ウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染抑制剤
【課題】 亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤、およびエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤を提供する。
【解決手段】 クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程とを有する。
【解決手段】 クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程とを有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染抑制剤に関し、特に、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤、およびエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスとは、細胞を構成単位とせずにＤＮＡかＲＮＡのいずれかをゲノムとして有し、宿主細胞内だけで増殖する微小構造体であり、宿主細胞内の代謝系を利用して増殖する。その際、病原体としてふるまうことがあり、ウイルスが増殖した結果として宿主に惹起される疾病をウイルス感染症という。ウイルス感染症には、例えば、ライノウイルスによる感冒、インフルエンザウイルスによるインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルスによる後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）、単純ヘルペスウイルスによる単純ヘルペス、腫瘍ウイルスによる癌など、さまざまなものがある。
【０００３】
ウイルスの増殖は、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、III「脱殻」、IV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」、V「ウイルス部品の集合」、VI「細胞からの放出」の、I〜VIのステップを経てなされる。従って、従来より、これらのステップを攻撃対象として、種々のウイルス感染症の治療剤やウイルス感染予防・阻害剤の研究開発がされている。
【０００４】
例えば、ウイルス感染予防・阻害剤やウイルス感染症治療剤として代表的であるワクチンは、弱毒化または不活化したウイルスを宿主に取り込ませて免疫を獲得させ、これを利用することで、前記ステップのうち、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、あるいはVI「細胞からの放出」ステップを対象としている。また、特開２００８−２５３１８８号公報に開示されているＤＮａｓｅＸタンパク質は、ウイルス遺伝子の宿主への取り込みを抑制することで、特開２００７−１６０４４号公報に開示されているペプチドは、レトロウイルスのインテグラーゼを阻害することで、それぞれIV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」ステップを攻撃する（特許文献１および特許文献２）。
【０００５】
一方、インフルエンザは、代表的なウイルス感染症として知られている。インフルエンザの治療剤、インフルエンザウイルス感染予防・阻害剤としては、例えば、インフルエンザ表面に存在する酵素ノイラミニダーゼの働きを阻害することによりVI「細胞からの放出」ステップを攻撃するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）やザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害することによりIII「脱殻」ステップを攻撃するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）を挙げることができる。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドが開示されており、I「細胞表面への吸着」およびII「細胞内への侵入」ステップを対象としている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５３１８８号公報
【特許文献２】特開２００７−１６０４４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されたウイルス感染予防・阻害剤は、外来遺伝子の分解を促進することが示されているものの、実際のウイルス感染を阻害するか否かは確かめられておらず、ウイルス感染阻害効果は不明である。また、ワクチン、レトロウイルス感染阻害剤（特許文献２）、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、インフルエンザ予防・治療剤（特許文献３）は、いずれもウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対するワクチンが作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となる。
【０００８】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤、およびエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とが複合体を形成し、エンドソーム上に存在することで、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによってウイルスが感染すること、および、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質との複合体の形成を阻害することにより、あるいはこれらが形成する複合体がエンドソーム上に存在することを抑制することにより、あるいはまたＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制することにより、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制できることを見出し、さらに、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスとクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）とを抑制することにより、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制できることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質に結合可能なｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）と対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１１】
（２）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１）に記載の方法。
【００１２】
（３）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１）または（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）蛍光共鳴エネルギー移動を観測する方法を用いる、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド。
【００１５】
（６）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（５）に記載の方法。
【００１６】
（７）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（５）または（６）に記載の方法。
【００１７】
（８）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００１８】
（９）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（８）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００１９】
（１０）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、（８）または（９）に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００２０】
（１１）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（８）から（１０）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２１】
（１２）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【００２２】
（１３）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１２）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２３】
（１４）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１２）または（１３）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２４】
（１５）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００２５】
（１６）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１５）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２６】
（１７）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１５）または（１６）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２７】
（１８）エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００２８】
（１９）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１８）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２９】
（２０）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質が、下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上の物質および／またはポリペプチドである、（１８）に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｖｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質。
【００３０】
（２１）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項２０に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００３１】
（２２）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１８）から（２１）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る方法によれば、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に感染を抑制することができる物質をスクリーニングすることができる。また、本発明に係るウイルス感染抑制剤によれば、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスおよび／またはエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】エンドサイトーシスの経路を説明する図である。
【図２】蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を用いてＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤとの結合を確認する場合の模式図である。
【図３】ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６１７０ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図４】ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６７９１ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図５ａ】Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの複合体、およびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により観察し、ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＥＡ１）の細胞内における存在箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である。
【図５ｂ】ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、１細胞における緑、赤および黄の各色の顆粒数の平均値を示すグラフである。
【図６】ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、ＥＧＦを添加しない場合およびＥＧＦを添加した場合の、１細胞における「黄色の顆粒数／赤色の顆粒数」の平均値を示すグラフである。
【図７】ｐＩＲＭ２１−３ＨＡ（８０６９ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図８ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をデキストランの取り込み量に換算して表したグラフである。
【図８ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をトランスフェリンの取り込み量に換算して表したグラフである。
【図９ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群について、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒをそれぞれ用いて導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現が見られる細胞数の割合を示す図である。
【図９ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群について、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、レンチウイルスＨＩＶおよびレトロウイルスＭＳＣＶをそれぞれ用いて導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現が見られる細胞数の割合を示す図である。
【図１０】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質およびＫ２５１Ｅタンパク質の細胞内における存在箇所をそれぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察し、Ｈ−Ｒａｓタンパク質の細胞内における存在箇所をＥＧＦＰの蛍光（緑色）により観察し、ＥＥＡ１の細胞内における存在箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である。
【図１１ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群に、ＰＲ８ウイルスを接種した場合のウイルス感染率を示す図である。図中、右側のシャーレの写真はプラークアッセイを行って出現したプラークを示す。
【図１１ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群にＡｉｃｈｉウイルスを接種した場合のウイルス感染率を示す図である。
【図１２ａ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、近隣結合法により作成した系統樹を示す図である。
【図１２ｂ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗにより作成したアラインメントを示す図である。図中、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤに特徴的なＮ末端側の２８アミノ酸を囲んで示す。
【図１２ｃ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、アラインメント作成結果に基づき、配列の保存性について視覚的に表現した図である。
【図１３】Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所を、ＥＧＦ刺激前後について、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により観察した結果を示す図である。
【図１４】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ（５９１８ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１５】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８（５６７５ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１６】ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ（５２６１ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１７】ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８（５０８３ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１８】Ｎ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、デキストランを取り込ませたＭＤＣＫ細胞において、デキストランをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）により観察し、Ｎ２８ポリペプチドの発現をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察した結果を示す図である（上図）。また、２４個のＭＤＣＫ細胞について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（下図）。
【図１９】Ｎ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞において、Ｎ２８ポリペプチドの発現をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察し、ＰＲ８ウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）により観察した結果を示す図である。
【図２０】ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６１７０ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図２１】ＥＣＦＰで標識したＮ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（Ｎ２８群）およびＥＣＦＰのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）において、導入したｃＤＮＡの発現をＥＣＦＰの蛍光（青色）により観察し、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である（左図）。また、各群の１２０個のＭＤＣＫ細胞について、ＥＣＦＰの蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（右図）。
【図２２】ＥＣＦＰで標識したＮ１１ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（Ｎ１１群）およびＥＣＦＰのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）において、導入したｃＤＮＡの発現をＥＣＦＰの蛍光（青色）により観察し、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である（上図）。また、各群の９０個のＭＤＣＫ細胞について、ＥＣＦＰの蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（下図）。
【図２３】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＭＤＣ群）、ＬＹ２９４００２とＭＤＣとを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ＋ＭＤＣ群）、およびオセルタミビルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（オセルタミビル群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。
【図２４】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａ（６２４５ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図２５】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、ＭＤＣを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＭＤＣ群）およびＬＹ２９４００２とＭＤＣとを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ＋ＭＤＣ群）における、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により、Ｒａｂ５タンパク質をＥＣＦＰの蛍光（青色）により、Ｒａｂ７タンパク質をＥＣＦＰの蛍光（青色）により、ＣＬＣａタンパク質をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）によりそれぞれ検出した結果を示す図（左図）および各群における「ＥＣＦＰの蛍光（青色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒数／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒数（ｂ／ａ）」と「Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒数／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒数（ｃ／ａ）」を示すグラフ（右図）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染抑制剤について詳細に説明する。本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域であるＲＢＤと対象物質とを共存させる工程（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程）、
（ｉｉ）対象物質がＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）、
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００３５】
すなわち、前記ウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合することにより、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づいており、その複合体の形成を阻害する物質、すなわち前記ウイルスの感染を抑制する物質をスクリーニングする方法である。
【００３６】
エンドサイトーシスとは、一般に、細胞が外界からの物質を細胞膜の小胞化と融合により内部に取り込む方式の総称である。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞装置の違いにより、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などに分類されている（図１；Ｍａｒｓｈら、Ｃｅｌｌ、第１３４巻、第７２９頁、２００９年）。
【００３７】
また、エンドサイトーシスは、細胞膜に存在する受容体タンパク質への刺激により生じるか否かにより、受容体依存性エンドサイトーシスおよび受容体非依存性エンドサイトーシスにも分類可能である。この場合、前者には前記の分類でいうクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やカベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などに相当するエンドサイトーシスが含まれ、後者には前記の分類でいうクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）に相当する、食作用（ファゴサイトーシス）や飲作用（ピノサイトーシス）などが含まれる。
【００３８】
すなわち、本発明において「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルスが包含される。
【００３９】
対象となる、エンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン−ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｂ（ＣＶＢ）、イネ萎縮ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを挙げることができる。
【００４０】
また、本発明において「クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって専ら感染するウイルスを除いた、エンドサイトーシスによって感染可能な（感染性を有する）ウイルス、すなわちクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルスが包含される。
【００４１】
また、対象となる、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスとしては、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルスを挙げることができる。好ましくは、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルスを挙げることができ、そのようなウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン−ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどを挙げることができる。
【００４２】
ウイルスが細胞内へ侵入する際、一般的に、エンベロープを持つウイルスは膜融合を利用し、アデノウイルスなどのエンベロープを持たないウイルスはエンドサイトーシスを利用する場合が多いが、エンベロープを持つウイルスのうち、インフルエンザウイルスなどは、エンドサイトーシスにより感染可能であることが知られている。すなわち、本発明における「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」または「クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、膜融合により感染可能な（感染性を有する）ウイルスであっても、それぞれ、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスまたはクラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスであれば包含される。
【００４３】
本発明において、感染を抑制するか否かは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年や、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第３巻、第３０１頁、２００１年、あるいはＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年などに従い、感染率を算出することにより評価することができる他、例えば、ウイルス株の感染価を指標として評価することができる。感染価とは、一般的に感染性の微生物を含む検体を培養細胞に等量ずつ接種した時、感染率５０％を与えるようなその検体の量をいい、「ＴＣＩＤ５０（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」で表される。
【００４４】
なお、本発明において「感染を抑制する」は、「感染を予防する」、「感染を阻止する」、「感染を阻害する」と交換可能に用いられる。また、「活性を抑制する」という場合は、「活性を阻害する」と交換可能に用いられる。
【００４５】
工程（ｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程）における、ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを共存させる方法は、当業者によって適宜選択可能な方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、Ｒａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質との溶液を調製することにより共存させる方法や、Ｒａｓタンパク質を固定した担体を、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを含む溶液に浸漬することにより共存させる方法などを挙げることができる。また、Ｒａｓタンパク質、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質は、必要に応じて、担体に結合させ、あるいは標識物質で標識することができる。そのような担体としては、例えば、マイクロプレートなどのプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、多孔性シリカ系担体などの不溶性担体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの可溶性タンパク質担体をはじめとする生物学的担体などを挙げることができ、担体への結合は、その種類に応じて、当業者が適宜選択可能な方法を用いることができる。また、使用可能な標識物質としては、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質、アイソトープなどを挙げることができる。
【００４６】
工程（ｉｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）における、「Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの『結合』」とは、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとが、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合により非共有的に結合することをいう。
【００４７】
工程（ｉｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）における、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合を確認する方法は、当業者によって適宜選択可能な方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、共免疫沈降法、カラムまたはビーズを用いたプルダウン法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＢＩＡＣＯＲＥ、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を用いた方法などのインビトロアッセイを挙げることができる。
【００４８】
ＦＲＥＴとは、近接した２個の蛍光物質の間で、励起エネルギーが電磁波ではなく電子の共鳴により直接移動する現象であり、一方の分子（供与体）で吸収された光のエネルギーによって他方の分子（受容体）から蛍光が放射される現象をいう。すなわち、２個の蛍光物質が近接している場合は、供与体の吸収スペクトルに相当する光で励起すると、供与体ではなく受容体の発光スペクトルに従う蛍光が現れる。
【００４９】
Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合を確認する方法としてＦＲＥＴを用いる場合、例えば、図２上段に示すように、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤに、それぞれ二つの異なる蛍光タンパク質をつなぎ、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合により観察されるＦＲＥＴの蛍光が、対象物質を共存させた場合に減ずるか否かを確認することにより行うことができる。また、図２下段に示すように、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤをつなげて一つのポリペプチドとし、それぞれのドメインに二つの異なる蛍光タンパク質をつないでもよい。この場合は、Ｒａｓタンパク質ドメインとＰＩ３Ｋタンパク質ドメインまたはＲＢＤドメインとの結合により観察されるＦＲＥＴの蛍光が、対象物質を共存させた場合に減ずるか否かを確認すればよい。なお、本発明におけるＦＲＥＴで用いることができる蛍光タンパク質として、青緑色蛍光タンパク質（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）を挙げることができる。
【００５０】
また、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法の異なる態様は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）下記（ａ）〜（ｄ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程（ポリペプチド共存工程）、
（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体ＰＩ３Ｋタンパク質をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体ＰＩ３Ｋタンパク質をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド
（ｉｉ）前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程（ポリペプチド結合能評価工程）
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００５１】
すなわち、前記異なる態様に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合し、ＲＢＤのアミノ（Ｎ）末端ポリペプチドによって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づいており、前記（ａ）〜（ｄ）から選択される１または２以上のポリペプチドと結合可能であって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することを阻害する物質、すなわち前記ウイルスの感染を抑制する物質をスクリーニングする方法である。
【００５２】
ここで、本発明においてポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物のことをいい、構成するアミノ酸数は特に限定されず、例えば、２アミノ酸からなるジペプチド、３アミノ酸からなるトリペプチド、４アミノ酸からなるテトラペプチド、１０程度のアミノ酸からなるオリゴペプチド、２０以上のアミノ酸からなるペプチドやタンパク質が包含される。
【００５３】
