エチニル基含有環状イミド化合物、並びに、それを用いたチオール基修飾剤及びそれを用いたアミノ基修飾剤
【課題】抗体、糖タンパク、酵素等、チオール基やアミノ基を有する化合物に対して、容易に化学修飾することのできるエチニル基含有環状イミド化合物を提供する。
【解決手段】第1発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とし、第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする
【解決手段】第1発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とし、第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのアミノ残基やチオール基の修飾剤として好適に用いることができるエチニル基含有環状イミド化合物、並びに、それを用いたチオール基修飾剤及びそれを用いたアミノ基修飾剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬分野において、化学修飾の手法を用いてタンパク、核酸、生理活性物質等を蛍光物質で標識したり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることが行われている。このために、多くの化学修飾剤が開発されている。
【０００３】
化学修飾の手法としては様々なものがあるが、中でもHuisgen反応を利用した化学修飾方法が注目されている。Huisgen反応とは、有機アジド化合物とアルキン類とが［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール誘導体を与える反応をいう（下記化学式参照）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
アルキン類が末端アルキンの場合、銅（Ｉ）イオンが触媒となり、選択的に１，４−二置換体が得られる。この反応は、他にアルコール、アミン、アミド、エステル、ハライドなど各種官能基があっても邪魔されず、目的のトリアゾールが高収率で得られる。反応溶媒もアルコール、一般的有機溶媒、水などの中で問題なく進行する。またアジド及びアルキンは各種有機化合物に導入が容易であり、反応後に余分な廃棄物を出さないという多くの利点を有している。このため、K.B.Sharplessらが提唱するクリック反応の代表例として、挙げられている。
【０００６】
本発明者らにおいても、オリゴヌクレオチド誘導体にエチニル基を導入し、さらに、このエチニル基と、ＰＥＴラベル化に適用できる元素で標識した有機アジド化合物とをHuisgen反応によって環化させてＰＥＴプローブ化することを提案している（特許文献１）。この方法によれば、迅速かつ簡単にＰＥＴプローブを製造できるため、半減期の短い18Ｆや11ＣによるＰＥＴラベル化法として注目されている。
【０００７】
また、Dirksらは、牛血清アルブミンのＳＨ基を足がかりにしてエチニル基を導入し、Huisgen反応による蛍光プローブ化を行っている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１９５６９８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dirks, A. J.; Cornelissen, J. J. L. M.; Nolte, R. J. M. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1129-1138.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗体、ペプチド、糖タンパク、酵素等、多くの生体内物質はペプチド鎖を有しており、これらペプチド鎖に容易に修飾できる化学修飾剤があれば、医薬分野の研究において便利なツールとなるはずである。このため、ペプチドや酵素や抗体等を、簡単且つ短時間で容易に化学修飾することのできる修飾剤の開発が要請されている。
【００１１】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、ペプチドや酵素や抗体等、チオール基やアミノ基を有する化合物に対して、エチニル基を容易に導入することのできる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために、ペプチド鎖に存在するアミノ基を足がかりとしてエチニル基を導入し、その後、有機アジド化合物とHuisgen反応によって環化させることを考えた。このためのアミノ基の修飾方法として、Ｎ−アルキルスクシンイミドがアミノ基の修飾剤として用いられていることを利用し、スクシンイミドにエチニル基を導入しておき、アミノ基にスクシンイミドを介してエチニル基を導入することを計画し、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、第１発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００１４】
【化２】
【００１５】
この一般式（１）のエチニル基含有環状イミド化合物は、ベンゼン環に結合したカルボニル炭素と、イミドの窒素に結合した酸素との間で結合が切断されやすいため、容易にアミノ基とカルボニル基との間でアミド結合を形成する（下記反応式参照）。このため、アミノ基にエチニル基を容易に導入することができる。さらに、第１発明のエチニル基含有環状イミド化合物のアミノ基への結合反応は、ジスルフィド結合に影響を与えることなく進行させることができる。このため、ペプチドやタンパク質において存在するジスルフィド結合に影響を与えることなく、アミノ基のみを選択的に修飾することができる。
【００１６】
【化３】
【００１７】
こうしてエチニル基を導入された付加化合物は、有機アジド化合物との間で容易に［３＋２］型の付加環化反応（すなわちHuisgen反応）が起こり、１，２，３−トリアゾール誘導体となる。ここで、有機アジド化合物として、蛍光性の官能基を導入したり、18Ｆや11Ｃによるラベル化された化合物を用いたりすれば、容易且つ短時間で、蛍光機能を発現させたり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることができる。
【００１８】
また、同様の考えから、発明者らは第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物を完成した。すなわち、第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００１９】
【化４】
【００２０】
さらに、本発明者は、ペプチド鎖に存在するチオール基を足がかりとしてエチニル基を導入し、その後、有機アジド化合物とHuisgen反応によって環化させることを考えた。このためのチオール基の修飾方法として、Ｎ−アルキルマレイミドがチオール基の修飾剤として用いられていることを利用し、マレイミドにエチニル基を導入しておき、チオール基にマレイミドを介してエチニル基を導入することを計画し、鋭意研究を行った結果、第３発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、第３発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（３）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００２２】
【化５】
【００２３】
この一般式（１）の環状イミド部分に存在する炭素−炭素二重結合へは、チオール基が容易にマイケル型の付加反応を行うことができる（下記反応式参照）。このため、ＳＨ基にエチニル基を容易に導入することができる。
【００２４】
【化６】
【００２５】
こうしてエチニル基を導入された付加化合物は、有機アジド化合物との間で容易に［３＋２］型の付加環化反応（すなわちHuisgen反応）が起こり、１，２，３−トリアゾール誘導体となる。ここで、有機アジド化合物として、蛍光性の官能基を導入したり、18Ｆや11Ｃによるラベル化された化合物を用いたりすれば、容易且つ短時間で、蛍光機能を発現させたり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることができる。
【００２６】
また、同様の考えから、発明者らは第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物を完成した。すなわち、第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（４）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００２７】
【化７】
【００２８】
第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素とすることができる。
【００２９】
また、第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位とすることもできる。この場合には、ベンゼン環に結合している３つの置換基が互いにメタ位となるため、たとえ、Ｒ３がアルキル基であっても、クリック反応時に立体的な障害を受けにくい。
【００３０】
さらに、第２及び第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ｎは１以上１０以下であるとすることが好ましい。ｎが１０を超えるような長いエチレン鎖を有した場合、クリック反応時に立体的な障害を受けやすく、反応が進行し難くなるおそれがある。
【００３１】
また、第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、Ｒ１及びＲ２は水素とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3をソマトスタチンのアミノ基に修飾させた場合の反応液のUPLC-MSの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３３】
以下に示す合成ルートに従い、実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3、実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5、実施例３のエチニル基含有環状イミド化合物12−14及び実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物18−20を合成した。
【００３４】
[実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate）の合成ルート]
【００３５】
【化８】
【００３６】
[実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5（1-(4-Ethynylbenzyl)-2,5-dioxopyrrole）の合成ルート]
【００３７】
【化９】
【００３８】
[実施例３のエチニル基含有環状イミド化合物12（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate）、13（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl) aminopentanoate）、14（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl) aminooctanoate）の合成ルート]
【００３９】
【化１０】
【００４０】
