イネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法
【課題】高アミロース澱粉は、難消化性澱粉やフィルム特性等、工業品、食品及び食品添加物として多岐に渡って利用されているが、これまで市販されているのは、高アミロース澱粉を含む品種のトウモロコシ由来であり、米由来はない。そこで、高アミロース澱粉を含むジャポニカ米品種のイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法を提供する。
【解決手段】イネの澱粉生合成酵素の一つであるスターチシンターゼのアイソザイムであるＩ型とＩＩＩａ型の変異体を交配した後代から、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得た、両酵素活性が非常に低下した白濁種子を選別したイネ。該イネ変異体系統の胚乳澱粉は、高いアミロース含量をもち、アミロペクチンの構造もユニークである。
【解決手段】イネの澱粉生合成酵素の一つであるスターチシンターゼのアイソザイムであるＩ型とＩＩＩａ型の変異体を交配した後代から、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得た、両酵素活性が非常に低下した白濁種子を選別したイネ。該イネ変異体系統の胚乳澱粉は、高いアミロース含量をもち、アミロペクチンの構造もユニークである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高アミロース澱粉を含むジャポニカ米品種のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、該澱粉を利用する飲食品及び工業品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高アミロース澱粉は、糊化しにくく、老化しやすいため、人間が食したときに、大腸まで消化されずに到達する難消化性澱粉（レジスタントスターチ、ＲＳ）と成り易く、大腸癌予防食品として最近注目されている。ＲＳは、食物繊維の一種であり、大腸環境の改善や免疫賦活作用等の生理機能をもつことが知られている。また、高アミロース澱粉は、その優れたフィルム特性等を利用した食品添加物や工業素材としても利用されている。
【０００３】
高アミロース澱粉を蓄積する日本稲（ジャポニカ米）としては、スターチシンターゼ（ＳＳ）のアイソザイムの一つであるＳＳＩＩＩａ型変異体イネがある（非特許文献１、特許文献１）。ＳＳＩＩＩａは、イネの登熟胚乳で働くＳＳ活性のうち、ＳＳＩに次ぐ第２番目の活性を示し、この酵素を完全に欠失した変異体では、結合型澱粉合成酵素（Ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＢＳＳＩ）の発現が促進され、アミロース含量が増加する。そして、その見かけのアミロース含量は、正常なジャポニカ米の１．５倍である。
また、ジャポニカ米品種のモチ米に印度稲（インディカ米）由来のＧＢＳＳＩ遺伝子を形質転換することで、見かけのアミロース含量が４６．３％であるジャポニカ米が得られたという報告がある（非特許文献２）。しかし、このアミロース含量の数値は、測定方法によって大きく異なり、Ｈａｎａｓｈｉｒｏらの方法によると、これらの見かけのアミロース含量は２１．９−２２．２％である（非特許文献３）。なお、申請者らが非特許文献３と同様の手法で測定したＳＳＩＩＩａ変異体イネは、見かけのアミロース含量は２６．０％である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−０５１０２３号公報
【非特許文献１】N. Fujita他 Plant Physiol., 144: 2009-2023 (2007)
【非特許文献２】K. Itoh他 Plant Cell Physiol., 44: 473-480 (2003)
【非特許文献３】I. Hanashiro他 Plant Cell Physiol., 49: 925-933 (2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、高アミロース澱粉素材としては、米由来のものは存在せず、主にトウモロコシ由来が用いられてきた。さらに、ジャポニカ米において、インディカ米と同等レベルもしくはそれ以上のアミロース含量を含む澱粉を胚乳に生産する高アミロース米は存在しなかった。加えて、米由来の高アミロース澱粉を応用した飲食品、食品添加物及び工業品はこれまで製造販売されていなかった。
【０００６】
本発明は、斯かる課題に鑑みてなされたもので、上記課題を解決できる高アミロース澱粉を含むジャポニカ米品種のイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載のイネ変異体の製造方法は、イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネの交配後代から生じた白濁種子を選別したことを特徴とする。
また、請求項２に記載のイネ変異体の製造方法は、前記イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及び前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得たことを特徴とする。
また、請求項３に記載のイネ変異体は、請求項１又は２に記載のイネ変異体の製造方法から製造されたことを特徴とする。
また、請求項４に記載のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩ型及び／又はイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下したことを特徴とする。
また、請求項５に記載のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の一方の遺伝子型は劣勢ホモであり、もう一方の遺伝子型はヘテロであることを特徴とする。
また、請求項６に記載のイネ変異体は、野生型イネ及び親系統イネと比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質に低下が見られないことを特徴とする。
また、請求項７に記載の澱粉の製造方法は、請求項３乃至６の何れかに記載のイネ変異体を用いたことを特徴とする。
また、請求項８に記載の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体の胚乳を用いたことを特徴とする。
また、請求項９に記載の澱粉は、請求項７又は８に記載の澱粉の製造方法から製造されたことを特徴とする。
また、請求項１０に記載の澱粉は、イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性の低下に起因する野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉とは異なることを特徴とする。
また、請求項１１に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、真のアミロース含量が高いことを特徴とする。
また、請求項１２に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なることを特徴とする。
また、請求項１３に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉物性が異なることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、白濁種子という形質を指標として用いることによって、高アミロース澱粉を含むイネ変異体を簡易に選別することができる。さらに、バイオ燃料の需要過多から、輸入穀類澱粉価格が高騰している昨今、国産のジャポニカ米品種での代用が望まれるが、本発明の高アミロース澱粉を含むイネ変異体は、これまでトウモロコシにしか無かった高アミロースの性質を備えており、代用はもちろん、米食の我が国においては、さまざまな食品添加物や工業素材への利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明では、スターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体イネの胚乳澱粉よりも高アミロースである澱粉を得るため、本発明者らが既に得ているＳＳＩＩＩａ変異体イネ（特開２００６−０５１０２３号公報）にスターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）変異体イネ（N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)；特開２００３−０７９２６０号公報）を交配することで、それらの後代から高アミロース澱粉を蓄積する種子を選抜する。
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１０】
本発明のイネ変異体は、ＳＳＩ変異体イネのうちＳＳＩを完全に欠失した系統（ｅ７−／−）とＳＳＩＩＩａ変異体イネのうちＳＳＩＩＩａを完全に欠失した系統（ｅ１−／−）を定法で交配したものであり、得られたＦ１種子の自殖種子（Ｆ２種子）を用いる。ここで、ＳＳＩ変異体イネ及びＳＳＩＩＩａ変異体イネは、当業者が用いることが可能な技術であれば、任意の方法を用いて作成することができる。好ましくは、ＳＳＩ遺伝子あるいはＳＳＩＩＩａ遺伝子にレトロトランスポゾンＴｏｓ１７を挿入して作成する。
Ｆ２種子は、親系統イネの種子の形態とは異なる白濁種子である。すなわち、野生型イネと同一の種子の形態を示すＳＳＩ変異体イネの種子、及び種子の中央部が濁る心白種子の形態を示すＳＳＩＩＩａ変異体イネの種子は選択から除外する（図１下部参照）。
さらに、この白濁種子を播種し、次世代の種子を得る。すると、白濁種子と正常種子が分離した系統と、白濁種子と心白種子が分離した系統が存在する（図１参照）。このことから、播種した白濁種子は、ＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩＩａ遺伝子に関して二重劣性ホモではなく、いずれかがヘテロであることが分かる。ここで、前者をＲ系統、後者をＡ系統と呼ぶ（図１参照）。
【００１１】
次に、Ｒ系統及びＡ系統の白濁種子を発芽させた後、葉身からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によってその遺伝子型を検出する。
すると、Ｒ系統白濁種子は、ＳＳＩ遺伝子座は劣性ホモであり、ＳＳＩＩＩａ遺伝子座はヘテロである。一方で、Ａ系統白濁種子は、Ｒ系統とは逆に、ＳＳＩ遺伝子座はヘテロであり、ＳＳＩＩＩａ遺伝子座は劣性ホモである（図２参照）。
【００１２】
次に、Ｒ系統白濁種子及びＡ系統白濁種子の次世代の登熟種子の可溶性抽出液のＳＳ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法で測定する。
すると、Ｒ系統白濁種子の次世代では、いずれの登熟種子でもＳＳＩ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩＩＩａ活性が強いものと弱いものが存在する（図３参照）。この可溶性画分を抽出して残った沈殿を用いてアミロペクチンの鎖長分布解析を行ったところ、ＳＳＩＩＩａ活性が強い種子は、いずれもＳＳＩ変異体イネの親系統イネと同一の鎖長分布パターンを示し、ＳＳＩＩＩａ活性が弱い種子は、いずれもＲ系統白濁種子と同一の鎖長分布パターンを示す（図３参照）。
また、Ａ系統白濁種子の次世代では、いずれの登熟種子でもＳＳＩＩＩａ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩ活性が強いものと弱いものが存在する（図４参照）。この可溶性画分を抽出して残った沈殿を用いてアミロペクチンの鎖長分布解析を行ったところ、ＳＳＩ活性が強い種子は、いずれもＳＳＩＩＩａ変異体イネの親系統イネと同一の鎖長分布パターンを示し、ＳＳＩ活性が弱い種子は、いずれもＡ系統白濁種子と同一の鎖長分布パターンを示す（図４参照）。
このように、本発明のイネ変異体は、ＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下しているものを含む。
【００１３】
