アンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法
【課題】簡便で正確な測定が可能なアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法を提供する。
【解決手段】デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物、被検試料、アンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］ 上記工程においてアンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【解決手段】デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物、被検試料、アンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］ 上記工程においてアンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシンＩは非常に重要な生理活性ペプチドであり、アンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という）によりＣ末端のジペプチドが切除されてアンジオテンシンＩＩとなる。このアンジオテンシンＩＩは極めて強い血圧上昇活性を有することから、ＡＣＥの阻害剤は降圧剤として期待でき、また、ＡＣＥの活性化剤は昇圧剤として期待できる。実際、ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル（Ｄ−３−メルカプト−２−メチルプロパノイル−Ｌ−プロリン）は、高血圧の治療剤として用いられている。
【０００３】
従って、ＡＣＥ活性を測定する技術は、薬剤探索に利用できるものとして有用である。特に近年、高血圧症などの成人病が問題となっており、降圧作用を有する物質を探索する技術は特に重要視されている。例えば、食品のＡＣＥ活性を測定することによりそのＡＣＥ阻害活性を見出すことができれば、その食品を高血圧予防の機能性食品として用いることが考えられる。また、降圧作用物質自体の探索も重要である。さらに、ＡＣＥ活性の測定技術を疾病の診断に応用することも可能である。
【０００４】
従来のＡＣＥ活性の測定方法としては、非特許文献１と２に記載のものが知られている。この方法では、基質化合物としてＨｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（「Ｈｉｐ」は馬尿酸を示す）を用い、被検試料と共にＡＣＥを加えて反応を行なう。そして、反応の結果生じた馬尿酸の量により被検試料の阻害活性を測定するものである。
【０００５】
ところがこの方法は煩雑であり、自動分析に不適であって、多種類の試料の分析には不向きであるという欠点を有する。つまり、この方法では反応により遊離する馬尿酸を酢酸エチルにより抽出し、酢酸エチルを除去した後に再溶解して２２８ｎｍの吸光度を測定する。この様に抽出操作が必要であることに加え、酢酸エチルを完全に除去しなければ正確な測定ができないなど、この方法は簡便なものではない。
【０００６】
そこで、上記方法の欠点を克服するために、ＡＣＥ阻害剤により切断され遊離した基質化合物の断片を蛍光化合物へ誘導したり、遊離する断片が紫外線により変化を示す様な基質化合物を用いる方法が開発されている。
【０００７】
例えば非特許文献３に記載の方法では、基質化合物としてｐ−ヒドロキシ馬尿酸−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを用い、被検物質の存在下でＡＣＥを作用させる。この反応により遊離したｐ−ヒドロキシ馬尿酸をヒップリカーゼ（アミノアシラーゼ）によりｐ−ヒドロキシ安息香酸とグリシンに切断し、さらにｐ−ヒドロキシ安息香酸を、４−アミノアンチピリンと過酸化水素と共にペルオキシダーゼによりキノンイミン色素に変換する。得られた反応液はそのまま吸光度測定に用いることができ、生じたキノンイミン色素の量を把握することによって、被検物質のＡＣＥ阻害活性を確認することができる。
【０００８】
しかしこの方法で使用するペルオキシダーゼは基質特異性が低いために、特に食品など様々な化合物を含むものを被検試料とする場合には、正確な測定ができない。また、過酸化水素の反応性は高いことから、測定を妨害する様な酸化反応を単独で起こすことがある。さらに、４−アミノアンチピリンは発癌性を有するという問題もある。
【非特許文献１】川岸舜朗 編著，「生化学実験法３８ 食品中の生体機能調節物質研究法」，学会出版センター，「ＩＩＩ−３ アンジオテンシン変換酵素阻害物質」，第１１６〜１２９頁（１９９６年発行）
【非特許文献２】D．Y．Cushman，H．S．Cheung，バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem．Pharmacol．），第２０巻，第１６３７〜１６４８頁（１９７１年）
【非特許文献３】Y．Kasahara，Y．Ashihara，クリニカル・ケミストリー，第２７巻１１号，第１９２２〜１９２５頁（１９８１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した様に、ＡＣＥ活性の測定方法の開発は極めて重要であると認識されており、既に様々な方法が知られている。しかし近年、成人病リスクが一般的に高まるにつれ高血圧症が問題となっており、ＡＣＥ活性に関与する化合物の探索をより広く行なう必要が生じていることから、より一層簡便で正確に行なえる測定方法が求められている。
【００１０】
そこで、本発明が解決すべき課題は、簡便で正確な測定が可能なＡＣＥ活性の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、従来方法の欠点を克服する手段につき鋭意検討を進めた。その結果、ＡＣＥの作用により生じた化合物を、最終的に基質特異性の高いデヒドロゲナーゼを用いて酸化し、この酸化化合物の生成量を測定する方法であれば、被検試料によるＡＣＥ活性の変化を簡便で正確に測定できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明に係るＡＣＥ活性の測定方法は、
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（以下、「ＡＣＥ基質化合物」という）、被検試料、ＡＣＥおよびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
【００１３】
【化１】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
【００１４】
上記工程においてＡＣＥおよびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程、
を含むことを特徴とする。
【００１５】
ＡＣＥ基質化合物としては、下記化合物（Ｉ）が好適である。
【００１６】
【化２】
［式中、Ｒは低級アルキルを示し、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【００１７】
上記化合物（Ｉ）は、先ずＡＣＥによりＣ末端側のジペプチド（−Ｘ−Ｙ）が切断され、次いでアミノアシラーゼによりＧｌｙが切断されて、３−ヒドロキシ脂肪族カルボン酸が生成する。この３−ヒドロキシ脂肪族カルボン酸は、デヒドロゲナーゼの代表的な基質化合物である。
【００１８】
ここで「低級アルキル」とは、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等である。
【００１９】
ＡＣＥ基質化合物としては、さらに下記化合物（Ｉａ）が好適である。
【００２０】
【化３】
［式中、ＸおよびＹは、上述したものと同義を示す］
【００２１】
当該化合物（Ｉａ）は、ＡＣＥとアミノアシラーゼの作用により３−ヒドロキシ酪酸となる。この３−ヒドロキシ酪酸はデヒドロゲナーゼの代表的な基質化合物であり、デヒドロゲナーゼとＮＡＤを用いる簡便な定量キットも市販されており、容易に定量することができる。
