ウィルス、微生物類の検出方法
【課題】微生物又は毒素などを検出するための試薬及びキット、並びに、該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素などを検出する方法を提供する。
【解決手段】微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに、該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素などを検出する方法である。ＡＩＥ効果を惹起する化合物としては、例えば、以下の式で表される化合物などを使用することができる。
【解決手段】微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに、該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素などを検出する方法である。ＡＩＥ効果を惹起する化合物としては、例えば、以下の式で表される化合物などを使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルス及び微生物類の検出方法、並びに該検出方法のための試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのウィルスや細菌による感染症は、重篤な病態を引き起こすことも少なくないため、感染予防や感染後の治療は、常に重要な臨床的課題となっている。感染病原体の中でも、とりわけ危険度の高いインフルエンザウィルス、特にここ数年世界規模での蔓延が危惧されている高病原性トリインフルエンザ、ＳＡＲＳに対する予防及び治療上の対策は、早急に対応すべき重要な問題の一つである。さらに、近年の地球温暖化に伴い、熱帯地方特有の感染症（例えば、デング出血熱）が感染地域を拡大してきており、今後の対策が不可欠である。
【０００３】
ウィルスや細菌などの微生物による生体への感染経路は、各微生物によって異なるが、感染標的細胞への侵入の際には、標的細胞表層に存在する受容体上の糖鎖構造を認識し、結合することが、多くの場合において知られている。このような感染時の現象に着目して、発明者らは、ウィルスや細菌感染によって生じる疾患の予防及び治療法の開発を行ってきた。発明者らは、例えば、カルボシランデンドリマーあるいはポリマー上に糖鎖を集積させ、病原性大腸菌Ｏ−１５７の産生するベロ毒素に対して動物レベルでも強い阻害活性を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献１及び特許文献１）、デングウィルス（非特許文献２及び特許文献２）、インフルエンザウィルスの引き起こす感染症に対し効果を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献３、特許文献３、特許文献４及び特許文献５）など、精力的に研究を行ってきた。
このように、ウィルス又は細菌感染時の標的細胞上の糖鎖構造の認識機構は、感染症の予防又は治療方法の開発において有益な手掛かりを与えてきた。
【０００４】
感染症自体を予防又は治療することは、当然、重要なことであるが、その一方で、どのような微生物感染が生じているのかを早急に突き止めることも、早期治療を行う上では非常に重要なことである。現在、主として行われている感染病原体の検査は、検査対象の病原体に特異的な抗原タンパク質を検出する方法、特定の遺伝子領域を増幅して検出する方法、あるいは、感染病原体を顕微鏡下で直接観察する方法などが行われている。これらの方法のうち、抗原タンパク質や特定遺伝子を同定する方法は、検出感度及び精度の点において優れてはいるものの、やや操作が煩雑であり、迅速な検査結果の取得の点に若干の問題がある。また、顕微鏡を用いて形態学的に感染病原体を特定する方法においては、観察対象の病原体の数がある程度高濃度でなければ検出が難しく、そのための感染病原体の増殖等に多くの時間が必要とされ、検査の迅速性に問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００５，１９１：２０９７−２１０５
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００６，３４１：４６７−４７３
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２００１，４２：３３２７−３３３０
【非特許文献４】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．２００４，４５：３２９
【非特許文献５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７：１１６６１
【非特許文献６】Ｓｙｎ．Ｍｅｔ．２００５，１５２：２４９
【非特許文献７】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２００７，４８：４３６５−４３６８
【特許文献１】特開２００５−２８９９０７
【特許文献２】特開２００５−３０６７６６
【特許文献３】特開２００８−５０２８３
【特許文献４】特開２００８−８１４１１
【特許文献５】特開２００５−７７２７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記状況の中、感染症の原因病原体の検出及び同定をさらに迅速かつ正確に行うために、従来方法とは異なる方法論に基づいた新たな手法の開発に期待が寄せられている。
そこで、本発明は、感染病原体を迅速かつ正確に検出及び同定する方法、及び該方法に使用される試薬又はキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、病原体に特異的に結合する糖鎖を担持したカルボシランデンドリマーによるＡＩＥ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）効果を利用して本発明を完成させた。ＡＩＥ効果とは、２，３，４，５−テトラフェニルシロール（以下、シロールと略記）など、中心の環の周りを囲むように複数のアリール基（例えば、フェニル基）が結合した分子が、液体中で互いに凝集し合い、紫外線照射により高効率発光を行う現象のことである（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）。発明者らは、シロールと上記カルボシランデンドリマーを結合させた化合物によって引き起こされるＡＩＥ効果が、該カルボシランデンドリマーが担持する糖鎖と病原体（例えば、インフルエンザウィルスなど）又は病原体が分泌する毒素（例えば、ベロ毒素など）との結合によって消失すること初めて見出した。これまでにも、発光分子を利用して病原微生物を検出する試みが行われてはいたが、発光分子と病原微生物との結合の前後において、発光量又は色調の変化を明瞭に現出させる有効な方法が見出されていなかったため、いずれの試みも実用化には程遠い状態にあった。本発明は、ＡＩＥ効果を利用することで、シンプルかつ迅速な微生物検出を提供する点において、特別顕著な効果を有している。
【０００８】
すなわち、本発明は、微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
より具体的には、本発明は、ＡＩＥ効果を惹起する化合物が以下の式（Ｉ）で示されることを特徴とする微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
【化６】
（式（Ｉ）において、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数）
あるいは、本発明は、以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
【化７】
［式中（ＩＩ）中、Ｘは以下の置換基