以上のことから、ＳＳＩ変異体イネとＳＳＩＩＩａ変異体イネを交配した後代に得られる白濁種子には、Ｒ系統及びＡ系統の２種類の遺伝子型のものが存在し、それらは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって生じたＳＳＩ活性あるいはＳＳＩＩＩａ活性の低下を親から受け継ぐ。すなわち、ＳＳＩあるいはＳＳＩＩＩａの一方の遺伝子座が劣勢ホモとなり完全に欠失し、もう一方の遺伝子座がヘテロになることでＳＳ活性が激減して、種子が白濁するという特徴を有する。このＳＳ活性の低下は、好ましくはＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下することが望ましい。また、両酵素の活性が低下、即ち、二重劣勢ホモになると種子が稔実しない。
なお、これらのイネ変異体イネの系統はいずれかの遺伝子座がヘテロであることから、次世代は再び異なる形態の種子が分離する（図１のＦ３種子参照）。したがって、白濁という明確な指標で、以下に述べるユニークな澱粉構造をもったイネ変異体を容易に選抜することが可能である。
【００１４】
次に、本発明のイネ変異体の澱粉について説明する。
一般に、澱粉とは、少なくとも緑藻より高等な植物が主として貯蔵組織に蓄積する不溶性のαグルカンである。イネ、トウモロコシ等の穀類や芋類、豆類が蓄積する貯蔵澱粉は、α１，４グルコシド結合からなる直鎖構造とα１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造とのグルコースホモポリマーである。通常の貯蔵澱粉は、ほとんどが直鎖成分からなるアミロースと枝分かれ成分を含むアミロペクチンからなり、後者は前者より多く、通常は７０−８０％を占める（澱粉科学の事典（不破英次他），３〜３８頁，朝倉書店（２００３））。
澱粉合成に関与する酵素には、ＡＤＰグルコースを基質としてα１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合を作る枝作り酵素（ＢＥ）、ＡＤＰグルコースを生産するＡＤＰグルコースピロフォスフォリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、余分な枝を払う枝切り酵素（ＤＢＥ）の４種類が考えられている。イネ等の高等植物には、これらの酵素に複数のアイソザイムが存在し、これらは異なる遺伝子にコードされている。これらのアイソザイム遺伝子が欠失あるいは損傷すると、変異体となり、すべての遺伝子が正常な野生型イネとは異なる澱粉構造を示すことが知られている（Y. Nakamura Plant Cell Physiol. 43: 718-725 (2002)）。
【００１５】
ここで、本発明のイネ変異体の澱粉は、以下の特徴を有する。
（１）本発明のＲ系統白濁種子とＡ系統白濁種子のアミロペクチンの鎖長分布を測定したところ、野生型イネ及び両親系統イネとは異なるユニークなパターンを示す（図５参照）。
（２）本発明のＲ系統及びＡ系統白濁種子は、野生型イネの種子重量のそれぞれ８７．７％及び８３．６％を維持する。好ましくは、野生型イネ及び両親系統イネの種子重量の８割以上を有することが望ましい。また、生育、開花日等も野生型イネと変わらず、農業形質の低下がみられない。これらの性質は、育種素材として利用する場合のメリットとなる。
（３）Ｒ系統及びＡ系統白濁種子澱粉の糊化温度は、アミロペクチンの鎖長分布の変化に伴い高くなる。特に、Ｒ系統白濁種子の糊化開始温度は、野生型イネの種子に比べて約６℃高いという澱粉物性を有する（図６参照）。このように、糊化温度が高い澱粉は、低温糊化させると、未糊化澱粉が残存し、老化しやすく、難消化性澱粉と成りやすい。
（４）Ｒ系統及びＡ系統白濁種子澱粉の見かけのアミロース含量は、それぞれ、２８．６％及び３２．５％であり、真のアミロース含量は、それぞれ、２５．３％及び２９．４％である。特にＡ系統白濁種子は、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ（見かけのアミロース含量が３０．２％，真のアミロース含量が２６．９％）より高い値を示す（図７及び図８参照）。好ましくは、野生型イネ及び両親系統イネを用いて製造される澱粉よりも真のアミロース含量が高いことが望ましい。
なお、本明細書中に記載の見かけのアミロース含量とは、澱粉のイソアミラーゼ分解物をゲル濾過したときに、最も分子量が大きいため、最初に検出されるフラクションの含量であり、アミロペクチンの超長鎖をも含む値である。これに対して、真のアミロース含量とは、見かけのアミロース含量からアミロペクチンの超長鎖を引いた値である（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci. 51: 303-313 (2004)）。
【実施例】
【００１６】
以下、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００１７】
（実施例１：白濁種子の遺伝子型決定）
本発明の白濁種子の親系統イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７をＳＳＩ遺伝子あるいはＳＳＩＩＩａ遺伝子に挿入することで、ＳＳＩ活性あるいはＳＳＩＩＩａ活性が低下している系統である。これらの遺伝子型が劣性ホモかヘテロかを確認するには、それぞれの遺伝子上にＴｏｓ１７が挿入されているか否かをネステッドＰＣＲ法によって確認すればよい。
ＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７が挿入されていることを確認するＰＣＲ（挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、Ｔ１Ｆ（配列表の配列番号９）とＳＳＩ−１Ｒ（配列表の配列番号１）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＴ２Ｆ（配列表の配列番号１０）とＳＳＩ−２Ｒ（配列表の配列番号２）を用いた。また、Ｔｏｓ１７が挿入されていないことを確認するＰＣＲ（非挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、ＳＳＩ−３Ｆ（配列表の配列番号３）とＳＳＩ−１Ｒ（配列表の配列番号１）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＳＳＩ−６Ｆ（配列表の配列番号４）とＳＳＩ−２Ｒ（配列表の配列番号２）を用いた。
そして、ネステッドＰＣＲを行うと、挿入ＰＣＲで２９２０ｂ．ｐ．、非挿入ＰＣＲで３１７０ｂ．ｐ．のバンドが得られた。ＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７がホモで挿入されていれば、挿入ＰＣＲでのみバンドが検出され、ヘテロであれば、挿入及び非挿入ＰＣＲの両方にバンドが検出されるが、いずれも予想通りのバンドパターンが得られた（図２上段参照）。
【００１８】
同様に、ＳＳＩＩＩａ遺伝子にＴｏｓ１７が挿入されていることを確認するＰＣＲ（挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、Ｔ１Ｆ（配列表の配列番号９）とＳＳＩＩＩａ−５Ｒ（配列表の配列番号５）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＴ２Ｆ（配列表の配列番号１０）とＳＳＩＩＩａ−６Ｒ（配列表の配列番号６）を用いた。また、Ｔｏｓ１７が挿入されていないことを確認するＰＣＲ（非挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、ＳＳＩＩＩａ−５Ｆ（配列表の配列番号７）とＳＳＩＩＩａ−５Ｒ（配列表の配列番号５）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＳＳＩＩＩａ−６Ｆ（配列表の配列番号８）とＳＳＩＩＩａ−６Ｒ（配列表の配列番号６）を用いた。
そして、ネステッドＰＣＲを行うと、挿入ＰＣＲで３０２０ｂ．ｐ．、非挿入ＰＣＲ後者で４８７０ｂ．ｐ．のバンドが得られた。ＳＳＩＩＩａ遺伝子にＴｏｓ１７がホモで挿入されていれば、挿入ＰＣＲでのみバンドが検出され、ヘテロであれば、挿入及び非挿入ＰＣＲの両方にバンドが検出されるが、いずれも予想通りのバンドパターンが得られた（図２下段参照）。
【００１９】
（実施例２：白濁種子の次世代の登熟種子から得た可溶性画分のＳＳ活性検出法）
白濁種子の次世代の登熟種子から得た可溶性画分のＳＳＩ活性及びＳＳＩＩＩａ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて検討した。具体的には、N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)に記載の方法に従って行った。
【００２０】
開花後１０〜１５日くらいの登熟種子１粒のもみ、胚、果皮を除去し、３倍体積の抽出バッファー［５０ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４），１２．５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ，８ｍＭの塩化マグネシウム，５００ｍＭの２−メルカプトエタノール］を加え、マイクロチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［０．３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），０．１％のブロモフェノールブルー，５０％のグリセロール］を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動にはグルコシルトランスフェラーゼ反応に必要なプライマーとしてカキグリコーゲンを６０℃で溶かし込んだ７．５％のアクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから６０分で電流を止めた。その後、基質であるＡＤＰグルコースを除いた反応液［クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５），０．５ＭのＣｉｔｒａｔｅ−Ｎａ，１００ｍＭのＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのジチオスレイトール，１ｍＭのＡＤＰグルコース］で２回洗浄し（各１５分）、ＡＤＰＧを加えて２０時間、３０℃でシーソーで反応させた。反応後、ヨード・ヨードカリ液（１％のＫＩ／０．１％のＩ２）で染色した。
【００２１】
図３及び図４に上記の結果を示す。イネの野生型（日本晴）の登熟種子をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色した場合、ＳＳアイソザイムはゲル中にポリグルカンを伸長するため、ヨード・ヨードカリ液で染色すると茶色のバンドを生じた。移動度の遅いバンドがＳＳＩＩＩａであり、これよりも移動度の早いバンドがＳＳＩである。野生型イネである日本晴（日）では両ＳＳのバンドが検出されるが、両親の変異体イネ（ΔＳＳＩ及びΔＳＳＩＩＩａ）ではいずれかの活性が欠失していた。それに対して、Ｒ系統白濁種子の次世代の登熟種子では、いずれもＳＳＩ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩＩＩａ活性が強いものと弱いものが存在した（図３＃１〜１３）。また、Ａ系統白濁種子の登熟種子では、いずれもＳＳＩＩＩａ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩ活性が強いものと弱いものが存在した（図４＃１〜１４）。したがって、実施の形態でも述べたように、本発明のイネ変異体には、ＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下したものを含むことが示された。
【００２２】
［実施例３：胚乳アミロペクチンの鎖長分布解析］
胚乳澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析は、オセアとモレルの方法（O’Shea and Morell, Electrophoresis, 17, 681-688 (1996)）を参考に以下のように行った。
【００２３】
