
「同一のプローブ核酸」とは、前記プローブ核酸に相補的な核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸をも含むものとする。
【００２３】
本実施態様では、同一のプローブ核酸が固定化されているｎ個のスポットにおいて各々別の試料核酸とハイブリダイズを行う。ここで同種の前記プローブ核酸が固定化されている前記スポットは、スポットＸ１、Ｘ２、…Ｘｎ−１、Ｘｎ（ｎは３以上の整数）と表す。
【００２４】
前記ｎ個のスポットＸ１、Ｘ２、…Ｘｎ−１、Ｘｎは、同一の核酸マイクロアレイ上に存在していてもよいが、各々別のｎ個の核酸マイクロアレイに存在することが好ましい。例えば、前記ｎ個のスポットが、同種のｎ個の核酸マイクロアレイに別々の存在する場合には、ブロック番号、Ｃｏｌｕｍｎ番号、Ｒｏｗ番号が同じであるスポットを前記ｎ個のスポットとすることが好ましい。
前記プローブ核酸の固定量は、１スポットあたり、０．８〜５μｇとすることが好ましく、１．０〜２．０μｇとすることがより好ましい。
【００２５】
工程（ａ）において、「プローブ核酸セット」とは、特定の転写産物についての遺伝子をコードするプローブ核酸の一群をいう。本実施態様において、前記プローブ核酸セットの数は、通常、アレイ上のスポットの数に対応する。
【００２６】
１つのプローブ核酸セットについて、固定化されるプローブ核酸の種類が各スポット間で異なる限り、各スポットには１種のプローブ核酸が固定化されていても複数種のプローブ核酸が固定化されていてもよい。通常、１つのアレイに１つのプローブ核酸セットが固定化されている。
工程（ａ）において、ｎセットのプローブ核酸セットは、ｎセットの同一のプローブ核酸セットをいい、あるプローブ核酸セットに相補的なプローブ核酸セットにストリンジェントな条件でハイブリダイズするプローブ核酸セットをも含むものとする。
前記同一のプローブ核酸セットは試料核酸の種類に対応し、ｎセットである。
【００２７】
前記プローブ核酸としては、化学合成した核酸、ｃＤＮＡ、ＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、ＰＡＣ（Ｐ１‐ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）、これらを遺伝子工学的な手法等を用いて増幅した物が挙げられる。
更に、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸を前記プローブ核酸として使用しても良い。例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＢＮＡ（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ホスホロアミデート型ＤＮＡ、ボラノホスフェート型ＤＮＡなどを用いることができる。また、キメラ型核酸を用いることもできる。
前記プローブ核酸を固体基板上に結合させる方法としては、ＧｅｎｅＣｈｉｐを代表とする光脱離基を結合させたアミダイトモノマーを用い、マスクを使用して、１ヌクレオチドずつ化学合成する方法やインクジェット方式でアミダイトモノマーを固体基板上にスポットし、望んだ配列を化学合成する方法、電極上で溶液のｐＨを変化させそのｐＨ変化を利用して保護基を脱離することにより基板上で核酸を合成する方法、あらかじめ化学合成した核酸を精製し基板上にスポットする方法、スポッターを用いてｃＤＮＡをスポットする方法などが挙げられる。前記スポット方式については、インクジェット方式、ピンアレイ方式などが挙げられる。
【００２８】
試料核酸は、本実施態様の核酸変異解析法に用いられる一本鎖ないしは二本鎖の核酸をいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ等いずれであってもよい。
【００２９】
試料核酸の由来は特に制限はなく、例えば、核酸マイクロアレイを用いて、核酸の発現量や存在量、ゲノムの中のコピー数などを測定しようとしている試料核酸を含有している細胞等の分析対象あるいは診断などの評価を行おうとしている細胞、同時に組織や、器官、一個体などが挙げられ、細胞そのものに制限されるものではない。
特に試料核酸の由来としては、ある疾患を持っていると考えられうるヒト患者、動物等から取得できる細胞等が好ましい。前記疾患としては、癌、遺伝病、感染症等の核酸になんらかの情報を持ちうる疾患が全て該当し特に制限するものではない。本実施態様の方法は、変異の数が比較的少ない、先天性の遺伝病などの検査に好適であり、粘膜・髪の毛・爪といった非侵襲的な部位や、血液・リンパ液・骨髄・精液・羊水などの体液を試料とすることが好ましい。
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸、又は同一個体の異なる細胞に由来する核酸であることが好ましく、ヒトの異なる個体に由来する核酸、又はヒトの同一個体の異なる細胞（例えば、正常細胞及びがん細胞）に由来する核酸であることがより好ましい。ヒトの異なる個体に由来する核酸であることが最も好ましい。
また、本実施態様の方法は、特定の遺伝病を有する可能性等によって選別されていない個体に対する検査(新生児の全数検査など)に用いられることが好ましい。
【００３０】
前記試料核酸を調製（精製及び断片化等）する際には、精製処理を行い、タンパクや脂質等の細胞溶解物を除去することが好ましい。精製を行わないと、蛍光等による標識の際に、様々な副反応が生じると共に、タンパクや脂質等細胞溶解物がバックグラウンドノイズに大きな影響を与え、核酸マイクロアレイの性能を著しく低下させるからである。
【００３１】
前記精製の手法としては、シリカやセルロース化合物などの核酸吸着性膜を担持したカートリッジを用いた方法、エタノール沈殿やイソプロパノール沈殿、フェノール−クロロホルム抽出などが挙げられ、更に、イオン交換樹脂やオクタデシル基などの疎水性置換基を結合したシリカ担体やサイズ排除効果を有する樹脂を使用した固相抽出カートリッジ、クロマトグラフィーなどによる手法などが挙げられる。前記試料核酸の長さは特に制限されず、例えばホールゲノムであってもよいが、下記の断片化処理後に前記精製処理を行っても良い。
なお、標識された試料核酸の長さは特に制限されないが、通常、標識・複製処理により１０００ｂ塩基（１ｋｂ）又は塩基対（ｂｐ）〜５０００ｂ又はｂｐに断片化されている。
【００３２】
断片化処理としては、酵素処理、超音波処理、機械的破砕処理、化学的処理等が挙げられる。前記酵素処理に使用する酵素としては、制限酵素又は核酸分解酵素を用いることが好ましい。制限酵素の種類は、複数用いることも可能である。
前記機械的破砕処理としては、ガラス、ステンレス、ジルコニアなどのボールを用いて、核酸を切断する手法等が挙げられる。
【００３３】
前記核酸に対しサブトラクション法による処理を行っても良い。サブトラクション法とは、対象遺伝子のコピー数や発現に差がある場合、遺伝子の中に存在する違いを、引き算の要領で差し引きし、効率的に遺伝子を単離する方法である。例えば、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ法、ＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、ＤｓＤＤ（Ｄｕｐｌｅｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｉｒｅｃｔ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）法等を用いることができる。
特に、本実施態様において、がん細胞に由来する試料核酸を用いる場合、がん組織の中には、がん細胞と共に多量の正常細胞が含まれているため、核酸マイクロアレイの性能が著しく低下する場合があるが、サブトラクション法によって、その性能低下をある程度防ぐことができる。
