エリシペロトリックス属のその他の菌種である血清型１８由来の豚丹毒菌感染防御活性を有する新規ポリペプチドとその遺伝子および製法
【課題】豚丹毒感染症予防用ワクチン等の医薬品組成物の主成分として利用するため、豚に免疫したときに高い安全性と優れた有効性を示す組換えポリペプチドとその製造法を提供する。
【解決手段】SpaC（エリシペロトリックス 属のその他の菌種に属する血清型18菌由来の表層防御抗原ポリペプチド）及びそのカルボキシル末端に存在する237アミノ酸を除去した部分ポリペプチド（SpaCΔC）を作製することにより、豚に対して高い安全性と優れた有効性を示す防御抗原を提供できる。
【効果】該成分は組換えポリペプチドとして大量に発現され、提供した製造方法により容易に調製することが可能である。SpaC及びSpaCΔCポリペプチドは、豚丹毒感染症の予防のためのワクチンの成分として、および豚丹毒に対する抗体測定のための抗原として有用に利用することができる。
【解決手段】SpaC（エリシペロトリックス 属のその他の菌種に属する血清型18菌由来の表層防御抗原ポリペプチド）及びそのカルボキシル末端に存在する237アミノ酸を除去した部分ポリペプチド（SpaCΔC）を作製することにより、豚に対して高い安全性と優れた有効性を示す防御抗原を提供できる。
【効果】該成分は組換えポリペプチドとして大量に発現され、提供した製造方法により容易に調製することが可能である。SpaC及びSpaCΔCポリペプチドは、豚丹毒感染症の予防のためのワクチンの成分として、および豚丹毒に対する抗体測定のための抗原として有用に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリシペロトリックス属のその他の菌種である血清型１８由来の感染防御活性をもつ新規ポリペプチドとこれをコードする遺伝子および該ポリペプチドに対する抗体に関する。更に詳細には、免疫したときに豚丹毒を予防するワクチン等の医薬品組成物を提供するための免疫原としてのポリペプチドとその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚丹毒は、豚丹毒菌を原因とする豚の伝染性疾患である。罹患豚は、急性に経過して急死する敗血症型、特徴的な蕁麻疹を呈する亜急性型、および明瞭な臨床症状は呈さないが、しばしば食肉処理場で発見されて問題となる心内膜炎型および関節炎型等の多様な病態を示す。急性型の発生例では高い死亡率が問題となる。一方、慢性型においては発育の遅延等による生産性の低下のほか、食肉処理場において本症が発見された場合には屠体が全部廃棄されるため、その経済的被害は多大となる。また、本菌はヒトに感染して類丹毒症を引き起こす例もあることから、人獣共通感染症の原因菌として公衆衛生面からも問題とされる。
【０００３】
豚丹毒菌は、菌体細胞壁に存在するペプチドグリカン中の耐熱性抗原の血清学的型別から現在２６種類の血清型と、その抗原を欠くＮ型に分類されている。近年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（非特許文献１）はＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を用いた分類法を応用し、これらの血清型菌は４つの菌種に分けられることを提言した。すなわち、血清型１ａ、１ｂ、２、４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、１７、１９、２１およびＮ型をＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（以下「Ｅｒ」と略称する）に、血清型３、７、１０、１４、２０、２２および２３をＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ（以下「Ｅｔ」と略称する）に、血清型１３をその他のエリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属菌種１に、血清型１８をその他のエリシペロトリックス属菌種２に分類した。疫学調査から、豚に強い病原性を示す菌種はＥｒで、この中でも特に１ａ， １ｂおよび２型が豚丹毒症例からの分離率が高い。けれども、感染実験の結果からすると、Ｅｒの各血清型菌はすべて豚に対する病原性を有しているとされる。
【０００４】
本症の予防のために、わが国では生ワクチンが長く用いられ、その防圧に貢献してきた。生ワクチン株は、血清型１ａの強毒株であるＫｏｇａｎｅｉ株を、アクリフラビンを添加した培地で長期継代することによって弱毒化したものである。けれども、最近、食肉処理場での慢性型豚丹毒の摘発例が増加傾向となっており、次のような生ワクチンの弱点が指摘されるようになった。第一に、生ワクチンは移行抗体および抗菌剤の使用によりワクチンテイクが阻害されるため、農場によってはワクチン効果が十分発揮できないケースがある。第二に、最近の飼養形態の変化に伴ってＳＰＦ豚等の衛生状態のよい動物が多く飼養されるようになり、このような豚に本ワクチンを接種した場合、ワクチン株自体の病原性によって発症する例も認められるようになった。
【０００５】
このような豚丹毒生ワクチンの弱点を克服するため、１９９７年、わが国において初めて不活化ワクチンの製造が承認され、使用されるに至った。このように、不活化ワクチンには生ワクチンに比べて多くの利点があるものの、Ｅｒ自体を培養して製造するためコスト高となること、および豚に使用される他のワクチンと混合したとき他の成分と干渉作用を起こしやすく、混合製剤の開発が困難であるなどの問題点がある。従って、Ｅｒから、感染防御に関係した抗原ポリペプチドだけを抽出・精製したコンポーネントワクチンが最も望ましく、コスト面から考えると、組換え体を用いて生産することが好ましい。
