インターロイキン１受容体に対する抗体及びその使用
ヒトＩＬ−１Ｒに結合し、そしてＩＬ−１ＲへのヒトＩＬ−１の結合を阻害する抗体であって、該抗体がハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得ることができるか、又はキメラの、ヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗体変異体又は該抗体のフラグメントであって、ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７１）のようなヒト繊維芽細胞においてＩＬ−１が媒介するＩｌ−８及びＩＬ−６の分泌について３５pM以下のＩＣ５０を示すものは、炎症疾患の処置について有利な特性を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）に対する抗体、その製造方法、前記抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
【０００２】
炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ）により活性化されるシグナル伝達経路は、ＩＬ−１が炎症疾患で奏し、そしてリウマチ様関節炎と関連する炎症や関節の破壊に関与する重要な役割により、多くの注目の焦点となってきた。
【０００３】
多数のタンパク質が、転写因子核内因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）、そしてｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）といったストレス活性化タンパク質キナーゼのポスト受容体活性化に関与することが記載されている。インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ．Ｐ１４７７８、ＣＤ１２１ａ）は、このシグナル伝達のメンバーであり、自然免疫応答及び炎症応答のクリティカルな決定因子である。リウマチ様関節炎への処置アプローチは、一つにはこの症状の重症度の認識が高まった結果として、そして一つにはこの症状の免疫病原性におけるサイトカイン類の重要な役割を理解する中での相当の進歩により、近年、大きく進化した変化を受けてきた。主要な焦点は、ＴＮＦα及びＩＬ−１をターゲットとする原理に基づく。最近、刊行された研究では、ＴＮＦαをターゲットとするいくつかの生物試薬の使用が、リウマチ様疾患の症候及び徴候における改善を持続し、そしてさらにＴＮＦα遮断が構造的損傷から関節を保護することを確認している。アナキンラは、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）であり、ＩＬ−１に媒介される作用を遮断する。
【０００４】
米国特許第６，５１１，６６５号は、ヒトＩＬ−１受容体に特異的に結合し、そしてＩＬ−１受容体へのＩＬ−１の結合を遮断するモノクローナル抗体をクレームする。
【０００５】
本発明の目的は、リウマチ様関節炎のような炎症疾患の治療にとって有益な手段であるＩＬ−１Ｒに対する新規抗体を提供することである。
【０００６】
発明の要約
（ＭＲＣ−５細胞のようなヒト胚性肺繊維芽細胞における）ＩＬ−８の分泌を媒介するＩＬ−１の阻害について、３５pM以下のＩＣ−５０値を示すＩＬ−１Ｒに対する抗体が存在することが、驚くべきことに見いだされた。
【０００７】
本発明に従う抗体は、天然の、そして変性したＩＬ−１Ｒについて、ＩＬ−１Ｒにエピトープ特異性を有し、そしてＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合、及びそれに続くシグナル伝達（核内因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）の活性化を阻害する。抗体は、ＩＬ−１Ｒの可溶性ドメインへ、そのグリコシル化型で結合し、そして３００pM、好ましくは２００pM以下（ＫD）の親和性を示す。抗体は、脱グリコシル化したＩＬ−１Ｒへの結合については、親和性が有意に減少することを示す。
【０００８】
本発明に従う抗体は、ＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで阻害し、それによりＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１Ｒａｃｐ（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質；Ｑ９ＮＰＨ３）からなる三元複合体の形成を阻害する。
【０００９】
本発明は、ヒトＩＬ−１Ｒに結合し、そしてヒトＩＬ−１のＩＬ−１Ｒへの結合を阻害する抗体であって、該抗体は好ましくはハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得られるか、又はキメラであり、ヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗体変異体又は抗体のフラグメントであり、ヒトの繊維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）においてＩＬ−１が媒介するＩＬ−８の分泌を阻害するために３５pM以下のＩＣ５０値を示すことを特徴とする、抗体を含む。
【００１０】
本発明に従う抗体は、好ましくはエフェクター機能（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を示さず、従ってＩｇＧ４アイソタイプのものである。特に好ましくは、セリン２２８のプロリンへの突然変異である（Angal, S.ら、Mol.Immunol.30 (1993年) 105〜108）。あるいは、前記抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものであり、そして好ましくはＣＨ１とＣＨ２との間の約ａａ２２０〜２４０でのヒンジ領域及び／又はＣＨ２とＣＨ３との間の約ａａ３３０の第２インタードメイン領域内で改変し、（番号付けはKabatに従い、例えばJohnson, G.及びWu, T.T.、Nucleic Acids Res.28 (2000年) 214〜218を参照のこと）、エフェクター機能を避ける。ＩｇＧクラスのスウィッチングは、抗体の定常の重鎖と軽鎖を、所望とするクラス、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４の抗体の重鎖と軽鎖で交換することにより、容易に実施することができる。このような方法は、当該技術分野で周知である。
【００１１】
本発明に従う抗体は、抗炎症治療を必要とする患者にとって利点を示す。本発明に従う抗体は、そのような疾患を患った、特にはリウマチ様関節炎を患った患者にとって、利益をもたらす新規で独創的な特性を有する。本発明に従う抗体は、前記特性を特徴とする。
【００１２】
さらに好ましくは、抗体はラット起源のものであり、そしてKabatに従うラット抗体の抗体配列フレームを含む。好ましくは、Kabat配列において、アミノ酸１０（セリン）がＶＬ鎖から欠失し（ＤＥＬ１０）、及び／又はＶＨ鎖のアミノ酸２６（グリシン）がグルタミン酸（Ｇ２６Ｅ）へ変更されている。好ましくは、抗体はＴ細胞エピトープを、ＷＯ９８／０８０９７に記載された方法を用いて枯渇している。
【００１３】
さらに好ましくは、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（Arend W.P.、J.Clin.Invest.88 (1991年) 1445〜1451）は、本発明に従う固定化抗体へのＩＬ−１Ｒ（１０nM）への結合を、１００μM（ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト）までの濃度で阻害せず、すなわちＩＬ−１Ｒへの本発明に従う抗体の結合は、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより阻害されない。
【００１４】
定常領域は、好ましくはKabat, E．（以下を参照のこと）に従うヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４定常領域である。好ましい定常領域を、図１４、１５及び１６に示す。
【００１５】
本発明はまた、抗体をコードする核酸も含む。コードされるポリペプチドは、以下に定義するそれぞれの他の抗体鎖：
ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）を含む抗体重鎖、ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）を含む抗体軽鎖
と共にアセンブルすることができる。ＣＤＲの番号付け及び定義は、シグナル配列を含み、Kabat, E.に従う(例えば、Johnson, G.及びWu, T.T.、Nucleic Acids Res.28(2000年)214〜218）。
【００１６】
好ましくは、核酸は配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）であるポリペプチドをコードする。
【００１７】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、そしてさらにキメラ抗体（ヒト定常鎖）、ヒト化抗体であり、そして特に好ましくはＴ細胞エピトープを欠く抗体である。
【００１８】
抗体は、ヒトＩＬ−１Ｒへ、抗体と競合して、配列番号１〜２の可変鎖を特徴として結合する。
【００１９】
抗体は、さらに３００pM以下、好ましくは２００pM（ＫD）以下、そしてより好ましくは約７０〜２００pMの親和性を特徴とする。
【００２０】
従って、本発明はまた、本発明に従うＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなる前記グループから選択されるポリペプチド及びコード核酸を含む。
【００２１】
さらに本発明は、本発明に従うこのようなアンタゴニストのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００２２】
本発明に従う好ましいハイブリドーマ細胞系である、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約により、２００３年７月１０日に、ドイツ国、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２６０１で、寄託した。
【００２３】
前記細胞系から得られる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。また、好ましくは図７〜１０及び１４〜１６に示す可変領域及び定常領域から組み合わせることができ、そしてヒトの繊維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）においてＩＬ−１が媒介するＩＬ−８の分泌阻害のために、３５pM以下のＩＣ５０値を示す全ての抗体である。これらの配列は、抗体２Ｄ８の配列を改変することにより得られた配列の例であり、ＩＣ５０及び／又はエピトープを特徴とする抗体２Ｄ８の優れた特性を維持しつつ改良した抗体を得ることができる。このような抗体では、図７及び８からの（Ｔ細胞エピトープを欠く）、又は図９及び１０（ヒト化した）からの、軽鎖及び重鎖を、図１４及び図１５又は図１６からの定常領域と組み合わせる。特に好ましくは、抗体ＤＥＩ５／７、ＤＥＩ４／７、ＤＥＩ２／４、ＤＥＩ５／４、ＤＥＩ４／５、ＤＥＩ５／５、ＨＵＭ２／２、ＨＵＭ２／３、ＤＥＩ１／８、ＤＥＩ２／８、ＤＥＩ２／９、ＤＥＩ４／９、ＤＥＩ５／８及びＤＥＩ５／９である。
【００２４】
本発明はさらに、本発明に従う改良特性を有するＩＬ−１Ｒに対する抗体の同定及び／又は製造の方法を提供する。本方法では、抗体２Ｄ８のポリペプチド配列を、アミノ酸の突然変異、欠失又は付加により改変して、ヒトへの投与の際の抗体の免疫原性を下げる。一般に、約５０個までのアミノ酸を可変重鎖及び軽鎖において改変して、免疫原性を下げる。この改変は、２Ｄ８のポリペプチド配列とKabatが提供するヒト抗体の配列との比較、及び／又は可変鎖におけるＴ細胞エピトープの同定及び除去により、実施する。このような改変の例を、図７〜１０に示す。有用な抗体は、これらの図のフレーム化したアミノ酸における１以上の変化により産生することができる。好ましくは、約２０〜５０個のアミノ酸を、可変鎖のフレーム化した領域において改変する。
【００２５】
従って本発明は、本発明に従う抗体の製造方法であって、抗体２Ｄ８の可変領域の配列において、図７〜１０に示す、それぞれフレーム化したアミノ酸に、１個以上のアミノ酸を突然変異、欠失又は付加し、発現ベクターを該改変した抗体の可変領域、及び好ましくは図１４〜１６に示すような、追加のヒト定常領域を、連続した読み枠でコードする核酸を含んで製造し、発現を宿主細胞内で実施し、そして組換えにより産生した抗体の軽鎖及び重鎖を集めて本発明に従う抗体にすることを特徴とする、製造方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、そのような抗体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及びそのような抗体の組換え体を産生するための、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、そのような抗体の組換え体の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、リウマチ様関節炎を有すると診断された（そしてそれ故に、そのような治療を必要とする）患者に、本発明に従うＩＬ−１Ｒに対する拮抗性抗体の有効量を投与することを含むリウマチ様関節炎及び／又は骨関節炎の処置方法を提供する。抗体は、好ましくは薬学的組成物において投与する。
【００２９】
本発明はさらに、リウマチ様関節炎の処置及び本発明に従う薬学的組成物の製造のための、本発明に従う抗体の使用を含む。さらに本発明は、本発明に従う薬学的組成物の製造方法を含む。
【００３０】
本発明はさらに、本発明に従う抗体を、薬学的有効量で、場合により抗体製剤に有用な薬学的目的のための緩衝液及び／又はさらに賦形剤と共に含有する薬学的組成物を含む。
【００３１】
本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体においてそのような抗体を含む薬学的組成物を提供する。ある実施態様では、薬学的組成物は製造品又はキットに含めることができる。
【００３２】
本発明はさらに、本発明に従う核酸を含み、該核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現することができるベクターを含む。
【００３３】
本発明はさらに、本発明に従うベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞を含む。
【００３４】
本発明はさらに、本発明に従う組換えのヒト抗体の製造方法であって、本発明に従う核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞で発現すること、及び該抗体を該細胞から回収することを特徴とする製造方法を含む。本発明はさらに、そのような組換え方法により得ることができる抗体を含む。
【００３５】
本発明の詳細な記載
用語「抗体」とは、抗体の種々の形態を包含し、全抗体、抗体フラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞エピトープを欠く抗体、そしてさらには本発明に従う特徴的な特性を保つ限りに、遺伝学的に操作した抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【００３６】
「抗体フラグメント」とは、全長抗体の部分、一般には少なくともその抗原結合部分又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、免疫毒素、及び抗体フラグメントから形成される多選択性抗体が挙げられる。さらに、抗体フラグメントは、ＶＨ鎖の特徴、すなわちＶＬ鎖とアセンブルすることができるか、又はＩＬ−１Ｒへ結合するＶＬ鎖の特徴、すなわち機能的抗原結合ポケットへＶＨ鎖とアセンブルすることができ、そしてそれによりＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合を阻害する特性を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００３７】
本明細書中に用いる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一のアミノ酸組成物の抗体分子調製物をいう。用語「キメラの抗体」とは、ラットに由来する可変領域、すなわち結合領域及び異なる起源又は種に由来する少なくとも定常領域の部分を、通常は組換えＤＮＡ技術により調製して含むモノクローナル抗体をいう。ラットの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラの抗体が、特に好ましい。そのようなラット／ヒトのキメラの抗体は、ラットの免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及びヒトの免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。本発明が包含する「キメラの抗体」の他の形態は、そのクラス又はサブクラスがオリジナルの抗体のものから改変又は変更したものである。そのような「キメラの」抗体にも、「クラス転換した抗体」として言及する。キメラの抗体を産生する方法としては、現在当該技術分野で周知である、慣用の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術が挙げられる。例えば、Morrison, S.L.ら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984年)6851〜6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【００３８】
用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を改変して、親の免疫グロブリンのものに比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体をいう。好ましい実施態様では、ラットのＣＤＲをヒトの抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L.ら、Nature 332(1988年)323〜327; 及びNeuberger, M.S.ら、Nature 314(1985年)268〜270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ及び二機能性抗体についての前記した抗原を認識する配列を表わすものに相当する。本発明に従うヒト化抗体の例を、図９及び１０に示す。
【００３９】
用語「Ｔ細胞エピトープを欠く抗体」とは、ヒトＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するタンパク質内のペプチド配列）を除去することにより改変して、免疫原性を除去又は減少した抗体をいう。この方法により、ペプチドのアミノ酸側鎖間の相互作用及びＭＨＣクラスＩＩ結合溝を有する特異的結合ポケットを同定する。同定した免疫原性領域を突然変異させて、免疫原性を排除する。このような方法は、一般に、例えばＷＯ９８／５２９７６に記載されている。有用で、そして本発明に従うＴ細胞エピトープを欠く抗体の可変領域の例を、図７及び８に示す。
【００４０】
本明細書中に用いる「結合」とは、約３００pM以下、好ましくは約２００pM以下（ＫD）、そしてより好ましくは約７０〜２００pMの親和性でのＩＬ−１Ｒへの抗体結合をいう。
【００４１】
