イン・サイチュー解析のためのオリゴヌクレオチドプローブおよびタンパク質を標識するためのオリゴヌクレオチド
【課題】細胞もしくは組織サンプル中の複数の核酸標的遺伝子または抗原を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブコレクションを提供する。
【解決手段】細胞もしくは組織サンプル中の特定の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションもしくは「カクテル」を提供する。カクテルは、次のものを検出するために有用である：κ遺伝子；λ遺伝子；ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）遺伝子；ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒＲＮＡ）遺伝子；Ａｌｕ；ポリＡ；および検出テール。
【解決手段】細胞もしくは組織サンプル中の特定の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションもしくは「カクテル」を提供する。カクテルは、次のものを検出するために有用である：κ遺伝子；λ遺伝子；ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）遺伝子；ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−ＢａｒｒＲＮＡ）遺伝子；Ａｌｕ；ポリＡ；および検出テール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸遺伝子標的を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブのコレクションに関する。特に、本発明はオリゴプローブのコレクションに関する。
【背景技術】
【０００２】
イン・サイチュー解析はイン・サイチューのハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を含む。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞もしくは組織サンプル中の標的とする核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、標的遺伝子配列もしくは転写物に対してアンチセンスである標識したＤＮＡもしくはＲＮＡプローブ分子を用いる。ＩＳＨは、発生生物学、細胞生物学および分子生物学を含む、多数の生物医療分野において有用な道具であることが分かっている。ＩＳＨは、例えば、遺伝障害を診断したり、遺伝子をマッピングしたり、遺伝子発現を研究したり、そして標的遺伝子発現の部位を局在化するために使用されてきた。
【０００３】
典型的には、ＩＳＨは、ガラススライド上に固定化した細胞もしくは組織サンプルを、細胞もしくは組織サンプル中の特定の標的遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる標識した核酸プローブに接触させることによって実施される（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。細胞もしくは組織サンプル中の核酸への標識したプローブ分子のハイブリダイゼーションは、次に、例えば、放射能に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法、またはＢｒｄＵのようなハプテンに結合している蛍光標識したタンパク質、プローブ中に組み入れられたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したヌクレオチドの結合に基づく間接検出法を用いて検出することができる。ハプテンに基づく方法は、さらに、結合性タンパク質−酵素複合体、例えば抗体−酵素複合体によって結合されるそれらの分子および比色法に基づく検出化学を含めるように拡張された。さらに、いくつかの標的遺伝子が、複数の異なる核酸タグで標識された複数の核酸プローブに細胞もしくは組織サンプルを接触させることによって同時に解析することができる。例えば、複数の核酸プローブが、異なる発光波長をもつ複数の蛍光化合物により標識することができ、それによって単一の標的細胞もしくは組織サンプルにおいて１段階で実施される同時多重発色分析を可能にする。
【０００４】
オリゴヌクレオチドプローブ中への標識したヌクレオチドの組み入れに伴う重要な問題は、通常、ヌクレオチドに結合している複合部分が、ワトソン・クリック塩基対の形成を妨害し、その結果その標的へのプローブのハイブリダイゼーションにネガティブに影響することである。このことは、非置換シトシン（１級アミン）と形成される自然のＧ−Ｃ結合に較べて、立体障害および２級アミンの低い反応性状態への予期されるシフト（Ｎ４標識したシトシンに見られるような）のために、Ｎ４−置換されたシトシンヌクレオチドを介して結合された標識の使用に関して見られた。小さいヌクレオチド（２５〜５０塩基）における何らかの小変化またはＧ−Ｃ結合の妨害は、意図した標的配列とハイブリダイズするこれらのオリゴの能力を低下させることがある。
【０００５】
オリゴヌクレオチド中に標識したヌクレオチドを組み入れるために適当なプローブ設計を開発する技術上の必要性が残っている。本発明者らは、数種の人工配列が、プローブ標識のための効果的に機能する代替物であり、そしてまた細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、単独でも、また複合したオリゴヌクレオチドプローブ混合物においても働くことを例証する。プローブコレクションのためのそのよ
うな遺伝子配列の開発および標識戦略は、医療、遺伝子および分子生物学技術における広い応用性を有する。
【０００６】
標識化学によるこの妨害およびハイブリダイゼーションストリンジェンシーおよび動力学が、本明細書において、少なくとも２つの別個の機能性ドメイン、すなわち遺伝子特異的であり、塩基対形成に必要である１つのドメインもしくは配列、およびスペーシングヌクレオチドと標識したヌクレオチドからなる人工的な非特異的配列（サンプルのゲノムに関して）である第２ドメインを有するオリゴを設計することによって解決される。これらの要素は、これらの標識ヌクレオチドがタンパク質（免疫グロブリンもしくはアビジン）を結合するためにハプテンとして一層作用しやすく、したがって遺伝子に特異的なドメインにおいてワトソン・クリック塩基対を妨害しないように置かれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．Ｒ．Ｃｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．ｄｅ Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ，ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９２）
【非特許文献２】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｈ．Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｋ．Ｌ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｂａｒｃｈａｓ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）
【非特許文献３】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、オリゴヌクレオチドプローブ中に標識を組み入れるための新規戦略および標識されたオリゴヌクレオチドプローブのコレクションを提供する。特に、本発明は、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析における使用のために、オリゴヌクレオチドプローブのコレクション中に組み入れることができるそのような配列の反復ポリマーを作成するための配列式を用いる非遺伝子特異的配列に関する。さらに、配列式に基づく標識された合成オリゴヌクレオチドポリマーを使用することは、結合性タンパク質、すなわち免疫グロブリンに複合された場合には、免疫組織化学的解析において使用されるそのようなタンパク質を標識するための非常に効果的な、そして制御される方法である。本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の特定核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションもしくは「カクテル」を提供する。カクテルは、次のものを検出するために有用である：κ遺伝子（配列番号：１から１６まで）；λ遺伝子（配列番号：１７から１９まで）；ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）遺伝子（配列番号：３０から５０まで）；ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ初期ＲＮＡ）遺伝子（配列番号：５１から５４まで）；Ａｌｕ（配列番号：５５から５６まで）；ポリＡ（配列番号：５７）；および検出テール（配列番号：５８）。
【０００９】
本発明は、配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nおよびその相補体（ＡＡＡＡＴＡＧ）n［式中、「ｎ」は少なくとも１である］を含んでなるオリゴヌクレオチド標識ドメインに向けられる。
【００１０】
また、本発明は、少なくとも２つの別個の機能性ドメイン、請求項２の標識ドメインを含んでなる第１のドメイン、および遺伝子に特異的な標的配列を含んでなる第２のドメイ
ンを有するオリゴヌクレオチドプローブに向けられる。
【００１１】
また、本発明は、プローブが配列番号：１から１６までより本質的になる群から選ばれるκ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核（ｈｅｔｅｒｅｏｎｕｃｌｅａｒ）ＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１２】
また、本発明は、プローブが配列番号：１７から２９までより本質的になる群から選ばれるλ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核ＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１３】
また、本発明は、プローブが配列番号：３０から５０までより本質的になる群から選ばれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型ＲＮＡおよび／または対応するｍＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１４】
また、本発明は、プローブが配列番号：５１から５４までより本質的になる群から選ばれるＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）初期ＲＮＡ、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２、（ＥＢＥＲ）を検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１５】
また、本発明は、プローブが配列番号：５５および５６より本質的になる群から選ばれるヒトＡｌｕ反復サテライトゲノムＤＮＡ配列を検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１６】
本発明の特定の好適な実施態様は、以下のある好適な実施態様および請求項のより詳細な記述から明らかになるであろう。
【００１７】
図１は、２ドメインプローブ設計の遺伝子プローブ構造を図解している。これは、次の実施例において記述される遺伝子特異的カクテルにおけるプローブのために使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。各プローブは、２つのドメイン：５’標識ドメインおよび３’標的遺伝子の標的遺伝子に特異的なドメインからなる。標識ドメインは、この特異配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nからなり、この場合、各シトシンは、発蛍光団もしくはシトシン−ハプテン複合体により標識されてもよく、この実施態様ではハプテンはフルオレセインである。この図は、具体的には、３０１（配列番号：５５）および３０２（配列番号：５６）プローブについての核酸配列を示し、これらの各々は、ヒト反復Ａｌｕ配列に対応する標的遺伝子の遺伝子特異的ドメインおよびフルオレセインハプテンを有する標識ドメインを保持する。
【００１８】
図２は、標識ドメインを含んでなるプローブ（３３０プローブ；配列番号：５８）を用いるヒト皮膚組織のイン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、これらのＩＳＨ実施例において使用されたオリゴヌクレオチドに共通する標識ドメインの配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴが、それがハイブリダイズしないためにヒト核酸配列とワトソン・クリック塩基対を形成する能力において非特異的で、そして非反応性であることを示している。
【００１９】
図３は、標識ドメインおよびポリｄ（Ｔ）標的遺伝子特異的ドメインを含んでなるプローブ（３２０プローブ；配列番号：５７）を用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。細胞質に局在される検出可能なシグナルの存在は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることができることを示している。