【化８】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物検出方法は、検出対象の微生物を簡便かつ迅速に、高精度で定性的及び定量的な検出を行うことができる。
【００１０】
特に、本発明は、微生物等の存在による蛍光強度の変化が明瞭であるため、検出目的微生物等の存在を視覚的に捉えることが可能である。
【００１１】
本発明の微生物検出試薬又はキットは、煩雑な操作を必要とせず、また、微量に存在する微生物の検出にも適しているため、感染症の危険を迅速に感知することができるため、早急な感染症治療を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーと、ＡＩＥ効果を惹起、あるいは、発現する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬又はキット、及び該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法に関するものである。ここで、「デンドリマー」とは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーの形態としては、例えば、ダンベル型、ファン型、ボール型などが知られているが（図１を参照のこと）、本発明においては、ＡＩＥ効果を惹起する化合物と作用可能（即ち、ＡＩＥ効果を訴外することなく）に結合できる形態であればいずれの形態を使用することも可能であり、デンドリマーの形態の選択は、当業者であれば容易に行うことができる。本発明に使用されるデンドリマーは、微生物又は毒素と特異的に結合するものである。例えば、カルボシランデンドリマーのコア骨格に、微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖を結合させたデンドリマーなどを使用することができる。微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖としては、限定はしないが、例えば、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素と特異的に結合するグロボ３糖（Ｇｂ３、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−）、インフルエンザウィルス等のウィルス表面に存在するヘマグルチニンと特異的に結合するシアリルラクトース、デング熱ウィルスのスパイク糖タンパク質と特異的に結合するラクトネオテトラオースなど、本発明で使用可能な糖鎖はこれまでに数多く同定されており、検出対象の微生物又は毒素に適した糖鎖を選択することは当業者であれば容易に行うことができる。本発明で使用可能な糖鎖と該糖鎖が認識する微生物の組合せの一例を表１〜５に示す。
【００１３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００１４】
本明細書に記載される「ＡＩＥ効果」とは、発光性化合物が互いに凝集し合い、特定の波長（例えば、紫外線など）の照射により高効率発光を惹起する現象（ＡＩＥ：ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）のことである。本発明で使用可能な、「ＡＩＥ効果を惹起する化合物」は、当業者によって選択可能な化合物であればいかなるものであっても使用可能であるが、限定はしないが、例えば、下記の式（Ｉ）で示される化合物などを使用することができる。
【化９】
式（Ｉ）中、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数である。特に限定はしないが、例えば、Ｒはｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）であり、特にＣ６Ｈ５（フェニル基）の場合は、ｎは４、Ａ及びＢがメチル基である２，３，４，５−テトラフェニルシロールなどを好適に使用することができる。
【００１５】
本発明のある実施形態は、以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬である。式（ＩＩ）で示される化合物は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーと、ＡＩＥ効果を惹起、あるいは、発現する化合物を結合させた化合物」の１例の一般式である。
【化１０】
式中（ＩＩ）中、Ｘは、例えば、以下の置換基
【化１１】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、例えば、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）であって、特にＣ６Ｈ５（フェニル基）などを好適に使用することができ、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、特にケイ素が好ましく、ｎは１〜４の整数である）が好ましい。また、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、アミド結合を含んでもよく、例えば、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）などが好ましく、Ｒ５は炭化水素基を示し、メチル基などが好ましい。Ｅ２は、炭素、ケイ素、ゲルマニウムであり、Ｅ１と同一でも異なっていてもよく、特に、ケイ素が好ましい。また、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である。
【００１６】
Ｙは検出対象の微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、検出対象の微生物又は毒素に応じて選択するができ、かかる選択は当業者であれば容易に行うことができる。特に限定はしないが、例えば、一般式（ＩＩ）で示される化合物は、Ｙが以下の式（ＩＩＩ）の糖鎖の場合、ベロ毒素を、式（ＩＶ）の糖鎖の場合、インフルエンザウィルスを、式（Ｖ）の糖鎖の場合、デング熱ウィルスの検出に使用することができる。
【００１７】
【化１２】
【００１８】
また、検出対象がインフルエンザウィルスの場合、トリインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→３）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればトリインフルエンザウィルスを特異的に検出することができ（例えば、ＷＯ０２／００２５８８を参照のこと）、ヒトインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→６）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればヒトインフルエンザウィルスを特異的に検出することができる（例えば、特開２００８−３１１５６を参照のこと）。
【００１９】
一般式（ＩＩ）中のＹは、１分子中の全てのＹの位置が微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であることが望ましいが、必ずしも、全てのＹが上記置換基である必要はなく、例えば、水素、Ｃ＝Ｃ二重結合、水酸基などであってもよく、当該技術分野における通常の合成方法により、Ｙの位置に結合し得ると当業者が予測可能な如何なる置換基であってもよい。
なお、ここで使用される「微生物」にはウィルスを含むものとする。
【００２０】
本発明で使用される一般式（ＩＩ）で示される化合物として、例えば、以下に示す化合物（ＩＩａ）（シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３）を使用することができる（合成方法の詳細については、例えば、非特許文献７などを参照のこと）。
