イオンチャネルの活性を阻害する低分子ペプチド
本発明は、機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害する新規ポリペプチド、このようなポリペプチド、またはそのの塩を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤、心房細動の治療薬を提供することを課題とする。 上記課題は、配列番号１（ＴＶＰ００３）、配列番号２（ＴＶＰ００４）、または配列番号３（ＴＶＰ００５）で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩や、これらを含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤、心房細動の治療薬などにより解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この発明は、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、このポリペプチドを含む機械刺激感受性チャネル阻害剤および心房細動の治療剤などに関するものである。より詳しくは、本発明は、クモ毒由来の天然ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）の配列をベースにして機械刺激感受性チャネルに作用するファーマコフォアを特定し、そのファーマコフォアを構成するようにデザインされ、かつ心房細動の治療に有用な新規ポリペプチドなどに関する。
【背景技術】
心房細動は、不整脈の一種であり、加齢とともにその有病率が高くなる。心房細動は、高齢者（６５歳以上）の約３％に認められる心臓疾患である。心房細動が慢性化すると、血栓を形成して脳塞栓症を引き起こすため、現在では心房細動が重症脳卒中患者の主要な原因疾患と考えられている。このように心房細動は、脳梗塞などの合併症の発生頻度と重症度を考慮し、近年致死性不整脈のひとつとして認識されるようになった（Ｊ．Ｎｉｐｐｏｎ．Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．２００２，６９（３））。これまでに心房細動を根治するような治療薬は得られておらず、心房細動、特に慢性心房細動に対する薬物療法には限界があると考えられていた（同前）。
心房細動は、心筋に存在するイオンチャネルの働きの異常が原因のひとつと考えられている。一方、クモ毒由来の天然ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４：配列番号４）が、機械刺激感受性チャネル（Ｓｔｒｅｔｃｈ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ：ＳＡＣ）の活性を阻害することが知られている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｓｕｃｈｙｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ Ｓｐａｔｕｌａｔａ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ ｔｈｅｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ５８３−５９８，２０００（非特許文献１）参照）。また、同文献には、陸上及び水中の動物由来の毒液由来の毒素を構成するペプチドには、６つのシステインを含むＩＣＫ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｋｎｏｔ：インヒビターシステインノット）モチーフが共通して見出されることが記載されている（非特許文献１の５９０頁右欄下から７行目〜下から３行目、および図３０）。また、同文献には、ＧｓＭＴｘ−４が、３つのシステインペア（Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５及びＣ３−Ｃ６）によって定義される基本構造を有するＩＣＫモチーフを有することが示唆されている（非特許文献１の５９５頁左欄７行目から下から１１行目、「ＧｓＭＴｘ−４の構造」の欄）。
また、ＧｓＭＴｘ−４を抽出・精製等する方法や、そのＧｓＭＴｘ−４を用いて心臓不整脈を治療する方法などが提案されている（例えば、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０９，ｐｐ３５−３６，２００１．（非特許文献２）、米国特許出願公開第２００２／００７７２８６号明細書（特許文献１）参照。）。また、ＧｓＭＴｘ−４の構造は、ＮＭＲを用いた溶液中での結果が知られている（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．（非特許文献３）参照。）。このような知見にかかわらず、クモ毒由来のペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）を用いた心房細動の治療剤は、開発されていなかった。
参考文献
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００７７２８６号明細書；
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｓｕｃｈｙｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ Ｓｐａｔｕｌａｔａ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ ｔｈｅｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ５８３−５９８，２０００；
【非特許文献２】Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０９，ｐｐ３５−３６，２００１；
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．
本発明では、ＧｓＭＴｘ−４のファーマコフォア（活性に必要最低限の空間構造）を同定し、ファーマコフォア情報に基づいて機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害する新規ポリペプチドを設計し、このようなポリペプチドを含む心房細動の治療剤などを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題は、以下の発明により解決される。
［１］ 本発明の第１の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチドであり、ＧｓＭＴｘ−４のファーマコフォアを構成するポリペプチドであると考えられる。これらのポリペプチドは、心房細動の治療などに有用である。
［２］ 本発明の第２の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。
［３］ 本発明の第３の実施態様に係る発明は、「配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチドである。これらのポリペプチドは、心房細動の治療などに有用である。
［４］ 本発明の第４の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。
［５］ 本発明の第５の実施態様に係る発明は、前記「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド」が、配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記［４］に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩である。
［６］ 本発明の第６の実施態様に係る発明は、「上記［１］、上記［３］、又は上記［４］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド」である。
［７］ 本発明の第７の実施態様に係る発明は、「上記［６］に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター」である。
［８］ 本発明の第８の実施態様に係る発明は、「上記［７］に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体」である。
［９］ 本発明の第９の実施態様に係る発明は、「上記［１］〜上記［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩のうちいずれか１つ以上を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤」である。この阻害剤は、機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害するので、機械刺激感受性チャネルの研究などに有効に用いられる。