【００２０】
図４Ａ−４Ｂは、組織サンプルが、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボ
ヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）場合の、３２０プローブを用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡに共通するポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることを示している。
【００２１】
図５Ａ−５Ｂは、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄が室温（Ａ）または３７℃（Ｂ）で実施された場合の、３２０プローブを用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。この結果は、より強い発色がより低いストリンジェント条件を示すことによって、発色の強度がハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関係することを示している。
【００２２】
図６は、３２０プローブを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。これは、このプローブ設計がまた包埋細胞系ならびに包埋組織を用いて機能することを示している。
【００２３】
図７は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２４】
図８は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２５】
図９は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるラット細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、このプローブコレクションがヒト核酸配列に特異的であることを示している。
【００２６】
図１０は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ） ＥＢＥＲ核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：５１から５４まで）を用いるＥＢＶ陰性ヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２７】
図１１は、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２８】
図１２は、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２９】
図１３Ａ−１３Ｂは、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明するが、この場合、組織サンプルは、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがヒトＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることを示している。
【００３０】
図１４は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１５）を用いるκ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３１】
図１５は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：２−４、配列番号：７−１２、配列番号：１４，１５）を用いるリンパ腫組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）のリンパ腫組織はκ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はλ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、κ軽鎖プローブコレクションがκ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【００３２】
図１６は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３３】
図１７は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒトＲＰＭＩ ８２２６細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３４】
図１８Ａ−１８Ｂは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織はλ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はκ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、λ軽鎖プローブコレクションがヒトλ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【００３５】
図１９は、ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ポジティブヒト肺組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する（ＣＭＶ感染細胞）。
図２０は、ＣＭＶ即時型ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されなかったラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３６】
図２１Ａ−２１Ｂは、ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されたラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織は倍率４０Ｘにおいて示され、そして（Ｂ）の組織は倍率２０Ｘにおいて示される。
【００３７】
＜好適な実施態様の詳細な記述＞
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブコレクションを提供する。特に、本発明は、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析における使用のためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションに関する。
【００３８】
より具体的には、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブまたはタンパク質に検出可能な部分（標識）を結合するためのヌクレオチドポリマーまたは標識ドメインについての特定の配列式の使用に関する。これらの配列もしくはその誘導体の特定の利用は、ハイブリ
ダイゼーション条件の標準ストリンジェンシー下では検出可能なレベルにおいてヒトＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズしないという不活性または非反応性の特性である。これらの標識ドメインまたはポリマーは、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析において細胞もしくは組織サンプル中の遺伝子に特異的な配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ中への組み入れに有用な遺伝子配列であることが例証された。さらに、この不活性な配列のセットは、免疫組織化学的解析においてハプテンおよび抗原を検出するために、免疫グロブリンもしくは他のタンパク質に標識を結合させるために有用である。
【００３９】
本明細書で使用されるように、用語「プローブ」もしくは「オリゴヌクレオチドプローブ」は、相補的核酸標的遺伝子を検出するために使用される核酸分子を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸（または相補体）配列が結合して二本鎖核酸分子を形成する過程を指す。例えば、放射性もしくは蛍光タグにより標的核酸分子を標識することによって、プローブと標的遺伝子間の相互作用が検出できる。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびコレクションのオリゴヌクレオチドプローブは慣用の方法を用いて合成される。参照、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２０：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ １６５−８９（Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，１９９３）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，１９９１）。
【００４２】
本発明の好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別個のドメイン：５’（または標識）ドメインおよび３’（または遺伝子に特異的な標的）ドメインを保持する（参照、図１Ａ）。本発明のより好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nおよび／または配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなる標識ドメインを保持する。また、他の実施態様が本明細書において例証され、これは２つの末端の標識ドメインおよび中央の遺伝子特異的標的ドメインを有する３重ドメイン態様も含む。具体的には、配列番号：１２５−１２６がこの標識スキームを表している。なお、標識ドメインのさらなる好適な実施態様は、ＴＣ（ＴＴＴＴＡＴＣ）nまたはその相補体である。この配列は（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴ標識ドメインと同じくらい独特であると予想される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特定の細胞もしくは組織において該プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが検出できるように標識される。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析における使用のために許容される標識は当業者には既知である。そのような標識は、例えば、放射能に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法と共役されたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したプローブ、または抗体−酵素に基づく検出法と共役されたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したプローブを用いて、プローブと標的遺伝子間の相互作用が検出されるのを可能にする。本発明の好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブはフルオレセインにより標識される。本発明のより好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、シトシンヌクレオチドが、直接検出のための発蛍光団、または間接検出のためのハプテンにより標識されてもよい配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなる標識ドメインを保持する。いずれにおいても、フルオレセイン−シトシンヌクレオチド複合体およびフルオレセイン分子は、ＯＢＥＡ結合を介してシトシンのＮ４位に結合される（引用によって本明細書に組み入れられているＭｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６８４，１４２号参照）。好適な実施態様では、標識ドメインに結合される発蛍光団の密度は、標識ドメインのみに対して測定された場合、少なくとも７モル％、好ましくは
少なくとも１０モル％、もっとも好ましくは少なくとも１６モル％である。例えば、プローブ４０１が考えられる場合（２ドメインプローブ）、それは、Ｃがまた標識される３’末端ＣＴを含む３０塩基の標識ドメインを含有し、モル％は５／３０＝１６．７モル％標識である。プローブ全体では、モル％は８．３である。
【００４３】