【化１３】
【００２１】
本発明の試薬は、本発明の「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」以外にも、当業者において微生物又は毒素の検出において必要と思われる物質、又は、当該検出に対し効果的に作用する物質など、他の添加物質を含んでもよい。このような添加物質としては、限定はしないが、例えば、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤などを使用することができる。また、本発明の検出試薬は、本発明の「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」を適当な溶媒、例えば、水溶液、有機溶媒等に溶解させた状態で提供することもできる。適切な溶媒は、当業者において容易に選択可能である。
【００２２】
本発明の試薬は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」をキットの形態で、適当な容器又はパック中に使用説明書と共に含めて提供することもできる。本発明に係る試薬がキットとして供給される場合、該試薬の構成成分を、活性構成成分の機能を低下することを回避するなどの必要に応じて、各構成成分を別々に包装してもよい。キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、構成成分を吸着せず、また、変質させない材質の容器中に供給される。また、キットに使用説明書が添付される場合、その使用説明は、紙又は他の材質上に印刷されて供給されてもよく、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。あるいは、キットの製造者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」（以下、「本発明の検出化合物」と記載する）を含んだ試薬又はキットを使用した、微生物又は毒素の検出方法である。
本発明の検出化合物によるＡＩＥ効果の発現は、該化合物の構造に適した溶媒環境において、発光強度が異なってくる。従って、使用する本発明の化合物の構造に応じた溶媒環境において微生物又は毒素の検出を行うことが望ましい。このような、検出環境に最も適する溶媒環境の選択は、当業者において通常の試行錯誤の範囲内の予備実験等で容易に設定することができる。例えば、本発明の検出化合物が式（ＩＩａ）で示される化合物の場合、測定を行う溶媒中の有機溶媒に対する水の比率が約２０％以下又は約７０％以上になると、発光効率が上昇する（図２を参照のこと）。よって、式（ＩＩａ）の化合物の発光効率は、例えば、有機溶媒中（例えば、アセトンなど）あるいは水中において発光効率が最大になる。また、測定に使用される測定環境は、検出対象の微生物又は毒素の安定性も考慮して、塩濃度、ｐＨなど至適な条件を選択することが望ましく、かかる選択は当業者にとって容易に行うことができる。
【００２４】
式（ＩＩａ）の化合物は、適当な測定溶媒（例えば、水）中において紫外線を照射すると強く青色発光を発する。この状態に、検出対象微生物又は毒素（例えば、式（ＩＩａ）の化合物の場合には、ベロ毒素）を添加すると、式（ＩＩａ）の化合物とベロ毒素が結合することによって、式（ＩＩａ）の化合物の凝集が崩壊することでＡＩＥ効果が阻害され、青色発光が消失する。これに対し、ベロ毒素以外の式（ＩＩａ）の化合物に担持される糖鎖とは結合しない微生物又は毒素を添加した場合には、ＡＩＥ効果の阻害は起こらず、青色発光には影響を与えない。従って、式（ＩＩａ）に示す化合物を本発明の検出化合物として使用する場合には、検出対象であるベロ毒素を検出環境中に添加した場合にのみ、青色発光が消失するため、ベロ毒素の存在を確認することができる。
以上のことは、式（ＩＩａ）以外の本発明の化合物を用いた場合にも同様に起こる現象であることから、ベロ毒素以外の微生物又は毒素を検出対象にする場合には、該検出対象に特異的に結合する糖鎖を担持した本発明の化合物を使用すれば、ベロ毒素以外の微生物又は毒素を容易に検出することができる。
本発明の化合物による発光強度は、検出対象の微生物又は毒素の量に依存して変動するため、検出対象微生物又は毒素を定量的に測定することも可能である。
【００２５】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（ＩＩａ））の合成
本発明の化合物の１例であるシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３の合成を下記のスキームに示す。
【化１４】
Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，１９９０、３９１：２７を参考に、１、１−ジクロロー２、３、４、５−テトラフェニルシロールをジフェニルアセチレン（もしくはトラン）のリチウムの還元、それによるテトラクロロシランとの環化反応により合成した。その後のカルボシランデンドリマーの世代拡張反応、末端官能基化反応、糖鎖導入反応はいずれも特許文献１と全て同じ反応条件により合成することができる。
このように合成したシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３がＡＩＥ効果を示すことを確認した。
【００２７】
２．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（ＩＩａ））とベロ毒素のＳｔｘ１及びＳｔｘ２との接着能
ベロ毒素にはＳｔｘ１とＳｔｘ２の２種類の毒素があり、それぞれに対し結合親和性の測定
を２種類（ＫＤ及びＲＵｍａｘ）ずつ行なった。いずれも、それらの値が小さいほどベロ毒素に対する接着能が高いことを示している。これによると、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３の値は、ダンベル（１）６−Ｇｂ３やボール（１）１２−Ｇｂ３のそれに比べるとやや大きな数値（ＫＤ値で一桁）を示すが、ファン（０）３−Ｇｂ３より遥かに低い値を示した。このことから、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３はベロ毒素に対する接着能を有していることが分かる。
【表６】
【実施例２】
【００２８】
本実施例は、シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３によるＡＩＥ効果がベロ毒素の存在によって消失することを示す目的で行われたものである。安全性の面を考慮して、ベロ毒素の代わりにここではピーナッツレクチン（ＰＮＡと標記する）を使用し、シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３の代わりにＰＮＡと特異的に結合するシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃを使用した。なお、当該技術分野においては、糖鎖とウイルス又は毒素との相互作用を確認するにあたり、安全性の面を考慮して、その代替的実験として糖鎖とレクチンの相互作用に関し検討することは、技術常識として周知のことである。
【００２９】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃの合成
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃは、以下に示すスキームのように合成を行った。
【化１５】
【００３０】
２．シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃのＡＩＥ効果のピーナッツレクチン（ＰＮＡ）による消失（図３）
