インターフェロン療法の効果予測方法及び予測用キット
【課題】Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測できる技術を提供する。
【解決手段】被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における特定のマーカー物質の濃度を指標として、当該被験者がインターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する。体液の例としては血液が挙げられる。イオン交換体や金属キレート体を固定化した基板等の担体にマーカー物質を捕捉し、質量分析によってマーカー物質の濃度を測定することができる。当該方法を簡便に実施できるキットも提供される。
【解決手段】被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における特定のマーカー物質の濃度を指標として、当該被験者がインターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する。体液の例としては血液が挙げられる。イオン交換体や金属キレート体を固定化した基板等の担体にマーカー物質を捕捉し、質量分析によってマーカー物質の濃度を測定することができる。当該方法を簡便に実施できるキットも提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターフェロン療法の効果予測方法及び予測用キットに関する。本発明のインターフェロン療法の効果予測方法は、インターフェロン療法終了後にＣ型肝炎ウイルスが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者と、Ｃ型肝炎ウイルスが再燃することなく効果が持続するＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別できるものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus。以下、「ＨＣＶ」と略記する。）の感染により発病するウイルス性肝炎である。Ｃ型肝炎は特別な症状が起こることなく徐々に進行し、治療せずにおくと１０〜３０年かけて肝硬変、さらに肝臓癌へと移行することが多い。
【０００３】
Ｃ型肝炎の治療法として、従来より、インターフェロンの投与（インターフェロン療法）が行なわれている。インターフェロンにはＨＣＶの増殖を抑える作用があり、治療が成功すれば、ＨＣＶは体内から消失する。しかし、インターフェロンの単独投与（インターフェロン単独療法）が有効なＣ型肝炎患者は限定的であることがわかっている。そこで、インターフェロンと別の抗ウイルス剤であるリバビリンとの併用投与（インターフェロン・リバビリン併用療法）が開発され、インターフェロン単独療法に比較して高い効果をあげている。しかしながら、インターフェロン・リバビリン併用療法によっても治療効果が認められないＣ型肝炎患者はなお多い。
【０００４】
インターフェロンは、生体内で産生される生理活性物質の一つであり、抗ウイルス作用や抗ガン作用を有することが知られている。インターフェロンには、α、β、γの主要なサブタイプがあり、このうち、Ｃ型肝炎の治療に用いられているのはαとβである。一方、リバビリン（Ribavirin，1-β-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide）は、プリン骨格をもつ核酸アナログの一種であり、内服の抗ウイルス剤としてインフルエンザ、ヘルペス、麻疹等の治療に古くから用いられている。しかし、リバビリンの単独投与はＣ型肝炎の治療にほとんど効果がなく、リバビリンはインターフェロンと併用することでＨＣＶの排除効果を高める効果を発揮する。
【０００５】
インターフェロン療法によりＣ型肝炎の治療を行なう場合は、４０週程度の長期にわたる投与が必要である。しかし、インターフェロンには発熱、全身倦怠感、関節痛等の副作用があり、長期投与による患者の身体的負担は大きい。さらに、インターフェロンは高価な医薬であり、経済的負担も大きい。また、インターフェロン・リバビリン併用療法を行なう場合は、インターフェロン投与と同じ期間のリバビリン投与が必要であるが、リバビリンにも溶血を起こす副作用があり、患者の身体的・経済的負担はさらに大きい。そして、インターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法による治療効果が得られないＣ型肝炎患者にとっては、これらの療法は副作用を引き起こすだけであり、何ら利益はない。したがって、Ｃ型肝炎患者に対するインターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法の効果を治療開始前に予測し、治療効果が期待できない患者をこれらの療法の対象から外すことが望ましい。
【０００６】
インターフェロン療法が成功するか否かについては、ウイルス側の要因と患者側の要因の２つが関与しているといわれている。ウイルス側の要因としては、ＨＣＶの遺伝子型とＨＣＶの量の関与が指摘されている。すなわち、ＨＣＶには複数の遺伝子型があり、遺伝子型が１ａ、１ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きにくく、それ以外の、例えば遺伝子型が２ａ、２ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きやすい。また、ＨＣＶの量が多いほどインターフェロンが効きにくい。そして、感染しているＨＣＶのタイピング（特許文献１）や、コア領域の変異検出（特許文献２）を行って、インターフェロン療法の効果を予測する方法が提案されている。一方、患者側の要因に着目した技術として、一塩基多型（ＳＮＰ）（特許文献３，４）、肝臓におけるインターフェロンレセプターの発現量（特許文献５）、血液中の特定のタンパク質の濃度（特許文献６）、を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する方法が提案されている。
【０００７】
一方、インターフェロン療法の効果判定については、より細かい分類に基づいて行われている（非特許文献１）。すなわちウイルス学的効果については、治療開始１２週目、治療終了時、および治療終了後２４週目の３段階でＨＣＶ−ＲＮＡを測定する。そして、治療開始１２週目におけるＨＣＶの陰性化（early virological response；ＥＶＲ）、治療終了時におけるＨＣＶの陰性化（end-of-treatment response；ＥＴＲ）、および治療終了後２４週目におけるＨＣＶの陰性化（sustained virological response；ＳＶＲ）について評価する。ここで、治療終了後２４週目の評価が最も重要とされており、この段階におけるＨＣＶ−ＲＮＡ陰性（ＳＶＲ）を「著効」、陽性を無効と判定する。さらに無効例を「再燃」（relapse）と「無反応」（non-response；ＮＲ）に分類する。「再燃」は治療終了時にＨＣＶ−ＲＮＡが陰性であった無効例、「無反応」（ＮＲ）は治療終了時にＨＣＶ−ＲＮＡが陽性であった無効例である。「無反応」に分類される患者は、インターフェロン療法の対象として適していないことになる。
【０００８】
インターフェロン療法によって「著効」（ＳＶＲ）を示す患者とＨＣＶが「再燃」する患者は、いずれもインターフェロン療法の対象として適当であるが、それぞれに適した治療計画が必要とされる。「著効」を示す患者についてはインターフェロン療法を積極的に受療することが効果的であり、それにより肝臓癌の発生率を抑えることが可能となる。一方、ＨＣＶが「再燃」する患者についてはインターフェロン投与を中断せずに長期投与することが効果的であり、それにより肝臓癌の発生率を抑えることが可能となる。
【０００９】
ところが、あるＣ型肝炎患者がインターフェロン療法によって「著効」を示す者であるか、ＨＣＶが「再燃」する者であるかを治療開始前に予測する技術がなく、インターフェロン療法を行う上での障害になっている。例えば、ＨＣＶが再燃する患者に対してインターフェロン投与を一定期間行った後に中断してしまい、その結果、ＨＣＶが再燃し、治療成績を下げる一因となっている。従来技術は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な患者とそれ以外の患者とを判別するものであり、「著効」（ＳＶＲ）を示す患者とＨＣＶが「再燃」（relapse）する患者とを判別するものではない。
【００１０】
なお、特許文献１〜４に開示されている技術では、いずれも患者から採取した検体からＤＮＡやＲＮＡを調製する必要があり、操作が煩雑である。また一般に、ＨＣＶの型や量をもって判定する場合は、インターフェロンが効き易いか効き難いかの大まかな判定しかできない。また特許文献５に開示されている技術では、検体として肝組織を採取する必要があり、侵襲を伴う。
【００１１】
なお、インターフェロン療法はＣ型肝炎患者のみならず、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者（ＨＣＶキャリア）に対して効果がある。すなわち、インターフェロン療法が成功すれば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者からＨＣＶが消失する。
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−２３８６８７号公報
【特許文献２】特開２００７−４３９８５号公報
【特許文献３】特開２００３−３３９３８０号公報
【特許文献４】特開２００４−２９８０１１号公報
【特許文献５】特開２００１−１４９０７６号公報
【特許文献６】国際公開第２００６／１０７０７８号パンフレット
【非特許文献１】社団法人日本肝臓学会編「慢性肝炎の治療ガイド２００６」２００６年１月１１日発行，ｐ．２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者と、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができる一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１つの様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００１５】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標とするものである。そして、マーカー物質として上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のうちの少なくとも１つを用いる。本様相の方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測することができる。また本様相の方法は、一般の臨床検査と同様に患者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速である。
【００１６】
本明細書において「インターフェロン療法」とは、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者にインターフェロンを投与してＨＣＶの排除を図る抗ウイルス療法を指すものとする。「インターフェロン療法」には、インターフェロン単独療法（インターフェロンの単独投与）の他に、インターフェロンと他の薬剤との併用療法、例えばインターフェロン・リバビリン併用療法（インターフェロンとリバビリンの併用投与）も含まれる。また、投与されるインターフェロンには、天然型インターフェロンの他に、ポリエチレングリコールが付加されたインターフェロン（ＰＥＧインターフェロン）のような誘導体も含まれる。
【００１７】
質量／電荷比の「約７７８０」、「約９３００」、「約５１３００」、「約１２５０００」等は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、約７７８０は概ね７７８０±０．２％、約９３００は概ね９３００±０．２％、約５１３００は概ね５１３００±０．２％、約１２５０００は概ね１２５０００±０．２％を指す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）の濃度は、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において高値を示し、インターフェロン療法によって著効を示すと予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において低値を示す。一方、マーカー物質（Ａ４）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。
【００１８】
好ましくは、下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【００１９】
血小板第４因子（Platelet Factor 4）、結合組織活性化ペプチド３（Connective tissue-activating peptide 3）、及び、ビタミンＤ結合タンパク質（Vitamin D Binding Protein）はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）の解析が容易である。
【００２０】
本明細書において「タンパク質の修飾体」という用語は、種々の意味に用いられる。「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼ等による切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。逆に、単量体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはその２量体等の多量体も含まれるものとする。
【００２１】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【００２２】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、上記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つを用いる。本様相の方法によっても、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測することができる。また本様相の方法も、一般の臨床検査と同様に患者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速である。さらに、血小板第４因子、結合組織活性化ペプチド３、及び、ビタミンＤ結合タンパク質は、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質の解析が容易である。なお「タンパク質の修飾体」については上述したとおりである。
【００２３】
好ましくは、前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００２４】
この好ましい様相では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができるマーカー物質である。本様相の方法によれば、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除できるので、予測の精度が高い。
【００２５】
なお、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）なＣ型肝炎ウイルス持続感染者「以外」のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とは、結局、インターフェロン療法終了時にＨＣＶの陰性化（ＥＴＲ）を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者のことである。当該のＣ型肝炎ウイルス持続感染者は、インターフェロン療法によって「著効」（ＳＶＲ）を示す者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが「再燃」（relapse）する者の両方を含んでいる。
【００２６】
ここで、質量／電荷比の「約３３６０」、「約８６１０」、「約１３９００」、「約２８１００」等は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、約３３６０は概ね３３６０±０．２％、約８６１０は概ね８６１０±０．２％、約１３９００は概ね１３９００±０．２％、約２８１００は概ね２８１００±０．２％を指す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、及び（Ｂ８）は、インターフェロン療法に対して「無反応」と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において低値を示し、それ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において高値を示す。一方、マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、及び（Ｂ１１）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。
【００２７】
好ましくは、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００２８】
アポリポタンパク質Ａ１（Apolipoprotein A1）、Ｃ１インヒビター（Plasma Protease C1 Inhibitor）、アポリポタンパク質Ｃ１（Apolipoprotein C1）、補体Ｃ４（Complement C4）、アポリポタンパク質Ａ２（Apolipoprotein A2）、及び、トランスサイレチン（Transthyretin）は、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ｂ１）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ７）、（Ｂ８）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）の解析が容易である。
【００２９】
好ましくは、前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００３０】
この好ましい様相では、上記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。（Ｄ１）〜（Ｄ６）に属するマーカー物質は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができるマーカー物質である。本様相の方法によっても、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除できるので、予測の精度が高い。さらに、アポリポタンパク質Ａ１、Ｃ１インヒビター、アポリポタンパク質Ｃ１、補体Ｃ４、アポリポタンパク質Ａ２、及び、トランスサイレチンは、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質の解析が容易である。なお「タンパク質の修飾体」については上述したとおりである。
【００３１】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００３２】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。本様相の方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な者であるか否かを予測することができる。本様相の方法は、例えば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する前の予備判定、すなわち１次スクリーニングに有用である。
【００３３】
好ましくは、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００３４】
アポリポタンパク質Ａ１、Ｃ１インヒビター、アポリポタンパク質Ｃ１、補体Ｃ４、アポリポタンパク質Ａ２、及び、トランスサイレチンは、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ｂ１）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ７）、（Ｂ８）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）の解析が容易である。
【００３５】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００３６】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、上記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。本様相の方法によっても、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な者であるか否かを予測することができる。本様相の方法も、例えば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する前の予備判定、すなわち１次スクリーニングに有用である。
【００３７】
好ましくは、前記体液は、血液である。
【００３８】
この好ましい様相によれば、検査材料を簡単に採取できるので、より簡便かつ迅速にＣ型肝炎ウイルス持続感染者におけるインターフェロン療法の効果を予測することができる。
【００３９】
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
【００４０】
この好ましい様相によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができる。その結果、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００４１】
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている。
【００４２】
この好ましい様相によれば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００４３】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。
【００４４】
この好ましい様相では、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体、金属キレート体又は抗体を用い、これらの物質を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体や金属キレート体の場合には各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合には、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００４５】
本発明のさらに他の様相は、本発明のインターフェロン療法の効果予測方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の効果予測用キットである。
【００４６】
本様相のインターフェロン療法の効果予測用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。本様相のキットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００４７】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。
【００４８】
この好ましい様相によれば、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のインターフェロン療法の効果予測方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であるかを予測することができる。その結果、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者に対してより適切なインターフェロン療法を施すことが可能となる。
【００５０】
本発明のインターフェロン療法の効果予測用キットによれば、インターフェロン療法によって著効を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であるかの予測を、より簡便かつ迅速に判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の１つの様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００５２】
これらのマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）は、いずれもインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法によって著効を示すと予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者との間で体液中における濃度が有意に差があるタンパク質である。マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。一方、マーカー物質（Ａ４）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。
【００５３】
１つの実施形態では、下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【００５４】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【００５５】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００５６】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。逆に、単量体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはその多量体も含まれるものとする。
【００５７】
これらの様相の方法の被験者となるＣ型肝炎ウイルス持続感染者については特に限定はなく、Ｃ型肝炎患者を含めた全てのＣ型肝炎ウイルス持続感染者が被験者となりうる。ただし、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除しておくと、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者と、ＨＣＶが再燃（relapse）する者との判別精度を上げることができる。インターフェロン療法に対して「無反応」と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を予め排除する方法としては特に限定はなく、公知の方法を採用することができるが、被験者の体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として選抜することが好ましい。すなわち、本発明の好ましい実施形態では、前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００５８】
これらのマーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外（ＥＴＲ）のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との間で体液中における濃度が有意に差があるタンパク質である。マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、及び（Ｂ８）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。一方、マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、及び（Ｂ１１）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。
【００５９】
