インスリン様成長因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）による喘息のマウスモデルにおける気道反応性亢進および炎症の阻止
呼吸器の炎症および反応性亢進におけるＩＧＦＢＰ−３の生理学的役割は、現在は不明である。本発明は、野生型ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−３変異体であるＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３の両方が、気管支喘息のような閉塞性呼吸器障害に関連した組織の炎症および反応性亢進を抑制するという予想外の知見に基づいている。組換えＩＧＦＢＰ−３もしくはＩＧＦＢＰ−３変異体、またはＩＧＦＢＰ−３もしくはＩＧＦＢＰ−３変異体をコードするベクターを投与することによって、喘息を含めて、閉塞性呼吸器障害および気道反応性亢進に関連した様々な状態を治療する方法が、本明細書において提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／６５２，０２３号明細書および２００５年７月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／６９８，７３１号明細書に対して優先権を主張し、これらの両方とも、図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、呼吸器疾患の分野に関する。より具体的には、本発明は、気道の閉塞および／または炎症に関連した状態、ならびに気道反応性亢進に関連した状態の治療、予防、および診断に関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）系は、体細胞の増殖においてだけでなく、癌、糖尿病、および栄養失調などの疾患においても重要な役割を果たしている（Rosenfeld １９８６；Rotwein １９９１）。ＩＧＦ系は、ＩＧＦリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ−ＩおよびＩＧＦＲ−ＩＩ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６）、ならびに一連のＩＧＦＢＰプロテアーゼから構成されている（Shimasaki １９９１；Jones １９９５；Edmondson ２００３）。この系の各構成要素は、ホルモン、成長因子、発育状態、栄養、傷害、および疾患などの因子に応答した一時性かつ組織特異的な調節の影響を受ける（Edmondson ２００３）。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、アミノ酸レベルで約６０％相同であり、かつ、インスリンに対して有意な相同性を示す（Rinderknecht １９７８ａ；Rinderknecht １９７８ｂ）。ＩＧＦは、パラクリン、オートクリン、および／または内分泌の様式で作用することによって、組織の増殖および分化を刺激することができる（Bach １９９５；Marshman ２００２）。ＩＧＦの分裂促進作用は、ヘテロ四量体の膜貫通チロシンキナーゼであるＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ−Ｉ）によって、主として媒介される（Nissley １９９１；Schumacher １９９１）。ＩＧＦＲ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方に高い親和力で結合し、かつ、インスリンには実質的により低い親和力で結合する（Marshman ２００２）。
【０００５】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに高い親和力で結合するが、インスリンには結合しない。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦを輸送し、タンパク質分解による劣化から保護することによってそれらの半減期を延長し、かつＩＧＦＲとの相互作用に対するそれらの有効性を調節するために不可欠である（Baxter １９９１；Le Roith ２００１）。この様式で、それらは、ＩＧＦ活性を増強または抑制することによって、増殖および分化に対するＩＧＦの影響を調節する（Bach １９９５）。ＩＧＦＢＰのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの両方とも、高度に保存されている。
【０００６】
最近の研究により、ＩＧＦＢＰが、「ＩＧＦ非依存性」作用と呼ばれる、ＩＧＦと相互作用する能力を超えた独特な内因性の生物活性を有することが実証された（Jones １９９５；Oh １９９８）。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は、細胞の増殖およびアポトーシスに対してＩＧＦ非依存性の影響を及ぼすことが示されている（Oh １９９３；Longobardi ２００３）。これらの生物学的影響が真にＩＧＦ非依存性であることを証明するために、ＩＧＦに対する結合親和力を有していないＩＧＦＢＰ−３変異体が作り出された。この変異体（ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３、Ｇ５６Ｇ８０Ｇ８１、または単にＧＧＧ変異体と呼ばれる）は、ＩＧＦＢＰ−３残基のＩｌｅ５６、Ｌｅｕ８０、およびＬｅｕ８１をＧｌｙ５６、Ｇｌｙ８０、およびＧｌｙ８１に部位特異的に変異誘発することによって作製される（Buckway ２００１；Longobardi ２００３；Kim ２００４）。この研究にもかかわらず、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ非依存性作用の根底にある機序は、まだ解明されていない。
【０００７】
気管支喘息は、気道の好酸球増加、粘液分泌過多を伴う杯細胞過形成、ならびに吸入されたアレルゲンおよび非特異的な刺激に対する反応性亢進を特徴とする、気道の慢性炎症性疾患である（Kay １９９１）。好酸球応答は、喘息の重要な特徴であると思われる。気管支組織における好酸球の蓄積およびそれに続く活性化は、気管支喘息の病態生理学において重要な役割を果たしている（Frigas １９８６）。最近の研究により、気道炎症が、気管支上皮細胞それら自体によって永続化されている可能性があることが示唆された。上皮細胞は、血小板活性化因子やプロスタグランジンなど多数の炎症メディエーターを産生することが示された（Holgate ２０００）。気管支上皮細胞はまた、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＭＣＰ−１、およびＲＡＮＴＥＳなど多種多様の炎症誘発性サイトカインも産生する（Holgate ２０００）。気管支喘息および他の気道炎症性疾患に罹患した被検体における気管支上皮細胞によるサイトカインおよび化学誘引物質の産生は、炎症細胞の局所的蓄積の一因となっていると思われる。
【０００８】
ＩＧＦ−Ｉは、ヒト気道上皮細胞によって産生される主要な線維芽細胞分裂促進因子として同定された（Cambrey １９９５）。他の研究により、コルチコステロイドを吸入すると、気管支喘息におけるＩＧＦ−Ｉ発現が抑制されることによって基底膜の網状層（lamina reticularis）が減少することが実証された（Hoshino １９９８）。ＩＧＦ−Ｉ発現とコラーゲン肥厚および線維芽細胞数の両方との間で有意な相互関係が示されて、気管支喘息に関連した炎症プロセスにＩＧＦ−Ｉが関与している可能性があることが示唆された。ＩＧＦＢＰに関しては、ＩＧＦＢＰプロテアーゼのマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）が、喘息の気道平滑筋細胞において増加していることが実証された（Rajah １９９９）。さらに、いずれもＭＭＰ−１のタンパク質分解基質であるＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−３が、喘息の気道組織抽出物中で切断されていることが示された（Rajah １９９９）。これらの研究は、喘息に関連した炎症プロセスにおいてＩＧＦ系が重要な役割を果たしていることを示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（詳細な説明）
本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を例示するためのものであるにすぎない。したがって、考察される個々の修正は、本発明の範囲に対する制約として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更、および修正を実施できることが当業者には明らかになると考えられ、かつ、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解される。
【００１０】
略語
以下の略語が本明細書において使用される：Ａｄ、アデノウイルス；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄；ＣＯＰＤ、慢性閉塞性肺疾患；ＩＣＡＭ−１、細胞間接着分子−１；ＩＧＦ、インスリン様成長因子；ＩＧＦＢＰ、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＩＧＦＲ、インスリン様成長因子受容体；ＯＶＡ、卵白アルブミン；ＳＥＭ、平均値の標準誤差；ＶＣＡＭ−１、血管細胞接着分子−１。
【００１１】
定義
本明細書において使用される「気道反応性亢進」という語句は、括約筋アゴニストに対する気道の感受性が正常な気道に比べて増大することを意味する。括約筋アゴニストは、ヒスタミン、メタコリン、クエン酸、アレルゲン、呼吸器ウイルス、または外来粒子などの直接的アゴニストでも、運動または冷気もしくは乾燥空気の吸入などの間接的アゴニストでもよい。
【００１２】
本明細書において使用される「閉塞性呼吸器障害」という語句は、気道閉塞を伴う状態を意味する。この閉塞は、気道反応性亢進、呼吸器組織の炎症、呼吸器組織の肥厚、またはこれらの任意の組合せから発生することがある。一実施形態では、罹患した呼吸器組織は、下部呼吸器組織である。閉塞性呼吸器障害は、急性または慢性のいずれかであり得る。急性疾患には、アレルギー反応および一時的な喘息様の症状が含まれる。慢性疾患には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれ、例として、喘息、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、肺気腫、または気管支拡張症を挙げることができる。
【００１３】
本明細書において使用される「下部呼吸器組織」という語句は、喉頭、気管、気管支、細気管支、および肺を含めて、下部呼吸器系中の任意の器官の組織を意味する。
【００１４】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、あるポリペプチドをコードする遺伝因子を、そのポリペプチドの発現をもたらすように作動可能に挿入することができる運搬体を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの部類には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なエレメント、およびレポーター遺伝子を含めて、発現を制御するための様々なエレメントを含んでよい。ベクターはまた、それだけには限らないが、ウイルス粒子、リポソーム、もしくはタンパク質被膜を含めて、細胞中への移行を助けるための様々な物質を含んでもよく、またはそれらに結合されてもよい。
【００１５】
本明細書において使用される「治療有効量」という語句は、対象とする状態の予防もしくは治療、またはその状態に関連した症状の緩和など、被検体において所望の治療的効果をもたらす化合物の量である。正確な治療有効量は、所与の被検体における治療の有効性の面から最も効果的な結果をもたらすと考えられる、組成物の量である。この量は、それだけには限らないが、治療用化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、被検体の生理学的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよび段階、全体的な身体的状態、所与の投薬量に対する応答性、ならびに投薬法のタイプを含む）、製剤中の１種または複数種の製薬上許容される担体の性質、ならびに投与経路を含めて、様々な因子に応じて変動すると考えられる。臨床的技術および薬理学的技術の分野の熟練者なら、ごく普通の実験法によって、すなわち、ある化合物の投与に対する被検体の応答を観察し、かつ、それに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができると考えられる。さらなる手引きに関しては、Remington: 「製薬の科学および実践(The Science and Practice of Pharmacy)」第２０版、Gennaro編、Williams&Wilkinsペンシルヴェニア州、２０００、を参照されたい。
【００１６】
ある状態もしくは障害に関して本明細書において使用される「治療する」という用語は、その状態もしくは障害を予防すること、その状態もしくは障害の発症もしくは発達速度を遅くさせること、その状態もしくは障害を発症するリスクを低減させること、その状態もしくは障害に関連した症状の発達を予防するか、もしくは遅延させること、その状態もしくは障害に関連した症状を軽減するか、もしくは終息させること、その状態もしくは障害の全面的もしくは部分的な軽減をもたらすこと、またはそれらの何らかの組合せを意味することができる。
【００１７】
本明細書において使用される「製薬上許容される担体」という語句は、１つの組織、器官、または身体の一部分から、別の組織、器官、または身体の一部分に対象の化合物を運搬または輸送するのに関与する、製薬上許容される物質、組成物、またはビヒクルを意味する。例えば、担体は、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、もしくはカプセル化物質、またはそれらの何らかの組合せであり得る。担体の各構成要素は、製剤の他の成分と共存できなければならないという点で、「製薬上許容され」なければならない。これは、接触する可能性がある任意の組織または器官と接触して使用するのにも適切でなければならない。すなわち、これは、毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、またはその治療的利益を過剰に上回る他の任意の厄介な問題のリスクを有してはならない。
【００１８】
本明細書において使用される「被検体」という用語は、任意の動物を意味するが、好ましくは哺乳動物、またはより好ましくはヒトを意味する。
【００１９】
ＩＧＦ系は、様々な細胞型の成長、増殖、および分化の調節に遍在的に関与している、複数の構成要素からなる分子ネットワークである。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、気管支喘息に関連した炎症プロセスに関与していると思われる。ＩＧＦ−１活性は、ＩＧＦＢＰによって調節されている。６種のＩＧＦＢＰは、Ｃ末端ドメインおよびＮ末端ドメインにおいて高レベルの保存を示すが、それらの発現パターンおよび特性は、幅広く変動する。６種のＩＧＦＢＰのうちで、ＩＧＦＢＰ−３が、血清中に最も大量に存在する。ＩＧＦＢＰ−３は、ある種の状況においてＩＧＦ−１活性を調節することが公知であるが、呼吸器の炎症および反応性亢進におけるその病態生理学的役割は不明である。本発明は、野生型ＩＧＦＢＰ−３およびＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体の両方が、気管支喘息のような閉塞性呼吸器障害に関連した組織の炎症および反応性亢進の抑制物質であることを予想外に実証する。
【発明の効果】
【００２０】
呼吸器炎症および気道反応性亢進に対するＩＧＦＢＰ−３の効果を判定するために、喘息のマウスモデルを使用した。これらの研究のために、３種のアデノウイルスベクターを作製した。第１のＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３は、野生型ＩＧＦＢＰ−３をコードするｃＤＮＡを含んだ。第２のｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３は、ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体をコードするｃＤＮＡを含んだ。第３のＡｄＬａｃＺは、対照として使用した。
【００２１】
ＯＶＡの腹腔内注射によって、マウスを感作した。初回感作後２１日目に、アデノウイルスベクターをマウスに気管内投与し、かつ、２１日目、２２日目、および２３日目に、ＯＶＡによる誘発をマウスに実施した。最終誘発後７２時間目に、ＢＡＬを実施し、かつ分析のために肺を切除した。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与されたマウスに由来するＢＡＬ液は、好酸球、リンパ球、好中球、および全細胞の数の有意な減少を示した。組換えＩＧＦＢＰ−３をマウスに投与した場合も、同様の結果が得られた。好酸球数の増加は、上皮損傷、基底膜の肥厚、ならびに、気管支平滑筋収縮および血漿滲出を引き起こして、気道壁の肥厚を結果として生じる能力を有する介在物質の放出を含めて、喘息の気道において認められる組織変化の多くに関連していると考えられている（O’Byrne ２００３）。