また、本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制する限り、配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、Ｒａｓタンパク質に結合する限り特に限定されないが、例えば１〜２７個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列に相当するのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００５４】
すなわち、配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤのＮ末端側１〜２８番目のアミノ酸から構成されるポリペプチドであるＮ２８ポリペプチドまたはＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤのＮ末端側９〜１９番目のアミノ酸から構成されるポリペプチドであるＮ１１ポリペプチドと、それぞれ高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチドが含まれる。また、配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、またはＮ１１ポリペプチドを欠くＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤと、それぞれ高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質に結合するポリペプチドが含まれる。また、ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００５５】
本発明に係る配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含され、また、本発明に係る配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、Ｒａｓタンパク質に結合する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。
【００５６】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドがＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成する場合、ＰＩ３Ｋタンパク質のアミノ酸配列において本発明に係るポリペプチドが構成する部位は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、ＲＢＤ以外の部位のいずれでもよいが、ＲＢＤが好ましく、ＲＢＤのＮ末端付近がより好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて１〜２８番目で構成されるポリペプチドがさらに好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて５〜２４番目で構成されるがよりさらに好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて９〜１９番目が最も好ましい。
【００５８】
工程（ｉ）（ポリペプチド共存工程）における、前記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドと対象物質とを共存させる方法としては、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程における方法と同様の方法を挙げることができる。
【００５９】
工程（ｉｉ）（ポリペプチド結合能評価工程）における、「前記ポリペプチドと対象物質との結合」とは、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程における「Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの『結合』」と同様、前記ポリペプチドと対象物質とが、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合により非共有的に結合することをいい、前記ポリペプチドと対象物質との結合を確認する方法としては、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程における方法と同様の方法を挙げることができる。
【００６０】
なお、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の工程を有してもよく、例えば、インキュベート工程や洗浄工程などを有してもよい。
【００６１】
本発明に係るウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする。
【００６２】
すなわち、前記ウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合することにより、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づき、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とするアンタゴニストである。
【００６３】
ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質としては、下記（ｅ）から（ｊ）のポリペプチドの他、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法によってスクリーニングされた物質を挙げることができる；
（ｅ）ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド
（ｇ）Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｈ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、（ｉ）Ｎ１１ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｊ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００６４】
前記（ｅ）から（ｊ）のポリペプチドを有効成分とする場合、これらがＰＩ３Ｋタンパク質と拮抗してＲａｓタンパク質と結合することにより、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との複合体の形成を阻害することができる。
【００６５】
本発明に係る異なる第二の態様のウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｋ）〜（ｎ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする；
（ｋ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド
（ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｎ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【００６６】
すなわち、前記異なる第二の態様に係るウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合し、ＲＢＤのＮ末端ポリペプチドによって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づき、ＲＢＤのＮ末端ポリペプチドと同一のポリペプチドである前記（ｋ）および／または前記（ｍ）、もしくは前記（ｋ）および・または前記（ｍ）とそれぞれ高い相同性を有する前記（ｌ）および／または前記（ｎ）の各ポリペプチドから選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とするものであり、これらのポリペプチドは、前記複合体がエンドソーム上に存在（局在）するのを抑制する。
【００６７】
また、これらのポリペプチドは、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）するのを抑制する限り、細胞内への移行を促進することが知られているポリリジン等の配列が付加されていてもよい。
【００６８】
本発明におけるポリペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明におけるポリペプチドに相当するｃＤＮＡが挿入された組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明におけるポリペプチドに相当するｃＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。
【００６９】
本発明に係る異なる第三の態様のウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする。
【００７０】
すなわち、前記異なる第三の態様に係るウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質とが複合体を形成している場合であっても、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制することにより、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスが阻害されるという知見に基づき、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分としている。
【００７１】
ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質としては、例えば、ＬＹ２９４００２［２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ］、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＺＳＴＫ４７４［２−（２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−１−ｙｌ）−４，６−ｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ］（Ｙａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９８巻、第５４５−５５６頁、２００６年）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ［３，３’，４’，５，７−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ］（Ｗ．Ｆ．Ｍａｔｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１８６巻、第６２４−６３１頁、１９９２年）などのＰＩ３Ｋ阻害剤を挙げることができる。なお、本実施例においては、好適なＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質として、ＬＹ２９４００２を用いている。
【００７２】
本発明に係る異なる第四の態様のウイルス感染抑制剤は、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする。
【００７３】
すなわち、前記異なる第四の態様に係るウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスとクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）とを抑制することにより、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染が顕著に抑制されるという知見に基づき、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分としている。
【００７４】
本発明において、エンドサイトーシスを抑制するとは、エンドサイトーシスの一連の過程のうちの１または２以上のステップを抑制することをいう。エンドサイトーシスには、外界からの物質を内部に含む小胞の形成、小胞とライソゾームやゴルジ体、カベオソーム、小胞体などの細胞小器官との融合、あるいは外界からの物質の消化・分解の一連の過程があり、この過程には、例えば、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）であれば、リガンドの受容体への結合、細胞膜の陥入、リガンドの初期エンドソームへの取り込み、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟、後期エンドソームとリソソームとの合体、後期エンドソームとゴルジ体からの小胞との合体などのステップがあり、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）であれば、それぞれ細胞膜の陥入や葉状仮足からのマクロピノソームの形成、リガンドの初期エンドソームへの取り込み、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟、後期エンドソームとリソソームとの合体、後期エンドソームとゴルジ体からの小胞との合体などのステップがある。
【００７５】
本発明に係るエンドサイトーシスを抑制する物質は、エンドサイトーシスの一連の過程に含まれるステップうち１または２以上のステップを抑制することにより、エンドサイトーシスを抑制する物質である。
【００７６】
本発明において、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうち、いずれか一つの経路、例えば、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、またはダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみを抑制するものでもよく、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうちの２以上の経路を抑制するものでもよいが、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質が好ましい。
【００７７】
本発明において、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質としては、例えば、サイトカラシンＢ、５−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｒｏｌｉｄｅ（ＥＩＰＡ）、アミロリドなどを挙げることができる他、本発明に係るクラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤を用いることができる。
【００７８】
本発明において、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質としては、例えば、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）、ショ糖、クロロプロマジン（ＣＰＺ）、メチル−β−Ｃｙｄなどを挙げることができる。なお、本実施例においては、好適なクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質として、ＭＤＣを用いている。
【００７９】
本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法により得られるウイルスの感染を抑制する物質やウイルス感染抑制剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００８０】
以下、本発明に係るウイルスの感染を阻害する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染阻害剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００８１】
＜実施例１＞Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の確認
Ｈ−ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｈ−Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）触媒サブユニットγ（ＣＧ）タンパク質のＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）との複合体を、Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＢｉＦＣ）法により可視化し、また、初期エンドソームマーカーであるｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＥＡ１）タンパク質を免疫抗体染色により可視化して、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所を確認した。Ｈ−Ｒａｓは、活性化型変異Ｈ−ＲａｓであるＨ−ＲａｓＧ１２Ｖを用いた。Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（配列番号３）は、Ｈ−Ｒａｓ（配列番号１）の３５番目のグアニンをチミンに、３６番目のシトシンをアデニンに置換したものであり、それ故、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質（配列番号４）は、Ｈ−Ｒａｓタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の１２番目であるグリシンがバリンに置換されており、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質は、ＧＴＰ結合型である活性化Ｈ−Ｒａｓタンパク質の状態を恒常的に維持している（Ｌｏｗｙ Ｄ．Ｒ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６２巻、第８５１−８９１頁、１９９３年）。また、Ｈ−Ｒａｓタンパク質と、生体内においてＲａｓタンパク質に結合することが知られている因子であるｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質の、それぞれのＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所も同時に確認し、Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所と比較した。
【００８２】
（１）ベクターの調製
以下、ＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにＨ−ＲａｓＧ１２Ｖが挿入され、かつＥｃｏＲI／ＸｈｏIサイトに強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは、京都大学の松田道行氏から供与されたものを用いた。このベクターの制限酵素地図を図３に示す。また、ＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにＨ−ＲａｓＧ１２Ｖが挿入されたベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは、京都大学の松田道行氏から供与されたものを用いた。このベクターの制限酵素地図を図４に示す。さらに、蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓタンパク質のｃＤＮＡ（Ｖｅｎｕｓ；配列番号５）は、理化学研究所の宮脇敦史氏から供与されたものを用いた。
【００８３】
Ｖｅｎｕｓを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｖｅｎｕｓの１〜５１６番目（ＶＮ配列；配列番号６）および５１７〜７１４番目（ＶＣ配列；配列番号７）を、それぞれ増幅して単離した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
【００８４】
ＶＮ配列の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号８）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡ−３’（配列番号９）
ＶＣ配列の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号１１）
ＰＣＲ反応溶液組成；ｄＮＴＰ ２００μｍｏｌ／Ｌ、フォワードプライマー ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、リバースプライマー ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１×Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ５２Ｕ／ｍＬ
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【００８５】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。ＶＮ配列のＰＣＲ産物は、制限酵素ＥｃｏＲIおよびＸｈｏIで消化した後、前記ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＥｃｏＲI／ＸｈｏIサイトに、ＥＧＦＰのｃＤＮＡに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖを得た。また、ＶＣ配列のＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔIおよびＢｇｌIIで消化した後、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＮｏｔI／ＢｇｌIIサイトに挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣを得た。
【００８６】
続いて、Ｔｈｅ Ｂａｂｒａｈａｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ．Ｓｔｅｐｈｅｎ氏から供与されたＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤ（配列番号１３）のｃＤＮＡ（配列番号１２）、北里大学の服部成介氏から供与されたｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤ（配列番号１５）のｃＤＮＡ（配列番号１４）および内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離したＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤ（配列番号１７）のｃＤＮＡ（配列番号１６）を、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖに代えてそれぞれ挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１−ＲＢＤ−ＶＣおよびｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ＶＣの各ベクターを得た。
【００８７】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
アフリカミドリザル腎由来のＣｏｓ１細胞群（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を３群に分け、ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群とした。ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、各群に本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入した。その組み合わせは次のとおりである。
【００８８】
導入したベクターの組み合わせ
ＰＩ３ＫＣＧ群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ
ｃ−Ｒａｆ１群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１−ＲＢＤ−ＶＣ
ＲａｌＧＤＳ群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ＶＣ
【００８９】
その後、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）を１０％（ｖ／ｖ）含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２４時間培養した。
【００９０】
（３）免疫蛍光染色
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群を、パラホルムアルデヒドを３％含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温で１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含むＰＢＳを用いて室温で４分間透過処理した後、ＰＢＳで洗浄した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％含むＰＢＳを用いて室温にて３０分間ブロッキングを行った後、ＰＢＳにＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＢＳＡをそれぞれ０．０５％および０．１％となるよう添加して調製したＰＢＴで洗浄した。続いて、抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をＰＢＳで１０００倍希釈した溶液に４℃にて一晩曝して、一次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。次に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）をＰＢＳで２００倍希釈した溶液に室温にて１時間曝して、二次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。
【００９１】
（４）蛍光顕微鏡による観察
本実施例（３）のＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ‐１０００（オリンパス社）を用いて、既報に従い観察した｛Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２２巻、第４号、第８５９−８６９頁、２００３年｝。すなわち、ＰＩ３ＫＣＧ群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの、ｃ−Ｒａｆ１群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの、ＲａｌＧＤＳ群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの、それぞれの複合体をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により検出し、ＥＥＡ１をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図５ａに示す。また、画像処理ソフトウェアＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、各群の１０個から２０個の細胞について、１細胞毎に、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光を示す顆粒（緑色の顆粒）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光を示す顆粒（赤色の顆粒）、およびＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光の重複を示す顆粒（黄色の顆粒）の数をそれぞれ数え、１細胞における各色の顆粒数の平均値と標準偏差を求めてグラフに表した。その結果を図５ｂに示す。
【００９２】
図５ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、緑色の蛍光を示す箇所と、赤色の蛍光を示す箇所の多くが重複しているため、緑色と赤色との混色による黄色の蛍光が多く見られた。一方、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、緑色の蛍光を示す箇所と、赤色の蛍光を示す箇所の重複が少ないため、緑色と赤色との混色による黄色の蛍光はほとんど見られなかった。また、図５ｂに示すように、緑色、赤色および黄色の顆粒の数をそれぞれ数えた結果も同様で、ＰＩ３ＫＣＧ群では、緑色の顆粒数および赤色の顆粒数と比較して黄色の顆粒数が多かったが、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、緑色の顆粒数および赤色の顆粒数と比較して黄色の顆粒数は少なかった。
【００９３】
以上より、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの複合体およびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの複合体は初期エンドソームにほとんど存在しない一方で、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体は初期エンドソームに存在することが明らかになった。
【００９４】
＜実施例２＞ＥＧＦ刺激によるＨ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の変化の確認
上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）の刺激により、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所が変化するか否かを確認した。
【００９５】
まず、実施例１（１）に記載の方法によりベクターを調製し、実施例１（２）に記載の方法によりＣｏｓ１細胞群にベクターを導入した後、２４時間培養した。
【００９６】
その後、各群をそれぞれさらに２つに分け、そのうち一方の培地にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるよう添加して、２０分間培養した。
【００９７】
続いて、実施例１（３）に記載の方法により免疫蛍光染色を行った。その後、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群の１０個から２０個の細胞について、黄色の顆粒数および赤色の顆粒数を数えて、１細胞における「黄色の顆粒数／赤色の顆粒数」を算出し、その平均値と標準偏差を求めた。その結果を図６に示す。
【００９８】
図６に示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、ＥＧＦを添加した場合はＥＧＦを添加しない場合と比較して、黄色の顆粒数の割合が顕著に増加した。一方、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、ＥＧＦを添加した場合はＥＧＦを添加しない場合と比較して、黄色の顆粒数の割合はほとんど変わらなかった。
【００９９】
以上より、ＥＧＦにより刺激をすると、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体がエンドソームに存在するようになることが明らかになった。
【０１００】
＜実施例３＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞におけるエンドサイトーシス機能の確認
主にクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが知られているトランスフェリンと、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうち、主にクラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが知られている分子量１００００のデキストランとを、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質を欠く細胞およびＲａｓタンパク質に結合しない変異ＰＩ３ＫＣＧタンパク質（Ｋ２５１Ｅタンパク質；配列番号１９）を発現する細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。Ｋ２５１Ｅタンパク質のｃＤＮＡ配列（Ｋ２５１Ｅ；配列番号１８）では、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のｃＤＮＡ配列（ＰＩ３ＫＣＧ；配列番号２０）の７５１番目のアデニンがグアニンに置換されており、これによりＫ２５１Ｅタンパク質ではＰＩ３ＫＣＧタンパク質（配列番号２１）のアミノ酸配列の２５１番目のリジンがグルタミン酸に置換されている。その結果、Ｋ２５１Ｅタンパク質はＲａｓタンパク質に結合しないことが確認されている｛Ｐａｃｏｌｄ Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ、第１０３巻、第６号、第９３１−９４３頁、２０００年｝。
【０１０１】
（１）野生型ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２を培地に添加して培養した野生型ＭＥＦ細胞群（ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群）の調製
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｊｃｌ；日本クレア社）からマウス胎児繊維芽（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０−１０４６頁、２０００年｝、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。続いて、この細胞群を２群に分け、そのうち一方は野生型ＭＥＦ細胞群とした。残りの一方は、全てのクラスのＰＩ３Ｋタンパク質活性阻害剤であるＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を５０μｍｏｌ／Ｌとなるよう培地に添加して１時間培養し、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群とした。
【０１０２】
（２）ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ ＪｃｌバックグラウンドのＰＩＫ３ＣＧ欠損マウスからＰＩ３ＫＣＧを欠くＭＥＦ細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０−１０４６頁、２０００年｝、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。
【０１０３】
（３）ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群の調製
［３−１］ベクターの調製
京都大学の松田道行氏から供与された、ヘマグルチニン（ＨＡ）のｃＤＮＡが３コピー挿入されたベクターｐＩＲＭ２１−３ＨＡの制限酵素地図を図７に示す。Ｔｈｅ Ｂａｂｒａｈａｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ．Ｓｔｅｐｈｅｎ氏から供与されたＰＩ３ＫＣＧを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＩ３ＫＣＧを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１０４】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＡ−３’（配列番号２２）
リバースプライマー ；５’−ＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２３）
【０１０５】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、ｐＩＲＭ２１−３ＨＡのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＩＲＭ２１−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧを得た。続いて、これを制限酵素ＳａｌIおよびＮｏｔIで消化し、プロモーター領域、３ＨＡおよびＰＩＫ３ＣＧを含むＤＮＡ断片を得た後、実施例１（１）に記載の方法により調製したｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＳａｌI／ＮｏｔIサイトに、ＦｌａｇおよびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖを含むＤＮＡ断片に代えて挿入し、ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩＫ３ＣＧを得た。
【０１０６】
［３−２］ ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのベクターの導入