この好ましい実施形態では、まず、（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つを指標として、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者がインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測される者であるか否かを判定する（予備判定）。次に、インターフェロン療法に対して「無反応」と予測される者でない（ＥＴＲ）と判定された被験者に対して（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標とし、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）すると予測される者のいずれであるかを判定する（本判定）。ただし、マーカー物質の濃度測定についてはこの順番で行う必要はなく、作業効率を考慮して適宜行えばよい。例えば、（Ａ１）〜（Ａ４）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の各マーカーの濃度を一度に測定し、各測定値を相互に照らし合わせることにより、予備判定と本判定とを行ってもよい。本実施形態では予備判定によって本判定の対象をあらかじめ絞り込むので、インターフェロン療法によって著効を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測される者との判別精度が特に高い。
【００６０】
１つの実施形態では、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００６１】
他の実施形態では、前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００６２】
「タンパク質の修飾体」の例については上述のとおりである。さらに具体的に例を挙げると、例えば、後述の実施例５で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ１（配列番号３６）のアミノ酸番号８１〜１０９の部分に相当するタンパク質断片（配列番号３７）は「アポリポタンパク質Ａ１の修飾体」に含まれる。また後述の実施例７で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ１のＣ末端側に相当する各タンパク質断片は「アポリポタンパク質Ａ１の修飾体」に含まれる。
【００６３】
後述の実施例６で示したような、ヒトＣ１インヒビター（配列番号３９）のアミノ酸番号４６７〜５００に相当するタンパク質断片（配列番号４０）は「Ｃ１インヒビターの修飾体」に含まれる。
【００６４】
後述の実施例８で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ｃ１（配列番号４５）のＮ末端側のアミノ酸２個が欠損したタンパク質断片（配列番号４６）は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
【００６５】
補体Ｃ４（配列番号９９）の断片である補体Ｃ４ａ（配列番号４９）は、「補体Ｃ４の修飾体」に含まれる。さらに、後述の実施例９に示したような、補体Ｃ４ａのＣ末端のＡｒｇが欠損したタンパク質断片（配列番号５０）は「補体Ｃ４の修飾体」に含まれる。配列番号５０のタンパク質断片は「補体Ｃ４ａの修飾体」とも換言できる。
【００６６】
後述の実施例１０に示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）にＣｙｓが付加したシステイニル化アポリポタンパク質Ａ２は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。また、アポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＧｌｎが欠損したタンパク質断片（配列番号５８）、さらに、当該タンパク質断片にＣｙｓが付加したもの（システイニル化アポリポタンパク質Ａ２の断片）は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００６７】
後述の実施例１２に示したように、アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）の２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。さらにアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）とＧｌｎ欠損アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）との組み合わせからなる２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。またさらに、Ｇｌｎ欠損アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）の２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００６８】
トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。後述の実施例１１に示したように、ヒトトランスサイレチン（配列番号６５）のＣｙｓ残基にＣｙｓが付加したシステイニル化トランスサイレチンは「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００６９】
マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、インターフェロン療法によって著効を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測される者とを判別する際の予備判定に有用なものであるが、単にインターフェロン療法に対して「無反応」と予測される者とそれ以外の者とを判別する目的に用いることもできる。（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する各マーカー物質についても同様である。
【００７０】
本発明において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を検査材料（測定試料）とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００７１】
本発明において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００７２】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００７３】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization；ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization；ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer；ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００７４】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合には、例えば、測定試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００７５】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合には、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００７６】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合；金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ；抗原と抗体、酵素と基質、ホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ；疎水性相互作用のような化学的な相互作用、などが挙げられる。
【００７７】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００７８】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。好ましくは、銅イオン結合金属キレート体が用いられる。
【００７９】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００８０】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００８１】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００８２】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板と、金属イオン基板とが好ましく用いられる。
【００８３】
本発明の方法によって被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者がインターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）すると予測される者のいずれであるかを実際に判定する手順の一例について、順を追って説明する。この例では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つを指標とする予備判定と、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標とする本判定とを行う。また、検査材料として血漿を用い、各マーカーの濃度測定はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって行う。
【００８４】
まず被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者から血液を採取し、検査材料となる血漿を調製する。この血漿をｐＨ９．０の条件でＱＡ等の強陰イオン交換樹脂カラムにアプライする。その後、ｐＨ９．０（素通り）、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．０、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０、及びｐＨ３．０の各溶出液で順次溶出し、最後に有機溶媒で溶出する。各溶出画分を確保する。
【００８５】
ｐＨ９．０の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板（弱陽イオン交換基板）に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ６）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ９．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換体を固定化した基板（強陰イオン交換基板）に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ４）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ９．０の画分を銅イオン金属キレート体を固定化した基板（銅イオン基板）に接触させ、次いで、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌの条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）が基板上に捕捉される。
【００８６】
ｐＨ５．０の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ１）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ５．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ２）及び（Ｂ２）が基板上に捕捉される。
【００８７】
ｐＨ４．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ３）、（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、及び（Ｂ１０）が基板上に捕捉される。
【００８８】
有機溶媒の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ３）が基板上に捕捉される。また、有機溶媒の画分を銅イオン基板に接触させ、次いで、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌの条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ８）及び（Ｂ１１）が基板上に捕捉される。
【００８９】
各基板をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、各マーカー物質に対応するイオンピークの強度を測定する。得られた各イオンピーク強度を基準値と比較する。基準値としては、例えばマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の場合には、インターフェロン療法によって著効を示すことが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿と、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃することが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を用いて、同様のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを予め行い、両者の値を比較して設定したカットオフ値を採用することができる。一方、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の場合には、インターフェロン療法に対して無反応であることが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿と、それ以外の者であることが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を用いて、同様のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを予め行い、両者の値を比較して設定したカットオフ値を採用することができる。この際の「著効」（ＳＶＲ）、「再燃」（relapse）、「無反応」（ＮＲ）、および「無反応以外」（ＥＴＲ）の確定診断については、例えば、血漿中のＨＣＶ濃度を元に行うことができる。
【００９０】
まず、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の測定結果を元に、予備判定を行う。具体的には、マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、又は（Ｂ８）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が小さいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定する。マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、又は（Ｂ１１）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が大きいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定する。ここで、（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の各マーカー物質については、１つだけを採用してもよいし、２つ以上を組み合わせて採用してもよい。
【００９１】
次に、予備判定で「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者を排除し、残った者を対象として、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の測定結果を元に本判定を行う。具体的には、マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、又は（Ａ３）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が大きいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者である」と判定する。一方、マーカー物質（Ａ４）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が小さいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者である」と判定する。ここで、（Ａ１）〜（Ａ４）の各マーカー物質については、１つだけを採用してもよいし、２つ以上を組み合わせて採用してもよい。
【００９２】
本判定で「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン投与を中断するとＨＣＶが再燃する可能性が高く、長期間のインターフェロン投与が効果的と予測される。一方、本判定で「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者」でないと判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン療法によって著効を示す可能性が高く、一定期間のインターフェロン投与が効果的と予測される。なお、予備判定で「インターフェロン療法に対して無反応な者」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン療法を行うべきか否かについて注意深く検討する必要がある。
【００９３】
本発明のインターフェロン療法の効果予測用キットは、上記したマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものである。好ましい実施形態では、マーカー物質に対する親和性を有する物質が、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。本実施形態のキットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、各マーカー物質の標準品、各種バッファー等を含めてもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００９４】
（キットの構成例）
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）銅イオン基板：１枚
（４）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ４．０）：適量
（５）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（６）基板洗浄用バッファーＣ（ｐＨ７．０；０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）：適量
（７）各マーカー物質の標準品：各適量
【００９５】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９６】
１．プロテインチップを用いたマーカー物質の検索
ＰＥＧインターフェロンα２ｂとリバビリンの４８週投与および投与後２４週の経過観察による「インターフェロンα・リバビリン併用療法」を受けたＣ型肝炎患者の治療前の血漿サンプルを収集した。患者の内訳は、著効（ＳＶＲ）を示した者（４８週投与終了時と投与後２４週目の両方においてＨＣＶ陰性）１０名、無反応（ＮＲ）であった者（４８週投与終了時においてＨＣＶ陽性）１０名、ＨＣＶが再燃（relapse）した者（４８週投与終了時においてＨＣＶ陰性、投与後２４週目においてＨＣＶ陽性）１２名とした。ＨＣＶ陰性化の確認は、血中におけるＨＣＶ（genotype 1b）数を測定することにより行なった。
【００９７】
各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ−Ｈｙｐｅｒ ＤＦ、バイオセプラ社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０のバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ８．０のバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ７．０のバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ６．０のバッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ５．０のバッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ４．０のバッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０のバッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（３３．３％ イソプロパノール、１６．７％ アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸からなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０、素通り）、画分２（ｐＨ８．０）、画分３（ｐＨ７．０）、画分４（ｐＨ６．０）、画分５（ｐＨ５．０）、画分６（ｐＨ４．０）、画分７（ｐＨ３．０）、画分８（有機溶媒）の８つの粗分画画分を得た。
【００９８】
得られた各画分１０μＬをｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０）で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、銅修飾チップＩＭＡＣ３０（バイオラッド社）に添加した。各プロテインチップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。
【００９９】
次に、各プロテインチップにエネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出した。これらの結果から、著効（ＳＶＲ）を示した者とＨＣＶが再燃（relapse）した者との間でイオンピーク強度に有意な差を示したイオンピークを４種選抜し、これらに対応するタンパク質を（Ａ１）〜（Ａ４）と命名した。同様に、無反応（ＮＲ）であった者とそれ以外（ＥＴＲ）の者との間でイオンピーク強度に有意な差を示したイオンピークを１１種選抜し、これらに対応するタンパク質を（Ｂ１）〜（Ｂ１１）と命名した。
【０１００】
２．マーカー物質（Ａ１）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が７７７７（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図１（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１（ｂ）にその箱髭図を示す。図１（ａ）中の横棒は平均値、図１（ｂ）中の髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．０２０、ＲＯＣ面積は０．７２であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７７８０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約７７８０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０１】
３．マーカー物質（Ａ２）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が９２９８（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図２（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図２（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．００８、ＲＯＣ面積は０．７２であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約９３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０２】
４．マーカー物質（Ａ３）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が５１３２１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図３（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図３（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．０４５、ＲＯＣ面積は０．７０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５１３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約５１３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０３】
５．マーカー物質（Ａ４）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１２５３５０（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で高値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で低値を示した。図４（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図４（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．００３、ＲＯＣ面積は０．７５であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１２５０００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１２５０００のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０４】
６．マーカー物質（Ｂ１）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３５６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図５（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図５（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０２８、ＲＯＣ面積は０．６７であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約３３６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０５】
７．マーカー物質（Ｂ２）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が３９６２（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図６（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図６（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．００００２、ＲＯＣ面積は０．８３であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３９６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約３９６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０６】
８．マーカー物質（Ｂ３）の特性
画分８（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４１５６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図７（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図７（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３１、ＲＯＣ面積は０．６８であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４１６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約４１６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０７】