【００２２】
摘出された肺組織の組織学的研究により、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３で処置されたマウスが、細気管支周囲領域および血管周囲領域の両方において、著しくレベルの低下した炎症および炎症細胞の浸潤を示すことが明らかにされた。組織学的データにより、アデノウイルスベクターを投与されたマウスが、ＩＧＦＢＰ−３の発現増加を示して、アデノウイルスベクターからの発現の有効性が確認されることも、立証された。
【００２３】
肺組織のウェスタンブロット解析およびＢＡＬ液の酵素イムノアッセイにより、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−１β、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、エオタキシン、およびＲＡＮＴＥＳの発現が、ＯＶＡによる誘発の後に増加すること、ならびにこの増加が、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって大きく減少することが明らかにされた。ウェスタンブロット解析により、内因性ＩＧＦＢＰ−３のレベルは、ＯＶＡによる誘発の後に有意に低下するのに対し、内因性ＩＧＦ−１のレベルは有意に上昇することも確認された。
【００２４】
生きている無拘束マウスにおいて、メタコリン濃度の上昇に対応した様々な呼吸パラメーターを測定した。これらのパラメーターを用いてＰｅｎｈ値を算出し、かつ、基線のＰｅｎｈの増加を利用して、メタコリンに対する気道反応性を評価した。試験された各メタコリン濃度におけるＰｅｎｈ値がより高いことによって実証されるように、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスは、対照マウスと比較すると、気道反応性亢進を示した。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、気道反応性亢進が有意に低減し、これは、Ｐｅｎｈ値の有意な減少によって示された。組換えＩＧＦＢＰ−３をマウスに投与した場合も、同様の結果が得られた。
【００２５】
これらの結果は、ＩＧＦＢＰ−３が、気管支喘息のような閉塞性呼吸器障害に関連した呼吸器炎症および気道反応性亢進の強力な抑制物質であることを実証する。ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体が、野生型タンパク質とほぼ同じ抑制効果を有することから、抑制が、単にＩＧＦ活性を妨害する能力ではなく、内因性ＩＧＦＢＰ−３の抗炎症性活性の結果であることが実証される。本明細書において説明する結果により、ＩＧＦＢＰ−３レベルの変化が、気管支喘息および他の閉塞性呼吸器障害の病因に関係があること、ならびに、ＩＧＦＢＰ−３の回復（restoration）がこれらの障害を予防および抑止するのに役立つと思われることが示唆される。
【００２６】
ＩＧＦＢＰ−３レベルを調節して、呼吸器組織の炎症または気道反応性亢進に関連した閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、またはそのリスクにさらされている被検体を治療することができる。被検体のＩＧＦＢＰ−３レベルは、外因性ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドもしくはその類似体、またはＩＧＦＢＰ−３もしくはＩＧＦＢＰ−３類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与することによって、上昇させることができる。同様に、被検体のＩＧＦＢＰ−３レベルは、内因性ＩＧＦＢＰ−３の発現を調節する１種または複数種の作用物質を投与することによっても調節することができる（例えば、米国特許第５，８４０，６７３号を参照されたい）。
【００２７】
ポリペプチド、ベクター、または他の作用物質は、例えば、エアロゾル投与、腸内投与、経鼻投与、眼内投与、経口投与、非経口投与、または経皮投与を含めて、当技術分野において公知の任意の有効な経路を介して被検体に投与してよく、かつ、製薬上許容される担体と組み合わせて投与してよい。
【００２８】
被検体のＩＧＦＢＰ−３発現のレベルを利用して、閉塞性呼吸器障害、またはそのような障害を発症する素因を診断することができる。発現は、被検体から得られた体液または組織試料において検出または測定することができ、かつ、公知の健常組織に由来する発現レベルと比較することができる。試験試料中のＩＧＦＢＰ−３発現の減少は、その被検体が、閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、または発症するリスクがあることを示唆し得る。ＩＧＦＢＰ−３発現は、閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、またはそのリスクがあることが公知である被検体において、長期に渡って測定してよい。これにより、その被検体がその障害の進行を観察し、かつ差し迫った発作を予期することが可能になると思われる。また、ＩＧＦＢＰ−３発現レベルの長期に渡る測定を利用して、治療戦略の有効性を観察するか、または、ある被検体のために治療手法をカスタマイズおよび調整することもできる。
【００２９】
以下の実施例は、特許請求される本発明をより良く例示するために提供され、かつ、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の物質の名前が挙げられない限り、それは、例示のためにすぎず、かつ本発明を限定するためのものではない。当業者は、独創的な能力を行使せずに、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、等価な手段または反応物を開発することができる。本発明の範囲内になお留まりつつ、本明細書において説明する手順において多くの変形を作り出せることが理解されるであろう。このような変形が本発明の範囲内に含まれることは、発明者らの意向である。
【実施例】
【００３０】
統計データ：
以下の実施例中のデータは、平均値±ＳＥＭとして表した。一元配置分散分析とそれに続くフィッシャーの検定によって、統計学的比較を実施した。対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、有意な群間差を判定した。統計的有意性はＰ＜０．０５に設定した。
【００３１】
（実施例１）ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３ベクター、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３ベクター、およびＡｄＬａｃＺベクターの作製：
３種のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを作製した：ＩＧＦＢＰ−３のｃＤＮＡを含むＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３；ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３のｃＤＮＡを含むｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３；および対照として使用されたＡｄＬａｃＺ。ＡｄＥａｓｙシステム（He １９９８）（Quantum Biotechnologies, Montreal, Quebec, カナダ）を用いて、Ｅ１／Ｅ３が欠失した複製欠損性組換えＡｄを作製した。以前に説明されているようにして（Kwak ２００３）、ｐｃＤＮＡ３／野生型ＩＧＦＢＰ−３に由来するＮｏｔＩ−ＸｂａＩ制限断片、およびＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体のｃＤＮＡに由来するＳａｌＩ−ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ制限断片を、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで消化したｐシャトルＣＭＶに連結した。ＡｄＬａｃＺを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１／ＬａｃＺ（Invitrogen Corp., San Diego、カリフォルニア州、米国）に由来するＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化したｐシャトルＣＭＶに連結した。製造業者の取扱い説明書に従って、細菌（組換え欠損大腸菌株ＢＪ５１８３）中でｐＡｄＥａｓｙウイルスのバックボーンへの組換えを実施した。組換えを確認し、かつ、アデノウイルス組換えＤＮＡを、はるかに多いＤＮＡ産生量をもたらす大腸菌の正常株（ＤＨ５α）に移入した。ＣＭＶ−ｃＤＮＡ挿入物を含む組換えｐＡｄＥａｓｙプラスミドをQIAGENカラム（QIAGEN Inc., Valencia, カリフォルニア州、米国）によって精製し、かつＰａｃＩで消化したＤＮＡ ５μｇを使用して、リン酸カルシウム法（Promega Corp., Madison、ウィスコンシン州、米国）によってＱＢＩ−２９３Ａ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に１５０ｍｍ培養皿当たり細胞２×１０６個の濃度で細胞を播種した。アデノウイルスの増殖を示す、トランスフェクトされた細胞の溶解は、４日以内に起こった。増幅後、組換えＡｄクローンを含む溶解産物を１５０ｍｍ培養皿から調製し、かつＣｓＣＩ勾配遠心分離によって精製した。回収したウイルスを等分し、かつ５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡ、および２５％グリセロールを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液中、−２０℃で保存した。ＱＢＩ−２９３Ａ細胞に段階希釈液を感染させることによってウイルスの力価を測定し、かつ０．３％アガロース、１０％ＦＢＳ、および１×ＤＭＥＭからなるオーバーレイの下でプラークを計数した。
【００３２】
（実施例２）ＢＡＬ液中の細胞数に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
８〜１０週齢であり、かつマウスに特異的な病原体を有していないメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、Korean Research Institute of Chemistry Technology（韓国化学技術研究所）（デジョン（大田）、韓国）から入手した。実験の間ずっと、層流式キャビネット中にこれらのマウスを収容し、かつ標準的な実験用固形飼料を自由に与えて飼育した。本研究において使用したすべての実験動物は、Chonbuk National University Medical School（全北大学校医学部）のInstitutional Animal Care and Use Committee（研究機関の動物管理使用委員会）によって承認されたガイドラインに従って処置した。
【００３３】
１日目および１４日目に、総体積２００μｌの、水酸化アルミニウム（Pierce Chemical Co., Rockford、イリノイ州、米国）１ｍｇ中に乳化させた卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, ミズーリ州、米国）２０μｇを腹腔内注射することによって、マウスを感作した。初回感作後、２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２；オムロン、東京、日本）を用いて、生理食塩水中３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＯＶＡのエアロゾルを１日当たり３０分間マウスに投与した。対照のマウスにはＯＶＡの代わりに生理食塩水を投与した。２１日目（ＯＶＡ気道投与の１時間前）および２３日目（気道投与の３時間後）に、Ａｄベクター（１０９ペスト形成単位（plague-forming units））を気管内投与した。対照マウスには生理食塩水を投与した。この投与プロトコールの概略図を図１に示す。このプロトコールにより、５種の実験群、すなわち、ＳＡＬ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＡｄＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３、ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３、およびＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺが得られた。
【００３４】
最終の気道投与の７２時間後に、各実験群から６匹のマウスに対して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。洗浄の際、過量のナトリウムペントバルビトン（ペントバルビタールナトリウム、１００ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）を用いてこれらのマウスを屠殺した。胸腔を露出させて膨張できるようにし、その後、気管に注意深く挿管し、かつ結紮糸でカテーテルを固定した。予熱した０．９％ＮａＣｌ溶液をゆっくりと肺に注入し、かつ回収した。ＢＡＬ分取物をプールし、かつ４℃で保存した。次いで、各プールの一部分を遠心分離し、かつ使用するまで上清を−７０℃で保存した。
【００３５】
血球計数器を用いて全細胞数を計数した。サイトスピン（Shandon Scientific Ltd., Cheshire、英国）によって、ＢＡＬ細胞の塗抹標本を調製した。細胞の差を検査するために、これらの塗抹標本をDiff-Quik溶液（Dade Diagnostics of Puerto Rico Inc., Aguada、プエルト・リコ）で染色した。無関係な盲検化された研究者２名が顕微鏡を用いてこれらの細胞を計数した。異なるランダムな４つの場所それぞれにおいて、約４００個の細胞を計数した。研究者間の結果の差異は５％未満であった。２名の研究者から得られた値の平均値を各細胞数として使用した。
【００３６】
ＢＡＬ液中の全細胞、好酸球、リンパ球、および好中球の数は、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に増加していた（図２、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けたＢＡＬ液中の各細胞型の数は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に減少した（図２、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。ＡｄＬａｃＺの投与は、細胞数に対して影響を与えなかった。
【００３７】
（実施例３）ＯＶＡによって誘発された喘息の病理に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
実施例２において説明したＢＡＬ処置に続いて、マウスから肺を切除した。切除する前に、気管の周りの結紮糸を用いて、気管内から、固定液（０．８％ホルマリン、４％酢酸）で肺および気管を満たした。１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリンで肺組織を固定した。標本を脱水し、かつパラフィンに包埋した。組織学的検査のために、Leicaモデル２１６５回転式ミクロトーム（Leica, Nussloch, ドイツ）上で固定した包埋組織の４μｍ切片を切断し、スライドガラス上に置き、脱パラフィンし、かつヘマトキシリン２およびエオシン−Ｙ（Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, ミシガン州）で順次染色した。
【００３８】
組織学的検査により、ＯＶＡに曝露されたマウスにおける喘息の典型的な病理学的特徴が明らかになった。好酸球を含む多数の炎症細胞が、ＯＶＡによる誘発に応答して、細気管支の周囲に浸潤していた（図３、パネルＡ（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）およびパネルＢ（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）を比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの細気管支周囲領域および血管周囲領域において、炎症細胞の浸潤が著しく低減した（図３、パネルＣ（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）およびパネルＤ（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３））。ＡｄＬａｃＺの投与には、効果がなかった（図３Ｅ）。