[実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物18（1-(4-Ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole）、19（1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole）、20（1-(4-Ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole）の合成ルート]
【００４１】
【化１１】
【００４２】
上記合成ルートにおける各段階の反応について、詳細に説明する。
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1) の合成
4-Iodobenzoic acid (2.5 g, 10.1 mmol)、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride (420 mg, 600 μmol)、CuI (230 mg, 12.1 mmol) をTHF (40 mL) とtriethylamine (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、trimethylsilylacetylene (2.5 mL, 15.0 mmol) を加え、室温で18 時間撹拌した。セライト濾過し、酢酸エチル (300 mL) で洗浄した。濾液を 1N 塩酸 (150 mL) 、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 1：1) にて精製し、4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (2.01 g, 91%) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 0.27 (s, 9H).
【００４３】
4-Ethynylbenzoic acid (2) の合成
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.6 g, 7.33 mmol)、FK (2.44 g, 41.8 mmol) をMeOH (40 mL) と THF (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で17 時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 1：1) にて精製し、4-ethynylbenzoic acid (500 mg, 47 %) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 13.42 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.72 (s, 1H).
【００４４】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (3) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (181 mg, 1.28 mmol) を DMF (4 mL) に溶解した後、60 ℃ で撹拌しながら、N-hydroxysuccinimide (176 mg, 1.53 mmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (295 mg, 1.53 mmol)、4-dimethylaminopyridine (31.3 mg, 256 μmol) を加え、30分撹拌後、室温で12 時間撹拌した。蒸留水 (50 mL) を加え、桐山ろ過によりろ取し、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (227 mg, 73 %) を淡黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 2.90 (s, 4H).
【００４５】
4-Ethynylbenzyl alcohol (4) の合成
LiAlH4 (173 mg, 4.6 mmol) をTHF (45 mL) に懸濁し、0 ℃ で撹拌しながら4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.0 g, 4.58 mmol) の THF (10 mL) 溶液を加え、2 時間加熱還流した。氷冷下で酒石酸ナトリウムカリウム飽和水溶液 (50 mL) を滴下し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 20：1 → 5：1) にて精製し、4-ethynylbenzyl alcohol (473 mg, 78 %) を黄褐色オイルとして得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.66 (s, 2H), 3.08 (s, 1H).
【００４６】
1-(4-Ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (5) の合成
Triphenylphosphine (85.1 mg, 324 μmol) を THF (2 mL) に溶解した後、-78 ℃ で撹拌しながら、diethyl azodicarboxylate (2.2 M in toluene, 140 μL, 308 μmol) を滴下した。5 分後、4-ethynylbenzyl alcohol (40.9 mg, 309 μ mol) のTHF (2 mL) 溶液を加え、5 分間撹拌した。maleimide (36.3 mg, 373 μmol) を加え、さらに5 分間撹拌した後、室温で24時間撹拌した。1N 塩酸 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 20：1 → 10：1 → クロロホルム：メタノール ＝100：1) にて精製し、1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (26.0 mg, 40%) を白色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 2H), 4.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.07 (s, 1H).
【００４７】
4-Ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (6) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (28.0 mg, 200 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (54.0 mg, 400 μmol)、 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (76.0 mg, 400 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。2-aminoethanol (30.3 μL, 400 μmol) を加え、室温で 20時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 5：1 → 1：10) にて精製し、4-ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (24.0 mg, 63 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.20 (s, 1H).
【００４８】
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (7) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (43.8 mg, 300 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (61.1 mg, 450 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (86.3 mg, 450 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。5-aminopentan-1-ol (80.0 μL, 768 μmol) を加え、室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 10：1 → 2：3) にて精製し、4-ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (42.7 mg, 62 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.23 (s, 1H), 3.67 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.47 (dd, J = 13.2 Hz, 7.1 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.70-1.59 (m, 4H), 1.51-1.43 (m, 2H).
【００４９】
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (8) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (154 mg, 1.0 mmol)、N-hydroxybenzotriazole (270 mg, 2.0 mmol) 及び1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (380 mg, 2.0 mmol) をDMF (30 mL) に加えた。室温で3 時間撹拌した後、8-aminooctan-1-ol (290 mg, 2.0 mmol) を加えた。室温で 17時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、4-ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (176 mg, 64 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.49-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.63-1.25 (m, 12H).
【００５０】
2-(4-Ethynylbenzamido)acetic acid (9) の合成
4-Ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (56.8 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 50：1 → 5：1) にて精製し、2-(4-ethynylbenzamido)acetic acid (58.0 mg, 95%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 12.60 (s, 1H), 8.88 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 4.34 (s, 1H), 3.88 (d, J = 5.6 Hz, 2H).