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末あるいは、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色に用いた上清を採取した後に残った沈殿を蒸留水とアセトンで洗浄したものを用いた。各々に５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍｌ加え２度洗浄した。さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μｌ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。その糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水を１０８９μｌ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μｌ、２％のアジ化ナトリウムを１５μｌ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８，林原生物化学研究所）を２μｌ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。さらに、イソアミラーゼを２μｌ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Carbohydrate Research, 94, 205-213 (1981)）の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液［２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸］を２μｌ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液［１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン］を２μｌ添加し、５５℃で９０分間反応させた。分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒｓ）を用いて行った。グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌａｒ ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌａｒ ％）のグラフを作成した（図３、図４及び図５参照）。これより、Ｒ系統白濁種子とＡ系統白濁種子のアミロペクチンの鎖長分布は、野生型イネ及び両親系統イネとは異なるユニークなパターンであることが示された。
【００２４】
（実施例４：胚乳澱粉の熱糊化特性）
イネ変異体系統における胚乳澱粉の熱糊化特性を、Fujita et al. Plant Cell Physiol. 44: 607-618 (2003)に記載の方法に従って、以下のように調べた。
【００２５】
完熟種子のもみ、胚を除去し、乳鉢で粉砕したものを１０５℃で２時間乾燥させた。乾燥させた粉末約３ｍｇに蒸留水９μｌを加えたものをアルミ容器に入れて示差走査熱量測定（ＤＳＣ，セイコーインスツルメンツ社製）に用いた。昇温速度は３℃／分で５〜１００℃を測定した。そして、測定器付属の計算ソフトで、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化熱量を算出した。
図６に野生型（日本晴）、ＳＳＩ変異体、ＳＳＩＩＩａ変異体、Ｒ系統、Ａ系統における澱粉特性の一覧を示す。各系統において、種子の澱粉特性が異なっていた。
特に、Ｒ系統白濁種子の糊化開始温度は５８．０±０．２℃であって、野生型イネ（日本晴）種子の５２．４±０．１℃と比べて約５．６℃上昇した。また、澱粉の糊化ピーク温度は、Ｒ系統白濁種子は６４．６±０．１℃及びＡ系統白濁種子は６１．９±０．１℃であって、日本晴種子の５８．２±０．１℃と比べてそれぞれ約６．４℃及び約３．７℃上昇した。また、澱粉の糊化終了温度は、Ｒ系統白濁種子は６９．９±０．２℃及びＡ系統白濁種子は６７．８±０．２℃であって、日本晴種子の６３．３±０．３℃と比べて各々約６．６℃及び約４．５℃上昇した。このように、糊化温度が高い澱粉物性を示すＲ系統及びＡ系統白濁種子の澱粉は、低温糊化させると未糊化澱粉が残存し老化しやすいため、難消化性澱粉に成りやすいことが示された。
【００２６】
（実施例５：枝切りした澱粉のゲル濾過クロマトグラフィー）
澱粉のα−１，６結合をイソアミラーゼで完全に切断し、α−１，４鎖のみにした後、ゲル濾過によって分離することで、澱粉中の見かけのアミロース含量を求めることができる。また、澱粉からアミロペクチンを精製し、同様にゲル濾過を行えば、真のアミロース含量を求めることができる。すなわち、澱粉のゲル濾過によって検出される高分子量のピークには真のアミロース含量とアミロペクチンに接続された非常に長い直鎖（Ｅｘｔｒａ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ， ＥＬＣ）の両方が検出され、精製したアミロペクチンからは、高分子量のピークにはＥＬＣのみが検出されるため、真のアミロース含量は見かけのアミロース含量からＥＬＣ含量を引くことで求めることができる（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci. 51: 303-313 (2004)）。
これらの方法を用いて、本発明のＲ系統及びＡ系統の白濁種子、並びに野生型イネ（日本晴）種子、ＳＳＩ変異体イネ種子、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ種子の胚乳澱粉の真のアミロース含量及びＥＬＣ含量を求めた。方法の詳細を以下に示す。
【００２７】
（実施例５．１：澱粉の精製法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Yamamoto他, Denpun Kagaku 28: 241-244 (1981)）を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍｌ加えて一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍｌ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
【００２８】
（実施例５．２：アミロペクチンの精製法）
アミロペクチンの精製は、Takeda et al. Carbohydr. Res. 148: 299-308 (1986)に記載の方法に基づいて行った。まず、精製した澱粉１ｇにＤＭＳＯを１００ｍｌ加え、８０〜８５℃で窒素気流下で静かに撹拌しながら澱粉を３時間溶解させた。次に、６０℃まで冷却後、エタノール５００ｍｌを加え、５℃で一晩放置し、２，０００ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。沈殿に再びＤＭＳＯを１００ｍｌ加え、８０〜８５℃で窒素気流下で静かに撹拌しながら澱粉を３時間溶解させた。次に、６０℃まで冷却後、エタノール５００ｍｌを加え、５℃で一晩放置し、２，０００ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。次に、得られた沈殿に６０℃の蒸留水１７０ｍｌを加えて７８〜８０℃に温め、窒素気流下で溶解させた。溶解後、８０〜８５℃に保温し、ｎ−ブタノールとイソアミルアルコールをそれぞれ１０ｍｌずつ加え、３時間静かに撹拌した。そして、６０℃まで冷却後、緩やかに冷却しながら一晩放置し、さらに二晩５℃で放置した。そして、８，５００ｇ、５℃で２０分遠心分離し、上清をロータリーエバポレーターで８倍に濃縮し、３倍量のメタノールを加えて５℃で一晩放置した。加えて、８，５００ｇ、５℃で２０分遠心分離し、沈殿にエタノール、アセトン、ジエチルエーテルを順次加えて２，０００ｇ、５℃で１０分間の遠心分離を行い、減圧乾燥して、粉末アミロペクチンを得た。
【００２９】
（実施例５．３：澱粉及び精製アミロペクチンの枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉あるいはアミロペクチン２２．５ｍｇに蒸留水０．２５ｍｌ加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍｌ加えて３７℃で２時間糊化させた。これに蒸留水３．２６ｍｌを加え、５ＮのＨＣｌを９０μｌ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を５ｍｌ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８，林原生物化学研究所）を１２．５μｌ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、４０℃で２４時間揺らしながら反応させた。そして、エタノールを５ｍｌ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍｌ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍｌ加えて、５℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
【００３０】
使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）３本（両カラムともＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍｌずつ分取し、６８本に分画した。各フラクションの糖量をフェノール硫酸法で測定した。
図７にゲル濾過の結果を示す。野生型（日本晴）、ＳＳＩ変異体、ＳＳＩＩＩａ変異体、Ｒ系統白濁種子、Ａ系統白濁種子における各フラクションの胚乳澱粉及び精製アミロペクチンの全糖量（％）、並びに澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘ（ｎｍ）を求めた。
図８に図７で求めた値から計算した結果を示す。各系統の胚乳澱粉（ｓｔａｒｃｈ）及び精製アミロペクチン（ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）の第１ピーク（Ｆｒ．Ｉ）、第２ピーク（Ｆｒ．ＩＩ）、第３ピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ）の各相対糖含量（％）、真のアミロース含量ＴＡＣ（％）、並びにＦｒ．ＩＩＩ／Ｆｒ．ＩＩを求めた。
これより、第１ピークにおける胚乳澱粉から精製アミロペクチンの量を引いた値である真のアミロース含量は、Ｒ系統白濁種子は２５．３％及びＡ系統白濁種子は２９．４％であって、日本晴種子の１７．９％と比べて大きく上昇していた。また、Ｒ系統及びＡ系統白濁種子共にＳＳＩ変異体種子の１９．７％と比べて高くなっていた。さらに、Ａ系統白濁種子は、ＳＳＩＩＩａ変異体種子の２６．９％と比べても高くなっていた。
【００３１】
このように、Ｒ系統白濁種子は親系統であるＳＳＩＩＩａ変異体の澱粉よりわずかに低いか同等の見かけのアミロース含量を示し、Ａ系統白濁種子は親系統であるＳＳＩＩＩａ変異体の澱粉より見かけのアミロース含量が高かった。以上のことから、野生型イネや既に報告されている組換体イネより、本発明のイネ変異体の方が澱粉の見かけのアミロース含量は高いといえる。
なお、日本人が米飯として食している米は日本稲（ジャポニカ米）であり、ジャポニカ米澱粉の見かけのアミロース含量は１６−２２％程度である。これに対し、東南アジア、インド等で食されている印度稲（インディカ米）は、ジャポニカ米に比べてパサパサとした食感を示し、見かけのアミロース含量は２３−２８％程度である（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci., 51: 303-313 (2004)）。これは、ＳＳアイソザイムのうち、アミロース合成に関与するＧＢＳＳＩがインディカ米では正常であるのに対し、ジャポニカ米はＧＢＳＳＩ遺伝子の変異によってその発現が低下しているため、そのアミロース含量がインディカ米に比べて低下するからである（M. Isshiki他 Plant J., 15: 133-138 (1998)）。
一般に、日本人にはアミロース含量の低いモチモチとした食感の米を好んで食す長年の習慣があり、最近はこれら通常のジャポニカ米より低アミロースである米が良食味米として全国の農業試験場で開発されている。したがって、本発明のジャポニカ米品種を用いた高アミロース含量の澱粉は、日本人にとって受け入れ易いと考えられる。
【００３２】