【００２２】
上記測定方法においては、デヒドロゲナーゼとして、補酵素であるＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用い、生成した酸化化合物の生成量を、ＮＡＤＨの生成量として間接的に測定することが好ましい。ＮＡＤＨの生成量は、直接的または間接的に比較的簡便且つ正確な測定が可能である。また、ＮＡＤＨの生成量の測定方法としては様々なものが開発されており、それらから適切なものを選択して使用できる。
【００２３】
使用するアミノアシラーゼの量は、１７２０００Ｕ／ｍＬ以上が好適である。３０分間という短い反応時間であっても、Ｇｌｙの切断反応が１００％進行することが実証されているからである。
【００２４】
また、０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬのＡＣＥを用いることが好ましい。この範囲のＡＣＥを用いれば、反応時間と反応の進行はほぼ直線関係にすることができるので、所定の反応時間経過後におけるＡＣＥ活性に対する被検試料の作用を、より正確に比較できるからである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明で用いるデヒドロゲナーゼは、基質特異性が非常に高い。また、デヒドロゲナーゼを使用して化合物を定量する方法は正確で簡便であり、よく研究されている。よって、デヒドロゲナーゼを利用してＡＣＥの活性を測定する本発明方法は、正確で簡便である。
【００２６】
従って本発明は、例えば食品など様々な化合物が含まれている被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を測定するのに適していることから、高血圧を予防する機能性食品や降圧剤の探索に利用できるものとして産業上極めて有用である。また、本発明は、疾病の診断にも適用できる可能性も有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明に係るＡＣＥ活性の測定方法は、
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（ＡＣＥ基質化合物）、被検試料、ＡＣＥおよびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程（以下、「ＡＣＥ反応工程」という）、および
【００２８】
【化４】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
【００２９】
上記工程においてＡＣＥおよびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程（以下、「デヒドロゲナーゼ反応工程」という）
を含むことを特徴とする。先ず、ＡＣＥ反応工程について説明する。
【００３０】
ＡＣＥ反応工程では、以下の反応が進行する。即ち、ＡＣＥの作用により末端ジペプチド（−Ｘ−Ｙ）が切断され、さらにアミノアシラーゼの作用によりＧｌｙが切断されることによって、デヒドロゲナーゼの基質化合物が生成する。なお、式中の「ＤＨ」はデヒドロゲナーゼを示す。
【００３１】
【化５】
【００３２】
本発明方法で用いる「ＡＣＥ基質化合物」は、デヒドロゲナーゼ基質化合物のカルボキシル基に、トリペプチドである−Ｇｌｙ−Ｘ−ＹのＮ末端アミノ基がアミド結合した化合物である。ここでＸとＹは、Ｌ−アミノ酸であればその種類は制限されず、一般的な天然アミノ酸、異常アミノ酸、合成アミノ酸などを用いることができるが、ＡＣＥの基質となる必要があることから、一般的な２０種類の天然Ｌ−アミノ酸が好適である。より好ましくは、ＡＣＥはアンギオテンシンＩのＣ末端の−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを切断してアンギオテンシンＩＩに変換することから、−Ｈｉｓ−Ｌｅｕとすることができる。また、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙも切断され易いことから好適である。
【００３３】
デヒドロゲナーゼの基質化合物は、次工程で使用するデヒドロゲナーゼの基質となるものであり且つ上記トリペプチド（−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）とアミド結合するためのカルボキシル基を有するものであれば、特にその種類は問わない。例えば、Ｄ−またはＬ−乳酸、Ｄ−またはＬ−リンゴ酸、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸などを用いることができる。
【００３４】
「ＡＣＥ基質化合物」としては、下記化合物（Ｉ）が好適であり、さらにＲ基がメチル基である下記化合物（Ｉａ）が好ましい。
【００３５】
【化６】
［式中、Ｒ、ＸおよびＹは、上述したものと同義を示す］
【００３６】
「ＡＣＥ基質化合物」は、デヒドロゲナーゼの基質化合物が一般的に市販されているなど容易に入手できることから、当該基質化合物に一般的な手法でトリペプチドを結合させることにより入手できる。
【００３７】
ＡＣＥ反応工程における「ＡＣＥ基質化合物」の量は、特に制限されないが、ＡＣＥ活性を評価できる程度に十分に存在せしめる必要がある。一般的には、反応系に５〜１０ｍＭ程度添加すればよい。
【００３８】
「被検試料」は、蒸留水等に溶解または懸濁した後、不溶成分が存在する場合には好ましくは濾過して反応系に添加する。或いは、そのまま反応系に添加すればよい。
【００３９】
被検試料の添加量は特に制限されないが、様々な化合物が含まれる試料の場合、アミノアシラーゼなどの酵素反応が過剰に阻害されることを防ぐために抑制する必要が生じることがある。また、複数の被検試料を測定して結果を比較する場合には、添加量を同一にする。何れにせよ、被検試料の添加量は、予備実験などにより適切に決定する必要がある。
【００４０】
ＡＣＥは、ヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ由来のものなど何れのものも使用でき、市販のものや単離精製したものを用いればよい。
【００４１】
ＡＣＥの添加量は、適度な反応時間において、ＡＣＥの作用による化合物の分解反応の進行と反応時間とが実質的な直線関係を形成する程度とする。一般的には、０．０５〜０．３Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬとする。
【００４２】
アミノアシラーゼも、市販のものや単離精製したものを用いればよい。また、その添加量は、ＡＣＥの作用により生成した化合物の末端Ｇｌｙを、適度な反応時間で定量的に切断できる程度にすることが好ましい。例えば、８００００Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１５００００Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１７００００Ｕ／ｍＬとする。
【００４３】
ＡＣＥ反応工程の反応は、上記各化合物等を溶媒中に混和することにより開始することができる。各化合物等の添加は、各化合物等の溶液を添加することによってもよい。使用できる溶媒としては、蒸留水、精製水、純水、超純水などを用いることができる。
【００４４】
反応温度は、通常、３７℃程度の恒温とする。また、反応時間は特に問わないが、複数の被検試料の結果を比較する場合には一定にする必要があり、また、ＡＣＥの作用による化合物の分解反応の進行と反応時間とが実質的な直線関係を形成する程度とする。その様な反応時間は、予備実験により決定すればよい。
【００４５】
所定の反応時間後、次のデヒドロゲナーゼ反応工程に移行すればよい。なお、複数の被検試料を比較するためには、当然に反応時間を同一にする。反応時間を厳密にするためには、塩酸を適量、例えば最終濃度で０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ程度添加して、反応を停止させてもよい。但し、かかる反応停止剤が次工程の反応を阻害する可能性もあるため、所定の反応時間後に適量の反応混合液を抜き出して、次工程の反応系に加えるという方法を採ってもよい。