【０００６】
本菌の感染防御を誘導する抗原に関しては、６５−７０ ｋＤａ の分子量をもつＳｐａＡとよばれる菌体表層に存在するポリペプチドが知られている。Ｅｒ血清型２型由来の当該遺伝子（ｓｐａＡ）はＭａｋｉｎｏら（非特許文献２）により、血清型１の遺伝子についてはＳｈｉｍｏｊｉら（非特許文献３）およびＩｍａｄａら（非特許文献４）により解析され、その配列が明らかにされている。組換え大腸菌により発現されたＳｐａＡポリペプチドで免疫されたマウスおよび豚は、Ｅｒ生菌による致死的な攻撃から発症が防御されることが明らかにされている。従って、このＳｐａＡポリペプチドは、豚丹毒症の予防ワクチンの重要な成分になり得るものと考えられる。一方で、このＳｐａＡポリペプチドの防御活性はＥｒ血清型１および２に対してしか実証されておらず、野外に常在しているその他のＥｒ血清型菌の攻撃に対し、同様の防御活性を示すかどうかについては不明である。ワクチンに利用する抗原ポリペプチドとしては、様々なＥｒ血清型菌に対して幅広くかつ高度な防御活性をもつもののほうがより好ましい。
【０００７】
Ｍａｋｉｎｏらの報告によると、ｓｐａＡ遺伝子はＥｒの１６血清型のうち１１の血清型菌（１ａ， １ｂ， ２， ５， ８， ９， １２， １５， １６， １７およびＮ）に存在し、残りの血清型菌（４，６，１１，１９および２１）には認められないとした。そこで、本特許において発明者らは、Ｅｒの残りの血清型菌に加えて、その他のエリシペロトリックス属菌種（血清型１８）にもｓｐａ遺伝子が存在することを見出した。そして、これらの遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を調べると、Ｅｒおよびその他のエリシペロトリックス属菌種には、お互いに６０％程度の低い相同性をもった３種類のＳｐａが存在することを見出した。そして、特に、その他のエリシペロトリックス属菌種（血清型１８）の有するＳｐａは、多様な血清型菌の感染に対し最も幅広い防御活性を有することを見出した。従って、今回発見された新しいＳｐａは、豚丹毒予防ワクチンの有用な成分となることが示され、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】J.Syst.Bacteriol., 42, 469-437, 1992
【非特許文献２】Microb.Pathog., 25, 101-109, 1998
【非特許文献３】Infect.Immun., 67, 1646-1651, 1999
【非特許文献４】Infect.Immun., 67, 4376-4382, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い安全性と優れた有効性を有するＥｒの多数の血清型に対して防御抗原活性を示すポリペプチド、およびその製造方法を提供することである。本発明の別の目的は、上記ポリペプチドを豚丹毒感染症予防のためのサブユニットワクチンの成分として利用すること、ならびにＥｒに対する抗体測定および診断に用いる抗原に使用することである。
【０００９】
このため、本発明者らは、（ａ）Ｅｒ各血清型参考株、特にｓｐａＡ遺伝子の存在の知られていない血清型４，６，１１，１９および２１ならびにその他のエリシペロトリックス属菌種よりＳｐａ関連遺伝子をクローン化すること、（ｂ）それらの全塩基配列を決定し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列に基づいて相同性検索を行うことによりＳｐａ関連ポリペプチドの分類を行なうこと、（ｃ）分類されたＳｐａ関連遺伝子の全長を発現ベクターに組込み、その組換えポリペプチドを発現・精製する。これをマウスに免疫し、交差防御試験により最も幅広い防御スペクトルをもつポリペプチドを選定すること、（ｄ）選択したＳｐａポリペプチドにつき、最も発現量が多く、収量に優れた部分断片を特定すること、（ｅ）得られたポリペプチドをワクチンの成分として実際に豚に免疫し、Ｅｒの生菌で攻撃して感染・発症防御効果を確認すること、ならびに（ｆ） 当該ポリペプチドを用いて、免疫した豚の抗体を測定すること、等を目的として鋭意研究を行なってきた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
その結果、本発明者らは、ｓｐａＡ遺伝子の塩基配列を元に、改変したＤＮＡプライマーを合成し、ｓｐａＡの存在が知られていなかったＥｒの血清型４，６，１１，１９および２１参考株、およびその他のエリシペロトリックス属菌種２に属する血清型１８菌株にもＳｐａ関連遺伝子が存在することを確認した。そこで、すべてのＥｒ各血清型参考株のＳｐａ関連遺伝子をそれぞれベクターＤＮＡにクローン化し、それらの全塩基配列を決定したところ、血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、９、１２、１５、１６、１７およびＮが保有するｓｐａＡ遺伝子、血清型４、６、１１、１９および２１が保有する別のＳｐａ関連遺伝子（ｓｐａＢと名づけた）、および血清型１８が保有するさらに別のＳｐａ関連遺伝子（ｓｐａＣと名づけた）の３種類の遺伝子が存在することを見出した。次に、ｓｐａＡ、ｓｐａＢおよびｓｐａＣ 遺伝子をそれぞれ大腸菌で発現させ、各Ｓｐａポリペプチドでマウスを免疫した。これに対し、それぞれ異なるＳｐａをもつＥｒ血清型菌により攻撃して交差防御試験を行ったところ、ＳｐａＣポリペプチドが最も幅広い血清型菌に対して防御効果を示すことが判明した。次に、大腸菌内でのＳｐａＣポリペプチドの発現量を向上させる目的で、Ｃ末端付近の２３７アミノ酸を除去した新たな欠失変異ポリペプチド（ＳｐａＣΔＣと名づけた）を構築した。