また、ジャポニカ米澱粉のもう一つの特徴は、糊化開始温度がインディカ米より低いことである。これは、ＳＳアイソザイムのうち、アミロペクチン合成に関与するスターチシンターゼＩＩａ型（ＳＳＩＩａ）がインディカ米では正常であるのに対し、ジャポニカ米はＳＳＩＩａ遺伝子の変異によってその活性が低下しているため、そのアミロペクチンの鎖長が完全に伸びきらず糊化温度の低下が生じるためである（Y. Nakamura他 Plant Mol. Biol., 58: 213-227 (2005)）。ＧＢＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩａ遺伝子は、イネの染色体６番の比較的近接した位置に座乗しているため、多くのインディカ米品種はＧＢＳＳＩ及びＳＳＩＩａが正常で、多くのジャポニカ米品種は両酵素が変異している（Y. Nakamura他 Starch, 54: 117-131 (2002)）。
このように、ジャポニカ米澱粉及びインディカ米澱粉の特徴は、主としてこれらのＧＢＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩａ遺伝子の両遺伝子によって特徴づけられることが解明されているが、本発明のＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性が著しく低下したイネ変異体は、別のＳＳアイソザイムであり、アミロース合成に働くＧＢＳＳＩ遺伝子の発現を著しく促進させ、ＧＢＳＳＩタンパク質が増加するため、高アミロースになると予想される。
また、イネのスターチシンターゼアイソザイムは１０種類も存在し、それぞれに組織、生育時期特異性や、対象とするαグルカンの種類が異なること、また、伸長するαグルカンの長さも異なる等によって役割分担されている（N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)）が、多くの場合は、特定のアイソザイムの活性が低下しても、他のアイソザイムの相補作用によって、グルカン量は大きくは減少しない。一方、相補によって強発現したアイソザイムの役割分担が異なることから、澱粉の成分や構造が野生型イネとは大きく変化すると解される。本発明は、まさに、この生物学的性質を狙ったものである。
【００３３】
なお、これまでに高アミロース澱粉としては、トウモロコシ由来のアミロメイズ（ハイロン５０、ハイロン７０）が利用されている。アミロメイズは、ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）変異体で、枝作り酵素ＩＩｂ型の変異体であると考えられているが、その学術的情報が公開されていないため、詳細は不明である。アミロメイズを湿熱処理したＲＳ（日食ロードスター、日本食品化工（株）製、アミロジェルＨＢ−４５０、三和澱粉工業（株）製）が販売されている。また、トウモロコシのａｅ変異体の見かけのアミロース含量は６５．２％である（CD Boyer他 Starch 12: 405-436 (1976)）。
これに対し、イネのａｅ変異体は、野生型イネに比べて特に高アミロースにはならないことが知られている（A. Nishi他 Plant Physiol., 127: 459-472 (2001)）。ただし、アミロペクチンの平均鎖長が非常に長いため、イネのａｅ変異体の胚乳澱粉は難糊化性を示す。そして、トウモロコシのように見かけのアミロース含量が５０％を超えるイネは、現在のところ存在しない。これまで、さまざまな米品種の中で、最も高いものでも見かけのアミロース含量が３０％程度であり、これらはいずれもインディカ米である（N. Inouchi他 J. Appl. Glycosci. 52: 239-246 (2005)）。
このように、これまで高アミロース澱粉素材としては、米由来のものは存在せず、トウモロコシ由来のものが用いられてきたが、近年、価格が高騰しているトウモロコシの代替として、さらには米食を習慣とする日本人にとって、高アミロース米が受け入れられる可能性は高い。特に、本発明の高アミロース澱粉は、糊化温度が高く老化し易く、難消化性の特徴を示す可能性が高いので、本発明の高アミロース米品種はダイエット米としても注目される。
【００３４】
上記に説明したように、本発明の高アミロース澱粉を有するジャポニカ米品種のイネ変異体は、高アミロース澱粉素材として食品添加物や工業素材における利用価値が高い。
本発明のイネ変異体は、イネやトウモロコシ等の穀類の登熟胚乳で最重要ＳＳであるＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性が著しく低下した系統であり、これらの詳細を解析することで、澱粉生合成における基礎的知見が豊富に発信できる上で重要な材料となる。
また、本イネ変異体の澱粉、即ち、本発明のイネ変異体系統によって生産される澱粉は、これまでに存在するイネ澱粉と比較して、類い希な高いアミロース含量を示し、アミロペクチン構造も野生型イネや両親系統イネと異なるユニークなものであり、独特の澱粉物性を示すことから、新規の構造・性質を有する澱粉として工業及び食品の各分野での利用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明はスターチシンターゼの主要なアイソザイムであるＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性を著しく低下させたイネ変異体系統から得られる新規の構造を有する澱粉及びその作成方法に関するものである。本発明のイネ変異体から得られた澱粉は、これまでのイネ澱粉には無かった高アミロースの性質をもち、アミロペクチンの構造もユニークで、新規の特性を有する。これらの米由来の高アミロース澱粉は、価格の高騰が懸念されるトウモロコシで用いられてきた澱粉産業の代替となりうる。また、難消化性を示すことが予想されることから、ダイエット米としての食品や添加物への利用、高アミロース澱粉が示すフィルム特性等から、工業用途にも用いられる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】スターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）変異体イネとスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体イネを交配した後代に得られた白濁種子の系譜及び遺伝子型を示す図である。また、両親の変異体イネ及びＲ系統とＡ系統の白濁種子を播種して得られたＦ３種子の形態も示す図である。
【図２】Ｒ系統及びＡ系統の遺伝子型を決定するＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。＃１−３は、各々異なる白濁種子から発芽させて得られた葉身から抽出したＤＮＡを示す。全ての個体で、予想通りのバンドパターンが得られた。
【図３】Ｒ系統白濁種子の次世代の登熟種子をランダムに採取し、それらから得られた可溶性画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色を示す図である。ＳＳ活性バンドを検出した結果、Ｒ系統から得られた種子は全てＳＳＩバンドを欠失しており、ＳＳＩＩＩａバンドは濃い種子と薄い種子が存在する。また、下図はこれらのＳＳ活性検出後に残った澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析を行い、ＳＳＩ変異体イネの種子、Ｒ系統の白濁種子、及びＲ系統の登熟種子のパターンと比較した図である。
【図４】Ａ系統白濁種子の次世代の登熟種子をランダムの採取し、それらから得られた可溶性画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色を示す図である。ＳＳ活性バンドを検出した結果、Ａ系統から得られた種子は全てＳＳＩＩＩａバンドを欠失しており、ＳＳＩバンドは濃い種子と薄い種子が存在した。また、下図はこれらのＳＳ活性検出後に残った澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析を行い、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ、Ａ系統の白濁種子、及びＡ系統の登熟種子のパターンと比較した図である。
【図５】Ｒ系統及びＡ系統の白濁種子並びに両親の変異体イネの胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンを野生型イネの分布パターンから引いた差分を示す図である。両白濁種子のパターンは、両親系統イネ及び野生型イネと比較しても異なるユニークなものであることが示される。
【図６】各系統の胚乳澱粉における示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による糊化開始温度（℃）、糊化ピーク温度（℃）、糊化終了温度（℃）、及び糊化熱量（ｍＪ／ｍｇ）を示す図である。
【図７】各系統の胚乳澱粉および精製アミロペクチンをゲル濾過した後、各フラクション（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．）の全糖量（％）をフェノール硫酸法で定量したものを示す図である。また、澱粉由来の各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘ（ｎｍ）も同時に示す。
【図８】各系統の胚乳澱粉および精製アミロペクチンをゲル濾過で分離したときの第１ピーク（Ｆｒ．Ｉ）、第２ピーク（Ｆｒ．ＩＩ）、第３ピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ）の各相対糖含量（％）、真のアミロース含量ＴＡＣ（％）、並びにＦｒ．ＩＩＩ／Ｆｒ．ＩＩを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号１：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−１Ｒ）
配列番号２：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−２Ｒ）
配列番号３：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−３Ｆ）
配列番号４：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−６Ｆ）
配列番号５：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−５Ｒ）
配列番号６：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−６Ｒ）
配列番号７：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−５Ｆ）
配列番号８：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−６Ｆ）
配列番号９：ＰＣＲプライマー（Ｔ１Ｆ）
配列番号１０：ＰＣＲプライマー（Ｔ２Ｆ）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高アミロース澱粉を含むジャポニカ米品種のイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法に関する。さらに、本発明は、該澱粉を利用する飲食品及び工業品に関する。
【背景技術】
【０００２】
高アミロース澱粉は、糊化しにくく、老化しやすいため、人間が食したときに、大腸まで消化されずに到達する難消化性澱粉（レジスタントスターチ、ＲＳ）と成り易く、大腸癌予防食品として最近注目されている。ＲＳは、食物繊維の一種であり、大腸環境の改善や免疫賦活作用等の生理機能をもつことが知られている。また、高アミロース澱粉は、その優れたフィルム特性等を利用した食品添加物や工業素材としても利用されている。
【０００３】
高アミロース澱粉を蓄積する日本稲（ジャポニカ米）としては、スターチシンターゼ（ＳＳ）のアイソザイムの一つであるＳＳＩＩＩａ型変異体イネがある（非特許文献１、特許文献１）。ＳＳＩＩＩａは、イネの登熟胚乳で働くＳＳ活性のうち、ＳＳＩに次ぐ第２番目の活性を示し、この酵素を完全に欠失した変異体では、結合型澱粉合成酵素（Ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ ｓｔａｒｃｈ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＧＢＳＳＩ）の発現が促進され、アミロース含量が増加する。そして、その見かけのアミロース含量は、正常なジャポニカ米の１．５倍である。