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ（０．４ ｍｇ，１．２×１０−４ｍｏｌ）を水（２ｍｌ）に溶解する。そこから１００μｌを測り取り、水で１０ｍｌにメスアップし１００倍希釈を行った。そのうち３ｍｌを測定用セルへ入れる。そこへＰＮＡ溶液を１０μｌ単位で加え、蛍光強度の減少がなくなるまで滴下した。滴下したＰＮＡ溶液はＰＮＡ（０．７ｍｇ，６．４×１０−６ｍｏｌ）を水（０．３ｍｌ）に溶解したものを用いた。測定は５℃で行った。測定時のシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ溶液の濃度は、０．６×１０−６ｍｏｌ／ｌ、ＰＮＡ溶液の濃度は、２．０×１０−５ｍｏｌ／ｌであった。
セル中の溶液の４８０ｎｍ波長における蛍光強度を測定したところ、滴下するＰＮＡ溶液の量依存的に蛍光強度が低下し（図４Ａ）、また、視覚的にも蛍光強度の低下を確認することができた（図４Ｂ）。
【００３１】
３．シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃのＡＩＥ効果に対する小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）の影響
次に、シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃとは結合しない小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を添加した場合に、シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃによるＡＩＥ効果が影響を受けるかどうか調べた。
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ（０．３ ｍｇ，８．７×１０−５ｍｏｌ）を水（２ｍｌ）に溶解する。そこから１００μｌを測り取り、水で１０ｍｌにメスアップし１００倍希釈を行った。そのうち３ｍｌを測定用セルへ入れる。そこへＷＧＡ溶液を１０μｌ単位で加え２４０μｌまで滴下した。滴下したＷＧＡ溶液はＷＧＡ（０．８ｍｇ，３．３×１０−５ｍｏｌ）を水（０．３ｍｌ）に溶解したものを用いた。測定は５℃で行った。測定時のシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ溶液の濃度は、０．４×１０−６ｍｏｌ／ｌ、ＷＧＡ溶液の濃度は、１．１×１０−４ｍｏｌ／ｌであった。
ＷＧＡと滴下した場合には、蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図５）。
さらに、ＰＮＡ及びＷＧＡのいずれも含まない緩衝液を滴下したところ、４００μｌ添加した時点で、ほとんど蛍光強度の減少は見られなかった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、病原性の微生物や毒素を迅速かつ簡便に検出することを可能にするものであり、病原菌又は病毒素等の検出技術の向上に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】デンドリマーの基本的な骨格を模式的に示した図である。
【図２】式（ＩＩａ）で示される化合物の蛍光強度に対する溶媒の影響。有機溶媒（アセトン）に対する水の比率を変動させて、励起波長３６０ｎｍに対する化合物からの蛍光強度を測定した。
【図３】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対するピーナッツレクチンの影響を測定する手順を示す。
【図４】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対するピーナッツレクチン（ＰＮＡ）の影響を測定した。Ａは、シロール−デンドリマー（０．４×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、ＰＮＡ（２．０×１０−５ｍｏｌ／ｌ）を０μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ及び４０μｌ添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。Ｂは、シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果（「無）を参照）が、ＰＮＡを添加することによって消失した結果（「有」を参照）を示す。
【図５】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対する小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）の影響を測定した。シロール−デンドリマー（０．６×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、ＷＧＡ（３．２×１０−４ｍｏｌ／ｌ）を２４０μｌまで添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。
【図６】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対する緩衝液影響を測定した。シロール−デンドリマー（０．７×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、本実施に用いたＰＮＡ及びＷＧＡを溶解させた緩衝液のみを４００μｌまで添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルス及び微生物類の検出方法、並びに該検出方法のための試薬又はキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのウィルスや細菌による感染症は、重篤な病態を引き起こすことも少なくないため、感染予防や感染後の治療は、常に重要な臨床的課題となっている。感染病原体の中でも、とりわけ危険度の高いインフルエンザウィルス、特にここ数年世界規模での蔓延が危惧されている高病原性トリインフルエンザ、ＳＡＲＳに対する予防及び治療上の対策は、早急に対応すべき重要な問題の一つである。さらに、近年の地球温暖化に伴い、熱帯地方特有の感染症（例えば、デング出血熱）が感染地域を拡大してきており、今後の対策が不可欠である。
【０００３】
ウィルスや細菌などの微生物による生体への感染経路は、各微生物によって異なるが、感染標的細胞への侵入の際には、標的細胞表層に存在する受容体上の糖鎖構造を認識し、結合することが、多くの場合において知られている。このような感染時の現象に着目して、発明者らは、ウィルスや細菌感染によって生じる疾患の予防及び治療法の開発を行ってきた。発明者らは、例えば、カルボシランデンドリマーあるいはポリマー上に糖鎖を集積させ、病原性大腸菌Ｏ−１５７の産生するベロ毒素に対して動物レベルでも強い阻害活性を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献１及び特許文献１）、デングウィルス（非特許文献２及び特許文献２）、インフルエンザウィルスの引き起こす感染症に対し効果を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献３、特許文献３、特許文献４及び特許文献５）など、精力的に研究を行ってきた。
このように、ウィルス又は細菌感染時の標的細胞上の糖鎖構造の認識機構は、感染症の予防又は治療方法の開発において有益な手掛かりを与えてきた。
【０００４】