本明細書中で用いる用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むと意図する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４２】
本明細書中で用いる「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））とは、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれをさす。可変の軽鎖及び重鎖のドメインは、同一の一般的構造を有し、そして各ドメインは、その配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲｓ）により連結された４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用し、そしてＣＤＲｓはβシート構造を連結するループを形成しているであろう。各鎖におけるＣＤＲｓは、フレームワーク領域によりその三次元構造で維持され、そして他の鎖のＣＤＲｓと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を奏し、そしてそれ故に本発明のさらなる目的を提供する。
【００４３】
本明細書中で用いる場合の用語「高頻度可変領域」又は「抗体の抗原結合部位」とは、抗原結合に応答しうる抗体のアミノ酸残基をいう。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲｓ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義した高頻度可変領域残基以外のそれらの可変ドメインの領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖はＮ末端からＣ末端まで、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabatらの標準的な定義付けであるSequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、メリーランド州ベテスダ（1991年）及び／又は「高頻度可変ループ」を形成するそれらの残基に従って、決定する。
【００４４】
本明細書中に用いる用語「ＩＬ−１Ｒへの結合」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＬＩＳＡアッセイにおける、好ましくはビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ及びストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを用いた結合アッセイにおける、ＩＬ−１Ｒへの抗体の結合親和性を意味する。ＩＬ−１Ｒへの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）により調べることもできる。結合の親和性は、用語Ｋon（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、Ｋoff（解離定数）及びＫD（Ｋon／Ｋoff）により定義する。本発明に従う抗体は、３００pM以下、好ましくは２００pM以下、そしてより好ましくは７０〜２００pMのＫDを示し、ＩＬ−１Ｒへの結合を阻害し、そして好ましくはＩＬ−１Ｒへ、ＩＬ−１と同様に同位置で結合する。
【００４５】
用語「ＩＬ−１Ｒ発現細胞」とは、ＩＬ−１受容体を発現しているそのような細胞をいう。そのような細胞とは、例えばＭＲＣ５細胞のような、ヒト繊維芽細胞である。
【００４６】
本発明に従う抗体は、抗体２Ｄ８と同じＩＬ−１Ｒのエピトープへの結合を示し、結合の立体障害によりＩＬ−１Ｒへの結合において阻害される。結合阻害は、固定化ＩＬ−１Ｒ及び抗体２Ｄ８を用いた競合アッセイにより検出することができる。５０％以上のシグナル減少は、抗体が抗体２Ｄ８と競合することを示す。
【００４７】
用語「エピトープ」とは、抗体へ特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、例えばアミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置からなり、そして通常は特異的な３次元構造の特徴も、特異的な電荷の特徴も有する。コンフォメーション及び非コンフォメーションのエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒存在下で失われる点で、区別される。本発明に従う抗体が特異的に結合するＩＬ−１Ｒのエピトープは、本発明に従う抗体により、天然の、そして変性したＩＬ−１Ｒの両者について認識される。本発明に従う抗体は、脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒへの結合より、少なくとも約５０倍、好ましくは少なくとも１００倍強く（Ｎ−グリコシダーゼＦでの処理後、ウェスタンブロットにより測定）、ヒトＩＬ−１Ｒ（グリコシル化、可溶性細胞外ドメイン）へ結合する。従って、本発明に従う抗体は脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒへの結合について親和性が有意に減少することを示す
【００４８】
本発明に従う抗体には、さらに前記本発明に従う抗体の特徴に影響せず又はそれを変化させない、「保存的配列改変」、ヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を有するそのような抗体が挙げられる。改変は、当該技術分野で既知の標準的技術、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ仲介変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸で置き換える置換が挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で明確にされている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このように、ヒトの抗ＩＬ−１Ｒ抗体において予見した非必須アミノ酸残基を、好ましくは同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と置換することができる。
【００４９】
アミノ酸置換は、Riechmann, L.ら、Nature 332(1988年)323〜327及びQueen, C.ら、Proc. Natl.Acad.Sci.USA86 (1989年) 10029〜10033に記載されるような分子モデリングに基づく変異誘発により、実施するとよい。
【００５０】
本発明に従う抗体は、好ましくは少なくとも約５日、好ましくは８〜１５日のｉｎ ｖｉｖｏ（カニクイザル又はヒト）の血清半減期を示す。
【００５１】
本発明に従う抗体は、好ましくは組換え手段により産生する。このような方法は当該技術分野で周知であり、そして原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現、続く抗体ポリペプチドの単離及び通常の薬学的に許容しうる純度への精製を含む。タンパク質発現のためには、軽鎖及び重鎖又はそれらのフラグメントをコードする核酸を標準的方法により発現ベクターへ挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又はＥ．ｃｏｌｉ細胞のような、適当な原核宿主細胞又は真核宿主細胞で実施し、そして抗体を細胞（溶解後の上清又は細胞）から回収する。
【００５２】
抗体の組換え体産生は、当該技術分野において周知であり、そして例えば、Makrides, S.C.、Protein Expr.Purif.17(1999年) 183〜202; Geisse, S.ら、Protein Expr.Purif.8(1996年) 271〜282; Kaufman, R.J.、Mol.Biotechnol.16(2000年) 151〜161; Werner, R.G.、Drug Res.48(1998年)870〜880の概説の項目に記載されている。
【００５３】
抗体は、全細胞、細胞溶解、又は部分的に精製した又はその後の純粋な形態において、存在するとよい。他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、標準的技術、例えばアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び他の当該技術分野における周知の技術により、精製を実施する。Ausubel, F.ら編集、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience、ニューヨーク(1987年) を参照のこと。
【００５４】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.ら、Cytotechnology 32(2000年)109〜123; 及びBarnes, L.M.ら、Biotech.Bioeng.73(2001年) 261〜270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y.ら、Nucl.Acids.Res.30(2002年) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989年) 3833〜3837; Carter, P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992年) 4285〜4289; 及びNorderhaug、L.ら、J.Immunol.Methods 204(1997年) 77〜87に記載されている。好ましい一過性発現系（HEK293)は、Schlaeger, E.-J.及びChristensen, K.、によりCytotechnology 30(1999年)71〜83に、そしてSchlaeger, E.-J.によりImmunol.Methods 194(1996年)191〜199に記載されている
【００５５】
原核細胞に適したコントロール配列としては、例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが既知である。
【００５６】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「作動可能に連結して」いる。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現させる場合は、プレ配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡをポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結し；配列の転写に影響させる場合は、プロモーター又はエンハンサーをコード配列に作動可能に連結し；あるいは翻訳を促進するように配置する場合は、リボソーム結合部位をコード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が近接し、そして分泌リーダーの場合には、近接して、かつ読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接していなくともよい。連結は、都合のよい制限部位での連結により達成する。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、慣用のプラクティスに従って用いる。
【００５７】
モノクローナル抗体を、適当に培養培地から、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えばタンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、分離する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、慣用の手順を用いて、容易に単離し、そして配列決定する。ハイブリドーマ細胞を、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの元として役目を果たさせることができる。一旦単離して、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを次に宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又はミエローマ細胞といった、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へトランスフェクションして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得るとよい。
【００５８】
ヒトのＩＬ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更を抗体ＤＮＡヘ導入することにより、又はペプチド合成により調製する。しかし、そのような改変は、非常に限られた範囲内でのみ、例えば前記のように実施することができる。例えば、改変は前記の抗体の特徴、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合を変えずに、組換え体産生の収率、タンパク質の安定性を改善し、あるいは精製を容易にすることができる。
【００５９】
抗ＩＬ−１Ｒ抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しないシステイン残基であれば、一般的にはセリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善し、そして異常な架橋を妨げてもよい。反対に、システイン結合を抗体に加えて、その安定性を改善してもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメンであれば）。
【００６０】
抗体のアミノ酸変異体の別タイプでは、抗体のオリジナルのグリコシル化パターンが変わる。変わるとは、抗体に見られる１個以上の炭水化物部分が欠失すること、及び／又は抗体に存在しない１個以上のグリコシル化部位が付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結している。Ｎ連結とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンであって、Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるものは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。このように、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、可能なグリコシル化部位を創る。グリコシル化部位の抗体への付加は、１個以上の前記トリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位のため）を含むようにアミノ酸配列を変えることにより、都合のよく達成する。
【００６１】
抗ＩＬ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の種々の方法により調製する。これらの方法としては、天然起源（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又はヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗ＩＬ−１Ｒ抗体の予め調製した変異体若しくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
共有的改変の別のタイプとしては、化学的又は酵素的にグリコシドを抗体へカップリングすることが挙げられる。これらの手順は、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化についてのグリコシル化能を有する宿主細胞での抗体の産生を要しないという点で、有利である。用いたカップリング機序により、糖を（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのもののような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させるとよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びAplin, J.D.及びWriston, J.C.Jr.、CRC Crit.Rev.Biochem.4 (1981年) 259〜306に記載されている。
【００６３】
抗体に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化には、抗体の、化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸又は等価の化合物への暴露を要する。この処理により、抗体は無傷のままに、連結している糖（Ｎアセチルグルコサミン又はＮアセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖を開裂する結果となる。化学的脱グリコシル化は、Sojahr, H.T.及びBahl, O.P.、Arch.Biochem.Biophys.259(1987年)52〜57により、そしてEdge, A.S.ら、Anal.Biochem.118(1981年)131〜137により、記載されている。抗体の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura, N.R.及びBahl.O.P.、Meth.Enzymol.138(1987年)350〜359に記載されたように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用により達成できる。
【００６４】
抗体の共有的改変の別タイプには、抗体を種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのうちの１つへ、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に説明されているように、連結することを含む。
【００６５】
本発明は、好ましくはＩＬ−１Ｒに結合するポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含み、該ポリペプチドはＩＬ−１のＩＬ−１Ｒへの結合を阻害し、配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）から選択される。
【００６６】
再構築した重鎖及び軽鎖の可変領域を、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化及び転写終結の配列と組合せて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖の発現構築物は、単一ベクターへ、共トランスフェクションして、逐次的にトランスフェクションするか、又は別々にトランスフェクションして宿主細胞へ組合わせることができ、それを次に融合して、両鎖を発現する単一の宿主細胞を形成する。
【００６７】
従って、本発明は本発明に従う組換えのヒト抗体の製造方法であって、配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）、並びにヒトの軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞で発現させ、そして該抗体を該細胞から回収することを特徴とする製造方法を提供する。
【００６８】
本発明はさらに、ＩＬ−１Ｒのｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断のための、好ましくは試料のＩＬ−１Ｒと本発明に従う抗体との間の結合を決定する免疫学的アッセイによる、本発明に従う抗体の使用を含む。