【００３９】
無関係な盲検化された研究者３名によって、各組織学的標本に炎症スコアを割り当てた。別の文献で説明されているように（Tournoy ２０００）、気管支周囲および血管周囲の炎症の程度を０〜３の主観的尺度に基づいて評価した。検出可能な炎症が無い場合は値０を割り当て、炎症細胞を伴う袖口様白血球集合（cuffing）がところどころある場合は値１を割り当て、大半の気管支または血管が炎症細胞の薄層（１〜５個の細胞）で取り囲まれている場合は値２を割り当て、かつ、大半の気管支または血管が炎症細胞の厚い層（５個より多い細胞）で取り囲まれている場合は値３を割り当てた。
【００４０】
気管支周囲、血管周囲、および肺全体の炎症スコアは、ＯＶＡによる誘発を受けた標本において有意に増加していた（図４、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。３箇所のスコアはすべて、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けた標本において有意に減少していた（図４、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍＩＧＦＢＰ−３」）。これらの結果は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３が、好酸球の流入を含めて、抗原に誘発された肺炎症を抑制することを示唆する。
【００４１】
（実施例４）ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
タンパク質抽出物を得るために、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、肺組織をホモジナイズした。Bradford試薬（Bio-Rad）を用いてタンパク質濃度を測定した。試料（１レーン当たりタンパク質３０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加した。１２０Ｖで９０分間電気泳動した後、分離されたタンパク質を、ウェットトランスファー法（２５０ｍＡ、９０分）によってポリビニリデンジフルオリド膜（Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, ニュージャージー州）上に移した。非特異的な部位は、ＴＢＳＴ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングし、その後、４℃で一晩、抗ＩＬ−４抗体（Serotec Ltd、Oxford、英国）、抗ＩＬ−５抗体、または抗ＩＬ−１３抗体（R&D Systems,Inc. Minneapolis、ミネソタ州）とともに、ブロットをインキュベートした。抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＩｇＧを用いて、抗体結合を検出した。メンブレンをストリップし、かつ、抗アクチン抗体（Sigma Aldrich）で再ブロットして、各レーンにおけるタンパク質のロード量が等しいことを確認した。高感度ケミルミネッセンスシステムの試薬（Amersham Pharmacia Biotech）で処理した後、写真フィルムに露光させることによって、特異的抗体の結合を可視化した。
【００４２】
ウェスタンブロット解析により、肺組織におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３サイトカインのレベルが、ＯＶＡによる誘発後に有意に上昇していることが明らかになった（図５、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の各サイトカインのレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって著しく低下した（図５、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」）。
【００４３】
製造業者のプロトコール（ＩＬ−４およびＩＬ−５はEndogen,Inc., Woburn, マサチューセッツ州、米国から入手；ＩＬ−１３は、R&D Systems,Inc., Minneapolis、ミネソタ州、米国から入手）に従って酵素イムノアッセイを実施して、ＢＡＬ液の上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルを定量した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３アッセイの感度は、それぞれ５ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、および１．５ｐｇ／ｍｌであった。
【００４４】
酵素イムノアッセイは、ウェスタンブロット解析から得られた結果と一致していた。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルは、ＯＶＡによる誘発を受けた被検体（図６、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）に由来するＢＡＬ液中で上昇しており、かつ、この上昇は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図６、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」を参照されたい）。
【００４５】
（実施例５）ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現レベルを、実施例４で説明したように、ウェスタンブロット法によって測定した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図７Ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図７Ａ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４６】
ＢＡＬ液中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ウェスタンブロット解析の結果と一致して、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現は、ＯＶＡによる誘発後に増加しており（図７Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」）、かつ、この増加は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図７Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４７】
（実施例６）ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織における血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）および細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現レベルを、実施例４で説明したようにウェスタンブロット法によって測定し、かつ、デンシトメトリー解析によって定量した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図８Ａおよび８Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図８Ａおよび８Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４８】
（実施例７）エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現レベルを、実施例４で説明したように、ウェスタンブロット法によって測定した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図９Ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図９Ａ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」）。
【００４９】
ＢＡＬ液中のエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ウェスタンブロット解析の結果と一致して、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現は、ＯＶＡによる誘発後に増加しており（図９Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」）、かつ、この増加は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図９Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００５０】
（実施例８）気道反応性亢進に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
以前に説明されているようにして（Lee ２００２）、最終誘発後３日目に、無拘束かつ意識のある状態で、マウスの気道反応性を測定した。バロメトリックプレチスモグラフィーのチャンバー（All Medicus Co., Seoul，韓国）にマウスを入れ、かつ、３分間、基線の指示値を記録し、平均した。同時に、濃度を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）エアロゾル化したメタコリンを、３分間、メインチャンバーの入口から噴霧した。各噴霧の後、３分間、指示値を記録し、平均した。肺抵抗（製造業者のプロトコールに従って、（呼気時間／休止時間−１）×（最大呼気流量／最大吸気流量）として算出されるＰｅｎｈ）は、最大吸気の箱圧力信号に対する最大呼気の箱圧力信号の比率の関数であり、かつ、呼気のタイミングの関数である、無次元の値である。基線のＰｅｎｈの増加率を用いて、段階的に上げたメタコリン濃度での気道反応性を評価した。基線のＰｅｎｈ（生理食塩水の投与後）を１００％として表した。
【００５１】
基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいて左に移動し（図１０、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）、これにより、ＯＶＡによる誘発後の気道反応性亢進が示唆された。濃度を段階的に上げたメタコリンを投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスおよび対照マウスの両方において、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントが増加し、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの方が、試験した各メタコリン濃度で、対照マウスより高い、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントを示した（図１０、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、未処置のＯＶＡによる誘発を受けたマウスに比べて右に移動した（図１０、「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」、および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」を比較されたい）。
【００５２】
（実施例９）正常な肺組織およびＯＶＡによる誘発を受けた肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現：
ＩＧＦＢＰ−３抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, カリフォルニア州）を用いて、実施例４で説明したように、肺タンパク質抽出物に対してウェスタンブロット解析を実施した。内因性ＩＧＦＢＰ−３の発現は、正常な肺組織と比べて、ＯＶＡによる誘発を受けた肺組織において有意に減少していた（図１１ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＩＧＦＢＰ−３レベルは、ＯＶＡによる誘発後、時間とともに減少したが、対照細胞においては有意な変化を示さなかった（図１１ｂ、様々な時点の「（ＯＶＡ）ＩＧＦＢＰ−３」および「（生理食塩水）ＩＧＦＢＰ−３」を比較されたい）。ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与されたマウスにおいてＩＧＦＢＰ−３の発現の増加が観察されて、アデノウイルス遺伝子導入技術が確認された（図１１ａ、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００５３】
（実施例１０）正常な肺組織およびＯＶＡによる誘発を受けた肺組織におけるＩＧＦ−１発現：
ＢＡＬ液中のＩＧＦ−１の発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ＩＧＦ−１のレベルは、ＯＶＡによる誘発後１時間目、６時間目、２４時間目、４８時間目、および７２時間目に有意に上昇していた（図１２Ａ、「ＰＲＥ」を「１時間目」、「６時間目」、「２４時間目」、「４８時間目」、および「７２時間目」と比較されたい）。生理食塩水の吸入後には、ＩＧＦ−１レベルの有意な変化は観察されなかった。
【００５４】
（実施例１１）肺組織および気管上皮細胞における免疫反応性ＩＧＦＢＰ−３の所在：
肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３の所在を組織学的解析によって観察した。ＩＧＦＢＰ−３は、対照マウスの細気管支の周囲の上皮層に局在していたが、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいては消失した（図１３、ＡおよびＢを比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を気管内投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現が回復したのに対し、ＡｄＬａｃＺを投与しても効果はなかった（図１３、ＣおよびＤを比較されたい）。
【００５５】
気管上皮細胞におけるＩＧＦＢＰ−３の所在を組織学的解析によって観察した。マウス気管上皮細胞を無菌状態下で単離した。気管分岐部の近位側の気管を切除し、かつ付着した脂肪組織を除去した。気管を縦方向に切開し、３つの部分に切断し、かつ０．１％プロテアーゼを含むＤＭＥＭ中で、４℃で一晩インキュベートした。組織を消化した後、酵素を不活性化するために、ＦＢＳ（最終濃度１０％）を媒体に添加した。未消化の組織断片を除去し、かつ、５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって、気管上皮細胞を回収した。これらの細胞を、液内培養用のコラーゲンでコーティングされた３５ｍｍシャーレ上に播種した。１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢを含む増殖培地ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Sigma-Aldrich）に、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ホスホエタノールアミン、コレラ毒素、エタノールアミン、ウシ脳下垂体抽出物、およびＢＳＡを添加した。細胞が接着するまで、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で細胞を維持した。
【００５６】
ＩＧＦＢＰ−３は対照マウスの気管上皮細胞に局在していたが、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいては著しく減少していた（図１３、ＥおよびＦを比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を気管内投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現が回復したのに対し、ＡｄＬａｃＺを投与しても効果はなかった（図１３、ＧおよびＨを比較されたい）。
【００５７】
（実施例１２）ＢＡＬ液中の細胞数に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