【００５１】
5-(4-Ethynylbenzamido)pentanoic acid (10) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (693 mg, 3.0 mmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (93.8 mg, 600 μmol)、NaClO2 (687 mg, 6.0 mmol)、NaOCl (5% in H2O, 1.5 mL, 1.01 mmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (15 mL)とMeCN (15 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で11時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 1：0 → 5：1) にて精製し、5-(4-ethynylbenzamido)pentanoic acid (736 mg, 100%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 11.99 (s, 1H), 8.53 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 3.24 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.52-1.51 (m, 4H).
【００５２】
8-(4-Ethynylbenzamido)octanoic acid (11) の合成
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 10：0 → 5：1) にて精製し、8-(4-ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 72%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.17 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.18 (s, 1H), 2.36-2.33 (m, 2H), 1.68-1.57 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 8H).
【００５３】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate (12) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)acetic acid (21.0 mg, 100 μmol) をTHF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (48.0 mg, 300 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (57.0 mg, 300 μmol)を加え、5時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 10：1 → 3：1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate (7.5 mg, 27%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 1H), 4.24 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 4H), 3.20 (s, 1H).
【００５４】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (13) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)pentanoic acid (73.5 mg, 300 μmol) をDMF (5 mL) に加え、60 ℃ で撹拌しながらN-hydroxysuccinimide (41.4 mg, 360 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (69.0 mg, 360 μmol)、4-dimethylaminopyridine (7.3 mg, 60.1 μmol) を加えた後、30分間撹拌した。室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 5：1 → 2：3) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (53.9 mg, 56%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.32 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.69 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.91-1.84 (m, 2H), 1.80-1.73 (m, 2H).
【００５５】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminooctanoate (14) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 200 μmol) をDMF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (28.0 mg, 240 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (46.0 mg, 200 μmol)を加え、室温で19時間撹拌した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 30：1 → 1：1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminooctanoate (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.83 (s, 4H), 2.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 2H), 1.47-1.34 (m, 8H).
【００５６】
N-(2-Azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (15) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxyethyl)benzamide (95.0 mg, 500 μmol) をDMF (5 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (148 μL, 1.0 mmol)、diphenylphosphorylazide (215 μL, 1.0 μmol) を加えた後、8時間撹拌した。室温で30分間撹拌した後、蒸留水 (5 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、N-(5-azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (18.0 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.90 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H).
【００５７】
N-(5-Azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (16) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (69.3 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (89 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 5：1 → 1：1) にて精製し、N-(5-azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (49.0 mg, 64%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.20 (s, 1H), 3.48-3.43 (m, 2H), 3.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.69-1.61 (m, 4H), 1.50-1.43 (m, 2H).
【００５８】
N-(8-Azidooctyl)-4-ethynylbenzamide (17) の合成
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (90 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、N-(8-azidooctyl)-4-ethynylbenzamide (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.17 (s, 1H), 1.74-1.24 (m, 12H).
【００５９】
1-(4-Ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole (18) の合成
N-(2-Azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、5時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(2-aminoethyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideを acetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 0：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole (37.2 mg, 80%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
【００６０】
1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (19) の合成
N-(5-Azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (40.1 mg, 150 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (59.5 mg, 225 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(5-aminopentyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (5 mL) に溶解した後、NaOMe (20.4 mg, 300 μmol)、maleic anhydride (29.4 mg, 300 μmol) を加え、6時間加熱還流した。蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 0：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (135 mg, 43%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
【００６１】
1-(4-Ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole (21) の合成
N-(8-Azidooctyll)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL)、蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(8-aminooctyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 10：1 → 2：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole (5.6 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.67 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 4.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.52-3.42 (m, 4H), 3.19 (s, 1H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.45-1.20 (m, 8H).
【００６２】
＜実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5のペプチドへの結合＞
以上のようにして合成した実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5を、トリペプチドの一種であるグルタチオン（還元型）のチオール基に修飾させた。反応式を化１２に示し、反応条件及び結果を表１に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
【００６３】
【化１２】
【００６４】
【表１】
【００６５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６７】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のEtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６８】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の DMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６９】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００７０】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００７１】