［１０］ 本発明の第１０の実施態様に係る発明は、「上記［１］〜上記［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩うちいずれか１つ以上を含有する心房細動の治療剤」である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で、その機能が確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有する。したがって、この治療剤は、心房細動の治療に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧｓＭＴｘ−４と相同性の高い１０の候補マルティプルアライメントの結果を示す図である。
図２は、１ＱＫ６とＧｓＭＴｘ−４とのアラインメントの結果を示す。
図３は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたステレオ図である。
図４は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたモデルのＣαトレースを示す。図４中、薄い線は鋳型を表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
図５は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉで活性中心と考えられるＡｒｇ２０近傍を表す図である。図５中、薄い線はｈｕｗｅｔｏｘｉｎ−Ｉを表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
図６（ａ）〜図６（ｄ）は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ： １ＱＫ６）を鋳型としたモデルの表面構造を表す図である。図６（ａ）〜図６（ｄ）において、左がｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ、右がＧｓＭＴｘ−４を表す。図６（ａ）は、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈから見たもの（上の図とほぼ同じ向き）を表す。図６（ｂ）は、ｘ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｃ）は、ｙ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｄ）は、ｙ軸の周りに１８０°回転したものを表す。
図７は、ＧｓＭＴｘ−４の構造およびデザインしたペプチドの構造を表す。
図８は、ＴＶＰ００３の阻害活性検査結果を示す図である。図８（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図８（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図９は、ＴＶＰ００４の阻害活性検査結果を示す図である。図９（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図９（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１０は、ＴＶＰ００５の阻害活性検査結果を示す図である。図１０（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１０（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１１は、ＴＶＰ０１７の阻害活性検査結果を示す図である。図１１（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１１（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１２は、ＴＶＰ０１９の阻害活性検査結果を示す図である。図１２（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１２（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１３は、活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性の検討結果を示すグラフである。図１３（ａ）は、ＴＶＰ０００３の心筋ＳＡチャネルに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ＴＶＰ０００３のＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｃ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
（本発明のポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド（すなわち、本発明の第１〜第５の実施態様に係る発明に関するポリペプチド）である。
また、本発明のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）などであってもよい。
本発明のペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているものも含まれる。本発明のペプチドには、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したものも含まれる。本発明のペプチドには、側鎖上の置換基が、適当な保護基で保護されているものも含まれる。本発明のペプチドには、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドも含まれる。
本発明のペプチドの塩における「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩である。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
（本発明のポリペプチドの合成）
本発明のポリペプチドは、化学的に合成してもよいし、組換えＤＮＡ技術を用いて製造してもよい。本発明のポリペプチドを化学的に合成するためには、公知の方法に従って合成すればよく、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボニルイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／ＨＯＮＢ法、ＢＯＰ試薬を用いる方法などにより、本発明のペプチドを得ることができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５）、Ｆ．Ｍ．Ｆｉｎｎ及びＫ．Ｈｏｆｍａｎｎ著、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第２巻、Ｈ．Ｎｅｎｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）；泉屋信夫他著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）１９８５年；矢島治明、榊原俊平他著、生化学実験講座１、日本生化学会編、東京化学同人 １９７７年；木村俊他著、続生化学実験講座２、日本生化学会編、東京化学同人１９８７年などを参照）。また、自動ペプチド合成装置（ＰＥアプライドバイオシステムズ社等）により化学合成することもできる。
また、反応後は、公知の精製法により本発明のポリペプチドを精製単離することができる。例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。このようなポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する方法が挙げられる。また適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別し本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングを行ってもよい。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じた方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。このようなＤＮＡは、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、そのＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ，９６，２３−２８（１９９０）〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。そのＳｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中にはその形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行なって、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行なって、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行なって、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のポリペプチドを生成させることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることや、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