感染症自体を予防又は治療することは、当然、重要なことであるが、その一方で、どのような微生物感染が生じているのかを早急に突き止めることも、早期治療を行う上では非常に重要なことである。現在、主として行われている感染病原体の検査は、検査対象の病原体に特異的な抗原タンパク質を検出する方法、特定の遺伝子領域を増幅して検出する方法、あるいは、感染病原体を顕微鏡下で直接観察する方法などが行われている。これらの方法のうち、抗原タンパク質や特定遺伝子を同定する方法は、検出感度及び精度の点において優れてはいるものの、やや操作が煩雑であり、迅速な検査結果の取得の点に若干の問題がある。また、顕微鏡を用いて形態学的に感染病原体を特定する方法においては、観察対象の病原体の数がある程度高濃度でなければ検出が難しく、そのための感染病原体の増殖等に多くの時間が必要とされ、検査の迅速性に問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００５，１９１：２０９７−２１０５
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００６，３４１：４６７−４７３
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２００１，４２：３３２７−３３３０
【非特許文献４】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．２００４，４５：３２９
【非特許文献５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７：１１６６１
【非特許文献６】Ｓｙｎ．Ｍｅｔ．２００５，１５２：２４９
【非特許文献７】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，２００７，４８：４３６５−４３６８
【特許文献１】特開２００５−２８９９０７
【特許文献２】特開２００５−３０６７６６
【特許文献３】特開２００８−５０２８３
【特許文献４】特開２００８−８１４１１
【特許文献５】特開２００５−７７２７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記状況の中、感染症の原因病原体の検出及び同定をさらに迅速かつ正確に行うために、従来方法とは異なる方法論に基づいた新たな手法の開発に期待が寄せられている。
そこで、本発明は、感染病原体を迅速かつ正確に検出及び同定する方法、及び該方法に使用される試薬又はキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、病原体に特異的に結合する糖鎖を担持したカルボシランデンドリマーによるＡＩＥ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）効果を利用して本発明を完成させた。ＡＩＥ効果とは、２，３，４，５−テトラフェニルシロール（以下、シロールと略記）など、中心の環の周りを囲むように複数のアリール基（例えば、フェニル基）が結合した分子が、液体中で互いに凝集し合い、紫外線照射により高効率発光を行う現象のことである（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）。発明者らは、シロールと上記カルボシランデンドリマーを結合させた化合物によって引き起こされるＡＩＥ効果が、該カルボシランデンドリマーが担持する糖鎖と病原体（例えば、インフルエンザウィルスなど）又は病原体が分泌する毒素（例えば、ベロ毒素など）との結合によって消失すること初めて見出した。これまでにも、発光分子を利用して病原微生物を検出する試みが行われてはいたが、発光分子と病原微生物との結合の前後において、発光量又は色調の変化を明瞭に現出させる有効な方法が見出されていなかったため、いずれの試みも実用化には程遠い状態にあった。本発明は、ＡＩＥ効果を利用することで、シンプルかつ迅速な微生物検出を提供する点において、特別顕著な効果を有している。
【０００８】
すなわち、本発明は、微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
より具体的には、本発明は、ＡＩＥ効果を惹起する化合物が以下の式（Ｉ）で示されることを特徴とする微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
【化６】
（式（Ｉ）において、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数）
あるいは、本発明は、以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
【化７】
［式中（ＩＩ）中、Ｘは以下の置換基
【化８】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物検出方法は、検出対象の微生物を簡便かつ迅速に、高精度で定性的及び定量的な検出を行うことができる。
【００１０】
特に、本発明は、微生物等の存在による蛍光強度の変化が明瞭であるため、検出目的微生物等の存在を視覚的に捉えることが可能である。
【００１１】
本発明の微生物検出試薬又はキットは、煩雑な操作を必要とせず、また、微量に存在する微生物の検出にも適しているため、感染症の危険を迅速に感知することができるため、早急な感染症治療を可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーと、ＡＩＥ効果を惹起、あるいは、発現する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬又はキット、及び該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法に関するものである。ここで、「デンドリマー」とは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーの形態としては、例えば、ダンベル型、ファン型、ボール型などが知られているが（図１を参照のこと）、本発明においては、ＡＩＥ効果を惹起する化合物と作用可能（即ち、ＡＩＥ効果を訴外することなく）に結合できる形態であればいずれの形態を使用することも可能であり、デンドリマーの形態の選択は、当業者であれば容易に行うことができる。本発明に使用されるデンドリマーは、微生物又は毒素と特異的に結合するものである。例えば、カルボシランデンドリマーのコア骨格に、微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖を結合させたデンドリマーなどを使用することができる。微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖としては、限定はしないが、例えば、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素と特異的に結合するグロボ３糖（Ｇｂ３、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−）、インフルエンザウィルス等のウィルス表面に存在するヘマグルチニンと特異的に結合するシアリルラクトース、デング熱ウィルスのスパイク糖タンパク質と特異的に結合するラクトネオテトラオースなど、本発明で使用可能な糖鎖はこれまでに数多く同定されており、検出対象の微生物又は毒素に適した糖鎖を選択することは当業者であれば容易に行うことができる。本発明で使用可能な糖鎖と該糖鎖が認識する微生物の組合せの一例を表１〜５に示す。
【００１３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００１４】
本明細書に記載される「ＡＩＥ効果」とは、発光性化合物が互いに凝集し合い、特定の波長（例えば、紫外線など）の照射により高効率発光を惹起する現象（ＡＩＥ：ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６及び非特許文献７）のことである。本発明で使用可能な、「ＡＩＥ効果を惹起する化合物」は、当業者によって選択可能な化合物であればいかなるものであっても使用可能であるが、限定はしないが、例えば、下記の式（Ｉ）で示される化合物などを使用することができる。