【００３４】
前記ｎ種の試料核酸として、少なくとも複数種の検体核酸及び少なくとも１種、好ましくは２種以上の標準核酸を含むことが好ましい。
また、本実施態様の別の態様として、試料核酸を用いない、即ちｎ種の試料核酸のすべてを検体核酸とすることもできる。
検体核酸とは、いわゆる検体から得た核酸、即ち、核酸変異について未知であって、本実施態様により核酸変異を解析しようとする標的の核酸をいう。例えば、正常細胞（がん化していない細胞）から抽出した核酸、異常細胞（例えば、がん細胞）から抽出した核酸を検体核酸として使用することができる。
標準核酸とは、上記で検体核酸と比較するためのもので、ユーザー（核酸変異解析法の実行者）が変異等につき予めある程度の情報を有している核酸をいう。具体的には、コピー数変化（ＣＮＶ）などについてコピー数変化が生じている位置とその数が既知の核酸であることが好ましく、塩基配列が既知であることがより好ましい。
また、例えば、ＣＮＶやなんらかのモザイクを持つ患者において癌が発症したとして、同一患者について癌細胞から得られた核酸と癌細胞以外の正常細胞から得られた核酸とを比較した場合、ＣＮＶやなんらかのモザイクについては、相殺されるので、該正常細胞から得られた核酸を標準核酸として用いることになんら障害が無い。そのため、ゲノム中のコピー数がその生物種における一般的な存在量と異なっていたとしても、同一固体の場合など、検体核酸と比較して情報を得られる限り、標準核酸とすることができる。
【００３５】
前記各試料核酸が同じ標識で標識されていることが好ましい。
標識とは、検出可能な物質を核酸に結合することをいう。前記検出可能な物質としては、特に制限はないが、蛍光物質、酵素、放射性同位元素、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を起こす化合物等を挙げることができ、蛍光物質による蛍光標識であることが好ましい。
【００３６】
前記蛍光物質として特に制限はないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、青色蛍光タンパク（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク（ＲＦＰ）、Ａｃｒｉｄｉｎｅ、ＤＡＰＩ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、希土類蛍光ラベル剤、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸなどを用いることができ、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５などのＣｙ−ｄｙｅによって蛍光標識することが好ましい。
更に、標識に関し、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎ：ＤＩＧ）、ビオチンなども利用することもできる。ビオチンを利用した例としては、プローブに結合させたビオチンに、アビジンを結合させ、ここにビオチンを結合させたアルカリ性ホスファターゼを結合させ、アルカリ性ホスファターゼの基質であるニトロブルーテトラゾリウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加えると紫色の発色が見られ検出に使用することができる。
また、非酵素的に標識することもできる。例えば、ＵＬＳ ａｒｒａｙＣＧＨ ＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＢＶ社製）なども用いることができる。
【００３７】
蛍光標識する方法としては、直接標識法、間接標識法いずれの標識法を用いても良い。直接標識法とは、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）を結合させたヌクレオチド化合物をヌクレオチドとともに混合しておき、一段階で核酸を標識する方法である。間接標識法とは、核酸を一本鎖とし、ここに短鎖核酸をハイブリダイゼーションさせ、蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）が結合できる置換基を持ったヌクレオチド化合物、例えば、アミノアリル基を持ったヌクレオチド化合物と天然型のヌクレオチドとともに混合しておき、最初に、この置換基を持った核酸を合成し、次に、アミノアリル基を介して蛍光物質（例えばＣｙ−ｄｙｅ）を結合させ、核酸を標識させる方法である。
【００３８】
蛍光物質等の標識化合物を核酸に導入する方法として、ランダムプライマー法（プライマーエクステンション法）、ニックトランスレーション法、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、末端標識法などを用いることができる。特に、本実施態様においてはランダムプライマー法を好適に用いることができる。
ランダムプライマー法は、核酸に対して、数ｂｐ（塩基対）から十数ｂｐのランダムなプライマー核酸をハイブリダイゼーションさせ、ポリメラーゼを用いて、増幅と標識とを同時に行い、標識された核酸を合成する方法である。ニックトランスレーション法は、例えば、ＤｎａｓｅＩでニックを入れた二本鎖核酸に、ＤＮＡポリメラーゼを作用させ、ＤＮＡを分解すると同時に、ＤＮＡポリメラーゼ活性により、標識された核酸を合成する方法である。ＰＣＲ法は、二種類のプライマーを準備し、そのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことで、増幅と標識とを同時に行い、標識された核酸を得る方法である。末端標識法は、５’末端を標識する方法では、アルカリホスファターゼで脱リン酸化した核酸の５’末端に、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化反応で蛍光物質等の標識化合物を取り込ませる方法である。３’末端を標識する方法は、ターミナルトランスフェラーゼにより、蛍光物質等の標識化合物を核酸の３’末端に付加する方法である。
【００３９】
標識された試料核酸等として、それらを含む未精製の溶液を使用することも可能である。その様な未精製溶液を用いる場合、それらの溶液中には、酵素などがそのまま残存しており、調製後、溶液中に残存する酵素の活性を失活させておくことが好ましい。データの再現性に影響を与えるのを防止する観点からである。
酵素の失活方法として、酵素の失活が可能な方法であればどの様な方法でもかまわないが、キレート剤を添加する方法、６０℃以上の加熱処理を行うことのいずれか一方若しくは両方を行うことが好ましい。加熱温度は、６０℃以上が好ましく、６３℃以上が更に好ましい。加熱時間は、１分以上あれば良く、最も好ましくは、６５℃以上で５分間以上の加熱処理を行うことが好ましい。
また、ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを用いた標識方法であれば、ボルテックスミキサー等を用いて酵素の活性を失わせることも可能である。
【００４０】
・ハイブリダイズ
工程（ａ）において、ｎセットの前記プローブ核酸セットの各々に対し、標識されたｎ種の試料核酸Ｓ１〜Ｓｎの各々１種ずつ接触させるために、前記スポット各々に前記試料核酸を各々１種ずつ含有させる手法としては、ピペッティング等任意の手法で行うことができる。
工程（ａ）において、前記プローブ核酸と前記試料核酸とは、ハイブリダイゼーション溶液中インキュベートすることによりハイブリダイズさせることができる。
インキュベートの条件としては特に制限はないが、２５〜５０℃の範囲で行うことが好ましく、３０〜４５℃の範囲で行うことがより好ましく、３７〜４２℃の範囲で行うことが更に好ましい。また、ハイブリダイゼーションの時間は、８〜９６時間とすることが好ましく、１２〜７２時間とすることがより好ましく、１６〜４８時間とすることが更に好ましい。
【００４１】