【００４６】
デヒドロゲナーゼ反応工程では、ＡＣＥ反応工程で生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する。この工程によって、ＡＣＥ反応工程においてＡＣＥの作用により分解された化合物の量や割合を間接的に測定することができ、結果としてＡＣＥの活性を測定できる。
【００４７】
当該工程では、ＡＣＥ反応工程の反応混合液とデヒドロゲナーゼとを混合する。好適には、デヒドロゲナーゼの溶液へＡＣＥ反応工程の反応混合液を添加し混合する。
【００４８】
デヒドロゲナーゼは、一般的に基質特異性が高い（例えば、今堀和友ら監修「生化学辞典第２版」東京化学同人，第８０１頁，「脱水素酵素」の項を参照）。よって、被検試料に様々な混合物が含まれている場合であっても、酵素反応が阻害される可能性は低く、より正確に測定することができる。
【００４９】
デヒドロゲナーゼとしては、ＡＣＥ反応工程でＡＣＥの基質化合物に含まれるデヒドロゲナーゼ基質化合物に対応するものを用いる。例えば、当該デヒドロゲナーゼ基質化合物として３−ヒドロキシ酪酸を利用する場合には、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを用いる。この様なデヒドロゲナーゼはよく研究されており、また、市販されているものもあるので、市販品を用いてもよいし単離精製したものを用いてもよい。
【００５０】
デヒドロゲナーゼの使用量は特に制限されないが、ＡＣＥ反応工程により得られたデヒドロゲナーゼ基質化合物を定量的に酸化できる量を使用することが好ましい。具体的には、もちろん酸化すべきデヒドロゲナーゼ基質化合物の量にもよるが、１０〜２０Ｕ／ｍＬ程度とすることができる。
【００５１】
当該酸化反応における反応温度や反応時間などは、使用するデヒドロゲナーゼの至適温度や活性などに応じて決定すればよい。好適には、デヒドロゲナーゼ基質化合物を定量的に酸化できる程度にする。
【００５２】
酸化反応後には、得られた酸化化合物の生成量を測定する。得られた数値を比較することによって、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を把握することができる。この測定は、酸化化合物の生成量を直接定量してもよいし、補酵素としてＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用いた場合には、ＮＡＤＨの生成量を測定してもよい。また、酸化化合物やＮＡＤＨをさらなる反応に付し、その生成量を間接的に測定してもよい。例えば、デヒドロゲナーゼ基質化合物の１つとしてＤ−３−ヒドロキシ酪酸があり、このＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量するためのキットが市販されている。このキットでは、下記反応を利用し、フォルマザンという化合物の生成に伴って増加する波長４９２ｎｍの吸光度の変化によりＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量する。なお、下記式において、３−ＨＢＤＨとは３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの略称であり、ＩＮＴは塩化ヨードニトロテトゾリウムを示す。
【００５３】
【化７】
【００５４】
なお、デヒドロゲナーゼの基質化合物は、被検試料にもとから含まれている可能性がある。例えば３−ヒドロキシ酪酸は、生体内でアセチルＣｏＡからアセト酢酸を経て生合成されるので、被検試料中に存在している場合がある。この様な場合には、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を正確に測定することができなくなる。従って、事前にＡＣＥ反応工程を行なわず被検試料中のデヒドロゲナーゼ基質化合物を測定して、その存在の有無を確認しておくことが好ましい。存在が確認された場合には、本発明方法による測定を行なった後に、得られた数値から被検試料にもとから含まれていたデヒドロゲナーゼ基質化合物の量を差し引くことによって、正確な測定が可能になる。
【００５５】
本発明方法により得られたＡＣＥ活性の測定結果をもって、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を簡便かつ正確に調べることができる。そして、被検試料が優れたＡＣＥ活性の阻害作用を有する場合には、被検試料自体が高血圧症の治療や予防に利用できたり、或いは被検試料から優れた降圧作用成分が見出される可能性がある。よって本発明方法は、成人病のリスクが高まっている現代において、極めて有用なものである。
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５７】
実施例１ ＡＣＥによる３ＨＢ−ＧＧＧの切断
ＡＣＥによりＤ−３−ヒドロキシ酪酸−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（以下、「Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸」を「３ＨＢ」と、「Ｇｌｙ」を「Ｇ」という場合がある）が、３ＨＢ−ＧとＧｌｙ−Ｇｌｙに切断されていることを確認するために、３ＨＢ−ＧＧＧとＡＣＥの反応の進行により生成するアミノ基の濃度を測定した。３．４ｍｇ／ｍＬの３ＨＢ−ＧＧＧ溶液（１２５μＬ）へ、超純水（１５μＬ）と０．１Ｕ／ｍＬのＡＣＥ（５０μＬ）を加えて２０秒間攪拌し、３７℃で０〜１２０分間反応させた。反応の停止は、１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えることにより行なった。なお、反応混合液における３ＨＢ−ＧＧＧの終濃度は７．３５ｍＭであった。反応後、反応溶液をセントリカット（クラボー社製、Ｗ−１０）に移し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して限外濾過することによって、分子量１０，０００以上の化合物を除いた。
【００５８】
次に、遊離するＧｌｙ−Ｇｌｙのアミノ基濃度をＴＮＢＳ法（R.B.Sashidharら， J.Immunol.Method.，167，pp121-127（1994年）を参照）測定することによって、３ＨＢ−ＧＧＧの分解を確認した。具体的には、限外濾過した濾液（５０μＬ）に４％ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ８．５、５０μＬ）とＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）の３０ｍＭ水溶液（５０μＬ）を加え、約３７℃で３０分間反応させることによって、Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ基にＴＮＢＳを定量的に結合させた。次いで、１０％ＳＤＳ（５０μＬ）と１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させた。この反応混合液から１８０μＬをマイクロプレートに移し、波長４１５ｎｍの可視光に対する吸光度を測定し、事前に測定した吸光度とＧｌｙ−Ｇｌｙ濃度との検量線から、各溶液におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ濃度を求めた。７．３５ｍＭの３ＨＢ−ＧＧＧから生成したＧｌｙ−Ｇｌｙの濃度、即ち３ＨＢ−ＧＧＧの分解率を求めた。結果を表１と図１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１の通り、３ＨＢ−ＧＧＧとＡＣＥとの反応によって、アミノ基が生じていることが分かった。別途、反応溶液をＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙの生成が確認された。よって、ＡＣＥにより３ＨＢ−ＧＧＧは３ＨＢ−ＧとＧｌｙ−Ｇｌｙとに分解されることが明らかにされた。また、図１より、実施例１のＡＣＥおよび３ＨＢ−ＧＧＧの濃度、反応温度および反応時間においては、反応時間と反応の進行との間には実質的に直線的な関係があることが分かった。