その結果、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは全長のＳｐａＣポリペプチドに比べて、大腸菌内での発現量は約１０倍上昇し、タンパク量あたりの防御活性も、ＳｐａＣポリペプチドと変わらなかった。このことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、全長のＳｐａＣに比べて、豚丹毒予防ワクチンの成分としてより好適であることが判明した。また、当該ポリペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡを行なうことによって、免疫豚の血清中のＳｐａポリペプチドに対する抗体が検出されたことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドはＥｒに対する抗体を検出するための抗原としても有用であることがあわせて示され、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を要点とするものである。
（１） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すポリペプチド。
（ａ） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド、
（ｃ） 配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ） 配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド。
【００１２】
（２） （１）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１３】
（３） 配列表の配列番号２および４に示すヌクレオチド配列を有する、（２）に記載のＤＮＡ。
【００１４】
（４） （２）に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【００１５】
（５） （４）に記載の発現ベクターによりＥｒの感染防御免疫活性を有するポリペプチドを生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【００１６】
（６） （５）に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に（１）に記載のポリペプチドを生産させ、該ポリペプチドを精製することを特徴とする（１）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１７】
（７） （１）に記載のポリペプチドを成分として含有することを特徴とする豚丹毒症に対する予防ワクチン。
【００１８】
（８） （１）に記載のポリペプチドを認識することを特徴とするモノクローナルおよびポリクローナル抗体。
【００１９】
（９） （１）に記載のポリペプチド、（２）に記載のＤＮＡ、（５）に記載の形質転換体または（８）に記載の抗体を用いることを特徴とするＥｒの検出方法、抗体検査方法および豚丹毒症の診断試薬。
【発明の効果】
【００２０】
本願の請求項１の発明によれば、豚に免疫したときにＥｒ強毒株の攻撃に対し感染、発病を完全に防御するポリペプチドを得ることができ、請求項７に記載した豚丹毒に対するワクチンとして用いることができる医薬品組成物を提供することができる。
【００２１】
また、請求項２の発明によれば、このポリペプチドをコードする遺伝子が得られ、請求項４、５および６の遺伝学的手法により発現させることで、当該ポリペプチドを単純工程で大量かつ安価に製造することができる。
【００２２】
更に請求項８および９の発明によれば、請求項１に示したポリペプチドに特異的な抗体を得、これを用いて豚丹毒の診断あるいはワクチン接種豚の免疫状態を把握するための抗体検出を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドはＥｒに対する感染防御免疫を誘導する上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定する例えば配列番号１および３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体を提供する。配列番号１に示したＳｐａＣポリペプチドはその他のエリシペロトリックス属菌種２血清型１８に特異的な分子量７６ ｋＤａのポリペプチドである。本ポリペプチドは、これをコードする配列番号２に示したＤＮＡをもとに、種々の方法によりポリペプチドに翻訳することによって得られる。
【００２４】
配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＳｐａＣΔＣポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドのうち、Ｎ末端から４２７アミノ酸の部分で、すなわち、ＳｐａＣポリペプチドのＣ末端の２３７アミノ酸を欠失した２７ｋＤａの分子量をもつ欠失変異体である。本ポリペプチドは、ＳｐａＣポリペプチドのＣ末端領域に位置する菌体表層へのアンカリング領域と疎水性領域の一部を除去し、感染防御免疫に関係する領域のみに限定したものである。このＳｐａＣΔＣポリペプチドは、大腸菌等の形質転換体を利用して遺伝子からポリペプチドに翻訳する際、全長のＳｐａＣに比べてその翻訳効率が非常に高いという利点をもつ。加えて、ＳｐａＣΔＣポリペプチドのタンパク量当たりの防御免疫誘導能は、ＳｐａＣポリペプチドと同等である。本ポリペプチドは、これをコードする配列番号４に示したＤＮＡを種々の方法により翻訳することで得られる。
【００２５】