（機械刺激感受性チャネル阻害剤）
機械刺激感受性チャネル阻害剤としては、本発明のポリペプチド、もしくはそれらの塩のうちいずれか１つ以上（以下、「本発明のポリペプチド等」ともいう。）を含有するものが挙げられる。本発明のポリペプチド等は、機械刺激感受性チャネル阻害剤として使用できる。本発明のポリペプチド等は、取り扱いが容易であり、後の実施例で示されるように高い阻害活性を有する。
（心房細動の治療剤）
心房細動の治療剤としては、本発明のポリペプチド、もしくはその塩のいずれか１つ以上を含有するものが挙げられる。すなわち、本発明によれば、医薬、及び医薬組成物をも提供できる。医薬組成物としては、本発明のポリペプチド、もしくはその塩と、医薬的に許容される担体を含むものがあげられる。
本発明のポリペプチドを含む心房細動の治療剤は、注射液などの形で非経口的に心房の血管等に投与するか、錠剤、カプセル剤など経口投与により使用できる。注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供されてもよい。また、ヒトのみならずヒト以外の哺乳動物に対しても投与することができる。これら製剤化については、公知の製剤化方法を採用することができる。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
上記のような剤型において、活性成分である本発明のポリペプチドは、剤型中例えば、０．０１重量％〜１００重量％、好ましくは０．１重量％〜９０重量％、より好ましくは１重量％〜５０重量％含まれる。
本発明のポリペプチドの投与量は、非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、心房細動患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与する。経口投与の場合、例えば、心房細動患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。本発明の心房細動の治療剤は、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
（ファルマコフォアの同定）
なお、本発明のポリペプチを設計するに当り、クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）のどの部位が活性に必要な最小単位となるファーマコフォアであるのかを、立体構造に基づいて精度良く予測した。
ファルマコフォアの同定は、例えば以下のようにして行なうことができる。まず、立体構造既知の類縁ペプチドの立体構造を鋳型としたホモロジーモデリング法によるクモ毒ペプチドの精密な構造予測を行なう。その結果、得られた構造に基づいて、活性部位を改変したペプチドの機能解析を行い、医薬品設計のターゲットとなる部位の絞込みを行なう。また、ＧｓＭＴｘ−４のジスルフィド結合の部分をミミックした設計を行い、安定な構造をもつペプチドをデザインする。ＧｓＭＴｘ−４は３つのジスルフィド結合を持つ比較的柔軟性の低い立体構造を有することが知られているため、一般的に結合に関与することが多い極性アミノ酸残基を含む環状ペプチドをいくつかデザインし、活性に必要なファーマコフォアの同定を行なう。
（活性の測定）
本発明のペプチドの活性評価方法としては、公知の活性評価方法を用いることができるが、好ましくは実施例１に記載されたパッチクランプ法による単一チャネル電流記録法を用いることができる。
【実施例１】
実験例１：クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）配列と一致度の高い構造既知の類縁ペプチドの検索
配列番号４で表されるＧｓＭＴｘ−４のアミノ酸配列と一致度の高い構造について、ＰＤＢ（タンパク質立体構造データベース）からクモ毒を対象に検索した。この結果、ＧｓＭＴｘ−４と相同性の高い１０の候補が上がった。これら候補のマルティプルアライメントの結果を以下の図１に示す。
図１に示す配列の中から、システイン残基が一致していて、なおかつシステイン残基間の長さがほぼ等しく、挿入欠失のない（ＧｓＭｔｘ４の方が１残基長い）１ＱＫ６（Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ：配列番号１２）を鋳型として選択し、ホモロジーモデリング法によりファーマコフォアの絞込みを行った。
実施例２：クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）の立体構造予測
鋳型ペプチド１ＱＫ６を用いてホモロジーモデリングを行った。まず、１ＱＫ６とＧｓＭＴｘ−４とのアラインメントを行った。その結果を図２に示す。
次に、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲを用いてモデル構造の構築を行った。構築したＧｓＭＴｘ−４の構造モデルと鋳型に用いたＨｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉとの重ね合わせた結果を図３および図４に示す。図３は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたステレオ図である。図４は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたモデルのＣαトレースを示す。図４中、薄い線は鋳型を表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
また、図５にはＨｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉで活性中心と考えられるＡｒｇ２０近傍の様子を示す。図５中、薄い線はｈｕｗｅｔｏｘｉｎ−Ｉを表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。さらに、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４の表面構造を比較した結果を図６に示す。図６（ａ）〜図６（ｄ）において、左がｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ、右がＧｓＭＴｘ−４を表す。図６（ａ）は、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈから見たもの（上の図とほぼ同じ向き）を表す。図６（ｂ）は、ｘ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｃ）は、ｙ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｄ）は、ｙ軸の周りに１８０°回転したものを表す。図６（ｂ）から両ペプチドの分子の形状はかなり異なっていることがわかる。また解離性側鎖を持つ残基の分布も異なっており、特異性決定に関係していることが推測できる。
また、Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．（上記非特許文献３）に開示されたＧｓＭＴｘ−４のＮＭＲによる溶液中の構造と、本実施例により求められたＧｓＭＴｘ−４の構造を比較すると、本発明において構築したモデリング構造は、実際のＧｓＭＴｘ−４の構造を反映していると判断できる。
実施例３：活性ペプチドのデザインとファーマコフォアの同定
上述のＧｓＭＴｘ−４のモデリング構造に基づいてペプチド断片のおおよその設計方針を決定した。図７に、ＧｓＭＴｘ−４の構造およびデザインしたペプチドの構造を表す。ＧｓＭＴｘ−４は、３つのジスルフィド結合により、図７の配列構造式に示すように４つのループ部分から成っている。したがって、ＧｓＭＴｘ−４のどのループ部分が阻害活性に寄与する部分であるかを調べるためにＴＶＰ００１からＴＶＰ００５の５つのペプチドをデザインした。これらのペプチドについては、ループを構成しない部位にあるシステインをアラニンに置換している。ＴＶＰ００１（配列番号１４）はループ１と２、ＴＶＰ００２（配列番号１５）はループ３と４、ＴＶＰ００３（配列番号１）はループ２、ＴＶＰ００４（配列番号２）はループ３、ＴＶＰ００５（配列番号３）はループ２と３から成っている。
（デザインしたペプチドのバイオアッセイ）