＜グルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物5修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物5修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１３に示し、反応条件及び結果を表２に示す。表２から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【００７２】
【化１３】
【００７３】
【表２】
【００７４】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７５】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７６】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７７】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (4 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７８】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７９】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。5分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００８０】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
【００８１】
Entry 8
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
【００８２】
＜実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3のペプチドへの結合＞
実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3をトリペプチドの一種であるグルタチオン（酸化型）のアミノ基に修飾させた。反応式を化１４に示し、反応条件及び結果を表３に示す。
【００８３】
【化１４】
【００８４】
【表３】
【００８５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８７】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８８】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８９】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９０】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９１】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９２】
Entry 8
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９３】
＜グルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１５に示し、反応条件及び結果を表４に示す。表４から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。また、還元性の強いアスコルビン酸ナトリウムを添加しているにもかかわらず、Ｓ−Ｓ結合は維持されることが分かった。
【００９４】
【化１５】
【００９５】
【表４】
【００９６】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、DMSO (16 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９７】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (10 μL) 溶液、DMSO (10 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９８】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９９】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【０１００】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０１】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０２】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０３】
＜実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3の生体分子への結合＞
実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3を14アミノ酸からなる生体ペプチド（ペプチドホルモン）であるソマトスタチンのアミノ基に修飾させた。反応式を化１６に示し、反応条件を表５に示す。また、UPLC-MSの測定結果を図１に示す。図１のUPLC-MSの測定結果より、モノ標識体及びジ標識体が生成していることが分かった。さらには、エドマン分解により、エチニル基含有環状イミド化合物3は N末端アミノ基よりリジン残基側鎖のアミノ基と優先的に反応することが分かった。
【０１０４】
【化１６】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０７】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０８】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。2時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０９】
＜ソマトスタチン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたソマトスタチン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１７に示し、反応条件及び結果を表６に示す。表６から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１１０】
【化１７】
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1896.8; observed mass [M+H]- 1896.3
【０１１３】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1915.8; observed mass [M+H]- 1916.6
【０１１４】
＜実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物19のペプチドへの結合＞
実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物19を、トリペプチドの一種であるグルタチオン（還元型）のチオール基に修飾させた。反応式を化１８に示し、反応条件及び結果を表７に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
【０１１５】
【化１８】
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (1.0 mg) の EtOH (100 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
【０１１８】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
【０１１９】
＜グルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物19修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物19修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化１９に示す。化１９から、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１２０】
【化１９】
【０１２１】
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 19/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 768.3; observed mass [M-H]- 769.6
【０１２２】
＜実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物12のペプチドへの結合＞
実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物12をトリペプチドの一種であるグルタチオン（酸化型）のアミノ基に修飾させた。反応式を化２０に示し、反応条件及び結果を表８に示す。
【０１２３】
【化２０】
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
【０１２６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
【０１２７】
＜グルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物12修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物12修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化２１に示す。化２１から、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１２８】
【化２１】
【０１２９】
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 12/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 989.3; observed mass [M-H]- 989.7
【０１３０】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明は、抗体、糖タンパク、酵素等を容易に化学修飾できることから、医療分野等における便利なツールとして利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドのアミノ残基やチオール基の修飾剤として好適に用いることができるエチニル基含有環状イミド化合物、並びに、それを用いたチオール基修飾剤及びそれを用いたアミノ基修飾剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬分野において、化学修飾の手法を用いてタンパク、核酸、生理活性物質等を蛍光物質で標識したり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることが行われている。このために、多くの化学修飾剤が開発されている。
【０００３】
化学修飾の手法としては様々なものがあるが、中でもHuisgen反応を利用した化学修飾方法が注目されている。Huisgen反応とは、有機アジド化合物とアルキン類とが［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール誘導体を与える反応をいう（下記化学式参照）。
【０００４】
【化１】
【０００５】
アルキン類が末端アルキンの場合、銅（Ｉ）イオンが触媒となり、選択的に１，４−二置換体が得られる。この反応は、他にアルコール、アミン、アミド、エステル、ハライドなど各種官能基があっても邪魔されず、目的のトリアゾールが高収率で得られる。反応溶媒もアルコール、一般的有機溶媒、水などの中で問題なく進行する。またアジド及びアルキンは各種有機化合物に導入が容易であり、反応後に余分な廃棄物を出さないという多くの利点を有している。このため、K.B.Sharplessらが提唱するクリック反応の代表例として、挙げられている。
【０００６】
本発明者らにおいても、オリゴヌクレオチド誘導体にエチニル基を導入し、さらに、このエチニル基と、ＰＥＴラベル化に適用できる元素で標識した有機アジド化合物とをHuisgen反応によって環化させてＰＥＴプローブ化することを提案している（特許文献１）。この方法によれば、迅速かつ簡単にＰＥＴプローブを製造できるため、半減期の短い18Ｆや11ＣによるＰＥＴラベル化法として注目されている。
【０００７】
また、Dirksらは、牛血清アルブミンのＳＨ基を足がかりにしてエチニル基を導入し、Huisgen反応による蛍光プローブ化を行っている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１９５６９８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dirks, A. J.; Cornelissen, J. J. L. M.; Nolte, R. J. M. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 1129-1138.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗体、ペプチド、糖タンパク、酵素等、多くの生体内物質はペプチド鎖を有しており、これらペプチド鎖に容易に修飾できる化学修飾剤があれば、医薬分野の研究において便利なツールとなるはずである。このため、ペプチドや酵素や抗体等を、簡単且つ短時間で容易に化学修飾することのできる修飾剤の開発が要請されている。