本発明の幾つかの実施態様では、いくつかの標的遺伝子が、複数の異なる核酸タグで標識された複数の核酸プローブに細胞もしくは組織サンプルを接触させることによって同時に解析される。例えば、複数の核酸プローブが、異なる発光波長をもつ複数の蛍光化合物により標識でき、それによって単一の標的細胞もしくは組織サンプルにおいて１段階で実施される同時多色分析を可能にする。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブコレクションは、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためにＩＳＨ解析において使用することができる。ＩＳＨ解析は、例えば、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．Ｒ．Ｃｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．ｄｅ Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ，ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９２）；Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｈ．Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｋ．Ｌ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｂａｒｃｈａｓ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；またはＩｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）において記述されるように実施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】２ドメインプローブ設計の遺伝子プローブ構造を図解する。これは、上記実施例において記述される遺伝子特異的カクテルにおけるプローブのために使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。各プローブは、２つのドメイン：５’標識ドメインおよび３’標的遺伝子の標的遺伝子に特異的なドメインからなる。標識ドメインは、この特異配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなり、この場合、シトシンヌクレオチドは、シトシン−ハプテン複合体であり、この実施例ではハプテンはフルオレセインである。この図は、具体的には、３０１（配列番号：５５）および３０２（配列番号：５６）プローブについての核酸配列を示し、これらの各々は、ヒト反復Ａｌｕ配列に対応する標的遺伝子の遺伝子特異的ドメインおよびフルオレセインハプテンを有する標識ドメインを保持する。
【図２】標識ドメインを含んでなるプローブ（３３０プローブ；配列番号：５８）を用いるヒト皮膚組織のイン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、これらのＩＳＨ実施例において使用されたオリゴヌクレオチドに共通する標識ドメインの配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴが、それがハイブリダイズしないためにヒト核酸配列とワトソン・クリック塩基対を形成する能力において非特異的で、そして非反応性であることを示している。
【図３】標識ドメインおよびポリｄ（Ｔ）標的遺伝子特異的ドメインを含んでなるプローブ（３２０プローブ；配列番号：５７）を用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。細胞質に局在される検出可能なシグナルの存在は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズできることを示している。
【図４】組織サンプルが、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）場合の、３２０プローブを用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡに共通するポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることを示している。
【図５】ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄が室温（Ａ）または３７℃（Ｂ）で実施された場合の、３２０プローブを用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。この結果は、より強い発色がより低いストリンジェント条件を示すことによって、発色の強度がハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関係することを示している。
【図６】３２０プローブを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。これは、このプローブ設計がまた包埋細胞系ならびに包埋組織を用いて機能することを示している。
【図７】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図８】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図９】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるラット細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、このプローブコレクションがヒト核酸配列に特異的であることを示している。
【図１０】Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ） ＥＢＥＲ核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：５１から５４まで）を用いるＥＢＶ陰性ヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１１】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１２】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１３】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明するが、この場合、組織サンプルは、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがヒトＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることを示している。
【図１４】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１５）を用いるκ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１５】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：２−４、配列番号：７−１２、配列番号：１４，１５）を用いるリンパ腫組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）のリンパ腫組織はκ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はλ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、κ軽鎖プローブコレクションがκ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【図１６】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１７】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒトＲＰＭＩ ８２２６細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１８】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織はλ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はκ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、λ軽鎖プローブコレクションがヒトλ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【図１９】ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ポジティブヒト肺組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。矢印はＣＭＶ感染細胞を示す。
【図２０】ＣＭＶ即時型ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されなかったラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図２１】ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されたラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織は倍率４０Ｘにおいて示され、そして（Ｂ）の組織は倍率２０Ｘにおいて示される。
【００４６】
本発明のプローブおよびプローブコレクションの好適な実施態様は、図１−２１および実施例１−２を参照することによってもっとも良く理解される。以下に示す実施例は、本発明の特別な実施態様および種々のその使用の具体的説明である。それらは、説明の目的のためにのみ記述され、そして本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
実施例１
プローブコレクションの調製
長さ５５〜６０塩基の多数のオリゴヌクレオチドプローブからなるプローブコレクションが次のように設計された。この実施例では、各オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別個のドメイン：５’（または標識）ドメインおよび３’（または標的遺伝子に特異的）ドメインを保持した（参照、図１）。
【００４８】
この実施態様では、標識ドメインは配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなり、この場合
、シトシンヌクレオチドは、フルオレセイン−シトシンヌクレオチド複合体を表し、そしてフルオレセイン分子は、ＯＢＥＡ結合を介してシトシンのＮ４位に結合される。
【００４９】
標的遺伝子に特異的なドメインは、特定核酸標的遺伝子に対して相補的である２５−３０塩基配列からなる。オリゴヌクレオチドプローブは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変部（参照、表１；オリゴヌクレオチドプローブ４０１−４１６）、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部（オリゴヌクレオチドプローブ５０１−５１５）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）配列（オリゴヌクレオチドプローブ２２１−２４１）、ヒトＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ初期ＲＮＡ）配列（オリゴヌクレオチドプローブ１００Ａ２，１００Ｃ２，１００Ａ１および１００Ｂ１），ヒト反復Ａｌｕ配列（オリゴヌクレオチドプローブ３０１および３０２）、およびポリｄ（Ｔ）（オリゴヌクレオチドプローブ３２０）に対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するよう設計された。
【００５０】
実施例２
標識ドメイン設計：Ａｌｕ反復配列プローブ
Ａｌｕヒト反復配列に対するすべて４プローブが使用されて標識ドメイン設計を評価した。プローブ番号３０１（配列番号：５５）、３０１Ａ（配列番号：１１６）、３０１Ａ２／２（配列番号：１２１）、および３０１Ａ３／２（配列番号：１２２）が表１に示される。
【００５１】
４つのプローブは、それぞれ、反応液中プローブ１ｍｌ当たり濃度１００，７５，５０および２５ｎｇ／ｍｌにおいて評価された。このハイブリダイゼーション解析は、標準プロトコールを用いてマニュアルで実施された。標的、パラフィン包埋細胞系ＭＢＡ ＭＤ４６８（Ｏｎｃｏｒ ＩＮＦＯＲＭTMＨｅｒ−２／ｎｅｕ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｌｉｄｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８１００，Ｌｅｖｅｌ １，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）が標的サンプルであり、そして標準キシレン法によってパラフィンを除去することによって処理された。組織は、ＶｅｎｔａｎａのＡＰＫバッファーによる１：２希釈液として、５０℃で１２分間ＶｅｎｔａｎａのＰｒｏｔｅａｓｅ １にさらされた。ハイブリダイゼーション反応は、２ＸＳＳＣ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の残留１００ｕｌ容量に対して、１００ｕｌプローブとしてのプローブ希釈液（２５％ホルムアミド、５％デキストラン硫酸、２ＸＳＳＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ）の添加により達成された。スライドは８５℃で５分間加熱され、次いで、３７℃で１時間インキュベートされた。標準ＳＳＣ洗浄が過剰のプローブを除去するために続いた。ハイブリッドはＦＩＴＣに対する抗体により検出された。マウス抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｃａｔ＃７６０−０６１）を用いて比色法により検出された。特に指摘しなければ、すべての試薬はＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺから得られた。結果は明視野顕微鏡を用いて発色検出によって観察された。
【００５２】