【００６９】
別の観点では、本発明は本発明の１個の又は組合せでのモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を含有する、薬学的に許容しうる担体と共に製剤化した組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００７０】
本明細書中に用いる「薬学的に許容しうる担体」としては、生理適合しうるいかなる、そして全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与に適する（例えば、注射又は点滴による）。
【００７１】
「薬学的に許容しうる塩」とは、抗体の所望とする生物学的活性を維持し、そして望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（例えば、Berge, S.M.ら、J.Pharm.Sci.66(1977年)1〜19を参照のこと）。そのような塩を、本発明に含む。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩のような非毒性無機塩由来のものが挙げられる。
【００７２】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の種々の方法により投与することができる。当該技術分野の技術者により認められるように、投与経路及び／又は様式は、所望とする結果によって異なる。
【００７３】
本発明の組成物を、特定の投与経路により投与するためには、化合物を、又は共投与する化合物を、その不活性化を防ぐ材料で被覆する必要があるかもしれない。例えば、化合物を患者へ適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤において、投与するとよい。薬学的に許容しうる希釈剤としては、食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。
【００７４】
薬学的に許容しうる担体としては、無菌の注射可能な溶液又は分散液の即席調剤用の、無菌水溶液又は分散液並びに無菌粉が挙げられる。薬学的活性物質のためのそのような媒及び剤の使用は、当該技術分野で既知である。
【００７５】
本明細書中で用いる表現「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味するが、限定はなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節腔内、関節下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴が挙げられる。
【００７６】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような賦形剤を含有してもよい。微生物の存在予防を、滅菌手順又は無菌の製造条件、並びに種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有せしめることの両者により、確実にするとよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを、組成物中に含有せしめることも望ましいであろう。さらに注射可能な剤形の吸収遷延は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含有せしめることにより、実現させるとよい。
【００７７】
選択した投与経路に関わらず、本発明の化合物は、適切な水和物形及び／又は本発明の薬学的組成物において用いるとよく、薬学的に許容しうる剤形に、当該技術分野の技術者に既知の慣用の方法により製剤化する。
【００７８】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、特に患者、組成物及び投与様式について、患者に毒性とならずに、所望とする治療の応答を得るために有効である活性成分を得るように、変えるとよい。選択した投与レベルは、採用した本発明の特別な組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、採用した特別な化合物の投与経路、投与時間、排泄率といった種々の薬物動態因子、治療期間、他の医薬、採用した特別な組成物との組合せで用いた化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康及び以前の薬歴などに依存するが、このような因子は医薬の分野で周知である。
【００７９】
組成物は、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、無菌かつ液体でなければならない。水だけでなく、担体は等張の緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコー及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの適切な混合物であればよい。
【００８０】
適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持するとよい。多くの場合、組成物における等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含有せしめることにより実現できる。
【００８１】
前記のように、活性化合物を適切に保護すると、化合物を、例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に経口投与するとよい。
【００８２】
本発明に従う抗体を、リウマチ様関節炎を患った、そしてそのような治療を必要とする患者の処置に用いることができる。従って、本発明はリウマチ様関節炎を患った患者の処置方法を含む。
【００８３】
本発明はさらに、本発明に従う抗体の有効量を薬学的に許容しうる担体と共に含む薬学的組成物の製造方法、及びそのような方法のための本発明に従う抗体の使用を提供する。
【００８４】
以下の実施例、参考文献及び配列表を、本発明の理解を助けるために提供するが、その真の意図は付した特許請求の範囲を説明するものである。本発明の精神を逸脱することなく、説明した手順において、改変することができると解される。
【００８５】
配列の記載
配列番号１は、ラット２Ｄ８の重鎖の可変領域；ラット起源のａａ１〜１９シグナル配列、２０〜１３４可変領域、１３５〜１３９末端フラグメントである。
配列番号２は、ラット２Ｄ８の軽鎖の可変領域；ラット起源のａａ１〜２０シグナル配列、２１〜１２９可変領域、１３０〜１３８末端フラグメントである。
配列番号３は、２Ｄ８キメラＨ鎖（ラット／ヒト）（ＩｇＧ１）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、２Ｄ８キメラＨ鎖（ラット／ヒト）（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、２Ｄ８キメラＬ鎖（ラット／ヒト）のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ＨＵＲＶＨのアミノ酸配列である（図７及び図９）。
配列番号７は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ１のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号８は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ２のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号９は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ３のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１０は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ４のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１１は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ５のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１２は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ６のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１３は、ＨＵＲＶＫのアミノ酸配列である（図８及び図１０）。
配列番号１４は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ４のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１５は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ５のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１６は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ７のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１７は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ８のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１８は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ９のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１９は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ１０のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号２０は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ１のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２１は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ２のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２２は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ３のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２３は、ＡＡＢ６７７８５−１のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２４は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ１のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２５は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ２のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２６は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ３のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２７は、ＣＡＤ４３０２５のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２８は、ＩＬ−１Ｒのアミノ酸配列である（図１１）。
配列番号２９は、軽鎖の定常領域の配列である（図１４）。
配列番号３０は、重鎖ＩｇＧ４の配列である（図１５）。
配列番号３１は、ＩｇＧ１の定常領域の配列である（図１６）。
配列番号３２は、ＤＥＩ５／８の重鎖の配列である（図１７）。
配列番号３３は、ＤＥＩ５／８の軽鎖の配列である（図１７）。
【００８６】
実施例
実施例１
ｈ−ＩＬ−１Ｒに対するラットモノクローナル抗体の産生
ハイブリドーマの培養
産生したラットモノクローナル抗体を、ＲＰＭＩ １６４０及び血清なしの１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ培地中（Bio Whittaker）、３７℃及び５％ＣＯ２で、培養した。
免疫化手順及びハイブリドーマ発生
５匹のSprague Dawleyラットを、ＳＦ９昆虫細胞で産生させた組換えのヒトＩＬ−１Ｒで、免疫化した。最初の免疫化（１００μgタンパク質）は、完全なフロイントのアジュバントで腹腔内に実施した。全ての他の免疫化は、不完全なフロイントのアジュバントで実施した。モノクローナル抗体は、ラットの脾細胞とＮＳＯ細胞を融合させて、産生した。
【００８７】
実施例２
ＩＬ−１Ｒ特異的ＥＬＩＳＡ
免疫化したマウス血清中の抗ＩＬ−１Ｒタイター又は培養上清中の抗体を、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＢＳＢＳＡ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中０．１２５μg/mlの濃度の可溶性ビオチン化ｈ−ＩＬ−１Ｒを、１時間室温で、シェーカー上で、９６ウェルプレート（スプレプトアビジンで予備被覆）に被覆した。その後、ウェルをＰＢＳＢＳＡを用いて、３０分間室温でブロックした。血清を１／１００にＰＢＳＢＳＡで予備希釈し、そして１／６４００まで連続希釈した。上清を、ＰＢＳＢＳＡ中１／１００〜１／１００００までの範囲で計算して、希釈した。希釈した血清又は上清をウェルに加え、そして２時間室温で、シェーカー上でインキュベートした。Ｐｒｅ−ｔａｐ血清又は培養培地を、陰性コントロールとして用いた。１２５ng/mlのラット抗ヒトＩＬ−１Ｒ抗体（クローン２Ｄ８）を、陽性コントロールとして用いた。続いて、プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、そして西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ウサギ抗ラットＩｇＧ（Bethyl Laboratories Inc.）と共にインキュベートし、ＰＢＳＢＳＡにおいて、１時間室温のシェーカー上で希釈した。ウェルをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そしてアッセイを新鮮に調製したＴＭ Ｂｌｕｅ（登録商標）（Intergen Company）溶液を用いて、１５〜２０分間室温の暗室中、シェーカー上で発色させた。吸収を、３７０nmで参照波長として４９２nmを用いて測定した。場合により、各ウェルへ２０μlの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して色素反応を止めることができるが、この場合は測定を、４５０nmで参照波長として６９０nmを用いて実施した。結果を、図１に示す。
【００８８】
実施例３
抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体の結合特性の決定
決定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００で、ＣＭ５チップを用いて実施した。カップリングは、アミンカップリングとして実施した。用いた緩衝液は、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）、ｐＨ７．４、２５℃であった。
ａ）抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体のＩＬ−１Ｒへの親和性の決定
親和性測定のため、抗Ｆｃγ抗体（ウサギ抗ヒト）を、ＩＬ−１Ｒに対する抗体提示のため、チップ表面上へカップリングさせた。抗ＩＬ−１Ｒ抗体を、抗Ｆｃγ抗体に結合させ、そして組換えヒトＩＬ−１Ｒ細胞外ドメインを溶液中種々の濃度で加えた。会合は６０秒のＩＬ−１Ｒインジェクションにより測定し、解離は３分間緩衝液でチップ表面を洗浄することにより測定した。抗体についての親和性定数ＫD（Ｋon／Ｋoff）は、
抗体２Ｄ８ １００pM
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ１） ９３pM
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ４） １０５pM
であった。
全抗体の全測定についてのデータ範囲は７０〜１２０pMであり、従って３個の抗体の親和性は同じ範囲である。
【００８９】
ｂ）ＩＬ−１Ｒへの、抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体のリガンドＩＬ−１の結合との競合
これらの測定については、ａ）と同じ方法を用いた。ｈＩＬ−１Ｒを抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体の２Ｄ８に結合させると、もはやｈＩＬ−１は受容体へ結合しなかった。この抗体は、受容体上でｈＩＬ−１の結合部位をブロックする（図３）。
【００９０】
ｃ）三元複合体構築物ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの、抗ｈＩＬ−１Ｒ２Ｄ８抗体による阻害
三元複合体の検出については、ポリクローナルの抗ＩｇＧ抗体を、融合タンパク質Ｆｃ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＮＰＨ３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の提示のため、チップ表面へカップリングさせた。ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ複合体の溶液中での固定化ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰへの結合を検出した。ｈＩＬ−１Ｒとインキュベートすると、抗ｈＩＬ−１Ｒ２Ｄ８抗体はこの三元複合体ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの形成を阻害した（図４）。
【００９１】
実施例４
ａ）ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害
ヒト繊維芽細胞におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害を、細胞バイオアッセイで決定した。ヒトの胚性肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５をｈ−ＩＬβで刺激し、そしてＩＬ−８の産生を一工程のＥＬＩＳＡで決定した。抗ｈ−ＩＬ−１Ｒ抗体の添加による刺激の阻害は、抗体のブロッキング機能を立証する。
バイオアッセイは、以下のアッセイ手順に従って行なった。：
１日目に、ＭＲＣ５細胞をウェル当たり２．５×１０３細胞個の密度で、１００μlの培養培地（１０％ＰＢＳ）に播き、そして２４時間インキュベータ中でインキュベートした。
２日目に、培養培地を除去し、そして試料を５０μlアッセイ培地（１％ＦＢＳ）（精製抗体を試験する場合）又はハイブリドーマ培地ＳＦ（ハイブリドーマ上清を試験する場合）に加えた。ハイブリドーマ上清の最適希釈は、１：１０００と１：１，０００，０００の間であった。インキュベーションは、３０分間インキュベーター内で実施した。続いてｈ−１Ｒ−１β、５０μl／ウェル（２×濃縮！）を、アッセイ培地（１％ＦＢＳ、又はハイブリドーマ上清を試験する場合は２％ＦＢＳ）において、１％の最終ＦＢＳ濃度まで加えた。さらにインキュベーションを３７℃で７時間実施し、そして上清（８０μl）を別の９６ウェルプレートへ移した。