本実施例（３）［３−１］で調製したｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧをＳｃａIで消化した後、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（２）で調製したＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞に導入した。
【０１０７】
その後、実施例１（２）に記載の環境下で２日間培養した後、培地にＧ４１８二硫酸塩（シグマ社）を０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加してさらに培養し、耐性細胞を得た。続いて、得られた耐性細胞について、常法に従いウェスタンブロットを行ってＰＩ３ＫＣＧタンパク質の発現の有無を確認し、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質を安定して発現している細胞を選択し、Ｇ４１８二硫酸塩（シグマ社）を０．２ｍｇ／ｍＬ含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１０８】
（４）Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群の調製
［４−１］ベクターの調製
ＰＩ３ＫＣＧの７５１番目のアデニンをグアニンに置換した部分を含む２２塩基のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。これらのプライマーをそれぞれ用いて、本実施例（３）のＰＩ３ＫＣＧを鋳型として１回目のＰＣＲを行い、Ｋ２５１Ｅの１〜７６２番目およびＫ２５１Ｅの７４０〜３３０９番目をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応溶液組成は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲに用いたプライマーおよびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。用いたプライマーにおいて、ＰＩ３ＫＣＧの７５１番目のアデニンをグアニンに置換した部分を下線で示す。
【０１０９】
１回目のＰＣＲ
Ｋ２５１Ｅの１〜７６２番目の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；配列番号９のプライマー
リバースプライマー ；５’−ＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２４）
Ｋ２５１Ｅの７４０〜３３０９番目の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号２５）
リバースプライマー ；配列番号１０のプライマー
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、６８℃で３分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【０１１０】
続いて、１回目のＰＣＲ産物を鋳型として、本実施例（３）［３−１］に記載のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行い、Ｋ２５１Ｅを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成は、鋳型ＤＮＡを１回目のＰＣＲ産物各５０ｎｇずつとした他は、実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
【０１１１】
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【０１１２】
得られたＰＣＲ産物は、本実施例（３）［３−１］に記載の方法によりベクターに挿入し、ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを得た。
【０１１３】
［４−２］ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのベクターの導入
本実施例（４）［４−１］で調製したｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを、本実施例（３）［３−２］に記載の方法により、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞に導入し、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群を調製した。
【０１１４】
（５）エンドサイトーシス機能の評価
本実施例（１）から（４）で調製した各群をそれぞれ２つに分け、そのうち一方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合した分子量１００００のデキストラン（インビトロジェン社）を、他方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合したトランスフェリン（インビトロジェン社）を、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下で、１０分間培養した。
【０１１５】
その後、３７℃に保った状態で実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群における２０個の細胞について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度を測定し、その平均値をデキストランの取り込み量およびトランスフェリンの取り込み量に換算してグラフに表した。その結果を図８ａおよび図８ｂに示す。
【０１１６】
図８ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と比較してデキストランの取り込み量の低下が見られた。一方、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と同程度のデキストランの取り込みが見られた。また、図８ｂに示すように、トランスフェリンの取り込み量は、いずれの細胞群においても野生型ＭＥＦ細胞群との違いが見られなかった。
【０１１７】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異によりＲａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合またはＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合には、クラスリン依存性のエンドサイトーシスは抑制されない一方で、クラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスは抑制されることが明らかになった。
【０１１８】
＜実施例４＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞における強化青緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）遺伝子発現率の確認
エンドサイトーシスを介する遺伝子導入試薬であるＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いる方法、エレクトロポレーション法による遺伝子導入装置であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）を用いる方法、エンドサイトーシスにより感染することが知られているレンチウイルスＨＩＶを用いる方法、および膜融合により感染することが知られているレトロウイルスＭＳＣＶを用いる方法の４つの方法により、ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞群およびＫ２５１Ｅ導入細胞群にＥＣＦＰ遺伝子の導入を行い、導入したＥＣＦＰ遺伝子を発現する細胞数を調べた。
【０１１９】
（１）ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒにより導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現率
実施例３（１）から（４）に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）をそれぞれ用いて、ＥＣＦＰのｃＤＮＡ（配列番号２６）が挿入されたベクターｐＥＣＦＰ−Ｃ１（クロンテック社）を、付属の使用書に従い導入した。なお、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群については、ＬＹ２９４００２を添加した培地において、ベクターの導入を行った。
【０１２０】
その後、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。続いて、気温を３７℃に保った状態で下記に示す条件により蛍光観察を行い、ＥＣＦＰの蛍光（青色）が見られる細胞を数え、各群の全体の細胞数に占める割合を算出した。その結果を図９ａに示す。
【０１２１】
蛍光観察に用いた条件
顕微鏡；倒立型リサーチ顕微鏡 ＩＸ７１（オリンパス社）
電動シャッター・ステージ；ＢｉｏＰｏｉｎｔＭＡＣ５０００（Ｌｕｄｉ社）
光源；キセノンランプ、７５ワット
減光フィルター；６％
ダイクロイックミラー；ＸＦ２０３４（４５５ＤＲＬＰ；オメガ社）
励起フィルター；ＸＦ１０７１（４４０ＡＦ２１）（オメガ社）
吸収フィルター；ＸＦ３０７５（４８０ＡＦ３０）（オメガ社）
記録装置；冷却ＣＣＤカメラＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱ（ＲｏｐｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ＣＣＤカメラおよびフィルターホイールの制御、画像データの分析；ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）
【０１２２】
図９ａに示すように、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群では、それぞれ野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＥＣＦＰ発現細胞数の割合が顕著に低下した。また、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。一方、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、いずれの細胞群においても、それぞれ野生型ＭＥＦ細胞群と比較してＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。
【０１２３】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異により、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合およびＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合に、エンドサイトーシスを介する遺伝子導入試薬であるＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によるＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入が抑制された一方で、エレクトロポレーション法による遺伝子導入装置であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によるＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入は抑制されないことから、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異によりＲａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合、またはＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合は、エンドサイトーシスが抑制されることが明らかになった。
【０１２４】
（２）レトロウイルスおよびレンチウイルスの感染により導入した遺伝子の発現率
［２−１］レトロウイルスＭＳＣＶおよびレンチウイルスＨＩＶの調製
ブリティッシュコロンビア大学のＭ．Ｒ．Ｇｏｌｄ氏から供与されたレトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ｐａｃ−ＥＣＦＰを、同氏から供与されたパッケージング細胞であるＢＯＳＣ２３細胞に導入することにより、ＥＣＦＰのｃＤＮＡを保持したレトロウイルスｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）を作成した。また、理化学研究所の三好浩之氏から供与されたＣＳ−ＣＡ−ＥＣＦＰ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＲＳＶ−ＲｅｖおよびレンチウイルスベクターｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐの３つのベクターを、コネチカット大学のＢ．Ｍａｙｅｒ氏から供与された、パッケージング細胞であるヒト胚性腎（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ；ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞に導入することにより、ＥＣＦＰのｃＤＮＡを保持したレンチウイルスＨＩＶを作成した｛Ｐｅａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、第８３９２頁、１９９３年；Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２０巻、第１３号、第３３３３−３３４１頁、２００１年；Ｉｎｕｚｕｋａ Ｔ．ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．第３７９巻、第５１０−５１３頁、２００９年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｍｏｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．第ｌ２４６巻、第４２９−４３８頁、２００４年｝。
【０１２５】
［２−２］野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのレトロウイルスおよびレンチウイルス接種
本実施例（２）［２−１］のレトロウイルスＭＳＣＶおよびレンチウイルスＨＩＶを、それぞれ重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=１となるようＤＭＥＭ培地に加えて、レトロウイルス含有培地およびレンチウイルス含有培地を調製した。実施例３（１）および（２）に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、それぞれを２群に分け、そのうち一方にはレトロウイルス含有培地を、他方にはレンチウイルス含有培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１２時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、実施例１（２）に記載の環境下で２日間培養した。
【０１２６】
［２−３］ＥＣＦＰの蛍光観察
本実施例（２）［２−２］の各群について、気温を３７℃に保った状態で本実施例（１）に記載の方法により蛍光観察を行い、ＥＣＦＰの蛍光（青色）が検出される細胞を数えて、全体の細胞数に占める割合を算出した。その結果を図９ｂに示す。
【０１２７】
また、本実施例（１）の結果のうち、野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群における結果について、「ＥＣＦＰ発現細胞数／全体の細胞数」の値に換算して、図９ｂに示す。
【０１２８】
図９ｂに示すように、レンチウイルスＨＩＶの感染によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合、およびＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群におけるＥＣＦＰ発現細胞数の割合が顕著に低下した。一方、レトロウイルスＭＳＣＶの感染によりＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入を行った場合、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入を行った場合は、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群におけるＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。
【０１２９】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質が欠損すると、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によるエンドサイトーシスを介した遺伝子導入、およびレンチウイルスの感染による遺伝子導入すなわちエンドサイトーシスによるウイルス感染が抑制されることが明らかになった。一方、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質が欠損しても、レトロウイルスの感染すなわち膜融合によるウイルス感染は抑制されないことが明らかになった。
【０１３０】
＜実施例５＞Ｋ２５１Ｅタンパク質およびＨ−Ｒａｓタンパク質の細胞内における存在箇所の確認
Ｋ２５１Ｅタンパク質およびＨ−Ｒａｓタンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、これらのタンパク質が細胞内において存在する箇所を確認した。
【０１３１】
（１）ベクターの調製
実施例３（３）［３−１］に記載の方法によりｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧを得た。また、実施例３（４）［４−１］に記載の方法によりｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは実施例１（１）に記載のものを用いた。
【０１３２】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
Ｃｏｓ１細胞群（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を２群に分けてＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群とし、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入し、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。前記ベクターの組み合わせは次のとおりである。
【０１３３】
導入したベクターの組み合わせ
ＰＩ３ＫＣＧ群；ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧとｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ
Ｋ２５１Ｅ群；ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１ＥとｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ
【０１３４】
（３）免疫蛍光染色
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群について、実施例１（３）に記載の方法により免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に加えて抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）に加えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）を用いた。
【０１３５】
（４）共焦点顕微鏡による観察
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群について、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。すなわち、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質およびＫ２５１Ｅタンパク質の存在する箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により検出し、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質の存在する箇所をＥＧＦＰの蛍光により検出した。また、ＥＥＡ１をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図１０に示す。融合図の下段のグラフは、融合図内に点線で示したラインに沿って、各蛍光の強度を示したものである。また、拡大図は融合図内の囲みの部分を拡大した図である。
【０１３６】
図１０に示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現の多くが、細胞内の同じ箇所で確認された。一方、Ｋ２５１Ｅ群では、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現は同じ箇所に観察されるものの、Ｋ２５１Ｅタンパク質の発現は、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現と、細胞内の同じ箇所ではほとんど確認されなかった。
【０１３７】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質とＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との結合が阻害されると、初期エンドソームにおけるＰＩ３ＫＣＧタンパク質の存在（局在）が抑制されることが明らかになった。
【０１３８】
＜実施例６＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞におけるウイルス感染率の確認
ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞群およびＫ２５１Ｅ導入細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【０１３９】
（１）ＭＥＦ細胞群の調製
まず、実施例３（１）から（４）に記載の方法により、野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群を調製した。
【０１４０】
（２）インフルエンザウイルスの調製
次に、北海道大学の高田礼人氏より供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２；Ａｉｃｈｉ）を、ニワトリ卵１０日胚（ホクレン中央種鶏場）の漿尿膜へ接種して、３７℃にて４８時間培養して増殖させた。
【０１４１】
（３）ＭＥＦ細胞群へのインフルエンザウイルス接種
続いて、本実施例（２）のＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスを、それぞれ重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=２５０となるようｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地）（インビトロジェン社）に加えて、ＰＲ８ウイルス含有培地およびＡｉｃｈｉウイルス含有培地を調製した。本実施例（１）の各群をＰＢＳで洗浄した後、それぞれを２群に分け、そのうち一方にはＰＲ８ウイルス含有培地を、他方にはＡｉｃｈｉウイルス含有培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）のＢａｃｔ−ａｇａｒおよび５μｇ／ｍＬのトリプシンを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養した。
【０１４２】
（４）プラークアッセイによるウイルス感染率の確認
その後、本実施例（３）の培養上清を、１２穴プレートで単層培養したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）に添加して、３７℃にて１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ−ａｇａｒ１％（ｗ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養し、出現したプラークを数えた。この結果をもとに、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスの各群におけるウイルス感染率を求めた｛Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第３巻、第３０１頁、２００１年；ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年｝。ＰＲ８ウイルスの結果を図１１ａに、Ａｉｃｈｉウイルスの結果を図１１ｂにそれぞれ示す。
【０１４３】
図１１ａおよび図１１ｂに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群では、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも顕著に低下した。また、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群でも、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも低下した。一方、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも野生型ＭＥＦ細胞群と同程度に高いことが確認された。
【０１４４】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異により、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲａｓタンパク質への結合が阻害されると、インフルエンザウイルスの感染が抑制されることが明らかになった。また、ＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合も、インフルエンザウイルスの感染が抑制されることが明らかになった。
【０１４５】
＜実施例７＞Ｒａｓ結合領域の配列比較
ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列と他の代表的なＲａｓ結合分子であるＲａｆタンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質の、それぞれのＲＢＤのアミノ酸配列とを比較検討し、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤに特異的な配列を抽出した。
【０１４６】
ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ；ＮＪ）法により系統樹を作成した。その結果を図１２ａに示す。また、これらの配列について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ＪＰ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてアラインメントを作成した。その結果を図１２ｂに示す。また、アラインメント作成結果に基づき、配列の保存性について視覚的に表現した図を図１２ｃに示す。
【０１４７】
図１２ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列は、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列と別のカテゴリーに分類された。それは、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのＮ末端側のアミノ酸配列がｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のものより長く、かつ特徴的な２８アミノ酸の配列を有することに起因することが図１２ｂより確認された。さらに、図１２ｃに示すように、Ｎ末端側においてアミノ酸配列の保存性が低いことが確認された。
【０１４８】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのＮ末端２８アミノ酸（Ｎ２８ポリペプチド；配列番号２７および配列番号２８）が、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質に、他のＲａｓ結合因子とは異なる機能を付与する配列であることが示唆された。
【０１４９】
＜実施例８＞Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の確認
Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体を、ＢｉＦＣ法により可視化し、この複合体が細胞内において存在する箇所を確認した。
【０１５０】
（１）ベクターの調製
実施例１（１）に記載の方法により、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣおよびｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣを得た。
【０１５１】
実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧを鋳型として、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤ（配列番号３０）に相当するｃＤＮＡ（配列番号２９）を増幅した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲに用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１５２】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号３１）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＴ−３’（配列番号３２）
【０１５３】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖに代えて挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣを得た。
【０１５４】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
Ｃｏｓ１細胞（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を、コラーゲンでコートした直径３５ｍｍのガラスベースディッシュ（旭テクノガラス社）に置き、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、添付の使用書に従い、本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入した。その組み合わせは次のとおりである。
【０１５５】
導入したベクターの組み合わせ
ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ
ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣ
【０１５６】
ベクター導入後の細胞は、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養し、培地を除去した後、ＦＢＳを含まないフェノールレッド不含培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；インビトロジェン社）を添加し、さらに４時間培養した。
【０１５７】
（３）蛍光顕微鏡による観察
その後、３７℃に保った状態で、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。観察開始から２０分後に、培地にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに観察を行った。ＥＧＦ添加前の結果を図１３上段に、ＥＧＦ添加後の結果を図１３下段にそれぞれ示す。
【０１５８】
図１３上段および下段に示すように、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣを導入した細胞では、ＥＧＦ添加前と比較して、ＥＧＦ添加後にＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）がエンドソームにおいて多数見られた。一方、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣを導入した細胞では、ＥＧＦ添加前と比較して、ＥＧＦ添加後にＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）がゴルジ装置に集積していることが確認された。
【０１５９】
以上より、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との複合体は、エンドソームへ存在せずゴルジ装置に集積することが明らかになった。すなわち、Ｎ２８ポリペプチドはＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との複合体をエンドソームへ存在させる機能を有することが明らかになった。
【０１６０】
＜実施例９＞Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞のエンドサイトーシス機能の確認
分子量１００００のデキストランを、Ｎ２８ポリペプチドを発現させたＭＤＣＫ細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。
【０１６１】
（１）ベクターの調製
実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＶｅｎｕｓのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを得た。このベクターの制限酵素地図を図１４に示す。
【０１６２】
続いて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｅｎｕｓとＮ２８ポリペプチドのｃＤＮＡとを含むＤＮＡ断片を増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１６３】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３３）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧ−３’（配列番号３４）
【０１６４】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＥｃｏＲIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓのＥｃｏＲI／ＮｏｔIサイトに、ＥＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８を得た。このベクターの制限酵素地図を図１５に示す。
【０１６５】
次に、実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたベクターｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを得た。このベクターの制限酵素地図を図１６に示す。続いて、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを制限酵素ＳｐｅIおよびＸｈｏIで消化し、プロモーターとヘマグルチニンのｃＤＮＡを含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得て、これを、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８のＳｐｅI／ＸｈｏIサイトに、Ｖｅｎｕｓに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を得た。このベクターの制限酵素地図を図１７に示す。
【０１６６】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を、コラーゲンでコートした直径３５ｍｍのガラスベースディッシュ（旭テクノガラス社）に置き、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、添付の使用書に従い、本実施例（１）で調製したｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を導入した。その後、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。