これらの実験の結果は、シグナル強度がプローブに共役されたフルオレセインハプテンの総数の関数であり、そしてシグナルが特定の標識ドメイン設計に属することであった。プローブ分子当たりのフルオレセイン数が大きいほど、より大きいシグナルが観察された。設計の比較およびプローブへのハプテンの配置は、これがシグナルの強度におけるファクターではないことを示した。５フルオレセインを含有した２つのプローブ（３０１Ａ３／２（配列番号：１２２）および３０１（配列番号：５５））両方は等しいシグナルを生じた。これらの２つのプローブは、３０１Ａ２／２、４フルオレセインを有する分離した標識ドメイン設計を有するプローブ、について見られるよりも大きいシグナルを生じた。プローブ３０１Ａ２／２は、プローブ３０１Ａ、５’末端に１つの標識ドメイン設計を有し、そして３フルオレセインを有するプローブ、よりも大きいシグナルを生じた。
【００５３】
実施例３
標識ドメイン設計：ＥＢＥＲプローブ
この実験は、フルオレセインハプテン間のより大きい間隔が、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析におけるプローブ検出段階におけるシグナル生成を改善できるか否かを決定するために、２つの標識ドメイン設計および配列を比較した。
【００５４】
使用された組織は、シラン＋ガラス顕微鏡スライド上に置かれた厚さ４ミクロンの中性バッファーホルマリンパラフィン包埋切片中に固定されたＥＢＶ感染ヒト脾臓組織であった。組織切片は、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM機器において脱パラフィンされ、続いて温度３７℃でＶｅｎｔａｎａのＰｒｏｔｅａｓｅ１により６分間消化された。プローブは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の自動ＩＳＨ染色システム，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって調製された後にスライド上に残された等容量の２ＸＳＳＣ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００残留容量に対して適用される１００ｕｌとして、濃度５０ｎｇ／ｍｌにおいてハイブリダイゼーションバッファー希釈液に溶解された。プローブ希釈液は３７℃で６分間スライド上で残留容量と混合され、次いで、溶液は８５℃に加熱され、そして全１０分間そこで維持された。次いで、スライドは温度３７℃にされ、そしてその温度で１時間維持された。スライド上のこれらの水性反応のすべては、処理中の水の蒸発損失を防ぐためにＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰTMのフィルム下ですべて実施された。ハイブリダイゼーション後の各スライドは、各洗浄間に６分間インキュベーションしつつ２ＸＳＳＣ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液で３回洗浄され、スライド容量は約３００ｕｌ（＋／−１０％ｖｏｌ）であった。ハイブリッドはＦＩＴＣに対する抗体により検出された。マウス抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｃａｔ＃７６０−０６１）を用いて比色法により検出された。
【００５５】
この研究のために使用された２つのオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ１００Ａ１（配列番号：５３）および１００２Ａ３２（配列番号：１２０）である。これらのプローブの間の２つの差異は標識ドメイン配列と構造であった。配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）4ＣＴ（配列番号：５８）を有するプローブ１００Ａ１の標識ドメインは、遺伝子標的ドメインに対して５’に存在し、ＯＢＥＡリンカーを介してシトシン残基に結合された５フルオレセインを含有していた。オリゴプローブ１００２Ａ３２の標識ドメインは（配列番号：１２５）に類似していた。異なる配列以外に、主要な差異は、シトシン間隔が７塩基離れて比較的近くに存在するオリゴ１００Ａ１に較べて、フルオレセイン標識されたシトシンが、１０塩基離れて間隔を置かれているということである。Ｈスコア解析によって推定されるこの比較の結果は、これらのオリゴヌクレオチドがスライド上で生成されたシグナル量に関して同等であることであった。データは、１００Ａ２については、３視野のすべてにおいて解析された３６８細胞ではＨスコアは１０６であり、そしてプローブ１００２Ａ３２については、３視野において解析された３４５細胞ではＨスコアは１０９であることであった。Ｈスコアは、スライド上の総標的特異的シグナルの相対的比較を得るために、組織切片におけるスコアバックグラウンド対シグナル比に因数分解する、顕微鏡を用いて実施される分光写真解析である。（参照、引用文献Ｇｉｒｏｕｄ，Ｆ．Ｐｅｒｒｉｎ Ｃ，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｙ Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｊ．；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｔｈｉｒｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４；ａｎｄ ＡｕｔｏＣｙｔｅ Ｑｕｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，１９９８，ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＡ−０２９，Ｃｏ ＡｕｔｏＣｙｔｅ Ｉｎｃ． Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏ ＮＣ２７２１）。ヒストグラムおよびスコアシートは、各オリゴが比色シグナルを生じる上で等しく有効であったことを示している。
このことは、標識ドメインの位置が遺伝子標的配列に対して３プライムであっても５プライムであってもよいか、または遺伝子標的配列が２つの標識ドメイン間に位置していてもよいことを示している。
【００５６】
実施例４
イン・サイチューハイブリダイゼーション
実施例１において調製されたプローブコレクションは、最初に、２０％デキストラン硫酸（ｗｔ／ｖｏｌ）、５０％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２ＸＳＳＣ、１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％Ｂｒｉｊ−３５からなる溶液において最終ｐＨ７．３において希釈された。次いで、プローブコレクションは２ＸＳＳＣおよび０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる溶液の等容量と混合された。
【００５７】
ＩＳＨ解析のためのサンプルは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された細胞もしくは組織サンプルを４μｍの切片に切断し、そして切片をガラススライド上に置くことによって調製された。続くサンプルの処理およびＩＳＨは、自動装置、例えば、両方とも引用によって本明細書に組み入れられている同時所有で同時係属中の米国特許出願第６０／０７６，１９８号および同第０９／２５９，２４０号に記述されているＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＩＳＨ／ＩＨＣ Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）において実施された。サンプルからパラフィンを除去するために、スライドは水溶液に浸漬され、約２０分間加熱され、次いで洗浄された。自動脱パラフィン操作は、両方とも引用によって本明細書に組み入れられている米国特許出願第６０／０９９、０１８号および同第０９／２５９，２４０号に一層完全に記述されている。次いで、サンプルはプロテアーゼで処理され、そしてスライドは、８５℃（ＲＮＡ標的遺伝子に対するハイブリダイゼーションのため）もしくは９０−９５℃（ＤＮＡ標的遺伝子に対するハイブリダイゼーションのため）に４〜１０分間加熱された。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応液は、典型的には、１０％デキストラン硫酸（ｗｔ／ｖｏｌ）、２５％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２ＸＳＳＣ、５ｍＭｔｒｉｓ、２．５ｍＭＥＤＴＡ，０．０２５％Ｂｒｉｊ−３５，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および各個々のプローブ分子２５〜１２５ｎｇ／ｍｌからなるハイブリダイゼーションバッファーにおいて行われた。ＩＳＨ反応は３７℃〜５４℃において実施された。実施例１において記述されるプローブコレクションを用いるＩＳＨでは、ハイブリダイゼーション反応は場合によっては４７℃で１時間実施された（ハイブリダイゼーション反応が場合によっては３７℃で１時間実施されたポリｄ（Ｔ）プローブを除く）。
【００５９】
サンプル中の特定の標的遺伝子に対するフルオレセイン標識プローブ分子のハイブリダイゼーションは、一連の結合性タンパク質を用いることによって検出された、すなわち二次抗体検出。しかしながら、結合されたプローブを可視化できるｄｅｔｅｃｔ検出法を使用することも同じく可能である。二次検出では、最初に、フルオレセイン標識されたプローブ分子に対向された抗フルオレセインマウスモノクローナル抗体がサンプルに添加された。次に、マウス抗体に対向したビオチン標識ポリクローナルヤギ抗体がサンプルに添加された。最後に、ハイブリダイゼーション反応物は、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質を用いて比色法により検出された。この技術は、「二次抗体検出」と呼ばれ、当業者には日常的に行われる。一次および二次抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺを含む多くの販売元から得ることができ、これらはＶｅｎｔａｎａ自動染色システム（ＥＳR，ＮｅｘＥＳR，ＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM，およびＢＥＮＣＨＭＡＲＫTM）において使用するために最適化されている。
【００６０】
図２−２１は、図１において図解される構造モチーフを有する本明細書で開示され、特許請求されるプローブまたはそのようなプローブからなるプローブコレクションを使用して、種々の細胞系もしくは組織サンプルのイン・サイチューハイブリダイゼーション解析について得られた結果を説明している。
【００６１】
【表１−１】
【００６２】
【表１−２】
【００６３】
【表１−３】
【００６４】
【表２】
【００６５】
前記の開示は、ある特定の本発明の実施態様を強調しており、そしてあらゆるその改変もしくは代替等価物は、添付される請求項において記述される本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸遺伝子標的を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブのコレクションに関する。特に、本発明はオリゴプローブのコレクションに関する。
【背景技術】
【０００２】
イン・サイチュー解析はイン・サイチューのハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を含む。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、細胞もしくは組織サンプル中の標的とする核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、標的遺伝子配列もしくは転写物に対してアンチセンスである標識したＤＮＡもしくはＲＮＡプローブ分子を用いる。ＩＳＨは、発生生物学、細胞生物学および分子生物学を含む、多数の生物医療分野において有用な道具であることが分かっている。ＩＳＨは、例えば、遺伝障害を診断したり、遺伝子をマッピングしたり、遺伝子発現を研究したり、そして標的遺伝子発現の部位を局在化するために使用されてきた。
【０００３】
典型的には、ＩＳＨは、ガラススライド上に固定化した細胞もしくは組織サンプルを、細胞もしくは組織サンプル中の特定の標的遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる標識した核酸プローブに接触させることによって実施される（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。細胞もしくは組織サンプル中の核酸への標識したプローブ分子のハイブリダイゼーションは、次に、例えば、放射能に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法、またはＢｒｄＵのようなハプテンに結合している蛍光標識したタンパク質、プローブ中に組み入れられたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したヌクレオチドの結合に基づく間接検出法を用いて検出することができる。ハプテンに基づく方法は、さらに、結合性タンパク質−酵素複合体、例えば抗体−酵素複合体によって結合されるそれらの分子および比色法に基づく検出化学を含めるように拡張された。さらに、いくつかの標的遺伝子が、複数の異なる核酸タグで標識された複数の核酸プローブに細胞もしくは組織サンプルを接触させることによって同時に解析することができる。例えば、複数の核酸プローブが、異なる発光波長をもつ複数の蛍光化合物により標識することができ、それによって単一の標的細胞もしくは組織サンプルにおいて１段階で実施される同時多重発色分析を可能にする。
【０００４】