９．マーカー物質（Ｂ４）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が６１９４（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図８（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図８（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．００６、ＲＯＣ面積は０．７０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６１９０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約６１９０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０８】
１０．マーカー物質（Ｂ５）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６５１１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図９（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図９（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０４９、ＲＯＣ面積は０．６４であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６５１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約６５１０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０９】
１１．マーカー物質（Ｂ６）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８６０８（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図１０（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１０（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３０、ＲＯＣ面積は０．６６であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８６１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約８６１０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１０】
１２．マーカー物質（Ｂ７）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８７１３（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示した。図１１（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１１（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０００８、ＲＯＣ面積は０．７５であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８７１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約８７１０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１１】
１３．マーカー物質（Ｂ８）の特性
画分８（有機溶媒）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３８８２（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図１２（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１２（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３７、ＲＯＣ面積は０．６６であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１３９００のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１２】
１４．マーカー物質（Ｂ９）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７２７１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図１３（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１３（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．０００１、ＲＯＣ面積は０．８０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１７３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１３】
１５．マーカー物質（Ｂ１０）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７４２４（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示した。図１４（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１４（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．００００００１、ＲＯＣ面積は０．９０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７４００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１７４００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１４】
１６．マーカー物質（Ｂ１１）の特性
画分８（有機溶媒）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２８０７６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図１５（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１５（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．０００４、ＲＯＣ面積は０．７７であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２８１００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約２８１００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【実施例２】
【０１１５】
マーカー物質（Ａ１）の精製と同定
アフィニティ樹脂 NHS-activated Sepharose 100μL（ＧＥヘルスケア社）をスピンカラムに充填し、リガンドとしてウサギＩｇＧ（シグマ社）１ｍｇを結合させ、ＰＢＳで平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬをＰＢＳで２倍希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。ＴＰＢＳでカラムを洗浄（４００μＬ×３回）し、さらにＰＢＳでカラムを洗浄（４００μＬ×２回）した後、１００μＬの５０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１１６】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１６に結果を示す。図１６中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．８ｋＤａのバンド（図１６の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ１）の質量／電荷比（平均値：７７７７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１７の矢印）。
【０１１７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．８ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「９４４．５３」、「１５７７．８４」、「１９０５．００」、「２０３３．１０」、「１３３３．７１」、及び「１４６１．８０」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血小板第４因子」（配列番号７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
【０１１８】
【表１】
【実施例３】
【０１１９】
マーカー物質（Ａ２）の精製と同定
強陽イオン交換樹脂SP-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５））にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１．２５ｍＬを前記平衡化バッファーで１０倍に希釈し、ステリフリップＨＶ ０．４５μｍでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。前記平衡化バッファー（２．５ｍＬ×１回）、５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．０）（２．５ｍＬ×４回）、及び５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）（２．５ｍＬ×１回）でカラムを洗浄し、５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）２．５ｍＬで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２０】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１８に結果を示す。図１８中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約９．３ｋＤａのバンド（図１８の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ２）の質量／電荷比（平均値：９２９８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１９の矢印）。
【０１２１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約９．３ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２１５１．０８」、「１７２４．８３」、「２４３３．１２」、「１５４８．７３」、「１１００．６３」、「２６５１．４２」、「２９７９．５５」、「１５６９．８０」、「１８９７．９５」、「２０２６．０５」、「１１８４．６１」、「１０５６．５２」、及び「１２９７．６９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号８〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血小板塩基性タンパク質（Platelet Basic Protein）」（配列番号２１）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：９２９８）から、マーカー物質（Ａ２）は血小板塩基性タンパク質の断片の１つである「結合組織活性化ペプチド３」（配列番号２２，アミノ酸配列からの理論分子量：９２９２）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１２２】
【表２】
【実施例４】
【０１２３】
マーカー物質（Ａ３）の精製と同定
Hi Trap Blue HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清４５０μＬを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、Millex HV 0.45μmでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、素通り画分と洗浄画分を確保した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２４】
Hi Trap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにて平衡化した。回収した画分４．５ｍＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで２倍希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにてカラムを洗浄し（５ＣＶ）、さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順次洗浄した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で溶出し、２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２５】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２０に結果を示す。図２０中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５１．３ｋＤａのバンド（図２０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ３）の質量／電荷比（平均値：５１３２１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２１の矢印）。
【０１２６】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約５１．３ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１１個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２３２８．１６」、「１５２９．７８」、「１６９４．９０」、「２５１８．００」、「２７０７．１８」、「１２５４．７１」、「１２７５．５６」、「１３８８．６８」、「９１５．４６」、「１３２６．７５」、及び「２０９２．８２」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２３〜３３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「ビタミンＤ結合タンパク質」（配列番号３４）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１２７】
【表３】
【実施例５】
【０１２８】
マーカー物質（Ｂ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）５００μＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で５倍に希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。５００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを洗浄し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／０．１％ＯＧＰで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２９】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１００μＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化した。回収した画分１ｍＬを１０％酢酸にてｐＨ５．０に調整した後、その全量を平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３０】
TSK-GEL Super ODS（東ソー社）を０．１％ＴＦＡで平衡化した。回収した画分をカラムに添加した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）から溶媒Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）への直線濃度勾配により溶出した。回収した画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。回収した画分を同じ条件の逆相ＨＰＬＣに再度供した。回収した画分を３つに分け（主要画分、参考画分１，２）、それらの精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した（図２２（ａ）〜（ｃ））。主要画分と参考画分１に、マーカー物質（Ｂ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２２（ａ），（ｂ）の矢印）。
【０１３１】
各画分をトリプシン消化し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。主要画分と参考画分２との比較から、マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）を主要画分と参考画分１から見出した。参考画分１のトリプシン消化物を質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社）で測定し、マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）を解析した。
【０１３２】
マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）のＭＳ／ＭＳデータを元にシーケンスタグ法を行い、Ｍａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索したところ、断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）のペプチドは配列番号３５で表わされるアミノ酸配列（ＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。さらに、アポリポタンパク質Ａ１全長のアミノ酸配列（配列番号３６）と配列番号３５との比較、並びに、マーカー物質（Ｂ１）の質量／電荷比（平均値：３３５６）から、マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１の８１番目〜１０９番目に相当するタンパク質断片（配列番号３７）と同定された。
【実施例６】
【０１３３】
マーカー物質（Ｂ３）の精製と同定
強陽イオン交換樹脂SP-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５））にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１．２５ｍＬを前記平衡化バッファーで１０倍に希釈し、ステリフリップＨＶ ０．４５μｍでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。前記平衡化バッファー２．５ｍＬでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．０）２．５ｍＬで４回溶出した（計１０．０ｍＬ）。２回目の溶出画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３４】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２３に結果を示す。図２３中、レーン１〜４はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約４．２ｋＤａのバンド（図２３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ３）の質量／電荷比（平均値：４１５６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２４の矢印）。
【０１３５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約４．２ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１個のピークが検出され、その精密質量は「８５３．４４」と算出された。このデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、このペプチドは配列番号３８で表わされるアミノ酸配列（ＦＰＶＦＭＧＲ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「Ｃ１インヒビター」（配列番号３９）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：４１５６）から、マーカー物質（Ｂ３）は「配列番号３８の４６８番目〜５００番目（Ｃ末端）に相当するタンパク質断片（配列番号４０、アミノ酸配列からの理論分子量：４１５３）と同定された。
【実施例７】
【０１３６】
マーカー物質（Ｂ４）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）２ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１ｍＬ加えて変性処理した。さらに、１．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファーを用いてｐＨ９．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分２ｍＬを回収した後、２ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）／０．１％ＯＧＰでカラムを洗浄し、洗浄画分を回収した。各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３７】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）２００μＬを充填したスピンカラムを１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）／０．１％ＯＧＰで平衡化した。先の非吸着画分と洗浄画分とを混合し、さらに１０％酢酸にてｐＨ４．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を素通りさせ、さらに、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）／０．１％ＯＧＰをベースにＮａＣｌ濃度を段階的に０．５Ｍまで上げながらカラムを洗浄した。２００μＬの３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで３回溶出した。回収した各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３８】
回収した各画分を混合した。この混合画分を逆相カラムTSK-GEL Super ODS（東ソー社）を用いたＨＰＬＣに供した。カラム２本を用い、溶出条件として溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）から溶媒Ｂ（７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）への直線グラジエントを採用した。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて溶出位置を確認しながら、８回繰り返した。さらに、グラジエント条件を変更して６回繰り返した。最終溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。マーカー物質（Ｂ４）の質量／電荷比（平均値：６１９４）と同等の質量／電荷比を示すピークと同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２５の矢印）。
【０１３９】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１６．２％Ｔ−６％Ｃポリアクリルアミド（Tricine）ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２６に結果を示す。図２６中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。約６．２ｋＤａのバンドが検出された（図２６の矢印）。
【０１４０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．２ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１個のピークが検出され、その精密質量は「１３８６．７１」と算出された。このデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、このペプチドは配列番号４１で表わされるアミノ酸配列（ＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：６１９４）と配列番号４１のアミノ酸配列から、マーカー物質（Ｂ４）、マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１のＣ末端側のタンパク質断片と考えられた。可能性としては、配列番号３６の１４０番目〜１９５番目、１４１番目〜１９６番目、１４２番目〜１９７番目、１４４番目〜１９８番目、又は１４６番目〜２００番目に相当するタンパク質断片が考えられた。
【実施例８】
【０１４１】
マーカー物質（Ｂ５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２７に結果を示す。図２７中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．５ｋＤａのバンド（図２７の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ５）の質量／電荷比（平均値：６５１１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２８の矢印）。
【０１４３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．５ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２９３．６７」、「１４８８．７０」、及び「１２０１．５５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４２〜４４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」（配列番号４５）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：６５１１）から、マーカー物質（Ｂ５）は配列番号４５のＮ末端側のアミノ酸２個が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の断片」（配列番号４６、アミノ酸配列からの理論分子量：６４３２）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