ペプチドの活性評価には、最も信頼性の高いパッチクランプ法による単一チャネル電流記録法を用いた。アッセイの対象としては、心筋由来の Ｃａ２＋依存性ＢｉｇＫチャネル（Ｋａｗａｋｕｂｏ ｅｔ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７６：Ｈ１８２７．１９９９）を用いた。このチャネルを、発現しているニワトリの心室筋、もしくはこのチャネルのｃＤＮＡを強制発現したＣＨＯ細胞にセルアタッチトパッチクランプ法を適用した後、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ引きちぎりパッチ膜（ｅｘｃｉｓｅｄ ｐａｔｃｈ）を形成し、膜電位固定下で単一チャネル電流を計測した。デザインした合成ペプチドはＧｓＭＴｘ−４と同様、細胞外からチャネルをブロックするものと想定し、予め記録用ガラスピペットの一定位置以上の空間に既知濃度のペプチドを充填して、拡散によりチャネルに到達させるバックフィル（ｂａｃｋ−ｆｉｌｌ）を用いて投与した。この手法では拡散開始後おおよそ１５−２０分でピペット内ペプチド濃度が平衡に達するので、２０分後の抑制率からペプチドの解離定数を推定できる。あるいは抑制の時間経過からペプチドの相対的抑制力を推定することもできる。ペプチドの正確な解離定数を求めるには、ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔの引きちぎりパッチ膜を形成して単一チャネル電流を計測し、種々の濃度のペプチドによる抑制効果を解析して用量−抑制曲線を求めなければならないが、この方法は格段の技術を要すること、今回は種々のデザインした合成ペプチドの一次スクリーニングであることから、前述のｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ引きちぎりパッチにバックフィルを組み合わせたアッセイ法を使って、ペプチドの抑制効果について、おおよその見積もりを行った。ペプチドの濃度としては、ＧｓＭＴｘ−４での結果を考慮して１０μＭを用いた。評価量としては、チャネルの開確率（Ｐｏ、パーセント表示）を用い、抑制の強さはコントロール（ペプチド投与前）を基準とした抑制率（パーセント）、あるいは抑制の時間経過で表現した。
（アッセイ結果）
デザインした５種類の合成ペプチドのうち、ＴＶＰ００３、ＴＶＰ００４、ＴＶＰ００５、に阻害活性が認められた。そこで、ＴＶＰ０００４のＮ末端から３番目のＲをＡに置換した変異体ＴＶＰ０１７（配列番号：１６）、およびＴＶＰ０００４のＮ末端から７番目のＫをＡに置換した変異体ＴＶＰ０１９（配列番号：１７）を合成し、上記のバイオアッセイにより阻害活性を測定したところ、これらの合成ペプチドにも阻害活性が認められた。
図８は、ＴＶＰ００３の阻害活性検査結果を示す。図８（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図８（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図８に示すように、ＴＶＰ００３は８分後にはほぼ１００％の抑制効果を示したことから、ＴＶＰ００３の解離定数はμＭオーダーかそれ以下であると推定された。この値は、ＴＶＰ００３が、天然のクモ毒ペプチドＧｓＭＴｘ−４と同等かそれ以上の阻害活性を有することを示唆している。
図９は、ＴＶＰ００４の阻害活性検査結果を示す図である。図９（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図９（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図９に示すようにＴＶＰ００４は１０μＭで８分後には約６０％、１６分後には９５％の阻害活性を示し、比較的強い阻害活性を示した。
図１０は、ＴＶＰ００５の阻害活性検査結果を示す図である。図１０（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１０（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１０に示すように、ＴＶＰ００５は、２０分後に約６０％の阻害効果を示したことから、その解離定数はおおよそ１０μＭ程度と推定された。
図１１は、ＴＶＰ０１７の阻害活性検査結果を示す。図１１（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図１１（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１１に示すように、ＴＶＰ０１７は６分後にはほぼ１００％の抑制効果を示したことから、ＴＶＰ００３よりさらに優れた抑制効果を示すことが分かった。この値は、ＴＶＰ０１７が、天然のクモ毒ペプチドＧｓＭＴｘ−４以上の阻害活性を有することを示唆している。
図１２は、ＴＶＰ０１９の阻害活性検査結果を示す。図１２（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図１２（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１２に示すように、ＴＶＰ０１７は１４分後にはほぼ８０％の抑制効果を示した。
（２）ペプチドのチャネルに対する特異性について
実施例４：活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性
本発明の活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性について検討した。活性ペプチドとしてＴＶＰ０００３を用い、チャネルには、実施例３で用いたチャネルと同じ心筋ＳＡチャネルを使用した。このチャネルはＣ末に５９アミノ酸からなるＳＴＲＥＸ配列を有しており、これを除去した変異体（ＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ）は、伸展活性をほとんど失い、ごく一般的なＣａ依存性ｂｉｇＫチャネルとなる（ＳＡＫＣＡ：Ｔａｎｇ，Ｎａｒｕｓｅ，Ｓｏｋａｂｅ，Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，１６９：１８５−２００，２００３）。図１３は、活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性の検討結果を示すグラフである。図１３（ａ）は、ＴＶＰ０００３の心筋ＳＡチャネルに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ＴＶＰ０００３のＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｃ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表すグラフである。図１３から、ＧｓＭＴｘ−４およびＴＶＰ００３は、野生型のＳＡチャネル抑制するのに対し、ＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔをほとんど抑制しないことがわかる。従って、ＧｓＭＴｘ−４およびＴＶＰ００３は、伸展活性を有するチャネルにのみ特異的に作用すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害する新規ポリペプチドを得ることができる。
このような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、その組換えベクターで形質転換させた形質転換体を用いれば、本発明のポリペプチドを大量に生産できる。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドの塩を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤は、機械刺激感受性チャネルに関する試薬を製造する際に有効である。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドを含有する心房細動の治療剤は、心房細動を効果的に治療することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【技術分野】
この発明は、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、このポリペプチドを含む機械刺激感受性チャネル阻害剤および心房細動の治療剤などに関するものである。より詳しくは、本発明は、クモ毒由来の天然ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）の配列をベースにして機械刺激感受性チャネルに作用するファーマコフォアを特定し、そのファーマコフォアを構成するようにデザインされ、かつ心房細動の治療に有用な新規ポリペプチドなどに関する。
【背景技術】
心房細動は、不整脈の一種であり、加齢とともにその有病率が高くなる。心房細動は、高齢者（６５歳以上）の約３％に認められる心臓疾患である。心房細動が慢性化すると、血栓を形成して脳塞栓症を引き起こすため、現在では心房細動が重症脳卒中患者の主要な原因疾患と考えられている。このように心房細動は、脳梗塞などの合併症の発生頻度と重症度を考慮し、近年致死性不整脈のひとつとして認識されるようになった（Ｊ．Ｎｉｐｐｏｎ．Ｍｅｄ．Ｓｃｈ．２００２，６９（３））。これまでに心房細動を根治するような治療薬は得られておらず、心房細動、特に慢性心房細動に対する薬物療法には限界があると考えられていた（同前）。