オリゴヌクレオチドプローブ中への標識したヌクレオチドの組み入れに伴う重要な問題は、通常、ヌクレオチドに結合している複合部分が、ワトソン・クリック塩基対の形成を妨害し、その結果その標的へのプローブのハイブリダイゼーションにネガティブに影響することである。このことは、非置換シトシン（１級アミン）と形成される自然のＧ−Ｃ結合に較べて、立体障害および２級アミンの低い反応性状態への予期されるシフト（Ｎ４標識したシトシンに見られるような）のために、Ｎ４−置換されたシトシンヌクレオチドを介して結合された標識の使用に関して見られた。小さいヌクレオチド（２５〜５０塩基）における何らかの小変化またはＧ−Ｃ結合の妨害は、意図した標的配列とハイブリダイズするこれらのオリゴの能力を低下させることがある。
【０００５】
オリゴヌクレオチド中に標識したヌクレオチドを組み入れるために適当なプローブ設計を開発する技術上の必要性が残っている。本発明者らは、数種の人工配列が、プローブ標識のための効果的に機能する代替物であり、そしてまた細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、単独でも、また複合したオリゴヌクレオチドプローブ混合物においても働くことを例証する。プローブコレクションのためのそのよ
うな遺伝子配列の開発および標識戦略は、医療、遺伝子および分子生物学技術における広い応用性を有する。
【０００６】
標識化学によるこの妨害およびハイブリダイゼーションストリンジェンシーおよび動力学が、本明細書において、少なくとも２つの別個の機能性ドメイン、すなわち遺伝子特異的であり、塩基対形成に必要である１つのドメインもしくは配列、およびスペーシングヌクレオチドと標識したヌクレオチドからなる人工的な非特異的配列（サンプルのゲノムに関して）である第２ドメインを有するオリゴを設計することによって解決される。これらの要素は、これらの標識ヌクレオチドがタンパク質（免疫グロブリンもしくはアビジン）を結合するためにハプテンとして一層作用しやすく、したがって遺伝子に特異的なドメインにおいてワトソン・クリック塩基対を妨害しないように置かれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．Ｒ．Ｃｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．ｄｅ Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ，ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９２）
【非特許文献２】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｈ．Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｋ．Ｌ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｂａｒｃｈａｓ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）
【非特許文献３】Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するために、オリゴヌクレオチドプローブ中に標識を組み入れるための新規戦略および標識されたオリゴヌクレオチドプローブのコレクションを提供する。特に、本発明は、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析における使用のために、オリゴヌクレオチドプローブのコレクション中に組み入れることができるそのような配列の反復ポリマーを作成するための配列式を用いる非遺伝子特異的配列に関する。さらに、配列式に基づく標識された合成オリゴヌクレオチドポリマーを使用することは、結合性タンパク質、すなわち免疫グロブリンに複合された場合には、免疫組織化学的解析において使用されるそのようなタンパク質を標識するための非常に効果的な、そして制御される方法である。本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の特定核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションもしくは「カクテル」を提供する。カクテルは、次のものを検出するために有用である：κ遺伝子（配列番号：１から１６まで）；λ遺伝子（配列番号：１７から１９まで）；ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）遺伝子（配列番号：３０から５０まで）；ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ初期ＲＮＡ）遺伝子（配列番号：５１から５４まで）；Ａｌｕ（配列番号：５５から５６まで）；ポリＡ（配列番号：５７）；および検出テール（配列番号：５８）。
【０００９】
本発明は、配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nおよびその相補体（ＡＡＡＡＴＡＧ）n［式中、「ｎ」は少なくとも１である］を含んでなるオリゴヌクレオチド標識ドメインに向けられる。
【００１０】
また、本発明は、少なくとも２つの別個の機能性ドメイン、請求項２の標識ドメインを含んでなる第１のドメイン、および遺伝子に特異的な標的配列を含んでなる第２のドメイ
ンを有するオリゴヌクレオチドプローブに向けられる。
【００１１】
また、本発明は、プローブが配列番号：１から１６までより本質的になる群から選ばれるκ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核（ｈｅｔｅｒｅｏｎｕｃｌｅａｒ）ＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１２】
また、本発明は、プローブが配列番号：１７から２９までより本質的になる群から選ばれるλ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核ＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１３】
また、本発明は、プローブが配列番号：３０から５０までより本質的になる群から選ばれるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型ＲＮＡおよび／または対応するｍＲＮＡを検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１４】
また、本発明は、プローブが配列番号：５１から５４までより本質的になる群から選ばれるＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）初期ＲＮＡ、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２、（ＥＢＥＲ）を検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１５】
また、本発明は、プローブが配列番号：５５および５６より本質的になる群から選ばれるヒトＡｌｕ反復サテライトゲノムＤＮＡ配列を検出するためのプローブセットに向けられる。
【００１６】
本発明の特定の好適な実施態様は、以下のある好適な実施態様および請求項のより詳細な記述から明らかになるであろう。
【００１７】
図１は、２ドメインプローブ設計の遺伝子プローブ構造を図解している。これは、次の実施例において記述される遺伝子特異的カクテルにおけるプローブのために使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。各プローブは、２つのドメイン：５’標識ドメインおよび３’標的遺伝子の標的遺伝子に特異的なドメインからなる。標識ドメインは、この特異配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nからなり、この場合、各シトシンは、発蛍光団もしくはシトシン−ハプテン複合体により標識されてもよく、この実施態様ではハプテンはフルオレセインである。この図は、具体的には、３０１（配列番号：５５）および３０２（配列番号：５６）プローブについての核酸配列を示し、これらの各々は、ヒト反復Ａｌｕ配列に対応する標的遺伝子の遺伝子特異的ドメインおよびフルオレセインハプテンを有する標識ドメインを保持する。
【００１８】
図２は、標識ドメインを含んでなるプローブ（３３０プローブ；配列番号：５８）を用いるヒト皮膚組織のイン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、これらのＩＳＨ実施例において使用されたオリゴヌクレオチドに共通する標識ドメインの配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴが、それがハイブリダイズしないためにヒト核酸配列とワトソン・クリック塩基対を形成する能力において非特異的で、そして非反応性であることを示している。
【００１９】
図３は、標識ドメインおよびポリｄ（Ｔ）標的遺伝子特異的ドメインを含んでなるプローブ（３２０プローブ；配列番号：５７）を用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。細胞質に局在される検出可能なシグナルの存在は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることができることを示している。
【００２０】
図４Ａ−４Ｂは、組織サンプルが、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボ
ヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）場合の、３２０プローブを用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡに共通するポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることを示している。
【００２１】
図５Ａ−５Ｂは、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄が室温（Ａ）または３７℃（Ｂ）で実施された場合の、３２０プローブを用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。この結果は、より強い発色がより低いストリンジェント条件を示すことによって、発色の強度がハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関係することを示している。
【００２２】
図６は、３２０プローブを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。これは、このプローブ設計がまた包埋細胞系ならびに包埋組織を用いて機能することを示している。
【００２３】
図７は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２４】
図８は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２５】
図９は、３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるラット細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、このプローブコレクションがヒト核酸配列に特異的であることを示している。
【００２６】
図１０は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ） ＥＢＥＲ核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：５１から５４まで）を用いるＥＢＶ陰性ヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２７】
図１１は、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２８】
図１２は、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００２９】
図１３Ａ−１３Ｂは、ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明するが、この場合、組織サンプルは、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがヒトＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることを示している。
【００３０】
図１４は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１５）を用いるκ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３１】
図１５は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：２−４、配列番号：７−１２、配列番号：１４，１５）を用いるリンパ腫組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）のリンパ腫組織はκ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はλ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、κ軽鎖プローブコレクションがκ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【００３２】
図１６は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３３】
図１７は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒトＲＰＭＩ ８２２６細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３４】