【００９２】
ｂ）ｈ−ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡ
アッセイ（Miller, M.D.及びKrangel, M.S.、評論Rev.Immunol.12(1992年)17〜46）を、製造者のプロトコール（R&D Systems、米国）に従って、未希釈の上清（血液及び脳脊髄液試料についてのプロトコール）を用いて実施した。刺激の最大（抗体を用いないコントロール）は、およそ７５０pg/mlのＩＬ−８であった。抗体によるＩＬ−８分泌の阻害についてのＩＣ５０を図５に示す。
抗体２Ｄ８ ７．２pM（１．０８ng/ml）
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ１） ４．７pM（０．７１ng/ml）
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ４） ５．１pM（０．７７ng/ml）
本発明に従う抗体を用いた全実験の範囲は、４．０〜３５．０pMであった。
２Ｄ８の、ＩＬ−１Ｒに対する市販で入手可能な抗体との、このＭＲＣ−５バイオアッセイにおける比較を、表１に示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】
図７〜１０のアミノ酸配列に基づき、ヒト化及びＴ細胞抗原枯渇抗体のパネルを変異誘発により構築し、そしてｈ−ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡによりＩＣ５０について調べる。結果を、抗体２Ｄ８（１．０）に関して、表２に示す。
用いた略記の説明：
ＨＵＭ：図９及び図１０の配列の組合せ
ＤＥＩ：図７及び図８の配列の組合せ
ＨＵＭ２／２：配列ＨＵＲＨｕＶＨｖ２及びＨＵＲＨｕＶＫｖ２の組合せ
ＤＥＩ１／８：配列ＨＵＲＤＩＶＨｖ１及びＨＵＲＤＩＶＫｖ８の組合せ
【００９５】
【表２】
【００９６】
ｃ）ＥＬＩＳＡによる免疫活性の決定
２Ｄ８抗体と比較した抗体の相対的な免疫活性を、ＥＬＩＳＡにより決定した。可溶性ビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒを、室温で１時間９６ウェルプレート（ストレプトアビジンで予備被覆した）に被覆した。ＢＳＡでブロッキング後、抗体を希釈し、そしてウェルに加えて、室温で２時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、そして西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）複合ウサギ抗ラットＩｇＧと共に室温で１時間インキュベーションした。さらに洗浄後、結合した抗体量を、ＴＭ−Ｂｌｕｅ（登録商標）を添加して３７０ｎでの吸収を測定することにより決定した。
結果を、表３に示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
実施例５
ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害
抗体２Ｄ８の、ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生を阻害するブロッキング能を評価するために、バイオアッセイを実施した。ヘパリン（１９U/ml）を用いて採取したヒト血液を１０ng/mlのｈ−ＩＬ１βを用いて刺激し、そしてＩＬ−８の産生を一工程のＥＬＩＳＡで決定した。抗ｈ−ＩＬ−１Ｒ抗体の添加による刺激の阻害は、ヒトのｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおける抗体のブロッキング機能を証明する。ＩＬ−１と共に抗体の存在下又は欠損下においてインキュベーションを３７℃で１６時間実施し、１：５希釈した試料をＩＬ−８存在について製造者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に従って試験した以外は、実施例４の記載に従って、バイオアッセイを実施した。ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生は、１００ng/mlの２Ｄ８抗体の濃度で〜５０％阻害した（図６を参照のこと）。
【００９９】
実施例６
抗体の組換え体産生
マウス可変領域に連結したヒト定常領域からなるキメラの抗体を発現するためのベクターを、構築した。２つのキメラの重鎖の発現ベクターを、発現ベクターｐＳＶｇｐｔにおいてヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ４定常領域に連結した抗ＩＬ１ＲラットＶＨからなるように構築した。キメラの軽鎖のベクターは、発現ベクターｐＳＶｈｙｇにおいてヒトＣカッパに連結した抗ＩＬ−１ＲラットＶＫからなるように、構築した。リーダーシグナルペプチド、リーダーイントロン及びマウスの免疫グロブリンプロモーターを含む５フランキング配列、並びにスプライス部位及びイントロン配列を含む３フランキング配列を、キメラの発現ベクターへ導入した。重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、ＮＳ０細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ８５１１０５０３、マウスミエローマを産生する非免疫グロブリン）へ、エレクトロポレーションにより共トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞クローンを、ヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによりヒト抗体の産生のためスクリーニングした。
【０１００】
実施例７
ＩＬ−１Ｒの脱グリコシル化
形質転換したＳＦ９昆虫細胞の上清から精製した組換えの可溶性ヒトタイプ１ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）（アミノ酸配列については、図１１を参照のこと）５μgを、３ｍＵのノイラミニダーゼ（Ｎ）（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国；No.269611）、０．３ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国；No.1347101）と、それぞれ３７℃で１７時間インキュベーションした。遠心分離後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１２）により、ＩＬ−１Ｒ（レーン１）の分子量がＮ−グリコシダーゼＦ（レーン３）とのインキュベーションでは約９kDa減少した一方で、ノイラミニダーゼ（レーン２）及びＯ−グリコシダーゼ（レーン４）とのインキュベーションでは分子量の有意な変化は観察されないことを実証した。ノイラミニダーゼとＮ−グリコシダーゼＦとの組み合わせ（レーン５）、Ｏ−グリコシダーゼとＮ−グリコシダーゼＦとの組み合わせ（レーン６）、又は全３つの組み合わせ（レーン８）は、炭水化物側鎖のさらなる開裂という結果にはならなかった。ノイラミニダーゼ及びＯ−グリコシダーゼの組み合わせでは、炭水化物側鎖を除去しなかった（レーン７）。
データは、ＩＬ−１Ｒが１つ以上の可能性のあるＮ−グリコシル化部位でグリコシル化し、そしてＮ連結グリコシル化がＮ−グリコシダーゼＦとのインキュベーションにより完全に除去されうることを実証する。Ｏ連結グリコシル化は、検出しなかった。
２Ｄ８抗体についてのウェスタンブロットのデータを、図１３に示す（レーンは、図１２にならう）。
【０１０１】
実施例８
エピトープの決定
抗原分子上の抗体の結合領域（エピトープ）を、ブロッティング及びｐｅｐｓｃａｎ分析により決定した。
ブロッティング分析については、天然の又は変性した組換えの、可溶性ヒトＩＬ−１Ｒ（ｒｓｈＩＬ−１Ｒ）試料をメンブレンに直接スポットし、抗ｈＩＬ１Ｒ抗体とインキュベーションし、そして抗ＦＣガンマ−ＰＯＤ抗体を用いて化学発光検出により検出した。さらに、ｒｓｈＩＬ−１ＲをＮ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化して、グリコシル化及び脱グリコシル化した両ｒｓｈＩＬ−１ＲをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で変性条件を下げて分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜上でブロットし、抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体と共にインキュベーションし、そして抗ＦＣγ−ＰＯＤ抗体を用いて化学発光検出により検出した。
ドットブロット分析では、本発明に従う抗体が特異的にｒｓｈＩＬ−１Ｒへ、自然の又は変性条件下で結合することを示した。最後に、ウェスタンブロット分析では、本発明に従う抗体はグリコシル化ｒｓｈＩＬ１Ｒ（天然又は変性）のみを認識することを示した。脱グリコシル化したｈＩＬ１Ｒは、ウェスタンブロット分析では検出されなかった。他のグリコシル化タンパク質（例えば、エリスロポエチン、カルボキシペプチダーゼＹ）は、本発明に従う抗体により認識せず、グリコシル化ｒｓｈＩＬ−１Ｒの認識の特異性が高い。
さらに、ｒｓｈＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインを表すビオチン化ペプチド（２０個のアミノ酸）を、抗ＩＬ−１Ｒ／ｒｓｈＩＬ−１Ｒ ｐｅｐｃａｎ分析での使用のために合成した。ペプチドは１０個のアミノ酸が重なり、そして不活性なＮ末端ビオチン化スペーサーを含む。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートへカップリングさせ、抗ｈＩＬ１Ｒ抗体とインキュベーションし、そして抗ＦＣγ抗体を用いて検出した。結合したペプチドは認識されるＩＬ−１Ｒの配列エピトープを表す。
【０１０２】
実施例９
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの存在下での、ＩＬ−１Ｒへの２Ｄ８及びＤＥＩ５／８の結合
ＩＬ−１Ｒとの抗ＩＬ−１Ｒ抗体のタンパク質タンパク質相互作用を、表面プラスモン共鳴によりBiacore 3000 Systemを用いて分析した。会合速度は、２分間の注入により決定し；解離速度は３分間の洗浄工程により測定した。陰性コントロールのデータを系の内因性ベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル減少のためにオリジナルの曲線から引いた。抗体及びチップ表面に固体化したＩＬ−１Ｒを用いた２つのアッセイ形式を、本研究で用いる。
ａ）抗ＩＬ−１Ｒ抗体２Ｄ８を、チップ表面上（ＣＭ５）にアミンカップリングにより共有的に固定する。ＩＬ−１Ｒを１０nMの濃度で、大量トランスファー条件下で注入して、阻害研究での参照として働く最大のシグナルを決定した。ＩＬ−１Ｒ（１０nM）結合の阻害を、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−ベータ又はＤＥＩ５／８の濃度を増大して（０．７８〜１００nM）ＩＬ−１Ｒをプレインキュベーション（ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で少なくとも２０分間室温で）することにより、測定する。続いて、試料をフローセルへ注入し、そして固定化２Ｄ８抗体との相互作用を決定する。
ｂ）ＩＬ−１ベータを、チップ表面上（ＣＭ５）にアミンカップリングにより共有的に固定する。ＩＬ−１Ｒを１０nMの濃度で、大量トランスファー条件下で注入して、参照値としてはたらく最大シグナルを決定した。ｒｓｈＩＬ−１Ｒ（１０nM）結合の阻害を、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ｒｓｈＩＬ−１ベータ又はＤＥＩ５／８の濃度を増大して（０．７８〜１００nM）ＩＬ−１Ｒをプレインキュベーションすることにより、測定する。続いて、試料をフローセルに注入し、そして固定化ｒｈＩＬ−１ベータとの相互作用を決定する。
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、第一のアッセイでは、１００μMの濃度でＩＬ−１Ｒ結合の阻害を示さない。ＩＬ−１ベータは８nMで、ＤＥＩ５／８は２nMで、最大半量の阻害（ＩＣ５０）を示す。第二のアッセイでは、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは４nMの、ＤＥＩ５／８は２nMの、そして２Ｄ８は２nMの阻害活性（ＩＣ５０）を示す。
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは２Ｄ８へのＩＬ−１Ｒの結合を、１００μMまでの濃度では阻害せず、２Ｄ８及びＩＬ−１Ｒアンタゴニストは競合する様式でＩＬ−１Ｒへ結合しないと結論する。２Ｄ８は結合に際してＩＬ−１Ｒの直接のコンフォメーションの変化を導く。このＩＬ−１Ｒのコンフォメーションの変化は、もはやＩＬ−１Ｒアンタゴニストの受容体への結合を許さない。受容体への結合において、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストに対し、２Ｄ８及びＤＥＩ５／８はアロステリック阻害を示す。ＩＬ−１ベータは２Ｄ８へのＩＬ−１Ｒの結合を阻害し、ＩＬ−１ベータ及び２Ｄ８のＩＬ−１Ｒへの競合的結合を示唆する。
【０１０３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、２Ｄ８抗体についてのＥＬＩＳＡ結合アッセイである。
【図２】図２は、２Ｄ８抗体のＩＬ−１Ｒへの親和性の決定である。
【図３】図３は、ＩＬ−１Ｒへの、２Ｄ８抗体のリガンドＩＬ−１の結合との競合である。
【図４】図４は、２Ｄ８抗体による三元複合体構築物ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの阻害である。上の線：ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃｐへのｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒの結合下の線：抗体２Ｄ８の添加
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図６】図６は、ヒトの血液におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図７】図７は、Ｔ細胞エピトープを欠く重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図８】図８は、Ｔ細胞エピトープを欠く軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図９】図９は、ヒト化した重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、ヒト化した軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１Ｒのアミノ酸配列である。ボールドのＮ：可能なグリコシル化部位
【図１２】図１２は、グリコシル化ＩＬ−１Ｒの、グリコシダーゼでの処理後のＳＤＳ ＰＡＧＥである。
【図１３】図１３は、グリコシル化及び脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒとの２Ｄ８のウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、軽鎖の定常領域である。
【図１５】図１５は、重鎖の定常領域である（ＩｇＧ４）。
【図１６】図１６は、重鎖の定常領域である（ＩｇＧ１）。
【図１７】図１７は、ＤＥＩ５／８の重鎖及び軽鎖である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）に対する抗体、その製造方法、前記抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
【０００２】
炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１アルファ及びＩＬ−１ベータ）により活性化されるシグナル伝達経路は、ＩＬ−１が炎症疾患で奏し、そしてリウマチ様関節炎と関連する炎症や関節の破壊に関与する重要な役割により、多くの注目の焦点となってきた。
【０００３】
多数のタンパク質が、転写因子核内因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）、そしてｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）といったストレス活性化タンパク質キナーゼのポスト受容体活性化に関与することが記載されている。インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ．Ｐ１４７７８、ＣＤ１２１ａ）は、このシグナル伝達のメンバーであり、自然免疫応答及び炎症応答のクリティカルな決定因子である。リウマチ様関節炎への処置アプローチは、一つにはこの症状の重症度の認識が高まった結果として、そして一つにはこの症状の免疫病原性におけるサイトカイン類の重要な役割を理解する中での相当の進歩により、近年、大きく進化した変化を受けてきた。主要な焦点は、ＴＮＦα及びＩＬ−１をターゲットとする原理に基づく。最近、刊行された研究では、ＴＮＦαをターゲットとするいくつかの生物試薬の使用が、リウマチ様疾患の症候及び徴候における改善を持続し、そしてさらにＴＮＦα遮断が構造的損傷から関節を保護することを確認している。アナキンラは、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）であり、ＩＬ−１に媒介される作用を遮断する。
【０００４】
米国特許第６，５１１，６６５号は、ヒトＩＬ−１受容体に特異的に結合し、そしてＩＬ−１受容体へのＩＬ−１の結合を遮断するモノクローナル抗体をクレームする。
【０００５】
本発明の目的は、リウマチ様関節炎のような炎症疾患の治療にとって有益な手段であるＩＬ−１Ｒに対する新規抗体を提供することである。
【０００６】
発明の要約
（ＭＲＣ−５細胞のようなヒト胚性肺繊維芽細胞における）ＩＬ−８の分泌を媒介するＩＬ−１の阻害について、３５pM以下のＩＣ−５０値を示すＩＬ−１Ｒに対する抗体が存在することが、驚くべきことに見いだされた。
【０００７】
本発明に従う抗体は、天然の、そして変性したＩＬ−１Ｒについて、ＩＬ−１Ｒにエピトープ特異性を有し、そしてＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合、及びそれに続くシグナル伝達（核内因子カッパＢ（ＮＦ−カッパＢ）の活性化を阻害する。抗体は、ＩＬ−１Ｒの可溶性ドメインへ、そのグリコシル化型で結合し、そして３００pM、好ましくは２００pM以下（ＫD）の親和性を示す。抗体は、脱グリコシル化したＩＬ−１Ｒへの結合については、親和性が有意に減少することを示す。
【０００８】
本発明に従う抗体は、ＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで阻害し、それによりＩＬ−１、ＩＬ−１受容体及びＩＬ−１Ｒａｃｐ（インターロイキン１受容体アクセサリータンパク質；Ｑ９ＮＰＨ３）からなる三元複合体の形成を阻害する。
【０００９】