【００１１】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、ペプチドや酵素や抗体等、チオール基やアミノ基を有する化合物に対して、エチニル基を容易に導入することのできる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために、ペプチド鎖に存在するアミノ基を足がかりとしてエチニル基を導入し、その後、有機アジド化合物とHuisgen反応によって環化させることを考えた。このためのアミノ基の修飾方法として、Ｎ−アルキルスクシンイミドがアミノ基の修飾剤として用いられていることを利用し、スクシンイミドにエチニル基を導入しておき、アミノ基にスクシンイミドを介してエチニル基を導入することを計画し、鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、第１発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００１４】
【化２】
【００１５】
この一般式（１）のエチニル基含有環状イミド化合物は、ベンゼン環に結合したカルボニル炭素と、イミドの窒素に結合した酸素との間で結合が切断されやすいため、容易にアミノ基とカルボニル基との間でアミド結合を形成する（下記反応式参照）。このため、アミノ基にエチニル基を容易に導入することができる。さらに、第１発明のエチニル基含有環状イミド化合物のアミノ基への結合反応は、ジスルフィド結合に影響を与えることなく進行させることができる。このため、ペプチドやタンパク質において存在するジスルフィド結合に影響を与えることなく、アミノ基のみを選択的に修飾することができる。
【００１６】
【化３】
【００１７】
こうしてエチニル基を導入された付加化合物は、有機アジド化合物との間で容易に［３＋２］型の付加環化反応（すなわちHuisgen反応）が起こり、１，２，３−トリアゾール誘導体となる。ここで、有機アジド化合物として、蛍光性の官能基を導入したり、18Ｆや11Ｃによるラベル化された化合物を用いたりすれば、容易且つ短時間で、蛍光機能を発現させたり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることができる。
【００１８】
また、同様の考えから、発明者らは第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物を完成した。すなわち、第２発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００１９】
【化４】
【００２０】
さらに、本発明者は、ペプチド鎖に存在するチオール基を足がかりとしてエチニル基を導入し、その後、有機アジド化合物とHuisgen反応によって環化させることを考えた。このためのチオール基の修飾方法として、Ｎ−アルキルマレイミドがチオール基の修飾剤として用いられていることを利用し、マレイミドにエチニル基を導入しておき、チオール基にマレイミドを介してエチニル基を導入することを計画し、鋭意研究を行った結果、第３発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、第３発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（３）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００２２】
【化５】
【００２３】
この一般式（１）の環状イミド部分に存在する炭素−炭素二重結合へは、チオール基が容易にマイケル型の付加反応を行うことができる（下記反応式参照）。このため、ＳＨ基にエチニル基を容易に導入することができる。
【００２４】
【化６】
【００２５】
こうしてエチニル基を導入された付加化合物は、有機アジド化合物との間で容易に［３＋２］型の付加環化反応（すなわちHuisgen反応）が起こり、１，２，３−トリアゾール誘導体となる。ここで、有機アジド化合物として、蛍光性の官能基を導入したり、18Ｆや11Ｃによるラベル化された化合物を用いたりすれば、容易且つ短時間で、蛍光機能を発現させたり、ＰＥＴラベル化を図ったりすることができる。
【００２６】
また、同様の考えから、発明者らは第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物を完成した。すなわち、第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物は、下記一般式（４）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とする。
【００２７】
【化７】
【００２８】
第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素とすることができる。
【００２９】
また、第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位とすることもできる。この場合には、ベンゼン環に結合している３つの置換基が互いにメタ位となるため、たとえ、Ｒ３がアルキル基であっても、クリック反応時に立体的な障害を受けにくい。
【００３０】
さらに、第２及び第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、ｎは１以上１０以下であるとすることが好ましい。ｎが１０を超えるような長いエチレン鎖を有した場合、クリック反応時に立体的な障害を受けやすく、反応が進行し難くなるおそれがある。
【００３１】
また、第１〜第４発明のエチニル基含有環状イミド化合物において、Ｒ１及びＲ２は水素とすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3をソマトスタチンのアミノ基に修飾させた場合の反応液のUPLC-MSの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３３】
以下に示す合成ルートに従い、実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3、実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5、実施例３のエチニル基含有環状イミド化合物12−14及び実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物18−20を合成した。
【００３４】
[実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate）の合成ルート]
【００３５】
【化８】
【００３６】
[実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5（1-(4-Ethynylbenzyl)-2,5-dioxopyrrole）の合成ルート]
【００３７】
【化９】
【００３８】
[実施例３のエチニル基含有環状イミド化合物12（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate）、13（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl) aminopentanoate）、14（2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl) aminooctanoate）の合成ルート]
【００３９】
【化１０】
【００４０】
[実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物18（1-(4-Ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole）、19（1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole）、20（1-(4-Ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole）の合成ルート]
【００４１】
【化１１】
【００４２】
上記合成ルートにおける各段階の反応について、詳細に説明する。
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1) の合成
4-Iodobenzoic acid (2.5 g, 10.1 mmol)、bis(triphenylphosphine)palladium(II) dichloride (420 mg, 600 μmol)、CuI (230 mg, 12.1 mmol) をTHF (40 mL) とtriethylamine (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、trimethylsilylacetylene (2.5 mL, 15.0 mmol) を加え、室温で18 時間撹拌した。セライト濾過し、酢酸エチル (300 mL) で洗浄した。濾液を 1N 塩酸 (150 mL) 、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 1：1) にて精製し、4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (2.01 g, 91%) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.05 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 0.27 (s, 9H).
【００４３】
4-Ethynylbenzoic acid (2) の合成
4-(Trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.6 g, 7.33 mmol)、FK (2.44 g, 41.8 mmol) をMeOH (40 mL) と THF (20 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で17 時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 1：1) にて精製し、4-ethynylbenzoic acid (500 mg, 47 %) を赤褐色結晶として得た。1H NMR (DMSO-d6) δ 13.42 (s, 1H), 8.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.72 (s, 1H).
【００４４】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (3) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (181 mg, 1.28 mmol) を DMF (4 mL) に溶解した後、60 ℃ で撹拌しながら、N-hydroxysuccinimide (176 mg, 1.53 mmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (295 mg, 1.53 mmol)、4-dimethylaminopyridine (31.3 mg, 256 μmol) を加え、30分撹拌後、室温で12 時間撹拌した。蒸留水 (50 mL) を加え、桐山ろ過によりろ取し、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (227 mg, 73 %) を淡黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 8.11 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.34 (s, 1H), 2.90 (s, 4H).
【００４５】
4-Ethynylbenzyl alcohol (4) の合成
LiAlH4 (173 mg, 4.6 mmol) をTHF (45 mL) に懸濁し、0 ℃ で撹拌しながら4-(trimethylsilyl)ethynylbenzoic acid (1.0 g, 4.58 mmol) の THF (10 mL) 溶液を加え、2 時間加熱還流した。氷冷下で酒石酸ナトリウムカリウム飽和水溶液 (50 mL) を滴下し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 20：1 → 5：1) にて精製し、4-ethynylbenzyl alcohol (473 mg, 78 %) を黄褐色オイルとして得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.48 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.66 (s, 2H), 3.08 (s, 1H).
【００４６】
1-(4-Ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (5) の合成
Triphenylphosphine (85.1 mg, 324 μmol) を THF (2 mL) に溶解した後、-78 ℃ で撹拌しながら、diethyl azodicarboxylate (2.2 M in toluene, 140 μL, 308 μmol) を滴下した。5 分後、4-ethynylbenzyl alcohol (40.9 mg, 309 μ mol) のTHF (2 mL) 溶液を加え、5 分間撹拌した。maleimide (36.3 mg, 373 μmol) を加え、さらに5 分間撹拌した後、室温で24時間撹拌した。1N 塩酸 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 20：1 → 10：1 → クロロホルム：メタノール ＝100：1) にて精製し、1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (26.0 mg, 40%) を白色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.49 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 2H), 4.72 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.07 (s, 1H).