心房細動は、心筋に存在するイオンチャネルの働きの異常が原因のひとつと考えられている。一方、クモ毒由来の天然ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４：配列番号４）が、機械刺激感受性チャネル（Ｓｔｒｅｔｃｈ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ：ＳＡＣ）の活性を阻害することが知られている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｓｕｃｈｙｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ Ｓｐａｔｕｌａｔａ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ ｔｈｅｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ５８３−５９８，２０００（非特許文献１）参照）。また、同文献には、陸上及び水中の動物由来の毒液由来の毒素を構成するペプチドには、６つのシステインを含むＩＣＫ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｋｎｏｔ：インヒビターシステインノット）モチーフが共通して見出されることが記載されている（非特許文献１の５９０頁右欄下から７行目〜下から３行目、および図３０）。また、同文献には、ＧｓＭＴｘ−４が、３つのシステインペア（Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５及びＣ３−Ｃ６）によって定義される基本構造を有するＩＣＫモチーフを有することが示唆されている（非特許文献１の５９５頁左欄７行目から下から１１行目、「ＧｓＭＴｘ−４の構造」の欄）。
また、ＧｓＭＴｘ−４を抽出・精製等する方法や、そのＧｓＭＴｘ−４を用いて心臓不整脈を治療する方法などが提案されている（例えば、Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０９，ｐｐ３５−３６，２００１．（非特許文献２）、米国特許出願公開第２００２／００７７２８６号明細書（特許文献１）参照。）。また、ＧｓＭＴｘ−４の構造は、ＮＭＲを用いた溶液中での結果が知られている（Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．（非特許文献３）参照。）。このような知見にかかわらず、クモ毒由来のペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）を用いた心房細動の治療剤は、開発されていなかった。
参考文献
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００７７２８６号明細書；
【非特許文献１】Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．Ｓｕｃｈｙｎａ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ Ｓｐａｔｕｌａｔａ Ｓｐｉｄｅｒ Ｖｅｎｏｍ ｔｈｅｔ Ｂｌｏｃｋｓ Ｃａｔｉｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ５８３−５９８，２０００；
【非特許文献２】Ｂｏｄｅ ｅｔ ａｌ，ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．４０９，ｐｐ３５−３６，２００１；
【非特許文献３】Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．
本発明では、ＧｓＭＴｘ−４のファーマコフォア（活性に必要最低限の空間構造）を同定し、ファーマコフォア情報に基づいて機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害する新規ポリペプチドを設計し、このようなポリペプチドを含む心房細動の治療剤などを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題は、以下の発明により解決される。
［１］ 本発明の第１の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチドであり、ＧｓＭＴｘ−４のファーマコフォアを構成するポリペプチドであると考えられる。これらのポリペプチドは、心房細動の治療などに有用である。
［２］ 本発明の第２の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。
［３］ 本発明の第３の実施態様に係る発明は、「配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチドである。これらのポリペプチドは、心房細動の治療などに有用である。
［４］ 本発明の第４の実施態様に係る発明は、「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩」である。
［５］ 本発明の第５の実施態様に係る発明は、前記「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド」が、配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである上記［４］に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩である。
［６］ 本発明の第６の実施態様に係る発明は、「上記［１］、上記［３］、又は上記［４］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド」である。
［７］ 本発明の第７の実施態様に係る発明は、「上記［６］に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター」である。
［８］ 本発明の第８の実施態様に係る発明は、「上記［７］に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体」である。
［９］ 本発明の第９の実施態様に係る発明は、「上記［１］〜上記［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩のうちいずれか１つ以上を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤」である。この阻害剤は、機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害するので、機械刺激感受性チャネルの研究などに有効に用いられる。
［１０］ 本発明の第１０の実施態様に係る発明は、「上記［１］〜上記［５］のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩うちいずれか１つ以上を含有する心房細動の治療剤」である。これらのポリペプチドは、本明細書の実施例で、その機能が確認されたとおり、機械刺激感受性チャネル阻害活性を有する。したがって、この治療剤は、心房細動の治療に有効に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＧｓＭＴｘ−４と相同性の高い１０の候補マルティプルアライメントの結果を示す図である。
図２は、１ＱＫ６とＧｓＭＴｘ−４とのアラインメントの結果を示す。
図３は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたステレオ図である。
図４は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたモデルのＣαトレースを示す。図４中、薄い線は鋳型を表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
図５は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉで活性中心と考えられるＡｒｇ２０近傍を表す図である。図５中、薄い線はｈｕｗｅｔｏｘｉｎ−Ｉを表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
図６（ａ）〜図６（ｄ）は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ（ＰＤＢ ｃｏｄｅ： １ＱＫ６）を鋳型としたモデルの表面構造を表す図である。図６（ａ）〜図６（ｄ）において、左がｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ、右がＧｓＭＴｘ−４を表す。図６（ａ）は、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈから見たもの（上の図とほぼ同じ向き）を表す。図６（ｂ）は、ｘ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｃ）は、ｙ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｄ）は、ｙ軸の周りに１８０°回転したものを表す。
図７は、ＧｓＭＴｘ−４の構造およびデザインしたペプチドの構造を表す。