【００６１】
実施例２ アミノアシラーゼによる３ＨＢ−Ｇの切断
次に、３ＨＢ−Ｇがアミノアシラーゼに切断されて３ＨＢ（３−ヒドロキシ酪酸）とＧｌｙが生じることを確認した。先ず、上記実施例１と同様の条件で１２０分間反応を行なった。次いで、０〜３４４０００Ｕ／ｍＬのアミノアシラーゼを加え、０〜３０分間反応させた。反応の停止は、１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えることにより行なった。
【００６２】
反応終了後、食品分析の分野で汎用されている３ＨＢ定量用のキット（ＪＫインターナショナル社製、Ｆ−キット）を用いて、生成した３ＨＢの量を測定した。具体的には、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００）を含むリン酸カリウム／トリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．６、０．６ｍＬ）、４Ｕのアミノアシラーゼと１３ｍｇのβ−ＮＡＤを２．５ｍＬの蒸留水に溶解した溶液（０．２ｍＬ）、塩化ヨードニトロテトゾリウム溶液（０．２ｍＬ）、蒸留水（２ｍＬ）および反応混合液（０．１ｍＬ）を混和し、２分後における波長：４９２ｎｍの吸光度（Ｅ1（試料））を測定した。また、試料を加えず同様に吸光度（Ｅ1（ブランク））を測定した。これら測定溶液へ、２７Ｕの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを約１．８ｍＬの蒸留水に溶解した溶液（０．０５ｍＬ）を加えて混和し、正確に２０分後の吸光度（Ｅ2（試料）とＥ2（ブランク））を測定し、さらに正確に１０分後の吸光度（Ｅ3（試料）とＥ3（ブランク））を測定した。次に、下記式に基づいて３ＨＢの量（濃度）を算出した。
【００６３】
【数１】
【００６４】
得られた３ＨＢ濃度から、切断された３ＨＢ−Ｇの割合（分解率）を求めた。結果を図２に示す。
【００６５】
図２の通り、１７２０００Ｕ／ｍＬ以上のアミノアシラーゼによれば、３０分間の反応時間で約１００％反応が進行することが確認された。
【００６６】
実施例３ 反応条件の最適化
上記実施例１と２の結果をふまえて、３ＨＢ−ＧＧＧを基質化合物として、ＡＣＥとアミノアシラーゼにより３ＨＢまで分解する反応を行なうに当たり、ＡＣＥの濃度を０〜０．５Ｕ／ｍＬに変化させて、ＡＣＥ濃度と反応時間の適値を検討した。具体的には、超純水（１２５μＬ）への３ＨＢ−ＧＧＧ溶液（７．１１ｍＭ）、ＡＣＥ（０〜０．５Ｕ／ｍＬ）およびアミノアシラーゼ（１７２０００Ｕ／ｍＬ）を溶解して３７℃で反応させ、０〜１２０分間に２０分毎に試料を採取し、実施例２と同様の方法で生成した３ＨＢの濃度を測定した。反応時間と生成した３ＨＢ濃度との関係を図３に、反応時間を６０分間とした場合におけるＡＣＥ濃度と３ＨＢ濃度との関係を図４に示す。
【００６７】
図３と４の通り、ＡＣＥ濃度が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬの場合には、反応時間と３ＨＢ生成量およびＡＣＥ濃度と３ＨＢ生成量とは、ほぼ直線関係にある。一方、ＡＣＥ濃度を０．５Ｕ／ｍＬとした場合には、３ＨＢの生成量が頭打ちになっている。また、これら結果から、活性試験を高感度で迅速に行なうことを考慮して、ＡＣＥ濃度を０．２Ｕ／ｍＬ程度にすることとした。また、０．２Ｕ／ｍＬのＡＣＥを用いれば、３０分間の反応で十分に測定を行なえることも分かった。
【００６８】
なお、３ＨＢ−ＧＧＧの初期濃度７．１１ｍＭに対する３ＨＢの最大生成量は１．９８ｍＭであり、分解率は最大で２７．８％であった。その原因は必ずしも明らかでないが、３ＨＢ生成量の測定に用いたＦ−キットの検出限界が考えられる。
【００６９】
実施例４
上記実施例１〜３の結果をふまえ、代表的なＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルとアラセプリルの存在下、ＡＣＥ活性の測定を行なった。具体的には、０〜１μＭのカプトプリルまたは０〜０．１ｍＭのアラセプリル、７．１１ｍＭの３ＨＢ−ＧＧＧ、０．２Ｕ／ｍＬのＡＣＥおよび３７２０００Ｕ／ｍＬのアミノアシラーゼからなる反応混合液を調製し、３０分間反応を行なった。１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させた後、実施例２と同様の方法により生成した３ＨＢの量を測定した。各ＡＣＥ阻害剤が存在しない場合に対する阻害率として、カプトプリルの結果を図５に、アラセプリルの結果を図６に示す。
【００７０】
図５と６の結果の通り、カプロプリルおよびアラセプリルの添加によりＡＣＥ阻害が生じ、阻害剤濃度に依存した阻害活性の変化を確認することができた。また、本測定条件におけるコントロールの変動係数は０．９％（ｎ＝３）であり、安定に測定が行なえることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＡＣＥによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解率と反応時間との関係を示す図である。
【図２】アミノアシラーゼによる３ＨＢ−Ｇの分解反応におけるアミノアシラーゼ濃度、分解率および反応時間との関係を示す図である。
【図３】ＡＣＥとアミノアシラーゼによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解反応におけるＡＣＥ濃度、分解率（３ＨＢの生成濃度）および反応時間との関係を示す図である。
【図４】ＡＣＥとアミノアシラーゼによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解反応で、反応時間を６０分間とした場合におけるＡＣＥ濃度と３ＨＢ濃度との関係を示す図である。
【図５】本発明方法によりカプトプリルのＡＣＥ阻害活性を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明方法によりアラセプリルのＡＣＥ阻害活性を測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンジオテンシンＩは非常に重要な生理活性ペプチドであり、アンジオテンシンＩ変換酵素（以下、「ＡＣＥ」という）によりＣ末端のジペプチドが切除されてアンジオテンシンＩＩとなる。このアンジオテンシンＩＩは極めて強い血圧上昇活性を有することから、ＡＣＥの阻害剤は降圧剤として期待でき、また、ＡＣＥの活性化剤は昇圧剤として期待できる。実際、ＡＣＥ阻害剤であるカプトプリル（Ｄ−３−メルカプト−２−メチルプロパノイル−Ｌ−プロリン）は、高血圧の治療剤として用いられている。
【０００３】
従って、ＡＣＥ活性を測定する技術は、薬剤探索に利用できるものとして有用である。特に近年、高血圧症などの成人病が問題となっており、降圧作用を有する物質を探索する技術は特に重要視されている。例えば、食品のＡＣＥ活性を測定することによりそのＡＣＥ阻害活性を見出すことができれば、その食品を高血圧予防の機能性食品として用いることが考えられる。また、降圧作用物質自体の探索も重要である。さらに、ＡＣＥ活性の測定技術を疾病の診断に応用することも可能である。
【０００４】
従来のＡＣＥ活性の測定方法としては、非特許文献１と２に記載のものが知られている。この方法では、基質化合物としてＨｉｐ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（「Ｈｉｐ」は馬尿酸を示す）を用い、被検試料と共にＡＣＥを加えて反応を行なう。そして、反応の結果生じた馬尿酸の量により被検試料の阻害活性を測定するものである。
【０００５】