工程（ａ）のハイブリダイズに用いるハイブリダイゼーション溶液としては該溶液において前記プローブ核酸と該試料核酸とがハイブリダイズする限り特に制限はない。前記プローブ核酸と該試料核酸とが好適にハイブリダイズする性質を有する溶液であることが好ましく、前記プローブ核酸と該試料核酸との配列の一致度が高いハイブリダイゼーションを促進し、その一方で、配列の一致度が低いハイブリダイゼーションを抑制する働きを有する溶液であることがより好ましい。
【００４２】
前記ハイブリダイゼーション溶液は、排除体積効果を有する物質、試料核酸の融点を低下させる物質、及びイオン強度を調整する溶液を含有することが好ましい。
前記排除体積効果を持つ物質として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば特開２０００−３２５０９９号公報参照）やデキストラン硫酸等が挙げられる。
前記試料核酸の融点を低下させる物質としては、ホルムアミド、グリセロール、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、グアニジン・チオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、ヨウ素などが挙げられる。
イオン強度を調整する溶液としては、ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）、ＳＳＰＥ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４）、ＭＥＳ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ等が挙げられる。
【００４３】
前記ハイブリダイゼーション溶液には、ブロッキング剤、界面活性剤等を含有させてもよい。
界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤等が挙げられる。アニオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等が挙げられる。ノニオン性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）などが挙げられる。
前記ブロッキング剤は、ハイブリダイゼーション時に非特異ハイブリダイゼーションの検出を低減するための物である。例えば、核酸マイクロアレイのバックグラウンドノイズを低減させる作用を主として有するｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、変性サケ精子ＤＮＡ、ｐｏｌｙ Ａ（ポリアデニル酸）、ｐｏｌｙ ｄＡ（ポリデオキシアデニル酸）、スキムミルクなどが挙げられ、一般に販売されているブロッキング剤も用いることができる。
【００４４】
この他に本実施態様において、特開２００５−０８７１０９公報に記載されているように、ハイブリダイゼーション溶液の組成の一つとして、リン脂質、デンハルト溶液（フィコール、ポリビニルピロリドン、ウシ血清アルブミンを主成分とする溶液）、４級アンモニウム塩であるベタイン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， １３７−１４４（１９９３））、ＴＭＡＣ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２， １５８５−１５８８ （１９８５））、市販されているハイブリダイゼーション溶液、例えば、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（東洋紡績株式会社製）、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ社製）などを用いることもできる。
【００４５】
ハイブリダイズは、標的核酸とプローブ核酸とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが好ましい。具体的なハイブリダイズの条件としては、例えば、３７℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った後、洗浄条件として、（１）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、３０秒間、（２）５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、１５分間、（３）２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（ｐＨ７．０）溶液を５ｍＬ、５０℃、３０分間、（４）２×ＳＳＣの溶液を５ｍＬ、室温、５分間の洗浄を行うことが挙げられる。
【００４６】
・工程（ｂ）
工程（ｂ）においては、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個のスポットにおけるハイブリダイズした該試料核酸の標識量値Ｆ１〜Ｆｎを取得する。
工程（ｂ）において、核酸マイクロアレイ上のハイブリダイズ後の標識強度を取得する手法としては標識強度を測定できる限り特に制限はない。
工程（ｂ）において、スポットＸ１の標識強度をＦ１、スポットＸ２の標識強度をＦ２…スポットＸｎ−１の標識強度をＦｎ−１、スポットＸｎの標識強度をＦｎと表す。ｎは３以上の整数である。
例えば、ラジオアイソトープであればＸ線フイルムやＢＡＳＳ（富士フイルム株式会社製）等を用いることができる。
標識物質として蛍光物質を用いた場合、蛍光スキャナーを用いることが好ましい。蛍光スキャナーとしては、例えば、ＦＬＡシリーズ（富士フイルム株式会社製）やＧｅｎｅＰｉｘシリーズ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＬＳ Ｒｅｌｏａｄｅｄ（テカン社製）などが挙げられる。
【００４７】
・工程（ｃ）
工程（ｃ）において、スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する。換言すれば、比較値の大小が陽性に相当するか否かについて、仮の判定を行う。工程（ｄ）を含まない従来の方法における陽性・陰性（特にＳ２〜Ｓｎのうちの標準核酸との比較値の判定結果）は、ここでいう仮に判定される陽性・陰性は、に相当する。
比較値とは、２つの同種のスポット同士の標識強度を比較することによって得られた数値であり、標識強度比、標識強度の差等が挙げられ、標識強度比であることが好ましく、標識強度比の対数値（Ｌｏｇ値）であることがより好ましく、標識強度比の底を２とする標識強度比の対数値（Ｌｏｇ２値）であることが更に好ましい。
比較値各々を陽性又は陰性と仮に判定する基準、即ち所定の数値範囲は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法と同等のものでよく、たとえば陽性であることが既知である試料核酸（ポジティブコントロール）と陰性であることが既知である試料核酸（ネガティブコントロール）を用意し、その中間値を閾値として判断することなどができる。
【００４８】
また、ハイブリダイズに供されるｎ種の試料核酸の量が互いに異なる可能性があるので、それを更正する工程を含むことが好ましい。このような工程は特に制限されず、異なるプローブ核酸セットにおいて得られた標識強度を比較する単色法のハイブリダイゼーションにおいて通常用いられている正規化を適用することができ、例えばグローバルノーマライゼーション等を使用することが出来る。
たとえば、各アレイ内のｐ個のスポットにおける標識強度の平均値や中央値を、比較するアレイ間で揃える方法や、後述する（ｃ２）の工程のように、１対のアレイ間の各スポットにおける各比較値を得た後で、該１対のアレイ間のｐ個の比較値の平均値や中央値が、ほかの１対のアレイ間のものと同じになるようにする方法が挙げられる。具体的には、個々の標識強度又は比較値と、各アレイ内のｐ個のスポットにおける標識強度の平均値や中央値で除した比や、標識強度の平均値や中央値を引いた値、あるいは偏差値で表す方法が挙げられる。