【０１４４】
【表４】
【実施例９】
【０１４５】
マーカー物質（Ｂ６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）５００μＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１５０μＬ加えて変性処理した。さらに、２５０μＬの前記平衡化バッファーを加えて希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分５００μＬを回収した。さらに５００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）／０．１％ＯＧＰで溶出した。非吸着画分と溶出画分を混合し、目的画分とした。目的画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４６】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１００μＬを充填したスピンカラムを１００ｍＭリン酸バッファーにて平衡化した。先の目的画分を１０％酢酸でｐＨ６．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非非吸着画分を素通りさせた。１００μＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）／０，１％ＯＧＰでカラムを３回洗浄した。１００μＬの０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）／０，１％ＯＧＰで２回溶出し、各画分を回収した。回収した各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４７】
非多孔性陽イオン交換カラムSP-NPR（東ソー社）を５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨで平行化し、先の溶出画分を添加した。５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）から５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）への直線濃度勾配により溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２９に結果を示す。図２９中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．６ｋＤａのバンド（図２９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ６）の質量／電荷比（平均値：８６０７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３０の矢印）。
【０１４９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．６ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７４９．４０」及び「１０３５．５０」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４７，４８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ４ａ」（配列番号４９）と同定された。
さらにその電荷／質量比（平均値：８６０７）から、マーカー物質（Ｂ６）はＣ末端アミノ酸のＡｒｇが欠失した補体Ｃ４ａの断片「補体Ｃ４ａ ｄｅｓ Ａｒｇ」（配列番号５０、アミノ酸配列からの理論分子量：８６０８）であることが示唆された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。
【０１５０】
【表５】
【実施例１０】
【０１５１】
マーカー物質（Ｂ７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１５２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３１に結果を示す。図３１中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．７ｋＤａのバンド（図３１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ７）の質量／電荷比（平均値：８７００）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３２の矢印）。
【０１５３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２６７７．２９」、「２３５０．１１」、「２９８２．４４」、「１１５６．６９」、「２５１３．３１」、及び「２３８５．２５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号５１〜５６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」（配列番号５７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第６表に示す。
【０１５４】
【表６】
【０１５５】
アポリポタンパク質Ａ２はジスルフィド結合による２量体で存在すること、並びに、Ｎ末端のＧｌｎ残基が欠損したものも存在することが知られている（Brewer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1972, 69, 1304-1308）。そこで、ゲルから抽出したタンパク質をＯｎ−Ｃｈｉｐで還元処理し、還元条件と非還元条件でのイオンピークのプロファイルを比較した。その結果、Ｃｙｓの質量に相当するピークのシフトが観察された。この結果と電荷／質量比（平均値：８７００）から、マーカー物質（Ｂ７）は、システイニル化されたアポリポタンパク質Ａ２であって且つそのＣ末端のＧｌｎが欠損しているアポリポタンパク質Ａ２の修飾体であると考えられた。Ｃ末端のＧｌｎが欠損しているアポリポタンパク質Ａ２断片の配列を配列番号５８に示す。
【実施例１１】
【０１５６】
マーカー物質（Ｂ８）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（コスモバイオ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加え、４℃で２０分間、変性処理した。この変性処理サンプルを平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で順次カラムを洗浄した。５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡにて溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１５７】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３３に結果を示す。図３３中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１３．９ｋＤａのバンド（図３３の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ８）の質量／電荷比（平均値：１３８８２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３４の矢印）。
【０１５８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１３．９ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１５２２．７２」、「１３９４．６２」、「２４５５．１７」、「３１４０．５３」、「２４５１．２０」、及び「２６０７．３１」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号５９〜６４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」（配列番号６５）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第７表に示す。
【０１５９】
【表７】
【０１６０】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。その電荷／質量比（平均値：１３８８２）から、マーカー物質（Ｂ８）はＣｙｓ残基にＣｙｓが付加したシステイニル化トランスサイレチンであると考えられた。
【実施例１２】
【０１６１】
マーカー物質（Ｂ９）と（Ｂ１０）の精製と同定
Hi Trap Blue HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（コスモバイオ社）１ｍＬを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、Millex HV 0.45μmでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、素通り画分と洗浄画分を確保した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。この精製を４セット行った。
【０１６２】
Hi Trap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。回収した画分２０ｍＬ（４セット分）を、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にてカラムを洗浄した。さらに、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、又は１６０ｍＭのＮａＣｌを含む各２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で順次洗浄した。２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１６３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３５に結果を示す。図３５中、レーン１，６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１７．４ｋＤａのバンド（図３５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ９）、（Ｂ１０）の両方の質量／電荷比（Ｂ９の平均値：１７２７４、Ｂ１０の平均値：１７４０７）をカバーしているピークを確認した（図３６の矢印）。
【０１６４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１７．４のバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１１９９．６８」、「１８５３．９６」、「１６２６．７９」、「１１５６．６８」、「１２８４．７８」、及び「１０６９．６５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号６６〜７１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」（配列番号５７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第８表に示す。
【０１６５】
【表８】
【０１６６】
上述したように、アポリポタンパク質Ａ２はジスルフィド結合による２量体で存在すること、並びに、Ｃ末端のＧｌｎ残基が欠損したもの（配列番号５８）も存在することが知られている。さらに、Ｃｙｓ残基のＳＨ基がブロックされてシスチンとなり得ることも知られている。（ａ）アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）の２量体、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）とそのＣ末端のＧｌｎ残基が欠損したもの（配列番号５８）からなる２量体、（ｃ）Ｃ末端のＧｌｎ残基が欠損したアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）二個からなる２量体、の理論分子量は、ぞれぞれ、１７３８０、１７２５２、１７１２３であることから、マーカー物質（Ｂ９）は（ｂ）の２量体、マーカー物質（Ｂ１０）は（ａ）の２量体と考えられた。
【実施例１３】
【０１６７】
マーカー物質（Ｂ１１）の精製と同定
実施例１１で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分離された約２８．１ｋＤａのバンド（図３３の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出した。抽出タンパク質についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ１１）の質量／電荷比（平均値：２８１２０）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３７の矢印）。
【０１６８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２８．１ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１６５０．８４」、「１８１５．８５」、「１４００．６７」、「１６１２．７８」、「２２０２．１１」、「２８８７．４４」、「１９３２．９４」、「３２３７．４６」、「２０２０．９９」、「１２５２．６２」、「１３８０．７１」、「１２８３．５８」、「８６９．５２」、「１７０６．９２」、「１４６７．７９」、「１７２３．９５」、「８７３．４５」、「８９６．４８」、「１０３１．５２」、「１３１８．６４」、「７８１．４４」、「１３０１．６５」、「８３１．４３」、「１０１２．５８」、「１２３０．７１」、「１３８６．７１」、及び「１５１４．８１」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号７２〜９９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第９表に示す。
【０１６９】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】（ａ）は質量／電荷比が７７７７（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図２】（ａ）は質量／電荷比が９２９８（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図３】（ａ）は質量／電荷比が５１３２１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図４】（ａ）は質量／電荷比が１２５３５０（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図５】（ａ）は質量／電荷比が３３５６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図６】（ａ）は質量／電荷比が３９６２（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図７】（ａ）は質量／電荷比が４１５６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図８】（ａ）は質量／電荷比が６１９４（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図９】（ａ）は質量／電荷比が６５１１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１０】（ａ）は質量／電荷比が８６０８（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１１】（ａ）は質量／電荷比が８７１３（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１２】（ａ）は質量／電荷比が１３８８２（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１３】（ａ）は質量／電荷比が１７２７１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１４】（ａ）は質量／電荷比が１７４２４（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１５】（ａ）は質量／電荷比が２８０７６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１６】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１７】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図１８】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１９】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２０】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２１】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２２】実施例５で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図であり、（ａ）は主要画分、（ｂ）は参考画分１、（ｃ）は参考画分２である。
【図２３】実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２４】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２５】実施例７で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２６】実施例７で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２７】実施例８で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２８】実施例８で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２９】実施例９で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３０】実施例９で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３１】実施例１０で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３２】実施例１０で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３３】実施例１１で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３４】実施例１１で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３５】実施例１２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３６】実施例１２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３７】実施例１３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はインターフェロン療法の効果予測方法及び予測用キットに関する。本発明のインターフェロン療法の効果予測方法は、インターフェロン療法終了後にＣ型肝炎ウイルスが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者と、Ｃ型肝炎ウイルスが再燃することなく効果が持続するＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別できるものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus。以下、「ＨＣＶ」と略記する。）の感染により発病するウイルス性肝炎である。Ｃ型肝炎は特別な症状が起こることなく徐々に進行し、治療せずにおくと１０〜３０年かけて肝硬変、さらに肝臓癌へと移行することが多い。
【０００３】
Ｃ型肝炎の治療法として、従来より、インターフェロンの投与（インターフェロン療法）が行なわれている。インターフェロンにはＨＣＶの増殖を抑える作用があり、治療が成功すれば、ＨＣＶは体内から消失する。しかし、インターフェロンの単独投与（インターフェロン単独療法）が有効なＣ型肝炎患者は限定的であることがわかっている。そこで、インターフェロンと別の抗ウイルス剤であるリバビリンとの併用投与（インターフェロン・リバビリン併用療法）が開発され、インターフェロン単独療法に比較して高い効果をあげている。しかしながら、インターフェロン・リバビリン併用療法によっても治療効果が認められないＣ型肝炎患者はなお多い。
【０００４】
インターフェロンは、生体内で産生される生理活性物質の一つであり、抗ウイルス作用や抗ガン作用を有することが知られている。インターフェロンには、α、β、γの主要なサブタイプがあり、このうち、Ｃ型肝炎の治療に用いられているのはαとβである。一方、リバビリン（Ribavirin，1-β-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide）は、プリン骨格をもつ核酸アナログの一種であり、内服の抗ウイルス剤としてインフルエンザ、ヘルペス、麻疹等の治療に古くから用いられている。しかし、リバビリンの単独投与はＣ型肝炎の治療にほとんど効果がなく、リバビリンはインターフェロンと併用することでＨＣＶの排除効果を高める効果を発揮する。
【０００５】
インターフェロン療法によりＣ型肝炎の治療を行なう場合は、４０週程度の長期にわたる投与が必要である。しかし、インターフェロンには発熱、全身倦怠感、関節痛等の副作用があり、長期投与による患者の身体的負担は大きい。さらに、インターフェロンは高価な医薬であり、経済的負担も大きい。また、インターフェロン・リバビリン併用療法を行なう場合は、インターフェロン投与と同じ期間のリバビリン投与が必要であるが、リバビリンにも溶血を起こす副作用があり、患者の身体的・経済的負担はさらに大きい。そして、インターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法による治療効果が得られないＣ型肝炎患者にとっては、これらの療法は副作用を引き起こすだけであり、何ら利益はない。したがって、Ｃ型肝炎患者に対するインターフェロン療法やインターフェロン・リバビリン併用療法の効果を治療開始前に予測し、治療効果が期待できない患者をこれらの療法の対象から外すことが望ましい。
【０００６】
インターフェロン療法が成功するか否かについては、ウイルス側の要因と患者側の要因の２つが関与しているといわれている。ウイルス側の要因としては、ＨＣＶの遺伝子型とＨＣＶの量の関与が指摘されている。すなわち、ＨＣＶには複数の遺伝子型があり、遺伝子型が１ａ、１ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きにくく、それ以外の、例えば遺伝子型が２ａ、２ｂのＨＣＶにはインターフェロンが効きやすい。また、ＨＣＶの量が多いほどインターフェロンが効きにくい。そして、感染しているＨＣＶのタイピング（特許文献１）や、コア領域の変異検出（特許文献２）を行って、インターフェロン療法の効果を予測する方法が提案されている。一方、患者側の要因に着目した技術として、一塩基多型（ＳＮＰ）（特許文献３，４）、肝臓におけるインターフェロンレセプターの発現量（特許文献５）、血液中の特定のタンパク質の濃度（特許文献６）、を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する方法が提案されている。
【０００７】
一方、インターフェロン療法の効果判定については、より細かい分類に基づいて行われている（非特許文献１）。すなわちウイルス学的効果については、治療開始１２週目、治療終了時、および治療終了後２４週目の３段階でＨＣＶ−ＲＮＡを測定する。そして、治療開始１２週目におけるＨＣＶの陰性化（early virological response；ＥＶＲ）、治療終了時におけるＨＣＶの陰性化（end-of-treatment response；ＥＴＲ）、および治療終了後２４週目におけるＨＣＶの陰性化（sustained virological response；ＳＶＲ）について評価する。ここで、治療終了後２４週目の評価が最も重要とされており、この段階におけるＨＣＶ−ＲＮＡ陰性（ＳＶＲ）を「著効」、陽性を無効と判定する。さらに無効例を「再燃」（relapse）と「無反応」（non-response；ＮＲ）に分類する。「再燃」は治療終了時にＨＣＶ−ＲＮＡが陰性であった無効例、「無反応」（ＮＲ）は治療終了時にＨＣＶ−ＲＮＡが陽性であった無効例である。「無反応」に分類される患者は、インターフェロン療法の対象として適していないことになる。
【０００８】
インターフェロン療法によって「著効」（ＳＶＲ）を示す患者とＨＣＶが「再燃」する患者は、いずれもインターフェロン療法の対象として適当であるが、それぞれに適した治療計画が必要とされる。「著効」を示す患者についてはインターフェロン療法を積極的に受療することが効果的であり、それにより肝臓癌の発生率を抑えることが可能となる。一方、ＨＣＶが「再燃」する患者についてはインターフェロン投与を中断せずに長期投与することが効果的であり、それにより肝臓癌の発生率を抑えることが可能となる。
【０００９】
ところが、あるＣ型肝炎患者がインターフェロン療法によって「著効」を示す者であるか、ＨＣＶが「再燃」する者であるかを治療開始前に予測する技術がなく、インターフェロン療法を行う上での障害になっている。例えば、ＨＣＶが再燃する患者に対してインターフェロン投与を一定期間行った後に中断してしまい、その結果、ＨＣＶが再燃し、治療成績を下げる一因となっている。従来技術は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な患者とそれ以外の患者とを判別するものであり、「著効」（ＳＶＲ）を示す患者とＨＣＶが「再燃」（relapse）する患者とを判別するものではない。
【００１０】
なお、特許文献１〜４に開示されている技術では、いずれも患者から採取した検体からＤＮＡやＲＮＡを調製する必要があり、操作が煩雑である。また一般に、ＨＣＶの型や量をもって判定する場合は、インターフェロンが効き易いか効き難いかの大まかな判定しかできない。また特許文献５に開示されている技術では、検体として肝組織を採取する必要があり、侵襲を伴う。
【００１１】
なお、インターフェロン療法はＣ型肝炎患者のみならず、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者（ＨＣＶキャリア）に対して効果がある。すなわち、インターフェロン療法が成功すれば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者からＨＣＶが消失する。
【００１２】
【特許文献１】特開２００１−２３８６８７号公報
【特許文献２】特開２００７−４３９８５号公報
【特許文献３】特開２００３−３３９３８０号公報
【特許文献４】特開２００４−２９８０１１号公報
【特許文献５】特開２００１−１４９０７６号公報
【特許文献６】国際公開第２００６／１０７０７８号パンフレット
【非特許文献１】社団法人日本肝臓学会編「慢性肝炎の治療ガイド２００６」２００６年１月１１日発行，ｐ．２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者と、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができる一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の１つの様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００１５】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の体液中におけるマーカー物質の濃度を指標とするものである。そして、マーカー物質として上記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）のうちの少なくとも１つを用いる。本様相の方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測することができる。また本様相の方法は、一般の臨床検査と同様に患者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速である。