図８は、ＴＶＰ００３の阻害活性検査結果を示す図である。図８（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図８（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図９は、ＴＶＰ００４の阻害活性検査結果を示す図である。図９（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図９（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１０は、ＴＶＰ００５の阻害活性検査結果を示す図である。図１０（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１０（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１１は、ＴＶＰ０１７の阻害活性検査結果を示す図である。図１１（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１１（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１２は、ＴＶＰ０１９の阻害活性検査結果を示す図である。図１２（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１２（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。
図１３は、活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性の検討結果を示すグラフである。図１３（ａ）は、ＴＶＰ０００３の心筋ＳＡチャネルに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ＴＶＰ０００３のＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｃ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
（本発明のポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド（すなわち、本発明の第１〜第５の実施態様に係る発明に関するポリペプチド）である。
また、本発明のペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）などであってもよい。
本発明のペプチドには、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているものも含まれる。本発明のペプチドには、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したものも含まれる。本発明のペプチドには、側鎖上の置換基が、適当な保護基で保護されているものも含まれる。本発明のペプチドには、糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドも含まれる。
本発明のペプチドの塩における「塩」としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩である。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
（本発明のポリペプチドの合成）
本発明のポリペプチドは、化学的に合成してもよいし、組換えＤＮＡ技術を用いて製造してもよい。本発明のポリペプチドを化学的に合成するためには、公知の方法に従って合成すればよく、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウッドワード試薬Ｋを用いる方法、カルボニルイミダゾール法、酸化還元法、ＤＣＣ／ＨＯＮＢ法、ＢＯＰ試薬を用いる方法などにより、本発明のペプチドを得ることができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ ａｎｄ Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５）、Ｆ．Ｍ．Ｆｉｎｎ及びＫ．Ｈｏｆｍａｎｎ著、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第２巻、Ｈ．Ｎｅｎｒａｔｈ、Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７６）；泉屋信夫他著「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株）１９８５年；矢島治明、榊原俊平他著、生化学実験講座１、日本生化学会編、東京化学同人 １９７７年；木村俊他著、続生化学実験講座２、日本生化学会編、東京化学同人１９８７年などを参照）。また、自動ペプチド合成装置（ＰＥアプライドバイオシステムズ社等）により化学合成することもできる。
また、反応後は、公知の精製法により本発明のポリペプチドを精製単離することができる。例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。このようなポリヌクレオチドとしては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられ、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（すなわち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（すなわち、非コード鎖）であってもよい。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明のポリペプチドのｍＲＮＡを定量することができる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅する方法が挙げられる。また適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別し本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングを行ってもよい。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じた方法に従って行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードするＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。このようなＤＮＡは、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、そのＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のポリペプチドのＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕，ＤＨ５α〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｇｅｎｅ，９６，２３−２８（１９９０）〕，ＤＨ１０Ｂ〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８７巻，４６４５−４６４９（１９９０）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。そのＳｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メッソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中にはその形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行なって、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行なって、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行なって、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のポリペプチドを生成させることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることや、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験および特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
（機械刺激感受性チャネル阻害剤）
機械刺激感受性チャネル阻害剤としては、本発明のポリペプチド、もしくはそれらの塩のうちいずれか１つ以上（以下、「本発明のポリペプチド等」ともいう。）を含有するものが挙げられる。本発明のポリペプチド等は、機械刺激感受性チャネル阻害剤として使用できる。本発明のポリペプチド等は、取り扱いが容易であり、後の実施例で示されるように高い阻害活性を有する。
（心房細動の治療剤）
心房細動の治療剤としては、本発明のポリペプチド、もしくはその塩のいずれか１つ以上を含有するものが挙げられる。すなわち、本発明によれば、医薬、及び医薬組成物をも提供できる。医薬組成物としては、本発明のポリペプチド、もしくはその塩と、医薬的に許容される担体を含むものがあげられる。