１日目および１４日目に、総体積２００μｌの、水酸化アルミニウム１ｍｇ中に乳化させたＯＶＡ２０μｇを腹腔内注射することによって、マウスを感作した。初回感作後、２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２）を用いて、生理食塩水中３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＯＶＡのエアロゾルを１日当たり３０分間マウスに投与した。対照のマウスにはＯＶＡの代わりに生理食塩水を投与した。２１日目（ＯＶＡ気道投与の１時間前）および２３日目（気道投与の３時間後）に、組換えＩＧＦＢＰ−３を投与した。対照マウスには生理食塩水を投与した。このプロトコールにより、４種の実験群、すなわち、ＳＡＬ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ、およびＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇが得られた。
【００５８】
実施例２で説明したように、最終の気道投与の７２時間後に、各実験群から１０匹のマウスに対してＢＡＬを実施した。無関係な盲検化された研究者２名が顕微鏡を用いてＢＡＬ塗抹標本を検査した。２名の研究者から得られた値の平均値を各細胞数として使用した。
【００５９】
ＢＡＬ液中の全細胞、好酸球、リンパ球、および好中球の数は、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に増加していた（図１４、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇの投与により、全細胞、リンパ球、好中球、および好酸球は減少した（図１４、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ」）。組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇの投与により、これらの各細胞型はさらに大幅に減少し、かつ、マクロファージの数も減少した（図１４、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ」）。
【００６０】
（実施例１３）気道反応性亢進に対する組換えＩＧＦＢＰ−３の効果：
実施例８で説明したように、最終誘発後３日目に、実施例１２から得られるマウスにおいて、気道反応性を測定した。基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいて左に移動し（図１５、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）、これにより、ＯＶＡによる誘発後の気道の反応性亢進が示唆された。さらに、メタコリン濃度の上昇に対応した、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの増加は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいてより大きかった。基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線が右に移動することによって示されるように、組換えＩＧＦＢＰ−３の投与により、気道反応性亢進は軽減された（図１５、「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ」、および「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ」を比較されたい）。
【００６１】
上述したように、前述の内容は、本発明の様々な実施形態を例示するためのものであるにすぎない。上記の個々の修正は、本発明の範囲に対する制約として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更、および修正を実施できることが当業者には明らかになると考えられ、かつ、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解される。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実験プロトコールの概略図である。水酸化アルミニウム１ｍｇ中に乳化させたＯＶＡを腹腔内注射することによって、１日目および１４日目にマウスを感作した。初回感作後２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザーを用いて、生理食塩水中３％（ｗ／ｖ）ＯＶＡのエアロゾル（または対照としての生理食塩水）を３０分間マウスに投与した。Ａｄベクターを用いた処置の場合、処置される各動物に２回、すなわち、２１日目（初回のＯＶＡ気道投与の１時間前）に１回目、および２３日目（最終のＯＶＡ気道投与の３時間後）に２回目を気管内投与した。
【図２】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＢＡＬ液中の全細胞構成要素および差次的な細胞構成要素に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。最終誘発後７２時間目に、対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）に由来するＢＡＬ液の各細胞構成要素の数を計数した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図３】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織における病理学的変化に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表的な肺切片。標本採取は、最終誘発後７２時間目に実施した。Ａ．対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）。Ｃ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）。Ｄ．ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）。Ｅ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）。バーは、５０μｍのスケールを示す。
【図４】気管支周囲および血管周囲の肺炎症に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、気管支周囲、血管周囲、および全体の肺炎症を測定した。全体の肺炎症は、気管支周囲および血管周囲の炎症スコアの平均として定義した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図５】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３タンパク質発現に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、ウェスタンブロットによって、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。
【図６】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＩＬ−４、１Ｌ−５、およびＩＬ−１３のレベルに対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、イムノアッセイによって、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルを測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図７】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現を、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図８】ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現を、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織において、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、生理食塩水を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ウェスタンブロットの結果を、アクチンに対するＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の相対比に基づくデンシトメトリー解析によって定量した。ＳＡＬ＋ＳＡＬマウスにおけるＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の相対比を任意に１として示す。データは、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図９】エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質発現を、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１０】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおける気道反応性に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、気道反応性を測定した。エアロゾル投与されたメタコリンに対する気道反応性を、意識のある無拘束マウスにおいて測定した。マウスに生理食塩水を噴霧投与し、次いで、１回に３分間、用量を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）メタコリンを噴霧投与した。各噴霧の後、３分間、呼吸パラメーターの指示値を記録し、その間にＰｅｎｈ値を決定した。データは、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１１】ＯＶＡによる誘発後の肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現を示す図である。Ａ．対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）におけるＩＧＦＢＰ−３発現をウェスタンブロットによって測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．誘発後の様々な時点に、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（（ＯＶＡ）ＩＧＦＢＰ−３）および対照マウス（（生理食塩水）ＩＧＦＢＰ−３）におけるＩＧＦＢＰ−３発現をウェスタンブロットによって測定した。１０回の独立した実験における結果は同様であった。
【図１２】ＯＶＡによる誘発後のＢＡＬ液におけるＩＧＦ−１発現を示す図である。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＩＧＦ−１タンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ）およびＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ）における発現を、誘発の前（ＰＲＥ）、ならびに最終誘発後１時間目、６時間目、２４時間目、および４８時間目、７２時間目に測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、Ｐｒｅに対してＰ＜０．０５であることを表す。アッセイの感度は３．５ｐｇ／ｍｌであった。
【図１３】肺組織および気管上皮細胞におけるＩＧＦＢＰ−３タンパク質の免疫組織化学的解析を示す図である。濃褐色は、ＩＧＦＢＰ−３陽性細胞を示す。バーは、５０μｍのスケールを示す。Ａ．対照マウスの肺組織。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｃ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｄ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｅ．対照マウスの気管上皮細胞。Ｆ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。Ｇ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。Ｈ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。
【図１４】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＢＡＬ液中の全細胞構成要素および差次的な細胞構成要素に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。最終誘発後７２時間目に、対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １μｇ）、および組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ）に由来するＢＡＬ液の各細胞構成要素の数を計数した。棒は、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１５】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおける気道反応性に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １μｇ）、および組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ）において、最終誘発後７２時間目に、気道反応性を測定した。エアロゾル投与されたメタコリンに対する気道反応性を、意識のある無拘束マウスにおいて測定した。マウスに生理食塩水を噴霧投与し、次いで、１回に３分間、用量を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）メタコリンを噴霧投与した。各噴霧の後、３分間、呼吸パラメーターの指示値を記録し、その間にＰｅｎｈ値を決定した。データは、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００５年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／６５２，０２３号明細書および２００５年７月１３日に出願された米国特許仮出願第６０／６９８，７３１号明細書に対して優先権を主張し、これらの両方とも、図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、呼吸器疾患の分野に関する。より具体的には、本発明は、気道の閉塞および／または炎症に関連した状態、ならびに気道反応性亢進に関連した状態の治療、予防、および診断に関する。
【背景技術】
【０００３】
インスリン様成長因子（ＩＧＦ）系は、体細胞の増殖においてだけでなく、癌、糖尿病、および栄養失調などの疾患においても重要な役割を果たしている（Rosenfeld １９８６；Rotwein １９９１）。ＩＧＦ系は、ＩＧＦリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ−ＩおよびＩＧＦＲ−ＩＩ）、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、およびＩＧＦＢＰ−６）、ならびに一連のＩＧＦＢＰプロテアーゼから構成されている（Shimasaki １９９１；Jones １９９５；Edmondson ２００３）。この系の各構成要素は、ホルモン、成長因子、発育状態、栄養、傷害、および疾患などの因子に応答した一時性かつ組織特異的な調節の影響を受ける（Edmondson ２００３）。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、アミノ酸レベルで約６０％相同であり、かつ、インスリンに対して有意な相同性を示す（Rinderknecht １９７８ａ；Rinderknecht １９７８ｂ）。ＩＧＦは、パラクリン、オートクリン、および／または内分泌の様式で作用することによって、組織の増殖および分化を刺激することができる（Bach １９９５；Marshman ２００２）。ＩＧＦの分裂促進作用は、ヘテロ四量体の膜貫通チロシンキナーゼであるＩ型ＩＧＦ受容体（ＩＧＦＲ−Ｉ）によって、主として媒介される（Nissley １９９１；Schumacher １９９１）。ＩＧＦＲ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方に高い親和力で結合し、かつ、インスリンには実質的により低い親和力で結合する（Marshman ２００２）。
【０００５】
ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに高い親和力で結合するが、インスリンには結合しない。ＩＧＦＢＰは、ＩＧＦを輸送し、タンパク質分解による劣化から保護することによってそれらの半減期を延長し、かつＩＧＦＲとの相互作用に対するそれらの有効性を調節するために不可欠である（Baxter １９９１；Le Roith ２００１）。この様式で、それらは、ＩＧＦ活性を増強または抑制することによって、増殖および分化に対するＩＧＦの影響を調節する（Bach １９９５）。ＩＧＦＢＰのＮ末端ドメインおよびＣ末端ドメインの両方とも、高度に保存されている。