【００１６】
本明細書において「インターフェロン療法」とは、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者にインターフェロンを投与してＨＣＶの排除を図る抗ウイルス療法を指すものとする。「インターフェロン療法」には、インターフェロン単独療法（インターフェロンの単独投与）の他に、インターフェロンと他の薬剤との併用療法、例えばインターフェロン・リバビリン併用療法（インターフェロンとリバビリンの併用投与）も含まれる。また、投与されるインターフェロンには、天然型インターフェロンの他に、ポリエチレングリコールが付加されたインターフェロン（ＰＥＧインターフェロン）のような誘導体も含まれる。
【００１７】
質量／電荷比の「約７７８０」、「約９３００」、「約５１３００」、「約１２５０００」等は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、約７７８０は概ね７７８０±０．２％、約９３００は概ね９３００±０．２％、約５１３００は概ね５１３００±０．２％、約１２５０００は概ね１２５０００±０．２％を指す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）の濃度は、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において高値を示し、インターフェロン療法によって著効を示すと予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において低値を示す。一方、マーカー物質（Ａ４）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。
【００１８】
好ましくは、下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【００１９】
血小板第４因子（Platelet Factor 4）、結合組織活性化ペプチド３（Connective tissue-activating peptide 3）、及び、ビタミンＤ結合タンパク質（Vitamin D Binding Protein）はいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、（Ａ３）の解析が容易である。
【００２０】
本明細書において「タンパク質の修飾体」という用語は、種々の意味に用いられる。「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱離（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼ等による切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。逆に、単量体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはその２量体等の多量体も含まれるものとする。
【００２１】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【００２２】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、上記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つを用いる。本様相の方法によっても、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測することができる。また本様相の方法も、一般の臨床検査と同様に患者から採取した体液を検査材料とするので、簡便かつ迅速である。さらに、血小板第４因子、結合組織活性化ペプチド３、及び、ビタミンＤ結合タンパク質は、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質の解析が容易である。なお「タンパク質の修飾体」については上述したとおりである。
【００２３】
好ましくは、前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００２４】
この好ましい様相では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができるマーカー物質である。本様相の方法によれば、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除できるので、予測の精度が高い。
【００２５】
なお、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）なＣ型肝炎ウイルス持続感染者「以外」のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とは、結局、インターフェロン療法終了時にＨＣＶの陰性化（ＥＴＲ）を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者のことである。当該のＣ型肝炎ウイルス持続感染者は、インターフェロン療法によって「著効」（ＳＶＲ）を示す者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが「再燃」（relapse）する者の両方を含んでいる。
【００２６】
ここで、質量／電荷比の「約３３６０」、「約８６１０」、「約１３９００」、「約２８１００」等は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、約３３６０は概ね３３６０±０．２％、約８６１０は概ね８６１０±０．２％、約１３９００は概ね１３９００±０．２％、約２８１００は概ね２８１００±０．２％を指す。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。なお、マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、及び（Ｂ８）は、インターフェロン療法に対して「無反応」と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において低値を示し、それ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者の体液において高値を示す。一方、マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、及び（Ｂ１１）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。
【００２７】
好ましくは、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００２８】
アポリポタンパク質Ａ１（Apolipoprotein A1）、Ｃ１インヒビター（Plasma Protease C1 Inhibitor）、アポリポタンパク質Ｃ１（Apolipoprotein C1）、補体Ｃ４（Complement C4）、アポリポタンパク質Ａ２（Apolipoprotein A2）、及び、トランスサイレチン（Transthyretin）は、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ｂ１）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ７）、（Ｂ８）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）の解析が容易である。
【００２９】
好ましくは、前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００３０】
この好ましい様相では、上記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。（Ｄ１）〜（Ｄ６）に属するマーカー物質は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者とを判別することができるマーカー物質である。本様相の方法によっても、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除できるので、予測の精度が高い。さらに、アポリポタンパク質Ａ１、Ｃ１インヒビター、アポリポタンパク質Ｃ１、補体Ｃ４、アポリポタンパク質Ａ２、及び、トランスサイレチンは、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質の解析が容易である。なお「タンパク質の修飾体」については上述したとおりである。
【００３１】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００３２】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。本様相の方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な者であるか否かを予測することができる。本様相の方法は、例えば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する前の予備判定、すなわち１次スクリーニングに有用である。
【００３３】
好ましくは、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００３４】
アポリポタンパク質Ａ１、Ｃ１インヒビター、アポリポタンパク質Ｃ１、補体Ｃ４、アポリポタンパク質Ａ２、及び、トランスサイレチンは、いずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相によればマーカー物質（Ｂ１）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ５）、（Ｂ６）、（Ｂ７）、（Ｂ８）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ１１）の解析が容易である。
【００３５】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００３６】
本様相のインターフェロン療法の効果予測方法では、上記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標としてインターフェロン療法の効果を予測する。本様相の方法によっても、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）な者であるか否かを予測することができる。本様相の方法も、例えば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）する者であるかを予測する前の予備判定、すなわち１次スクリーニングに有用である。
【００３７】
好ましくは、前記体液は、血液である。
【００３８】
この好ましい様相によれば、検査材料を簡単に採取できるので、より簡便かつ迅速にＣ型肝炎ウイルス持続感染者におけるインターフェロン療法の効果を予測することができる。
【００３９】
好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
【００４０】
この好ましい様相によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができる。その結果、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
【００４１】
好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている。
【００４２】
この好ましい様相によれば、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
【００４３】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。
【００４４】
この好ましい様相では、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体、金属キレート体又は抗体を用い、これらの物質を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体や金属キレート体の場合には各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合には、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
【００４５】
本発明のさらに他の様相は、本発明のインターフェロン療法の効果予測方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の効果予測用キットである。
【００４６】
本様相のインターフェロン療法の効果予測用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。本様相のキットによれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００４７】
好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。
【００４８】
この好ましい様相によれば、マーカー物質をより確実に担体上に捕捉することができる。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のインターフェロン療法の効果予測方法によれば、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者が、インターフェロン療法によって著効を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であるかを予測することができる。その結果、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者に対してより適切なインターフェロン療法を施すことが可能となる。
【００５０】
本発明のインターフェロン療法の効果予測用キットによれば、インターフェロン療法によって著効を示す者であるか、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であるかの予測を、より簡便かつ迅速に判別することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明の１つの様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００５２】
これらのマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）は、いずれもインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法によって著効を示すと予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者との間で体液中における濃度が有意に差があるタンパク質である。マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。一方、マーカー物質（Ａ４）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。
【００５３】
１つの実施形態では、下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【００５４】
本発明の他の様相は、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法である。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【００５５】
タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ−カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱離（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱離、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
【００５６】
「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。また、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。逆に、単量体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはその多量体も含まれるものとする。
【００５７】
これらの様相の方法の被験者となるＣ型肝炎ウイルス持続感染者については特に限定はなく、Ｃ型肝炎患者を含めた全てのＣ型肝炎ウイルス持続感染者が被験者となりうる。ただし、インターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を被験者から排除しておくと、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示す者と、ＨＣＶが再燃（relapse）する者との判別精度を上げることができる。インターフェロン療法に対して「無反応」と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者を予め排除する方法としては特に限定はなく、公知の方法を採用することができるが、被験者の体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として選抜することが好ましい。すなわち、本発明の好ましい実施形態では、前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【００５８】
これらのマーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、いずれもインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測されるＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外（ＥＴＲ）のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との間で体液中における濃度が有意に差があるタンパク質である。マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、及び（Ｂ８）は、前者の体液において低値を示し、後者の体液において高値を示す。一方、マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、及び（Ｂ１１）は、前者の体液において高値を示し、後者の体液において低値を示す。
【００５９】
この好ましい実施形態では、まず、（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つを指標として、被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者がインターフェロン療法に対して「無反応」（ＮＲ）と予測される者であるか否かを判定する（予備判定）。次に、インターフェロン療法に対して「無反応」と予測される者でない（ＥＴＲ）と判定された被験者に対して（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標とし、インターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）すると予測される者のいずれであるかを判定する（本判定）。ただし、マーカー物質の濃度測定についてはこの順番で行う必要はなく、作業効率を考慮して適宜行えばよい。例えば、（Ａ１）〜（Ａ４）並びに（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の各マーカーの濃度を一度に測定し、各測定値を相互に照らし合わせることにより、予備判定と本判定とを行ってもよい。本実施形態では予備判定によって本判定の対象をあらかじめ絞り込むので、インターフェロン療法によって著効を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測される者との判別精度が特に高い。
【００６０】
１つの実施形態では、下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たす。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【００６１】
他の実施形態では、前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とする。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【００６２】
「タンパク質の修飾体」の例については上述のとおりである。さらに具体的に例を挙げると、例えば、後述の実施例５で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ１（配列番号３６）のアミノ酸番号８１〜１０９の部分に相当するタンパク質断片（配列番号３７）は「アポリポタンパク質Ａ１の修飾体」に含まれる。また後述の実施例７で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ１のＣ末端側に相当する各タンパク質断片は「アポリポタンパク質Ａ１の修飾体」に含まれる。
【００６３】
後述の実施例６で示したような、ヒトＣ１インヒビター（配列番号３９）のアミノ酸番号４６７〜５００に相当するタンパク質断片（配列番号４０）は「Ｃ１インヒビターの修飾体」に含まれる。
【００６４】
後述の実施例８で示したような、ヒトアポリポタンパク質Ｃ１（配列番号４５）のＮ末端側のアミノ酸２個が欠損したタンパク質断片（配列番号４６）は「アポリポタンパク質Ｃ１の修飾体」に含まれる。
【００６５】
補体Ｃ４（配列番号９９）の断片である補体Ｃ４ａ（配列番号４９）は、「補体Ｃ４の修飾体」に含まれる。さらに、後述の実施例９に示したような、補体Ｃ４ａのＣ末端のＡｒｇが欠損したタンパク質断片（配列番号５０）は「補体Ｃ４の修飾体」に含まれる。配列番号５０のタンパク質断片は「補体Ｃ４ａの修飾体」とも換言できる。
【００６６】
後述の実施例１０に示したような、ヒトアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）にＣｙｓが付加したシステイニル化アポリポタンパク質Ａ２は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。また、アポリポタンパク質Ａ２のＣ末端のＧｌｎが欠損したタンパク質断片（配列番号５８）、さらに、当該タンパク質断片にＣｙｓが付加したもの（システイニル化アポリポタンパク質Ａ２の断片）は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００６７】
後述の実施例１２に示したように、アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）の２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。さらにアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）とＧｌｎ欠損アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）との組み合わせからなる２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。またさらに、Ｇｌｎ欠損アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）の２量体は「アポリポタンパク質Ａ２の修飾体」に含まれる。
【００６８】
トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている（Amareth Lim et al., J. Biol. Chem., vol. 258, No. 50, 2003）。後述の実施例１１に示したように、ヒトトランスサイレチン（配列番号６５）のＣｙｓ残基にＣｙｓが付加したシステイニル化トランスサイレチンは「トランスサイレチンの修飾体」に含まれる。
【００６９】
マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）は、インターフェロン療法によって著効を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃すると予測される者とを判別する際の予備判定に有用なものであるが、単にインターフェロン療法に対して「無反応」と予測される者とそれ以外の者とを判別する目的に用いることもできる。（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する各マーカー物質についても同様である。
【００７０】
本発明において使用する体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を検査材料（測定試料）とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
【００７１】
本発明において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
【００７２】
イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
【００７３】
質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization；ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization；ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer；ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
【００７４】
電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合には、例えば、測定試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
【００７５】
クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合には、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
【００７６】
好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合；金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ；抗原と抗体、酵素と基質、ホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ；疎水性相互作用のような化学的な相互作用、などが挙げられる。
【００７７】
イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２−ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
【００７８】
金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。好ましくは、銅イオン結合金属キレート体が用いられる。
【００７９】
抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
【００８０】
疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
【００８１】
本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
【００８２】
一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）−飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板と、金属イオン基板とが好ましく用いられる。
【００８３】