本発明のポリペプチドを含む心房細動の治療剤は、注射液などの形で非経口的に心房の血管等に投与するか、錠剤、カプセル剤など経口投与により使用できる。注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供されてもよい。また、ヒトのみならずヒト以外の哺乳動物に対しても投与することができる。これら製剤化については、公知の製剤化方法を採用することができる。
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
上記のような剤型において、活性成分である本発明のポリペプチドは、剤型中例えば、０．０１重量％〜１００重量％、好ましくは０．１重量％〜９０重量％、より好ましくは１重量％〜５０重量％含まれる。
本発明のポリペプチドの投与量は、非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、心房細動患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与する。経口投与の場合、例えば、心房細動患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。本発明の心房細動の治療剤は、好ましくは１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
（ファルマコフォアの同定）
なお、本発明のポリペプチを設計するに当り、クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）のどの部位が活性に必要な最小単位となるファーマコフォアであるのかを、立体構造に基づいて精度良く予測した。
ファルマコフォアの同定は、例えば以下のようにして行なうことができる。まず、立体構造既知の類縁ペプチドの立体構造を鋳型としたホモロジーモデリング法によるクモ毒ペプチドの精密な構造予測を行なう。その結果、得られた構造に基づいて、活性部位を改変したペプチドの機能解析を行い、医薬品設計のターゲットとなる部位の絞込みを行なう。また、ＧｓＭＴｘ−４のジスルフィド結合の部分をミミックした設計を行い、安定な構造をもつペプチドをデザインする。ＧｓＭＴｘ−４は３つのジスルフィド結合を持つ比較的柔軟性の低い立体構造を有することが知られているため、一般的に結合に関与することが多い極性アミノ酸残基を含む環状ペプチドをいくつかデザインし、活性に必要なファーマコフォアの同定を行なう。
（活性の測定）
本発明のペプチドの活性評価方法としては、公知の活性評価方法を用いることができるが、好ましくは実施例１に記載されたパッチクランプ法による単一チャネル電流記録法を用いることができる。
【実施例１】
実験例１：クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）配列と一致度の高い構造既知の類縁ペプチドの検索
配列番号４で表されるＧｓＭＴｘ−４のアミノ酸配列と一致度の高い構造について、ＰＤＢ（タンパク質立体構造データベース）からクモ毒を対象に検索した。この結果、ＧｓＭＴｘ−４と相同性の高い１０の候補が上がった。これら候補のマルティプルアライメントの結果を以下の図１に示す。
図１に示す配列の中から、システイン残基が一致していて、なおかつシステイン残基間の長さがほぼ等しく、挿入欠失のない（ＧｓＭｔｘ４の方が１残基長い）１ＱＫ６（Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ：配列番号１２）を鋳型として選択し、ホモロジーモデリング法によりファーマコフォアの絞込みを行った。
実施例２：クモ毒ペプチド（ＧｓＭＴｘ−４）の立体構造予測
鋳型ペプチド１ＱＫ６を用いてホモロジーモデリングを行った。まず、１ＱＫ６とＧｓＭＴｘ−４とのアラインメントを行った。その結果を図２に示す。
次に、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲを用いてモデル構造の構築を行った。構築したＧｓＭＴｘ−４の構造モデルと鋳型に用いたＨｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉとの重ね合わせた結果を図３および図４に示す。図３は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたステレオ図である。図４は、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４を重ね合わせたモデルのＣαトレースを示す。図４中、薄い線は鋳型を表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。
また、図５にはＨｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉで活性中心と考えられるＡｒｇ２０近傍の様子を示す。図５中、薄い線はｈｕｗｅｔｏｘｉｎ−Ｉを表し、濃い線はＧｓＭＴｘ−４を表す。さらに、Ｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−ＩとＧｓＭＴｘ−４の表面構造を比較した結果を図６に示す。図６（ａ）〜図６（ｄ）において、左がｈｕｗｅｎｔｏｘｉｎ−Ｉ、右がＧｓＭＴｘ−４を表す。図６（ａ）は、ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｐａｔｃｈから見たもの（上の図とほぼ同じ向き）を表す。図６（ｂ）は、ｘ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｃ）は、ｙ軸の周りに＋９０°回転したものを表す。図６（ｄ）は、ｙ軸の周りに１８０°回転したものを表す。図６（ｂ）から両ペプチドの分子の形状はかなり異なっていることがわかる。また解離性側鎖を持つ残基の分布も異なっており、特異性決定に関係していることが推測できる。
また、Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ３７，ｐｐ３４４３−３４４５０，２００２．（上記非特許文献３）に開示されたＧｓＭＴｘ−４のＮＭＲによる溶液中の構造と、本実施例により求められたＧｓＭＴｘ−４の構造を比較すると、本発明において構築したモデリング構造は、実際のＧｓＭＴｘ−４の構造を反映していると判断できる。
実施例３：活性ペプチドのデザインとファーマコフォアの同定
上述のＧｓＭＴｘ−４のモデリング構造に基づいてペプチド断片のおおよその設計方針を決定した。図７に、ＧｓＭＴｘ−４の構造およびデザインしたペプチドの構造を表す。ＧｓＭＴｘ−４は、３つのジスルフィド結合により、図７の配列構造式に示すように４つのループ部分から成っている。したがって、ＧｓＭＴｘ−４のどのループ部分が阻害活性に寄与する部分であるかを調べるためにＴＶＰ００１からＴＶＰ００５の５つのペプチドをデザインした。これらのペプチドについては、ループを構成しない部位にあるシステインをアラニンに置換している。ＴＶＰ００１（配列番号１４）はループ１と２、ＴＶＰ００２（配列番号１５）はループ３と４、ＴＶＰ００３（配列番号１）はループ２、ＴＶＰ００４（配列番号２）はループ３、ＴＶＰ００５（配列番号３）はループ２と３から成っている。
（デザインしたペプチドのバイオアッセイ）
ペプチドの活性評価には、最も信頼性の高いパッチクランプ法による単一チャネル電流記録法を用いた。アッセイの対象としては、心筋由来の Ｃａ２＋依存性ＢｉｇＫチャネル（Ｋａｗａｋｕｂｏ ｅｔ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２７６：Ｈ１８２７．１９９９）を用いた。このチャネルを、発現しているニワトリの心室筋、もしくはこのチャネルのｃＤＮＡを強制発現したＣＨＯ細胞にセルアタッチトパッチクランプ法を適用した後、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ引きちぎりパッチ膜（ｅｘｃｉｓｅｄ ｐａｔｃｈ）を形成し、膜電位固定下で単一チャネル電流を計測した。デザインした合成ペプチドはＧｓＭＴｘ−４と同様、細胞外からチャネルをブロックするものと想定し、予め記録用ガラスピペットの一定位置以上の空間に既知濃度のペプチドを充填して、拡散によりチャネルに到達させるバックフィル（ｂａｃｋ−ｆｉｌｌ）を用いて投与した。この手法では拡散開始後おおよそ１５−２０分でピペット内ペプチド濃度が平衡に達するので、２０分後の抑制率からペプチドの解離定数を推定できる。あるいは抑制の時間経過からペプチドの相対的抑制力を推定することもできる。ペプチドの正確な解離定数を求めるには、ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔの引きちぎりパッチ膜を形成して単一チャネル電流を計測し、種々の濃度のペプチドによる抑制効果を解析して用量−抑制曲線を求めなければならないが、この方法は格段の技術を要すること、今回は種々のデザインした合成ペプチドの一次スクリーニングであることから、前述のｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ引きちぎりパッチにバックフィルを組み合わせたアッセイ法を使って、ペプチドの抑制効果について、おおよその見積もりを行った。ペプチドの濃度としては、ＧｓＭＴｘ−４での結果を考慮して１０μＭを用いた。評価量としては、チャネルの開確率（Ｐｏ、パーセント表示）を用い、抑制の強さはコントロール（ペプチド投与前）を基準とした抑制率（パーセント）、あるいは抑制の時間経過で表現した。