【化９】
式（Ｉ）中、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数である。特に限定はしないが、例えば、Ｒはｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）であり、特にＣ６Ｈ５（フェニル基）の場合は、ｎは４、Ａ及びＢがメチル基である２，３，４，５−テトラフェニルシロールなどを好適に使用することができる。
【００１５】
本発明のある実施形態は、以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬である。式（ＩＩ）で示される化合物は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーと、ＡＩＥ効果を惹起、あるいは、発現する化合物を結合させた化合物」の１例の一般式である。
【化１０】
式中（ＩＩ）中、Ｘは、例えば、以下の置換基
【化１１】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、例えば、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）であって、特にＣ６Ｈ５（フェニル基）などを好適に使用することができ、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、特にケイ素が好ましく、ｎは１〜４の整数である）が好ましい。また、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、アミド結合を含んでもよく、例えば、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）などが好ましく、Ｒ５は炭化水素基を示し、メチル基などが好ましい。Ｅ２は、炭素、ケイ素、ゲルマニウムであり、Ｅ１と同一でも異なっていてもよく、特に、ケイ素が好ましい。また、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である。
【００１６】
Ｙは検出対象の微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、検出対象の微生物又は毒素に応じて選択するができ、かかる選択は当業者であれば容易に行うことができる。特に限定はしないが、例えば、一般式（ＩＩ）で示される化合物は、Ｙが以下の式（ＩＩＩ）の糖鎖の場合、ベロ毒素を、式（ＩＶ）の糖鎖の場合、インフルエンザウィルスを、式（Ｖ）の糖鎖の場合、デング熱ウィルスの検出に使用することができる。
【００１７】
【化１２】
【００１８】
また、検出対象がインフルエンザウィルスの場合、トリインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→３）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればトリインフルエンザウィルスを特異的に検出することができ（例えば、ＷＯ０２／００２５８８を参照のこと）、ヒトインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→６）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればヒトインフルエンザウィルスを特異的に検出することができる（例えば、特開２００８−３１１５６を参照のこと）。
【００１９】
一般式（ＩＩ）中のＹは、１分子中の全てのＹの位置が微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であることが望ましいが、必ずしも、全てのＹが上記置換基である必要はなく、例えば、水素、Ｃ＝Ｃ二重結合、水酸基などであってもよく、当該技術分野における通常の合成方法により、Ｙの位置に結合し得ると当業者が予測可能な如何なる置換基であってもよい。
なお、ここで使用される「微生物」にはウィルスを含むものとする。
【００２０】
本発明で使用される一般式（ＩＩ）で示される化合物として、例えば、以下に示す化合物（ＩＩａ）（シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３）を使用することができる（合成方法の詳細については、例えば、非特許文献７などを参照のこと）。
【化１３】
【００２１】
本発明の試薬は、本発明の「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」以外にも、当業者において微生物又は毒素の検出において必要と思われる物質、又は、当該検出に対し効果的に作用する物質など、他の添加物質を含んでもよい。このような添加物質としては、限定はしないが、例えば、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤などを使用することができる。また、本発明の検出試薬は、本発明の「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」を適当な溶媒、例えば、水溶液、有機溶媒等に溶解させた状態で提供することもできる。適切な溶媒は、当業者において容易に選択可能である。
【００２２】
本発明の試薬は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」をキットの形態で、適当な容器又はパック中に使用説明書と共に含めて提供することもできる。本発明に係る試薬がキットとして供給される場合、該試薬の構成成分を、活性構成成分の機能を低下することを回避するなどの必要に応じて、各構成成分を別々に包装してもよい。キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、構成成分を吸着せず、また、変質させない材質の容器中に供給される。また、キットに使用説明書が添付される場合、その使用説明は、紙又は他の材質上に印刷されて供給されてもよく、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。あるいは、キットの製造者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、「微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物」（以下、「本発明の検出化合物」と記載する）を含んだ試薬又はキットを使用した、微生物又は毒素の検出方法である。
本発明の検出化合物によるＡＩＥ効果の発現は、該化合物の構造に適した溶媒環境において、発光強度が異なってくる。従って、使用する本発明の化合物の構造に応じた溶媒環境において微生物又は毒素の検出を行うことが望ましい。このような、検出環境に最も適する溶媒環境の選択は、当業者において通常の試行錯誤の範囲内の予備実験等で容易に設定することができる。例えば、本発明の検出化合物が式（ＩＩａ）で示される化合物の場合、測定を行う溶媒中の有機溶媒に対する水の比率が約２０％以下又は約７０％以上になると、発光効率が上昇する（図２を参照のこと）。よって、式（ＩＩａ）の化合物の発光効率は、例えば、有機溶媒中（例えば、アセトンなど）あるいは水中において発光効率が最大になる。また、測定に使用される測定環境は、検出対象の微生物又は毒素の安定性も考慮して、塩濃度、ｐＨなど至適な条件を選択することが望ましく、かかる選択は当業者にとって容易に行うことができる。
【００２４】