本発明の方法によって被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者がインターフェロン療法によって著効（ＳＶＲ）を示すと予測される者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃（relapse）すると予測される者のいずれであるかを実際に判定する手順の一例について、順を追って説明する。この例では、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つを指標とする予備判定と、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標とする本判定とを行う。また、検査材料として血漿を用い、各マーカーの濃度測定はＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって行う。
【００８４】
まず被験者のＣ型肝炎ウイルス持続感染者から血液を採取し、検査材料となる血漿を調製する。この血漿をｐＨ９．０の条件でＱＡ等の強陰イオン交換樹脂カラムにアプライする。その後、ｐＨ９．０（素通り）、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０、ｐＨ６．０、ｐＨ５．０、ｐＨ４．０、及びｐＨ３．０の各溶出液で順次溶出し、最後に有機溶媒で溶出する。各溶出画分を確保する。
【００８５】
ｐＨ９．０の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板（弱陽イオン交換基板）に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ６）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ９．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換体を固定化した基板（強陰イオン交換基板）に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ４）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ９．０の画分を銅イオン金属キレート体を固定化した基板（銅イオン基板）に接触させ、次いで、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌの条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）が基板上に捕捉される。
【００８６】
ｐＨ５．０の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ１）が基板上に捕捉される。また、ｐＨ５．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ２）及び（Ｂ２）が基板上に捕捉される。
【００８７】
ｐＨ４．０の画分をＱＡ等の強陰イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ９．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ａ３）、（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、及び（Ｂ１０）が基板上に捕捉される。
【００８８】
有機溶媒の画分をＣＭ等の弱陽イオン交換基板に接触させ、次いで、ｐＨ４．０の条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ３）が基板上に捕捉される。また、有機溶媒の画分を銅イオン基板に接触させ、次いで、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌの条件で洗浄する。このとき、マーカー物質（Ｂ８）及び（Ｂ１１）が基板上に捕捉される。
【００８９】
各基板をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供し、各マーカー物質に対応するイオンピークの強度を測定する。得られた各イオンピーク強度を基準値と比較する。基準値としては、例えばマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の場合には、インターフェロン療法によって著効を示すことが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿と、インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃することが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を用いて、同様のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを予め行い、両者の値を比較して設定したカットオフ値を採用することができる。一方、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の場合には、インターフェロン療法に対して無反応であることが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿と、それ以外の者であることが分かっているＣ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を用いて、同様のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを予め行い、両者の値を比較して設定したカットオフ値を採用することができる。この際の「著効」（ＳＶＲ）、「再燃」（relapse）、「無反応」（ＮＲ）、および「無反応以外」（ＥＴＲ）の確定診断については、例えば、血漿中のＨＣＶ濃度を元に行うことができる。
【００９０】
まず、マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の測定結果を元に、予備判定を行う。具体的には、マーカー物質（Ｂ１），（Ｂ２）、（Ｂ３）、（Ｂ４）、（Ｂ６）、又は（Ｂ８）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が小さいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定する。マーカー物質（Ｂ５）、（Ｂ７）、（Ｂ９）、（Ｂ１０）、又は（Ｂ１１）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が大きいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定する。ここで、（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の各マーカー物質については、１つだけを採用してもよいし、２つ以上を組み合わせて採用してもよい。
【００９１】
次に、予備判定で「インターフェロン療法に対して無反応な者である」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者を排除し、残った者を対象として、マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の測定結果を元に本判定を行う。具体的には、マーカー物質（Ａ１）、（Ａ２）、又は（Ａ３）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が大きいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者である」と判定する。一方、マーカー物質（Ａ４）の場合には、設定した基準値よりもイオンピーク強度が小さいときに、当該Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者が「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者である」と判定する。ここで、（Ａ１）〜（Ａ４）の各マーカー物質については、１つだけを採用してもよいし、２つ以上を組み合わせて採用してもよい。
【００９２】
本判定で「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン投与を中断するとＨＣＶが再燃する可能性が高く、長期間のインターフェロン投与が効果的と予測される。一方、本判定で「インターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者」でないと判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン療法によって著効を示す可能性が高く、一定期間のインターフェロン投与が効果的と予測される。なお、予備判定で「インターフェロン療法に対して無反応な者」と判定されたＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、インターフェロン療法を行うべきか否かについて注意深く検討する必要がある。
【００９３】
本発明のインターフェロン療法の効果予測用キットは、上記したマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むものである。好ましい実施形態では、マーカー物質に対する親和性を有する物質が、イオン交換体、金属キレート体又は抗体である。本実施形態のキットによれば、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、各マーカー物質の標準品、各種バッファー等を含めてもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
【００９４】
（キットの構成例）
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）銅イオン基板：１枚
（４）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ４．０）：適量
（５）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（６）基板洗浄用バッファーＣ（ｐＨ７．０；０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）：適量
（７）各マーカー物質の標準品：各適量
【００９５】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９６】
１．プロテインチップを用いたマーカー物質の検索
ＰＥＧインターフェロンα２ｂとリバビリンの４８週投与および投与後２４週の経過観察による「インターフェロンα・リバビリン併用療法」を受けたＣ型肝炎患者の治療前の血漿サンプルを収集した。患者の内訳は、著効（ＳＶＲ）を示した者（４８週投与終了時と投与後２４週目の両方においてＨＣＶ陰性）１０名、無反応（ＮＲ）であった者（４８週投与終了時においてＨＣＶ陽性）１０名、ＨＣＶが再燃（relapse）した者（４８週投与終了時においてＨＣＶ陰性、投与後２４週目においてＨＣＶ陽性）１２名とした。ＨＣＶ陰性化の確認は、血中におけるＨＣＶ（genotype 1b）数を測定することにより行なった。
【００９７】
各血漿サンプル２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各血清サンプルを強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ Ｃｅｒａｍｉｃ−Ｈｙｐｅｒ ＤＦ、バイオセプラ社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０のバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１−ｏ−Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ８．０のバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ７．０のバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ６．０のバッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ５．０のバッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ４．０のバッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０のバッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（３３．３％ イソプロパノール、１６．７％ アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸からなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０、素通り）、画分２（ｐＨ８．０）、画分３（ｐＨ７．０）、画分４（ｐＨ６．０）、画分５（ｐＨ５．０）、画分６（ｐＨ４．０）、画分７（ｐＨ３．０）、画分８（有機溶媒）の８つの粗分画画分を得た。
【００９８】
得られた各画分１０μＬをｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ４．０）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０）で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファー（１００ｍＭ リン酸ナトリウム，０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で１０倍希釈した後、銅修飾チップＩＭＡＣ３０（バイオラッド社）に添加した。各プロテインチップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。
【００９９】
次に、各プロテインチップにエネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ−Ｈ、ＳＰＡ−Ｌ）又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００〜２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出した。これらの結果から、著効（ＳＶＲ）を示した者とＨＣＶが再燃（relapse）した者との間でイオンピーク強度に有意な差を示したイオンピークを４種選抜し、これらに対応するタンパク質を（Ａ１）〜（Ａ４）と命名した。同様に、無反応（ＮＲ）であった者とそれ以外（ＥＴＲ）の者との間でイオンピーク強度に有意な差を示したイオンピークを１１種選抜し、これらに対応するタンパク質を（Ｂ１）〜（Ｂ１１）と命名した。
【０１００】
２．マーカー物質（Ａ１）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が７７７７（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図１（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１（ｂ）にその箱髭図を示す。図１（ａ）中の横棒は平均値、図１（ｂ）中の髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．０２０、ＲＯＣ面積は０．７２であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約７７８０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約７７８０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０１】
３．マーカー物質（Ａ２）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が９２９８（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図２（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図２（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．００８、ＲＯＣ面積は０．７２であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約９３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０２】
４．マーカー物質（Ａ３）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が５１３２１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で低値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で高値を示した。図３（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図３（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．０４５、ＲＯＣ面積は０．７０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約５１３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約５１３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０３】
５．マーカー物質（Ａ４）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１２５３５０（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークは著効（ＳＶＲ）を示した者で高値を示し、ＨＣＶが再燃（relapse）した者で低値を示した。図４（ａ）に著効を示した者とＨＣＶが再燃した者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図４（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＳＶＲ vs relapse）は０．００３、ＲＯＣ面積は０．７５であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１２５０００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法によって著効を示すＣ型肝炎ウイルス持続感染者とインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃するＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１２５０００のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法終了後にＨＣＶが再燃する者であると予測することができる。
【０１０４】
６．マーカー物質（Ｂ１）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３５６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図５（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図５（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０２８、ＲＯＣ面積は０．６７であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約３３６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０５】
７．マーカー物質（Ｂ２）の特性
画分５（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が３９６２（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図６（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図６（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．００００２、ＲＯＣ面積は０．８３であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約３９６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約３９６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０６】
８．マーカー物質（Ｂ３）の特性
画分８（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が４１５６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図７（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図７（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３１、ＲＯＣ面積は０．６８であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約４１６０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約４１６０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０７】
９．マーカー物質（Ｂ４）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が６１９４（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図８（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図８（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．００６、ＲＯＣ面積は０．７０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６１９０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約６１９０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０８】
１０．マーカー物質（Ｂ５）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が６５１１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図９（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図９（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０４９、ＲＯＣ面積は０．６４であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約６５１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約６５１０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１０９】
１１．マーカー物質（Ｂ６）の特性
画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ４．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８６０８（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図１０（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１０（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３０、ＲＯＣ面積は０．６６であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８６１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約８６１０のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１０】
１２．マーカー物質（Ｂ７）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が８７１３（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示した。図１１（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１１（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０００８、ＲＯＣ面積は０．７５であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約８７１０のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約８７１０のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１１】
１３．マーカー物質（Ｂ８）の特性
画分８（有機溶媒）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３８８２（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で低値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で高値を示した。図１２（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１２（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓ ＥＴＲ）は０．０３７、ＲＯＣ面積は０．６６であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３９００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１３９００のイオンピーク強度が基準値より低い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１２】
１４．マーカー物質（Ｂ９）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７２７１（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図１３（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１３（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．０００１、ＲＯＣ面積は０．８０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７３００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１７３００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１３】
１５．マーカー物質（Ｂ１０）の特性
画分６（ｐＨ４．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が１７４２４（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはインターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示し、それ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示した。図１４（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１４（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．００００００１、ＲＯＣ面積は０．９０であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約１７４００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約１７４００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【０１１４】