【０００６】
最近の研究により、ＩＧＦＢＰが、「ＩＧＦ非依存性」作用と呼ばれる、ＩＧＦと相互作用する能力を超えた独特な内因性の生物活性を有することが実証された（Jones １９９５；Oh １９９８）。例えば、ＩＧＦＢＰ−３は、細胞の増殖およびアポトーシスに対してＩＧＦ非依存性の影響を及ぼすことが示されている（Oh １９９３；Longobardi ２００３）。これらの生物学的影響が真にＩＧＦ非依存性であることを証明するために、ＩＧＦに対する結合親和力を有していないＩＧＦＢＰ−３変異体が作り出された。この変異体（ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３、Ｇ５６Ｇ８０Ｇ８１、または単にＧＧＧ変異体と呼ばれる）は、ＩＧＦＢＰ−３残基のＩｌｅ５６、Ｌｅｕ８０、およびＬｅｕ８１をＧｌｙ５６、Ｇｌｙ８０、およびＧｌｙ８１に部位特異的に変異誘発することによって作製される（Buckway ２００１；Longobardi ２００３；Kim ２００４）。この研究にもかかわらず、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ非依存性作用の根底にある機序は、まだ解明されていない。
【０００７】
気管支喘息は、気道の好酸球増加、粘液分泌過多を伴う杯細胞過形成、ならびに吸入されたアレルゲンおよび非特異的な刺激に対する反応性亢進を特徴とする、気道の慢性炎症性疾患である（Kay １９９１）。好酸球応答は、喘息の重要な特徴であると思われる。気管支組織における好酸球の蓄積およびそれに続く活性化は、気管支喘息の病態生理学において重要な役割を果たしている（Frigas １９８６）。最近の研究により、気道炎症が、気管支上皮細胞それら自体によって永続化されている可能性があることが示唆された。上皮細胞は、血小板活性化因子やプロスタグランジンなど多数の炎症メディエーターを産生することが示された（Holgate ２０００）。気管支上皮細胞はまた、ＩＬ−１、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＭＣＰ−１、およびＲＡＮＴＥＳなど多種多様の炎症誘発性サイトカインも産生する（Holgate ２０００）。気管支喘息および他の気道炎症性疾患に罹患した被検体における気管支上皮細胞によるサイトカインおよび化学誘引物質の産生は、炎症細胞の局所的蓄積の一因となっていると思われる。
【０００８】
ＩＧＦ−Ｉは、ヒト気道上皮細胞によって産生される主要な線維芽細胞分裂促進因子として同定された（Cambrey １９９５）。他の研究により、コルチコステロイドを吸入すると、気管支喘息におけるＩＧＦ−Ｉ発現が抑制されることによって基底膜の網状層（lamina reticularis）が減少することが実証された（Hoshino １９９８）。ＩＧＦ−Ｉ発現とコラーゲン肥厚および線維芽細胞数の両方との間で有意な相互関係が示されて、気管支喘息に関連した炎症プロセスにＩＧＦ−Ｉが関与している可能性があることが示唆された。ＩＧＦＢＰに関しては、ＩＧＦＢＰプロテアーゼのマトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）が、喘息の気道平滑筋細胞において増加していることが実証された（Rajah １９９９）。さらに、いずれもＭＭＰ−１のタンパク質分解基質であるＩＧＦＢＰ−２およびＩＧＦＢＰ−３が、喘息の気道組織抽出物中で切断されていることが示された（Rajah １９９９）。これらの研究は、喘息に関連した炎症プロセスにおいてＩＧＦ系が重要な役割を果たしていることを示す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（詳細な説明）
本発明の以下の説明は、本発明の様々な実施形態を例示するためのものであるにすぎない。したがって、考察される個々の修正は、本発明の範囲に対する制約として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更、および修正を実施できることが当業者には明らかになると考えられ、かつ、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解される。
【００１０】
略語
以下の略語が本明細書において使用される：Ａｄ、アデノウイルス；ＢＡＬ、気管支肺胞洗浄；ＣＯＰＤ、慢性閉塞性肺疾患；ＩＣＡＭ−１、細胞間接着分子−１；ＩＧＦ、インスリン様成長因子；ＩＧＦＢＰ、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＩＧＦＲ、インスリン様成長因子受容体；ＯＶＡ、卵白アルブミン；ＳＥＭ、平均値の標準誤差；ＶＣＡＭ−１、血管細胞接着分子−１。
【００１１】
定義
本明細書において使用される「気道反応性亢進」という語句は、括約筋アゴニストに対する気道の感受性が正常な気道に比べて増大することを意味する。括約筋アゴニストは、ヒスタミン、メタコリン、クエン酸、アレルゲン、呼吸器ウイルス、または外来粒子などの直接的アゴニストでも、運動または冷気もしくは乾燥空気の吸入などの間接的アゴニストでもよい。
【００１２】
本明細書において使用される「閉塞性呼吸器障害」という語句は、気道閉塞を伴う状態を意味する。この閉塞は、気道反応性亢進、呼吸器組織の炎症、呼吸器組織の肥厚、またはこれらの任意の組合せから発生することがある。一実施形態では、罹患した呼吸器組織は、下部呼吸器組織である。閉塞性呼吸器障害は、急性または慢性のいずれかであり得る。急性疾患には、アレルギー反応および一時的な喘息様の症状が含まれる。慢性疾患には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれ、例として、喘息、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、肺気腫、または気管支拡張症を挙げることができる。
【００１３】
本明細書において使用される「下部呼吸器組織」という語句は、喉頭、気管、気管支、細気管支、および肺を含めて、下部呼吸器系中の任意の器官の組織を意味する。
【００１４】
本明細書において使用される「ベクター」という用語は、あるポリペプチドをコードする遺伝因子を、そのポリペプチドの発現をもたらすように作動可能に挿入することができる運搬体を意味する。ベクターの例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスの部類には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能なエレメント、およびレポーター遺伝子を含めて、発現を制御するための様々なエレメントを含んでよい。ベクターはまた、それだけには限らないが、ウイルス粒子、リポソーム、もしくはタンパク質被膜を含めて、細胞中への移行を助けるための様々な物質を含んでもよく、またはそれらに結合されてもよい。
【００１５】
本明細書において使用される「治療有効量」という語句は、対象とする状態の予防もしくは治療、またはその状態に関連した症状の緩和など、被検体において所望の治療的効果をもたらす化合物の量である。正確な治療有効量は、所与の被検体における治療の有効性の面から最も効果的な結果をもたらすと考えられる、組成物の量である。この量は、それだけには限らないが、治療用化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、被検体の生理学的状態（年齢、性別、疾患のタイプおよび段階、全体的な身体的状態、所与の投薬量に対する応答性、ならびに投薬法のタイプを含む）、製剤中の１種または複数種の製薬上許容される担体の性質、ならびに投与経路を含めて、様々な因子に応じて変動すると考えられる。臨床的技術および薬理学的技術の分野の熟練者なら、ごく普通の実験法によって、すなわち、ある化合物の投与に対する被検体の応答を観察し、かつ、それに応じて投薬量を調整することによって、治療有効量を決定することができると考えられる。さらなる手引きに関しては、Remington: 「製薬の科学および実践(The Science and Practice of Pharmacy)」第２０版、Gennaro編、Williams&Wilkinsペンシルヴェニア州、２０００、を参照されたい。
【００１６】
ある状態もしくは障害に関して本明細書において使用される「治療する」という用語は、その状態もしくは障害を予防すること、その状態もしくは障害の発症もしくは発達速度を遅くさせること、その状態もしくは障害を発症するリスクを低減させること、その状態もしくは障害に関連した症状の発達を予防するか、もしくは遅延させること、その状態もしくは障害に関連した症状を軽減するか、もしくは終息させること、その状態もしくは障害の全面的もしくは部分的な軽減をもたらすこと、またはそれらの何らかの組合せを意味することができる。
【００１７】
本明細書において使用される「製薬上許容される担体」という語句は、１つの組織、器官、または身体の一部分から、別の組織、器官、または身体の一部分に対象の化合物を運搬または輸送するのに関与する、製薬上許容される物質、組成物、またはビヒクルを意味する。例えば、担体は、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶剤、もしくはカプセル化物質、またはそれらの何らかの組合せであり得る。担体の各構成要素は、製剤の他の成分と共存できなければならないという点で、「製薬上許容され」なければならない。これは、接触する可能性がある任意の組織または器官と接触して使用するのにも適切でなければならない。すなわち、これは、毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、またはその治療的利益を過剰に上回る他の任意の厄介な問題のリスクを有してはならない。
【００１８】
本明細書において使用される「被検体」という用語は、任意の動物を意味するが、好ましくは哺乳動物、またはより好ましくはヒトを意味する。
【００１９】
ＩＧＦ系は、様々な細胞型の成長、増殖、および分化の調節に遍在的に関与している、複数の構成要素からなる分子ネットワークである。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、気管支喘息に関連した炎症プロセスに関与していると思われる。ＩＧＦ−１活性は、ＩＧＦＢＰによって調節されている。６種のＩＧＦＢＰは、Ｃ末端ドメインおよびＮ末端ドメインにおいて高レベルの保存を示すが、それらの発現パターンおよび特性は、幅広く変動する。６種のＩＧＦＢＰのうちで、ＩＧＦＢＰ−３が、血清中に最も大量に存在する。ＩＧＦＢＰ−３は、ある種の状況においてＩＧＦ−１活性を調節することが公知であるが、呼吸器の炎症および反応性亢進におけるその病態生理学的役割は不明である。本発明は、野生型ＩＧＦＢＰ−３およびＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体の両方が、気管支喘息のような閉塞性呼吸器障害に関連した組織の炎症および反応性亢進の抑制物質であることを予想外に実証する。
【発明の効果】
【００２０】
呼吸器炎症および気道反応性亢進に対するＩＧＦＢＰ−３の効果を判定するために、喘息のマウスモデルを使用した。これらの研究のために、３種のアデノウイルスベクターを作製した。第１のＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３は、野生型ＩＧＦＢＰ−３をコードするｃＤＮＡを含んだ。第２のｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３は、ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体をコードするｃＤＮＡを含んだ。第３のＡｄＬａｃＺは、対照として使用した。
【００２１】
ＯＶＡの腹腔内注射によって、マウスを感作した。初回感作後２１日目に、アデノウイルスベクターをマウスに気管内投与し、かつ、２１日目、２２日目、および２３日目に、ＯＶＡによる誘発をマウスに実施した。最終誘発後７２時間目に、ＢＡＬを実施し、かつ分析のために肺を切除した。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与されたマウスに由来するＢＡＬ液は、好酸球、リンパ球、好中球、および全細胞の数の有意な減少を示した。組換えＩＧＦＢＰ−３をマウスに投与した場合も、同様の結果が得られた。好酸球数の増加は、上皮損傷、基底膜の肥厚、ならびに、気管支平滑筋収縮および血漿滲出を引き起こして、気道壁の肥厚を結果として生じる能力を有する介在物質の放出を含めて、喘息の気道において認められる組織変化の多くに関連していると考えられている（O’Byrne ２００３）。
【００２２】
摘出された肺組織の組織学的研究により、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３で処置されたマウスが、細気管支周囲領域および血管周囲領域の両方において、著しくレベルの低下した炎症および炎症細胞の浸潤を示すことが明らかにされた。組織学的データにより、アデノウイルスベクターを投与されたマウスが、ＩＧＦＢＰ−３の発現増加を示して、アデノウイルスベクターからの発現の有効性が確認されることも、立証された。
【００２３】
肺組織のウェスタンブロット解析およびＢＡＬ液の酵素イムノアッセイにより、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−１β、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、エオタキシン、およびＲＡＮＴＥＳの発現が、ＯＶＡによる誘発の後に増加すること、ならびにこの増加が、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって大きく減少することが明らかにされた。ウェスタンブロット解析により、内因性ＩＧＦＢＰ−３のレベルは、ＯＶＡによる誘発の後に有意に低下するのに対し、内因性ＩＧＦ−１のレベルは有意に上昇することも確認された。
【００２４】
生きている無拘束マウスにおいて、メタコリン濃度の上昇に対応した様々な呼吸パラメーターを測定した。これらのパラメーターを用いてＰｅｎｈ値を算出し、かつ、基線のＰｅｎｈの増加を利用して、メタコリンに対する気道反応性を評価した。試験された各メタコリン濃度におけるＰｅｎｈ値がより高いことによって実証されるように、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスは、対照マウスと比較すると、気道反応性亢進を示した。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、気道反応性亢進が有意に低減し、これは、Ｐｅｎｈ値の有意な減少によって示された。組換えＩＧＦＢＰ−３をマウスに投与した場合も、同様の結果が得られた。
【００２５】
これらの結果は、ＩＧＦＢＰ−３が、気管支喘息のような閉塞性呼吸器障害に関連した呼吸器炎症および気道反応性亢進の強力な抑制物質であることを実証する。ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体が、野生型タンパク質とほぼ同じ抑制効果を有することから、抑制が、単にＩＧＦ活性を妨害する能力ではなく、内因性ＩＧＦＢＰ−３の抗炎症性活性の結果であることが実証される。本明細書において説明する結果により、ＩＧＦＢＰ−３レベルの変化が、気管支喘息および他の閉塞性呼吸器障害の病因に関係があること、ならびに、ＩＧＦＢＰ−３の回復（restoration）がこれらの障害を予防および抑止するのに役立つと思われることが示唆される。
【００２６】
ＩＧＦＢＰ−３レベルを調節して、呼吸器組織の炎症または気道反応性亢進に関連した閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、またはそのリスクにさらされている被検体を治療することができる。被検体のＩＧＦＢＰ−３レベルは、外因性ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドもしくはその類似体、またはＩＧＦＢＰ−３もしくはＩＧＦＢＰ−３類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与することによって、上昇させることができる。同様に、被検体のＩＧＦＢＰ−３レベルは、内因性ＩＧＦＢＰ−３の発現を調節する１種または複数種の作用物質を投与することによっても調節することができる（例えば、米国特許第５，８４０，６７３号を参照されたい）。
【００２７】
ポリペプチド、ベクター、または他の作用物質は、例えば、エアロゾル投与、腸内投与、経鼻投与、眼内投与、経口投与、非経口投与、または経皮投与を含めて、当技術分野において公知の任意の有効な経路を介して被検体に投与してよく、かつ、製薬上許容される担体と組み合わせて投与してよい。
【００２８】