【０１６７】
（３）エンドサイトーシス機能の評価
本実施例（２）のＭＤＣＫ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した分子量１００００のデキストラン（インビトロジェン社）０．５ｍｇ／ｍＬおよびＦＢＳ１０％（ｖ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１０分間培養した。
【０１６８】
（４）免疫蛍光染色
本実施例（３）のＭＤＣＫ細胞群について、実施例１（３）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体は抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に代えて抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）を用い、二次抗体はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）に代えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）を用いた。また、抗体の希釈にはＰＢＳに代えてＰＢＴを用い、二次抗体の希釈倍率は２００倍に代えて３００倍とし、一次抗体による抗原抗体反応の時間は一晩に代えて１２時間とした。
【０１６９】
（５）蛍光顕微鏡による観察
本実施例（４）のＭＤＣＫ細胞群について、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）を検出した。その結果を図１８の上図に示す。また、２４個の細胞について、１細胞におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度をそれぞれ測定し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を縦軸に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度を横軸にとったグラフにプロットした。その結果を図１８の下図に示す。
【０１７０】
図１８の上図および下図に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が小さい細胞、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が大きい細胞、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。
【０１７１】
以上より、Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、クラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスが抑制されることが明らかになった。
【０１７２】
＜実施例１０＞Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞のウイルス核タンパク質取り込み量の確認
Ｎ２８ポリペプチドを発現させたＭＤＣＫ細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、細胞内へのウイルス核タンパク質の取り込み量を調べた。
【０１７３】
（１）ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるウイルス核タンパク質の取り込み量
［１−１］ベクターの調製およびＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入
実施例９（１）に記載の方法によりｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を得て、これを実施例９（２）に記載の方法によりＭＤＣＫ細胞群に導入した。
【０１７４】
［１−２］ＭＤＣＫ細胞群へのインフルエンザウイルス接種
実施例６（２）に記載の方法により調製したＰＲ８ウイルスを、ＭＯＩ=２となるようＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に加えて、ＰＲ８ウイルス含有培地を調製した。本実施例（１）［１−１］のＭＤＣＫ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、ＰＲ８ウイルス含有培地を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）のＢａｃｔ−ａｇａｒおよび５μｇ／ｍＬのトリプシンを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて５時間培養した。
【０１７５】
［１−３］免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（１）［１−２］のＭＤＣＫ細胞群について、実施例９（４）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）に加えて北海道大学の高田礼人氏から供与された抗インフルエンザウイルス核タンパク質マウスモノクローナル抗体を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）に加えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）を用いた。その後、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。その結果を図１９に示す。
【０１７６】
図１９に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が大きい細胞ではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が小さく、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が大きい細胞ではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が小さかった。
【０１７７】
以上より、ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。
【０１７８】
（２）ＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるウイルス核タンパク質の取り込み量
［２−１］ベクターの調製
京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（制限酵素地図を図２０に示す）を制限酵素ＳｐｅIおよびＸｈｏIで消化して、プロモーターとＥＣＦＰのｃＤＮＡを含む約２．４ｋｂｐの断片を得た。この２．４ｋｂｐの断片を、実施例９（１）に記載の方法により得たｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８のＳｐｅI／ＸｈｏIサイトに、３コピーのＨＡのｃＤＮＡに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を得た。
【０１７９】
［２−２］ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入およびインフルエンザウイルス接種
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を２群に分け、コントロール群およびＮ２８群とした。実施例９（２）に記載の方法により、コントロール群には京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰを、Ｎ２８群には本実施例（２）［２−１］のｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８をそれぞれ導入した。その後、本実施例（１）［１−２］に記載の方法によりコントロール群およびＮ２８群にＰＲ８ウイルスを接種した。
【０１８０】
［２−３］免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（２）［２−２］のコントロール群およびＮ２８群について、実施例９（４）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）に代えて北海道大学の高田礼人氏から供与された抗インフルエンザウイルス核タンパク質マウスモノクローナル抗体を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）に代えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）を用いた。その後、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行った。その結果を図２１の左図に示す。また、各群のそれぞれ１２０個の細胞について、１細胞におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度およびＥＣＦＰの蛍光強度をそれぞれ測定して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度を縦軸に、ＥＣＦＰの蛍光強度を横軸にとったグラフにプロットした。その結果を図２１の右図に示す。
【０１８１】
図２１左図および右図に示すように、Ｎ２８群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＥＣＦＰの蛍光強度の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。一方、コントロール群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞が同程度に存在していた。
【０１８２】
以上より、ＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。また、この結果は本実施例（１）と同様の結果であることから、ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドまたはＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるインフルエンザウイルスの細胞内への取り込み抑制効果は、標識タンパク質によるものではなく、Ｎ２８ポリペプチドによるものであることが確認された。
【０１８３】
＜実施例１１＞Ｎ２８ポリペプチドの中央部１１アミノ酸を発現させた細胞のウイルス核タンパク質取り込み量の確認
Ｎ２８ポリペプチドの中央部１１アミノ酸（Ｎ１１ポリペプチド；配列番号３９および配列番号４０）を発現させたＭＤＣＫ細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、細胞内へのウイルス核タンパク質の取り込み量を調べた。
【０１８４】
（１）ベクターの調製
実施例１０（２）［２−１］に記載の方法によりｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ２８ポリペプチドのカルボキシル（Ｃ）末端側２０アミノ酸（配列番号３６）に相当するｃＤＮＡ（配列番号３５）を含む２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１８５】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号３７）
リバースプライマー ；５’−ＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号３８）
【０１８６】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＢｇｌIIで消化した後、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８のＸｈｏI／ＢｇｌIIサイトに挿入し、Ｎ２８ポリペプチドに相当するｃＤＮＡに代えてＮ２８ポリペプチドのＣ末端側２０アミノ酸に相当するｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０を得た。
【０１８７】
続いて、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ１１ポリペプチドに相当するｃＤＮＡ（配列番号３９）を含む７００ｂｐのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１８８】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号４１）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号４２）
【０１８９】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＥｃｏＲIおよびＮｏｔIで消化した後、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０のＥｃｏＲI／ＮｏｔIサイトに挿入し、Ｎ２８ポリペプチドのＣ末端側２０アミノ酸に相当するｃＤＮＡに代えてＮ１１ポリペプチドに相当するｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ１１を得た。
【０１９０】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入およびインフルエンザウイルス接種
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を２群に分け、コントロール群およびＮ１１群とした。実施例９（２）に記載の方法により、コントロール群には京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰを、Ｎ１１群には本実施例（１）で調製したｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ１１をそれぞれ導入した。その後、実施例１０（２）［２−２］に記載の方法によりコントロール群およびＮ１１群にＰＲ８ウイルスを接種した。
【０１９１】
（３）免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（２）のコントロール群およびＮ１１群について、実施例１０（２）［２−３］に記載の方法により、免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察を行った。ただし、蛍光強度を測定した細胞数は１２０個に代えて９０個とした。その結果を図２２上図および下図に示す。
【０１９２】
図２２上図および下図に示すように、Ｎ１１群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。一方、コントロール群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞が同程度に存在していた。
【０１９３】
以上より、Ｎ１１ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。
【０１９４】
＜実施例１２＞クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した細胞におけるウイルス感染率の確認
実施例３および実施例４においてクラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制することが確認された、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性阻害剤であるＬＹ２９４００２およびクラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制することが知られているモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、第２２９１−２２９５頁、１９８２年； Ｒａｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第３７８巻、第２３５−２３９頁、１９９６年）を添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【０１９５】
（１）各試薬による前処理
１２ウェルプレートでＭＥＭ培地を用いて培養したＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を５群に分け、コントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群、ＬＹ＋ＭＤＣ群およびオセルタミビル群とした。続いて、各群の培地に下記の試薬を添加して３０分間培養することにより、前処理を行った。濃度は培地中の濃度を示す。
【０１９６】
コントロール群 ；無添加
ＬＹ２９４００２群；ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
ＭＤＣ群 ；モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
ＬＹ＋ＭＤＣ群 ；ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
オセルタミビル群 ；オセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社） １００μｍｏｌ／Ｌ
【０１９７】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのインフルエンザウイルス接種およびプラークアッセイによるウイルス感染率の確認
実施例１０（１）［１−２］に記載の方法により、本実施例（１）の各群にＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＭＯＩ=２に代えてＭＯＩ=１とし、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地には、本実施例（１）の前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加した。また、ウイルス接種後の培養時間は５時間に代えて２日間とした。その後、実施例６（４）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた。その結果を図２３に示す。
【０１９８】
図２３に示すように、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群、ＬＹ＋ＭＤＣ群およびオセルタミビル群のウイルス感染率は、コントロール群と比較してそれぞれ約１／５、約１、約１／１００および約１／１０であった。
【０１９９】
以上より、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制すると、インフルエンザウイルスの感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
【０２００】
＜実施例１３＞クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した細胞におけるウイルス核タンパク質の存在（局在）箇所の確認
【０２０１】
初期エンドソームマーカータンパク質、後期エンドソームマーカータンパク質、クラスリン軽鎖タンパク質およびウイルス核タンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、ＬＹ２９４００２およびＭＤＣを添加してインフルエンザウイルスを接種した細胞において、これらのタンパク質が存在する箇所を調べた。
【０２０２】
（１）ベクターの調製
初期エンドソームに存在（局在）することが知られているＲａｂ５タンパク質（配列番号４４）のｃＤＮＡ（配列番号４３）が挿入されたベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ５、および後期エンドソームに存在（局在）することが知られているＲａｂ７タンパク質（配列番号４６）のｃＤＮＡ（配列番号４５）が挿入されたベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７は東京大学の坪井貴司氏から供与された。また、クラスリン軽鎖（ＣＬＣａ）タンパク質（配列番号４８）のｃＤＮＡ（配列番号４７）は東京大学の河岡義裕氏から供与された。ＣＬＣａのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、５’端および３’端にそれぞれＸｈｏIおよびＮｏｔIサイトが付加されたＣＬＣａのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０２０３】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号４９）
リバースプライマー；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧ−３’（配列番号５０）
【０２０４】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＶｅｎｕｓのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａを得た。このベクターの制限酵素地図を図２４に示す。
【０２０５】
続いて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ５およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｒａｂ５タンパク質およびＲａｂ７タンパク質のそれぞれのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０２０６】
Ｒａｂ５の増幅に用いたプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号５１）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号５２）
Ｒａｂ７の増幅に用いたプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号５３）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号５４）
【０２０７】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにそれぞれ挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ５およびｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７を得た。
【０２０８】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
実施例９（２）に記載の方法により、本実施例（１）のｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ５、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７およびｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａをＣｏｓ１細胞群（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）に導入した。
【０２０９】
（３）各試薬による前処理
本実施例（２）のＣｏｓ１細胞群を４群に分け、コントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群およびＬＹ＋ＭＤＣ群とした。続いて、これらの各群に、実施例１２（１）に記載の方法により各試薬による前処理を行った。
【０２１０】
（４）Ｃｏｓ１細胞群へのインフルエンザウイルス接種
実施例１０（１）［１−２］に記載の方法により、本実施例（３）の各群にＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＭＯＩ=２に代えてＭＯＩ=１００とし、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地には、本実施例（３）の前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加した。またウイルス接種後の培養は行わなかった。
【０２１１】
（５）免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（４）の各群について、実施例１０（２）［２−３］に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、二次抗体の希釈倍率は３００倍に代えて２５０倍とした。その後、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行い、Ｒａｂ５タンパク質、Ｒａｂ７タンパク質、ＣＬＣａタンパク質およびインフルエンザウイルスのウイルス核タンパク質をそれぞれＥＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図２５の左図に示す。また、各群の１０個の細胞について、下記の蛍光を示す顆粒の数をそれぞれ数え、ｂ／ａおよびｃ／ａの１細胞あたりの割合をそれぞれ求めた。その結果を図２５の右図に示す。
【０２１２】
ａ；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒
ｂ；ＥＣＦＰの蛍光（青色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒
ｃ；Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒
【０２１３】
図２５の左図および右図に示すように、ＬＹ２９４００２群では、コントロール群と比較してｂ／ａが低下した一方で、ｃ／ａは同様の割合であり、ＭＤＣ群では、コントロール群と比較してｂ／ａがやや低下した一方で、ｃ／ａは顕著に低下した。これに対し、ＬＹ＋ＭＤＣ群では、コントロール群と比較してｂ／ａおよびｃ／ａのいずれも顕著に低下した。
【０２１４】
以上より、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制した場合はクラスリン依存性エンドサイトーシスによりインフルエンザウイルスが細胞内に取り込まれ、クラスリン依存性エンドサイトーシスのみを抑制した場合はクラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりインフルエンザウイルスが細胞内に取り込まれることが明らかになった。これに対し、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した場合は、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが顕著に抑制されることが明らかになった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染抑制剤に関し、特に、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤、およびエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスとは、細胞を構成単位とせずにＤＮＡかＲＮＡのいずれかをゲノムとして有し、宿主細胞内だけで増殖する微小構造体であり、宿主細胞内の代謝系を利用して増殖する。その際、病原体としてふるまうことがあり、ウイルスが増殖した結果として宿主に惹起される疾病をウイルス感染症という。ウイルス感染症には、例えば、ライノウイルスによる感冒、インフルエンザウイルスによるインフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルスによる後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＡＩＤＳ）、単純ヘルペスウイルスによる単純ヘルペス、腫瘍ウイルスによる癌など、さまざまなものがある。
【０００３】
ウイルスの増殖は、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、III「脱殻」、IV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」、V「ウイルス部品の集合」、VI「細胞からの放出」の、I〜VIのステップを経てなされる。従って、従来より、これらのステップを攻撃対象として、種々のウイルス感染症の治療剤やウイルス感染予防・阻害剤の研究開発がされている。
【０００４】
例えば、ウイルス感染予防・阻害剤やウイルス感染症治療剤として代表的であるワクチンは、弱毒化または不活化したウイルスを宿主に取り込ませて免疫を獲得させ、これを利用することで、前記ステップのうち、I「細胞表面への吸着」、II「細胞内への侵入」、あるいはVI「細胞からの放出」ステップを対象としている。また、特開２００８−２５３１８８号公報に開示されているＤＮａｓｅＸタンパク質は、ウイルス遺伝子の宿主への取り込みを抑制することで、特開２００７−１６０４４号公報に開示されているペプチドは、レトロウイルスのインテグラーゼを阻害することで、それぞれIV「ウイルスゲノムやウイルスタンパク質などのウイルス部品の合成」ステップを攻撃する（特許文献１および特許文献２）。
【０００５】
一方、インフルエンザは、代表的なウイルス感染症として知られている。インフルエンザの治療剤、インフルエンザウイルス感染予防・阻害剤としては、例えば、インフルエンザ表面に存在する酵素ノイラミニダーゼの働きを阻害することによりVI「細胞からの放出」ステップを攻撃するオセルタミビル（商品名タミフル；ロシュ社）やザナミビル（商品名リレンザ；グラクソ・スミスクライン社）の他、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質を阻害することによりIII「脱殻」ステップを攻撃するアマンタジン（商品名シンメトレル；ノバルティスファーマ社）を挙げることができる。また、国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレットには、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに親和性の高いペプチドが開示されており、I「細胞表面への吸着」およびII「細胞内への侵入」ステップを対象としている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２５３１８８号公報
【特許文献２】特開２００７−１６０４４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００７／１０５５６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されたウイルス感染予防・阻害剤は、外来遺伝子の分解を促進することが示されているものの、実際のウイルス感染を阻害するか否かは確かめられておらず、ウイルス感染阻害効果は不明である。また、ワクチン、レトロウイルス感染阻害剤（特許文献２）、オセルタミビル、ザナミビル、アマンタジン、インフルエンザ予防・治療剤（特許文献３）は、いずれもウイルス本体に由来するタンパク質を標的としているため、亜型への効果が期待できず、また、変異体の出現により耐性獲得が生じやすいという問題点を抱えている。例えば、現在日本で使用されている季節性インフルエンザに対するワクチンは、先行するオーストラリアでの流行株の情報に基づき、日本で流行すると予想された株に対するワクチンが作製されるため、毎年不安定であるうえ、この予測が外れた場合や変異体が生じた場合には、対応が困難となる。
【０００８】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなくウイルスの感染を抑制することができる、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤、およびエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスのウイルス感染抑制剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主細胞側の因子であるｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とが複合体を形成し、エンドソーム上に存在することで、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによってウイルスが感染すること、および、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質との複合体の形成を阻害することにより、あるいはこれらが形成する複合体がエンドソーム上に存在することを抑制することにより、あるいはまたＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制することにより、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制できることを見出し、さらに、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスとクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）とを抑制することにより、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制できることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは下記の各発明を完成した。
【００１０】
（１）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質に結合可能なｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）と対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法。
【００１１】
（２）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１）に記載の方法。
【００１２】
（３）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１）または（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）蛍光共鳴エネルギー移動を観測する方法を用いる、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程と、前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程とを有する、前記方法；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド。
【００１５】
（６）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（５）に記載の方法。
【００１６】
（７）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（５）または（６）に記載の方法。
【００１７】
（８）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００１８】
（９）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（８）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００１９】
（１０）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、（８）または（９）に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００２０】
（１１）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（８）から（１０）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２１】
（１２）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【００２２】
（１３）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１２）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２３】
（１４）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１２）または（１３）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２４】
（１５）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００２５】
（１６）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１５）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２６】
（１７）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１５）または（１６）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【００２７】