【００４７】
4-Ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (6) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (28.0 mg, 200 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (54.0 mg, 400 μmol)、 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (76.0 mg, 400 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。2-aminoethanol (30.3 μL, 400 μmol) を加え、室温で 20時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 5：1 → 1：10) にて精製し、4-ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (24.0 mg, 63 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.75 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.84 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.20 (s, 1H).
【００４８】
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (7) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (43.8 mg, 300 μmol)、N-hydroxybenzotriazole (61.1 mg, 450 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (86.3 mg, 450 μmol) をDMF (10 mL) に溶解した後、室温で6 時間撹拌した。5-aminopentan-1-ol (80.0 μL, 768 μmol) を加え、室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 10：1 → 2：3) にて精製し、4-ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (42.7 mg, 62 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.23 (s, 1H), 3.67 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.47 (dd, J = 13.2 Hz, 7.1 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.70-1.59 (m, 4H), 1.51-1.43 (m, 2H).
【００４９】
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (8) の合成
4-Ethynylbenzoic acid (154 mg, 1.0 mmol)、N-hydroxybenzotriazole (270 mg, 2.0 mmol) 及び1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (380 mg, 2.0 mmol) をDMF (30 mL) に加えた。室温で3 時間撹拌した後、8-aminooctan-1-ol (290 mg, 2.0 mmol) を加えた。室温で 17時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、4-ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (176 mg, 64 %) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.65-3.62 (m, 2H), 3.49-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.63-1.25 (m, 12H).
【００５０】
2-(4-Ethynylbenzamido)acetic acid (9) の合成
4-Ethynyl-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (56.8 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 50：1 → 5：1) にて精製し、2-(4-ethynylbenzamido)acetic acid (58.0 mg, 95%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 12.60 (s, 1H), 8.88 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 4.34 (s, 1H), 3.88 (d, J = 5.6 Hz, 2H).
【００５１】
5-(4-Ethynylbenzamido)pentanoic acid (10) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (693 mg, 3.0 mmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (93.8 mg, 600 μmol)、NaClO2 (687 mg, 6.0 mmol)、NaOCl (5% in H2O, 1.5 mL, 1.01 mmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (15 mL)とMeCN (15 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で11時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (150 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 1：0 → 5：1) にて精製し、5-(4-ethynylbenzamido)pentanoic acid (736 mg, 100%) を無色結晶として得た。1H NMR (DMSO) δ 11.99 (s, 1H), 8.53 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 4.35 (s, 1H), 3.24 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.23 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.52-1.51 (m, 4H).
【００５２】
8-(4-Ethynylbenzamido)octanoic acid (11) の合成
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol)、2,2,6,6-tetramethylpiperidine 1-oxyl (9.38 mg, 60 μmol)、NaClO2 (68.7mg, 600 μmol), NaOCl (5% in H2O, 0.15 mL, 100 μmol) をPhosphate Buffer (pH6.5) (1.5 mL)、MeCN (1.5 mL) の混合溶媒に溶解した後、室温で18時間撹拌した。氷冷下で蒸留水 (2 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した後、水層に1N 塩酸 (15 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム：メタノール = 10：0 → 5：1) にて精製し、8-(4-ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 72%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.17 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.18 (s, 1H), 2.36-2.33 (m, 2H), 1.68-1.57 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 8H).
【００５３】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate (12) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)acetic acid (21.0 mg, 100 μmol) をTHF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (48.0 mg, 300 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (57.0 mg, 300 μmol)を加え、5時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 10：1 → 3：1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminoacetate (7.5 mg, 27%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.72 (s, 1H), 4.24 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 3.80 (s, 4H), 3.20 (s, 1H).
【００５４】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (13) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)pentanoic acid (73.5 mg, 300 μmol) をDMF (5 mL) に加え、60 ℃ で撹拌しながらN-hydroxysuccinimide (41.4 mg, 360 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (69.0 mg, 360 μmol)、4-dimethylaminopyridine (7.3 mg, 60.1 μmol) を加えた後、30分間撹拌した。室温で11時間撹拌した後、蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 5：1 → 2：3) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (53.9 mg, 56%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.32 (s, 1H), 3.53-3.48 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.85 (s, 4H), 2.69 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 1.91-1.84 (m, 2H), 1.80-1.73 (m, 2H).
【００５５】
2,5-Dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminooctanoate (14) の合成
5-(4-Ethynylbenzamido)octanoic acid (62.0 mg, 200 μmol) をDMF (4 mL) に溶解した後、N-hydroxysuccinimide (28.0 mg, 240 μmol)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (46.0 mg, 200 μmol)を加え、室温で19時間撹拌した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 30：1 → 1：1) を行い、2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminooctanoate (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.72 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.16 (s, 1H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.83 (s, 4H), 2.61 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.78-1.74 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 2H), 1.47-1.34 (m, 8H).
【００５６】
N-(2-Azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (15) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxyethyl)benzamide (95.0 mg, 500 μmol) をDMF (5 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (148 μL, 1.0 mmol)、diphenylphosphorylazide (215 μL, 1.0 μmol) を加えた後、8時間撹拌した。室温で30分間撹拌した後、蒸留水 (5 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、N-(5-azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (18.0 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.90 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.44 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 3.18 (s, 1H).
【００５７】
N-(5-Azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (16) の合成
4-Ethynyl-N-(5-hydroxypentyl)benzamide (69.3 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃ で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (89 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 5：1 → 1：1) にて精製し、N-(5-azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (49.0 mg, 64%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.20 (s, 1H), 3.48-3.43 (m, 2H), 3.29 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.69-1.61 (m, 4H), 1.50-1.43 (m, 2H).
【００５８】
N-(8-Azidooctyl)-4-ethynylbenzamide (17) の合成
4-Ethynyl-N-(8-hydroxyoctyl)benzamide (82.0 mg, 300 μmol) をDMF (3 mL) に溶解した後、0 ℃で撹拌しながら1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (90 μL, 600 μmol)、diphenylphosphorylazide (130 μL, 600 μmol) を加えた後、60 ℃で4時間撹拌した。蒸留水 (3 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル = 30：1 → 1：1) にて精製し、N-(8-azidooctyl)-4-ethynylbenzamide (42.0 mg, 57%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.29 (s, 1H), 4.25-4.20 (m, 2H), 3.43-3.37 (m, 2H), 3.17 (s, 1H), 1.74-1.24 (m, 12H).