このような工程を含むことで、前述したような試料核酸量による差を更正することができる。ここで、更正する方法は特に限定されず、例えば平均値や中央値を標識強度に乗除する、平均値や中央値より一定値以上外れた値を除外するなどの方法が挙げられる。
【００４９】
また上記更正する工程で平均値や中央値で除した比とした場合、得られた値はコピー数に相当する値となる。前述した工程（ｃ）の所定の数値範囲は、各測定値（特に既知の変異を測定した値）を参考に明確に変異していると考えられる領域を除ける値を設定することもできるし、理論的なコピー数としてありえる数値から設定することもできる。後者としては、具体的には、異常のない常染色体上の特定の核酸領域が存在する個数が１コピーであり、１対の前記染色体対のコピー数を１とする場合、理論的にありえるコピー数は、０、０．５、１、１．５、２・・・と０．５おきの値となる。そのため、前記工程（ｃ）における判定を行う基準として、上記間隔の半分、即ち０．２５を閾値として仮の陰陽を判断したり、あるいは中間的な値（たとえば０．２〜０．３）を従来のように擬陽性として判定を行わずに除外したりすることもできる。
前記比較値の所定の数値範囲は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションの陽性を判断する基準と同様に設定することができる。例えば蛍光強度比を用いる場合、論理的には０．８〜１．２等の値を挙げることができるが、配列の特定等を考慮して任意に設定可能である。例えば後述する補正を行う場合はその分を乗除することができる。
【００５０】
即ち、本実施態様において前記工程（ｃ）は、ｎセットのプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットに対して、下記（ｃ１）〜（ｃ３）の工程を行う工程であることが好ましい。即ち、全部で（ｎ−１）×ｐ個の比較値が算出される。
［（ｃ１）前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているｐ対のスポット同士における標識強度を各々比較し、ｐ個の比較値を算出する工程］
［（ｃ２）工程（ｃ１）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する工程］
［（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを判定する工程］
より詳しくは、本実施態様においては、下記の工程を含む。
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイを備え、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
【００５１】
工程（ｃ３）において、比較値が標識強度比であって、標識強度比の平均値ないしは中央値の偏差を基準に陽性又は陰性と仮に判定することが好ましい。たとえば、平均値ないしは中央値の偏差に基づき閾値（所定の数値範囲）を設け、平均値ないしは中央値からの偏差が前記閾値を超える場合を陽性（又は陰性）と仮に判定することができる。
工程（ｃ２）・（ｃ３）における比較値の平均値又は中央値を算出する工程及びそれと各比較値を対比する工程は、上述したように比較値とする前に各プローブ核酸セット内のｐ個のスポットにおける各標識強度の平均値又は中央値を算出し、それと各標識強度とを対比することでも行うことができる。即ち、本実施態様において、前記工程（ｃ）が下記工程であってもよい。
［（ｃｃ）前記ｎセットのプローブ核酸セット内の各スポットにおける標識強度の平均値ないしは中央値を算出し、
その平均値ないしは中央値に基づく各スポットの偏差値（Ｆ’１、Ｆ’２…Ｆ’ｎ）をｎセットのプローブ核酸セット各々において算出し、
ｎセットのプローブ核酸セットうちの２個の対の間で同種のスポット同士の標識強度の比較値を算出し、Ｆ’１とＦ’２の対の比較値からＦ’１とＦ’ｎの対の比較値までのｎ−１個の比較値各々について、ｎセットの前記平均値ないしは中央値を基準に所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程］
【００５２】
なお、本実施態様では説明のために各工程について別々に番号をつけて説明しているが、この順番を制限するものではなく、同時に処理することを排除するものでもない。
【００５３】
・工程（ｄ）
工程（ｄ）において、所定の数値範囲に入らないと判定した数が、ｎ−１のうちの所定数を超える場合に前記スポットＸ１を陽性と確定する。該所定数は、ｎ−１の半数であることが好ましく、ｎが４以上かつ該所定数がｎ−１の７０％であることがより好ましい。また、一定数以下であるものについては、陰性と確定することが好ましいが、ある程度の範囲を定めて擬陽性とし、再検査を行うことも好ましい。再検査を行う場合でも、再検査を行う必要が生じる可能性は従来の方法より大幅に減らすことが期待できる。また再検査を行う場合には、比較対照を変えて行うことが好ましい。
なお、比較値が所定の数値範囲に入らないと判定した数が工程（ｄ）におけるｎ−１のうちの所定数を超えない場合は、スポットＸ１におけるデータは信頼性が欠けると判断して再検査を行う等の処理を行うことができる。
また、スポット（Ｘ１）は任意のスポットであり、通常スポットＸ１と同一のアレイ内の複数のスポット（好ましくはすべてのスポット）において、上記（Ｘ１）と置き換えて、本実施態様の（ａ）〜（ｄ）と同様の工程又は（ｉ）〜（ｉｉｉ）処理を行う。
【００５４】
・標識強度の補正
前記工程（ｂ）において取得される前記標識強度が補正された値であることが好ましい。
具体的には、前記工程（ｂ）における前記標識強度の取得が、下記工程から得られた値であることが好ましい。
あるスポットにおいて、標識された前記試料核酸と、固定化された前記プローブ核酸とをハイブリダイズさせる工程、
前記プローブ核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしうる配列を有し、標識された前記試料核酸とは異なる標識で標識されている標識された検証核酸を前記スポットに付与して前記プローブ核酸とハイブリダイズさせる工程、
前記スポットにおいてハイブリダイズした標識された前記試料核酸の標識強度を取得する工程、
前記スポットにおいてハイブリダイズした標識された前記検証核酸の標識強度を測定する工程、及び
前記検証核酸の前記標識強度に基づき、前記スポットにおける固定された前記プローブ核酸の量を検知し、該検知量により前記試料核酸の標識強度を補正する工程を含むことが好ましい。
この補正方法は、例えば特開２０１０‐００４８７３に記載の方法を用いることができる。
【００５５】
ここで、標識された前記試料核酸をハイブリダイゼーションさせる工程と、前記標識検証核酸（Ｂ）をハイブリダイゼーションさせる工程とが同時に行われ、かつ、
該ハイブリダイズした該標識試料核酸の量を測定する工程と、前記ハイブリダイズした検証核酸の量を測定する工程とが同時に行われることが好ましい。
ここで、検証核酸とは、前記プローブ核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしうる配列を有する核酸をいい、複数のスポットにおけるハイブリダイズ能力の大小、具体的には各スポットに固定化されているプローブ核酸の量に起因するばらつきを検知し、更にはプローブ核酸量のスポット間のばらつきを補正するために使用することができる。そのため、検証核酸は、核酸マイクロアレイ上の全スポットに固定化されているプローブ核酸とハイブリダイズ可能であればよく、どの様な配列、鎖長でも良い。ここで、全てのスポットとは、同一溶液の検体又は標準が反応する可能性がある全スポットを表し、通常は単一の核酸マイクロアレイ上のスポット全てのことであるが、これに限定されない。