本発明は、ヒトＩＬ−１Ｒに結合し、そしてヒトＩＬ−１のＩＬ−１Ｒへの結合を阻害する抗体であって、該抗体は好ましくはハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得られるか、又はキメラであり、ヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗体変異体又は抗体のフラグメントであり、ヒトの繊維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）においてＩＬ−１が媒介するＩＬ−８の分泌を阻害するために３５pM以下のＩＣ５０値を示すことを特徴とする、抗体を含む。
【００１０】
本発明に従う抗体は、好ましくはエフェクター機能（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を示さず、従ってＩｇＧ４アイソタイプのものである。特に好ましくは、セリン２２８のプロリンへの突然変異である（Angal, S.ら、Mol.Immunol.30 (1993年) 105〜108）。あるいは、前記抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものであり、そして好ましくはＣＨ１とＣＨ２との間の約ａａ２２０〜２４０でのヒンジ領域及び／又はＣＨ２とＣＨ３との間の約ａａ３３０の第２インタードメイン領域内で改変し、（番号付けはKabatに従い、例えばJohnson, G.及びWu, T.T.、Nucleic Acids Res.28 (2000年) 214〜218を参照のこと）、エフェクター機能を避ける。ＩｇＧクラスのスウィッチングは、抗体の定常の重鎖と軽鎖を、所望とするクラス、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４の抗体の重鎖と軽鎖で交換することにより、容易に実施することができる。このような方法は、当該技術分野で周知である。
【００１１】
本発明に従う抗体は、抗炎症治療を必要とする患者にとって利点を示す。本発明に従う抗体は、そのような疾患を患った、特にはリウマチ様関節炎を患った患者にとって、利益をもたらす新規で独創的な特性を有する。本発明に従う抗体は、前記特性を特徴とする。
【００１２】
さらに好ましくは、抗体はラット起源のものであり、そしてKabatに従うラット抗体の抗体配列フレームを含む。好ましくは、Kabat配列において、アミノ酸１０（セリン）がＶＬ鎖から欠失し（ＤＥＬ１０）、及び／又はＶＨ鎖のアミノ酸２６（グリシン）がグルタミン酸（Ｇ２６Ｅ）へ変更されている。好ましくは、抗体はＴ細胞エピトープを、ＷＯ９８／０８０９７に記載された方法を用いて枯渇している。
【００１３】
さらに好ましくは、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト（Arend W.P.、J.Clin.Invest.88 (1991年) 1445〜1451）は、本発明に従う固定化抗体へのＩＬ−１Ｒ（１０nM）への結合を、１００μM（ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト）までの濃度で阻害せず、すなわちＩＬ−１Ｒへの本発明に従う抗体の結合は、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストにより阻害されない。
【００１４】
定常領域は、好ましくはKabat, E．（以下を参照のこと）に従うヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４定常領域である。好ましい定常領域を、図１４、１５及び１６に示す。
【００１５】
本発明はまた、抗体をコードする核酸も含む。コードされるポリペプチドは、以下に定義するそれぞれの他の抗体鎖：
ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）を含む抗体重鎖、ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）を含む抗体軽鎖
と共にアセンブルすることができる。ＣＤＲの番号付け及び定義は、シグナル配列を含み、Kabat, E.に従う(例えば、Johnson, G.及びWu, T.T.、Nucleic Acids Res.28(2000年)214〜218）。
【００１６】
好ましくは、核酸は配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）であるポリペプチドをコードする。
【００１７】
抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であり、そしてさらにキメラ抗体（ヒト定常鎖）、ヒト化抗体であり、そして特に好ましくはＴ細胞エピトープを欠く抗体である。
【００１８】
抗体は、ヒトＩＬ−１Ｒへ、抗体と競合して、配列番号１〜２の可変鎖を特徴として結合する。
【００１９】
抗体は、さらに３００pM以下、好ましくは２００pM（ＫD）以下、そしてより好ましくは約７０〜２００pMの親和性を特徴とする。
【００２０】
従って、本発明はまた、本発明に従うＩＬ−１Ｒ抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３からなる前記グループから選択されるポリペプチド及びコード核酸を含む。
【００２１】
さらに本発明は、本発明に従うこのようなアンタゴニストのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００２２】
本発明に従う好ましいハイブリドーマ細胞系である、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８は、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約により、２００３年７月１０日に、ドイツ国、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ＤＳＭＺ）に、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２６０１で、寄託した。
【００２３】
前記細胞系から得られる抗体は、本発明の好ましい実施態様である。また、好ましくは図７〜１０及び１４〜１６に示す可変領域及び定常領域から組み合わせることができ、そしてヒトの繊維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）においてＩＬ−１が媒介するＩＬ−８の分泌阻害のために、３５pM以下のＩＣ５０値を示す全ての抗体である。これらの配列は、抗体２Ｄ８の配列を改変することにより得られた配列の例であり、ＩＣ５０及び／又はエピトープを特徴とする抗体２Ｄ８の優れた特性を維持しつつ改良した抗体を得ることができる。このような抗体では、図７及び８からの（Ｔ細胞エピトープを欠く）、又は図９及び１０（ヒト化した）からの、軽鎖及び重鎖を、図１４及び図１５又は図１６からの定常領域と組み合わせる。特に好ましくは、抗体ＤＥＩ５／７、ＤＥＩ４／７、ＤＥＩ２／４、ＤＥＩ５／４、ＤＥＩ４／５、ＤＥＩ５／５、ＨＵＭ２／２、ＨＵＭ２／３、ＤＥＩ１／８、ＤＥＩ２／８、ＤＥＩ２／９、ＤＥＩ４／９、ＤＥＩ５／８及びＤＥＩ５／９である。
【００２４】
本発明はさらに、本発明に従う改良特性を有するＩＬ−１Ｒに対する抗体の同定及び／又は製造の方法を提供する。本方法では、抗体２Ｄ８のポリペプチド配列を、アミノ酸の突然変異、欠失又は付加により改変して、ヒトへの投与の際の抗体の免疫原性を下げる。一般に、約５０個までのアミノ酸を可変重鎖及び軽鎖において改変して、免疫原性を下げる。この改変は、２Ｄ８のポリペプチド配列とKabatが提供するヒト抗体の配列との比較、及び／又は可変鎖におけるＴ細胞エピトープの同定及び除去により、実施する。このような改変の例を、図７〜１０に示す。有用な抗体は、これらの図のフレーム化したアミノ酸における１以上の変化により産生することができる。好ましくは、約２０〜５０個のアミノ酸を、可変鎖のフレーム化した領域において改変する。
【００２５】
従って本発明は、本発明に従う抗体の製造方法であって、抗体２Ｄ８の可変領域の配列において、図７〜１０に示す、それぞれフレーム化したアミノ酸に、１個以上のアミノ酸を突然変異、欠失又は付加し、発現ベクターを該改変した抗体の可変領域、及び好ましくは図１４〜１６に示すような、追加のヒト定常領域を、連続した読み枠でコードする核酸を含んで製造し、発現を宿主細胞内で実施し、そして組換えにより産生した抗体の軽鎖及び重鎖を集めて本発明に従う抗体にすることを特徴とする、製造方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、そのような抗体をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及びそのような抗体の組換え体を産生するための、そのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、そのような抗体の組換え体の製造方法を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、リウマチ様関節炎を有すると診断された（そしてそれ故に、そのような治療を必要とする）患者に、本発明に従うＩＬ−１Ｒに対する拮抗性抗体の有効量を投与することを含むリウマチ様関節炎及び／又は骨関節炎の処置方法を提供する。抗体は、好ましくは薬学的組成物において投与する。
【００２９】
本発明はさらに、リウマチ様関節炎の処置及び本発明に従う薬学的組成物の製造のための、本発明に従う抗体の使用を含む。さらに本発明は、本発明に従う薬学的組成物の製造方法を含む。
【００３０】
本発明はさらに、本発明に従う抗体を、薬学的有効量で、場合により抗体製剤に有用な薬学的目的のための緩衝液及び／又はさらに賦形剤と共に含有する薬学的組成物を含む。
【００３１】
本発明はさらに、薬学的に許容しうる担体においてそのような抗体を含む薬学的組成物を提供する。ある実施態様では、薬学的組成物は製造品又はキットに含めることができる。
【００３２】
本発明はさらに、本発明に従う核酸を含み、該核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞において発現することができるベクターを含む。
【００３３】
本発明はさらに、本発明に従うベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞を含む。
【００３４】
本発明はさらに、本発明に従う組換えのヒト抗体の製造方法であって、本発明に従う核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞で発現すること、及び該抗体を該細胞から回収することを特徴とする製造方法を含む。本発明はさらに、そのような組換え方法により得ることができる抗体を含む。
【００３５】
本発明の詳細な記載
用語「抗体」とは、抗体の種々の形態を包含し、全抗体、抗体フラグメント、ヒト化抗体、キメラ抗体、Ｔ細胞エピトープを欠く抗体、そしてさらには本発明に従う特徴的な特性を保つ限りに、遺伝学的に操作した抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【００３６】
「抗体フラグメント」とは、全長抗体の部分、一般には少なくともその抗原結合部分又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、二重特異性抗体、一本鎖抗体分子、免疫毒素、及び抗体フラグメントから形成される多選択性抗体が挙げられる。さらに、抗体フラグメントは、ＶＨ鎖の特徴、すなわちＶＬ鎖とアセンブルすることができるか、又はＩＬ−１Ｒへ結合するＶＬ鎖の特徴、すなわち機能的抗原結合ポケットへＶＨ鎖とアセンブルすることができ、そしてそれによりＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合を阻害する特性を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００３７】
本明細書中に用いる用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一のアミノ酸組成物の抗体分子調製物をいう。用語「キメラの抗体」とは、ラットに由来する可変領域、すなわち結合領域及び異なる起源又は種に由来する少なくとも定常領域の部分を、通常は組換えＤＮＡ技術により調製して含むモノクローナル抗体をいう。ラットの可変領域及びヒトの定常領域を含むキメラの抗体が、特に好ましい。そのようなラット／ヒトのキメラの抗体は、ラットの免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及びヒトの免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む免疫グロブリン遺伝子の発現産物である。本発明が包含する「キメラの抗体」の他の形態は、そのクラス又はサブクラスがオリジナルの抗体のものから改変又は変更したものである。そのような「キメラの」抗体にも、「クラス転換した抗体」として言及する。キメラの抗体を産生する方法としては、現在当該技術分野で周知である、慣用の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術が挙げられる。例えば、Morrison, S.L.ら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984年)6851〜6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照のこと。
【００３８】
用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を改変して、親の免疫グロブリンのものに比較して異なる特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含む抗体をいう。好ましい実施態様では、ラットのＣＤＲをヒトの抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L.ら、Nature 332(1988年)323〜327; 及びNeuberger, M.S.ら、Nature 314(1985年)268〜270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ及び二機能性抗体についての前記した抗原を認識する配列を表わすものに相当する。本発明に従うヒト化抗体の例を、図９及び１０に示す。
【００３９】
用語「Ｔ細胞エピトープを欠く抗体」とは、ヒトＴ細胞エピトープ（ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有するタンパク質内のペプチド配列）を除去することにより改変して、免疫原性を除去又は減少した抗体をいう。この方法により、ペプチドのアミノ酸側鎖間の相互作用及びＭＨＣクラスＩＩ結合溝を有する特異的結合ポケットを同定する。同定した免疫原性領域を突然変異させて、免疫原性を排除する。このような方法は、一般に、例えばＷＯ９８／５２９７６に記載されている。有用で、そして本発明に従うＴ細胞エピトープを欠く抗体の可変領域の例を、図７及び８に示す。
【００４０】
本明細書中に用いる「結合」とは、約３００pM以下、好ましくは約２００pM以下（ＫD）、そしてより好ましくは約７０〜２００pMの親和性でのＩＬ−１Ｒへの抗体結合をいう。
【００４１】
本明細書中で用いる用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むと意図する。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖でよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００４２】
本明細書中で用いる「可変領域」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））とは、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれをさす。可変の軽鎖及び重鎖のドメインは、同一の一般的構造を有し、そして各ドメインは、その配列が広く保存され、３個の「高頻度可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲｓ）により連結された４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、βシートコンフォメーションを採用し、そしてＣＤＲｓはβシート構造を連結するループを形成しているであろう。各鎖におけるＣＤＲｓは、フレームワーク領域によりその三次元構造で維持され、そして他の鎖のＣＤＲｓと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に従う抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を奏し、そしてそれ故に本発明のさらなる目的を提供する。
【００４３】
本明細書中で用いる場合の用語「高頻度可変領域」又は「抗体の抗原結合部位」とは、抗原結合に応答しうる抗体のアミノ酸残基をいう。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲｓ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義した高頻度可変領域残基以外のそれらの可変ドメインの領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖はＮ末端からＣ末端まで、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabatらの標準的な定義付けであるSequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、メリーランド州ベテスダ（1991年）及び／又は「高頻度可変ループ」を形成するそれらの残基に従って、決定する。
【００４４】
本明細書中に用いる用語「ＩＬ−１Ｒへの結合」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＥＬＩＳＡアッセイにおける、好ましくはビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒ及びストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを用いた結合アッセイにおける、ＩＬ−１Ｒへの抗体の結合親和性を意味する。ＩＬ−１Ｒへの結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ）により調べることもできる。結合の親和性は、用語Ｋon（抗体／抗原複合体からの抗体の会合についての速度定数）、Ｋoff（解離定数）及びＫD（Ｋon／Ｋoff）により定義する。本発明に従う抗体は、３００pM以下、好ましくは２００pM以下、そしてより好ましくは７０〜２００pMのＫDを示し、ＩＬ−１Ｒへの結合を阻害し、そして好ましくはＩＬ−１Ｒへ、ＩＬ−１と同様に同位置で結合する。
【００４５】
用語「ＩＬ−１Ｒ発現細胞」とは、ＩＬ−１受容体を発現しているそのような細胞をいう。そのような細胞とは、例えばＭＲＣ５細胞のような、ヒト繊維芽細胞である。
【００４６】
本発明に従う抗体は、抗体２Ｄ８と同じＩＬ−１Ｒのエピトープへの結合を示し、結合の立体障害によりＩＬ−１Ｒへの結合において阻害される。結合阻害は、固定化ＩＬ−１Ｒ及び抗体２Ｄ８を用いた競合アッセイにより検出することができる。５０％以上のシグナル減少は、抗体が抗体２Ｄ８と競合することを示す。
【００４７】