ところがこの方法は煩雑であり、自動分析に不適であって、多種類の試料の分析には不向きであるという欠点を有する。つまり、この方法では反応により遊離する馬尿酸を酢酸エチルにより抽出し、酢酸エチルを除去した後に再溶解して２２８ｎｍの吸光度を測定する。この様に抽出操作が必要であることに加え、酢酸エチルを完全に除去しなければ正確な測定ができないなど、この方法は簡便なものではない。
【０００６】
そこで、上記方法の欠点を克服するために、ＡＣＥ阻害剤により切断され遊離した基質化合物の断片を蛍光化合物へ誘導したり、遊離する断片が紫外線により変化を示す様な基質化合物を用いる方法が開発されている。
【０００７】
例えば非特許文献３に記載の方法では、基質化合物としてｐ−ヒドロキシ馬尿酸−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを用い、被検物質の存在下でＡＣＥを作用させる。この反応により遊離したｐ−ヒドロキシ馬尿酸をヒップリカーゼ（アミノアシラーゼ）によりｐ−ヒドロキシ安息香酸とグリシンに切断し、さらにｐ−ヒドロキシ安息香酸を、４−アミノアンチピリンと過酸化水素と共にペルオキシダーゼによりキノンイミン色素に変換する。得られた反応液はそのまま吸光度測定に用いることができ、生じたキノンイミン色素の量を把握することによって、被検物質のＡＣＥ阻害活性を確認することができる。
【０００８】
しかしこの方法で使用するペルオキシダーゼは基質特異性が低いために、特に食品など様々な化合物を含むものを被検試料とする場合には、正確な測定ができない。また、過酸化水素の反応性は高いことから、測定を妨害する様な酸化反応を単独で起こすことがある。さらに、４−アミノアンチピリンは発癌性を有するという問題もある。
【非特許文献１】川岸舜朗 編著，「生化学実験法３８ 食品中の生体機能調節物質研究法」，学会出版センター，「ＩＩＩ−３ アンジオテンシン変換酵素阻害物質」，第１１６〜１２９頁（１９９６年発行）
【非特許文献２】D．Y．Cushman，H．S．Cheung，バイオケミカル・ファーマコロジー（Biochem．Pharmacol．），第２０巻，第１６３７〜１６４８頁（１９７１年）
【非特許文献３】Y．Kasahara，Y．Ashihara，クリニカル・ケミストリー，第２７巻１１号，第１９２２〜１９２５頁（１９８１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述した様に、ＡＣＥ活性の測定方法の開発は極めて重要であると認識されており、既に様々な方法が知られている。しかし近年、成人病リスクが一般的に高まるにつれ高血圧症が問題となっており、ＡＣＥ活性に関与する化合物の探索をより広く行なう必要が生じていることから、より一層簡便で正確に行なえる測定方法が求められている。
【００１０】
そこで、本発明が解決すべき課題は、簡便で正確な測定が可能なＡＣＥ活性の測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、従来方法の欠点を克服する手段につき鋭意検討を進めた。その結果、ＡＣＥの作用により生じた化合物を、最終的に基質特異性の高いデヒドロゲナーゼを用いて酸化し、この酸化化合物の生成量を測定する方法であれば、被検試料によるＡＣＥ活性の変化を簡便で正確に測定できることを見出して、本発明を完成した。
【００１２】
即ち、本発明に係るＡＣＥ活性の測定方法は、
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（以下、「ＡＣＥ基質化合物」という）、被検試料、ＡＣＥおよびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
【００１３】
【化１】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
【００１４】
上記工程においてＡＣＥおよびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程、
を含むことを特徴とする。
【００１５】
ＡＣＥ基質化合物としては、下記化合物（Ｉ）が好適である。
【００１６】
【化２】
［式中、Ｒは低級アルキルを示し、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【００１７】
上記化合物（Ｉ）は、先ずＡＣＥによりＣ末端側のジペプチド（−Ｘ−Ｙ）が切断され、次いでアミノアシラーゼによりＧｌｙが切断されて、３−ヒドロキシ脂肪族カルボン酸が生成する。この３−ヒドロキシ脂肪族カルボン酸は、デヒドロゲナーゼの代表的な基質化合物である。
【００１８】
ここで「低級アルキル」とは、炭素数が１〜６の直鎖状または分枝鎖状の脂肪族炭化水素を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等である。
【００１９】
ＡＣＥ基質化合物としては、さらに下記化合物（Ｉａ）が好適である。
【００２０】
【化３】
［式中、ＸおよびＹは、上述したものと同義を示す］
【００２１】
当該化合物（Ｉａ）は、ＡＣＥとアミノアシラーゼの作用により３−ヒドロキシ酪酸となる。この３−ヒドロキシ酪酸はデヒドロゲナーゼの代表的な基質化合物であり、デヒドロゲナーゼとＮＡＤを用いる簡便な定量キットも市販されており、容易に定量することができる。
【００２２】
上記測定方法においては、デヒドロゲナーゼとして、補酵素であるＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用い、生成した酸化化合物の生成量を、ＮＡＤＨの生成量として間接的に測定することが好ましい。ＮＡＤＨの生成量は、直接的または間接的に比較的簡便且つ正確な測定が可能である。また、ＮＡＤＨの生成量の測定方法としては様々なものが開発されており、それらから適切なものを選択して使用できる。
【００２３】
使用するアミノアシラーゼの量は、１７２０００Ｕ／ｍＬ以上が好適である。３０分間という短い反応時間であっても、Ｇｌｙの切断反応が１００％進行することが実証されているからである。
【００２４】
また、０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬのＡＣＥを用いることが好ましい。この範囲のＡＣＥを用いれば、反応時間と反応の進行はほぼ直線関係にすることができるので、所定の反応時間経過後におけるＡＣＥ活性に対する被検試料の作用を、より正確に比較できるからである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明で用いるデヒドロゲナーゼは、基質特異性が非常に高い。また、デヒドロゲナーゼを使用して化合物を定量する方法は正確で簡便であり、よく研究されている。よって、デヒドロゲナーゼを利用してＡＣＥの活性を測定する本発明方法は、正確で簡便である。
【００２６】
従って本発明は、例えば食品など様々な化合物が含まれている被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を測定するのに適していることから、高血圧を予防する機能性食品や降圧剤の探索に利用できるものとして産業上極めて有用である。また、本発明は、疾病の診断にも適用できる可能性も有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明に係るＡＣＥ活性の測定方法は、
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（ＡＣＥ基質化合物）、被検試料、ＡＣＥおよびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程（以下、「ＡＣＥ反応工程」という）、および
【００２８】
【化４】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
【００２９】
上記工程においてＡＣＥおよびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程（以下、「デヒドロゲナーゼ反応工程」という）
を含むことを特徴とする。先ず、ＡＣＥ反応工程について説明する。
【００３０】