また、ジャポニカ米品種のモチ米に印度稲（インディカ米）由来のＧＢＳＳＩ遺伝子を形質転換することで、見かけのアミロース含量が４６．３％であるジャポニカ米が得られたという報告がある（非特許文献２）。しかし、このアミロース含量の数値は、測定方法によって大きく異なり、Ｈａｎａｓｈｉｒｏらの方法によると、これらの見かけのアミロース含量は２１．９−２２．２％である（非特許文献３）。なお、申請者らが非特許文献３と同様の手法で測定したＳＳＩＩＩａ変異体イネは、見かけのアミロース含量は２６．０％である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−０５１０２３号公報
【非特許文献１】N. Fujita他 Plant Physiol., 144: 2009-2023 (2007)
【非特許文献２】K. Itoh他 Plant Cell Physiol., 44: 473-480 (2003)
【非特許文献３】I. Hanashiro他 Plant Cell Physiol., 49: 925-933 (2008)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、高アミロース澱粉素材としては、米由来のものは存在せず、主にトウモロコシ由来が用いられてきた。さらに、ジャポニカ米において、インディカ米と同等レベルもしくはそれ以上のアミロース含量を含む澱粉を胚乳に生産する高アミロース米は存在しなかった。加えて、米由来の高アミロース澱粉を応用した飲食品、食品添加物及び工業品はこれまで製造販売されていなかった。
【０００６】
本発明は、斯かる課題に鑑みてなされたもので、上記課題を解決できる高アミロース澱粉を含むジャポニカ米品種のイネ変異体及びその製造方法、並びに該イネ変異体に由来する澱粉及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に記載のイネ変異体の製造方法は、イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネの交配後代から生じた白濁種子を選別したことを特徴とする。
また、請求項２に記載のイネ変異体の製造方法は、前記イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及び前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得たことを特徴とする。
また、請求項３に記載のイネ変異体は、請求項１又は２に記載のイネ変異体の製造方法から製造されたことを特徴とする。
また、請求項４に記載のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩ型及び／又はイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下したことを特徴とする。
また、請求項５に記載のイネ変異体は、イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の一方の遺伝子型は劣勢ホモであり、もう一方の遺伝子型はヘテロであることを特徴とする。
また、請求項６に記載のイネ変異体は、野生型イネ及び親系統イネと比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質に低下が見られないことを特徴とする。
また、請求項７に記載の澱粉の製造方法は、請求項３乃至６の何れかに記載のイネ変異体を用いたことを特徴とする。
また、請求項８に記載の澱粉の製造方法は、前記イネ変異体の胚乳を用いたことを特徴とする。
また、請求項９に記載の澱粉は、請求項７又は８に記載の澱粉の製造方法から製造されたことを特徴とする。
また、請求項１０に記載の澱粉は、イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性の低下に起因する野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉とは異なることを特徴とする。
また、請求項１１に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、真のアミロース含量が高いことを特徴とする。
また、請求項１２に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なることを特徴とする。
また、請求項１３に記載の澱粉は、野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉物性が異なることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、白濁種子という形質を指標として用いることによって、高アミロース澱粉を含むイネ変異体を簡易に選別することができる。さらに、バイオ燃料の需要過多から、輸入穀類澱粉価格が高騰している昨今、国産のジャポニカ米品種での代用が望まれるが、本発明の高アミロース澱粉を含むイネ変異体は、これまでトウモロコシにしか無かった高アミロースの性質を備えており、代用はもちろん、米食の我が国においては、さまざまな食品添加物や工業素材への利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明では、スターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体イネの胚乳澱粉よりも高アミロースである澱粉を得るため、本発明者らが既に得ているＳＳＩＩＩａ変異体イネ（特開２００６−０５１０２３号公報）にスターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）変異体イネ（N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)；特開２００３−０７９２６０号公報）を交配することで、それらの後代から高アミロース澱粉を蓄積する種子を選抜する。
以下、本発明の具体的態様、技術的範囲等について詳しく説明する。
【００１０】
本発明のイネ変異体は、ＳＳＩ変異体イネのうちＳＳＩを完全に欠失した系統（ｅ７−／−）とＳＳＩＩＩａ変異体イネのうちＳＳＩＩＩａを完全に欠失した系統（ｅ１−／−）を定法で交配したものであり、得られたＦ１種子の自殖種子（Ｆ２種子）を用いる。ここで、ＳＳＩ変異体イネ及びＳＳＩＩＩａ変異体イネは、当業者が用いることが可能な技術であれば、任意の方法を用いて作成することができる。好ましくは、ＳＳＩ遺伝子あるいはＳＳＩＩＩａ遺伝子にレトロトランスポゾンＴｏｓ１７を挿入して作成する。
Ｆ２種子は、親系統イネの種子の形態とは異なる白濁種子である。すなわち、野生型イネと同一の種子の形態を示すＳＳＩ変異体イネの種子、及び種子の中央部が濁る心白種子の形態を示すＳＳＩＩＩａ変異体イネの種子は選択から除外する（図１下部参照）。
さらに、この白濁種子を播種し、次世代の種子を得る。すると、白濁種子と正常種子が分離した系統と、白濁種子と心白種子が分離した系統が存在する（図１参照）。このことから、播種した白濁種子は、ＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩＩａ遺伝子に関して二重劣性ホモではなく、いずれかがヘテロであることが分かる。ここで、前者をＲ系統、後者をＡ系統と呼ぶ（図１参照）。
【００１１】
次に、Ｒ系統及びＡ系統の白濁種子を発芽させた後、葉身からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によってその遺伝子型を検出する。
すると、Ｒ系統白濁種子は、ＳＳＩ遺伝子座は劣性ホモであり、ＳＳＩＩＩａ遺伝子座はヘテロである。一方で、Ａ系統白濁種子は、Ｒ系統とは逆に、ＳＳＩ遺伝子座はヘテロであり、ＳＳＩＩＩａ遺伝子座は劣性ホモである（図２参照）。
【００１２】
次に、Ｒ系統白濁種子及びＡ系統白濁種子の次世代の登熟種子の可溶性抽出液のＳＳ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法で測定する。
すると、Ｒ系統白濁種子の次世代では、いずれの登熟種子でもＳＳＩ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩＩＩａ活性が強いものと弱いものが存在する（図３参照）。この可溶性画分を抽出して残った沈殿を用いてアミロペクチンの鎖長分布解析を行ったところ、ＳＳＩＩＩａ活性が強い種子は、いずれもＳＳＩ変異体イネの親系統イネと同一の鎖長分布パターンを示し、ＳＳＩＩＩａ活性が弱い種子は、いずれもＲ系統白濁種子と同一の鎖長分布パターンを示す（図３参照）。
また、Ａ系統白濁種子の次世代では、いずれの登熟種子でもＳＳＩＩＩａ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩ活性が強いものと弱いものが存在する（図４参照）。この可溶性画分を抽出して残った沈殿を用いてアミロペクチンの鎖長分布解析を行ったところ、ＳＳＩ活性が強い種子は、いずれもＳＳＩＩＩａ変異体イネの親系統イネと同一の鎖長分布パターンを示し、ＳＳＩ活性が弱い種子は、いずれもＡ系統白濁種子と同一の鎖長分布パターンを示す（図４参照）。
このように、本発明のイネ変異体は、ＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下しているものを含む。
【００１３】
以上のことから、ＳＳＩ変異体イネとＳＳＩＩＩａ変異体イネを交配した後代に得られる白濁種子には、Ｒ系統及びＡ系統の２種類の遺伝子型のものが存在し、それらは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって生じたＳＳＩ活性あるいはＳＳＩＩＩａ活性の低下を親から受け継ぐ。すなわち、ＳＳＩあるいはＳＳＩＩＩａの一方の遺伝子座が劣勢ホモとなり完全に欠失し、もう一方の遺伝子座がヘテロになることでＳＳ活性が激減して、種子が白濁するという特徴を有する。このＳＳ活性の低下は、好ましくはＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下することが望ましい。また、両酵素の活性が低下、即ち、二重劣勢ホモになると種子が稔実しない。
なお、これらのイネ変異体イネの系統はいずれかの遺伝子座がヘテロであることから、次世代は再び異なる形態の種子が分離する（図１のＦ３種子参照）。したがって、白濁という明確な指標で、以下に述べるユニークな澱粉構造をもったイネ変異体を容易に選抜することが可能である。
【００１４】
次に、本発明のイネ変異体の澱粉について説明する。
一般に、澱粉とは、少なくとも緑藻より高等な植物が主として貯蔵組織に蓄積する不溶性のαグルカンである。イネ、トウモロコシ等の穀類や芋類、豆類が蓄積する貯蔵澱粉は、α１，４グルコシド結合からなる直鎖構造とα１，６グルコシド結合からなる枝分かれ構造とのグルコースホモポリマーである。通常の貯蔵澱粉は、ほとんどが直鎖成分からなるアミロースと枝分かれ成分を含むアミロペクチンからなり、後者は前者より多く、通常は７０−８０％を占める（澱粉科学の事典（不破英次他），３〜３８頁，朝倉書店（２００３））。
澱粉合成に関与する酵素には、ＡＤＰグルコースを基質としてα１，４グルコシド結合を伸長するスターチシンターゼ（ＳＳ）、α１，６グルコシド結合を作る枝作り酵素（ＢＥ）、ＡＤＰグルコースを生産するＡＤＰグルコースピロフォスフォリラーゼ（ＡＧＰａｓｅ）、余分な枝を払う枝切り酵素（ＤＢＥ）の４種類が考えられている。イネ等の高等植物には、これらの酵素に複数のアイソザイムが存在し、これらは異なる遺伝子にコードされている。これらのアイソザイム遺伝子が欠失あるいは損傷すると、変異体となり、すべての遺伝子が正常な野生型イネとは異なる澱粉構造を示すことが知られている（Y. Nakamura Plant Cell Physiol. 43: 718-725 (2002)）。
【００１５】
ここで、本発明のイネ変異体の澱粉は、以下の特徴を有する。
（１）本発明のＲ系統白濁種子とＡ系統白濁種子のアミロペクチンの鎖長分布を測定したところ、野生型イネ及び両親系統イネとは異なるユニークなパターンを示す（図５参照）。
（２）本発明のＲ系統及びＡ系統白濁種子は、野生型イネの種子重量のそれぞれ８７．７％及び８３．６％を維持する。好ましくは、野生型イネ及び両親系統イネの種子重量の８割以上を有することが望ましい。また、生育、開花日等も野生型イネと変わらず、農業形質の低下がみられない。これらの性質は、育種素材として利用する場合のメリットとなる。
（３）Ｒ系統及びＡ系統白濁種子澱粉の糊化温度は、アミロペクチンの鎖長分布の変化に伴い高くなる。特に、Ｒ系統白濁種子の糊化開始温度は、野生型イネの種子に比べて約６℃高いという澱粉物性を有する（図６参照）。このように、糊化温度が高い澱粉は、低温糊化させると、未糊化澱粉が残存し、老化しやすく、難消化性澱粉と成りやすい。