用語「エピトープ」とは、抗体へ特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、例えばアミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置からなり、そして通常は特異的な３次元構造の特徴も、特異的な電荷の特徴も有する。コンフォメーション及び非コンフォメーションのエピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒存在下で失われる点で、区別される。本発明に従う抗体が特異的に結合するＩＬ−１Ｒのエピトープは、本発明に従う抗体により、天然の、そして変性したＩＬ−１Ｒの両者について認識される。本発明に従う抗体は、脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒへの結合より、少なくとも約５０倍、好ましくは少なくとも１００倍強く（Ｎ−グリコシダーゼＦでの処理後、ウェスタンブロットにより測定）、ヒトＩＬ−１Ｒ（グリコシル化、可溶性細胞外ドメイン）へ結合する。従って、本発明に従う抗体は脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒへの結合について親和性が有意に減少することを示す
【００４８】
本発明に従う抗体には、さらに前記本発明に従う抗体の特徴に影響せず又はそれを変化させない、「保存的配列改変」、ヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を有するそのような抗体が挙げられる。改変は、当該技術分野で既知の標準的技術、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ仲介変異誘発により導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸で置き換える置換が挙げられる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で明確にされている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。このように、ヒトの抗ＩＬ−１Ｒ抗体において予見した非必須アミノ酸残基を、好ましくは同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と置換することができる。
【００４９】
アミノ酸置換は、Riechmann, L.ら、Nature 332(1988年)323〜327及びQueen, C.ら、Proc. Natl.Acad.Sci.USA86 (1989年) 10029〜10033に記載されるような分子モデリングに基づく変異誘発により、実施するとよい。
【００５０】
本発明に従う抗体は、好ましくは少なくとも約５日、好ましくは８〜１５日のｉｎ ｖｉｖｏ（カニクイザル又はヒト）の血清半減期を示す。
【００５１】
本発明に従う抗体は、好ましくは組換え手段により産生する。このような方法は当該技術分野で周知であり、そして原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現、続く抗体ポリペプチドの単離及び通常の薬学的に許容しうる純度への精製を含む。タンパク質発現のためには、軽鎖及び重鎖又はそれらのフラグメントをコードする核酸を標準的方法により発現ベクターへ挿入する。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又はＥ．ｃｏｌｉ細胞のような、適当な原核宿主細胞又は真核宿主細胞で実施し、そして抗体を細胞（溶解後の上清又は細胞）から回収する。
【００５２】
抗体の組換え体産生は、当該技術分野において周知であり、そして例えば、Makrides, S.C.、Protein Expr.Purif.17(1999年) 183〜202; Geisse, S.ら、Protein Expr.Purif.8(1996年) 271〜282; Kaufman, R.J.、Mol.Biotechnol.16(2000年) 151〜161; Werner, R.G.、Drug Res.48(1998年)870〜880の概説の項目に記載されている。
【００５３】
抗体は、全細胞、細胞溶解、又は部分的に精製した又はその後の純粋な形態において、存在するとよい。他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために、標準的技術、例えばアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び他の当該技術分野における周知の技術により、精製を実施する。Ausubel, F.ら編集、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience、ニューヨーク(1987年) を参照のこと。
【００５４】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M.ら、Cytotechnology 32(2000年)109〜123; 及びBarnes, L.M.ら、Biotech.Bioeng.73(2001年) 261〜270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y.ら、Nucl.Acids.Res.30(2002年) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989年) 3833〜3837; Carter, P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992年) 4285〜4289; 及びNorderhaug、L.ら、J.Immunol.Methods 204(1997年) 77〜87に記載されている。好ましい一過性発現系（HEK293)は、Schlaeger, E.-J.及びChristensen, K.、によりCytotechnology 30(1999年)71〜83に、そしてSchlaeger, E.-J.によりImmunol.Methods 194(1996年)191〜199に記載されている
【００５５】
原核細胞に適したコントロール配列としては、例えばプロモーター、場合によりオペレーター配列、そしてリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが既知である。
【００５６】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合に、「作動可能に連結して」いる。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現させる場合は、プレ配列又は分泌リーダーについてのＤＮＡをポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結し；配列の転写に影響させる場合は、プロモーター又はエンハンサーをコード配列に作動可能に連結し；あるいは翻訳を促進するように配置する場合は、リボソーム結合部位をコード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が近接し、そして分泌リーダーの場合には、近接して、かつ読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接していなくともよい。連結は、都合のよい制限部位での連結により達成する。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを、慣用のプラクティスに従って用いる。
【００５７】
モノクローナル抗体を、適当に培養培地から、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えばタンパク質Ａセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーにより、分離する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、慣用の手順を用いて、容易に単離し、そして配列決定する。ハイブリドーマ細胞を、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの元として役目を果たさせることができる。一旦単離して、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、それを次に宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又はミエローマ細胞といった、他に免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞へトランスフェクションして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得るとよい。
【００５８】
ヒトのＩＬ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチドの変更を抗体ＤＮＡヘ導入することにより、又はペプチド合成により調製する。しかし、そのような改変は、非常に限られた範囲内でのみ、例えば前記のように実施することができる。例えば、改変は前記の抗体の特徴、例えばＩｇＧアイソタイプ及びエピトープ結合を変えずに、組換え体産生の収率、タンパク質の安定性を改善し、あるいは精製を容易にすることができる。
【００５９】
抗ＩＬ−１Ｒ抗体の適切なコンフォメーションを維持することに関与しないシステイン残基であれば、一般的にはセリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善し、そして異常な架橋を妨げてもよい。反対に、システイン結合を抗体に加えて、その安定性を改善してもよい（特に、抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメンであれば）。
【００６０】
抗体のアミノ酸変異体の別タイプでは、抗体のオリジナルのグリコシル化パターンが変わる。変わるとは、抗体に見られる１個以上の炭水化物部分が欠失すること、及び／又は抗体に存在しない１個以上のグリコシル化部位が付加することを意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結している。Ｎ連結とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニンであって、Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるものは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。このように、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、可能なグリコシル化部位を創る。グリコシル化部位の抗体への付加は、１個以上の前記トリペプチド配列（Ｎ連結グリコシル化部位のため）を含むようにアミノ酸配列を変えることにより、都合のよく達成する。
【００６１】
抗ＩＬ−１Ｒ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野で既知の種々の方法により調製する。これらの方法としては、天然起源（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、又はヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗ＩＬ−１Ｒ抗体の予め調製した変異体若しくは非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
共有的改変の別のタイプとしては、化学的又は酵素的にグリコシドを抗体へカップリングすることが挙げられる。これらの手順は、Ｎ連結又はＯ連結グリコシル化についてのグリコシル化能を有する宿主細胞での抗体の産生を要しないという点で、有利である。用いたカップリング機序により、糖を（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのもののような遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのもののような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させるとよい。これらの方法は、ＷＯ８７／０５３３０及びAplin, J.D.及びWriston, J.C.Jr.、CRC Crit.Rev.Biochem.4 (1981年) 259〜306に記載されている。
【００６３】
抗体に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化には、抗体の、化合物であるトリフルオロメタンスルホン酸又は等価の化合物への暴露を要する。この処理により、抗体は無傷のままに、連結している糖（Ｎアセチルグルコサミン又はＮアセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖を開裂する結果となる。化学的脱グリコシル化は、Sojahr, H.T.及びBahl, O.P.、Arch.Biochem.Biophys.259(1987年)52〜57により、そしてEdge, A.S.ら、Anal.Biochem.118(1981年)131〜137により、記載されている。抗体の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura, N.R.及びBahl.O.P.、Meth.Enzymol.138(1987年)350〜359に記載されたように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼの使用により達成できる。
【００６４】
抗体の共有的改変の別タイプには、抗体を種々の非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのうちの１つへ、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に説明されているように、連結することを含む。
【００６５】
本発明は、好ましくはＩＬ−１Ｒに結合するポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含み、該ポリペプチドはＩＬ−１のＩＬ−１Ｒへの結合を阻害し、配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）から選択される。
【００６６】
再構築した重鎖及び軽鎖の可変領域を、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化及び転写終結の配列と組合せて、発現ベクター構築物を形成する。重鎖及び軽鎖の発現構築物は、単一ベクターへ、共トランスフェクションして、逐次的にトランスフェクションするか、又は別々にトランスフェクションして宿主細胞へ組合わせることができ、それを次に融合して、両鎖を発現する単一の宿主細胞を形成する。
【００６７】
従って、本発明は本発明に従う組換えのヒト抗体の製造方法であって、配列番号１の可変領域からなる重鎖（ＶＨ）及び配列番号２の可変領域からなる軽鎖（ＶＬ）、並びにヒトの軽鎖定常領域（ＣＬ）をコードする核酸を、原核宿主細胞又は真核宿主細胞で発現させ、そして該抗体を該細胞から回収することを特徴とする製造方法を提供する。
【００６８】
本発明はさらに、ＩＬ−１Ｒのｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断のための、好ましくは試料のＩＬ−１Ｒと本発明に従う抗体との間の結合を決定する免疫学的アッセイによる、本発明に従う抗体の使用を含む。
【００６９】
別の観点では、本発明は本発明の１個の又は組合せでのモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を含有する、薬学的に許容しうる担体と共に製剤化した組成物、例えば薬学的組成物を提供する。
【００７０】
本明細書中に用いる「薬学的に許容しうる担体」としては、生理適合しうるいかなる、そして全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与に適する（例えば、注射又は点滴による）。
【００７１】
「薬学的に許容しうる塩」とは、抗体の所望とする生物学的活性を維持し、そして望ましくない毒性効果を与えない塩をいう（例えば、Berge, S.M.ら、J.Pharm.Sci.66(1977年)1〜19を参照のこと）。そのような塩を、本発明に含む。そのような塩の例としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩のような非毒性無機塩由来のものが挙げられる。
【００７２】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の種々の方法により投与することができる。当該技術分野の技術者により認められるように、投与経路及び／又は様式は、所望とする結果によって異なる。
【００７３】
本発明の組成物を、特定の投与経路により投与するためには、化合物を、又は共投与する化合物を、その不活性化を防ぐ材料で被覆する必要があるかもしれない。例えば、化合物を患者へ適切な担体、例えばリポソーム又は希釈剤において、投与するとよい。薬学的に許容しうる希釈剤としては、食塩水及び水性緩衝液が挙げられる。
【００７４】
薬学的に許容しうる担体としては、無菌の注射可能な溶液又は分散液の即席調剤用の、無菌水溶液又は分散液並びに無菌粉が挙げられる。薬学的活性物質のためのそのような媒及び剤の使用は、当該技術分野で既知である。
【００７５】
本明細書中で用いる表現「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与様式を意味するが、限定はなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節腔内、関節下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴が挙げられる。
【００７６】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤のような賦形剤を含有してもよい。微生物の存在予防を、滅菌手順又は無菌の製造条件、並びに種々の抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含有せしめることの両者により、確実にするとよい。等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを、組成物中に含有せしめることも望ましいであろう。さらに注射可能な剤形の吸収遷延は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅延させる剤を含有せしめることにより、実現させるとよい。
【００７７】
選択した投与経路に関わらず、本発明の化合物は、適切な水和物形及び／又は本発明の薬学的組成物において用いるとよく、薬学的に許容しうる剤形に、当該技術分野の技術者に既知の慣用の方法により製剤化する。
【００７８】
本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与レベルは、特に患者、組成物及び投与様式について、患者に毒性とならずに、所望とする治療の応答を得るために有効である活性成分を得るように、変えるとよい。選択した投与レベルは、採用した本発明の特別な組成物又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、採用した特別な化合物の投与経路、投与時間、排泄率といった種々の薬物動態因子、治療期間、他の医薬、採用した特別な組成物との組合せで用いた化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康及び以前の薬歴などに依存するが、このような因子は医薬の分野で周知である。
【００７９】
組成物は、組成物がシリンジにより送達可能である程度に、無菌かつ液体でなければならない。水だけでなく、担体は等張の緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコー及び液体ポリエチレングリコールなど）、並びにそれらの適切な混合物であればよい。