ＡＣＥ反応工程では、以下の反応が進行する。即ち、ＡＣＥの作用により末端ジペプチド（−Ｘ−Ｙ）が切断され、さらにアミノアシラーゼの作用によりＧｌｙが切断されることによって、デヒドロゲナーゼの基質化合物が生成する。なお、式中の「ＤＨ」はデヒドロゲナーゼを示す。
【００３１】
【化５】
【００３２】
本発明方法で用いる「ＡＣＥ基質化合物」は、デヒドロゲナーゼ基質化合物のカルボキシル基に、トリペプチドである−Ｇｌｙ−Ｘ−ＹのＮ末端アミノ基がアミド結合した化合物である。ここでＸとＹは、Ｌ−アミノ酸であればその種類は制限されず、一般的な天然アミノ酸、異常アミノ酸、合成アミノ酸などを用いることができるが、ＡＣＥの基質となる必要があることから、一般的な２０種類の天然Ｌ−アミノ酸が好適である。より好ましくは、ＡＣＥはアンギオテンシンＩのＣ末端の−Ｈｉｓ−Ｌｅｕを切断してアンギオテンシンＩＩに変換することから、−Ｈｉｓ−Ｌｅｕとすることができる。また、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙも切断され易いことから好適である。
【００３３】
デヒドロゲナーゼの基質化合物は、次工程で使用するデヒドロゲナーゼの基質となるものであり且つ上記トリペプチド（−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）とアミド結合するためのカルボキシル基を有するものであれば、特にその種類は問わない。例えば、Ｄ−またはＬ−乳酸、Ｄ−またはＬ−リンゴ酸、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸などを用いることができる。
【００３４】
「ＡＣＥ基質化合物」としては、下記化合物（Ｉ）が好適であり、さらにＲ基がメチル基である下記化合物（Ｉａ）が好ましい。
【００３５】
【化６】
［式中、Ｒ、ＸおよびＹは、上述したものと同義を示す］
【００３６】
「ＡＣＥ基質化合物」は、デヒドロゲナーゼの基質化合物が一般的に市販されているなど容易に入手できることから、当該基質化合物に一般的な手法でトリペプチドを結合させることにより入手できる。
【００３７】
ＡＣＥ反応工程における「ＡＣＥ基質化合物」の量は、特に制限されないが、ＡＣＥ活性を評価できる程度に十分に存在せしめる必要がある。一般的には、反応系に５〜１０ｍＭ程度添加すればよい。
【００３８】
「被検試料」は、蒸留水等に溶解または懸濁した後、不溶成分が存在する場合には好ましくは濾過して反応系に添加する。或いは、そのまま反応系に添加すればよい。
【００３９】
被検試料の添加量は特に制限されないが、様々な化合物が含まれる試料の場合、アミノアシラーゼなどの酵素反応が過剰に阻害されることを防ぐために抑制する必要が生じることがある。また、複数の被検試料を測定して結果を比較する場合には、添加量を同一にする。何れにせよ、被検試料の添加量は、予備実験などにより適切に決定する必要がある。
【００４０】
ＡＣＥは、ヒト、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウサギ由来のものなど何れのものも使用でき、市販のものや単離精製したものを用いればよい。
【００４１】
ＡＣＥの添加量は、適度な反応時間において、ＡＣＥの作用による化合物の分解反応の進行と反応時間とが実質的な直線関係を形成する程度とする。一般的には、０．０５〜０．３Ｕ／ｍＬ、より好ましくは０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬとする。
【００４２】
アミノアシラーゼも、市販のものや単離精製したものを用いればよい。また、その添加量は、ＡＣＥの作用により生成した化合物の末端Ｇｌｙを、適度な反応時間で定量的に切断できる程度にすることが好ましい。例えば、８００００Ｕ／ｍＬ以上、より好ましくは１５００００Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１７００００Ｕ／ｍＬとする。
【００４３】
ＡＣＥ反応工程の反応は、上記各化合物等を溶媒中に混和することにより開始することができる。各化合物等の添加は、各化合物等の溶液を添加することによってもよい。使用できる溶媒としては、蒸留水、精製水、純水、超純水などを用いることができる。
【００４４】
反応温度は、通常、３７℃程度の恒温とする。また、反応時間は特に問わないが、複数の被検試料の結果を比較する場合には一定にする必要があり、また、ＡＣＥの作用による化合物の分解反応の進行と反応時間とが実質的な直線関係を形成する程度とする。その様な反応時間は、予備実験により決定すればよい。
【００４５】
所定の反応時間後、次のデヒドロゲナーゼ反応工程に移行すればよい。なお、複数の被検試料を比較するためには、当然に反応時間を同一にする。反応時間を厳密にするためには、塩酸を適量、例えば最終濃度で０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ程度添加して、反応を停止させてもよい。但し、かかる反応停止剤が次工程の反応を阻害する可能性もあるため、所定の反応時間後に適量の反応混合液を抜き出して、次工程の反応系に加えるという方法を採ってもよい。
【００４６】
デヒドロゲナーゼ反応工程では、ＡＣＥ反応工程で生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する。この工程によって、ＡＣＥ反応工程においてＡＣＥの作用により分解された化合物の量や割合を間接的に測定することができ、結果としてＡＣＥの活性を測定できる。
【００４７】
当該工程では、ＡＣＥ反応工程の反応混合液とデヒドロゲナーゼとを混合する。好適には、デヒドロゲナーゼの溶液へＡＣＥ反応工程の反応混合液を添加し混合する。
【００４８】
デヒドロゲナーゼは、一般的に基質特異性が高い（例えば、今堀和友ら監修「生化学辞典第２版」東京化学同人，第８０１頁，「脱水素酵素」の項を参照）。よって、被検試料に様々な混合物が含まれている場合であっても、酵素反応が阻害される可能性は低く、より正確に測定することができる。
【００４９】
デヒドロゲナーゼとしては、ＡＣＥ反応工程でＡＣＥの基質化合物に含まれるデヒドロゲナーゼ基質化合物に対応するものを用いる。例えば、当該デヒドロゲナーゼ基質化合物として３−ヒドロキシ酪酸を利用する場合には、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを用いる。この様なデヒドロゲナーゼはよく研究されており、また、市販されているものもあるので、市販品を用いてもよいし単離精製したものを用いてもよい。
【００５０】
デヒドロゲナーゼの使用量は特に制限されないが、ＡＣＥ反応工程により得られたデヒドロゲナーゼ基質化合物を定量的に酸化できる量を使用することが好ましい。具体的には、もちろん酸化すべきデヒドロゲナーゼ基質化合物の量にもよるが、１０〜２０Ｕ／ｍＬ程度とすることができる。
【００５１】
当該酸化反応における反応温度や反応時間などは、使用するデヒドロゲナーゼの至適温度や活性などに応じて決定すればよい。好適には、デヒドロゲナーゼ基質化合物を定量的に酸化できる程度にする。
【００５２】
酸化反応後には、得られた酸化化合物の生成量を測定する。得られた数値を比較することによって、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を把握することができる。この測定は、酸化化合物の生成量を直接定量してもよいし、補酵素としてＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用いた場合には、ＮＡＤＨの生成量を測定してもよい。また、酸化化合物やＮＡＤＨをさらなる反応に付し、その生成量を間接的に測定してもよい。例えば、デヒドロゲナーゼ基質化合物の１つとしてＤ−３−ヒドロキシ酪酸があり、このＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量するためのキットが市販されている。このキットでは、下記反応を利用し、フォルマザンという化合物の生成に伴って増加する波長４９２ｎｍの吸光度の変化によりＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量する。なお、下記式において、３−ＨＢＤＨとは３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの略称であり、ＩＮＴは塩化ヨードニトロテトゾリウムを示す。