被検体のＩＧＦＢＰ−３発現のレベルを利用して、閉塞性呼吸器障害、またはそのような障害を発症する素因を診断することができる。発現は、被検体から得られた体液または組織試料において検出または測定することができ、かつ、公知の健常組織に由来する発現レベルと比較することができる。試験試料中のＩＧＦＢＰ−３発現の減少は、その被検体が、閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、または発症するリスクがあることを示唆し得る。ＩＧＦＢＰ−３発現は、閉塞性呼吸器障害に罹患しているか、またはそのリスクがあることが公知である被検体において、長期に渡って測定してよい。これにより、その被検体がその障害の進行を観察し、かつ差し迫った発作を予期することが可能になると思われる。また、ＩＧＦＢＰ−３発現レベルの長期に渡る測定を利用して、治療戦略の有効性を観察するか、または、ある被検体のために治療手法をカスタマイズおよび調整することもできる。
【００２９】
以下の実施例は、特許請求される本発明をより良く例示するために提供され、かつ、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特定の物質の名前が挙げられない限り、それは、例示のためにすぎず、かつ本発明を限定するためのものではない。当業者は、独創的な能力を行使せずに、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、等価な手段または反応物を開発することができる。本発明の範囲内になお留まりつつ、本明細書において説明する手順において多くの変形を作り出せることが理解されるであろう。このような変形が本発明の範囲内に含まれることは、発明者らの意向である。
【実施例】
【００３０】
統計データ：
以下の実施例中のデータは、平均値±ＳＥＭとして表した。一元配置分散分析とそれに続くフィッシャーの検定によって、統計学的比較を実施した。対応のないスチューデントのｔ検定を用いて、有意な群間差を判定した。統計的有意性はＰ＜０．０５に設定した。
【００３１】
（実施例１）ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３ベクター、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３ベクター、およびＡｄＬａｃＺベクターの作製：
３種のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターを作製した：ＩＧＦＢＰ−３のｃＤＮＡを含むＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３；ＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３のｃＤＮＡを含むｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３；および対照として使用されたＡｄＬａｃＺ。ＡｄＥａｓｙシステム（He １９９８）（Quantum Biotechnologies, Montreal, Quebec, カナダ）を用いて、Ｅ１／Ｅ３が欠失した複製欠損性組換えＡｄを作製した。以前に説明されているようにして（Kwak ２００３）、ｐｃＤＮＡ３／野生型ＩＧＦＢＰ−３に由来するＮｏｔＩ−ＸｂａＩ制限断片、およびＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３変異体のｃＤＮＡに由来するＳａｌＩ−ＳｍａＩ／ＥｃｏＲＶ制限断片を、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで消化したｐシャトルＣＭＶに連結した。ＡｄＬａｃＺを作製するために、ｐｃＤＮＡ３．１／ＬａｃＺ（Invitrogen Corp., San Diego、カリフォルニア州、米国）に由来するＳａｌＩ−ＮｏｔＩ制限断片を、ＳａｌＩ−ＮｏｔＩで消化したｐシャトルＣＭＶに連結した。製造業者の取扱い説明書に従って、細菌（組換え欠損大腸菌株ＢＪ５１８３）中でｐＡｄＥａｓｙウイルスのバックボーンへの組換えを実施した。組換えを確認し、かつ、アデノウイルス組換えＤＮＡを、はるかに多いＤＮＡ産生量をもたらす大腸菌の正常株（ＤＨ５α）に移入した。ＣＭＶ−ｃＤＮＡ挿入物を含む組換えｐＡｄＥａｓｙプラスミドをQIAGENカラム（QIAGEN Inc., Valencia, カリフォルニア州、米国）によって精製し、かつＰａｃＩで消化したＤＮＡ ５μｇを使用して、リン酸カルシウム法（Promega Corp., Madison、ウィスコンシン州、米国）によってＱＢＩ−２９３Ａ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間前に１５０ｍｍ培養皿当たり細胞２×１０６個の濃度で細胞を播種した。アデノウイルスの増殖を示す、トランスフェクトされた細胞の溶解は、４日以内に起こった。増幅後、組換えＡｄクローンを含む溶解産物を１５０ｍｍ培養皿から調製し、かつＣｓＣＩ勾配遠心分離によって精製した。回収したウイルスを等分し、かつ５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ＢＳＡ、および２５％グリセロールを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液中、−２０℃で保存した。ＱＢＩ−２９３Ａ細胞に段階希釈液を感染させることによってウイルスの力価を測定し、かつ０．３％アガロース、１０％ＦＢＳ、および１×ＤＭＥＭからなるオーバーレイの下でプラークを計数した。
【００３２】
（実施例２）ＢＡＬ液中の細胞数に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
８〜１０週齢であり、かつマウスに特異的な病原体を有していないメスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、Korean Research Institute of Chemistry Technology（韓国化学技術研究所）（デジョン（大田）、韓国）から入手した。実験の間ずっと、層流式キャビネット中にこれらのマウスを収容し、かつ標準的な実験用固形飼料を自由に与えて飼育した。本研究において使用したすべての実験動物は、Chonbuk National University Medical School（全北大学校医学部）のInstitutional Animal Care and Use Committee（研究機関の動物管理使用委員会）によって承認されたガイドラインに従って処置した。
【００３３】
１日目および１４日目に、総体積２００μｌの、水酸化アルミニウム（Pierce Chemical Co., Rockford、イリノイ州、米国）１ｍｇ中に乳化させた卵白アルブミン（ＯＶＡ）（Sigma-Aldrich, St. Louis, ミズーリ州、米国）２０μｇを腹腔内注射することによって、マウスを感作した。初回感作後、２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２；オムロン、東京、日本）を用いて、生理食塩水中３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＯＶＡのエアロゾルを１日当たり３０分間マウスに投与した。対照のマウスにはＯＶＡの代わりに生理食塩水を投与した。２１日目（ＯＶＡ気道投与の１時間前）および２３日目（気道投与の３時間後）に、Ａｄベクター（１０９ペスト形成単位（plague-forming units））を気管内投与した。対照マウスには生理食塩水を投与した。この投与プロトコールの概略図を図１に示す。このプロトコールにより、５種の実験群、すなわち、ＳＡＬ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＡｄＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３、ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３、およびＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺが得られた。
【００３４】
最終の気道投与の７２時間後に、各実験群から６匹のマウスに対して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。洗浄の際、過量のナトリウムペントバルビトン（ペントバルビタールナトリウム、１００ｍｇ／ｋｇ体重、腹腔内投与）を用いてこれらのマウスを屠殺した。胸腔を露出させて膨張できるようにし、その後、気管に注意深く挿管し、かつ結紮糸でカテーテルを固定した。予熱した０．９％ＮａＣｌ溶液をゆっくりと肺に注入し、かつ回収した。ＢＡＬ分取物をプールし、かつ４℃で保存した。次いで、各プールの一部分を遠心分離し、かつ使用するまで上清を−７０℃で保存した。
【００３５】
血球計数器を用いて全細胞数を計数した。サイトスピン（Shandon Scientific Ltd., Cheshire、英国）によって、ＢＡＬ細胞の塗抹標本を調製した。細胞の差を検査するために、これらの塗抹標本をDiff-Quik溶液（Dade Diagnostics of Puerto Rico Inc., Aguada、プエルト・リコ）で染色した。無関係な盲検化された研究者２名が顕微鏡を用いてこれらの細胞を計数した。異なるランダムな４つの場所それぞれにおいて、約４００個の細胞を計数した。研究者間の結果の差異は５％未満であった。２名の研究者から得られた値の平均値を各細胞数として使用した。
【００３６】
ＢＡＬ液中の全細胞、好酸球、リンパ球、および好中球の数は、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に増加していた（図２、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けたＢＡＬ液中の各細胞型の数は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に減少した（図２、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。ＡｄＬａｃＺの投与は、細胞数に対して影響を与えなかった。
【００３７】
（実施例３）ＯＶＡによって誘発された喘息の病理に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
実施例２において説明したＢＡＬ処置に続いて、マウスから肺を切除した。切除する前に、気管の周りの結紮糸を用いて、気管内から、固定液（０．８％ホルマリン、４％酢酸）で肺および気管を満たした。１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリンで肺組織を固定した。標本を脱水し、かつパラフィンに包埋した。組織学的検査のために、Leicaモデル２１６５回転式ミクロトーム（Leica, Nussloch, ドイツ）上で固定した包埋組織の４μｍ切片を切断し、スライドガラス上に置き、脱パラフィンし、かつヘマトキシリン２およびエオシン−Ｙ（Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, ミシガン州）で順次染色した。
【００３８】
組織学的検査により、ＯＶＡに曝露されたマウスにおける喘息の典型的な病理学的特徴が明らかになった。好酸球を含む多数の炎症細胞が、ＯＶＡによる誘発に応答して、細気管支の周囲に浸潤していた（図３、パネルＡ（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）およびパネルＢ（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）を比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの細気管支周囲領域および血管周囲領域において、炎症細胞の浸潤が著しく低減した（図３、パネルＣ（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）およびパネルＤ（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３））。ＡｄＬａｃＺの投与には、効果がなかった（図３Ｅ）。
【００３９】
無関係な盲検化された研究者３名によって、各組織学的標本に炎症スコアを割り当てた。別の文献で説明されているように（Tournoy ２０００）、気管支周囲および血管周囲の炎症の程度を０〜３の主観的尺度に基づいて評価した。検出可能な炎症が無い場合は値０を割り当て、炎症細胞を伴う袖口様白血球集合（cuffing）がところどころある場合は値１を割り当て、大半の気管支または血管が炎症細胞の薄層（１〜５個の細胞）で取り囲まれている場合は値２を割り当て、かつ、大半の気管支または血管が炎症細胞の厚い層（５個より多い細胞）で取り囲まれている場合は値３を割り当てた。
【００４０】
気管支周囲、血管周囲、および肺全体の炎症スコアは、ＯＶＡによる誘発を受けた標本において有意に増加していた（図４、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。３箇所のスコアはすべて、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けた標本において有意に減少していた（図４、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍＩＧＦＢＰ−３」）。これらの結果は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３が、好酸球の流入を含めて、抗原に誘発された肺炎症を抑制することを示唆する。
【００４１】
（実施例４）ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
タンパク質抽出物を得るために、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、肺組織をホモジナイズした。Bradford試薬（Bio-Rad）を用いてタンパク質濃度を測定した。試料（１レーン当たりタンパク質３０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加した。１２０Ｖで９０分間電気泳動した後、分離されたタンパク質を、ウェットトランスファー法（２５０ｍＡ、９０分）によってポリビニリデンジフルオリド膜（Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, ニュージャージー州）上に移した。非特異的な部位は、ＴＢＳＴ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中５％脱脂粉乳で１時間ブロッキングし、その後、４℃で一晩、抗ＩＬ−４抗体（Serotec Ltd、Oxford、英国）、抗ＩＬ−５抗体、または抗ＩＬ−１３抗体（R&D Systems,Inc. Minneapolis、ミネソタ州）とともに、ブロットをインキュベートした。抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ＩｇＧを用いて、抗体結合を検出した。メンブレンをストリップし、かつ、抗アクチン抗体（Sigma Aldrich）で再ブロットして、各レーンにおけるタンパク質のロード量が等しいことを確認した。高感度ケミルミネッセンスシステムの試薬（Amersham Pharmacia Biotech）で処理した後、写真フィルムに露光させることによって、特異的抗体の結合を可視化した。
【００４２】
ウェスタンブロット解析により、肺組織におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３サイトカインのレベルが、ＯＶＡによる誘発後に有意に上昇していることが明らかになった（図５、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の各サイトカインのレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって著しく低下した（図５、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」）。
【００４３】
製造業者のプロトコール（ＩＬ−４およびＩＬ−５はEndogen,Inc., Woburn, マサチューセッツ州、米国から入手；ＩＬ−１３は、R&D Systems,Inc., Minneapolis、ミネソタ州、米国から入手）に従って酵素イムノアッセイを実施して、ＢＡＬ液の上清中のＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルを定量した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３アッセイの感度は、それぞれ５ｐｇ／ｍｌ、５ｐｇ／ｍｌ、および１．５ｐｇ／ｍｌであった。
【００４４】
酵素イムノアッセイは、ウェスタンブロット解析から得られた結果と一致していた。ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルは、ＯＶＡによる誘発を受けた被検体（図６、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）に由来するＢＡＬ液中で上昇しており、かつ、この上昇は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図６、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」を参照されたい）。