式（ＩＩａ）の化合物は、適当な測定溶媒（例えば、水）中において紫外線を照射すると強く青色発光を発する。この状態に、検出対象微生物又は毒素（例えば、式（ＩＩａ）の化合物の場合には、ベロ毒素）を添加すると、式（ＩＩａ）の化合物とベロ毒素が結合することによって、式（ＩＩａ）の化合物の凝集が崩壊することでＡＩＥ効果が阻害され、青色発光が消失する。これに対し、ベロ毒素以外の式（ＩＩａ）の化合物に担持される糖鎖とは結合しない微生物又は毒素を添加した場合には、ＡＩＥ効果の阻害は起こらず、青色発光には影響を与えない。従って、式（ＩＩａ）に示す化合物を本発明の検出化合物として使用する場合には、検出対象であるベロ毒素を検出環境中に添加した場合にのみ、青色発光が消失するため、ベロ毒素の存在を確認することができる。
以上のことは、式（ＩＩａ）以外の本発明の化合物を用いた場合にも同様に起こる現象であることから、ベロ毒素以外の微生物又は毒素を検出対象にする場合には、該検出対象に特異的に結合する糖鎖を担持した本発明の化合物を使用すれば、ベロ毒素以外の微生物又は毒素を容易に検出することができる。
本発明の化合物による発光強度は、検出対象の微生物又は毒素の量に依存して変動するため、検出対象微生物又は毒素を定量的に測定することも可能である。
【００２５】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（ＩＩａ））の合成
本発明の化合物の１例であるシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３の合成を下記のスキームに示す。
【化１４】
Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，１９９０、３９１：２７を参考に、１、１−ジクロロー２、３、４、５−テトラフェニルシロールをジフェニルアセチレン（もしくはトラン）のリチウムの還元、それによるテトラクロロシランとの環化反応により合成した。その後のカルボシランデンドリマーの世代拡張反応、末端官能基化反応、糖鎖導入反応はいずれも特許文献１と全て同じ反応条件により合成することができる。
このように合成したシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３がＡＩＥ効果を示すことを確認した。
【００２７】
２．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（ＩＩａ））とベロ毒素のＳｔｘ１及びＳｔｘ２との接着能
ベロ毒素にはＳｔｘ１とＳｔｘ２の２種類の毒素があり、それぞれに対し結合親和性の測定
を２種類（ＫＤ及びＲＵｍａｘ）ずつ行なった。いずれも、それらの値が小さいほどベロ毒素に対する接着能が高いことを示している。これによると、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３の値は、ダンベル（１）６−Ｇｂ３やボール（１）１２−Ｇｂ３のそれに比べるとやや大きな数値（ＫＤ値で一桁）を示すが、ファン（０）３−Ｇｂ３より遥かに低い値を示した。このことから、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３はベロ毒素に対する接着能を有していることが分かる。
【表６】
【実施例２】
【００２８】
本実施例は、シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３によるＡＩＥ効果がベロ毒素の存在によって消失することを示す目的で行われたものである。安全性の面を考慮して、ベロ毒素の代わりにここではピーナッツレクチン（ＰＮＡと標記する）を使用し、シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３の代わりにＰＮＡと特異的に結合するシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃを使用した。なお、当該技術分野においては、糖鎖とウイルス又は毒素との相互作用を確認するにあたり、安全性の面を考慮して、その代替的実験として糖鎖とレクチンの相互作用に関し検討することは、技術常識として周知のことである。
【００２９】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃの合成
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃは、以下に示すスキームのように合成を行った。
【化１５】
【００３０】
２．シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃのＡＩＥ効果のピーナッツレクチン（ＰＮＡ）による消失（図３）
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ（０．４ ｍｇ，１．２×１０−４ｍｏｌ）を水（２ｍｌ）に溶解する。そこから１００μｌを測り取り、水で１０ｍｌにメスアップし１００倍希釈を行った。そのうち３ｍｌを測定用セルへ入れる。そこへＰＮＡ溶液を１０μｌ単位で加え、蛍光強度の減少がなくなるまで滴下した。滴下したＰＮＡ溶液はＰＮＡ（０．７ｍｇ，６．４×１０−６ｍｏｌ）を水（０．３ｍｌ）に溶解したものを用いた。測定は５℃で行った。測定時のシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ溶液の濃度は、０．６×１０−６ｍｏｌ／ｌ、ＰＮＡ溶液の濃度は、２．０×１０−５ｍｏｌ／ｌであった。
セル中の溶液の４８０ｎｍ波長における蛍光強度を測定したところ、滴下するＰＮＡ溶液の量依存的に蛍光強度が低下し（図４Ａ）、また、視覚的にも蛍光強度の低下を確認することができた（図４Ｂ）。
【００３１】
３．シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃのＡＩＥ効果に対する小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）の影響
次に、シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃとは結合しない小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）を添加した場合に、シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃによるＡＩＥ効果が影響を受けるかどうか調べた。
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ（０．３ ｍｇ，８．７×１０−５ｍｏｌ）を水（２ｍｌ）に溶解する。そこから１００μｌを測り取り、水で１０ｍｌにメスアップし１００倍希釈を行った。そのうち３ｍｌを測定用セルへ入れる。そこへＷＧＡ溶液を１０μｌ単位で加え２４０μｌまで滴下した。滴下したＷＧＡ溶液はＷＧＡ（０．８ｍｇ，３．３×１０−５ｍｏｌ）を水（０．３ｍｌ）に溶解したものを用いた。測定は５℃で行った。測定時のシロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ溶液の濃度は、０．４×１０−６ｍｏｌ／ｌ、ＷＧＡ溶液の濃度は、１．１×１０−４ｍｏｌ／ｌであった。
ＷＧＡと滴下した場合には、蛍光強度の低下はほとんど見られなかった（図５）。
さらに、ＰＮＡ及びＷＧＡのいずれも含まない緩衝液を滴下したところ、４００μｌ添加した時点で、ほとんど蛍光強度の減少は見られなかった（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、病原性の微生物や毒素を迅速かつ簡便に検出することを可能にするものであり、病原菌又は病毒素等の検出技術の向上に貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】デンドリマーの基本的な骨格を模式的に示した図である。
【図２】式（ＩＩａ）で示される化合物の蛍光強度に対する溶媒の影響。有機溶媒（アセトン）に対する水の比率を変動させて、励起波長３６０ｎｍに対する化合物からの蛍光強度を測定した。