本発明のポリペプチドには、配列番号１および３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染防御免疫誘導能を示すポリペプチドも含まれる。このような変異の仕方に制限はないが、例えば配列番号１および２に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異などの技術を用いて人工的に変異ＤＮＡを作製し、これをポリペプチドに翻訳することにより得る事ができる。また、血清型１８の他の菌株からｓｐａＣ遺伝子をクローン化して翻訳したとき、自然に配列番号１および３と数個のアミノ酸の異なるポリペプチドが得られるかもしれないが、これも本発明に包括される。さらに、配列番号３に示すＳｐａＣΔＣポリペプチドはＳｐａＣをもとにＣ末端の２３７アミノ酸を欠失した変異体であるから、実際にはＳｐａＣからＳｐａＣΔＣの間にあるＣ末端の１〜２３７個のアミノ酸欠失変異体もすべて本発明に包括される。本発明に包括されるポリペプチドを別に表現すると、配列番号１および３のアミノ酸配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に９５％以上であるべきである。
【００２６】
＜２＞ 本発明ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定する配列番号１および３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体をコードするＤＮＡを提供する。好適実施態様により、該ＤＮＡは配列番号２および４に示す塩基配列を有するＤＮＡである。本発明のＤＮＡはその他のエリシペロトリックス属菌種２の好ましくは血清型１８の染色体ＤＮＡからクローン化することにより得ることができる。例えば、当該菌の染色体ＤＮＡからゲノムライブラリーを作製し、各クローンを大腸菌等の宿主に形質転換してコードするポリペプチドを宿主内に発現させ、該ポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてこの発現ライブラリーをスクリーニングする方法、あるいは配列番号２または４の塩基配列の一部を含むＤＮＡに放射性化合物やＤＩＧ等で標識し、これをプローブとしてハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得る事ができる。また、別の方法として、配列番号２または４の配列の一部をオリゴヌクレオチドプライマーとし、当該菌の染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ない、増幅したＤＮＡ断片をベクターＤＮＡにクローン化する方法も可能である。また、配列番号２または４の塩基配列をもとに、ＤＮＡ合成機を用いて、直接化学的に配列を合成することも可能である。
【００２７】
請求項２または３に規定されるＤＮＡは、配列番号２または４に示す塩基配列において複数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＥｒに対する感染防御免疫を誘導する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。このような変異の仕方に制限はないが、例えば配列番号２または４に示す塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異技術などを用いて人工的に変異ＤＮＡを作製することができる。また、その他エリシペロトリックス属菌種２ 血清型１８の他の菌株由来のｓｐａＣ遺伝子は、配列番号２と複数個の塩基が置換されている可能性がある。また、配列番号４は配列番号２の３’末端の７１４塩基対を欠失したものであるので、この欠失が１個から７１４個の範囲にあるものは本発明に含有される。配列番号２および４との塩基配列の相同性で言えば、上記変異体は７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に９５％以上の相同性を有しているべきである。これら変異ＤＮＡは、例えば、５０％ホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション溶液中で、３７℃下といったストリンジェントな条件下で、配列番号２または４のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして例示することができる。
【００２８】
＜３＞ 本発明のベクター、形質転換体および形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法
本発明は、本発明ＤＮＡをベクターに組み込むことにより得られる組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを形質転換することにより得られた形質転換体、およびこの形質転換体を培養し、得られた培養液からＳｐａＣまたはＳｐａＣΔＣポリペプチドを回収することを特徴とする該ポリペプチドの製造法を提供する。
【００２９】
請求項（２）および（３）に規定されるｓｐａＣおよびｓｐａＣΔＣ遺伝子とその変異体遺伝子を形質転換する際、原核または真核生物である宿主細胞において自立複製または染色体中への組み込みが可能なものを選択することができる。例えば、原核細胞用としてpUCシリーズ（宝酒造社製）、pQEシリーズ（プロメガ社製）、pBluescriptIIシリーズ（ストラタジーン社製）、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン社製）、pHY300PLK（宝酒造社製）など、酵母用ベクターとしてｐＳＧ５（ストラタジーン社製）、pBPV（ファルマシア社製）など、動物細胞用としてpcDM8（フナコシ社製）、pREP4（インビトローゲン社製）など、昆虫細胞用としてpBlueBacIII（インビトローゲン社製）など、植物細胞用として、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどを例示することができるが、これらに限定されない。勿論、必要に応じて、市販または文献記載のベクターを任意に改変することも可能であろう。