【００８０】
適当な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持するとよい。多くの場合、組成物における等張剤、例えば糖、マンニトール又はソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含有せしめることにより実現できる。
【００８１】
前記のように、活性化合物を適切に保護すると、化合物を、例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に経口投与するとよい。
【００８２】
本発明に従う抗体を、リウマチ様関節炎を患った、そしてそのような治療を必要とする患者の処置に用いることができる。従って、本発明はリウマチ様関節炎を患った患者の処置方法を含む。
【００８３】
本発明はさらに、本発明に従う抗体の有効量を薬学的に許容しうる担体と共に含む薬学的組成物の製造方法、及びそのような方法のための本発明に従う抗体の使用を提供する。
【００８４】
以下の実施例、参考文献及び配列表を、本発明の理解を助けるために提供するが、その真の意図は付した特許請求の範囲を説明するものである。本発明の精神を逸脱することなく、説明した手順において、改変することができると解される。
【００８５】
配列の記載
配列番号１は、ラット２Ｄ８の重鎖の可変領域；ラット起源のａａ１〜１９シグナル配列、２０〜１３４可変領域、１３５〜１３９末端フラグメントである。
配列番号２は、ラット２Ｄ８の軽鎖の可変領域；ラット起源のａａ１〜２０シグナル配列、２１〜１２９可変領域、１３０〜１３８末端フラグメントである。
配列番号３は、２Ｄ８キメラＨ鎖（ラット／ヒト）（ＩｇＧ１）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、２Ｄ８キメラＨ鎖（ラット／ヒト）（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、２Ｄ８キメラＬ鎖（ラット／ヒト）のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ＨＵＲＶＨのアミノ酸配列である（図７及び図９）。
配列番号７は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ１のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号８は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ２のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号９は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ３のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１０は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ４のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１１は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ５のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１２は、ＨＵＲＤＩＶＨｖ６のアミノ酸配列である（図７）。
配列番号１３は、ＨＵＲＶＫのアミノ酸配列である（図８及び図１０）。
配列番号１４は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ４のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１５は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ５のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１６は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ７のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１７は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ８のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１８は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ９のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号１９は、ＨＵＲＤＩＶＫｖ１０のアミノ酸配列である（図８）。
配列番号２０は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ１のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２１は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ２のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２２は、ＨＵＲ ＨｕＶＨｖ３のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２３は、ＡＡＢ６７７８５−１のアミノ酸配列である（図９）。
配列番号２４は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ１のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２５は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ２のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２６は、ＨＵＲ ＨｕＶＫｖ３のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２７は、ＣＡＤ４３０２５のアミノ酸配列である（図１０）。
配列番号２８は、ＩＬ−１Ｒのアミノ酸配列である（図１１）。
配列番号２９は、軽鎖の定常領域の配列である（図１４）。
配列番号３０は、重鎖ＩｇＧ４の配列である（図１５）。
配列番号３１は、ＩｇＧ１の定常領域の配列である（図１６）。
配列番号３２は、ＤＥＩ５／８の重鎖の配列である（図１７）。
配列番号３３は、ＤＥＩ５／８の軽鎖の配列である（図１７）。
【００８６】
実施例
実施例１
ｈ−ＩＬ−１Ｒに対するラットモノクローナル抗体の産生
ハイブリドーマの培養
産生したラットモノクローナル抗体を、ＲＰＭＩ １６４０及び血清なしの１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ培地中（Bio Whittaker）、３７℃及び５％ＣＯ２で、培養した。
免疫化手順及びハイブリドーマ発生
５匹のSprague Dawleyラットを、ＳＦ９昆虫細胞で産生させた組換えのヒトＩＬ−１Ｒで、免疫化した。最初の免疫化（１００μgタンパク質）は、完全なフロイントのアジュバントで腹腔内に実施した。全ての他の免疫化は、不完全なフロイントのアジュバントで実施した。モノクローナル抗体は、ラットの脾細胞とＮＳＯ細胞を融合させて、産生した。
【００８７】
実施例２
ＩＬ−１Ｒ特異的ＥＬＩＳＡ
免疫化したマウス血清中の抗ＩＬ−１Ｒタイター又は培養上清中の抗体を、抗原特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＢＳＢＳＡ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中０．１２５μg/mlの濃度の可溶性ビオチン化ｈ−ＩＬ−１Ｒを、１時間室温で、シェーカー上で、９６ウェルプレート（スプレプトアビジンで予備被覆）に被覆した。その後、ウェルをＰＢＳＢＳＡを用いて、３０分間室温でブロックした。血清を１／１００にＰＢＳＢＳＡで予備希釈し、そして１／６４００まで連続希釈した。上清を、ＰＢＳＢＳＡ中１／１００〜１／１００００までの範囲で計算して、希釈した。希釈した血清又は上清をウェルに加え、そして２時間室温で、シェーカー上でインキュベートした。Ｐｒｅ−ｔａｐ血清又は培養培地を、陰性コントロールとして用いた。１２５ng/mlのラット抗ヒトＩＬ−１Ｒ抗体（クローン２Ｄ８）を、陽性コントロールとして用いた。続いて、プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、そして西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ウサギ抗ラットＩｇＧ（Bethyl Laboratories Inc.）と共にインキュベートし、ＰＢＳＢＳＡにおいて、１時間室温のシェーカー上で希釈した。ウェルをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そしてアッセイを新鮮に調製したＴＭ Ｂｌｕｅ（登録商標）（Intergen Company）溶液を用いて、１５〜２０分間室温の暗室中、シェーカー上で発色させた。吸収を、３７０nmで参照波長として４９２nmを用いて測定した。場合により、各ウェルへ２０μlの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して色素反応を止めることができるが、この場合は測定を、４５０nmで参照波長として６９０nmを用いて実施した。結果を、図１に示す。
【００８８】
実施例３
抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体の結合特性の決定
決定は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００で、ＣＭ５チップを用いて実施した。カップリングは、アミンカップリングとして実施した。用いた緩衝液は、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）、ｐＨ７．４、２５℃であった。
ａ）抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体のＩＬ−１Ｒへの親和性の決定
親和性測定のため、抗Ｆｃγ抗体（ウサギ抗ヒト）を、ＩＬ−１Ｒに対する抗体提示のため、チップ表面上へカップリングさせた。抗ＩＬ−１Ｒ抗体を、抗Ｆｃγ抗体に結合させ、そして組換えヒトＩＬ−１Ｒ細胞外ドメインを溶液中種々の濃度で加えた。会合は６０秒のＩＬ−１Ｒインジェクションにより測定し、解離は３分間緩衝液でチップ表面を洗浄することにより測定した。抗体についての親和性定数ＫD（Ｋon／Ｋoff）は、
抗体２Ｄ８ １００pM
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ１） ９３pM
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ４） １０５pM
であった。
全抗体の全測定についてのデータ範囲は７０〜１２０pMであり、従って３個の抗体の親和性は同じ範囲である。
【００８９】
ｂ）ＩＬ−１Ｒへの、抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体のリガンドＩＬ−１の結合との競合
これらの測定については、ａ）と同じ方法を用いた。ｈＩＬ−１Ｒを抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体の２Ｄ８に結合させると、もはやｈＩＬ−１は受容体へ結合しなかった。この抗体は、受容体上でｈＩＬ−１の結合部位をブロックする（図３）。
【００９０】
ｃ）三元複合体構築物ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの、抗ｈＩＬ−１Ｒ２Ｄ８抗体による阻害
三元複合体の検出については、ポリクローナルの抗ＩｇＧ抗体を、融合タンパク質Ｆｃ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９ＮＰＨ３；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の提示のため、チップ表面へカップリングさせた。ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ複合体の溶液中での固定化ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰへの結合を検出した。ｈＩＬ−１Ｒとインキュベートすると、抗ｈＩＬ−１Ｒ２Ｄ８抗体はこの三元複合体ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの形成を阻害した（図４）。
【００９１】
実施例４
ａ）ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害
ヒト繊維芽細胞におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害を、細胞バイオアッセイで決定した。ヒトの胚性肺繊維芽細胞ＭＲＣ−５をｈ−ＩＬβで刺激し、そしてＩＬ−８の産生を一工程のＥＬＩＳＡで決定した。抗ｈ−ＩＬ−１Ｒ抗体の添加による刺激の阻害は、抗体のブロッキング機能を立証する。
バイオアッセイは、以下のアッセイ手順に従って行なった。：
１日目に、ＭＲＣ５細胞をウェル当たり２．５×１０３細胞個の密度で、１００μlの培養培地（１０％ＰＢＳ）に播き、そして２４時間インキュベータ中でインキュベートした。
２日目に、培養培地を除去し、そして試料を５０μlアッセイ培地（１％ＦＢＳ）（精製抗体を試験する場合）又はハイブリドーマ培地ＳＦ（ハイブリドーマ上清を試験する場合）に加えた。ハイブリドーマ上清の最適希釈は、１：１０００と１：１，０００，０００の間であった。インキュベーションは、３０分間インキュベーター内で実施した。続いてｈ−１Ｒ−１β、５０μl／ウェル（２×濃縮！）を、アッセイ培地（１％ＦＢＳ、又はハイブリドーマ上清を試験する場合は２％ＦＢＳ）において、１％の最終ＦＢＳ濃度まで加えた。さらにインキュベーションを３７℃で７時間実施し、そして上清（８０μl）を別の９６ウェルプレートへ移した。
【００９２】
ｂ）ｈ−ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡ
アッセイ（Miller, M.D.及びKrangel, M.S.、評論Rev.Immunol.12(1992年)17〜46）を、製造者のプロトコール（R&D Systems、米国）に従って、未希釈の上清（血液及び脳脊髄液試料についてのプロトコール）を用いて実施した。刺激の最大（抗体を用いないコントロール）は、およそ７５０pg/mlのＩＬ−８であった。抗体によるＩＬ−８分泌の阻害についてのＩＣ５０を図５に示す。
抗体２Ｄ８ ７．２pM（１．０８ng/ml）
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ１） ４．７pM（０．７１ng/ml）
キメラ２Ｄ８（ＩｇＧ４） ５．１pM（０．７７ng/ml）
本発明に従う抗体を用いた全実験の範囲は、４．０〜３５．０pMであった。
２Ｄ８の、ＩＬ−１Ｒに対する市販で入手可能な抗体との、このＭＲＣ−５バイオアッセイにおける比較を、表１に示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】
図７〜１０のアミノ酸配列に基づき、ヒト化及びＴ細胞抗原枯渇抗体のパネルを変異誘発により構築し、そしてｈ−ＩＬ−８−ＥＬＩＳＡによりＩＣ５０について調べる。結果を、抗体２Ｄ８（１．０）に関して、表２に示す。
用いた略記の説明：
ＨＵＭ：図９及び図１０の配列の組合せ
ＤＥＩ：図７及び図８の配列の組合せ
ＨＵＭ２／２：配列ＨＵＲＨｕＶＨｖ２及びＨＵＲＨｕＶＫｖ２の組合せ
ＤＥＩ１／８：配列ＨＵＲＤＩＶＨｖ１及びＨＵＲＤＩＶＫｖ８の組合せ
【００９５】
【表２】
【００９６】
ｃ）ＥＬＩＳＡによる免疫活性の決定
２Ｄ８抗体と比較した抗体の相対的な免疫活性を、ＥＬＩＳＡにより決定した。可溶性ビオチン化ヒトＩＬ−１Ｒを、室温で１時間９６ウェルプレート（ストレプトアビジンで予備被覆した）に被覆した。ＢＳＡでブロッキング後、抗体を希釈し、そしてウェルに加えて、室温で２時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、そして西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）複合ウサギ抗ラットＩｇＧと共に室温で１時間インキュベーションした。さらに洗浄後、結合した抗体量を、ＴＭ−Ｂｌｕｅ（登録商標）を添加して３７０ｎでの吸収を測定することにより決定した。
結果を、表３に示す。
【００９７】
【表３】
【００９８】
実施例５
ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生の阻害
抗体２Ｄ８の、ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生を阻害するブロッキング能を評価するために、バイオアッセイを実施した。ヘパリン（１９U/ml）を用いて採取したヒト血液を１０ng/mlのｈ−ＩＬ１βを用いて刺激し、そしてＩＬ−８の産生を一工程のＥＬＩＳＡで決定した。抗ｈ−ＩＬ−１Ｒ抗体の添加による刺激の阻害は、ヒトのｅｘ ｖｉｖｏアッセイにおける抗体のブロッキング機能を証明する。ＩＬ−１と共に抗体の存在下又は欠損下においてインキュベーションを３７℃で１６時間実施し、１：５希釈した試料をＩＬ−８存在について製造者のプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）に従って試験した以外は、実施例４の記載に従って、バイオアッセイを実施した。ヒト血液におけるＩＬ−１誘導のＩＬ−８産生は、１００ng/mlの２Ｄ８抗体の濃度で〜５０％阻害した（図６を参照のこと）。
【００９９】
実施例６
抗体の組換え体産生
マウス可変領域に連結したヒト定常領域からなるキメラの抗体を発現するためのベクターを、構築した。２つのキメラの重鎖の発現ベクターを、発現ベクターｐＳＶｇｐｔにおいてヒトＩｇＧ１及びヒトＩｇＧ４定常領域に連結した抗ＩＬ１ＲラットＶＨからなるように構築した。キメラの軽鎖のベクターは、発現ベクターｐＳＶｈｙｇにおいてヒトＣカッパに連結した抗ＩＬ−１ＲラットＶＫからなるように、構築した。リーダーシグナルペプチド、リーダーイントロン及びマウスの免疫グロブリンプロモーターを含む５フランキング配列、並びにスプライス部位及びイントロン配列を含む３フランキング配列を、キメラの発現ベクターへ導入した。重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、ＮＳ０細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ８５１１０５０３、マウスミエローマを産生する非免疫グロブリン）へ、エレクトロポレーションにより共トランスフェクションした。トランスフェクションした細胞クローンを、ヒトＩｇＧについてのＥＬＩＳＡによりヒト抗体の産生のためスクリーニングした。
【０１００】
実施例７
ＩＬ−１Ｒの脱グリコシル化