（４）Ｒ系統及びＡ系統白濁種子澱粉の見かけのアミロース含量は、それぞれ、２８．６％及び３２．５％であり、真のアミロース含量は、それぞれ、２５．３％及び２９．４％である。特にＡ系統白濁種子は、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ（見かけのアミロース含量が３０．２％，真のアミロース含量が２６．９％）より高い値を示す（図７及び図８参照）。好ましくは、野生型イネ及び両親系統イネを用いて製造される澱粉よりも真のアミロース含量が高いことが望ましい。
なお、本明細書中に記載の見かけのアミロース含量とは、澱粉のイソアミラーゼ分解物をゲル濾過したときに、最も分子量が大きいため、最初に検出されるフラクションの含量であり、アミロペクチンの超長鎖をも含む値である。これに対して、真のアミロース含量とは、見かけのアミロース含量からアミロペクチンの超長鎖を引いた値である（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci. 51: 303-313 (2004)）。
【実施例】
【００１６】
以下、図を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
【００１７】
（実施例１：白濁種子の遺伝子型決定）
本発明の白濁種子の親系統イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７をＳＳＩ遺伝子あるいはＳＳＩＩＩａ遺伝子に挿入することで、ＳＳＩ活性あるいはＳＳＩＩＩａ活性が低下している系統である。これらの遺伝子型が劣性ホモかヘテロかを確認するには、それぞれの遺伝子上にＴｏｓ１７が挿入されているか否かをネステッドＰＣＲ法によって確認すればよい。
ＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７が挿入されていることを確認するＰＣＲ（挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、Ｔ１Ｆ（配列表の配列番号９）とＳＳＩ−１Ｒ（配列表の配列番号１）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＴ２Ｆ（配列表の配列番号１０）とＳＳＩ−２Ｒ（配列表の配列番号２）を用いた。また、Ｔｏｓ１７が挿入されていないことを確認するＰＣＲ（非挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、ＳＳＩ−３Ｆ（配列表の配列番号３）とＳＳＩ−１Ｒ（配列表の配列番号１）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＳＳＩ−６Ｆ（配列表の配列番号４）とＳＳＩ−２Ｒ（配列表の配列番号２）を用いた。
そして、ネステッドＰＣＲを行うと、挿入ＰＣＲで２９２０ｂ．ｐ．、非挿入ＰＣＲで３１７０ｂ．ｐ．のバンドが得られた。ＳＳＩ遺伝子にＴｏｓ１７がホモで挿入されていれば、挿入ＰＣＲでのみバンドが検出され、ヘテロであれば、挿入及び非挿入ＰＣＲの両方にバンドが検出されるが、いずれも予想通りのバンドパターンが得られた（図２上段参照）。
【００１８】
同様に、ＳＳＩＩＩａ遺伝子にＴｏｓ１７が挿入されていることを確認するＰＣＲ（挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、Ｔ１Ｆ（配列表の配列番号９）とＳＳＩＩＩａ−５Ｒ（配列表の配列番号５）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＴ２Ｆ（配列表の配列番号１０）とＳＳＩＩＩａ−６Ｒ（配列表の配列番号６）を用いた。また、Ｔｏｓ１７が挿入されていないことを確認するＰＣＲ（非挿入ＰＣＲ）は、ファーストＰＣＲのプライマーとして、ＳＳＩＩＩａ−５Ｆ（配列表の配列番号７）とＳＳＩＩＩａ−５Ｒ（配列表の配列番号５）を、セカンドＰＣＲのプライマーとしてＳＳＩＩＩａ−６Ｆ（配列表の配列番号８）とＳＳＩＩＩａ−６Ｒ（配列表の配列番号６）を用いた。
そして、ネステッドＰＣＲを行うと、挿入ＰＣＲで３０２０ｂ．ｐ．、非挿入ＰＣＲ後者で４８７０ｂ．ｐ．のバンドが得られた。ＳＳＩＩＩａ遺伝子にＴｏｓ１７がホモで挿入されていれば、挿入ＰＣＲでのみバンドが検出され、ヘテロであれば、挿入及び非挿入ＰＣＲの両方にバンドが検出されるが、いずれも予想通りのバンドパターンが得られた（図２下段参照）。
【００１９】
（実施例２：白濁種子の次世代の登熟種子から得た可溶性画分のＳＳ活性検出法）
白濁種子の次世代の登熟種子から得た可溶性画分のＳＳＩ活性及びＳＳＩＩＩａ活性をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色法（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて検討した。具体的には、N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)に記載の方法に従って行った。
【００２０】
開花後１０〜１５日くらいの登熟種子１粒のもみ、胚、果皮を除去し、３倍体積の抽出バッファー［５０ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌ（ｐＨ７．４），１２．５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ，８ｍＭの塩化マグネシウム，５００ｍＭの２−メルカプトエタノール］を加え、マイクロチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心分離して得た上清にＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［０．３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），０．１％のブロモフェノールブルー，５０％のグリセロール］を１／２体積加えて電気泳動に用いた。電気泳動にはグルコシルトランスフェラーゼ反応に必要なプライマーとしてカキグリコーゲンを６０℃で溶かし込んだ７．５％のアクリルアミドゲルを用いた。フロントが濃縮ゲルを通過するまで７．５ｍＡ、通過してから１５ｍＡの定常電流で４℃下で電気泳動し、フロントが出てから６０分で電流を止めた。その後、基質であるＡＤＰグルコースを除いた反応液［クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５），０．５ＭのＣｉｔｒａｔｅ−Ｎａ，１００ｍＭのＢｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５），０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のＧｌｙｃｅｒｏｌ、２ｍＭのジチオスレイトール，１ｍＭのＡＤＰグルコース］で２回洗浄し（各１５分）、ＡＤＰＧを加えて２０時間、３０℃でシーソーで反応させた。反応後、ヨード・ヨードカリ液（１％のＫＩ／０．１％のＩ２）で染色した。
【００２１】
図３及び図４に上記の結果を示す。イネの野生型（日本晴）の登熟種子をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色した場合、ＳＳアイソザイムはゲル中にポリグルカンを伸長するため、ヨード・ヨードカリ液で染色すると茶色のバンドを生じた。移動度の遅いバンドがＳＳＩＩＩａであり、これよりも移動度の早いバンドがＳＳＩである。野生型イネである日本晴（日）では両ＳＳのバンドが検出されるが、両親の変異体イネ（ΔＳＳＩ及びΔＳＳＩＩＩａ）ではいずれかの活性が欠失していた。それに対して、Ｒ系統白濁種子の次世代の登熟種子では、いずれもＳＳＩ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩＩＩａ活性が強いものと弱いものが存在した（図３＃１〜１３）。また、Ａ系統白濁種子の登熟種子では、いずれもＳＳＩＩＩａ活性バンドが欠失するが、ＳＳＩ活性が強いものと弱いものが存在した（図４＃１〜１４）。したがって、実施の形態でも述べたように、本発明のイネ変異体には、ＳＳＩ及び／又はＳＳＩＩＩａの活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下したものを含むことが示された。
【００２２】
［実施例３：胚乳アミロペクチンの鎖長分布解析］
胚乳澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析は、オセアとモレルの方法（O’Shea and Morell, Electrophoresis, 17, 681-688 (1996)）を参考に以下のように行った。
【００２３】
試料は、完熟種子１粒から外内穎及び胚を取り除き、ペンチで胚乳を粉砕した後、エッペンドルフチューブ内でプラスチック製ホモジナイザー（グライナー社製）を用いてさらに磨砕した粉末あるいは、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色に用いた上清を採取した後に残った沈殿を蒸留水とアセトンで洗浄したものを用いた。各々に５ｍｌのメタノールを加え、１０分間煮沸した。次に、２、５００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去し、９０％のメタノールを５ｍｌ加え２度洗浄した。さらに、沈殿に５Ｎの水酸化ナトリウムを１５μｌ加え、５分間煮沸して澱粉を糊化させた。その糊化液を氷酢酸９．６μｌで中和した後、蒸留水を１０８９μｌ、０．６Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）を１００μｌ、２％のアジ化ナトリウムを１５μｌ、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８，林原生物化学研究所）を２μｌ（約２１０ｕｎｉｔ）加え、スターラーバーで撹拌しながら３７℃で８時間以上反応した。さらに、イソアミラーゼを２μｌ追加して８時間以上反応した後、常温で１０，０００ｘｇで遠心分離し、上清を脱イオンカラム（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で濾過した。次に、α−グルカン鎖の非還元末端を蛍光標識するため、Ｈｉｚｕｋｕｒｉら（Carbohydrate Research, 94, 205-213 (1981)）の方法により試料中の糖含量を定量し５ｎｍｏｌ相当の還元末端をもつα−グルカン鎖を遠心濃縮機で乾燥させ、１−アミノピレン−３，６，８−三硫酸塩（ＡＰＴＳ）溶液［２．５％のＡＰＴＳ、１５％の酢酸］を２μｌ、シアン化ホウ素ナトリウム溶液［１Ｍのシアン化ホウ素ナトリウム、１００％のテトラヒドロフラン］を２μｌ添加し、５５℃で９０分間反応させた。分析時には１２．５倍に蒸留水で希釈して用いた。鎖長分布解析は、キャピラリー電気泳動装置（Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒｓ）を用いて行った。グルコース重合度（ＤＰ）３以上の各ピーク面積を数値化し、ＤＰ６０までのピーク面積の合計を１００％としたときの各ＤＰの割合（Ｍｏｌａｒ ％）を算出した。また、各変異体イネから野生型イネのパターンを引いた差分（ΔＭｏｌａｒ ％）のグラフを作成した（図３、図４及び図５参照）。これより、Ｒ系統白濁種子とＡ系統白濁種子のアミロペクチンの鎖長分布は、野生型イネ及び両親系統イネとは異なるユニークなパターンであることが示された。
【００２４】
（実施例４：胚乳澱粉の熱糊化特性）
イネ変異体系統における胚乳澱粉の熱糊化特性を、Fujita et al. Plant Cell Physiol. 44: 607-618 (2003)に記載の方法に従って、以下のように調べた。
【００２５】
完熟種子のもみ、胚を除去し、乳鉢で粉砕したものを１０５℃で２時間乾燥させた。乾燥させた粉末約３ｍｇに蒸留水９μｌを加えたものをアルミ容器に入れて示差走査熱量測定（ＤＳＣ，セイコーインスツルメンツ社製）に用いた。昇温速度は３℃／分で５〜１００℃を測定した。そして、測定器付属の計算ソフトで、糊化開始温度、糊化ピーク温度、糊化終了温度、糊化熱量を算出した。
図６に野生型（日本晴）、ＳＳＩ変異体、ＳＳＩＩＩａ変異体、Ｒ系統、Ａ系統における澱粉特性の一覧を示す。各系統において、種子の澱粉特性が異なっていた。