【００３０】
形質転換体は、本発明ＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換することにより得ることができる。宿主細胞には、例えば原核生物としてエシェリシア属、バチルス属などの微生物、真核生物としてサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピチア属などの酵母類、ヒト胎児腎細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ〉細胞などの哺乳動物細胞、バキュロウイルス感受性昆虫細胞および昆虫体などがあげられる。形質転換法としては、以下のものに限定されないが、塩化カルシウム法、燐酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法，リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などを用いることができる。
【００３１】
形質転換された宿主細胞を培養し、発現ベクターに組込まれた目的ＤＮＡを発現させ、タンパク質精製に関する公知の方法を利用してＳｐａＣ、ＳｐａＣΔＣおよびその変異ポリペプチドを分離・精製することができる。通常、超音波処理、ホモジナイザー処理および高圧圧縮処理等により宿主細胞を破壊して抽出液を得、この抽出液から、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などの方法を組合せることによって、分離・精製された当該ポリペプチドを得ることができる。
【００３２】
〈４〉本発明ポリペプチドを成分とする豚丹毒予防ワクチン、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに抗体を用いた菌検出方法および抗体検査方法
本発明により得られるポリペプチドは、豚丹毒症の対象動物である豚および実験動物に免疫することにより、該動物の血液中に該ポリペプチドに対する抗体が誘導され、その抗体の作用によって該動物はＥｒの強毒菌での攻撃に対し、感染および発病から防御される。このような効果により、該ポリペプチドを豚丹毒症に対するワクチンとして利用することができる。また、該ポリペプチドは上記のように高い免疫原性を有することから、種々の動物に対して抗体産生が可能で、血清中に産生された抗体はポリクローナル抗体として、免疫マウスの脾細胞を元に得られたハイブリドーマの産生する抗体はモノクローナル抗体として、それぞれ利用することができる。このポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、Ｅｒ特異的に反応することから、種々の抗原抗体反応を応用することにより、感染動物からのＥｒの検出、感染および免疫動物中に産生されたＥｒに対する抗体の検出および定量に応用することができる。
【００３３】
ワクチン製剤に使用する場合の該ポリペプチドの単回投与量は、通常１μｇタンパク量以上、好ましくは１０μｇタンパク量以上、より好ましくは１００μｇタンパク量以上、特に１００μｇから１０００μｇタンパク量である。ポリペプチドをワクチンとする場合、その抗体応答をさらに高めるため、免疫賦活剤（アジュバント）を加えることが好ましい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、植物性または鉱物性油脂と界面活性剤との混合物等を使用することができ、それぞれのアジュバントの特性に従った免疫刺激可能量で配合される。
【００３４】
また、本発明のワクチン製剤には、本発明ポリペプチドの他に、抗原性を有する物質を混合してもよい。例えば、豚由来病原性細菌または病原ウイルス由来抗原が好適であり、より具体的には、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopeumoniae）、アクチノバシラス・ブルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、ヘモフィルス・バラスイス（Haemophilus parasuis）、大腸菌（Esherichia coli）、サルモネラ・コレレエスイス（Salmonella choleraesuis）、連鎖球菌（Streptococcus suis）、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、豚パルボウイルス（porcine parvovirus）、豚サーコウイルス（porcine circovirus）、豚インフルエンザウイルス（swine influenza virus）、オーエスキー病ウイルス（Aujesky’s disease virus）等を挙げることができる。病原体由来抗原とは、当該菌またはウイルスそのもの、あるいは当該菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子をもとに大腸菌やバキュロウイルス等の他の生物で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００３５】