図１８Ａ−１８Ｂは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織はλ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はκ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、λ軽鎖プローブコレクションがヒトλ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【００３５】
図１９は、ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ポジティブヒト肺組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する（ＣＭＶ感染細胞）。
図２０は、ＣＭＶ即時型ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されなかったラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【００３６】
図２１Ａ−２１Ｂは、ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されたラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織は倍率４０Ｘにおいて示され、そして（Ｂ）の組織は倍率２０Ｘにおいて示される。
【００３７】
＜好適な実施態様の詳細な記述＞
本発明は、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためのオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブコレクションを提供する。特に、本発明は、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析における使用のためのオリゴヌクレオチドプローブのコレクションに関する。
【００３８】
より具体的には、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブまたはタンパク質に検出可能な部分（標識）を結合するためのヌクレオチドポリマーまたは標識ドメインについての特定の配列式の使用に関する。これらの配列もしくはその誘導体の特定の利用は、ハイブリ
ダイゼーション条件の標準ストリンジェンシー下では検出可能なレベルにおいてヒトＤＮＡもしくはＲＮＡにハイブリダイズしないという不活性または非反応性の特性である。これらの標識ドメインまたはポリマーは、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析において細胞もしくは組織サンプル中の遺伝子に特異的な配列を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ中への組み入れに有用な遺伝子配列であることが例証された。さらに、この不活性な配列のセットは、免疫組織化学的解析においてハプテンおよび抗原を検出するために、免疫グロブリンもしくは他のタンパク質に標識を結合させるために有用である。
【００３９】
本明細書で使用されるように、用語「プローブ」もしくは「オリゴヌクレオチドプローブ」は、相補的核酸標的遺伝子を検出するために使用される核酸分子を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるように、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸（または相補体）配列が結合して二本鎖核酸分子を形成する過程を指す。例えば、放射性もしくは蛍光タグにより標的核酸分子を標識することによって、プローブと標的遺伝子間の相互作用が検出できる。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびコレクションのオリゴヌクレオチドプローブは慣用の方法を用いて合成される。参照、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ２０：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ １６５−８９（Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，１９９３）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，１９９１）。
【００４２】
本発明の好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別個のドメイン：５’（または標識）ドメインおよび３’（または遺伝子に特異的な標的）ドメインを保持する（参照、図１Ａ）。本発明のより好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nおよび／または配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなる標識ドメインを保持する。また、他の実施態様が本明細書において例証され、これは２つの末端の標識ドメインおよび中央の遺伝子特異的標的ドメインを有する３重ドメイン態様も含む。具体的には、配列番号：１２５−１２６がこの標識スキームを表している。なお、標識ドメインのさらなる好適な実施態様は、ＴＣ（ＴＴＴＴＡＴＣ）nまたはその相補体である。この配列は（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴ標識ドメインと同じくらい独特であると予想される。本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、特定の細胞もしくは組織において該プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが検出できるように標識される。イン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析における使用のために許容される標識は当業者には既知である。そのような標識は、例えば、放射能に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法、蛍光に基づく直接検出法と共役されたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したプローブ、または抗体−酵素に基づく検出法と共役されたジゴキシゲニン標識もしくはビオチン標識したプローブを用いて、プローブと標的遺伝子間の相互作用が検出されるのを可能にする。本発明の好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブはフルオレセインにより標識される。本発明のより好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、シトシンヌクレオチドが、直接検出のための発蛍光団、または間接検出のためのハプテンにより標識されてもよい配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなる標識ドメインを保持する。いずれにおいても、フルオレセイン−シトシンヌクレオチド複合体およびフルオレセイン分子は、ＯＢＥＡ結合を介してシトシンのＮ４位に結合される（引用によって本明細書に組み入れられているＭｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６８４，１４２号参照）。好適な実施態様では、標識ドメインに結合される発蛍光団の密度は、標識ドメインのみに対して測定された場合、少なくとも７モル％、好ましくは
少なくとも１０モル％、もっとも好ましくは少なくとも１６モル％である。例えば、プローブ４０１が考えられる場合（２ドメインプローブ）、それは、Ｃがまた標識される３’末端ＣＴを含む３０塩基の標識ドメインを含有し、モル％は５／３０＝１６．７モル％標識である。プローブ全体では、モル％は８．３である。
【００４３】
本発明の幾つかの実施態様では、いくつかの標的遺伝子が、複数の異なる核酸タグで標識された複数の核酸プローブに細胞もしくは組織サンプルを接触させることによって同時に解析される。例えば、複数の核酸プローブが、異なる発光波長をもつ複数の蛍光化合物により標識でき、それによって単一の標的細胞もしくは組織サンプルにおいて１段階で実施される同時多色分析を可能にする。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドプローブおよびオリゴヌクレオチドプローブコレクションは、細胞もしくは組織サンプル中の核酸標的遺伝子を検出または局在化するためにＩＳＨ解析において使用することができる。ＩＳＨ解析は、例えば、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｇ．Ｒ．Ｃｏｕｌｔｏｎ ａｎｄ Ｊ．ｄｅ Ｂｅｌｌｅｒｏｃｈｅ，ｅｄｓ．，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９２）；Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｈ．Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｋ．Ｌ．Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｂａｒｃｈａｓ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；またはＩｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９２）において記述されるように実施されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】２ドメインプローブ設計の遺伝子プローブ構造を図解する。これは、上記実施例において記述される遺伝子特異的カクテルにおけるプローブのために使用されるオリゴヌクレオチドの設計である。各プローブは、２つのドメイン：５’標識ドメインおよび３’標的遺伝子の標的遺伝子に特異的なドメインからなる。標識ドメインは、この特異配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなり、この場合、シトシンヌクレオチドは、シトシン−ハプテン複合体であり、この実施例ではハプテンはフルオレセインである。この図は、具体的には、３０１（配列番号：５５）および３０２（配列番号：５６）プローブについての核酸配列を示し、これらの各々は、ヒト反復Ａｌｕ配列に対応する標的遺伝子の遺伝子特異的ドメインおよびフルオレセインハプテンを有する標識ドメインを保持する。
【図２】標識ドメインを含んでなるプローブ（３３０プローブ；配列番号：５８）を用いるヒト皮膚組織のイン・サイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、これらのＩＳＨ実施例において使用されたオリゴヌクレオチドに共通する標識ドメインの配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴが、それがハイブリダイズしないためにヒト核酸配列とワトソン・クリック塩基対を形成する能力において非特異的で、そして非反応性であることを示している。
【図３】標識ドメインおよびポリｄ（Ｔ）標的遺伝子特異的ドメインを含んでなるプローブ（３２０プローブ；配列番号：５７）を用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。細胞質に局在される検出可能なシグナルの存在は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズできることを示している。
【図４】組織サンプルが、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）場合の、３２０プローブを用いるヒト皮膚組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがメッセンジャーＲＮＡに共通するポリアデニル化領域に特異的にハイブリダイズすることを示している。
【図５】ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシー洗浄が室温（Ａ）または３７℃（Ｂ）で実施された場合の、３２０プローブを用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。この結果は、より強い発色がより低いストリンジェント条件を示すことによって、発色の強度がハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関係することを示している。
【図６】３２０プローブを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。これは、このプローブ設計がまた包埋細胞系ならびに包埋組織を用いて機能することを示している。
【図７】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＲａｊｉ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図８】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図９】３０１および３０２プローブからなるプローブコレクションを用いるラット細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。検出可能なシグナルの不在は、このプローブコレクションがヒト核酸配列に特異的であることを示している。