【００４５】
（実施例５）ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現レベルを、実施例４で説明したように、ウェスタンブロット法によって測定した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図７Ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図７Ａ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４６】
ＢＡＬ液中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ウェスタンブロット解析の結果と一致して、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現は、ＯＶＡによる誘発後に増加しており（図７Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」）、かつ、この増加は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図７Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４７】
（実施例６）ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織における血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）および細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の発現レベルを、実施例４で説明したようにウェスタンブロット法によって測定し、かつ、デンシトメトリー解析によって定量した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図８Ａおよび８Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図８Ａおよび８Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３」）。
【００４８】
（実施例７）エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
肺組織におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現レベルを、実施例４で説明したように、ウェスタンブロット法によって測定した。両方のタンパク質のレベルが、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に上昇していた（図９Ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けた組織中の両タンパク質のレベルは、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低下した（図９Ａ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ３」）。
【００４９】
ＢＡＬ液中のエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ウェスタンブロット解析の結果と一致して、エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳの発現は、ＯＶＡによる誘発後に増加しており（図９Ｂ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」）、かつ、この増加は、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３の投与によって有意に低減された（図９Ｂ、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００５０】
（実施例８）気道反応性亢進に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
以前に説明されているようにして（Lee ２００２）、最終誘発後３日目に、無拘束かつ意識のある状態で、マウスの気道反応性を測定した。バロメトリックプレチスモグラフィーのチャンバー（All Medicus Co., Seoul，韓国）にマウスを入れ、かつ、３分間、基線の指示値を記録し、平均した。同時に、濃度を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）エアロゾル化したメタコリンを、３分間、メインチャンバーの入口から噴霧した。各噴霧の後、３分間、指示値を記録し、平均した。肺抵抗（製造業者のプロトコールに従って、（呼気時間／休止時間−１）×（最大呼気流量／最大吸気流量）として算出されるＰｅｎｈ）は、最大吸気の箱圧力信号に対する最大呼気の箱圧力信号の比率の関数であり、かつ、呼気のタイミングの関数である、無次元の値である。基線のＰｅｎｈの増加率を用いて、段階的に上げたメタコリン濃度での気道反応性を評価した。基線のＰｅｎｈ（生理食塩水の投与後）を１００％として表した。
【００５１】
基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいて左に移動し（図１０、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）、これにより、ＯＶＡによる誘発後の気道反応性亢進が示唆された。濃度を段階的に上げたメタコリンを投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスおよび対照マウスの両方において、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントが増加し、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの方が、試験した各メタコリン濃度で、対照マウスより高い、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントを示した（図１０、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３またはｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与すると、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、未処置のＯＶＡによる誘発を受けたマウスに比べて右に移動した（図１０、「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」、「ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３」、および「ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３」を比較されたい）。
【００５２】
（実施例９）正常な肺組織およびＯＶＡによる誘発を受けた肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現：
ＩＧＦＢＰ−３抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, カリフォルニア州）を用いて、実施例４で説明したように、肺タンパク質抽出物に対してウェスタンブロット解析を実施した。内因性ＩＧＦＢＰ−３の発現は、正常な肺組織と比べて、ＯＶＡによる誘発を受けた肺組織において有意に減少していた（図１１ａ、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。ＩＧＦＢＰ−３レベルは、ＯＶＡによる誘発後、時間とともに減少したが、対照細胞においては有意な変化を示さなかった（図１１ｂ、様々な時点の「（ＯＶＡ）ＩＧＦＢＰ−３」および「（生理食塩水）ＩＧＦＢＰ−３」を比較されたい）。ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与されたマウスにおいてＩＧＦＢＰ−３の発現の増加が観察されて、アデノウイルス遺伝子導入技術が確認された（図１１ａ、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３」）。
【００５３】
（実施例１０）正常な肺組織およびＯＶＡによる誘発を受けた肺組織におけるＩＧＦ−１発現：
ＢＡＬ液中のＩＧＦ−１の発現レベルを、実施例４で説明したように、酵素イムノアッセイによって測定した。ＩＧＦ−１のレベルは、ＯＶＡによる誘発後１時間目、６時間目、２４時間目、４８時間目、および７２時間目に有意に上昇していた（図１２Ａ、「ＰＲＥ」を「１時間目」、「６時間目」、「２４時間目」、「４８時間目」、および「７２時間目」と比較されたい）。生理食塩水の吸入後には、ＩＧＦ−１レベルの有意な変化は観察されなかった。
【００５４】
（実施例１１）肺組織および気管上皮細胞における免疫反応性ＩＧＦＢＰ−３の所在：
肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３の所在を組織学的解析によって観察した。ＩＧＦＢＰ−３は、対照マウスの細気管支の周囲の上皮層に局在していたが、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいては消失した（図１３、ＡおよびＢを比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を気管内投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現が回復したのに対し、ＡｄＬａｃＺを投与しても効果はなかった（図１３、ＣおよびＤを比較されたい）。
【００５５】
気管上皮細胞におけるＩＧＦＢＰ−３の所在を組織学的解析によって観察した。マウス気管上皮細胞を無菌状態下で単離した。気管分岐部の近位側の気管を切除し、かつ付着した脂肪組織を除去した。気管を縦方向に切開し、３つの部分に切断し、かつ０．１％プロテアーゼを含むＤＭＥＭ中で、４℃で一晩インキュベートした。組織を消化した後、酵素を不活性化するために、ＦＢＳ（最終濃度１０％）を媒体に添加した。未消化の組織断片を除去し、かつ、５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離によって、気管上皮細胞を回収した。これらの細胞を、液内培養用のコラーゲンでコーティングされた３５ｍｍシャーレ上に播種した。１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢを含む増殖培地ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Sigma-Aldrich）に、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ホスホエタノールアミン、コレラ毒素、エタノールアミン、ウシ脳下垂体抽出物、およびＢＳＡを添加した。細胞が接着するまで、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で細胞を維持した。
【００５６】
ＩＧＦＢＰ−３は対照マウスの気管上皮細胞に局在していたが、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいては著しく減少していた（図１３、ＥおよびＦを比較されたい）。ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を気管内投与すると、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現が回復したのに対し、ＡｄＬａｃＺを投与しても効果はなかった（図１３、ＧおよびＨを比較されたい）。
【００５７】
（実施例１２）ＢＡＬ液中の細胞数に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果：
１日目および１４日目に、総体積２００μｌの、水酸化アルミニウム１ｍｇ中に乳化させたＯＶＡ２０μｇを腹腔内注射することによって、マウスを感作した。初回感作後、２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザー（ＮＥ−Ｕ１２）を用いて、生理食塩水中３％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＯＶＡのエアロゾルを１日当たり３０分間マウスに投与した。対照のマウスにはＯＶＡの代わりに生理食塩水を投与した。２１日目（ＯＶＡ気道投与の１時間前）および２３日目（気道投与の３時間後）に、組換えＩＧＦＢＰ−３を投与した。対照マウスには生理食塩水を投与した。このプロトコールにより、４種の実験群、すなわち、ＳＡＬ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＳＡＬ、ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ、およびＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇが得られた。
【００５８】
実施例２で説明したように、最終の気道投与の７２時間後に、各実験群から１０匹のマウスに対してＢＡＬを実施した。無関係な盲検化された研究者２名が顕微鏡を用いてＢＡＬ塗抹標本を検査した。２名の研究者から得られた値の平均値を各細胞数として使用した。
【００５９】
ＢＡＬ液中の全細胞、好酸球、リンパ球、および好中球の数は、ＯＶＡによる誘発後７２時間目に有意に増加していた（図１４、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）。組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇの投与により、全細胞、リンパ球、好中球、および好酸球は減少した（図１４、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ」）。組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇの投与により、これらの各細胞型はさらに大幅に減少し、かつ、マクロファージの数も減少した（図１４、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ」）。
【００６０】
（実施例１３）気道反応性亢進に対する組換えＩＧＦＢＰ−３の効果：
実施例８で説明したように、最終誘発後３日目に、実施例１２から得られるマウスにおいて、気道反応性を測定した。基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいて左に移動し（図１５、「ＳＡＬ＋ＳＡＬ」および「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」を比較されたい）、これにより、ＯＶＡによる誘発後の気道の反応性亢進が示唆された。さらに、メタコリン濃度の上昇に対応した、基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの増加は、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおいてより大きかった。基線Ｐｅｎｈに対するパーセントの用量反応曲線が右に移動することによって示されるように、組換えＩＧＦＢＰ−３の投与により、気道反応性亢進は軽減された（図１５、「ＯＶＡ＋ＳＡＬ」、「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３ １μｇ」、および「ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ」を比較されたい）。
【００６１】
上述したように、前述の内容は、本発明の様々な実施形態を例示するためのものであるにすぎない。上記の個々の修正は、本発明の範囲に対する制約として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な均等物、変更、および修正を実施できることが当業者には明らかになると考えられ、かつ、そのような均等な実施形態が本明細書に含まれるべきであることが理解される。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実験プロトコールの概略図である。水酸化アルミニウム１ｍｇ中に乳化させたＯＶＡを腹腔内注射することによって、１日目および１４日目にマウスを感作した。初回感作後２１日目、２２日目、および２３日目に、超音波ネブライザーを用いて、生理食塩水中３％（ｗ／ｖ）ＯＶＡのエアロゾル（または対照としての生理食塩水）を３０分間マウスに投与した。Ａｄベクターを用いた処置の場合、処置される各動物に２回、すなわち、２１日目（初回のＯＶＡ気道投与の１時間前）に１回目、および２３日目（最終のＯＶＡ気道投与の３時間後）に２回目を気管内投与した。