特に、Ｒ系統白濁種子の糊化開始温度は５８．０±０．２℃であって、野生型イネ（日本晴）種子の５２．４±０．１℃と比べて約５．６℃上昇した。また、澱粉の糊化ピーク温度は、Ｒ系統白濁種子は６４．６±０．１℃及びＡ系統白濁種子は６１．９±０．１℃であって、日本晴種子の５８．２±０．１℃と比べてそれぞれ約６．４℃及び約３．７℃上昇した。また、澱粉の糊化終了温度は、Ｒ系統白濁種子は６９．９±０．２℃及びＡ系統白濁種子は６７．８±０．２℃であって、日本晴種子の６３．３±０．３℃と比べて各々約６．６℃及び約４．５℃上昇した。このように、糊化温度が高い澱粉物性を示すＲ系統及びＡ系統白濁種子の澱粉は、低温糊化させると未糊化澱粉が残存し老化しやすいため、難消化性澱粉に成りやすいことが示された。
【００２６】
（実施例５：枝切りした澱粉のゲル濾過クロマトグラフィー）
澱粉のα−１，６結合をイソアミラーゼで完全に切断し、α−１，４鎖のみにした後、ゲル濾過によって分離することで、澱粉中の見かけのアミロース含量を求めることができる。また、澱粉からアミロペクチンを精製し、同様にゲル濾過を行えば、真のアミロース含量を求めることができる。すなわち、澱粉のゲル濾過によって検出される高分子量のピークには真のアミロース含量とアミロペクチンに接続された非常に長い直鎖（Ｅｘｔｒａ ｌｏｎｇ ｃｈａｉｎ， ＥＬＣ）の両方が検出され、精製したアミロペクチンからは、高分子量のピークにはＥＬＣのみが検出されるため、真のアミロース含量は見かけのアミロース含量からＥＬＣ含量を引くことで求めることができる（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci. 51: 303-313 (2004)）。
これらの方法を用いて、本発明のＲ系統及びＡ系統の白濁種子、並びに野生型イネ（日本晴）種子、ＳＳＩ変異体イネ種子、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ種子の胚乳澱粉の真のアミロース含量及びＥＬＣ含量を求めた。方法の詳細を以下に示す。
【００２７】
（実施例５．１：澱粉の精製法）
澱粉の精製は、冷アルカリ浸せき法（Yamamoto他, Denpun Kagaku 28: 241-244 (1981)）を用いた。１０ｇの玄米を８０％まで精米し、０．１％のＮａＯＨを２００ｍｌ加えて一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、乳鉢ですりつぶし、１５０μｍのメッシュに通して、３，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。沈殿に０．１％のＮａＯＨを６００ｍｌ加えて氷中で３時間振とうし、一晩４℃で放置した。翌日、上清を捨て、蒸留水でけん濁し、１Ｎの酢酸で中和した。さらに、蒸留水で５回洗浄し、乾燥させ、乳鉢で粉体にした。
【００２８】
（実施例５．２：アミロペクチンの精製法）
アミロペクチンの精製は、Takeda et al. Carbohydr. Res. 148: 299-308 (1986)に記載の方法に基づいて行った。まず、精製した澱粉１ｇにＤＭＳＯを１００ｍｌ加え、８０〜８５℃で窒素気流下で静かに撹拌しながら澱粉を３時間溶解させた。次に、６０℃まで冷却後、エタノール５００ｍｌを加え、５℃で一晩放置し、２，０００ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。沈殿に再びＤＭＳＯを１００ｍｌ加え、８０〜８５℃で窒素気流下で静かに撹拌しながら澱粉を３時間溶解させた。次に、６０℃まで冷却後、エタノール５００ｍｌを加え、５℃で一晩放置し、２，０００ｇ、５℃で１５分間遠心分離した。次に、得られた沈殿に６０℃の蒸留水１７０ｍｌを加えて７８〜８０℃に温め、窒素気流下で溶解させた。溶解後、８０〜８５℃に保温し、ｎ−ブタノールとイソアミルアルコールをそれぞれ１０ｍｌずつ加え、３時間静かに撹拌した。そして、６０℃まで冷却後、緩やかに冷却しながら一晩放置し、さらに二晩５℃で放置した。そして、８，５００ｇ、５℃で２０分遠心分離し、上清をロータリーエバポレーターで８倍に濃縮し、３倍量のメタノールを加えて５℃で一晩放置した。加えて、８，５００ｇ、５℃で２０分遠心分離し、沈殿にエタノール、アセトン、ジエチルエーテルを順次加えて２，０００ｇ、５℃で１０分間の遠心分離を行い、減圧乾燥して、粉末アミロペクチンを得た。
【００２９】
（実施例５．３：澱粉及び精製アミロペクチンの枝切り及びゲル濾過）
精製した澱粉あるいはアミロペクチン２２．５ｍｇに蒸留水０．２５ｍｌ加えて混合し、２ＮのＮａＯＨを０．２５ｍｌ加えて３７℃で２時間糊化させた。これに蒸留水３．２６ｍｌを加え、５ＮのＨＣｌを９０μｌ加えて中和させた。次に、１００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）を５ｍｌ加え、Ｐ．ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａイソアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８，林原生物化学研究所）を１２．５μｌ（約８７５ｕｎｉｔ）加え、４０℃で２４時間揺らしながら反応させた。そして、エタノールを５ｍｌ加え、ロータリーエバポレーターで乾固させた。これに蒸留水を０．４ｍｌ及び２ＮのＮａＯＨを０．４ｍｌ加えて、５℃で３０分間糊化させ、５μｍのフィルターで濾過した後、ろ液をゲル濾過カラムにアプライした。
【００３０】
使用したカラムは、ＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）１本にＴＳＫｇｅｌ ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５０Ｓ（３００ｘ２０ｍｍ）３本（両カラムともＴＯＳＯＨ社製）を直列に接続したものであり、溶離液は０．２％のＮａＣｌ／０．０５ＮのＮａＯＨを用いた。試験管１本あたり３ｍｌずつ分取し、６８本に分画した。各フラクションの糖量をフェノール硫酸法で測定した。
図７にゲル濾過の結果を示す。野生型（日本晴）、ＳＳＩ変異体、ＳＳＩＩＩａ変異体、Ｒ系統白濁種子、Ａ系統白濁種子における各フラクションの胚乳澱粉及び精製アミロペクチンの全糖量（％）、並びに澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘ（ｎｍ）を求めた。
図８に図７で求めた値から計算した結果を示す。各系統の胚乳澱粉（ｓｔａｒｃｈ）及び精製アミロペクチン（ａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）の第１ピーク（Ｆｒ．Ｉ）、第２ピーク（Ｆｒ．ＩＩ）、第３ピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ）の各相対糖含量（％）、真のアミロース含量ＴＡＣ（％）、並びにＦｒ．ＩＩＩ／Ｆｒ．ＩＩを求めた。
これより、第１ピークにおける胚乳澱粉から精製アミロペクチンの量を引いた値である真のアミロース含量は、Ｒ系統白濁種子は２５．３％及びＡ系統白濁種子は２９．４％であって、日本晴種子の１７．９％と比べて大きく上昇していた。また、Ｒ系統及びＡ系統白濁種子共にＳＳＩ変異体種子の１９．７％と比べて高くなっていた。さらに、Ａ系統白濁種子は、ＳＳＩＩＩａ変異体種子の２６．９％と比べても高くなっていた。
【００３１】
このように、Ｒ系統白濁種子は親系統であるＳＳＩＩＩａ変異体の澱粉よりわずかに低いか同等の見かけのアミロース含量を示し、Ａ系統白濁種子は親系統であるＳＳＩＩＩａ変異体の澱粉より見かけのアミロース含量が高かった。以上のことから、野生型イネや既に報告されている組換体イネより、本発明のイネ変異体の方が澱粉の見かけのアミロース含量は高いといえる。
なお、日本人が米飯として食している米は日本稲（ジャポニカ米）であり、ジャポニカ米澱粉の見かけのアミロース含量は１６−２２％程度である。これに対し、東南アジア、インド等で食されている印度稲（インディカ米）は、ジャポニカ米に比べてパサパサとした食感を示し、見かけのアミロース含量は２３−２８％程度である（T. Horibata他 J. Appl. Glycosci., 51: 303-313 (2004)）。これは、ＳＳアイソザイムのうち、アミロース合成に関与するＧＢＳＳＩがインディカ米では正常であるのに対し、ジャポニカ米はＧＢＳＳＩ遺伝子の変異によってその発現が低下しているため、そのアミロース含量がインディカ米に比べて低下するからである（M. Isshiki他 Plant J., 15: 133-138 (1998)）。
一般に、日本人にはアミロース含量の低いモチモチとした食感の米を好んで食す長年の習慣があり、最近はこれら通常のジャポニカ米より低アミロースである米が良食味米として全国の農業試験場で開発されている。したがって、本発明のジャポニカ米品種を用いた高アミロース含量の澱粉は、日本人にとって受け入れ易いと考えられる。
【００３２】
また、ジャポニカ米澱粉のもう一つの特徴は、糊化開始温度がインディカ米より低いことである。これは、ＳＳアイソザイムのうち、アミロペクチン合成に関与するスターチシンターゼＩＩａ型（ＳＳＩＩａ）がインディカ米では正常であるのに対し、ジャポニカ米はＳＳＩＩａ遺伝子の変異によってその活性が低下しているため、そのアミロペクチンの鎖長が完全に伸びきらず糊化温度の低下が生じるためである（Y. Nakamura他 Plant Mol. Biol., 58: 213-227 (2005)）。ＧＢＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩａ遺伝子は、イネの染色体６番の比較的近接した位置に座乗しているため、多くのインディカ米品種はＧＢＳＳＩ及びＳＳＩＩａが正常で、多くのジャポニカ米品種は両酵素が変異している（Y. Nakamura他 Starch, 54: 117-131 (2002)）。
このように、ジャポニカ米澱粉及びインディカ米澱粉の特徴は、主としてこれらのＧＢＳＳＩ遺伝子とＳＳＩＩａ遺伝子の両遺伝子によって特徴づけられることが解明されているが、本発明のＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性が著しく低下したイネ変異体は、別のＳＳアイソザイムであり、アミロース合成に働くＧＢＳＳＩ遺伝子の発現を著しく促進させ、ＧＢＳＳＩタンパク質が増加するため、高アミロースになると予想される。
また、イネのスターチシンターゼアイソザイムは１０種類も存在し、それぞれに組織、生育時期特異性や、対象とするαグルカンの種類が異なること、また、伸長するαグルカンの長さも異なる等によって役割分担されている（N. Fujita他 Plant Physiology 140: 1070-1084 (2006)）が、多くの場合は、特定のアイソザイムの活性が低下しても、他のアイソザイムの相補作用によって、グルカン量は大きくは減少しない。一方、相補によって強発現したアイソザイムの役割分担が異なることから、澱粉の成分や構造が野生型イネとは大きく変化すると解される。本発明は、まさに、この生物学的性質を狙ったものである。
【００３３】
なお、これまでに高アミロース澱粉としては、トウモロコシ由来のアミロメイズ（ハイロン５０、ハイロン７０）が利用されている。アミロメイズは、ａｍｙｌｏｓｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｒ（ａｅ）変異体で、枝作り酵素ＩＩｂ型の変異体であると考えられているが、その学術的情報が公開されていないため、詳細は不明である。アミロメイズを湿熱処理したＲＳ（日食ロードスター、日本食品化工（株）製、アミロジェルＨＢ−４５０、三和澱粉工業（株）製）が販売されている。また、トウモロコシのａｅ変異体の見かけのアミロース含量は６５．２％である（CD Boyer他 Starch 12: 405-436 (1976)）。
これに対し、イネのａｅ変異体は、野生型イネに比べて特に高アミロースにはならないことが知られている（A. Nishi他 Plant Physiol., 127: 459-472 (2001)）。ただし、アミロペクチンの平均鎖長が非常に長いため、イネのａｅ変異体の胚乳澱粉は難糊化性を示す。そして、トウモロコシのように見かけのアミロース含量が５０％を超えるイネは、現在のところ存在しない。これまで、さまざまな米品種の中で、最も高いものでも見かけのアミロース含量が３０％程度であり、これらはいずれもインディカ米である（N. Inouchi他 J. Appl. Glycosci. 52: 239-246 (2005)）。