【００５９】
1-(4-Ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole (18) の合成
N-(2-Azidoethyl)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、5時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(2-aminoethyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideを acetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 0：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidoethyl)-2,5-dioxopyrrole (37.2 mg, 80%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
【００６０】
1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (19) の合成
N-(5-Azidopentyl)-4-ethynylbenzamide (40.1 mg, 150 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (59.5 mg, 225 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(5-aminopentyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (5 mL) に溶解した後、NaOMe (20.4 mg, 300 μmol)、maleic anhydride (29.4 mg, 300 μmol) を加え、6時間加熱還流した。蒸留水 (20 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 50：1 → 0：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (135 mg, 43%) を黄色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.73 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.66 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 3.56-3.53 (m, 2H), 3.47-3.42 (m, 2H), 3.19 (s, 1H), 1.73-1.61 (m, 4H), 1.40-1.33 (m, 2H).
【００６１】
1-(4-Ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole (21) の合成
N-(8-Azidooctyll)-4-ethynylbenzamide (29.0 mg, 100 μmol) をMeOH (3 mL) に溶解した後、triphenylphosphine (131 mg, 500 μmol) を加え、4時間加熱還流した。1N塩酸 (10 mL)、蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。水層を減圧留去して得られたN-(8-aminooctyl)-4-ethynylbenzamide hydrochlorideをacetic acid (3 mL) に溶解した後、NaOMe (13.6 mg, 200 μmol)、maleic anhydride (19.6 mg, 200 μmol) を加え、4時間加熱還流した。蒸留水 (10 mL) を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン：酢酸エチル ＝ 10：1 → 2：1) で精製し、1-(4-ethynylbenzamidooctyl)-2,5-dioxopyrrole (5.6 mg, 17%) を無色結晶として得た。1H NMR (CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.55 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.67 (s, 2H), 6.15 (s, 1H), 4.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.52-3.42 (m, 4H), 3.19 (s, 1H), 1.64-1.54 (m, 4H), 1.45-1.20 (m, 8H).
【００６２】
＜実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5のペプチドへの結合＞
以上のようにして合成した実施例２のエチニル基含有環状イミド化合物5を、トリペプチドの一種であるグルタチオン（還元型）のチオール基に修飾させた。反応式を化１２に示し、反応条件及び結果を表１に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
【００６３】
【化１２】
【００６４】
【表１】
【００６５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６７】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のEtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６８】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の DMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００６９】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) の EtOH (15 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００７０】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブにGlutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 8.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 517.5; observed mass [M-H]- 516.2
【００７１】
＜グルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物5修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物5修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１３に示し、反応条件及び結果を表２に示す。表２から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【００７２】
【化１３】
【００７３】
【表２】
【００７４】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７５】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７６】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７７】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (4 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７８】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００７９】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。5分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 651.2; observed mass [M+H]+ 653.9
【００８０】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
【００８１】
Entry 8
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 5/Milli-Q water (10 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (2 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]+ 668.2; observed mass [M+H]+ 672.1
【００８２】
＜実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3のペプチドへの結合＞
実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3をトリペプチドの一種であるグルタチオン（酸化型）のアミノ基に修飾させた。反応式を化１４に示し、反応条件及び結果を表３に示す。
【００８３】
【化１４】
【００８４】
【表３】
【００８５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のEtOH (50 μL) およびacetone (50 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８７】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８８】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００８９】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９０】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９１】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９２】
Entry 8
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (0.7 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 25 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 739.2; observed mass [M-H]- 737.9
【００９３】
＜グルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１５に示し、反応条件及び結果を表４に示す。表４から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。また、還元性の強いアスコルビン酸ナトリウムを添加しているにもかかわらず、Ｓ−Ｓ結合は維持されることが分かった。
【００９４】
【化１５】
【００９５】
【表４】
【００９６】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (4 μL) 溶液、DMSO (16 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９７】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (10 μL) 溶液、DMSO (10 μL)、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９８】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【００９９】
Entry 4
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM benzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 867.2; observed mass [M-H]- 867.4
【０１００】
Entry 5
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０１】
Entry 6
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、20 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (20 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０２】
Entry 7
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 891.2; observed mass [M-H]- 889.5
【０１０３】
＜実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3の生体分子への結合＞
実施例１のエチニル基含有環状イミド化合物3を14アミノ酸からなる生体ペプチド（ペプチドホルモン）であるソマトスタチンのアミノ基に修飾させた。反応式を化１６に示し、反応条件を表５に示す。また、UPLC-MSの測定結果を図１に示す。図１のUPLC-MSの測定結果より、モノ標識体及びジ標識体が生成していることが分かった。さらには、エドマン分解により、エチニル基含有環状イミド化合物3は N末端アミノ基よりリジン残基側鎖のアミノ基と優先的に反応することが分かった。
【０１０４】
【化１６】
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０７】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０８】
Entry 3
1.5 mL エッペンドルフチューブにsomatostatin (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (33.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl 4-ethynylbenzoate (148 μg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。2時間後に反応溶液 10 μL を取り出し、0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後B conc. 30%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加ソマトスタチンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1765.0; observed mass [M+H]- 1764.7
【０１０９】