また、ハイブリダイズ可能であれば、どの様な核酸でも良く、ＤＮＡやＲＮＡの様な天然型の核酸や、ＤＮＡやＲＮＡなどの天然型の核酸を化学修飾した核酸であってもよい。
例えば、ＰＮＡ、メチルホスホネート型ＤＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、キメラ型核酸などを用いることができる。
【００５６】
検証核酸として好ましい配列としては、反復配列が挙げられる。反復配列とは、リピート配列ともいい、ある塩基数ごとに制限酵素認識部位のように繰り返し出現する配列であり、短い塩基配列のパターンが何度も繰り返す配列、例えば、ｐｏｌｙ ｄ（ＡＴ）やｐｏｌｙ ｄ（ＧＣ）などや、一単位が数千塩基対に及ぶ長い配列が何度も繰り返す配列などをあげることができ、ヒト等の高等生物中にはゲノム中に高頻度で出現することが知られている。本実施態様においては、例えばインビトロジェン社で販売されているＣｏｔ−１ ＤＮＡを好適に用いることができる。
Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、通常、核酸マイクロアレイ測定時にマンマリアン（哺乳類）から得られた検体の反復配列をブロックするために使用される核酸として知られている。
【００５７】
そのＣｏｔ−１ ＤＮＡの少なくとも一部を標識化して未標識のＣｏｔ−１ ＤＮＡとともに用いることによって、特異的なハイブリダイゼーションの検出感度を高め、かつスポット差を低減させることもできる。
【００５８】
検証核酸は、検体の核酸とは異なり、かつ、プローブ核酸セット全てが共通して持っている配列を有する核酸を用いることも好ましい。
例えば、プローブ核酸中に共通に存在する核酸配列部分に実質的に相補的な核酸配列を有する、合成オリゴヌクレオチドを検証核酸として用いることもできる。
また、アレイを作製するときに用いたベクター（プラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ウィルスなど）の核酸、大腸菌のゲノムなど、アレイを作製する上で、全てのスポットに存在すると考えられる配列を有する核酸も検証核酸として使用出来る。
【００５９】
本実施態様では、試料核酸に対して、検証核酸の使用量をモル比で１以上用いることが好ましい。モル比を１以上用いることによって、核酸マイクロアレイの性能が向上する。
【００６０】
検証核酸の大きさは、２０ｂｐ以上であることが好ましく、２０ｂｐ〜１Ｍｂｐであることがより好ましく、１００ｂｐ〜５００ｋｂであることが更に好ましい。
検証核酸の使用量は、検体又は標準の核酸に対して、０．５〜２倍モルの範囲とすることが好ましい。
【００６１】
・自動化
本実施態様の核酸変異解析法は、すべての工程を手作業で行うこともできるし、部分的に自動化された機械で行うこともできるし、全工程を自動化された機械で行うこともできる。
自動化を行うことにより、作業者は煩雑な作業から解放され、人件費を低減し、熟練度の違いによる結果の差異を減少させ、ヒューマンエラーを防ぐことが可能となる。
【００６２】
・プログラム
次に、本実施態様のプログラムについて説明する。
本実施態様のプログラムは、以上説明した核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
【００６３】
手順（Ｉ）は下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であることが好ましい。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
【００６４】
本実施態様のプログラムを用いることにより、前述の標識強度を測定し得られたデータを処理する際、効率よくデータ処理を実施することができる。
該プログラムは、通常コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録した形態で提供される。該記録媒体は、コンピュータが読み取り可能なものである限り特に制限はない。本実施態様の記録媒体は、可搬型又は固定型の両方の媒体が含まれ、例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）、ハードディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
本実施態様のプログラムは、上記記録媒体に記録されて流通させることも、コンピュータの記録装置に記録しておき、ネットワークを通じて他のコンピュータに転送する形態で流通させることもできる。
【００６５】
次に、本実施態様の、遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法について説明する。
本実施態様の、遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法は、上記説明した核酸変異解析法を用いてなる。診断の対象となる前記疾患としては、癌、遺伝病、感染症等の核酸になんらかの情報を持ちうる疾患が全て該当し特に制限するものではない。
本実施態様の診断方法において、正常細胞（がん化していない細胞）から抽出した核酸を標準核酸、異常細胞（例えば、癌患者、遺伝病患者、感染症患者に由来する細胞）から抽出した核酸を検体核酸として上記説明した核酸変異解析法に適用することで、検体の提供患者、又は検体とした細胞の病変についてＣＮＶ等の原因に起因する擬陽性ないし擬陰性の影響を受けることなく診断することができる。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の主旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って本発明の範囲は以下の具体例に制限されるものではない。
なお、以下の実施例において、Ｃｙ３−ｍａｌｅとは、ｍａｌｅ ＤＮＡに対して、Ｃｙ３で標識したものを示す。同様に、Ｃｙ５−ｍａｌｅとは、ｍａｌｅ ＤＮＡに対して、Ｃｙ５で標識したものを示す。また、Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ等も同様に、それぞれの標識化合物で標識した核酸であることを示す。
【００６７】
〔実施例１〕
１．標識された試料核酸の調製
マイクロチューブに、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅ （プロメガ株式会社製， カタログ番号Ｇ１５２；以下ｍａｌｅのゲノムＤＮＡと呼ぶ）を３μＬ（０．７５μｇ）、水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ ＤＮＡｓｅ， ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ， ＧＩＢＣＯ）を８μＬ、アレイＣＧＨ用のラベリングシステム（ＢｉｏＰｒｉｍｅ （登録商標） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の２．５ｘＲａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （インビトロジェン株式会社）を２０μＬ入れ、ブロックインキュベータを用いて、９５℃で５分間熱処理、３７℃で１５分間静置した。
【００６８】