（１８）エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【００２８】
（１９）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、（１８）に記載のウイルス感染抑制剤。
【００２９】
（２０）クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質が、下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上の物質および／またはポリペプチドである、（１８）に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｖｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質。
【００３０】
（２１）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項２０に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００３１】
（２２）ウイルスがインフルエンザウイルスである、（１８）から（２１）のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【発明の効果】
【００３２】
本発明に係る方法によれば、亜型や変異体の出現などのウイルス側の変化に影響されることなく、広範囲のウイルス株に対して長期的に感染を抑制することができる物質をスクリーニングすることができる。また、本発明に係るウイルス感染抑制剤によれば、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスおよび／またはエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】エンドサイトーシスの経路を説明する図である。
【図２】蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を用いてＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤとの結合を確認する場合の模式図である。
【図３】ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６１７０ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図４】ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６７９１ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図５ａ】Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの複合体、およびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により観察し、ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＥＡ１）の細胞内における存在箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である。
【図５ｂ】ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、１細胞における緑、赤および黄の各色の顆粒数の平均値を示すグラフである。
【図６】ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、ＥＧＦを添加しない場合およびＥＧＦを添加した場合の、１細胞における「黄色の顆粒数／赤色の顆粒数」の平均値を示すグラフである。
【図７】ｐＩＲＭ２１−３ＨＡ（８０６９ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図８ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をデキストランの取り込み量に換算して表したグラフである。
【図８ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度をトランスフェリンの取り込み量に換算して表したグラフである。
【図９ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群について、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒをそれぞれ用いて導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現が見られる細胞数の割合を示す図である。
【図９ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群について、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、レンチウイルスＨＩＶおよびレトロウイルスＭＳＣＶをそれぞれ用いて導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現が見られる細胞数の割合を示す図である。
【図１０】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質およびＫ２５１Ｅタンパク質の細胞内における存在箇所をそれぞれＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察し、Ｈ−Ｒａｓタンパク質の細胞内における存在箇所をＥＧＦＰの蛍光（緑色）により観察し、ＥＥＡ１の細胞内における存在箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である。
【図１１ａ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群に、ＰＲ８ウイルスを接種した場合のウイルス感染率を示す図である。図中、右側のシャーレの写真はプラークアッセイを行って出現したプラークを示す。
【図１１ｂ】野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群にＡｉｃｈｉウイルスを接種した場合のウイルス感染率を示す図である。
【図１２ａ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、近隣結合法により作成した系統樹を示す図である。
【図１２ｂ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗにより作成したアラインメントを示す図である。図中、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤに特徴的なＮ末端側の２８アミノ酸を囲んで示す。
【図１２ｃ】ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、アラインメント作成結果に基づき、配列の保存性について視覚的に表現した図である。
【図１３】Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所を、ＥＧＦ刺激前後について、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により観察した結果を示す図である。
【図１４】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ（５９１８ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１５】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８（５６７５ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１６】ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ（５２６１ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１７】ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８（５０８３ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図１８】Ｎ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、デキストランを取り込ませたＭＤＣＫ細胞において、デキストランをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）により観察し、Ｎ２８ポリペプチドの発現をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察した結果を示す図である（上図）。また、２４個のＭＤＣＫ細胞について、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（下図）。
【図１９】Ｎ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞において、Ｎ２８ポリペプチドの発現をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により観察し、ＰＲ８ウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）により観察した結果を示す図である。
【図２０】ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（６１７０ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図２１】ＥＣＦＰで標識したＮ２８ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（Ｎ２８群）およびＥＣＦＰのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）において、導入したｃＤＮＡの発現をＥＣＦＰの蛍光（青色）により観察し、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である（左図）。また、各群の１２０個のＭＤＣＫ細胞について、ＥＣＦＰの蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（右図）。
【図２２】ＥＣＦＰで標識したＮ１１ポリペプチドのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（Ｎ１１群）およびＥＣＦＰのｃＤＮＡが挿入されたベクターを導入した後、ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）において、導入したｃＤＮＡの発現をＥＣＦＰの蛍光（青色）により観察し、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により観察した結果を示す図である（上図）。また、各群の９０個のＭＤＣＫ細胞について、ＥＣＦＰの蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度をそれぞれ測定した結果を示すグラフである（下図）。
【図２３】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＭＤＣ群）、ＬＹ２９４００２とＭＤＣとを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ＋ＭＤＣ群）、およびオセルタミビルを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（オセルタミビル群）の、それぞれのウイルス感染率を示すグラフである。
【図２４】ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａ（６２４５ｂｐ）の制限酵素地図である。
【図２５】ＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（コントロール群）、ＬＹ２９４００２を添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ２９４００２群）、ＭＤＣを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＭＤＣ群）およびＬＹ２９４００２とＭＤＣとを添加してＰＲ８ウイルスを接種したＭＤＣＫ細胞群（ＬＹ＋ＭＤＣ群）における、ＰＲ８ウイルスのウイルス核タンパク質をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により、Ｒａｂ５タンパク質をＥＣＦＰの蛍光（青色）により、Ｒａｂ７タンパク質をＥＣＦＰの蛍光（青色）により、ＣＬＣａタンパク質をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）によりそれぞれ検出した結果を示す図（左図）および各群における「ＥＣＦＰの蛍光（青色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒数／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒数（ｂ／ａ）」と「Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒数／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒数（ｃ／ａ）」を示すグラフ（右図）である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染抑制剤について詳細に説明する。本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域であるＲＢＤと対象物質とを共存させる工程（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程）、
（ｉｉ）対象物質がＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）、
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００３５】
すなわち、前記ウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合することにより、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づいており、その複合体の形成を阻害する物質、すなわち前記ウイルスの感染を抑制する物質をスクリーニングする方法である。
【００３６】
エンドサイトーシスとは、一般に、細胞が外界からの物質を細胞膜の小胞化と融合により内部に取り込む方式の総称である。エンドサイトーシスは、取り込む物質の種類や大きさ、関与する細胞装置の違いにより、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などに分類されている（図１；Ｍａｒｓｈら、Ｃｅｌｌ、第１３４巻、第７２９頁、２００９年）。
【００３７】
また、エンドサイトーシスは、細胞膜に存在する受容体タンパク質への刺激により生じるか否かにより、受容体依存性エンドサイトーシスおよび受容体非依存性エンドサイトーシスにも分類可能である。この場合、前者には前記の分類でいうクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やカベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）などに相当するエンドサイトーシスが含まれ、後者には前記の分類でいうクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）に相当する、食作用（ファゴサイトーシス）や飲作用（ピノサイトーシス）などが含まれる。
【００３８】
すなわち、本発明において「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルスが包含される。
【００３９】
対象となる、エンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン−ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ヘルペスウイルス、エボラウイルス、ポリオウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｂ（ＣＶＢ）、イネ萎縮ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを挙げることができる。
【００４０】
また、本発明において「クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって専ら感染するウイルスを除いた、エンドサイトーシスによって感染可能な（感染性を有する）ウイルス、すなわちクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルスが包含される。
【００４１】
また、対象となる、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスとしては、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルス、ダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能な（感染性を有する）ウイルスを挙げることができる。好ましくは、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により感染可能なウイルスを挙げることができ、そのようなウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、コロナウイルス、シミアン−ウイルス４０、ワクシニアウイルス、ニューカッスル病ウイルスなどを挙げることができる。
【００４２】
ウイルスが細胞内へ侵入する際、一般的に、エンベロープを持つウイルスは膜融合を利用し、アデノウイルスなどのエンベロープを持たないウイルスはエンドサイトーシスを利用する場合が多いが、エンベロープを持つウイルスのうち、インフルエンザウイルスなどは、エンドサイトーシスにより感染可能であることが知られている。すなわち、本発明における「エンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」または「クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルス」には、膜融合により感染可能な（感染性を有する）ウイルスであっても、それぞれ、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスまたはクラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能な（感染性を有する）ウイルスであれば包含される。
【００４３】
本発明において、感染を抑制するか否かは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年や、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第３巻、第３０１頁、２００１年、あるいはＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年などに従い、感染率を算出することにより評価することができる他、例えば、ウイルス株の感染価を指標として評価することができる。感染価とは、一般的に感染性の微生物を含む検体を培養細胞に等量ずつ接種した時、感染率５０％を与えるようなその検体の量をいい、「ＴＣＩＤ５０（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）」で表される。
【００４４】
なお、本発明において「感染を抑制する」は、「感染を予防する」、「感染を阻止する」、「感染を阻害する」と交換可能に用いられる。また、「活性を抑制する」という場合は、「活性を阻害する」と交換可能に用いられる。
【００４５】
工程（ｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程）における、ＰＩ３Ｋタンパク質に結合可能なＲａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを共存させる方法は、当業者によって適宜選択可能な方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、Ｒａｓタンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質との溶液を調製することにより共存させる方法や、Ｒａｓタンパク質を固定した担体を、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質とを含む溶液に浸漬することにより共存させる方法などを挙げることができる。また、Ｒａｓタンパク質、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲＢＤと対象物質は、必要に応じて、担体に結合させ、あるいは標識物質で標識することができる。そのような担体としては、例えば、マイクロプレートなどのプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、多孔性シリカ系担体などの不溶性担体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの可溶性タンパク質担体をはじめとする生物学的担体などを挙げることができ、担体への結合は、その種類に応じて、当業者が適宜選択可能な方法を用いることができる。また、使用可能な標識物質としては、例えば、着色粒子、酵素、蛍光物質、アイソトープなどを挙げることができる。
【００４６】
工程（ｉｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）における、「Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの『結合』」とは、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとが、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合により非共有的に結合することをいう。
【００４７】
工程（ｉｉ）（Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程）における、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合を確認する方法は、当業者によって適宜選択可能な方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、共免疫沈降法、カラムまたはビーズを用いたプルダウン法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）、ＢＩＡＣＯＲＥ、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を用いた方法などのインビトロアッセイを挙げることができる。
【００４８】
ＦＲＥＴとは、近接した２個の蛍光物質の間で、励起エネルギーが電磁波ではなく電子の共鳴により直接移動する現象であり、一方の分子（供与体）で吸収された光のエネルギーによって他方の分子（受容体）から蛍光が放射される現象をいう。すなわち、２個の蛍光物質が近接している場合は、供与体の吸収スペクトルに相当する光で励起すると、供与体ではなく受容体の発光スペクトルに従う蛍光が現れる。
【００４９】
Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合を確認する方法としてＦＲＥＴを用いる場合、例えば、図２上段に示すように、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤに、それぞれ二つの異なる蛍光タンパク質をつなぎ、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの結合により観察されるＦＲＥＴの蛍光が、対象物質を共存させた場合に減ずるか否かを確認することにより行うことができる。また、図２下段に示すように、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤをつなげて一つのポリペプチドとし、それぞれのドメインに二つの異なる蛍光タンパク質をつないでもよい。この場合は、Ｒａｓタンパク質ドメインとＰＩ３Ｋタンパク質ドメインまたはＲＢＤドメインとの結合により観察されるＦＲＥＴの蛍光が、対象物質を共存させた場合に減ずるか否かを確認すればよい。なお、本発明におけるＦＲＥＴで用いることができる蛍光タンパク質として、青緑色蛍光タンパク質（ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）を挙げることができる。
【００５０】
また、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法の異なる態様は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）下記（ａ）〜（ｄ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程（ポリペプチド共存工程）、
（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体ＰＩ３Ｋタンパク質をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体ＰＩ３Ｋタンパク質をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド
（ｉｉ）前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程（ポリペプチド結合能評価工程）
以上（ｉ）および（ｉｉ）の工程を有する。
【００５１】
すなわち、前記異なる態様に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合し、ＲＢＤのアミノ（Ｎ）末端ポリペプチドによって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づいており、前記（ａ）〜（ｄ）から選択される１または２以上のポリペプチドと結合可能であって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することを阻害する物質、すなわち前記ウイルスの感染を抑制する物質をスクリーニングする方法である。
【００５２】
ここで、本発明においてポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合により結合してなる化合物のことをいい、構成するアミノ酸数は特に限定されず、例えば、２アミノ酸からなるジペプチド、３アミノ酸からなるトリペプチド、４アミノ酸からなるテトラペプチド、１０程度のアミノ酸からなるオリゴペプチド、２０以上のアミノ酸からなるペプチドやタンパク質が包含される。
【００５３】
また、本発明において、「１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」というときの、欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の個数は、配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制する限り、配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、Ｒａｓタンパク質に結合する限り特に限定されないが、例えば１〜２７個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個の任意の個数を挙げることができる。なお、同一あるいは性質の似たアミノ酸配列に相当するのであれば、さらに多くのアミノ酸が置換、挿入、および／または付加されてもよい。
【００５４】
すなわち、配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤのＮ末端側１〜２８番目のアミノ酸から構成されるポリペプチドであるＮ２８ポリペプチドまたはＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤのＮ末端側９〜１９番目のアミノ酸から構成されるポリペプチドであるＮ１１ポリペプチドと、それぞれ高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチドが含まれる。また、配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列については、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、またはＮ１１ポリペプチドを欠くＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤと、それぞれ高い同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質に結合するポリペプチドが含まれる。また、ここにいう「高い同一性」とは、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００５５】
本発明に係る配列番号２８または配列番号４０（配列番号３９）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させ、ＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成しない場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含され、また、本発明に係る配列番号１３、配列番号３０または配列番号５６（配列番号５５）において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドには、Ｒａｓタンパク質に結合する機能を有する限り、これらアミノ酸配列の１または複数の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるペプチドが包含される。
【００５６】
本発明において、保存的アミノ酸置換とは、生じる分子の生理学的活性を変化させることなく一般的になされ得る範囲、すなわち保存的置換の範囲で認められるもの（Ｗａｔｓｏｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅなど）であり、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファンの非極性アミノ酸；グリシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンの極性無電荷側鎖アミノ酸；フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンの芳香族アミノ酸といった側鎖に類似性のあるアミノ酸同士（アミノ酸のファミリー内部）で起こる置換を挙げることができる。同様に、アスパラギン酸およびグルタミン酸の酸性アミノ酸；リシン、アルギニンおよびヒスチジンの塩基性アミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンおよびトレオニンの脂肪族アミノ酸（セリンおよびトレオニンの脂肪族−ヒドロキシアミノ酸と分類することもできる）；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンの芳香族アミノ酸；アスパラギンおよびグルタミンのアミド）；システインおよびメチオニンの含硫アミノ酸といった分類をすることができる。
【００５７】
本発明に係るポリペプチドがＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成する場合、ＰＩ３Ｋタンパク質のアミノ酸配列において本発明に係るポリペプチドが構成する部位は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤ、ＲＢＤ以外の部位のいずれでもよいが、ＲＢＤが好ましく、ＲＢＤのＮ末端付近がより好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて１〜２８番目で構成されるポリペプチドがさらに好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて５〜２４番目で構成されるがよりさらに好ましく、ＲＢＤのＮ末端から数えて９〜１９番目が最も好ましい。
【００５８】
工程（ｉ）（ポリペプチド共存工程）における、前記（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドと対象物質とを共存させる方法としては、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ共存工程における方法と同様の方法を挙げることができる。
【００５９】
工程（ｉｉ）（ポリペプチド結合能評価工程）における、「前記ポリペプチドと対象物質との結合」とは、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程における「Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質またはＲＢＤとの『結合』」と同様、前記ポリペプチドと対象物質とが、水素結合、イオン結合、疎水結合、ファンデルワールス結合により非共有的に結合することをいい、前記ポリペプチドと対象物質との結合を確認する方法としては、前記Ｒａｓ−ＰＩ３Ｋ／ＲＢＤ結合阻害能評価工程における方法と同様の方法を挙げることができる。
【００６０】
なお、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法には、その特徴を損なわない限りにおいて、他の工程を有してもよく、例えば、インキュベート工程や洗浄工程などを有してもよい。
【００６１】
本発明に係るウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする。
【００６２】
すなわち、前記ウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合することにより、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づき、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とするアンタゴニストである。
【００６３】
ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との結合を阻害する物質としては、下記（ｅ）から（ｊ）のポリペプチドの他、本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法によってスクリーニングされた物質を挙げることができる；
（ｅ）ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｆ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド
（ｇ）Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｈ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、（ｉ）Ｎ１１ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤと同一のポリペプチドである配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｊ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【００６４】
前記（ｅ）から（ｊ）のポリペプチドを有効成分とする場合、これらがＰＩ３Ｋタンパク質と拮抗してＲａｓタンパク質と結合することにより、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質との複合体の形成を阻害することができる。
【００６５】
本発明に係る異なる第二の態様のウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｋ）〜（ｎ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする；
（ｋ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｌ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド
（ｍ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｎ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【００６６】