ワクチン効果の評価は、マウス等の実験動物、あるいは対象動物である豚を用いた免疫・攻撃試験により行うことができるが、例えば次のようにしてもよい。該ポリペプチドをアジュバントと混合し、豚の頚部筋肉内に３〜４週間隔で１ ｍＬずつ２回注射する。対照群は非免疫とする。２回目注射後２週にＥｒ強毒菌の生菌を皮内に注射することにより攻撃し、攻撃後約１週間観察する。ワクチン注射群および対照群の死亡数、豚丹毒症の臨床症状の発現頭数を比較したとき、ワクチン注射群の方が対照群に比べて有意に少ないことでワクチンの効果を判定することができる。マウスを用いて評価する場合は、該ポリペプチドをアジュバントと混合したものを０．２ ｍＬずつ３週間隔で２回皮下に注射する。対照群は非免疫とする。２回注射後２週にＥｒ強毒菌の生菌を各マウスの皮内に注射することにより攻撃し、攻撃後約２週間観察する。ワクチン注射群の死亡数は対照群に比べて有意に少ないことから、ワクチンの効果を判定することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして得られる。該ポリペプチドをアジュバントと混合し、ウサギの背部皮下に２〜４週間隔で３〜５回免疫する。最終免疫から２〜３週後に全採血して免疫血清を得る。この血清から、硫安分画法または市販の抗体精製キットを用いてイムノグロブリン分画を採取することによりポリクローナル抗体が得られる。本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして得られる。上記のようにして免疫したマウスから脾臓細胞を回収し、常法（MONOCLONAL ANTIBODYTECHNOLOGY, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1984）に従ってマウスミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）を作製する。この中から、該ポリペプチドに対する抗体産生が確認されたハイブリドーマをスクリーニングし、さらにその細胞株をクローニングしたのち、その細胞株の培養上清から、あるいは細胞株を移植されたヌードマウスの腹水から先に述べた方法によりイムノグロブリン分画を採取することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、豚丹毒罹患豚および豚丹毒ワクチン免疫豚の血清中に存在する抗体の検出および定量に応用することができる。その抗体測定結果は、豚丹毒症の診断、あるいは豚丹毒ワクチン注射による免疫状態の把握において重要な指標となる。また、豚丹毒罹患豚の臓器や関節からのErの検出のための試薬として応用することができる。Erを検出することにより、当該動物が豚丹毒症に罹患しているかどうかを診断することが可能となる。
【００３８】
例えば、豚丹毒症罹患豚の血清中の抗体測定に、当該ポリペプチドに対する抗体を用いた酵素免疫測定法（Enzyme linked immunosorbent assay:ＥＬＩＳＡ）を以下のようにして応用することができる。炭酸・重炭酸緩衝液 ｐＨ９．６等で希釈したウサギポリクロナール抗体を、市販のＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一夜吸着する。１％ゼラチン溶液等でブロッキングした後、緩衝液で希釈した本発明ポリペプチドを添加し、３７℃で約３０分間反応させる。次いで被験豚血清を添加し、３７℃で約３０分間反応後、抗豚ＩｇＧ酵素標識抗体を加えて３７℃で１５分間反応させる。洗浄後、基質・発色剤混合液（０．０４％ オルソフェニレンジアミン、０．０２％の過酸化水素を含むクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．０等）を加えて室温で２０分程度反応させる。停止液（４Ｎ 硫酸等）を加えて反応を停止させ、４９２ ｎｍでの吸光度値を測定する。この吸光度の程度が、被験血清中に含まれる該ポリペプチドに対する抗体レベルを示しており、ワクチン非注射豚においてこの数値が高い場合にはＥｒの感染あったものと診断できる。一方、ワクチン注射豚において、この数値の高低を調べることにより、ワクチン注射により誘導された防御免疫の獲得程度を知ることができる。
【００３９】
一方、同じＥＬＩＳＡ法を応用して、Ｅｒの検出を行なうことができる。前記と同様に炭酸・重炭酸緩衝液等により希釈した本発明ポリペプチドに対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに吸着させる。ブロッキング後、次いでＥｒの感染の疑われる豚の血液や関節液、臓器やリンパ節などの乳剤を緩衝液で希釈し、プレートに加えて３７℃で３０分程度反応させる。洗浄後、本発明ポリペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を加え、３７℃で３０分程度反応させ、洗浄後、これに市販の抗ウサギＩｇＧ酵素標識抗体を加えて、さらに３７℃で１５分程度反応させる。洗浄後、基質・発色剤混合液を加え、室温で２０分程度反応させた後、停止液を加えて反応を停止させ、４９２ ｎｍでの吸光度値を測定する。検体中にＥｒが存在した場合には高い吸光度値を示すことから、検体中のＥｒの存在を、培養法に比べてより迅速に検出でき、これにより、検査豚が豚丹毒症に罹患しているか否かを迅速に診断することができる。
【００４０】
上記に例示した他にも、本発明ポリペプチドを用いて周知の抗原抗体反応、例えばウエスタンブロット法、ラテックス凝集反応、蛍光抗体法およびラジオイムノアッセイなどにより、抗体測定およびＥｒの検出を実施することができる。
【００４１】
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００４２】
ＥｒのｓｐａＡ及びその関連遺伝子のクローン化
ＥｒのｓｐａＡ遺伝子を保有することが判明している各血清型菌、及びこれまでｓｐａＡ遺伝子が検出されていなかったＥｒ血清型菌およびその他のエリシペロトリックス属菌種から、ｓｐａＡ及びその関連遺伝子のクローン化を試みた。