前記ラベリングシステムの１０ｘｄＣＴＰ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ （インビトロジェン株式会社）を５μＬ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を３μＬ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ （登録商標） Ａｒｒａｙ ＣＧＨ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＳｙｓｔｅｍのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ （インビトロジェン株式会社）を１μＬ添加し、ブロックインキュベータを用いて３７℃で２時間、標識化反応と同時に増幅反応を行った。ついでブロックインキュベータを用いて６５℃に加熱し、反応溶液中に含まれているＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔを失活させた。
【００６９】
上記操作をＣｏｒｉｅｌｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌの細胞株ＧＭ０７１８９（以下検体核酸Ｎｏ．１と呼ぶ）、ＧＭ０７１８９（同検体核酸Ｎｏ．２）、ＧＭ１３４５１（同検体核酸Ｎｏ．３）、及びＧＭ１３４５１（同検体核酸Ｎｏ．４）から、ｐｕｒｅｇｅｎｅ（ＱＩＡｇｅｎ社）のプロトコルに沿ってゲノム抽出を実施した。抽出したＤＮＡについては、ナノドロップ（スクラム社）を用いてＯＤを測定した。このように得られたゲノムに対しても、上記Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅと同様の操作を行って、未精製標識試料核酸を得た。なお、これらに対しても、標識化合物として、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いた。
【００７０】
２．１．標識検証核酸の調製
マイクロチューブにＣｏｔ−１ ＤＮＡ （インビトロジェン株式会社製、カタログ番号１５２７９−０１１）を３μｇ（１３μＬ）用い、標識化合物にＣｙ５−ｄＣＴＰ Ｂｕｌｋ Ｐａｃｋ ２５０ｎｍｏｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を３μＬ用いた以外は同様にして、標識された検証核酸（未精製）を得た。
【００７１】
２．２．標識検証核酸を含むハイブリダイゼーション用溶液の調製
マイクロチューブに、標識核酸Ｃｙ５−Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを２１μＬ、未標識のＣｏｔ−１ ＤＮＡ ６２μＬ（６２μｇ、インビトロジェン株式会社製）を６２μｇ、ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡを０．３μｇ、３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）を９μＬ添加し、−２０℃の９９．５％（ｖ／ｖ）エタノールを３６０μＬ添加し、エタノール沈殿を行った。乾燥後、水８．７μＬ、ホルムアミド６．５μＬ、２０％ ＳＤＳ １６．８μＬを加えた。ここに、デキストラン１ｇ、ホルムアミド５ｍＬ、２０×ＳＳＣ １ｍＬに水を加えて７ｍＬとしておいたデキストラン・ホルムアミド溶液３２μＬを添加し、完全に溶解させた。その後、１つのチューブにまとめ、３０μＬずつチューブに分注した。
ここに、上記標識された試料核酸のゲノム１０μＬずつを添加し良く攪拌した。その後、７５℃１５分インキュベートした後、４２℃に３０分以上保温した。
【００７２】
３．ＢＡＣアレイスライドの作製
ヒトゲノムをインサートとしたＢＡＣライブラリーから、染色体ごとにランダムかつ先天性異常が含まれる遺伝子領域と考えられる領域を含むＢＡＣを選択し、ＬＢ培地５０ｍＬ（＋クロラムフェニコール）で１晩培養した。上記ＢＡＣは染色体ごとにある一定の長さで選んだものであり、最終的に約３４０スポットとしたものである。
これをＱＩＡＧＥＮ社ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｄｉ ｋｉｔを用いて添付されたプロトコール通り抽出した。これを１．５μｇ／１６μＬＴＥに調整し、制限酵素ＲｓａＩ、ＤｐｎＩ、ＨａｅＩＩＩを用いてそれぞれ２時間消化後、８０℃２０分で失活させ、３種を混合させた。更に、配列番号１の配列を有するアダプター：５’−ａａｔｔｃｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｇ−３’及び配列番号２の配列を有するその相補鎖である：５’−Ｐ−ｃａｔｃｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇｇ−３’（５’末端リン酸化）を添加し、９５℃５分、７０℃１５分、６５℃１５分、６０℃１５分、５５℃１５分、５０℃１５分、４５℃１５分、４０℃１５分、３５℃１５分、３０℃１５分、２５℃１５分でアダプターを制限酵素消化後のＤＮＡ断片に付着させ、１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液５μＬ及びＴ４リガーゼ２．５μＬを添加し、制限酵素処理後のＤＮＡ断片とアダプターを結合させた。これをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。ＥＸ−Ｔａｑ（タカラバイオ社製）と配列番号３の配列を有する５’末端アミノ化プライマー：５’−ＮＨ２−ｇｇａａｔｔｃｃｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｇ−３’を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは１ｓｔＰＣＲとして１５サイクル、２ｎｄＰＣＲとして１０サイクル実施した。これをマイクロコンカラムにて限外濾過を実施し精製し、最終濃度１μｇ／μＬとし、プローブ核酸とした。これを日本碍子社に送付し、松波ガラスのスライドガラスにピエゾ法によりスポッティングを実施させ、ＢＡＣアレイとした。
更に、このＢＡＣアレイを特開２００２−１７６９７７公報に記載されている手順に準じてブロッキング、熱変性を行なった。
【００７３】
４．ハイブリダイゼーション
アロカ社のハイブリマスターＨＳ３００を用いてハイブリダイゼーションを実施した。
ＢＡＣアレイスライドをいれ、３７度になるように設定し、ハイブリダイゼーション溶液を添加後、１６時間攪拌しながらハイブリダイゼーションを実施した。この際、保湿液としては５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣを用いた。その後、２５℃で５分５ｍＬの２×ＳＳＣ、５分１０ｍＬの２×ＳＳＣで洗浄、５０℃で１４分５ｍＬの５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ、３０分５ｍＬの０．１％ＳＤＳ／２×ＳＳＣで洗浄し、５分２５℃の２×ＳＳＣで洗浄した。
【００７４】
５．蛍光画像の取り込み及びデータ処理
ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ（ａｘｏｎ社製）を用いて蛍光画像を取り込んだ。これを数値化したｇｐｒファイルを基に計算を実施した。計算方法は、Ｃｏｔ‐１ ＤＮＡの蛍光値であるｃｙ５を補正の指標として、ｃｙ３で標識した標識ゲノムの蛍光強度に対し補正を実施して比較を行った。蛍光値はバックグラウンド蛍光値を差し引いたものを用いた。
計算方法：ｌｏｇ２（ゲノム検体核酸の蛍光強度／標識ｃｏｔ‐１（検体）／ゲノム標準核酸の蛍光強度×標識ｃｏｔ‐１（標準））
この計算を、このようにして検体核酸Ｎｏ．１をハイブリダイズした全スポットと、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅをハイブリダイズした全スポットにおける同種のスポットの全ての対において行った。
上記計算により得られた全スポット対の値に対して、全スポット対の中央値で除することによりグローバルノーマライゼーションを行った。