すなわち、前記異なる第二の態様に係るウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質のＲＢＤとこれに結合可能なＲａｓタンパク質とが結合し、ＲＢＤのＮ末端ポリペプチドによって、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）することとなり、その結果、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりウイルスが感染するという知見に基づき、ＲＢＤのＮ末端ポリペプチドと同一のポリペプチドである前記（ｋ）および／または前記（ｍ）、もしくは前記（ｋ）および・または前記（ｍ）とそれぞれ高い相同性を有する前記（ｌ）および／または前記（ｎ）の各ポリペプチドから選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とするものであり、これらのポリペプチドは、前記複合体がエンドソーム上に存在（局在）するのを抑制する。
【００６７】
また、これらのポリペプチドは、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在（局在）するのを抑制する限り、細胞内への移行を促進することが知られているポリリジン等の配列が付加されていてもよい。
【００６８】
本発明におけるポリペプチドは、その配列を基にして、当業者によって適宜選択可能な方法を用いて合成することができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成するペプチド合成法の他、本発明におけるポリペプチドに相当するｃＤＮＡが挿入された組換えベクターを作製し、作製したベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地にて培養し、得られた培養物から採取する方法や、本発明におけるポリペプチドに相当するｃＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させて得る方法などを挙げることができる。
【００６９】
本発明に係る異なる第三の態様のウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする。
【００７０】
すなわち、前記異なる第三の態様に係るウイルス感染抑制剤は、ＰＩ３Ｋタンパク質とＲａｓタンパク質とが複合体を形成している場合であっても、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制することにより、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスが阻害されるという知見に基づき、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分としている。
【００７１】
ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質としては、例えば、ＬＹ２９４００２［２−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）−８−ｐｈｅｎｙｌ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ］、Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ、ＺＳＴＫ４７４［２−（２−ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−１−ｙｌ）−４，６−ｄｉｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−１，３，５−ｔｒｉａｚｉｎｅ］（Ｙａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．第９８巻、第５４５−５５６頁、２００６年）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ［３，３’，４’，５，７−Ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ］（Ｗ．Ｆ．Ｍａｔｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１８６巻、第６２４−６３１頁、１９９２年）などのＰＩ３Ｋ阻害剤を挙げることができる。なお、本実施例においては、好適なＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質として、ＬＹ２９４００２を用いている。
【００７２】
本発明に係る異なる第四の態様のウイルス感染抑制剤は、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする。
【００７３】
すなわち、前記異なる第四の態様に係るウイルス感染抑制剤は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスとクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）とを抑制することにより、エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染が顕著に抑制されるという知見に基づき、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分としている。
【００７４】
本発明において、エンドサイトーシスを抑制するとは、エンドサイトーシスの一連の過程のうちの１または２以上のステップを抑制することをいう。エンドサイトーシスには、外界からの物質を内部に含む小胞の形成、小胞とライソゾームやゴルジ体、カベオソーム、小胞体などの細胞小器官との融合、あるいは外界からの物質の消化・分解の一連の過程があり、この過程には、例えば、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）であれば、リガンドの受容体への結合、細胞膜の陥入、リガンドの初期エンドソームへの取り込み、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟、後期エンドソームとリソソームとの合体、後期エンドソームとゴルジ体からの小胞との合体などのステップがあり、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）やマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）であれば、それぞれ細胞膜の陥入や葉状仮足からのマクロピノソームの形成、リガンドの初期エンドソームへの取り込み、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟、後期エンドソームとリソソームとの合体、後期エンドソームとゴルジ体からの小胞との合体などのステップがある。
【００７５】
本発明に係るエンドサイトーシスを抑制する物質は、エンドサイトーシスの一連の過程に含まれるステップうち１または２以上のステップを抑制することにより、エンドサイトーシスを抑制する物質である。
【００７６】
本発明において、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質は、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうち、いずれか一つの経路、例えば、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、マクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、コレステロール依存性エンドサイトーシス（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみ、またはダイナミン−２依存性エンドサイトーシス（Ｄｙｎａｍｉｎ−２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）のみを抑制するものでもよく、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうちの２以上の経路を抑制するものでもよいが、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質が好ましい。
【００７７】
本発明において、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質としては、例えば、サイトカラシンＢ、５−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｒｏｌｉｄｅ（ＥＩＰＡ）、アミロリドなどを挙げることができる他、本発明に係るクラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤を用いることができる。
【００７８】
本発明において、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質としては、例えば、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）、ショ糖、クロロプロマジン（ＣＰＺ）、メチル−β−Ｃｙｄなどを挙げることができる。なお、本実施例においては、好適なクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質として、ＭＤＣを用いている。
【００７９】
本発明に係るウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法により得られるウイルスの感染を抑制する物質やウイルス感染抑制剤の製剤化には、当業者に公知の方法を用いることができる。投与形態もまた、当業者によって適宜選択することができる投与形態でよく、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合の、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合の、吸入剤、注射剤、点滴剤、座薬、塗布剤、噴霧剤、貼付剤などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。
【００８０】
以下、本発明に係るウイルスの感染を阻害する物質のスクリーニング方法およびウイルス感染阻害剤について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００８１】
＜実施例１＞Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の確認
Ｈ−ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｈ−Ｒａｓ）タンパク質とＰｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）触媒サブユニットγ（ＣＧ）タンパク質のＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）との複合体を、Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ（ＢｉＦＣ）法により可視化し、また、初期エンドソームマーカーであるｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ １（ＥＥＡ１）タンパク質を免疫抗体染色により可視化して、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所を確認した。Ｈ−Ｒａｓは、活性化型変異Ｈ−ＲａｓであるＨ−ＲａｓＧ１２Ｖを用いた。Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（配列番号３）は、Ｈ−Ｒａｓ（配列番号１）の３５番目のグアニンをチミンに、３６番目のシトシンをアデニンに置換したものであり、それ故、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質（配列番号４）は、Ｈ−Ｒａｓタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）の１２番目であるグリシンがバリンに置換されており、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質は、ＧＴＰ結合型である活性化Ｈ−Ｒａｓタンパク質の状態を恒常的に維持している（Ｌｏｗｙ Ｄ．Ｒ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６２巻、第８５１−８９１頁、１９９３年）。また、Ｈ−Ｒａｓタンパク質と、生体内においてＲａｓタンパク質に結合することが知られている因子であるｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質の、それぞれのＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所も同時に確認し、Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所と比較した。
【００８２】
（１）ベクターの調製
以下、ＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにＨ−ＲａｓＧ１２Ｖが挿入され、かつＥｃｏＲI／ＸｈｏIサイトに強化緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）のｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは、京都大学の松田道行氏から供与されたものを用いた。このベクターの制限酵素地図を図３に示す。また、ＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにＨ−ＲａｓＧ１２Ｖが挿入されたベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは、京都大学の松田道行氏から供与されたものを用いた。このベクターの制限酵素地図を図４に示す。さらに、蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓタンパク質のｃＤＮＡ（Ｖｅｎｕｓ；配列番号５）は、理化学研究所の宮脇敦史氏から供与されたものを用いた。
【００８３】
Ｖｅｎｕｓを鋳型として、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社）を用いてＰＣＲを行い、Ｖｅｎｕｓの１〜５１６番目（ＶＮ配列；配列番号６）および５１７〜７１４番目（ＶＣ配列；配列番号７）を、それぞれ増幅して単離した。ＰＣＲに用いたプライマー、ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
【００８４】
ＶＮ配列の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号８）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡ−３’（配列番号９）
ＶＣ配列の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号１１）
ＰＣＲ反応溶液組成；ｄＮＴＰ ２００μｍｏｌ／Ｌ、フォワードプライマー ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、リバースプライマー ３００ｎｍｏｌ／Ｌ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇ、ＭｇＣｌ２ １．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１×Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ ５２Ｕ／ｍＬ
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【００８５】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。ＶＮ配列のＰＣＲ産物は、制限酵素ＥｃｏＲIおよびＸｈｏIで消化した後、前記ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＥｃｏＲI／ＸｈｏIサイトに、ＥＧＦＰのｃＤＮＡに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖを得た。また、ＶＣ配列のＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔIおよびＢｇｌIIで消化した後、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＮｏｔI／ＢｇｌIIサイトに挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣを得た。
【００８６】
続いて、Ｔｈｅ Ｂａｂｒａｈａｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ．Ｓｔｅｐｈｅｎ氏から供与されたＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤ（配列番号１３）のｃＤＮＡ（配列番号１２）、北里大学の服部成介氏から供与されたｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤ（配列番号１５）のｃＤＮＡ（配列番号１４）および内皮細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離したＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤ（配列番号１７）のｃＤＮＡ（配列番号１６）を、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖに代えてそれぞれ挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１−ＲＢＤ−ＶＣおよびｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ＶＣの各ベクターを得た。
【００８７】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
アフリカミドリザル腎由来のＣｏｓ１細胞群（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を３群に分け、ＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群とした。ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、各群に本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入した。その組み合わせは次のとおりである。
【００８８】
導入したベクターの組み合わせ
ＰＩ３ＫＣＧ群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ
ｃ−Ｒａｆ１群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆ１−ＲＢＤ−ＶＣ
ＲａｌＧＤＳ群；ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ−ＶＣ
【００８９】
その後、胎児牛血清（ＦＢＳ；Ｃａｎｓｅｒａ社）を１０％（ｖ／ｖ）含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地；シグマ社）で、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２４時間培養した。
【００９０】
（３）免疫蛍光染色
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群を、パラホルムアルデヒドを３％含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて室温で１５分間固定した後、ＰＢＳで洗浄した。続いて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．１％含むＰＢＳを用いて室温で４分間透過処理した後、ＰＢＳで洗浄した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１％含むＰＢＳを用いて室温にて３０分間ブロッキングを行った後、ＰＢＳにＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびＢＳＡをそれぞれ０．０５％および０．１％となるよう添加して調製したＰＢＴで洗浄した。続いて、抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）をＰＢＳで１０００倍希釈した溶液に４℃にて一晩曝して、一次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。次に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）をＰＢＳで２００倍希釈した溶液に室温にて１時間曝して、二次抗体による抗原抗体反応を行った後、ＰＢＳで洗浄した。
【００９１】
（４）蛍光顕微鏡による観察
本実施例（３）のＰＩ３ＫＣＧ群、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群について、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を、共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ‐１０００（オリンパス社）を用いて、既報に従い観察した｛Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２２巻、第４号、第８５９−８６９頁、２００３年｝。すなわち、ＰＩ３ＫＣＧ群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの、ｃ−Ｒａｆ１群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの、ＲａｌＧＤＳ群においてはＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの、それぞれの複合体をＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）により検出し、ＥＥＡ１をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図５ａに示す。また、画像処理ソフトウェアＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、各群の１０個から２０個の細胞について、１細胞毎に、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光を示す顆粒（緑色の顆粒）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光を示す顆粒（赤色の顆粒）、およびＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光の重複を示す顆粒（黄色の顆粒）の数をそれぞれ数え、１細胞における各色の顆粒数の平均値と標準偏差を求めてグラフに表した。その結果を図５ｂに示す。
【００９２】
図５ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、緑色の蛍光を示す箇所と、赤色の蛍光を示す箇所の多くが重複しているため、緑色と赤色との混色による黄色の蛍光が多く見られた。一方、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、緑色の蛍光を示す箇所と、赤色の蛍光を示す箇所の重複が少ないため、緑色と赤色との混色による黄色の蛍光はほとんど見られなかった。また、図５ｂに示すように、緑色、赤色および黄色の顆粒の数をそれぞれ数えた結果も同様で、ＰＩ３ＫＣＧ群では、緑色の顆粒数および赤色の顆粒数と比較して黄色の顆粒数が多かったが、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、緑色の顆粒数および赤色の顆粒数と比較して黄色の顆粒数は少なかった。
【００９３】
以上より、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とｃ−Ｒａｆ１タンパク質のＲＢＤとの複合体およびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤとの複合体は初期エンドソームにほとんど存在しない一方で、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体は初期エンドソームに存在することが明らかになった。
【００９４】
＜実施例２＞ＥＧＦ刺激によるＨ−Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の変化の確認
上皮細胞増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）の刺激により、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体の細胞内における存在箇所が変化するか否かを確認した。
【００９５】
まず、実施例１（１）に記載の方法によりベクターを調製し、実施例１（２）に記載の方法によりＣｏｓ１細胞群にベクターを導入した後、２４時間培養した。
【００９６】
その後、各群をそれぞれさらに２つに分け、そのうち一方の培地にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるよう添加して、２０分間培養した。
【００９７】
続いて、実施例１（３）に記載の方法により免疫蛍光染色を行った。その後、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群の１０個から２０個の細胞について、黄色の顆粒数および赤色の顆粒数を数えて、１細胞における「黄色の顆粒数／赤色の顆粒数」を算出し、その平均値と標準偏差を求めた。その結果を図６に示す。
【００９８】
図６に示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、ＥＧＦを添加した場合はＥＧＦを添加しない場合と比較して、黄色の顆粒数の割合が顕著に増加した。一方、ｃ−Ｒａｆ１群およびＲａｌＧＤＳ群では、ＥＧＦを添加した場合はＥＧＦを添加しない場合と比較して、黄色の顆粒数の割合はほとんど変わらなかった。
【００９９】
以上より、ＥＧＦにより刺激をすると、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとの複合体がエンドソームに存在するようになることが明らかになった。
【０１００】
＜実施例３＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞におけるエンドサイトーシス機能の確認
主にクラスリン依存性エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが知られているトランスフェリンと、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスのうち、主にクラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが知られている分子量１００００のデキストランとを、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質を欠く細胞およびＲａｓタンパク質に結合しない変異ＰＩ３ＫＣＧタンパク質（Ｋ２５１Ｅタンパク質；配列番号１９）を発現する細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。Ｋ２５１Ｅタンパク質のｃＤＮＡ配列（Ｋ２５１Ｅ；配列番号１８）では、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のｃＤＮＡ配列（ＰＩ３ＫＣＧ；配列番号２０）の７５１番目のアデニンがグアニンに置換されており、これによりＫ２５１Ｅタンパク質ではＰＩ３ＫＣＧタンパク質（配列番号２１）のアミノ酸配列の２５１番目のリジンがグルタミン酸に置換されている。その結果、Ｋ２５１Ｅタンパク質はＲａｓタンパク質に結合しないことが確認されている｛Ｐａｃｏｌｄ Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ、第１０３巻、第６号、第９３１−９４３頁、２０００年｝。
【０１０１】
（１）野生型ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２を培地に添加して培養した野生型ＭＥＦ細胞群（ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群）の調製
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ Ｊｃｌ；日本クレア社）からマウス胎児繊維芽（Ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＭＥＦ）細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０−１０４６頁、２０００年｝、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。続いて、この細胞群を２群に分け、そのうち一方は野生型ＭＥＦ細胞群とした。残りの一方は、全てのクラスのＰＩ３Ｋタンパク質活性阻害剤であるＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を５０μｍｏｌ／Ｌとなるよう培地に添加して１時間培養し、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群とした。
【０１０２】
（２）ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ ＪｃｌバックグラウンドのＰＩＫ３ＣＧ欠損マウスからＰＩ３ＫＣＧを欠くＭＥＦ細胞群を既報に従って調製し｛Ｓａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８７巻、第５４５５号、第１０４０−１０４６頁、２０００年｝、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。
【０１０３】
（３）ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群の調製
［３−１］ベクターの調製
京都大学の松田道行氏から供与された、ヘマグルチニン（ＨＡ）のｃＤＮＡが３コピー挿入されたベクターｐＩＲＭ２１−３ＨＡの制限酵素地図を図７に示す。Ｔｈｅ Ｂａｂｒａｈａｍ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＬ．Ｓｔｅｐｈｅｎ氏から供与されたＰＩ３ＫＣＧを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＩ３ＫＣＧを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１０４】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＴＡＴＡＡ−３’（配列番号２２）
リバースプライマー ；５’−ＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＣＴＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＣＴＣ−３’（配列番号２３）
【０１０５】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、ｐＩＲＭ２１−３ＨＡのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＩＲＭ２１−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧを得た。続いて、これを制限酵素ＳａｌIおよびＮｏｔIで消化し、プロモーター領域、３ＨＡおよびＰＩＫ３ＣＧを含むＤＮＡ断片を得た後、実施例１（１）に記載の方法により調製したｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶのＳａｌI／ＮｏｔIサイトに、ＦｌａｇおよびＨ−ＲａｓＧ１２Ｖを含むＤＮＡ断片に代えて挿入し、ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩＫ３ＣＧを得た。
【０１０６】
［３−２］ ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのベクターの導入
本実施例（３）［３−１］で調製したｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧをＳｃａIで消化した後、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（２）で調製したＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞に導入した。
【０１０７】
その後、実施例１（２）に記載の環境下で２日間培養した後、培地にＧ４１８二硫酸塩（シグマ社）を０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう添加してさらに培養し、耐性細胞を得た。続いて、得られた耐性細胞について、常法に従いウェスタンブロットを行ってＰＩ３ＫＣＧタンパク質の発現の有無を確認し、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質を安定して発現している細胞を選択し、Ｇ４１８二硫酸塩（シグマ社）を０．２ｍｇ／ｍＬ含むＤＭＥＭ培地で培養した。
【０１０８】
（４）Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群の調製
［４−１］ベクターの調製
ＰＩ３ＫＣＧの７５１番目のアデニンをグアニンに置換した部分を含む２２塩基のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを設計した。これらのプライマーをそれぞれ用いて、本実施例（３）のＰＩ３ＫＣＧを鋳型として１回目のＰＣＲを行い、Ｋ２５１Ｅの１〜７６２番目およびＫ２５１Ｅの７４０〜３３０９番目をそれぞれ増幅した。ＰＣＲ反応溶液組成は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲに用いたプライマーおよびＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。用いたプライマーにおいて、ＰＩ３ＫＣＧの７５１番目のアデニンをグアニンに置換した部分を下線で示す。
【０１０９】
１回目のＰＣＲ
Ｋ２５１Ｅの１〜７６２番目の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；配列番号９のプライマー
リバースプライマー ；５’−ＣＴＴＧＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧ−３’（配列番号２４）
Ｋ２５１Ｅの７４０〜３３０９番目の増幅に用いたプライマー：
フォワードプライマー；５’−ＣＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＡＡＧ−３’（配列番号２５）
リバースプライマー ；配列番号１０のプライマー
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、６８℃で３分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【０１１０】
続いて、１回目のＰＣＲ産物を鋳型として、本実施例（３）［３−１］に記載のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行い、Ｋ２５１Ｅを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成は、鋳型ＤＮＡを１回目のＰＣＲ産物各５０ｎｇずつとした他は、実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲ反応条件は下記のとおりである。
【０１１１】
ＰＣＲ反応条件；９４℃で２分の反応の後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３分の各反応を１サイクルとして３０サイクル行い、その後７２℃で５分の反応を行った。
【０１１２】
得られたＰＣＲ産物は、本実施例（３）［３−１］に記載の方法によりベクターに挿入し、ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを得た。
【０１１３】
［４−２］ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのベクターの導入
本実施例（４）［４−１］で調製したｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを、本実施例（３）［３−２］に記載の方法により、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞に導入し、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群を調製した。