形質転換したＳＦ９昆虫細胞の上清から精製した組換えの可溶性ヒトタイプ１ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）（アミノ酸配列については、図１１を参照のこと）５μgを、３ｍＵのノイラミニダーゼ（Ｎ）（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国；No.269611）、０．３ＵのＮ−グリコシダーゼＦ（Roche Diagnostics GmbH、ドイツ国；No.1347101）と、それぞれ３７℃で１７時間インキュベーションした。遠心分離後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図１２）により、ＩＬ−１Ｒ（レーン１）の分子量がＮ−グリコシダーゼＦ（レーン３）とのインキュベーションでは約９kDa減少した一方で、ノイラミニダーゼ（レーン２）及びＯ−グリコシダーゼ（レーン４）とのインキュベーションでは分子量の有意な変化は観察されないことを実証した。ノイラミニダーゼとＮ−グリコシダーゼＦとの組み合わせ（レーン５）、Ｏ−グリコシダーゼとＮ−グリコシダーゼＦとの組み合わせ（レーン６）、又は全３つの組み合わせ（レーン８）は、炭水化物側鎖のさらなる開裂という結果にはならなかった。ノイラミニダーゼ及びＯ−グリコシダーゼの組み合わせでは、炭水化物側鎖を除去しなかった（レーン７）。
データは、ＩＬ−１Ｒが１つ以上の可能性のあるＮ−グリコシル化部位でグリコシル化し、そしてＮ連結グリコシル化がＮ−グリコシダーゼＦとのインキュベーションにより完全に除去されうることを実証する。Ｏ連結グリコシル化は、検出しなかった。
２Ｄ８抗体についてのウェスタンブロットのデータを、図１３に示す（レーンは、図１２にならう）。
【０１０１】
実施例８
エピトープの決定
抗原分子上の抗体の結合領域（エピトープ）を、ブロッティング及びｐｅｐｓｃａｎ分析により決定した。
ブロッティング分析については、天然の又は変性した組換えの、可溶性ヒトＩＬ−１Ｒ（ｒｓｈＩＬ−１Ｒ）試料をメンブレンに直接スポットし、抗ｈＩＬ１Ｒ抗体とインキュベーションし、そして抗ＦＣガンマ−ＰＯＤ抗体を用いて化学発光検出により検出した。さらに、ｒｓｈＩＬ−１ＲをＮ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化して、グリコシル化及び脱グリコシル化した両ｒｓｈＩＬ−１ＲをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で変性条件を下げて分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜上でブロットし、抗ｈＩＬ−１Ｒ抗体と共にインキュベーションし、そして抗ＦＣγ−ＰＯＤ抗体を用いて化学発光検出により検出した。
ドットブロット分析では、本発明に従う抗体が特異的にｒｓｈＩＬ−１Ｒへ、自然の又は変性条件下で結合することを示した。最後に、ウェスタンブロット分析では、本発明に従う抗体はグリコシル化ｒｓｈＩＬ１Ｒ（天然又は変性）のみを認識することを示した。脱グリコシル化したｈＩＬ１Ｒは、ウェスタンブロット分析では検出されなかった。他のグリコシル化タンパク質（例えば、エリスロポエチン、カルボキシペプチダーゼＹ）は、本発明に従う抗体により認識せず、グリコシル化ｒｓｈＩＬ−１Ｒの認識の特異性が高い。
さらに、ｒｓｈＩＬ−１Ｒの細胞外ドメインを表すビオチン化ペプチド（２０個のアミノ酸）を、抗ＩＬ−１Ｒ／ｒｓｈＩＬ−１Ｒ ｐｅｐｃａｎ分析での使用のために合成した。ペプチドは１０個のアミノ酸が重なり、そして不活性なＮ末端ビオチン化スペーサーを含む。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレートへカップリングさせ、抗ｈＩＬ１Ｒ抗体とインキュベーションし、そして抗ＦＣγ抗体を用いて検出した。結合したペプチドは認識されるＩＬ−１Ｒの配列エピトープを表す。
【０１０２】
実施例９
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストの存在下での、ＩＬ−１Ｒへの２Ｄ８及びＤＥＩ５／８の結合
ＩＬ−１Ｒとの抗ＩＬ−１Ｒ抗体のタンパク質タンパク質相互作用を、表面プラスモン共鳴によりBiacore 3000 Systemを用いて分析した。会合速度は、２分間の注入により決定し；解離速度は３分間の洗浄工程により測定した。陰性コントロールのデータを系の内因性ベースラインドリフトの補正及びノイズシグナル減少のためにオリジナルの曲線から引いた。抗体及びチップ表面に固体化したＩＬ−１Ｒを用いた２つのアッセイ形式を、本研究で用いる。
ａ）抗ＩＬ−１Ｒ抗体２Ｄ８を、チップ表面上（ＣＭ５）にアミンカップリングにより共有的に固定する。ＩＬ−１Ｒを１０nMの濃度で、大量トランスファー条件下で注入して、阻害研究での参照として働く最大のシグナルを決定した。ＩＬ−１Ｒ（１０nM）結合の阻害を、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ＩＬ−ベータ又はＤＥＩ５／８の濃度を増大して（０．７８〜１００nM）ＩＬ−１Ｒをプレインキュベーション（ＨＢＳ−Ｐ緩衝液中で少なくとも２０分間室温で）することにより、測定する。続いて、試料をフローセルへ注入し、そして固定化２Ｄ８抗体との相互作用を決定する。
ｂ）ＩＬ−１ベータを、チップ表面上（ＣＭ５）にアミンカップリングにより共有的に固定する。ＩＬ−１Ｒを１０nMの濃度で、大量トランスファー条件下で注入して、参照値としてはたらく最大シグナルを決定した。ｒｓｈＩＬ−１Ｒ（１０nM）結合の阻害を、ＩＬ−１Ｒアンタゴニスト、ｒｓｈＩＬ−１ベータ又はＤＥＩ５／８の濃度を増大して（０．７８〜１００nM）ＩＬ−１Ｒをプレインキュベーションすることにより、測定する。続いて、試料をフローセルに注入し、そして固定化ｒｈＩＬ−１ベータとの相互作用を決定する。
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは、第一のアッセイでは、１００μMの濃度でＩＬ−１Ｒ結合の阻害を示さない。ＩＬ−１ベータは８nMで、ＤＥＩ５／８は２nMで、最大半量の阻害（ＩＣ５０）を示す。第二のアッセイでは、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは４nMの、ＤＥＩ５／８は２nMの、そして２Ｄ８は２nMの阻害活性（ＩＣ５０）を示す。
ＩＬ−１Ｒアンタゴニストは２Ｄ８へのＩＬ−１Ｒの結合を、１００μMまでの濃度では阻害せず、２Ｄ８及びＩＬ−１Ｒアンタゴニストは競合する様式でＩＬ−１Ｒへ結合しないと結論する。２Ｄ８は結合に際してＩＬ−１Ｒの直接のコンフォメーションの変化を導く。このＩＬ−１Ｒのコンフォメーションの変化は、もはやＩＬ−１Ｒアンタゴニストの受容体への結合を許さない。受容体への結合において、ＩＬ−１Ｒアンタゴニストに対し、２Ｄ８及びＤＥＩ５／８はアロステリック阻害を示す。ＩＬ−１ベータは２Ｄ８へのＩＬ−１Ｒの結合を阻害し、ＩＬ−１ベータ及び２Ｄ８のＩＬ−１Ｒへの競合的結合を示唆する。
【０１０３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、２Ｄ８抗体についてのＥＬＩＳＡ結合アッセイである。
【図２】図２は、２Ｄ８抗体のＩＬ−１Ｒへの親和性の決定である。
【図３】図３は、ＩＬ−１Ｒへの、２Ｄ８抗体のリガンドＩＬ−１の結合との競合である。
【図４】図４は、２Ｄ８抗体による三元複合体構築物ｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒ／ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃＰの阻害である。上の線：ｈＩＬ−１Ｒ ＡｃｐへのｈＩＬ−１／ｈＩＬ−１Ｒの結合下の線：抗体２Ｄ８の添加
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＭＲＣ−５細胞におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図６】図６は、ヒトの血液におけるＩＬ−１誘導ＩＬ−８産生の阻害である。
【図７】図７は、Ｔ細胞エピトープを欠く重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図８】図８は、Ｔ細胞エピトープを欠く軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図９】図９は、ヒト化した重鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図１０】図１０は、ヒト化した軽鎖の可変領域のアミノ酸配列である。
【図１１】図１１は、ＩＬ−１Ｒのアミノ酸配列である。ボールドのＮ：可能なグリコシル化部位
【図１２】図１２は、グリコシル化ＩＬ−１Ｒの、グリコシダーゼでの処理後のＳＤＳ ＰＡＧＥである。
【図１３】図１３は、グリコシル化及び脱グリコシル化ＩＬ−１Ｒとの２Ｄ８のウェスタンブロットである。
【図１４】図１４は、軽鎖の定常領域である。
【図１５】図１５は、重鎖の定常領域である（ＩｇＧ４）。
【図１６】図１６は、重鎖の定常領域である（ＩｇＧ１）。
【図１７】図１７は、ＤＥＩ５／８の重鎖及び軽鎖である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１Ｒに結合し、そしてＩＬ−１ＲへのヒトＩＬ−１の結合を阻害する抗体であって、該抗体が、ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）のようなヒトの繊維芽細胞におけるＩＬ−１が媒介するＩＬ−８及びＩＬ−６の分泌の阻害について、３５pM以下のＩＣ５０値を示す、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得ることができるか、又はキメラの、ヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗体変異体又は該抗体のフラグメントあることを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＬ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）により産生されることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ＣＨ１とＣＨ２との間の約ａａ２２０〜２４０でのヒンジ領域及び／又はＣＨ２とＣＨ３との間の約ａａ３３０の第２インタードメイン領域内で改変された、ＩｇＧ４アイソタイプのものであるか、又はＩｇＧ１アイソタイプのものであることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、図７〜１０及び図１４〜１６から選択される可変領域及び定常領域を示すことを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
約３００pM以下（ＫD）の親和性を特徴とする、請求項１〜４記載の抗体。
【請求項６】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）として、以下の配列：
ａ）重鎖内に、ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）、並びに
ｂ）軽鎖内に、ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）
を含むことを特徴とする、請求項１〜５記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ラット起源のものであることを特徴とする、請求項１〜６記載の抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得ることができる、請求項１〜７記載の抗体。
【請求項９】
薬学的組成物の製造のための請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１０】
薬学的有効量で請求項１〜８記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項１１】
ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）。
【請求項１２】
請求項１〜８記載の抗体の薬学的有効量を含む薬学的組成物の製造方法。
【請求項１３】
以下に定義する他の抗体鎖とそれぞれアセンブルすることができるポリペプチドをコードしている核酸であって、該ポリペプチドが
ａ）ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）を含む抗体重鎖、又は
ｂ）ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）を含む抗体軽鎖
のいずれかである、核酸。
【請求項１４】
原核宿主細胞又は真核宿主細胞内で前記核酸を発現することができる、請求項１３記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項１６】
ＩＬ−１Ｒに結合し、そしてＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合を阻害するポリペプチドの製造方法であって、請求項１３記載の重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコードする核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞内で発現すること、並びに該ポリペプチドを該細胞から回収することを特徴とする、製造方法。
【請求項１７】
抗炎症治療を必要とする患者の処置方法であって、患者に請求項１〜８記載の抗体の治療学的有効量を投与することを特徴とする、処置方法。
【請求項１８】
本発明に従う抗体の製造方法であって、抗体２Ｄ８の可変領域の配列において、図７〜１０に示したそれぞれの読み枠にはめたアミノ酸に、１個以上のアミノ酸を突然変異、欠失又は付加し、発現ベクターを図１４〜１６に示すように、連続する読み枠において、該改変した抗体の可変領域及び追加のヒト定常領域をコードする核酸を含んで製造し、発現を宿主細胞内で実施し、そして組換えにより産生した抗体の軽鎖及び重鎖を本発明に従う抗体とアセンブルすることを特徴とする、製造方法。
【請求項１】
ヒトＩＬ−１Ｒに結合し、そしてＩＬ−１ＲへのヒトＩＬ−１の結合を阻害する抗体であって、該抗体が、ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）のようなヒトの繊維芽細胞におけるＩＬ−１が媒介するＩＬ−８及びＩＬ−６の分泌の阻害について、３５pM以下のＩＣ５０値を示す、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得ることができるか、又はキメラの、ヒト化した、若しくはＴ細胞エピトープを欠く抗体変異体又は該抗体のフラグメントあることを特徴とする抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ハイブリドーマ細胞系ＭＡＬ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）により産生されることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、ＣＨ１とＣＨ２との間の約ａａ２２０〜２４０でのヒンジ領域及び／又はＣＨ２とＣＨ３との間の約ａａ３３０の第２インタードメイン領域内で改変された、ＩｇＧ４アイソタイプのものであるか、又はＩｇＧ１アイソタイプのものであることを特徴とする、請求項１又は２記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、図７〜１０及び図１４〜１６から選択される可変領域及び定常領域を示すことを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
約３００pM以下（ＫD）の親和性を特徴とする、請求項１〜４記載の抗体。
【請求項６】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）として、以下の配列：
ａ）重鎖内に、ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）、並びに
ｂ）軽鎖内に、ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）
を含むことを特徴とする、請求項１〜５記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ラット起源のものであることを特徴とする、請求項１〜６記載の抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）から得ることができる、請求項１〜７記載の抗体。
【請求項９】
薬学的組成物の製造のための請求項１〜８記載の抗体の使用。
【請求項１０】
薬学的有効量で請求項１〜８記載の抗体を含有する薬学的組成物。
【請求項１１】
ハイブリドーマ細胞系ＭＡＫ＜ｈ−ＩＬ−１ＲＩ＞２Ｄ８（ＤＳＭ ＡＣＣ ２６０１）。
【請求項１２】
請求項１〜８記載の抗体の薬学的有効量を含む薬学的組成物の製造方法。
【請求項１３】
以下に定義する他の抗体鎖とそれぞれアセンブルすることができるポリペプチドをコードしている核酸であって、該ポリペプチドが
ａ）ＣＤＲｓとして、配列番号１のＣＤＲ１（ａａ４５〜５４）、ＣＤＲ２（ａａ６９〜８４）及びＣＤＲ３（ａａ１１７〜１２３）を含む抗体重鎖、又は
ｂ）ＣＤＲｓとして、配列番号２のＣＤＲ１（ａａ４３〜５７）、ＣＤＲ２（ａａ７３〜７９）及びＣＤＲ３（ａａ１１２〜１２０）を含む抗体軽鎖
のいずれかである、核酸。
【請求項１４】
原核宿主細胞又は真核宿主細胞内で前記核酸を発現することができる、請求項１３記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のベクターを含む原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項１６】
ＩＬ−１Ｒに結合し、そしてＩＬ−１ＲへのＩＬ−１の結合を阻害するポリペプチドの製造方法であって、請求項１３記載の重鎖をコードする核酸及び軽鎖をコードする核酸を原核宿主細胞又は真核宿主細胞内で発現すること、並びに該ポリペプチドを該細胞から回収することを特徴とする、製造方法。
【請求項１７】
抗炎症治療を必要とする患者の処置方法であって、患者に請求項１〜８記載の抗体の治療学的有効量を投与することを特徴とする、処置方法。
【請求項１８】
本発明に従う抗体の製造方法であって、抗体２Ｄ８の可変領域の配列において、図７〜１０に示したそれぞれの読み枠にはめたアミノ酸に、１個以上のアミノ酸を突然変異、欠失又は付加し、発現ベクターを図１４〜１６に示すように、連続する読み枠において、該改変した抗体の可変領域及び追加のヒト定常領域をコードする核酸を含んで製造し、発現を宿主細胞内で実施し、そして組換えにより産生した抗体の軽鎖及び重鎖を本発明に従う抗体とアセンブルすることを特徴とする、製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２００７−５２７２３０（Ｐ２００７−５２７２３０Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５７６１（Ｐ２００６−５２５７６１）
【出願日】平成１６年９月９日（２００４．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１００４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３８７２
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月９日（２００４．９．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１００４７
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２３８７２
【国際公開日】平成１７年３月１７日（２００５．３．１７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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