このようにして検体核酸Ｎｏ．１と、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅとの比較を行った。しかし、標準核酸のＣＮＶが既知でないため、この比較結果では擬陽性ないし擬陰性を含んでいる可能性がある。
そこで、標準核酸Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍａｌｅの代わりに検体核酸Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、Ｎｏ．４に変更して同様に検体核酸Ｎｏ．１との比較を各々行った。
【００７５】
６．結果
図３〜６に、上記計算を行った結果を示す。縦軸は蛍光強度比、横軸はスポット番号（プローブ核酸番号）を表す。図３〜６中、◆は閾値内のデータ、□は閾値外のデータ（＋方向に外れたもの）、△は閾値外のデータ（−方向に外れたもの）を表す。閾値は０．８及び１．２と設定した。
図３は、検体核酸 Ｎｏ．１と標準核酸であるｍａｌｅのゲノムＤＮＡの蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図４は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．２の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図５は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．３の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
図６は、検体核酸 Ｎｏ．１と検体核酸 Ｎｏ．４の蛍光強度比の対数プロットの結果を示す図である。
【００７６】
各図において常染色体に相当するスポットで、閾値を外れたのは以下のスポットである。
図３：４、１７、８１、１１１、１２７、１３５、１４５、１４６、１４７、１６３、１９７、２０２、２２１、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２４４、２４５、２６４、３１０、３２８
図４：３１、１８１、１９７、２１９、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２８１、２９１、３１４、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２
図５：１、６、１０、１３、１５、１９、２０、２１、２７、２９、３０、３５、３６、４４、４７、５１、５２、５５、５７、５９、６４、６６、７２、８０、８６、９４、９６、１１３、１３７、１４１、１５７、１６７、１７４、１７８、１８１、１８５、２０４、２１５、２１６、２１７、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３６、２５６、２６７、２６９、２７８、２７９、２８７、２９０、２９１、２９９、３０５、３０７、３３４
図６：１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１７、２９、３１、５２、８６、１１１、１１３、１６３、１７４、１９７、２１６、２１７、２２６、２２７、２２８、２３０、２３１、２３２、２３６、２４５、２７３、２８７、２９０、３０６、３４２
この結果、１９７、２２５〜２３２の各スポットにおいては、図３〜図６のうちの過半数の結果において閾値を越えているため、陽性であると判定できた。その他の上記閾値を越えたスポットについては、擬陽性又は擬陰性と判定できた。
これにより、Ｎｏ．１の試料は、１９７、２２５〜２３２のスポットに固定化した核酸に対応する遺伝子にコピー数が増加する異常があることがわかった。
また、Ｎｏ．２〜Ｎｏ．４の試料及び標準としたｍａｌｅについて、上記Ｎｏ．１の試料と置き換えて同様に測定することで、それぞれのコピー数変化を測定することが出来る。
なお、本実施例で該当する例は無かったが、あるスポットについてのアレイ間比較結果で、正の閾値外及び負の閾値外両方の結果が存在する場合（例えば図３、４でｎ番スポットが□、図５、６で同ｎ番スポットが△となった場合）、当該スポットは陽性とは判断しないことが好ましい。
【００７７】
以上の結果から、本発明の方法により擬陽性等の影響を受けることなく陽性又は陰性に確定できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の核酸変異解析法、プログラム及び診断方法は、従来のアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法で問題となっていた解析結果における擬陽性ないし擬陰性の影響、特に標準核酸のＣＮＶによる影響を低減し解析結果の信頼性を向上させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つの核酸マイクロアレイ上に複数のスポットがあり、該複数のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化されている同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該ｎセットのプローブ核酸セットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程と、
（ｂ）前記ｎセットのプローブ核酸セットから選ばれた、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個の各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程と、
（ｃ）スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの各標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程と、を有し、
ｎは３以上の整数であり、前記試料核酸は検体核酸または標準核酸であり、少なくとも前記Ｓ１は検体核酸であり、Ｘ１はＳ１を接触させたスポットである、
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。
【請求項２】
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも２種が検体核酸である請求項１に記載の核酸変異解析法。
【請求項３】
（ｃ’）Ｆ２とＦ１の比較値からＦ２とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ’）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ’）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ２を陽性と判断する工程と、を更に有し、前記スポットＸ２は前記Ｓ１とは異なる試料核酸Ｓ２と接触させたスポットである、請求項１又は２に記載の核酸変異解析法。
【請求項４】
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも１種が標準核酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項５】
前記ｎ種の試料核酸がすべて検体核酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項６】
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項７】
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイに備えられ、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