（アッセイ結果）
デザインした５種類の合成ペプチドのうち、ＴＶＰ００３、ＴＶＰ００４、ＴＶＰ００５、に阻害活性が認められた。そこで、ＴＶＰ０００４のＮ末端から３番目のＲをＡに置換した変異体ＴＶＰ０１７（配列番号：１６）、およびＴＶＰ０００４のＮ末端から７番目のＫをＡに置換した変異体ＴＶＰ０１９（配列番号：１７）を合成し、上記のバイオアッセイにより阻害活性を測定したところ、これらの合成ペプチドにも阻害活性が認められた。
図８は、ＴＶＰ００３の阻害活性検査結果を示す。図８（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図８（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図８に示すように、ＴＶＰ００３は８分後にはほぼ１００％の抑制効果を示したことから、ＴＶＰ００３の解離定数はμＭオーダーかそれ以下であると推定された。この値は、ＴＶＰ００３が、天然のクモ毒ペプチドＧｓＭＴｘ−４と同等かそれ以上の阻害活性を有することを示唆している。
図９は、ＴＶＰ００４の阻害活性検査結果を示す図である。図９（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図９（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図９に示すようにＴＶＰ００４は１０μＭで８分後には約６０％、１６分後には９５％の阻害活性を示し、比較的強い阻害活性を示した。
図１０は、ＴＶＰ００５の阻害活性検査結果を示す図である。図１０（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す。図１０（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１０に示すように、ＴＶＰ００５は、２０分後に約６０％の阻害効果を示したことから、その解離定数はおおよそ１０μＭ程度と推定された。
図１１は、ＴＶＰ０１７の阻害活性検査結果を示す。図１１（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図１１（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１１に示すように、ＴＶＰ０１７は６分後にはほぼ１００％の抑制効果を示したことから、ＴＶＰ００３よりさらに優れた抑制効果を示すことが分かった。この値は、ＴＶＰ０１７が、天然のクモ毒ペプチドＧｓＭＴｘ−４以上の阻害活性を有することを示唆している。
図１２は、ＴＶＰ０１９の阻害活性検査結果を示す。図１２（ａ）は、単一チャネル電流の計測結果を表す図である。図１２（ｂ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表す。図１２に示すように、ＴＶＰ０１７は１４分後にはほぼ８０％の抑制効果を示した。
（２）ペプチドのチャネルに対する特異性について
実施例４：活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性
本発明の活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性について検討した。活性ペプチドとしてＴＶＰ０００３を用い、チャネルには、実施例３で用いたチャネルと同じ心筋ＳＡチャネルを使用した。このチャネルはＣ末に５９アミノ酸からなるＳＴＲＥＸ配列を有しており、これを除去した変異体（ＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔ）は、伸展活性をほとんど失い、ごく一般的なＣａ依存性ｂｉｇＫチャネルとなる（ＳＡＫＣＡ：Ｔａｎｇ，Ｎａｒｕｓｅ，Ｓｏｋａｂｅ，Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，１６９：１８５−２００，２００３）。図１３は、活性ペプチドの機械刺激感受性チャネルに対する特異性の検討結果を示すグラフである。図１３（ａ）は、ＴＶＰ０００３の心筋ＳＡチャネルに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ＴＶＰ０００３のＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔに関する単一チャネル電流の測定結果を示すグラフである。図１３（ｃ）は、チャネルの開確立（Ｐｏ）を表すグラフである。図１３から、ＧｓＭＴｘ−４およびＴＶＰ００３は、野生型のＳＡチャネル抑制するのに対し、ＳＴＲＥＸ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ−ｍｕｔａｎｔをほとんど抑制しないことがわかる。従って、ＧｓＭＴｘ−４およびＴＶＰ００３は、伸展活性を有するチャネルにのみ特異的に作用すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
本発明によれば、機械刺激感受性チャネルの活性を特異的に阻害する新規ポリペプチドを得ることができる。
このような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、その組換えベクターで形質転換させた形質転換体を用いれば、本発明のポリペプチドを大量に生産できる。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドの塩を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤は、機械刺激感受性チャネルに関する試薬を製造する際に有効である。
本発明のポリペプチド、または本発明のポリペプチドを含有する心房細動の治療剤は、心房細動を効果的に治療することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項３】
配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項５】
前記「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド」が、配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項４に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの塩。
【請求項６】
請求項１、請求項３、又は請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩のうちいずれか１つ以上を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩うちいずれか１つ以上を含有する心房細動の治療剤。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項３】
配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩。
【請求項５】
前記「配列番号１、配列番号２、または配列番号３で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるものではなく、かつ機械刺激感受性チャネル阻害活性を有するポリペプチド」が、配列番号１６、または配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項４に記載のポリペプチドまたは当該ポリペプチドの塩。
【請求項６】
請求項１、請求項３、又は請求項４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩のうちいずれか１つ以上を含有する機械刺激感受性チャネル阻害剤。
【請求項１０】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のポリペプチド、または当該ポリペプチドの塩うちいずれか１つ以上を含有する心房細動の治療剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６４７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０４１０１（Ｐ２００５−５０４１０１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１９０
【国際出願日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５００３８６５６３）株式会社ファルマデザイン (9)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【発行日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４１９０
【国際出願日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【出願人】（５００３８６５６３）株式会社ファルマデザイン (9)
【Ｆターム（参考）】
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