＜ソマトスタチン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたソマトスタチン−エチニル基含有環状イミド化合物3修飾体について、アジド化合物とのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式を化１７に示し、反応条件及び結果を表６に示す。表６から、反応条件を適切に選択することにより、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１１０】
【化１７】
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM benzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1896.8; observed mass [M+H]- 1896.3
【０１１３】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM somatostatin labelled with 3/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL)、DMSO (16 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、5分後 B conc. 30%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M+H]- 1915.8; observed mass [M+H]- 1916.6
【０１１４】
＜実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物19のペプチドへの結合＞
実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物19を、トリペプチドの一種であるグルタチオン（還元型）のチオール基に修飾させた。反応式を化１８に示し、反応条件及び結果を表７に示す。適切に反応条件を選べば、短時間かつ高収率で反応が進行することが分かった。
【０１１５】
【化１８】
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の 0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (100 μL) 溶液と1-(4-Ethynylbenzamidopentyl)-2,5-dioxopyrrole (1.0 mg) の EtOH (100 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
【０１１８】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (reduced form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 6.0) (100 μL) 溶液と1-(4-ethynylbenzyl)-1H-pyrrole-2,5-dione (0.7 mg) のDMSO (33.5 μL) 溶液を加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。また1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、上記と同様にHPLCにより分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 616.2; observed mass [M-H]- 614.2
【０１１９】
＜グルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物19修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン（酸化型）−エチニル基含有環状イミド化合物19修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化１９に示す。化１９から、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１２０】
【化１９】
【０１２１】
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (reduced form) labelled with 19/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 768.3; observed mass [M-H]- 769.6
【０１２２】
＜実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物12のペプチドへの結合＞
実施例４のエチニル基含有環状イミド化合物12をトリペプチドの一種であるグルタチオン（酸化型）のアミノ基に修飾させた。反応式を化２０に示し、反応条件及び結果を表８に示す。
【０１２３】
【化２０】
【０１２４】
【表８】
【０１２５】
Entry 1
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
【０１２６】
Entry 2
1.5 mL エッペンドルフチューブにglutathione (oxidized form) (1.0 mg) の0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (35.5 μL) 溶液と2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-(4-ethynylbenzoyl)aminopentanoate (0.6 mg) のDMSO (100 μL) 溶液を加えた後、一緒にボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。1時間後に0.45 μmのフィルターで濾過し、300 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後B conc. 50%、30 分後B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでエチニルベンゼンモノ付加還元型グルタチオンを得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 823.2; observed mass [M-H]- 837.9
【０１２７】
＜グルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物12修飾体の高速クリック（Huisgen）反応＞
上記のようにして得られたグルタチオン−エチニル基含有環状イミド化合物12修飾体について、フルオロベンジルアジドとのクリック（Huisgen）反応を行った。反応式、反応条件及び結果を化２１に示す。化２１から、室温において短時間かつ高収率でクリック（Huisgen）反応が起こることがわかった。
【０１２８】
【化２１】
【０１２９】
1.5 mL エッペンドルフチューブに0.1 M Phosphate Buffer (pH 7.0) (116 μL)、MeCN (22 μL)、10mM glutathione (oxidized form) labelled with 12/Milli-Q water (2 μL)、10 mM 4-fluorobenzylazide/DMSO (0.4 μL) 溶液、100 mM sodium ascobate (20 μL)、100 mM CuSO4 (20 μL) を順に加えた後、ボルテックスミキサーで撹拌し、スピンダウンして静置した。15分後に 0.45μm のフィルターで濾過し、450 μL の滅菌水で洗いこみした後、HPLC (C-18カラム、λ= 260 nm、A 液：0.1 % TFA/Milli-Q water、B 液：0.1 % TFA/MeCN、binary gradient：初期B conc. 0%、25分後 B conc. 50%、30 分後 B conc. 0%、終了までB conc. 0%) により分取することでクリック付加体を得た。
MALDI-TOF/MS calculated mass [M-H]- 989.3; observed mass [M-H]- 989.7
【０１３０】
この発明は上記発明の実施の態様及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
本発明は、抗体、糖タンパク、酵素等を容易に化学修飾できることから、医療分野等における便利なツールとして利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化１】
【請求項２】
下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化２】
【請求項３】
下記一般式（３）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化３】
【請求項４】
下記一般式（４）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化４】
【請求項５】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項６】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項７】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項２又は４に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項９】
請求項１又は２のエチニル基含有環状イミド化合物からなるアミノ基修飾剤。
【請求項１０】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項９に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１１】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項９又は１０に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１２】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１３】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１項記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１４】
請求項３又は４のエチニル基含有環状イミド化合物からなるチオール基修飾剤。
【請求項１５】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項１４項に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１６】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１７】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか１項記載のチオール基修飾剤。
【請求項１】
下記一般式（１）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化１】
【請求項２】
下記一般式（２）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化２】
【請求項３】
下記一般式（３）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化３】
【請求項４】
下記一般式（４）（ただしＲ１及びＲ２は水素又はアルキル基を示し、Ｒ３は水素、アルキル基、アルコキシ基又はハロゲンを示す）で表されることを特徴とするエチニル基含有環状イミド化合物。
【化４】
【請求項５】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項６】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項７】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項２又は４に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項８】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のエチニル基含有環状イミド化合物。
【請求項９】
請求項１又は２のエチニル基含有環状イミド化合物からなるアミノ基修飾剤。
【請求項１０】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項９に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１１】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項９又は１０に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１２】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項９乃至１１のいずれか１項に記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１３】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１項記載のアミノ基修飾剤。
【請求項１４】
請求項３又は４のエチニル基含有環状イミド化合物からなるチオール基修飾剤。
【請求項１５】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基はエチニル基に対してパラ位であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする請求項１４項に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１６】
ベンゼン環に結合しているカルボニル基及びＲ３はエチニル基に対してメタ位であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１７】
ｎは１以上１０以下であることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載のチオール基修飾剤。
【請求項１８】
Ｒ１及びＲ２は水素であることを特徴とする請求項１４乃至１７のいずれか１項記載のチオール基修飾剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１８８４２０（Ｐ２０１２−１８８４２０Ａ）
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−３７８２９（Ｐ２０１２−３７８２９）
【出願日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月４日（２０１２．１０．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年２月２３日（２０１２．２．２３）
【出願人】（３０４０１９３９９）国立大学法人岐阜大学 (289)
【Ｆターム（参考）】
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