【０１１４】
（５）エンドサイトーシス機能の評価
本実施例（１）から（４）で調製した各群をそれぞれ２つに分け、そのうち一方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合した分子量１００００のデキストラン（インビトロジェン社）を、他方にはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を結合したトランスフェリン（インビトロジェン社）を、それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬとなるよう培地に添加し、３７℃、ＣＯ２５％を含む加湿環境下で、１０分間培養した。
【０１１５】
その後、３７℃に保った状態で実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行い、各群における２０個の細胞について、１細胞あたりの顆粒状構造物の蛍光強度を測定し、その平均値をデキストランの取り込み量およびトランスフェリンの取り込み量に換算してグラフに表した。その結果を図８ａおよび図８ｂに示す。
【０１１６】
図８ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と比較してデキストランの取り込み量の低下が見られた。一方、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と同程度のデキストランの取り込みが見られた。また、図８ｂに示すように、トランスフェリンの取り込み量は、いずれの細胞群においても野生型ＭＥＦ細胞群との違いが見られなかった。
【０１１７】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異によりＲａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合またはＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合には、クラスリン依存性のエンドサイトーシスは抑制されない一方で、クラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスは抑制されることが明らかになった。
【０１１８】
＜実施例４＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞における強化青緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）遺伝子発現率の確認
エンドサイトーシスを介する遺伝子導入試薬であるＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いる方法、エレクトロポレーション法による遺伝子導入装置であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）を用いる方法、エンドサイトーシスにより感染することが知られているレンチウイルスＨＩＶを用いる方法、および膜融合により感染することが知られているレトロウイルスＭＳＣＶを用いる方法の４つの方法により、ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞群およびＫ２５１Ｅ導入細胞群にＥＣＦＰ遺伝子の導入を行い、導入したＥＣＦＰ遺伝子を発現する細胞数を調べた。
【０１１９】
（１）ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔおよびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒにより導入したＥＣＦＰ遺伝子の発現率
実施例３（１）から（４）に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群に、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）をそれぞれ用いて、ＥＣＦＰのｃＤＮＡ（配列番号２６）が挿入されたベクターｐＥＣＦＰ−Ｃ１（クロンテック社）を、付属の使用書に従い導入した。なお、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群については、ＬＹ２９４００２を添加した培地において、ベクターの導入を行った。
【０１２０】
その後、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。続いて、気温を３７℃に保った状態で下記に示す条件により蛍光観察を行い、ＥＣＦＰの蛍光（青色）が見られる細胞を数え、各群の全体の細胞数に占める割合を算出した。その結果を図９ａに示す。
【０１２１】
蛍光観察に用いた条件
顕微鏡；倒立型リサーチ顕微鏡 ＩＸ７１（オリンパス社）
電動シャッター・ステージ；ＢｉｏＰｏｉｎｔＭＡＣ５０００（Ｌｕｄｉ社）
光源；キセノンランプ、７５ワット
減光フィルター；６％
ダイクロイックミラー；ＸＦ２０３４（４５５ＤＲＬＰ；オメガ社）
励起フィルター；ＸＦ１０７１（４４０ＡＦ２１）（オメガ社）
吸収フィルター；ＸＦ３０７５（４８０ＡＦ３０）（オメガ社）
記録装置；冷却ＣＣＤカメラＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱ（ＲｏｐｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ＣＣＤカメラおよびフィルターホイールの制御、画像データの分析；ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）
【０１２２】
図９ａに示すように、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、Ｋ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群およびＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群では、それぞれ野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＥＣＦＰ発現細胞数の割合が顕著に低下した。また、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。一方、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、いずれの細胞群においても、それぞれ野生型ＭＥＦ細胞群と比較してＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。
【０１２３】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異により、Ｒａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合およびＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合に、エンドサイトーシスを介する遺伝子導入試薬であるＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によるＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入が抑制された一方で、エレクトロポレーション法による遺伝子導入装置であるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によるＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入は抑制されないことから、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異によりＲａｓタンパク質とＰＩ３ＫＣＧタンパク質との結合が阻害された場合、またはＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合は、エンドサイトーシスが抑制されることが明らかになった。
【０１２４】
（２）レトロウイルスおよびレンチウイルスの感染により導入した遺伝子の発現率
［２−１］レトロウイルスＭＳＣＶおよびレンチウイルスＨＩＶの調製
ブリティッシュコロンビア大学のＭ．Ｒ．Ｇｏｌｄ氏から供与されたレトロウイルスベクターｐＭＳＣＶ−ｐａｃ−ＥＣＦＰを、同氏から供与されたパッケージング細胞であるＢＯＳＣ２３細胞に導入することにより、ＥＣＦＰのｃＤＮＡを保持したレトロウイルスｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）を作成した。また、理化学研究所の三好浩之氏から供与されたＣＳ−ＣＡ−ＥＣＦＰ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＲＳＶ−ＲｅｖおよびレンチウイルスベクターｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐの３つのベクターを、コネチカット大学のＢ．Ｍａｙｅｒ氏から供与された、パッケージング細胞であるヒト胚性腎（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ；ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞に導入することにより、ＥＣＦＰのｃＤＮＡを保持したレンチウイルスＨＩＶを作成した｛Ｐｅａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、第８３９２頁、１９９３年；Ｏｈｂａ Ｙ．ら、ＥＭＢＯ．Ｊ．第２０巻、第１３号、第３３３３−３３４１頁、２００１年；Ｉｎｕｚｕｋａ Ｔ．ら、Ｂ．Ｂ．Ｒ．Ｃ．第３７９巻、第５１０−５１３頁、２００９年；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｍｏｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．第ｌ２４６巻、第４２９−４３８頁、２００４年｝。
【０１２５】
［２−２］野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群へのレトロウイルスおよびレンチウイルス接種
本実施例（２）［２−１］のレトロウイルスＭＳＣＶおよびレンチウイルスＨＩＶを、それぞれ重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=１となるようＤＭＥＭ培地に加えて、レトロウイルス含有培地およびレンチウイルス含有培地を調製した。実施例３（１）および（２）に記載の方法により調製した野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、それぞれを２群に分け、そのうち一方にはレトロウイルス含有培地を、他方にはレンチウイルス含有培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１２時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、実施例１（２）に記載の環境下で２日間培養した。
【０１２６】
［２−３］ＥＣＦＰの蛍光観察
本実施例（２）［２−２］の各群について、気温を３７℃に保った状態で本実施例（１）に記載の方法により蛍光観察を行い、ＥＣＦＰの蛍光（青色）が検出される細胞を数えて、全体の細胞数に占める割合を算出した。その結果を図９ｂに示す。
【０１２７】
また、本実施例（１）の結果のうち、野生型ＭＥＦ細胞群およびＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群における結果について、「ＥＣＦＰ発現細胞数／全体の細胞数」の値に換算して、図９ｂに示す。
【０１２８】
図９ｂに示すように、レンチウイルスＨＩＶの感染によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合、およびＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡを導入した場合は、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群におけるＥＣＦＰ発現細胞数の割合が顕著に低下した。一方、レトロウイルスＭＳＣＶの感染によりＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入を行った場合、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ａｍａｘａ社）によりＥＣＦＰのｃＤＮＡの導入を行った場合は、野生型ＭＥＦ細胞群と比較して、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群におけるＥＣＦＰ発現細胞数の割合はほぼ同じであった。
【０１２９】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質が欠損すると、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）によるエンドサイトーシスを介した遺伝子導入、およびレンチウイルスの感染による遺伝子導入すなわちエンドサイトーシスによるウイルス感染が抑制されることが明らかになった。一方、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質が欠損しても、レトロウイルスの感染すなわち膜融合によるウイルス感染は抑制されないことが明らかになった。
【０１３０】
＜実施例５＞Ｋ２５１Ｅタンパク質およびＨ−Ｒａｓタンパク質の細胞内における存在箇所の確認
Ｋ２５１Ｅタンパク質およびＨ−Ｒａｓタンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、これらのタンパク質が細胞内において存在する箇所を確認した。
【０１３１】
（１）ベクターの調製
実施例３（３）［３−１］に記載の方法によりｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧを得た。また、実施例３（４）［４−１］に記載の方法によりｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１Ｅを得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖは実施例１（１）に記載のものを用いた。
【０１３２】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
Ｃｏｓ１細胞群（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を２群に分けてＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群とし、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、付属の使用書に従い、本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入し、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。前記ベクターの組み合わせは次のとおりである。
【０１３３】
導入したベクターの組み合わせ
ＰＩ３ＫＣＧ群；ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧとｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ
Ｋ２５１Ｅ群；ｐＣＸＮ２−３ＨＡ−Ｋ２５１ＥとｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ
【０１３４】
（３）免疫蛍光染色
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群について、実施例１（３）に記載の方法により免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に加えて抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）に加えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）を用いた。
【０１３５】
（４）共焦点顕微鏡による観察
本実施例（２）のＰＩ３ＫＣＧ群およびＫ２５１Ｅ群について、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。すなわち、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質およびＫ２５１Ｅタンパク質の存在する箇所をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）により検出し、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質の存在する箇所をＥＧＦＰの蛍光により検出した。また、ＥＥＡ１をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図１０に示す。融合図の下段のグラフは、融合図内に点線で示したラインに沿って、各蛍光の強度を示したものである。また、拡大図は融合図内の囲みの部分を拡大した図である。
【０１３６】
図１０に示すように、ＰＩ３ＫＣＧ群では、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現の多くが、細胞内の同じ箇所で確認された。一方、Ｋ２５１Ｅ群では、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現は同じ箇所に観察されるものの、Ｋ２５１Ｅタンパク質の発現は、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質およびＥＥＡ１タンパク質の発現と、細胞内の同じ箇所ではほとんど確認されなかった。
【０１３７】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質とＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との結合が阻害されると、初期エンドソームにおけるＰＩ３ＫＣＧタンパク質の存在（局在）が抑制されることが明らかになった。
【０１３８】
＜実施例６＞ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞およびＫ２５１Ｅ導入細胞におけるウイルス感染率の確認
ＰＩ３ＫＣＧ欠損細胞群およびＫ２５１Ｅ導入細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【０１３９】
（１）ＭＥＦ細胞群の調製
まず、実施例３（１）から（４）に記載の方法により、野生型ＭＥＦ細胞群、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群を調製した。
【０１４０】
（２）インフルエンザウイルスの調製
次に、北海道大学の高田礼人氏より供与されたインフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１；ＰＲ８）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２；Ａｉｃｈｉ）を、ニワトリ卵１０日胚（ホクレン中央種鶏場）の漿尿膜へ接種して、３７℃にて４８時間培養して増殖させた。
【０１４１】
（３）ＭＥＦ細胞群へのインフルエンザウイルス接種
続いて、本実施例（２）のＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスを、それぞれ重複感染度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ＭＯＩ）=２５０となるようｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ培地）（インビトロジェン社）に加えて、ＰＲ８ウイルス含有培地およびＡｉｃｈｉウイルス含有培地を調製した。本実施例（１）の各群をＰＢＳで洗浄した後、それぞれを２群に分け、そのうち一方にはＰＲ８ウイルス含有培地を、他方にはＡｉｃｈｉウイルス含有培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）のＢａｃｔ−ａｇａｒおよび５μｇ／ｍＬのトリプシンを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養した。
【０１４２】
（４）プラークアッセイによるウイルス感染率の確認
その後、本実施例（３）の培養上清を、１２穴プレートで単層培養したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｃａｎｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）に添加して、３７℃にて１時間培養した。続いて、培養上清を除去し、Ｂａｃｔ−ａｇａｒ１％（ｗ／ｖ）およびトリプシン５μｇ／ｍＬを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加して、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて２日間培養し、出現したプラークを数えた。この結果をもとに、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスの各群におけるウイルス感染率を求めた｛Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７６巻 、第１０９９０頁、２００１年；Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、第３巻、第３０１頁、２００１年；ＰＬｏＳ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、第５巻、第３号、第ｅ１０００３５０頁、２００９年｝。ＰＲ８ウイルスの結果を図１１ａに、Ａｉｃｈｉウイルスの結果を図１１ｂにそれぞれ示す。
【０１４３】
図１１ａおよび図１１ｂに示すように、ＰＩ３ＫＣＧ欠損ＭＥＦ細胞群およびＫ２５１Ｅ導入ＭＥＦ細胞群では、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも顕著に低下した。また、ＬＹ２９４００２添加ＭＥＦ細胞群でも、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも低下した。一方、ＰＩ３ＫＣＧ導入ＭＥＦ細胞群では、ＰＲ８ウイルスおよびＡｉｃｈｉウイルスのウイルス感染率はいずれも野生型ＭＥＦ細胞群と同程度に高いことが確認された。
【０１４４】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質の欠損またはＰＩ３ＫＣＧタンパク質の変異により、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲａｓタンパク質への結合が阻害されると、インフルエンザウイルスの感染が抑制されることが明らかになった。また、ＬＹ２９４００２によりＰＩ３ＫＣＧタンパク質を含むＰＩ３Ｋタンパク質のキナーゼ活性が阻害された場合も、インフルエンザウイルスの感染が抑制されることが明らかになった。
【０１４５】
＜実施例７＞Ｒａｓ結合領域の配列比較
ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列と他の代表的なＲａｓ結合分子であるＲａｆタンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質の、それぞれのＲＢＤのアミノ酸配列とを比較検討し、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤに特異的な配列を抽出した。
【０１４６】
ＰＩ３ＫＣＧタンパク質、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列について、近隣結合（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ；ＮＪ）法により系統樹を作成した。その結果を図１２ａに示す。また、これらの配列について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ＪＰ／ｔｏｐ−ｊ．ｈｔｍｌ）を用いてアラインメントを作成した。その結果を図１２ｂに示す。また、アラインメント作成結果に基づき、配列の保存性について視覚的に表現した図を図１２ｃに示す。
【０１４７】
図１２ａに示すように、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列は、ｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のＲＢＤのアミノ酸配列と別のカテゴリーに分類された。それは、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのＮ末端側のアミノ酸配列がｃ−Ｒａｆ１タンパク質およびＲａｌＧＤＳタンパク質のものより長く、かつ特徴的な２８アミノ酸の配列を有することに起因することが図１２ｂより確認された。さらに、図１２ｃに示すように、Ｎ末端側においてアミノ酸配列の保存性が低いことが確認された。
【０１４８】
以上より、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのＮ末端２８アミノ酸（Ｎ２８ポリペプチド；配列番号２７および配列番号２８）が、ＰＩ３ＫＣＧタンパク質に、他のＲａｓ結合因子とは異なる機能を付与する配列であることが示唆された。
【０１４９】
＜実施例８＞Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体の細胞内における存在箇所の確認
Ｈ−Ｒａｓタンパク質とＮ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質との複合体を、ＢｉＦＣ法により可視化し、この複合体が細胞内において存在する箇所を確認した。
【０１５０】
（１）ベクターの調製
実施例１（１）に記載の方法により、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣおよびｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣを得た。
【０１５１】
実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧを鋳型として、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤ（配列番号３０）に相当するｃＤＮＡ（配列番号２９）を増幅した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。ＰＣＲに用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１５２】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＡＡＧＧＴＣＴＣＡＣＣ−３’（配列番号３１）
リバースプライマー ；５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＴＣＣＡＧＴ−３’（配列番号３２）
【０１５３】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、前記ベクターｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ−ＶＣのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに、Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖに代えて挿入し、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣを得た。
【０１５４】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
Ｃｏｓ１細胞（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）を、コラーゲンでコートした直径３５ｍｍのガラスベースディッシュ（旭テクノガラス社）に置き、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、添付の使用書に従い、本実施例（１）で調製したベクターを組み合わせて導入した。その組み合わせは次のとおりである。
【０１５５】
導入したベクターの組み合わせ
ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣ
ｐＣＡＧＧＳ−ＶＮ−Ｈ−ＲａｓＧ１２ＶとｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣ
【０１５６】
ベクター導入後の細胞は、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養し、培地を除去した後、ＦＢＳを含まないフェノールレッド不含培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；インビトロジェン社）を添加し、さらに４時間培養した。
【０１５７】
（３）蛍光顕微鏡による観察
その後、３７℃に保った状態で、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。観察開始から２０分後に、培地にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、さらに観察を行った。ＥＧＦ添加前の結果を図１３上段に、ＥＧＦ添加後の結果を図１３下段にそれぞれ示す。
【０１５８】
図１３上段および下段に示すように、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−ＶＣを導入した細胞では、ＥＧＦ添加前と比較して、ＥＧＦ添加後にＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）がエンドソームにおいて多数見られた。一方、ｐＣＸＮ２−Ｆｌａｇ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤ−Ｎ２８ｄ−ＶＣを導入した細胞では、ＥＧＦ添加前と比較して、ＥＧＦ添加後にＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）がゴルジ装置に集積していることが確認された。
【０１５９】
以上より、Ｎ２８ポリペプチドを欠くＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との複合体は、エンドソームへ存在せずゴルジ装置に集積することが明らかになった。すなわち、Ｎ２８ポリペプチドはＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤとＨ−ＲａｓＧ１２Ｖタンパク質との複合体をエンドソームへ存在させる機能を有することが明らかになった。
【０１６０】
＜実施例９＞Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞のエンドサイトーシス機能の確認
分子量１００００のデキストランを、Ｎ２８ポリペプチドを発現させたＭＤＣＫ細胞に取り込ませ、それらの取り込み量を調べた。
【０１６１】
（１）ベクターの調製
実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＶｅｎｕｓのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを得た。このベクターの制限酵素地図を図１４に示す。
【０１６２】
続いて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＶｅｎｕｓとＮ２８ポリペプチドのｃＤＮＡとを含むＤＮＡ断片を増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１６３】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３３）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧ−３’（配列番号３４）
【０１６４】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＥｃｏＲIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＧＦＰ−Ｈ−ＲａｓのＥｃｏＲI／ＮｏｔIサイトに、ＥＧＦＰ−Ｈ−Ｒａｓに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８を得た。このベクターの制限酵素地図を図１５に示す。
【０１６５】
次に、実施例３（３）［３−１］のＰＩ３ＫＣＧタンパク質のＲＢＤのｃＤＮＡを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたベクターｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを得た。このベクターの制限酵素地図を図１６に示す。続いて、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−ＰＩ３ＫＣＧ−ＲＢＤを制限酵素ＳｐｅIおよびＸｈｏIで消化し、プロモーターとヘマグルチニンのｃＤＮＡを含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得て、これを、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−Ｎ２８のＳｐｅI／ＸｈｏIサイトに、Ｖｅｎｕｓに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を得た。このベクターの制限酵素地図を図１７に示す。
【０１６６】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を、コラーゲンでコートした直径３５ｍｍのガラスベースディッシュ（旭テクノガラス社）に置き、ＦｕＧｅｎｅ ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社）を用いて、添付の使用書に従い、本実施例（１）で調製したｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を導入した。その後、実施例１（２）に記載の環境下で２４時間培養した。
【０１６７】
（３）エンドサイトーシス機能の評価
本実施例（２）のＭＤＣＫ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した分子量１００００のデキストラン（インビトロジェン社）０．５ｍｇ／ｍＬおよびＦＢＳ１０％（ｖ／ｖ）を含むＤＭＥＭ培地を添加し、３７℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１０分間培養した。
【０１６８】
（４）免疫蛍光染色
本実施例（３）のＭＤＣＫ細胞群について、実施例１（３）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体は抗ＥＥＡ１マウスモノクローナル抗体（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に代えて抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）を用い、二次抗体はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）に代えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）を用いた。また、抗体の希釈にはＰＢＳに代えてＰＢＴを用い、二次抗体の希釈倍率は２００倍に代えて３００倍とし、一次抗体による抗原抗体反応の時間は一晩に代えて１２時間とした。
【０１６９】
（５）蛍光顕微鏡による観察
本実施例（４）のＭＤＣＫ細胞群について、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行い、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光（赤紫色）を検出した。その結果を図１８の上図に示す。また、２４個の細胞について、１細胞におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度をそれぞれ測定し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度を縦軸に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度を横軸にとったグラフにプロットした。その結果を図１８の下図に示す。
【０１７０】
図１８の上図および下図に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が小さい細胞、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が大きい細胞、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。