１６．マーカー物質（Ｂ１１）の特性
画分８（有機溶媒）を銅修飾チップＩＭＡＣ３０に接触させ、ｐＨ７．０かつ０．５Ｍ ＮａＣｌのプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ−Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が２８０７６（平均値）のイオンピークが検出された。本ピークはそれ以外（ＥＴＲ）の者で低値を示し、インターフェロン療法に対して無反応（ＮＲ）であった者で高値を示した。図１５（ａ）に無反応であった者とそれ以外の者に分けてピーク強度をプロットしたドットプロット、図１５（ｂ）にその箱髭図を示す。その結果、本ピークのｐ値（ＮＲ ｖｓＥＴＲ）は０．０００４、ＲＯＣ面積は０．７７であった。以上より、血液中のタンパク質でＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに供すると質量／電荷比が約２８１００のピークを生じるタンパク質が、インターフェロン療法に対して無反応なＣ型肝炎ウイルス持続感染者とそれ以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者との判別の指標となることがわかった。例えば、Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者の治療前の血漿を検査材料として、上記した条件のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行い、質量／電荷比が約２８１００のイオンピーク強度が基準値より高い場合に、そのＣ型肝炎ウイルス持続感染者はインターフェロン療法に対して無反応な者であると予測することができる。このようにして無反応な者と予測された以外のＣ型肝炎ウイルス持続感染者については、さらに、上記したマーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つを指標として著効を示す者とＨＣＶが再燃する者のいずれであるかを予測することができる。
【実施例２】
【０１１５】
マーカー物質（Ａ１）の精製と同定
アフィニティ樹脂 NHS-activated Sepharose 100μL（ＧＥヘルスケア社）をスピンカラムに充填し、リガンドとしてウサギＩｇＧ（シグマ社）１ｍｇを結合させ、ＰＢＳで平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬをＰＢＳで２倍希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。ＴＰＢＳでカラムを洗浄（４００μＬ×３回）し、さらにＰＢＳでカラムを洗浄（４００μＬ×２回）した後、１００μＬの５０％アセトニトリル／０．５％ＴＦＡで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１１６】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１６に結果を示す。図１６中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約７．８ｋＤａのバンド（図１６の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ１）の質量／電荷比（平均値：７７７７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１７の矢印）。
【０１１７】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約７．８ｋＤａのバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「９４４．５３」、「１５７７．８４」、「１９０５．００」、「２０３３．１０」、「１３３３．７１」、及び「１４６１．８０」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号１〜６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血小板第４因子」（配列番号７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
【０１１８】
【表１】
【実施例３】
【０１１９】
マーカー物質（Ａ２）の精製と同定
強陽イオン交換樹脂SP-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５））にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１．２５ｍＬを前記平衡化バッファーで１０倍に希釈し、ステリフリップＨＶ ０．４５μｍでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。前記平衡化バッファー（２．５ｍＬ×１回）、５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．０）（２．５ｍＬ×４回）、及び５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）（２．５ｍＬ×１回）でカラムを洗浄し、５０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ１１．０）２．５ｍＬで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２０】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図１８に結果を示す。図１８中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約９．３ｋＤａのバンド（図１８の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ２）の質量／電荷比（平均値：９２９８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１９の矢印）。
【０１２１】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約９．３ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２１５１．０８」、「１７２４．８３」、「２４３３．１２」、「１５４８．７３」、「１１００．６３」、「２６５１．４２」、「２９７９．５５」、「１５６９．８０」、「１８９７．９５」、「２０２６．０５」、「１１８４．６１」、「１０５６．５２」、及び「１２９７．６９」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号８〜２０で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「血小板塩基性タンパク質（Platelet Basic Protein）」（配列番号２１）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：９２９８）から、マーカー物質（Ａ２）は血小板塩基性タンパク質の断片の１つである「結合組織活性化ペプチド３」（配列番号２２，アミノ酸配列からの理論分子量：９２９２）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
【０１２２】
【表２】
【実施例４】
【０１２３】
マーカー物質（Ａ３）の精製と同定
Hi Trap Blue HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬを２０，０００Ｇ、４℃で１０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清４５０μＬを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、Millex HV 0.45μmでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、素通り画分と洗浄画分を確保した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２４】
Hi Trap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにて平衡化した。回収した画分４．５ｍＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで２倍希釈し、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにてカラムを洗浄し（５ＣＶ）、さらに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順次洗浄した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で溶出し、２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２５】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２０に結果を示す。図２０中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約５１．３ｋＤａのバンド（図２０の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ３）の質量／電荷比（平均値：５１３２１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２１の矢印）。
【０１２６】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約５１．３ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１１個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２３２８．１６」、「１５２９．７８」、「１６９４．９０」、「２５１８．００」、「２７０７．１８」、「１２５４．７１」、「１２７５．５６」、「１３８８．６８」、「９１５．４６」、「１３２６．７５」、及び「２０９２．８２」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号２３〜３３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「ビタミンＤ結合タンパク質」（配列番号３４）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
【０１２７】
【表３】
【実施例５】
【０１２８】
マーカー物質（Ｂ１）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）５００μＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で５倍に希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。５００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）でカラムを洗浄し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）／０．１％ＯＧＰで溶出した。回収した溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１２９】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１００μＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）で平衡化した。回収した画分１ｍＬを１０％酢酸にてｐＨ５．０に調整した後、その全量を平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３０】
TSK-GEL Super ODS（東ソー社）を０．１％ＴＦＡで平衡化した。回収した画分をカラムに添加した。溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）から溶媒Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）への直線濃度勾配により溶出した。回収した画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。回収した画分を同じ条件の逆相ＨＰＬＣに再度供した。回収した画分を３つに分け（主要画分、参考画分１，２）、それらの精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した（図２２（ａ）〜（ｃ））。主要画分と参考画分１に、マーカー物質（Ｂ１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２２（ａ），（ｂ）の矢印）。
【０１３１】
各画分をトリプシン消化し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを行った。主要画分と参考画分２との比較から、マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）を主要画分と参考画分１から見出した。参考画分１のトリプシン消化物を質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社）で測定し、マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）を解析した。
【０１３２】
マーカー物質（Ｂ１）に固有の断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）のＭＳ／ＭＳデータを元にシーケンスタグ法を行い、Ｍａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索したところ、断片ピーク（ｍ／ｚ：１３７４）のペプチドは配列番号３５で表わされるアミノ酸配列（ＬＳＰＬＧＥＥＭＲＤＲ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。さらに、アポリポタンパク質Ａ１全長のアミノ酸配列（配列番号３６）と配列番号３５との比較、並びに、マーカー物質（Ｂ１）の質量／電荷比（平均値：３３５６）から、マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１の８１番目〜１０９番目に相当するタンパク質断片（配列番号３７）と同定された。
【実施例６】
【０１３３】
マーカー物質（Ｂ３）の精製と同定
強陽イオン交換樹脂SP-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５））にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１．２５ｍＬを前記平衡化バッファーで１０倍に希釈し、ステリフリップＨＶ ０．４５μｍでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。前記平衡化バッファー２．５ｍＬでカラムを洗浄した後、５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．０）２．５ｍＬで４回溶出した（計１０．０ｍＬ）。２回目の溶出画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３４】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２３に結果を示す。図２３中、レーン１〜４はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約４．２ｋＤａのバンド（図２３の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ３）の質量／電荷比（平均値：４１５６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２４の矢印）。
【０１３５】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約４．２ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１個のピークが検出され、その精密質量は「８５３．４４」と算出された。このデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、このペプチドは配列番号３８で表わされるアミノ酸配列（ＦＰＶＦＭＧＲ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「Ｃ１インヒビター」（配列番号３９）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：４１５６）から、マーカー物質（Ｂ３）は「配列番号３８の４６８番目〜５００番目（Ｃ末端）に相当するタンパク質断片（配列番号４０、アミノ酸配列からの理論分子量：４１５３）と同定された。
【実施例７】
【０１３６】
マーカー物質（Ｂ４）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）２ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ 尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１ｍＬ加えて変性処理した。さらに、１．５Ｍ Ｔｒｉｓバッファーを用いてｐＨ９．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分２ｍＬを回収した後、２ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）／０．１％ＯＧＰでカラムを洗浄し、洗浄画分を回収した。各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３７】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）２００μＬを充填したスピンカラムを１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）／０．１％ＯＧＰで平衡化した。先の非吸着画分と洗浄画分とを混合し、さらに１０％酢酸にてｐＨ４．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を素通りさせ、さらに、１００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）／０．１％ＯＧＰをベースにＮａＣｌ濃度を段階的に０．５Ｍまで上げながらカラムを洗浄した。２００μＬの３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで３回溶出した。回収した各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１３８】
回収した各画分を混合した。この混合画分を逆相カラムTSK-GEL Super ODS（東ソー社）を用いたＨＰＬＣに供した。カラム２本を用い、溶出条件として溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ）から溶媒Ｂ（７０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ）への直線グラジエントを採用した。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて溶出位置を確認しながら、８回繰り返した。さらに、グラジエント条件を変更して６回繰り返した。最終溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。マーカー物質（Ｂ４）の質量／電荷比（平均値：６１９４）と同等の質量／電荷比を示すピークと同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２５の矢印）。
【０１３９】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１６．２％Ｔ−６％Ｃポリアクリルアミド（Tricine）ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２６に結果を示す。図２６中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。約６．２ｋＤａのバンドが検出された（図２６の矢印）。
【０１４０】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．２ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも１個のピークが検出され、その精密質量は「１３８６．７１」と算出された。このデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、このペプチドは配列番号４１で表わされるアミノ酸配列（ＶＳＦＬＳＡＬＥＥＹＴＫＫ）のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：６１９４）と配列番号４１のアミノ酸配列から、マーカー物質（Ｂ４）、マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１のＣ末端側のタンパク質断片と考えられた。可能性としては、配列番号３６の１４０番目〜１９５番目、１４１番目〜１９６番目、１４２番目〜１９７番目、１４４番目〜１９８番目、又は１４６番目〜２００番目に相当するタンパク質断片が考えられた。
【実施例８】
【０１４１】
マーカー物質（Ｂ５）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２７に結果を示す。図２７中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約６．５ｋＤａのバンド（図２７の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ５）の質量／電荷比（平均値：６５１１）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図２８の矢印）。
【０１４３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約６．５ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１２９３．６７」、「１４８８．７０」、及び「１２０１．５５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４２〜４４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ｃ１」（配列番号４５）と同定された。さらにその電荷／質量比（平均値：６５１１）から、マーカー物質（Ｂ５）は配列番号４５のＮ末端側のアミノ酸２個が欠損した「アポリポタンパク質Ｃ１の断片」（配列番号４６、アミノ酸配列からの理論分子量：６４３２）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
【０１４４】
【表４】
【実施例９】
【０１４５】
マーカー物質（Ｂ６）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）５００μＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）１００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１５０μＬ加えて変性処理した。さらに、２５０μＬの前記平衡化バッファーを加えて希釈した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分５００μＬを回収した。さらに５００μＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）／０．１％ＯＧＰで溶出した。非吸着画分と溶出画分を混合し、目的画分とした。目的画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４６】
弱陽イオン交換樹脂CM-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１００μＬを充填したスピンカラムを１００ｍＭリン酸バッファーにて平衡化した。先の目的画分を１０％酢酸でｐＨ６．０に調整した後、平衡化した前記カラムに添加した。非非吸着画分を素通りさせた。１００μＬの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）／０，１％ＯＧＰでカラムを３回洗浄した。１００μＬの０．１Ｍ ＮａＣｌを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．０）／０，１％ＯＧＰで２回溶出し、各画分を回収した。回収した各画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４７】
非多孔性陽イオン交換カラムSP-NPR（東ソー社）を５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨで平行化し、先の溶出画分を添加した。５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）から５００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）への直線濃度勾配により溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１４８】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図２９に結果を示す。図２９中、レーン１，２はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．６ｋＤａのバンド（図２９の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ６）の質量／電荷比（平均値：８６０７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３０の矢印）。
【０１４９】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．６ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Ｑ−ＳＴＡＲ（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７４９．４０」及び「１０３５．５０」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号４７，４８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ４ａ」（配列番号４９）と同定された。
さらにその電荷／質量比（平均値：８６０７）から、マーカー物質（Ｂ６）はＣ末端アミノ酸のＡｒｇが欠失した補体Ｃ４ａの断片「補体Ｃ４ａ ｄｅｓ Ａｒｇ」（配列番号５０、アミノ酸配列からの理論分子量：８６０８）であることが示唆された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第５表に示す。
【０１５０】
【表５】
【実施例１０】
【０１５１】
マーカー物質（Ｂ７）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose FF（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（ＣＥＭＩＣＯＭ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。非吸着画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１５２】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３１に結果を示す。図３１中、レーン１〜３はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約８．７ｋＤａのバンド（図３１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ７）の質量／電荷比（平均値：８７００）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３２の矢印）。