【図１０】Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ） ＥＢＥＲ核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：５１から５４まで）を用いるＥＢＶ陰性ヒトＨＴ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１１】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１２】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１３】ＥＢＶ ＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：５１から５４まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明するが、この場合、組織サンプルは、イン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理されなかった（Ａ）か、またはイン・サイチューハイブリダイゼーション前にリボヌクレアーゼＡにより処理された（Ｂ）。（Ｂ）における検出可能なシグナルにおける減少は、このプローブがヒトＥＢＥＲ１および２核ＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることを示している。
【図１４】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１５）を用いるκ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１５】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：２−４、配列番号：７−１２、配列番号：１４，１５）を用いるリンパ腫組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）のリンパ腫組織はκ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はλ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、κ軽鎖プローブコレクションがκ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【図１６】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブ（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒト扁桃組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１７】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるλ軽鎖ポジティブヒトＲＰＭＩ ８２２６細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図１８】ヒト免疫グロブリンλ軽鎖ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：１９から２９まで）を用いるヒト脾臓組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織はλ軽鎖を過発現し、そして（Ｂ）の組織はκ軽鎖を過発現する。（Ｂ）における検出可能なシグナルの不在は、λ軽鎖プローブコレクションがヒトλ軽鎖ｍＲＮＡに特異的であることを示している。
【図１９】ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ポジティブヒト肺組織のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。矢印はＣＭＶ感染細胞を示す。
【図２０】ＣＭＶ即時型ｍＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されなかったラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。
【図２１】ＣＭＶ即時型ＲＮＡに対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するプローブからなるプローブコレクション（配列番号：３０−３２，配列番号：３４−３５，配列番号：３８，配列番号：５０）を用いる、ＣＭＶ即時型ＲＮＡの発現がシクロヘキサミドによって誘発されたラット９Ｇ細胞系のＩＳＨ解析について得られた結果を説明する。（Ａ）の組織は倍率４０Ｘにおいて示され、そして（Ｂ）の組織は倍率２０Ｘにおいて示される。
【００４６】
本発明のプローブおよびプローブコレクションの好適な実施態様は、図１−２１および実施例１−２を参照することによってもっとも良く理解される。以下に示す実施例は、本発明の特別な実施態様および種々のその使用の具体的説明である。それらは、説明の目的のためにのみ記述され、そして本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
実施例１
プローブコレクションの調製
長さ５５〜６０塩基の多数のオリゴヌクレオチドプローブからなるプローブコレクションが次のように設計された。この実施例では、各オリゴヌクレオチドプローブは、２つの別個のドメイン：５’（または標識）ドメインおよび３’（または標的遺伝子に特異的）ドメインを保持した（参照、図１）。
【００４８】
この実施態様では、標識ドメインは配列（ＣＴＡＴＴＴＴ）nＣＴからなり、この場合
、シトシンヌクレオチドは、フルオレセイン−シトシンヌクレオチド複合体を表し、そしてフルオレセイン分子は、ＯＢＥＡ結合を介してシトシンのＮ４位に結合される。
【００４９】
標的遺伝子に特異的なドメインは、特定核酸標的遺伝子に対して相補的である２５−３０塩基配列からなる。オリゴヌクレオチドプローブは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変部（参照、表１；オリゴヌクレオチドプローブ４０１−４１６）、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変部（オリゴヌクレオチドプローブ５０１−５１５）、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）配列（オリゴヌクレオチドプローブ２２１−２４１）、ヒトＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）ＥＢＥＲ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ初期ＲＮＡ）配列（オリゴヌクレオチドプローブ１００Ａ２，１００Ｃ２，１００Ａ１および１００Ｂ１），ヒト反復Ａｌｕ配列（オリゴヌクレオチドプローブ３０１および３０２）、およびポリｄ（Ｔ）（オリゴヌクレオチドプローブ３２０）に対応する標的遺伝子特異的ドメインを保持するよう設計された。
【００５０】
実施例２
標識ドメイン設計：Ａｌｕ反復配列プローブ
Ａｌｕヒト反復配列に対するすべて４プローブが使用されて標識ドメイン設計を評価した。プローブ番号３０１（配列番号：５５）、３０１Ａ（配列番号：１１６）、３０１Ａ２／２（配列番号：１２１）、および３０１Ａ３／２（配列番号：１２２）が表１に示される。
【００５１】
４つのプローブは、それぞれ、反応液中プローブ１ｍｌ当たり濃度１００，７５，５０および２５ｎｇ／ｍｌにおいて評価された。このハイブリダイゼーション解析は、標準プロトコールを用いてマニュアルで実施された。標的、パラフィン包埋細胞系ＭＢＡ ＭＤ４６８（Ｏｎｃｏｒ ＩＮＦＯＲＭTMＨｅｒ−２／ｎｅｕ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｌｉｄｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８１００，Ｌｅｖｅｌ １，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）が標的サンプルであり、そして標準キシレン法によってパラフィンを除去することによって処理された。組織は、ＶｅｎｔａｎａのＡＰＫバッファーによる１：２希釈液として、５０℃で１２分間ＶｅｎｔａｎａのＰｒｏｔｅａｓｅ １にさらされた。ハイブリダイゼーション反応は、２ＸＳＳＣ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の残留１００ｕｌ容量に対して、１００ｕｌプローブとしてのプローブ希釈液（２５％ホルムアミド、５％デキストラン硫酸、２ＸＳＳＣ、１％Ｔｒｉｔｏｎ）の添加により達成された。スライドは８５℃で５分間加熱され、次いで、３７℃で１時間インキュベートされた。標準ＳＳＣ洗浄が過剰のプローブを除去するために続いた。ハイブリッドはＦＩＴＣに対する抗体により検出された。マウス抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｃａｔ＃７６０−０６１）を用いて比色法により検出された。特に指摘しなければ、すべての試薬はＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺから得られた。結果は明視野顕微鏡を用いて発色検出によって観察された。
【００５２】
これらの実験の結果は、シグナル強度がプローブに共役されたフルオレセインハプテンの総数の関数であり、そしてシグナルが特定の標識ドメイン設計に属することであった。プローブ分子当たりのフルオレセイン数が大きいほど、より大きいシグナルが観察された。設計の比較およびプローブへのハプテンの配置は、これがシグナルの強度におけるファクターではないことを示した。５フルオレセインを含有した２つのプローブ（３０１Ａ３／２（配列番号：１２２）および３０１（配列番号：５５））両方は等しいシグナルを生じた。これらの２つのプローブは、３０１Ａ２／２、４フルオレセインを有する分離した標識ドメイン設計を有するプローブ、について見られるよりも大きいシグナルを生じた。プローブ３０１Ａ２／２は、プローブ３０１Ａ、５’末端に１つの標識ドメイン設計を有し、そして３フルオレセインを有するプローブ、よりも大きいシグナルを生じた。
【００５３】
実施例３
標識ドメイン設計：ＥＢＥＲプローブ
この実験は、フルオレセインハプテン間のより大きい間隔が、イン・サイチューハイブリダイゼーション解析におけるプローブ検出段階におけるシグナル生成を改善できるか否かを決定するために、２つの標識ドメイン設計および配列を比較した。
【００５４】
使用された組織は、シラン＋ガラス顕微鏡スライド上に置かれた厚さ４ミクロンの中性バッファーホルマリンパラフィン包埋切片中に固定されたＥＢＶ感染ヒト脾臓組織であった。組織切片は、Ｖｅｎｔａｎａ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM機器において脱パラフィンされ、続いて温度３７℃でＶｅｎｔａｎａのＰｒｏｔｅａｓｅ１により６分間消化された。プローブは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．の自動ＩＳＨ染色システム，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙによって調製された後にスライド上に残された等容量の２ＸＳＳＣ／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００残留容量に対して適用される１００ｕｌとして、濃度５０ｎｇ／ｍｌにおいてハイブリダイゼーションバッファー希釈液に溶解された。プローブ希釈液は３７℃で６分間スライド上で残留容量と混合され、次いで、溶液は８５℃に加熱され、そして全１０分間そこで維持された。次いで、スライドは温度３７℃にされ、そしてその温度で１時間維持された。スライド上のこれらの水性反応のすべては、処理中の水の蒸発損失を防ぐためにＬＩＱＵＩＤ ＣＯＶＥＲＳＬＩＰTMのフィルム下ですべて実施された。ハイブリダイゼーション後の各スライドは、各洗浄間に６分間インキュベーションしつつ２ＸＳＳＣ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液で３回洗浄され、スライド容量は約３００ｕｌ（＋／−１０％ｖｏｌ）であった。ハイブリッドはＦＩＴＣに対する抗体により検出された。マウス抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｂｌｕｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ｃａｔ＃７６０−０６１）を用いて比色法により検出された。
【００５５】
この研究のために使用された２つのオリゴヌクレオチドプローブは、プローブ１００Ａ１（配列番号：５３）および１００２Ａ３２（配列番号：１２０）である。これらのプローブの間の２つの差異は標識ドメイン配列と構造であった。配列式（ＣＴＡＴＴＴＴ）4ＣＴ（配列番号：５８）を有するプローブ１００Ａ１の標識ドメインは、遺伝子標的ドメインに対して５’に存在し、ＯＢＥＡリンカーを介してシトシン残基に結合された５フルオレセインを含有していた。オリゴプローブ１００２Ａ３２の標識ドメインは（配列番号：１２５）に類似していた。異なる配列以外に、主要な差異は、シトシン間隔が７塩基離れて比較的近くに存在するオリゴ１００Ａ１に較べて、フルオレセイン標識されたシトシンが、１０塩基離れて間隔を置かれているということである。Ｈスコア解析によって推定されるこの比較の結果は、これらのオリゴヌクレオチドがスライド上で生成されたシグナル量に関して同等であることであった。データは、１００Ａ２については、３視野のすべてにおいて解析された３６８細胞ではＨスコアは１０６であり、そしてプローブ１００２Ａ３２については、３視野において解析された３４５細胞ではＨスコアは１０９であることであった。Ｈスコアは、スライド上の総標的特異的シグナルの相対的比較を得るために、組織切片におけるスコアバックグラウンド対シグナル比に因数分解する、顕微鏡を用いて実施される分光写真解析である。（参照、引用文献Ｇｉｒｏｕｄ，Ｆ．Ｐｅｒｒｉｎ Ｃ，ａｎｄ Ｓｉｍｏｎｙ Ｌａｆｏｎｔａｉｎｅ，Ｊ．；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｔｈｉｒｄ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９４；ａｎｄ ＡｕｔｏＣｙｔｅ Ｑｕｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，１９９８，ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒ ＰＡ−０２９，Ｃｏ ＡｕｔｏＣｙｔｅ Ｉｎｃ． Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏ ＮＣ２７２１）。ヒストグラムおよびスコアシートは、各オリゴが比色シグナルを生じる上で等しく有効であったことを示している。