【０１７１】
以上より、Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、クラスリン非依存性エンドサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスが抑制されることが明らかになった。
【０１７２】
＜実施例１０＞Ｎ２８ポリペプチドを発現させた細胞のウイルス核タンパク質取り込み量の確認
Ｎ２８ポリペプチドを発現させたＭＤＣＫ細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、細胞内へのウイルス核タンパク質の取り込み量を調べた。
【０１７３】
（１）ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるウイルス核タンパク質の取り込み量
［１−１］ベクターの調製およびＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入
実施例９（１）に記載の方法によりｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８を得て、これを実施例９（２）に記載の方法によりＭＤＣＫ細胞群に導入した。
【０１７４】
［１−２］ＭＤＣＫ細胞群へのインフルエンザウイルス接種
実施例６（２）に記載の方法により調製したＰＲ８ウイルスを、ＭＯＩ=２となるようＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に加えて、ＰＲ８ウイルス含有培地を調製した。本実施例（１）［１−１］のＭＤＣＫ細胞群をＰＢＳで洗浄した後、ＰＲ８ウイルス含有培地を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて１時間培養することによりウイルス接種を行った。続いて、ＰＢＳで洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）のＢａｃｔ−ａｇａｒおよび５μｇ／ｍＬのトリプシンを含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を添加し、３５℃、ＣＯ２５％（ｖ／ｖ）を含む加湿環境下にて５時間培養した。
【０１７５】
［１−３］免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（１）［１−２］のＭＤＣＫ細胞群について、実施例９（４）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）に加えて北海道大学の高田礼人氏から供与された抗インフルエンザウイルス核タンパク質マウスモノクローナル抗体を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）に加えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）を用いた。その後、実施例１（４）に記載の方法により蛍光観察を行った。その結果を図１９に示す。
【０１７６】
図１９に示すように、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が大きい細胞ではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が小さく、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８の蛍光強度が大きい細胞ではＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７の蛍光強度が小さかった。
【０１７７】
以上より、ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。
【０１７８】
（２）ＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるウイルス核タンパク質の取り込み量
［２−１］ベクターの調製
京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｈ−ＲａｓＧ１２Ｖ（制限酵素地図を図２０に示す）を制限酵素ＳｐｅIおよびＸｈｏIで消化して、プロモーターとＥＣＦＰのｃＤＮＡを含む約２．４ｋｂｐの断片を得た。この２．４ｋｂｐの断片を、実施例９（１）に記載の方法により得たｐＣＡＧＧＳ−３ＨＡ−Ｎ２８のＳｐｅI／ＸｈｏIサイトに、３コピーのＨＡのｃＤＮＡに代えて挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を得た。
【０１７９】
［２−２］ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入およびインフルエンザウイルス接種
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を２群に分け、コントロール群およびＮ２８群とした。実施例９（２）に記載の方法により、コントロール群には京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰを、Ｎ２８群には本実施例（２）［２−１］のｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８をそれぞれ導入した。その後、本実施例（１）［１−２］に記載の方法によりコントロール群およびＮ２８群にＰＲ８ウイルスを接種した。
【０１８０】
［２−３］免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（２）［２−２］のコントロール群およびＮ２８群について、実施例９（４）に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、一次抗体として、抗ＨＡラットモノクローナル抗体３Ｆ１０（ロシュ社）に代えて北海道大学の高田礼人氏から供与された抗インフルエンザウイルス核タンパク質マウスモノクローナル抗体を用い、二次抗体として、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を結合した抗ラット抗体（インビトロジェン社）に代えてＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４を結合した抗マウス抗体（インビトロジェン社）を用いた。その後、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行った。その結果を図２１の左図に示す。また、各群のそれぞれ１２０個の細胞について、１細胞におけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度およびＥＣＦＰの蛍光強度をそれぞれ測定して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度を縦軸に、ＥＣＦＰの蛍光強度を横軸にとったグラフにプロットした。その結果を図２１の右図に示す。
【０１８１】
図２１左図および右図に示すように、Ｎ２８群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＥＣＦＰの蛍光強度の蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。一方、コントロール群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞が同程度に存在していた。
【０１８２】
以上より、ＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。また、この結果は本実施例（１）と同様の結果であることから、ＨＡにより標識したＮ２８ポリペプチドまたはＥＣＦＰにより標識したＮ２８ポリペプチドを発現させた細胞におけるインフルエンザウイルスの細胞内への取り込み抑制効果は、標識タンパク質によるものではなく、Ｎ２８ポリペプチドによるものであることが確認された。
【０１８３】
＜実施例１１＞Ｎ２８ポリペプチドの中央部１１アミノ酸を発現させた細胞のウイルス核タンパク質取り込み量の確認
Ｎ２８ポリペプチドの中央部１１アミノ酸（Ｎ１１ポリペプチド；配列番号３９および配列番号４０）を発現させたＭＤＣＫ細胞群にインフルエンザウイルスを接種し、細胞内へのウイルス核タンパク質の取り込み量を調べた。
【０１８４】
（１）ベクターの調製
実施例１０（２）［２−１］に記載の方法によりｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を得た。ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ２８ポリペプチドのカルボキシル（Ｃ）末端側２０アミノ酸（配列番号３６）に相当するｃＤＮＡ（配列番号３５）を含む２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１８５】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号３７）
リバースプライマー ；５’−ＡＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧ−３’（配列番号３８）
【０１８６】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＢｇｌIIで消化した後、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２８のＸｈｏI／ＢｇｌIIサイトに挿入し、Ｎ２８ポリペプチドに相当するｃＤＮＡに代えてＮ２８ポリペプチドのＣ末端側２０アミノ酸に相当するｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０を得た。
【０１８７】
続いて、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｎ１１ポリペプチドに相当するｃＤＮＡ（配列番号３９）を含む７００ｂｐのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０１８８】
フォワードプライマー；５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号４１）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣ−３’（配列番号４２）
【０１８９】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＥｃｏＲIおよびＮｏｔIで消化した後、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ２０のＥｃｏＲI／ＮｏｔIサイトに挿入し、Ｎ２８ポリペプチドのＣ末端側２０アミノ酸に相当するｃＤＮＡに代えてＮ１１ポリペプチドに相当するｃＤＮＡが挿入されたベクターｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ１１を得た。
【０１９０】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのベクターの導入およびインフルエンザウイルス接種
ＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を２群に分け、コントロール群およびＮ１１群とした。実施例９（２）に記載の方法により、コントロール群には京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰを、Ｎ１１群には本実施例（１）で調製したｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｎ１１をそれぞれ導入した。その後、実施例１０（２）［２−２］に記載の方法によりコントロール群およびＮ１１群にＰＲ８ウイルスを接種した。
【０１９１】
（３）免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（２）のコントロール群およびＮ１１群について、実施例１０（２）［２−３］に記載の方法により、免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察を行った。ただし、蛍光強度を測定した細胞数は１２０個に代えて９０個とした。その結果を図２２上図および下図に示す。
【０１９２】
図２２上図および下図に示すように、Ｎ１１群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞が多数存在するのに対し、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞は存在しなかった。一方、コントロール群では、ＥＣＦＰの蛍光強度が小さく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が大きい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度が大きく、かつＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度が小さい細胞、ＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが小さい細胞およびＥＣＦＰの蛍光強度とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光強度とのいずれもが大きい細胞が同程度に存在していた。
【０１９３】
以上より、Ｎ１１ポリペプチドを発現させた細胞では、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが抑制されることが明らかになった。
【０１９４】
＜実施例１２＞クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した細胞におけるウイルス感染率の確認
実施例３および実施例４においてクラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制することが確認された、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性阻害剤であるＬＹ２９４００２およびクラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制することが知られているモノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；Ｓｃｈｌｅｇｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７９巻、第２２９１−２２９５頁、１９８２年； Ｒａｙら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、第３７８巻、第２３５−２３９頁、１９９６年）を添加してインフルエンザウイルスを接種し、ウイルス感染率を調べた。
【０１９５】
（１）各試薬による前処理
１２ウェルプレートでＭＥＭ培地を用いて培養したＭＤＣＫ細胞群（ＪＣＲＢ細胞バンク：ＪＣＲＢ９０２９）を５群に分け、コントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群、ＬＹ＋ＭＤＣ群およびオセルタミビル群とした。続いて、各群の培地に下記の試薬を添加して３０分間培養することにより、前処理を行った。濃度は培地中の濃度を示す。
【０１９６】
コントロール群 ；無添加
ＬＹ２９４００２群；ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
ＭＤＣ群 ；モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
ＬＹ＋ＭＤＣ群 ；ＬＹ２９４００２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ；シグマ社）５０μｍｏｌ／Ｌ
オセルタミビル群 ；オセルタミビル（Ｒｏｃｈｅ社） １００μｍｏｌ／Ｌ
【０１９７】
（２）ＭＤＣＫ細胞群へのインフルエンザウイルス接種およびプラークアッセイによるウイルス感染率の確認
実施例１０（１）［１−２］に記載の方法により、本実施例（１）の各群にＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＭＯＩ=２に代えてＭＯＩ=１とし、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地には、本実施例（１）の前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加した。また、ウイルス接種後の培養時間は５時間に代えて２日間とした。その後、実施例６（４）に記載の方法によりプラークアッセイを行い、ウイルス感染率を求めた。その結果を図２３に示す。
【０１９８】
図２３に示すように、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群、ＬＹ＋ＭＤＣ群およびオセルタミビル群のウイルス感染率は、コントロール群と比較してそれぞれ約１／５、約１、約１／１００および約１／１０であった。
【０１９９】
以上より、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制すると、インフルエンザウイルスの感染を顕著に抑制できることが明らかになった。
【０２００】
＜実施例１３＞クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した細胞におけるウイルス核タンパク質の存在（局在）箇所の確認
【０２０１】
初期エンドソームマーカータンパク質、後期エンドソームマーカータンパク質、クラスリン軽鎖タンパク質およびウイルス核タンパク質を免疫抗体染色および蛍光標識により可視化し、ＬＹ２９４００２およびＭＤＣを添加してインフルエンザウイルスを接種した細胞において、これらのタンパク質が存在する箇所を調べた。
【０２０２】
（１）ベクターの調製
初期エンドソームに存在（局在）することが知られているＲａｂ５タンパク質（配列番号４４）のｃＤＮＡ（配列番号４３）が挿入されたベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ５、および後期エンドソームに存在（局在）することが知られているＲａｂ７タンパク質（配列番号４６）のｃＤＮＡ（配列番号４５）が挿入されたベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７は東京大学の坪井貴司氏から供与された。また、クラスリン軽鎖（ＣＬＣａ）タンパク質（配列番号４８）のｃＤＮＡ（配列番号４７）は東京大学の河岡義裕氏から供与された。ＣＬＣａのｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、５’端および３’端にそれぞれＸｈｏIおよびＮｏｔIサイトが付加されたＣＬＣａのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０２０３】
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号４９）
リバースプライマー；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧ−３’（配列番号５０）
【０２０４】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＶｅｎｕｓのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトに挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａを得た。このベクターの制限酵素地図を図２４に示す。
【０２０５】
続いて、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ５およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１−Ｒａｂ７を鋳型としてＰＣＲを行い、Ｒａｂ５タンパク質およびＲａｂ７タンパク質のそれぞれのｃＤＮＡを増幅して単離した。ＰＣＲ反応溶液組成およびＰＣＲ反応条件は実施例１（１）に記載の方法と同様にした。用いたプライマーは下記のとおりである。
【０２０６】
Ｒａｂ５の増幅に用いたプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＴＡＡＴＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’（配列番号５１）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号５２）
Ｒａｂ７の増幅に用いたプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号５３）
リバースプライマー ；５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号５４）
【０２０７】
得られたＰＣＲ産物はＱＩＡＸII（キアゲン社）により精製した。これを制限酵素ＸｈｏIおよびＮｏｔIで消化した後、京都大学の松田道行氏から供与されたｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰのＸｈｏI／ＮｏｔIサイトにそれぞれ挿入し、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ５およびｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７を得た。
【０２０８】
（２）Ｃｏｓ１細胞群へのベクターの導入
実施例９（２）に記載の方法により、本実施例（１）のｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ５、ｐＣＡＧＧＳ−ＥＣＦＰ−Ｒａｂ７およびｐＣＡＧＧＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＣＬＣａをＣｏｓ１細胞群（ＡＴＣＣ；受託番号ＣＲＬ−１６５０）に導入した。
【０２０９】
（３）各試薬による前処理
本実施例（２）のＣｏｓ１細胞群を４群に分け、コントロール群、ＬＹ２９４００２群、ＭＤＣ群およびＬＹ＋ＭＤＣ群とした。続いて、これらの各群に、実施例１２（１）に記載の方法により各試薬による前処理を行った。
【０２１０】
（４）Ｃｏｓ１細胞群へのインフルエンザウイルス接種
実施例１０（１）［１−２］に記載の方法により、本実施例（３）の各群にＰＲ８ウイルスを接種した。ただし、ＭＯＩ=２に代えてＭＯＩ=１００とし、各群に添加するＰＲ８ウイルス含有培地には、本実施例（３）の前処理時と同じ試薬を同じ濃度となるよう添加した。またウイルス接種後の培養は行わなかった。
【０２１１】
（５）免疫蛍光染色および蛍光顕微鏡による観察
本実施例（４）の各群について、実施例１０（２）［２−３］に記載の方法により、免疫蛍光染色を行った。ただし、二次抗体の希釈倍率は３００倍に代えて２５０倍とした。その後、実施例１（４）に記載の方法により、蛍光観察を行い、Ｒａｂ５タンパク質、Ｒａｂ７タンパク質、ＣＬＣａタンパク質およびインフルエンザウイルスのウイルス核タンパク質をそれぞれＥＣＦＰ、Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）により検出した。その結果を図２５の左図に示す。また、各群の１０個の細胞について、下記の蛍光を示す顆粒の数をそれぞれ数え、ｂ／ａおよびｃ／ａの１細胞あたりの割合をそれぞれ求めた。その結果を図２５の右図に示す。
【０２１２】
ａ；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）を示す顆粒
ｂ；ＥＣＦＰの蛍光（青色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒
ｃ；Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光（緑色）とＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４の蛍光（赤色）との重複を示す顆粒
【０２１３】
図２５の左図および右図に示すように、ＬＹ２９４００２群では、コントロール群と比較してｂ／ａが低下した一方で、ｃ／ａは同様の割合であり、ＭＤＣ群では、コントロール群と比較してｂ／ａがやや低下した一方で、ｃ／ａは顕著に低下した。これに対し、ＬＹ＋ＭＤＣ群では、コントロール群と比較してｂ／ａおよびｃ／ａのいずれも顕著に低下した。
【０２１４】
以上より、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制した場合はクラスリン依存性エンドサイトーシスによりインフルエンザウイルスが細胞内に取り込まれ、クラスリン依存性エンドサイトーシスのみを抑制した場合はクラスリンに依存しないエンドサイトーシスによりインフルエンザウイルスが細胞内に取り込まれることが明らかになった。これに対し、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスのいずれも抑制した場合は、インフルエンザウイルスの細胞内への取り込みが顕著に抑制されることが明らかになった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質に結合可能なｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）と対象物質とを共存させる工程と、
前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光共鳴エネルギー移動を観測する方法を用いる、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程と、
前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド。
【請求項６】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項９】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項８に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１０】
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項８または請求項９に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【請求項１１】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８から請求項１０のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１２】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【請求項１３】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１２に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１４】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１２または請求項１３のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１５】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項１６】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１５に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１７】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１５または請求項１６のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１８】
エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項１９】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１８に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項２０】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質が、下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上の物質および／またはポリペプチドである、請求項１８に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｖｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質。
【請求項２１】
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項２０に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【請求項２２】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１８から請求項２１のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質に結合可能なｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質と、ＰＩ３Ｋタンパク質またはそのＲａｓ結合領域（Ｒａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｄｏｍａｉｎ；ＲＢＤ）と対象物質とを共存させる工程と、
前記対象物質が前記Ｒａｓタンパク質と前記ＰＩ３Ｋタンパク質または前記ＲＢＤとの結合阻害能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
蛍光共鳴エネルギー移動を観測する方法を用いる、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染を抑制する物質のスクリーニング方法であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドと対象物質とを共存させる工程と、
前記対象物質が前記ポリペプチドとの結合能を有するか否かを評価する工程と
を有する、前記方法；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＰＩ３Ｋタンパク質の一部を構成した場合にＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体をエンドソーム上に存在させることができるポリペプチド。
【請求項６】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項９】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項８に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１０】
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項８または請求項９に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【請求項１１】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項８から請求項１０のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１２】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、下記（ｉ）〜（ｉｖ）から選択される１または２以上のポリペプチドを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド。
【請求項１３】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１２に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１４】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１２または請求項１３のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１５】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質を有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項１６】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１５に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１７】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１５または請求項１６のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項１８】
エンドサイトーシスにより感染可能なウイルスの感染抑制剤であって、クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質とクラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を抑制する物質とを有効成分とする、前記ウイルス感染抑制剤。
【請求項１９】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスがクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）および／またはマクロピノサイトーシス（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）である、請求項１８に記載のウイルス感染抑制剤。
【請求項２０】
クラスリンに依存しないエンドサイトーシスを抑制する物質が、下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上の物質および／またはポリペプチドである、請求項１８に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号２８において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号４０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号４０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質とＰＩ３Ｋタンパク質とが形成する複合体がエンドソーム上に存在するのを抑制するポリペプチド、
（ｖｉ）ＰＩ３Ｋタンパク質の活性を抑制する物質。
【請求項２１】
Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ３−ｋｉｎａｓｅ（ＰＩ３Ｋ）タンパク質とｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ（Ｒａｓ）タンパク質との結合を阻害する物質が下記（ｉ）〜（ｖｉ）から選択される１または２以上のポリペプチドである、請求項２０に記載のウイルス感染抑制剤；
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１３において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｖ）配列番号３０において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
（ｖ）配列番号５６のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｖｉ）配列番号５６において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつＲａｓタンパク質と結合するポリペプチド。
【請求項２２】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１８から請求項２１のいずれかに記載のウイルス感染抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２０１３−６７７２（Ｐ２０１３−６７７２Ａ）
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０７６０２（Ｐ２０１０−１０７６０２）
【出願日】平成２２年５月７日（２０１０．５．７）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月７日（２０１０．５．７）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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