【００４３】
Ｅｒの各血清型参考株を０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、１％ 牛血清加トリプトース・ホスフェイト・ブロスにて３７℃、１８時間静置培養した。遠心により回収した菌体を、滅菌蒸留水に浮遊し、１００℃、５分間加熱処理後、遠心して上清を回収した。この上清中に含まれる染色体ＤＮＡをテンプレートとし、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー Er60K-1F（図１、配列番号７）及びEr60K-2RH（図１、配列番号８）を用いてＰＣＲを行なった。その結果、これまでｓｐａＡを保有していることが知られているＥｒ血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、１２、１５、１６、１７及びＮの各血清型菌株において、約１．９ ｋｂの遺伝子断片が増幅された（図２）。次に、ｓｐａＡ遺伝子の存在が知られておらず、上記プライマーによって増幅産物が得られなかったＥｒの血清型菌およびその他のエリシペロトリックス属菌種である血清型４、６、１１、１９、２１および１８については、上記プライマーと配列が異なる新たな２種類のオリゴヌクレオチドプライマー Er70-1F（図１、配列番号９）及びEr70-2R（図１、配列番号１０）を合成し、これを用いて再度ＰＣＲを行なった。その結果、Ｅｒの血清型４、６、１１、１９および２１からは約１．９ ｋｂの、その他のエリシペロトリックス属菌種である血清型１８から約２ ｋｂのＤＮＡ増幅産物が認められた（図２）。これらの血清型菌より増幅されたＰＣＲ産物は、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製後、常法に従いそれぞれベクタープラスミド（pGEM-T Easy、Promega社製）にクローン化した。これをエレクトロポレーション法により大腸菌XL-1 Blue（Stratagene社製）に形質転換し、５０μｇ力価／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天培地にて、３７℃、１８時間培養した。形成されたコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種して、３７℃、１８時間振盪培養し、得られた菌液から市販のキット（Qiagen Plasmid Kit、Qiagen社製）を用いて、各プラスミドＤＮＡを抽出、精製した。
【実施例２】
【００４４】
ｓｐａＡおよびその関連遺伝子の塩基配列解析とこれにコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列の比較
プラスミドにクローン化された各血清型菌由来ｓｐａＡ及びその関連遺伝子は、市販キット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit、Applied Biosystem (ABI)社製）を用いたジデオキシシークエンス反応後、全自動塩基配列決定装置（A310型、ABI社製）を用いてその全塩基配列を決定した。得られた塩基配列を元にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索し、このＯＲＦにコードされるＥｒ各血清型菌由来のＳｐａＡとその関連ポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。
【００４５】
今回のＰＣＲにより増幅産物の認められたＥｒ各血清型菌とその他のエリシペロトリックス属菌種由来のＳｐａＡ関連ポリペプチドの推定アミノ酸配列について、相互に相同性検索を行なった成績を表1に示した。９５％以上の相同性を示すポリペプチドを一つのグループとすると、各ポリペプチドは明確に３つのグループに区分された。ＳｐａＡと９５％以上の相同性を示すグループ１には血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、１２、１５、１６、１７およびＮのポリペプチドが属した。一方、ＳｐａＡとは６０％程度しか相同性を示さないが、お互いには９５％以上の相同性を示すグループ２として、血清型４、６、１１、１９および２１由来のポリペプチドが属した。さらに、ＳｐａＡ及びグループ２のいずれのポリペプチドとも約６０％程度の相同性しか示さないグループ３には、血清型１８（その他のエリシペロトリックス属菌種）由来のポリペプチドが属した。このように、Ｅｒ及びその他のエリシペロトリックス属菌種には、菌体表層防御抗原としてＳｐａＡを含めて少なくとも明確に異なる三種類のポリペプチドが存在することが明らかになった。そこで、従来報告のある血清型１および２型のポリペプチドはＳｐａＡと名づけられていることから、今回発見したＥｒの血清型４、６、１１、１９および２１が保有するポリペプチドをＳｐａＢ、その他のエリシペロトリックス属菌種の血清型１８が保有するポリペプチドをＳｐａＣとそれぞれ新たに命名することとした。
【００４６】
３種類のＳｐａポリペプチドを、分子内機能ドメイン別にアミノ酸の相同性を比較すると、Ｎ末端から２９アミノ酸を含むシグナル領域は、ＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣとも、同一の配列であった（図３、４、５および６）。Ｃ末端周辺のリピートユニット領域ではそれぞれのポリペプチド間で高い相同性が認められたが、リピートの回数はＳｐａＡ及びＳｐａＢは９回であったのに対して、ＳｐａＣは１０回であった。防御抗原性に関与すると考えられる中間部分のドメインについては、各ポリペプチド間で最も低い相同性を示し、４０−５０％程度であった。従って、各Ｓｐａポリペプチドをワクチンの成分として用いた場合、それぞれ異なった防御抗原性を示す可能性が示唆された。