【０１５３】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約８．７ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「２６７７．２９」、「２３５０．１１」、「２９８２．４４」、「１１５６．６９」、「２５１３．３１」、及び「２３８５．２５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号５１〜５６で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」（配列番号５７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第６表に示す。
【０１５４】
【表６】
【０１５５】
アポリポタンパク質Ａ２はジスルフィド結合による２量体で存在すること、並びに、Ｎ末端のＧｌｎ残基が欠損したものも存在することが知られている（Brewer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1972, 69, 1304-1308）。そこで、ゲルから抽出したタンパク質をＯｎ−Ｃｈｉｐで還元処理し、還元条件と非還元条件でのイオンピークのプロファイルを比較した。その結果、Ｃｙｓの質量に相当するピークのシフトが観察された。この結果と電荷／質量比（平均値：８７００）から、マーカー物質（Ｂ７）は、システイニル化されたアポリポタンパク質Ａ２であって且つそのＣ末端のＧｌｎが欠損しているアポリポタンパク質Ａ２の修飾体であると考えられた。Ｃ末端のＧｌｎが欠損しているアポリポタンパク質Ａ２断片の配列を配列番号５８に示す。
【実施例１１】
【０１５６】
マーカー物質（Ｂ８）の精製と同定
強陰イオン交換樹脂Q-Sepharose HP（ＧＥヘルスケア社）１ｍＬを充填したスピンカラムを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），１Ｍ尿素，０．２２％ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。ヒト標準血清（コスモバイオ社）５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加え、４℃で２０分間、変性処理した。この変性処理サンプルを平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で順次カラムを洗浄した。５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡにて溶出した。溶出画分の精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１５７】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲル（１５−２０％）ＮＴＨ−５Ａ０Ｔ（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３３に結果を示す。図３３中、レーン１〜６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１３．９ｋＤａのバンド（図３３の矢印Ａ）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ８）の質量／電荷比（平均値：１３８８２）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３４の矢印）。
【０１５８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１３．９ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１５２２．７２」、「１３９４．６２」、「２４５５．１７」、「３１４０．５３」、「２４５１．２０」、及び「２６０７．３１」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号５９〜６４で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」（配列番号６５）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第７表に示す。
【０１５９】
【表７】
【０１６０】
上述したように、トランスサイレチンについては、その唯一のＣｙｓ残基が修飾を受けた種々の修飾トランスサイレチンが見出されている。その電荷／質量比（平均値：１３８８２）から、マーカー物質（Ｂ８）はＣｙｓ残基にＣｙｓが付加したシステイニル化トランスサイレチンであると考えられた。
【実施例１２】
【０１６１】
マーカー物質（Ｂ９）と（Ｂ１０）の精製と同定
Hi Trap Blue HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。ヒト標準血清（コスモバイオ社）１ｍＬを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で１０倍希釈し、Millex HV 0.45μmでろ過した後、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄し、素通り画分と洗浄画分を確保した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。この精製を４セット行った。
【０１６２】
Hi Trap Q HP 1mL（ＧＥヘルスケア社）を２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて平衡化した。回収した画分２０ｍＬ（４セット分）を、平衡化した前記カラムに添加した。２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にてカラムを洗浄した。さらに、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、又は１６０ｍＭのＮａＣｌを含む各２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で順次洗浄した。２００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度が高い画分を回収し、精製度をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにて確認した。
【０１６３】
回収した画分の一部をアセトン沈殿処理した後、１５％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図３５に結果を示す。図３５中、レーン１，６はいずれも回収画分、Ｍは分子量マーカーである。分離された約１７．４ｋＤａのバンド（図３５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ９）、（Ｂ１０）の両方の質量／電荷比（Ｂ９の平均値：１７２７４、Ｂ１０の平均値：１７４０７）をカバーしているピークを確認した（図３６の矢印）。
【０１６４】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約１７．４のバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１１９９．６８」、「１８５３．９６」、「１６２６．７９」、「１１５６．６８」、「１２８４．７８」、及び「１０６９．６５」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号６６〜７１で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」（配列番号５７）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第８表に示す。
【０１６５】
【表８】
【０１６６】
上述したように、アポリポタンパク質Ａ２はジスルフィド結合による２量体で存在すること、並びに、Ｃ末端のＧｌｎ残基が欠損したもの（配列番号５８）も存在することが知られている。さらに、Ｃｙｓ残基のＳＨ基がブロックされてシスチンとなり得ることも知られている。（ａ）アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）の２量体、（ｂ）アポリポタンパク質Ａ２（配列番号５７）とそのＣ末端のＧｌｎ残基が欠損したもの（配列番号５８）からなる２量体、（ｃ）Ｃ末端のＧｌｎ残基が欠損したアポリポタンパク質Ａ２（配列番号５８）二個からなる２量体、の理論分子量は、ぞれぞれ、１７３８０、１７２５２、１７１２３であることから、マーカー物質（Ｂ９）は（ｂ）の２量体、マーカー物質（Ｂ１０）は（ａ）の２量体と考えられた。
【実施例１３】
【０１６７】
マーカー物質（Ｂ１１）の精製と同定
実施例１１で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、分離された約２８．１ｋＤａのバンド（図３３の矢印Ｂ）を切り出してタンパク質を抽出した。抽出タンパク質についてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ｂ１１）の質量／電荷比（平均値：２８１２０）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図３７の矢印）。
【０１６８】
あらためて同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って約２８．１ｋＤａのバンドを切り出し、実施例２と同様にして質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも２８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１６５０．８４」、「１８１５．８５」、「１４００．６７」、「１６１２．７８」、「２２０２．１１」、「２８８７．４４」、「１９３２．９４」、「３２３７．４６」、「２０２０．９９」、「１２５２．６２」、「１３８０．７１」、「１２８３．５８」、「８６９．５２」、「１７０６．９２」、「１４６７．７９」、「１７２３．９５」、「８７３．４５」、「８９６．４８」、「１０３１．５２」、「１３１８．６４」、「７８１．４４」、「１３０１．６５」、「８３１．４３」、「１０１２．５８」、「１２３０．７１」、「１３８６．７１」、及び「１５１４．８１」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、これらのペプチドはそれぞれ配列番号７２〜９９で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ１」（配列番号３６）と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第９表に示す。
【０１６９】
【表９】
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】（ａ）は質量／電荷比が７７７７（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図２】（ａ）は質量／電荷比が９２９８（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図３】（ａ）は質量／電荷比が５１３２１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図４】（ａ）は質量／電荷比が１２５３５０（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図５】（ａ）は質量／電荷比が３３５６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図６】（ａ）は質量／電荷比が３９６２（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図７】（ａ）は質量／電荷比が４１５６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図８】（ａ）は質量／電荷比が６１９４（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図９】（ａ）は質量／電荷比が６５１１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１０】（ａ）は質量／電荷比が８６０８（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１１】（ａ）は質量／電荷比が８７１３（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１２】（ａ）は質量／電荷比が１３８８２（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１３】（ａ）は質量／電荷比が１７２７１（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１４】（ａ）は質量／電荷比が１７４２４（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１５】（ａ）は質量／電荷比が２８０７６（平均値）のイオンピークについてのドットプロット、（ｂ）はその箱髭図である。
【図１６】実施例２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１７】実施例２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図１８】実施例３で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図１９】実施例３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２０】実施例４で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２１】実施例４で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２２】実施例５で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図であり、（ａ）は主要画分、（ｂ）は参考画分１、（ｃ）は参考画分２である。
【図２３】実施例６で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２４】実施例６で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２５】実施例７で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２６】実施例７で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２７】実施例８で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図２８】実施例８で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図２９】実施例９で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３０】実施例９で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３１】実施例１０で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３２】実施例１０で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３３】実施例１１で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３４】実施例１１で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３５】実施例１２で行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３６】実施例１２で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【図３７】実施例１３で行ったＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果を表すイオンピーク図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【請求項４】
前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項５】
下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項４に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項６】
前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項８】
下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項７に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項１０】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１１】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１２】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項１１に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の効果予測用キット。
【請求項１５】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体であることを特徴とする請求項１４に記載のインターフェロン療法の効果予測用キット。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）〜（Ａ４）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ａ１）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５１３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１２５０００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項２】
下記（１）〜（３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（１）マーカー物質（Ａ１）は血小板第４因子又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ２）は結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体である。
（３）マーカー物質（Ａ３）はビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体である。
【請求項３】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｃ１）血小板第４因子又はその修飾体、
（Ｃ２）結合組織活性化ペプチド３又はその修飾体、
（Ｃ３）ビタミンＤ結合タンパク質又はその修飾体。
【請求項４】
前記体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度をさらに指標とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項５】
下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項４に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項６】
前記体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属する少なくとも１つの濃度をさらに指標とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項７】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記マーカー物質（Ｂ１）〜（Ｂ１１）の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｂ１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ２）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３９６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ３）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約４１６０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ４）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６１９０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約６５１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ６）ｐＨ４．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８６１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約８７１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ８）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３９００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ９）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７３００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１０）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１７４００のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ｂ１１）ｐＨ７．０かつ０．５ＭのＮａＣｌ濃度で銅イオン結合金属キレート体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２８１００のイオンピークを生じるタンパク質。
【請求項８】
下記（４）〜（１３）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項７に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
（４）マーカー物質（Ｂ１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（５）マーカー物質（Ｂ３）はＣ１インヒビター又はその修飾体である、
（６）マーカー物質（Ｂ４）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である、
（７）マーカー物質（Ｂ５）はアポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体である、
（８）マーカー物質（Ｂ６）は補体Ｃ４又はその修飾体である、
（９）マーカー物質（Ｂ７）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１０）マーカー物質（Ｂ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である、
（１１）マーカー物質（Ｂ９）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１２）マーカー物質（Ｂ１０）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（１３）マーカー物質（Ｂ１１）はアポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体である。
【請求項９】
Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者から採取した体液における下記（Ｄ１）〜（Ｄ６）のいずれかに属するマーカー物質の少なくとも１つの濃度を指標として、前記Ｃ型肝炎ウイルス持続感染者に対するインターフェロン療法の効果を予測することを特徴とするインターフェロン療法の効果予測方法。
（Ｄ１）アポリポタンパク質Ａ１又はその修飾体、
（Ｄ２）Ｃ１インヒビター又はその修飾体、
（Ｄ３）アポリポタンパク質Ｃ１又はその修飾体、
（Ｄ４）補体Ｃ４又はその修飾体、
（Ｄ５）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｄ６）トランスサイレチン又はその修飾体。
【請求項１０】
前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１１】
前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１２】
前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項１１に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１３】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体であることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のインターフェロン療法の効果予測方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のインターフェロン療法の効果予測方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とするインターフェロン療法の効果予測用キット。
【請求項１５】
前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体、金属キレート体又は抗体であることを特徴とする請求項１４に記載のインターフェロン療法の効果予測用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２８】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３６】
【図３７】
【図１６】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１７】
【図１９】
【図２１】
【図２２】
【図２４】
【図２５】
【図２８】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３６】
【図３７】
【図１６】
【図１８】
【図２０】
【図２３】
【図２６】
【図２７】
【図２９】
【図３１】
【図３３】
【図３５】
【公開番号】特開２００９−１０３６８１（Ｐ２００９−１０３６８１Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３５０８８（Ｐ２００８−１３５０８８）
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【出願人】（３０３０５８７０８）株式会社バイオマーカーサイエンス (27)
【出願人】（５９６１５６１７４）
【Ｆターム（参考）】
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