【図３】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対するピーナッツレクチンの影響を測定する手順を示す。
【図４】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対するピーナッツレクチン（ＰＮＡ）の影響を測定した。Ａは、シロール−デンドリマー（０．４×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、ＰＮＡ（２．０×１０−５ｍｏｌ／ｌ）を０μｌ、１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ及び４０μｌ添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。Ｂは、シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果（「無）を参照）が、ＰＮＡを添加することによって消失した結果（「有」を参照）を示す。
【図５】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対する小麦胚芽レクチン（ＷＧＡ）の影響を測定した。シロール−デンドリマー（０．６×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、ＷＧＡ（３．２×１０−４ｍｏｌ／ｌ）を２４０μｌまで添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。
【図６】シロール−デンドリマーのＡＩＥ効果に対する緩衝液影響を測定した。シロール−デンドリマー（０．７×１０−６ｍｏｌ／ｌ）に対し、本実施に用いたＰＮＡ及びＷＧＡを溶解させた緩衝液のみを４００μｌまで添加し、励起波長３６０ｎｍで測定した蛍光強度の変化を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬。
【請求項２】
前記ＡＩＥ効果を惹起する化合物が以下の式（Ｉ）で示されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【化１】
（式（Ｉ）において、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数）
【請求項３】
Ｒが、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）からなる群より選択される請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、請求項１に記載の微生物又は毒素を検出する試薬。
【化２】
［式中（ＩＩ）中、Ｘは以下の置換基
【化３】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
【請求項５】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が同一又は異なり、アミド結合を含んでもよく、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）であり、Ｒ５がメチル基である請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
Ｒが、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）からなる群より選択される請求項４又は５に記載の試薬。
【請求項７】
ＲがＣ６Ｈ５であり、Ｅ１及びＥ２がケイ素である請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
Ｙが以下の置換基
【化４】
の何れかである請求項４乃至７のいずれかに記載の試薬。
【請求項９】
ｌが０、ｍが２、ｎが４、Ｒ２及びＲ３が−Ｃ３Ｈ６−、Ｒ４が−Ｃ４Ｈ８−であり、Ｙが以下の置換基である請求項８に記載の試薬。
【化５】
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の試薬を含む、微生物又は毒素を検出するためのキット。
【請求項１１】
請求項１乃至１０いずれかに記載の試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法。
【請求項１】
微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬。
【請求項２】
前記ＡＩＥ効果を惹起する化合物が以下の式（Ｉ）で示されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
【化１】
（式（Ｉ）において、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１は、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、Ａ及びＢは同一でも異なってもよい炭化水素基、ｎは１〜４の整数）
【請求項３】
Ｒが、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）からなる群より選択される請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
以下の式（ＩＩ）で示される化合物を含む、請求項１に記載の微生物又は毒素を検出する試薬。
【化２】
［式中（ＩＩ）中、Ｘは以下の置換基
【化３】
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
【請求項５】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が同一又は異なり、アミド結合を含んでもよく、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）であり、Ｒ５がメチル基である請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
Ｒが、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、１−ナフチル、２−スチリル、ビフェニル、２−チエニル、ビチエニル、２−チアゾール、２−ピリジル、３−ピリジル、Ｎ−メチル−２−ピロリル、２，４，６−トリメチルフェニル（Ｍｅｓ）、２，４，６−トリイソプロピルフェニル（Ｔｉｐ）からなる群より選択される請求項４又は５に記載の試薬。
【請求項７】
ＲがＣ６Ｈ５であり、Ｅ１及びＥ２がケイ素である請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
Ｙが以下の置換基
【化４】
の何れかである請求項４乃至７のいずれかに記載の試薬。
【請求項９】
ｌが０、ｍが２、ｎが４、Ｒ２及びＲ３が−Ｃ３Ｈ６−、Ｒ４が−Ｃ４Ｈ８−であり、Ｙが以下の置換基である請求項８に記載の試薬。
【化５】
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の試薬を含む、微生物又は毒素を検出するためのキット。
【請求項１１】
請求項１乃至１０いずれかに記載の試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１１２７７７（Ｐ２０１０−１１２７７７Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８３９７６（Ｐ２００８−２８３９７６）
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月５日（２００８．１１．５）
【出願人】（５０４１９０５４８）国立大学法人埼玉大学 (292)
【Ｆターム（参考）】
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