【図２】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＢＡＬ液中の全細胞構成要素および差次的な細胞構成要素に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。最終誘発後７２時間目に、対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）に由来するＢＡＬ液の各細胞構成要素の数を計数した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図３】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織における病理学的変化に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した代表的な肺切片。標本採取は、最終誘発後７２時間目に実施した。Ａ．対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）。Ｃ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）。Ｄ．ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）。Ｅ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）。バーは、５０μｍのスケールを示す。
【図４】気管支周囲および血管周囲の肺炎症に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、気管支周囲、血管周囲、および全体の肺炎症を測定した。全体の肺炎症は、気管支周囲および血管周囲の炎症スコアの平均として定義した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図５】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３タンパク質発現に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、ウェスタンブロットによって、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３の発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。
【図６】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＩＬ−４、１Ｌ−５、およびＩＬ−１３のレベルに対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、イムノアッセイによって、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３のレベルを測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図７】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現を、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βタンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図８】ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＶＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１タンパク質発現を、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織において、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、生理食塩水を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ウェスタンブロットの結果を、アクチンに対するＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の相対比に基づくデンシトメトリー解析によって定量した。ＳＡＬ＋ＳＡＬマウスにおけるＶＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１の相対比を任意に１として示す。データは、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図９】エオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質の発現に対するＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。Ａ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質発現を、ウェスタンブロット法によって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるエオタキシンおよびＲＡＮＴＥＳタンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、発現を測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１０】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおける気道反応性に対する、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３およびｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＷＴ−ＩＧＦＢＰ−３）、ｍ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ｍ−ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）において、最終誘発後７２時間目に、気道反応性を測定した。エアロゾル投与されたメタコリンに対する気道反応性を、意識のある無拘束マウスにおいて測定した。マウスに生理食塩水を噴霧投与し、次いで、１回に３分間、用量を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）メタコリンを噴霧投与した。各噴霧の後、３分間、呼吸パラメーターの指示値を記録し、その間にＰｅｎｈ値を決定した。データは、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１１】ＯＶＡによる誘発後の肺組織におけるＩＧＦＢＰ−３発現を示す図である。Ａ．対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ−３）、およびＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＡｄＬａｃＺ）におけるＩＧＦＢＰ−３発現をウェスタンブロットによって測定した。６回の独立した実験における結果は同様であった。Ｂ．誘発後の様々な時点に、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（（ＯＶＡ）ＩＧＦＢＰ−３）および対照マウス（（生理食塩水）ＩＧＦＢＰ−３）におけるＩＧＦＢＰ−３発現をウェスタンブロットによって測定した。１０回の独立した実験における結果は同様であった。
【図１２】ＯＶＡによる誘発後のＢＡＬ液におけるＩＧＦ−１発現を示す図である。ＯＶＡによる誘発を受けたマウスのＢＡＬ液におけるＩＧＦ−１タンパク質発現を、酵素イムノアッセイによって測定した。対照マウス（ＳＡＬ）およびＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ）における発現を、誘発の前（ＰＲＥ）、ならびに最終誘発後１時間目、６時間目、２４時間目、および４８時間目、７２時間目に測定した。棒は、６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、Ｐｒｅに対してＰ＜０．０５であることを表す。アッセイの感度は３．５ｐｇ／ｍｌであった。
【図１３】肺組織および気管上皮細胞におけるＩＧＦＢＰ−３タンパク質の免疫組織化学的解析を示す図である。濃褐色は、ＩＧＦＢＰ−３陽性細胞を示す。バーは、５０μｍのスケールを示す。Ａ．対照マウスの肺組織。Ｂ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｃ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｄ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの肺組織。Ｅ．対照マウスの気管上皮細胞。Ｆ．ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。Ｇ．ＷＴ−ＡｄＩＧＦＢＰ−３を投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。Ｈ．ＡｄＬａｃＺを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウスの気管上皮細胞。
【図１４】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおけるＢＡＬ液中の全細胞構成要素および差次的な細胞構成要素に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。最終誘発後７２時間目に、対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １μｇ）、および組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ）に由来するＢＡＬ液の各細胞構成要素の数を計数した。棒は、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【図１５】ＯＶＡによる誘発を受けたマウスにおける気道反応性に対する組換えＩＧＦＢＰ−３投与の効果を示す図である。対照マウス（ＳＡＬ＋ＳＡＬ）、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＳＡＬ）、組換えＩＧＦＢＰ−３ １μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １μｇ）、および組換えＩＧＦＢＰ−３ １０μｇを投与された、ＯＶＡによる誘発を受けたマウス（ＯＶＡ＋ＩＧＦＢＰ３ １０μｇ）において、最終誘発後７２時間目に、気道反応性を測定した。エアロゾル投与されたメタコリンに対する気道反応性を、意識のある無拘束マウスにおいて測定した。マウスに生理食塩水を噴霧投与し、次いで、１回に３分間、用量を段階的に上げた（２．５〜５０ｍｇ／ｍｌ）メタコリンを噴霧投与した。各噴霧の後、３分間、呼吸パラメーターの指示値を記録し、その間にＰｅｎｈ値を決定した。データは、１０回の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。＃は、ＳＡＬ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表し、＊は、ＯＶＡ＋ＳＡＬに対してＰ＜０．０５であることを表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項２】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記状態が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内因性ＩＧＦＢＰ−３の産生を増大させる１種または複数種の作用物質を投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項６】
外因性ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドまたはその類似体を投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項７】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、閉塞性呼吸器障害を治療する方法。
【請求項９】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記状態が喘息である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、下部呼吸器組織の炎症を軽減する方法。
【請求項１３】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記状態が喘息である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
正常な被検体のＩＧＦＢＰ−３の発現レベルと比較して、ある被検体のＩＧＦＢＰ−３の発現レベルを検出するステップを含む、気道反応性亢進に関連した状態を有するかまたは気道反応性亢進に関連した状態の素因を有する被検体を、診断する方法。
【請求項１】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項２】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記状態が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
内因性ＩＧＦＢＰ−３の産生を増大させる１種または複数種の作用物質を投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項６】
外因性ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドまたはその類似体を投与するステップを含む、被検体の気道反応性亢進に関連した状態を治療する方法。
【請求項７】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、閉塞性呼吸器障害を治療する方法。
【請求項９】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記状態が喘息である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＧＦＢＰ−３またはその類似体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを投与するステップを含む、下部呼吸器組織の炎症を軽減する方法。
【請求項１３】
前記類似体がＧＧＧ−ＩＧＦＢＰ−３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベクターがアデノウイルスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記状態が喘息である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
正常な被検体のＩＧＦＢＰ−３の発現レベルと比較して、ある被検体のＩＧＦＢＰ−３の発現レベルを検出するステップを含む、気道反応性亢進に関連した状態を有するかまたは気道反応性亢進に関連した状態の素因を有する被検体を、診断する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００８−５３００８１（Ｐ２００８−５３００８１Ａ）
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５４６８０（Ｐ２００７−５５４６８０）
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１１２５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５２２６
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０８１４３７６４）バイオキュア ファーマ エルエルシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＵＲＥ ＰＨＡＲＭＡ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１０日（２００６．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００１１２５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８５２２６
【国際公開日】平成１８年８月１７日（２００６．８．１７）
【出願人】（５０８１４３７６４）バイオキュア ファーマ エルエルシー (1)
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＣＵＲＥ ＰＨＡＲＭＡ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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