【００５３】
【化７】
【００５４】
なお、デヒドロゲナーゼの基質化合物は、被検試料にもとから含まれている可能性がある。例えば３−ヒドロキシ酪酸は、生体内でアセチルＣｏＡからアセト酢酸を経て生合成されるので、被検試料中に存在している場合がある。この様な場合には、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を正確に測定することができなくなる。従って、事前にＡＣＥ反応工程を行なわず被検試料中のデヒドロゲナーゼ基質化合物を測定して、その存在の有無を確認しておくことが好ましい。存在が確認された場合には、本発明方法による測定を行なった後に、得られた数値から被検試料にもとから含まれていたデヒドロゲナーゼ基質化合物の量を差し引くことによって、正確な測定が可能になる。
【００５５】
本発明方法により得られたＡＣＥ活性の測定結果をもって、被検試料がＡＣＥ活性に与える影響を簡便かつ正確に調べることができる。そして、被検試料が優れたＡＣＥ活性の阻害作用を有する場合には、被検試料自体が高血圧症の治療や予防に利用できたり、或いは被検試料から優れた降圧作用成分が見出される可能性がある。よって本発明方法は、成人病のリスクが高まっている現代において、極めて有用なものである。
【００５６】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５７】
実施例１ ＡＣＥによる３ＨＢ−ＧＧＧの切断
ＡＣＥによりＤ−３−ヒドロキシ酪酸−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（以下、「Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸」を「３ＨＢ」と、「Ｇｌｙ」を「Ｇ」という場合がある）が、３ＨＢ−ＧとＧｌｙ−Ｇｌｙに切断されていることを確認するために、３ＨＢ−ＧＧＧとＡＣＥの反応の進行により生成するアミノ基の濃度を測定した。３．４ｍｇ／ｍＬの３ＨＢ−ＧＧＧ溶液（１２５μＬ）へ、超純水（１５μＬ）と０．１Ｕ／ｍＬのＡＣＥ（５０μＬ）を加えて２０秒間攪拌し、３７℃で０〜１２０分間反応させた。反応の停止は、１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えることにより行なった。なお、反応混合液における３ＨＢ−ＧＧＧの終濃度は７．３５ｍＭであった。反応後、反応溶液をセントリカット（クラボー社製、Ｗ−１０）に移し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して限外濾過することによって、分子量１０，０００以上の化合物を除いた。
【００５８】
次に、遊離するＧｌｙ−Ｇｌｙのアミノ基濃度をＴＮＢＳ法（R.B.Sashidharら， J.Immunol.Method.，167，pp121-127（1994年）を参照）測定することによって、３ＨＢ−ＧＧＧの分解を確認した。具体的には、限外濾過した濾液（５０μＬ）に４％ＮａＨＣＯ3水溶液（ｐＨ８．５、５０μＬ）とＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）の３０ｍＭ水溶液（５０μＬ）を加え、約３７℃で３０分間反応させることによって、Ｇｌｙ−Ｇｌｙのアミノ基にＴＮＢＳを定量的に結合させた。次いで、１０％ＳＤＳ（５０μＬ）と１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させた。この反応混合液から１８０μＬをマイクロプレートに移し、波長４１５ｎｍの可視光に対する吸光度を測定し、事前に測定した吸光度とＧｌｙ−Ｇｌｙ濃度との検量線から、各溶液におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ濃度を求めた。７．３５ｍＭの３ＨＢ−ＧＧＧから生成したＧｌｙ−Ｇｌｙの濃度、即ち３ＨＢ−ＧＧＧの分解率を求めた。結果を表１と図１に示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１の通り、３ＨＢ−ＧＧＧとＡＣＥとの反応によって、アミノ基が生じていることが分かった。別途、反応溶液をＨＰＬＣにより分析したところ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙの生成が確認された。よって、ＡＣＥにより３ＨＢ−ＧＧＧは３ＨＢ−ＧとＧｌｙ−Ｇｌｙとに分解されることが明らかにされた。また、図１より、実施例１のＡＣＥおよび３ＨＢ−ＧＧＧの濃度、反応温度および反応時間においては、反応時間と反応の進行との間には実質的に直線的な関係があることが分かった。
【００６１】
実施例２ アミノアシラーゼによる３ＨＢ−Ｇの切断
次に、３ＨＢ−Ｇがアミノアシラーゼに切断されて３ＨＢ（３−ヒドロキシ酪酸）とＧｌｙが生じることを確認した。先ず、上記実施例１と同様の条件で１２０分間反応を行なった。次いで、０〜３４４０００Ｕ／ｍＬのアミノアシラーゼを加え、０〜３０分間反応させた。反応の停止は、１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えることにより行なった。
【００６２】
反応終了後、食品分析の分野で汎用されている３ＨＢ定量用のキット（ＪＫインターナショナル社製、Ｆ−キット）を用いて、生成した３ＨＢの量を測定した。具体的には、界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００）を含むリン酸カリウム／トリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．６、０．６ｍＬ）、４Ｕのアミノアシラーゼと１３ｍｇのβ−ＮＡＤを２．５ｍＬの蒸留水に溶解した溶液（０．２ｍＬ）、塩化ヨードニトロテトゾリウム溶液（０．２ｍＬ）、蒸留水（２ｍＬ）および反応混合液（０．１ｍＬ）を混和し、２分後における波長：４９２ｎｍの吸光度（Ｅ1（試料））を測定した。また、試料を加えず同様に吸光度（Ｅ1（ブランク））を測定した。これら測定溶液へ、２７Ｕの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼを約１．８ｍＬの蒸留水に溶解した溶液（０．０５ｍＬ）を加えて混和し、正確に２０分後の吸光度（Ｅ2（試料）とＥ2（ブランク））を測定し、さらに正確に１０分後の吸光度（Ｅ3（試料）とＥ3（ブランク））を測定した。次に、下記式に基づいて３ＨＢの量（濃度）を算出した。
【００６３】
【数１】
【００６４】
得られた３ＨＢ濃度から、切断された３ＨＢ−Ｇの割合（分解率）を求めた。結果を図２に示す。
【００６５】
図２の通り、１７２０００Ｕ／ｍＬ以上のアミノアシラーゼによれば、３０分間の反応時間で約１００％反応が進行することが確認された。
【００６６】
実施例３ 反応条件の最適化
上記実施例１と２の結果をふまえて、３ＨＢ−ＧＧＧを基質化合物として、ＡＣＥとアミノアシラーゼにより３ＨＢまで分解する反応を行なうに当たり、ＡＣＥの濃度を０〜０．５Ｕ／ｍＬに変化させて、ＡＣＥ濃度と反応時間の適値を検討した。具体的には、超純水（１２５μＬ）への３ＨＢ−ＧＧＧ溶液（７．１１ｍＭ）、ＡＣＥ（０〜０．５Ｕ／ｍＬ）およびアミノアシラーゼ（１７２０００Ｕ／ｍＬ）を溶解して３７℃で反応させ、０〜１２０分間に２０分毎に試料を採取し、実施例２と同様の方法で生成した３ＨＢの濃度を測定した。反応時間と生成した３ＨＢ濃度との関係を図３に、反応時間を６０分間とした場合におけるＡＣＥ濃度と３ＨＢ濃度との関係を図４に示す。
【００６７】