を有する、上記１〜６のいずれか一項に記載の核酸変異解析方法。
【請求項８】
前記各試料核酸がすべて同じ標識で標識されている請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）における前記標識強度Ｆ１〜Ｆｎが補正された値である請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
【請求項１１】
請求項１０に記載されたプログラムであって、手順（ｉ）が下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であるプログラム。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法。
【請求項１】
（ａ）１つの核酸マイクロアレイ上に複数のスポットがあり、該複数のスポットに互いに異なるプローブ核酸が固定化されている同一のプローブ核酸セットをｎセット用いて、該ｎセットのプローブ核酸セットに対し、標識された、Ｓ１〜Ｓｎのｎ種の試料核酸をそれぞれ１種ずつ接触させてハイブリダイズさせる工程と、
（ｂ）前記ｎセットのプローブ核酸セットから選ばれた、同一のプローブ核酸が固定化されているＸ１〜Ｘｎのｎ個のスポットを選択し、Ｘ１〜Ｘｎのｎ個の各スポットにおいてハイブリダイズした該試料核酸の標識強度Ｆ１〜Ｆｎを取得する工程と、
（ｃ）スポットＸ１の標識量値Ｆ１とＦ２〜Ｆｎの各標識量値とを比較することによってｎ−１個の比較値Ｃ２〜Ｃｎを得て、該比較値の各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する工程と、を有し、
ｎは３以上の整数であり、前記試料核酸は検体核酸または標準核酸であり、少なくとも前記Ｓ１は検体核酸であり、Ｘ１はＳ１を接触させたスポットである、
アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション法による核酸変異解析法。
【請求項２】
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも２種が検体核酸である請求項１に記載の核酸変異解析法。
【請求項３】
（ｃ’）Ｆ２とＦ１の比較値からＦ２とＦｎの比較値までのｎ−１個の比較値各々が所定の数値範囲に入るか否かを判定する工程と、
（ｄ’）前記ｎ−１個の比較値のうち、工程（ｃ’）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値の個数が所定数を超えるか否かを判定し、所定数を超える場合に、前記スポットＸ２を陽性と判断する工程と、を更に有し、前記スポットＸ２は前記Ｓ１とは異なる試料核酸Ｓ２と接触させたスポットである、請求項１又は２に記載の核酸変異解析法。
【請求項４】
前記ｎ種の試料核酸の少なくとも１種が標準核酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項５】
前記ｎ種の試料核酸がすべて検体核酸である請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項６】
前記ｎ種の試料核酸が、生物分類学的に同一種に属する異なる個体に由来する核酸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項７】
ｎ個の同一のプローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎが備えられており、
各プローブ核酸セットＮＳｉはｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐを有する核酸マイクロアレイに備えられ、ｉは整数かつ１≦ｉ≦ｎであり、ｐは整数かつ２≦ｐであり、
互いに異なるプローブ核酸が各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットｔｉ１〜ｔｉｐに固定されており、
各プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットの１つが前記スポットＸｉであり、
スポットｔ１ｊ〜ｔｎｊには同一のプローブ核酸が固定されており、ｊは整数かつ１≦ｊ≦ｐであり、
前記工程（ａ）は標識された試料核酸Ｓｉをプローブ核酸セットＮＳｉに接触させて、プローブ核酸セットＮＳｉのｐ個のスポットに固定された核酸に試料核酸Ｓｉをハイブリダイズさせ、
工程（ｂ）は各プローブ核酸セットＮＳｉのスポットｔｉ１〜ｔｉｐにおいてハイブリダイズされた試料核酸の標識量値Ｆｉ１〜Ｆｉｐを取得し、
プローブ核酸セットＮＳ１〜ＮＳｎから、ＮＳ１とＮＳｍが選択され、ｍは整数かつ２≦ｍ≦ｎであり、
工程（ｃ）は
（ｃ１）標識量値Ｆ１ｊとＦｍｊを比較してｐ個の比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’を求め、
（ｃ２）比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’の平均値又は中央値を算出し、
（ｃ３）工程（ｃ２）で得られた平均値又は中央値に基づき所定の数値範囲を設定し、比較値Ｃ１’’〜Ｃｐ’’が該所定の数値範囲内にあるか否かを判断する工程
を有する、上記１〜６のいずれか一項に記載の核酸変異解析方法。
【請求項８】
前記各試料核酸がすべて同じ標識で標識されている請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）における前記標識強度Ｆ１〜Ｆｎが補正された値である請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸変異解析法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法におけるデータ処理を実行するためのプログラムであって、下記の手順（Ｉ）及び（ＩＩ）を実行するためのプログラム。
［（Ｉ）Ｆ１とＦ２からＦ１とＦｎとのｎ−１個の比較値が所定の数値範囲に入るか否かを比較する手順］
［（ＩＩ）前記（Ｉ）で仮に決定したｎ−１個の比較値全てのうち、手順（Ｉ）で所定の数値範囲に入らないと判定された比較値が所定数を超えて存在する場合に、前記スポットＸ１を陽性と判断する手順］
【請求項１１】
請求項１０に記載されたプログラムであって、手順（ｉ）が下記の手順（ｉ）〜（ｖ）であるプログラム。
［（ｉ）ｎ個のプローブ核酸セットの各々にｐ個ずつあるスポットにおいて、
前記ｎセットのプローブ核酸セットからスポットＸ１を含むように選択される２個のプローブ核酸セットの対を選び、
該２個のプローブ核酸セットの間で同一のプローブ核酸が固定化されているスポット同士の標識強度の比較値を算出する手順］
［（ｉｉ）前記手順（ｉ）における比較値の算出を、プローブ核酸セット内のｐ個のスポット同士において行う手順］
［（ｉｉｉ）前記手順（ｉｉ）で得られたｐ個の比較値の平均値又は中央値を算出する手順］
［（ｉｖ）前記手順（ｉｉｉ）で得られた平均値又は中央値から所定の数値範囲を設定し、ｐ個の比較値それぞれが該所定の数値範囲を越えているか否かを比較する手順］
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸変異解析法を用いてなる遺伝子の変異に由来する疾患の診断方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−７８４０９（Ｐ２０１１−７８４０９Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０２４９４（Ｐ２０１０−２０２４９４）
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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