このように、これまで高アミロース澱粉素材としては、米由来のものは存在せず、トウモロコシ由来のものが用いられてきたが、近年、価格が高騰しているトウモロコシの代替として、さらには米食を習慣とする日本人にとって、高アミロース米が受け入れられる可能性は高い。特に、本発明の高アミロース澱粉は、糊化温度が高く老化し易く、難消化性の特徴を示す可能性が高いので、本発明の高アミロース米品種はダイエット米としても注目される。
【００３４】
上記に説明したように、本発明の高アミロース澱粉を有するジャポニカ米品種のイネ変異体は、高アミロース澱粉素材として食品添加物や工業素材における利用価値が高い。
本発明のイネ変異体は、イネやトウモロコシ等の穀類の登熟胚乳で最重要ＳＳであるＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性が著しく低下した系統であり、これらの詳細を解析することで、澱粉生合成における基礎的知見が豊富に発信できる上で重要な材料となる。
また、本イネ変異体の澱粉、即ち、本発明のイネ変異体系統によって生産される澱粉は、これまでに存在するイネ澱粉と比較して、類い希な高いアミロース含量を示し、アミロペクチン構造も野生型イネや両親系統イネと異なるユニークなものであり、独特の澱粉物性を示すことから、新規の構造・性質を有する澱粉として工業及び食品の各分野での利用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明はスターチシンターゼの主要なアイソザイムであるＳＳＩとＳＳＩＩＩａの活性を著しく低下させたイネ変異体系統から得られる新規の構造を有する澱粉及びその作成方法に関するものである。本発明のイネ変異体から得られた澱粉は、これまでのイネ澱粉には無かった高アミロースの性質をもち、アミロペクチンの構造もユニークで、新規の特性を有する。これらの米由来の高アミロース澱粉は、価格の高騰が懸念されるトウモロコシで用いられてきた澱粉産業の代替となりうる。また、難消化性を示すことが予想されることから、ダイエット米としての食品や添加物への利用、高アミロース澱粉が示すフィルム特性等から、工業用途にも用いられる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】スターチシンターゼＩ型（ＳＳＩ）変異体イネとスターチシンターゼＩＩＩａ型（ＳＳＩＩＩａ）変異体イネを交配した後代に得られた白濁種子の系譜及び遺伝子型を示す図である。また、両親の変異体イネ及びＲ系統とＡ系統の白濁種子を播種して得られたＦ３種子の形態も示す図である。
【図２】Ｒ系統及びＡ系統の遺伝子型を決定するＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動像を示す図である。＃１−３は、各々異なる白濁種子から発芽させて得られた葉身から抽出したＤＮＡを示す。全ての個体で、予想通りのバンドパターンが得られた。
【図３】Ｒ系統白濁種子の次世代の登熟種子をランダムに採取し、それらから得られた可溶性画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色を示す図である。ＳＳ活性バンドを検出した結果、Ｒ系統から得られた種子は全てＳＳＩバンドを欠失しており、ＳＳＩＩＩａバンドは濃い種子と薄い種子が存在する。また、下図はこれらのＳＳ活性検出後に残った澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析を行い、ＳＳＩ変異体イネの種子、Ｒ系統の白濁種子、及びＲ系統の登熟種子のパターンと比較した図である。
【図４】Ａ系統白濁種子の次世代の登熟種子をランダムの採取し、それらから得られた可溶性画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ／ＳＳ活性染色を示す図である。ＳＳ活性バンドを検出した結果、Ａ系統から得られた種子は全てＳＳＩＩＩａバンドを欠失しており、ＳＳＩバンドは濃い種子と薄い種子が存在した。また、下図はこれらのＳＳ活性検出後に残った澱粉のアミロペクチンの鎖長分布解析を行い、ＳＳＩＩＩａ変異体イネ、Ａ系統の白濁種子、及びＡ系統の登熟種子のパターンと比較した図である。
【図５】Ｒ系統及びＡ系統の白濁種子並びに両親の変異体イネの胚乳アミロペクチンの鎖長分布パターンを野生型イネの分布パターンから引いた差分を示す図である。両白濁種子のパターンは、両親系統イネ及び野生型イネと比較しても異なるユニークなものであることが示される。
【図６】各系統の胚乳澱粉における示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による糊化開始温度（℃）、糊化ピーク温度（℃）、糊化終了温度（℃）、及び糊化熱量（ｍＪ／ｍｇ）を示す図である。
【図７】各系統の胚乳澱粉および精製アミロペクチンをゲル濾過した後、各フラクション（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｎｏ．）の全糖量（％）をフェノール硫酸法で定量したものを示す図である。また、澱粉由来の各フラクションの澱粉ヨウ素複合体のλｍａｘ（ｎｍ）も同時に示す。
【図８】各系統の胚乳澱粉および精製アミロペクチンをゲル濾過で分離したときの第１ピーク（Ｆｒ．Ｉ）、第２ピーク（Ｆｒ．ＩＩ）、第３ピーク（Ｆｒ．ＩＩＩ）の各相対糖含量（％）、真のアミロース含量ＴＡＣ（％）、並びにＦｒ．ＩＩＩ／Ｆｒ．ＩＩを示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００３７】
配列番号１：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−１Ｒ）
配列番号２：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−２Ｒ）
配列番号３：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−３Ｆ）
配列番号４：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩ−６Ｆ）
配列番号５：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−５Ｒ）
配列番号６：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−６Ｒ）
配列番号７：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−５Ｆ）
配列番号８：ＰＣＲプライマー（ＳＳＩＩＩａ−６Ｆ）
配列番号９：ＰＣＲプライマー（Ｔ１Ｆ）
配列番号１０：ＰＣＲプライマー（Ｔ２Ｆ）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネの交配後代から生じた白濁種子を選別したイネ変異体の製造方法。
【請求項２】
前記イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及び前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得た請求項１に記載のイネ変異体の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のイネ変異体の製造方法から製造されたイネ変異体。
【請求項４】
イネスターチシンターゼＩ型及び／又はイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下した請求項３に記載のイネ変異体。
【請求項５】
イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の一方の遺伝子型は劣勢ホモであり、もう一方の遺伝子型はヘテロである請求項３又は４に記載のイネ変異体。
【請求項６】
野生型イネ及び親系統イネと比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質に低下が見られない請求項３乃至５の何れかに記載のイネ変異体。
【請求項７】
請求項３乃至６の何れかに記載のイネ変異体を用いた澱粉の製造方法。
【請求項８】
前記イネ変異体の胚乳を用いた請求項７に記載の澱粉の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の澱粉の製造方法から製造された澱粉。
【請求項１０】
イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性の低下に起因する野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉とは異なる請求項９に記載の澱粉。
【請求項１１】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、真のアミロース含量が高い請求項９又は１０に記載の澱粉。
【請求項１２】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なる請求項９乃至１１の何れかに記載の澱粉。
【請求項１３】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉物性が異なる請求項９乃至１２の何れかに記載の澱粉。
【請求項１】
イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネの交配後代から生じた白濁種子を選別したイネ変異体の製造方法。
【請求項２】
前記イネスターチシンターゼＩ型変異体イネ及び前記イネスターチシンターゼＩＩＩａ型変異体イネは、レトロトランスポゾンＴｏｓ１７の挿入によって得た請求項１に記載のイネ変異体の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のイネ変異体の製造方法から製造されたイネ変異体。
【請求項４】
イネスターチシンターゼＩ型及び／又はイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性が野生型イネおよび親系統イネと比べて低下した請求項３に記載のイネ変異体。
【請求項５】
イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の一方の遺伝子型は劣勢ホモであり、もう一方の遺伝子型はヘテロである請求項３又は４に記載のイネ変異体。
【請求項６】
野生型イネ及び親系統イネと比べて、種子重量が８割以上維持され、農業形質に低下が見られない請求項３乃至５の何れかに記載のイネ変異体。
【請求項７】
請求項３乃至６の何れかに記載のイネ変異体を用いた澱粉の製造方法。
【請求項８】
前記イネ変異体の胚乳を用いた請求項７に記載の澱粉の製造方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の澱粉の製造方法から製造された澱粉。
【請求項１０】
イネスターチシンターゼＩ型及びイネスターチシンターゼＩＩＩａ型の活性の低下に起因する野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉とは異なる請求項９に記載の澱粉。
【請求項１１】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、真のアミロース含量が高い請求項９又は１０に記載の澱粉。
【請求項１２】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、アミロペクチンの鎖長分布が異なる請求項９乃至１１の何れかに記載の澱粉。
【請求項１３】
野生型イネや親系統イネを用いて製造される澱粉と比べて、澱粉物性が異なる請求項９乃至１２の何れかに記載の澱粉。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−６３４０１（Ｐ２０１０−６３４０１Ａ）
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２３２２９８（Ｐ２００８−２３２２９８）
【出願日】平成２０年９月１０日（２００８．９．１０）
【出願人】（３０６０２４１４８）公立大学法人秋田県立大学 (74)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月１０日（２００８．９．１０）
【出願人】（３０６０２４１４８）公立大学法人秋田県立大学 (74)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]