図３と４の通り、ＡＣＥ濃度が０．０５〜０．２Ｕ／ｍＬの場合には、反応時間と３ＨＢ生成量およびＡＣＥ濃度と３ＨＢ生成量とは、ほぼ直線関係にある。一方、ＡＣＥ濃度を０．５Ｕ／ｍＬとした場合には、３ＨＢの生成量が頭打ちになっている。また、これら結果から、活性試験を高感度で迅速に行なうことを考慮して、ＡＣＥ濃度を０．２Ｕ／ｍＬ程度にすることとした。また、０．２Ｕ／ｍＬのＡＣＥを用いれば、３０分間の反応で十分に測定を行なえることも分かった。
【００６８】
なお、３ＨＢ−ＧＧＧの初期濃度７．１１ｍＭに対する３ＨＢの最大生成量は１．９８ｍＭであり、分解率は最大で２７．８％であった。その原因は必ずしも明らかでないが、３ＨＢ生成量の測定に用いたＦ−キットの検出限界が考えられる。
【００６９】
実施例４
上記実施例１〜３の結果をふまえ、代表的なＡＣＥ阻害剤であるカプトプリルとアラセプリルの存在下、ＡＣＥ活性の測定を行なった。具体的には、０〜１μＭのカプトプリルまたは０〜０．１ｍＭのアラセプリル、７．１１ｍＭの３ＨＢ−ＧＧＧ、０．２Ｕ／ｍＬのＡＣＥおよび３７２０００Ｕ／ｍＬのアミノアシラーゼからなる反応混合液を調製し、３０分間反応を行なった。１Ｎ塩酸（２５μＬ）を加えて反応を停止させた後、実施例２と同様の方法により生成した３ＨＢの量を測定した。各ＡＣＥ阻害剤が存在しない場合に対する阻害率として、カプトプリルの結果を図５に、アラセプリルの結果を図６に示す。
【００７０】
図５と６の結果の通り、カプロプリルおよびアラセプリルの添加によりＡＣＥ阻害が生じ、阻害剤濃度に依存した阻害活性の変化を確認することができた。また、本測定条件におけるコントロールの変動係数は０．９％（ｎ＝３）であり、安定に測定が行なえることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ＡＣＥによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解率と反応時間との関係を示す図である。
【図２】アミノアシラーゼによる３ＨＢ−Ｇの分解反応におけるアミノアシラーゼ濃度、分解率および反応時間との関係を示す図である。
【図３】ＡＣＥとアミノアシラーゼによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解反応におけるＡＣＥ濃度、分解率（３ＨＢの生成濃度）および反応時間との関係を示す図である。
【図４】ＡＣＥとアミノアシラーゼによる３ＨＢ−ＧＧＧの分解反応で、反応時間を６０分間とした場合におけるＡＣＥ濃度と３ＨＢ濃度との関係を示す図である。
【図５】本発明方法によりカプトプリルのＡＣＥ阻害活性を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明方法によりアラセプリルのＡＣＥ阻害活性を測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（以下、「ＡＣＥ基質化合物」という）、被検試料、アンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
【化１】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
上記工程においてアンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程、
を含むことを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項２】
ＡＣＥ基質化合物として、下記化合物（Ｉ）を用いる請求項１に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【化２】
［式中、Ｒは低級アルキルを示し、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【請求項３】
デヒドロゲナーゼとして、補酵素であるＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用い、酸化化合物の生成量を、ＮＡＤＨの生成量として間接的に測定する請求項１または２に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項４】
ＡＣＥ基質化合物として、下記化合物（Ｉａ）を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【化３】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【請求項５】
１７２０００Ｕ／ｍＬ以上のアミノアシラーゼを用いる請求項１〜４のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項６】
０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬのアンジオテンシンＩ変換酵素を用いる請求項１〜５のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項１】
デヒドロゲナーゼの基質化合物に下記ペプチド鎖がアミド結合した化合物（以下、「ＡＣＥ基質化合物」という）、被検試料、アンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼを含む溶液を所定時間反応させる工程、および
【化１】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示し、右側はＣ末端、左側はＮ末端を示す］
上記工程においてアンジオテンシンＩ変換酵素およびアミノアシラーゼの作用により生成したデヒドロゲナーゼの基質化合物をデヒドロゲナーゼにより酸化し、得られた酸化化合物の生成量を測定する工程、
を含むことを特徴とするアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項２】
ＡＣＥ基質化合物として、下記化合物（Ｉ）を用いる請求項１に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【化２】
［式中、Ｒは低級アルキルを示し、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【請求項３】
デヒドロゲナーゼとして、補酵素であるＮＡＤを必要とするデヒドロゲナーゼを用い、酸化化合物の生成量を、ＮＡＤＨの生成量として間接的に測定する請求項１または２に記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項４】
ＡＣＥ基質化合物として、下記化合物（Ｉａ）を用いる請求項１〜３のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【化３】
［式中、ＸおよびＹは夫々独立してＬ−アミノ酸を示す］
【請求項５】
１７２０００Ｕ／ｍＬ以上のアミノアシラーゼを用いる請求項１〜４のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【請求項６】
０．１〜０．２５Ｕ／ｍＬのアンジオテンシンＩ変換酵素を用いる請求項１〜５のいずれかに記載のアンジオテンシンＩ変換酵素活性の測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−２０２５１５（Ｐ２００７−２０２５１５Ａ）
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７５０３（Ｐ２００６−２７５０３）
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５９０００５０８１）株式会社同仁化学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月３日（２００６．２．３）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５９０００５０８１）株式会社同仁化学研究所 (9)
【Ｆターム（参考）】
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