このことは、標識ドメインの位置が遺伝子標的配列に対して３プライムであっても５プライムであってもよいか、または遺伝子標的配列が２つの標識ドメイン間に位置していてもよいことを示している。
【００５６】
実施例４
イン・サイチューハイブリダイゼーション
実施例１において調製されたプローブコレクションは、最初に、２０％デキストラン硫酸（ｗｔ／ｖｏｌ）、５０％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２ＸＳＳＣ、１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．０５％Ｂｒｉｊ−３５からなる溶液において最終ｐＨ７．３において希釈された。次いで、プローブコレクションは２ＸＳＳＣおよび０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる溶液の等容量と混合された。
【００５７】
ＩＳＨ解析のためのサンプルは、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された細胞もしくは組織サンプルを４μｍの切片に切断し、そして切片をガラススライド上に置くことによって調製された。続くサンプルの処理およびＩＳＨは、自動装置、例えば、両方とも引用によって本明細書に組み入れられている同時所有で同時係属中の米国特許出願第６０／０７６，１９８号および同第０９／２５９，２４０号に記述されているＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＩＳＨ／ＩＨＣ Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）において実施された。サンプルからパラフィンを除去するために、スライドは水溶液に浸漬され、約２０分間加熱され、次いで洗浄された。自動脱パラフィン操作は、両方とも引用によって本明細書に組み入れられている米国特許出願第６０／０９９、０１８号および同第０９／２５９，２４０号に一層完全に記述されている。次いで、サンプルはプロテアーゼで処理され、そしてスライドは、８５℃（ＲＮＡ標的遺伝子に対するハイブリダイゼーションのため）もしくは９０−９５℃（ＤＮＡ標的遺伝子に対するハイブリダイゼーションのため）に４〜１０分間加熱された。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応液は、典型的には、１０％デキストラン硫酸（ｗｔ／ｖｏｌ）、２５％ホルムアミド（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２ＸＳＳＣ、５ｍＭｔｒｉｓ、２．５ｍＭＥＤＴＡ，０．０２５％Ｂｒｉｊ−３５，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、および各個々のプローブ分子２５〜１２５ｎｇ／ｍｌからなるハイブリダイゼーションバッファーにおいて行われた。ＩＳＨ反応は３７℃〜５４℃において実施された。実施例１において記述されるプローブコレクションを用いるＩＳＨでは、ハイブリダイゼーション反応は場合によっては４７℃で１時間実施された（ハイブリダイゼーション反応が場合によっては３７℃で１時間実施されたポリｄ（Ｔ）プローブを除く）。
【００５９】
サンプル中の特定の標的遺伝子に対するフルオレセイン標識プローブ分子のハイブリダイゼーションは、一連の結合性タンパク質を用いることによって検出された、すなわち二次抗体検出。しかしながら、結合されたプローブを可視化できるｄｅｔｅｃｔ検出法を使用することも同じく可能である。二次検出では、最初に、フルオレセイン標識されたプローブ分子に対向された抗フルオレセインマウスモノクローナル抗体がサンプルに添加された。次に、マウス抗体に対向したビオチン標識ポリクローナルヤギ抗体がサンプルに添加された。最後に、ハイブリダイゼーション反応物は、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質を用いて比色法により検出された。この技術は、「二次抗体検出」と呼ばれ、当業者には日常的に行われる。一次および二次抗体は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺを含む多くの販売元から得ることができ、これらはＶｅｎｔａｎａ自動染色システム（ＥＳR，ＮｅｘＥＳR，ＤＩＳＣＯＶＥＲＹTM，およびＢＥＮＣＨＭＡＲＫTM）において使用するために最適化されている。
【００６０】
図２−２１は、図１において図解される構造モチーフを有する本明細書で開示され、特許請求されるプローブまたはそのようなプローブからなるプローブコレクションを使用して、種々の細胞系もしくは組織サンプルのイン・サイチューハイブリダイゼーション解析について得られた結果を説明している。
【００６１】
【表１−１】
【００６２】
【表１−２】
【００６３】
【表１−３】
【００６４】
【表２】
【００６５】
前記の開示は、ある特定の本発明の実施態様を強調しており、そしてあらゆるその改変もしくは代替等価物は、添付される請求項において記述される本発明の精神および範囲内にあることが理解されるべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
κ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核（ｈｅｔｅｒｅｏｎｕｃｌｅａｒ）ＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：１から１６までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項２】
λ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核ＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：１７から１９までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項３】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型ＲＮＡおよび／または対応するｍＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：３−３０から５０までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項４】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の初期ＲＮＡｓ、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２、（ＥＢＥＲ）を検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：５１から５４までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項５】
ヒトＡｌｕ反復サテライトゲノムＤＮＡ配列を検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：５５および５６より本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項６】
プローブが配列番号：５９から７４まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項７】
プローブが配列番号：７５から８７まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項８】
プローブが配列番号：８８から１０８まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項９】
プローブが配列番号：１０９から１１２まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項１０】
プローブが配列番号：１１３から１１４まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項１１】
配列番号：５８の配列からなる標識ドメインを有する第１のドメイン及び遺伝子特異的標的配列を有する標的ドメインを含む第２のドメインを含んでなる合成オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１】
κ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核（ｈｅｔｅｒｅｏｎｕｃｌｅａｒ）ＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：１から１６までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項２】
λ免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡまたは対応する異核ＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：１７から１９までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項３】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型ＲＮＡおよび／または対応するｍＲＮＡを検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：３−３０から５０までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項４】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の初期ＲＮＡｓ、ＲＮＡ１およびＲＮＡ２、（ＥＢＥＲ）を検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：５１から５４までより本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項５】
ヒトＡｌｕ反復サテライトゲノムＤＮＡ配列を検出するためのプローブセットであって、プローブが配列番号：５５および５６より本質的になる群から選ばれることを特徴とする、プローブセット。
【請求項６】
プローブが配列番号：５９から７４まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項７】
プローブが配列番号：７５から８７まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項８】
プローブが配列番号：８８から１０８まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項９】
プローブが配列番号：１０９から１１２まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項１０】
プローブが配列番号：１１３から１１４まで、とそれらの相補体より本質的になる群から選ばれるＤＮＡプローブセット。
【請求項１１】
配列番号：５８の配列からなる標識ドメインを有する第１のドメイン及び遺伝子特異的標的配列を有する標的ドメインを含む第２のドメインを含んでなる合成オリゴヌクレオチドプローブ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２０１２−６５６６０（Ｐ２０１２−６５６６０Ａ）
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２３３２９５（Ｐ２０１１−２３３２９５）
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【分割の表示】特願２００２−５２７３１４（Ｐ２００２−５２７３１４）の分割
【原出願日】平成１３年９月６日（２００１．９．６）
【出願人】（５９９０７５０７０）ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月５日（２０１２．４．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月２４日（２０１１．１０．２４）
【分割の表示】特願２００２−５２７３１４（Ｐ２００２−５２７３１４）の分割
【原出願日】平成１３年９月６日（２００１．９．６）
【出願人】（５９９０７５０７０）ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド (31)
【Ｆターム（参考）】
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