【００４７】
以上の成績から、Ｅｒとその他のエリシペロトリックス属菌種には３種類の菌体表層防御抗原が存在することがはじめて明らかになった。以下、ＳｐａＡは血清型１ａのFujisawa株、ＳｐａＢは血清型６のDolphin E-1株、及びＳｐａＣにはその他のエリシペロトリックス属菌種に属する血清型１８の７１５株由来のポリペプチドをそれぞれ用い、以降の試験に供した。
【００４８】
【表１】
【実施例３】
【００４９】
各Ｓｐａポリペプチドの発現と精製
各Ｓｐａポリペプチドを、ヒスチジンヘキサマーとの融合タンパク質として組換え大腸菌で発現するために、各遺伝子をｐＱＥシリーズのベクターへ以下のようにしてクローン化した。
【００５０】
ｓｐａＡとｓｐａＢ遺伝子については、各プラスミドＤＮＡをBamHIとHindIIIで二重消化して約１．９ ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、同じ制限酵素で切断したｐＱＥ９ベクターに連結した。ｓｐａＣ遺伝子については、BamHIとSalIで二重消化して約２ ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、これを同じ制限酵素で切断したｐＱＥ３０ベクターに連結した。エレクトロポレーション法により各連結体を大腸菌XL-1 Blueに形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で培養し、コロニーを形成させた。
【００５１】
平板上に形成されたコロニーをそれぞれ選択し、アンピシリンを含むＬＢ液体培地２５０ ｍＬに接種し、３７℃、１８時間振盪培養した。この培養液から、遠心により菌体を回収し、これを１ ｍＭ イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地２５０ ｍＬに再浮遊し、さらに３７℃、４時間振盪培養することによって各Ｓｐａポリペプチドを発現した。各ポリペプチドを発現した大腸菌は、遠心により回収し、超音波破砕装置（Sonic Power、Branson社製）を用いてレベル５で２０秒、数回の超音波処理によって菌体を破砕した。これを１０，０００×ｇで２０分間遠心し、沈殿した各Ｓｐａポリペプチドを３．５Ｍグアニジンバッファー（ｐＨ ７．４）に浮遊して可溶化した。可溶化された各Ｓｐａポリペプチドは、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィー（キアージエン社製）により、付属の取扱い説明書に従って精製操作を行った。
【実施例４】
【００５２】
ＳｐａＡ、Ｂ及びＣポリペプチドの交差防御免疫誘導能
５週齢のｄｄＹマウス１６０匹を使用し、４０匹ずつ４群に分け、それぞれＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣの各ポリペプチド４０μｇタンパク量／匹を市販水中油滴型アジュバント（セピック社製）と等量混合し、３週間隔で２回皮下に注射して免疫した。残りの４０匹は非注射対照とした。第２回注射後２週に各群をさらに１０匹ずつ４区に分け、Ｅｒ血清型１ａ、２、６および１８の生菌をそれぞれ０．１ｍｌ皮下接種して攻撃した。攻撃菌量は順に２．９×１０２、３．８×１０２、４．１×１０４および６．９×１０２ ＣＦＵであった。攻撃後２週間観察し、生死により防御効果を判定した。
【００５３】
非注射対照群は、いずれの血清型菌の攻撃に対してもすべて死亡した（表２）。ＳｐａＡを保有する血清型１ａおよび２型菌の攻撃に対しては、ＳｐａＡおよびＳｐａＣの両免疫群で高度な防御が認められたが、ＳｐａＢ免疫群では１ａ型菌攻撃に対して９匹、２型菌攻撃に対して５匹が死亡し、防御効果が認められなかった。同様に、ＳｐａＢを保有する血清型６の攻撃に対しては、ＳｐａＢおよびＳｐａＣ免疫群では防御されたが、ＳｐａＡ免疫群では５匹が死亡し、防御の程度は不十分であった。ＳｐａＣを保有する血清型１８の攻撃に対しては、ＳｐａＣ免疫群で高度な防御がみられたが、ＳｐａＡおよびＳｐａＢ免疫群でそれぞれ３および４匹が死亡し、防御の程度は中等度であった。以上の成績から、３種類のＳｐａのうち、各血清型菌の攻撃に対して最も高い交差防御抗原性を示すものはＳｐａＣポリペプチドであることが判明した。
【００５４】
【表２】
【実施例５】
【００５５】
ＳｐａＣΔＣポリペプチドの作出とその免疫原性
大腸菌における全長のＳｐａＣポリペプチドの発現量は低かった。そこで、ＳｐａＣ分子を機能領域（ドメイン）ごとに見ると、Ｃ末端付近に存在するリピート領域及びプロリンおよびグリシンを多く含む疎水性領域は、StreptococcusやClostridiumなどの他のグラム陽性菌の例（Pancholi, V. and Fischetti, V.A., J.Bacteriol.,170, 2618-2624, 1988; Yother, J. and Briles, D.E., J.Bacteriol.,174, 601-609, 1992）から類推して、当該ポリペプチドの菌体表層への結合にかかわるものと思われた。従って、本領域は防御抗原性には直接関与しないと考えられたため、Ｃ末端から２３７アミノ酸を除去したポリペプチド（以下ＳｐａＣΔＣと呼ぶ）を作出する目的で、ｓｐａＣ遺伝子の３’末端から７１４ｂｐを欠損したＤＮＡ断片を構築した。当該断片を増幅するため、Er70-1F（図１、配列番号９）及びEr70K18-2R（図１、配列番号１１）という２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ｓｐａＣ遺伝子をテンプレートとしてＰＣＲを行なった。増幅された約１．３ ｋｂのＤＮＡ断片は、実施例２と同様にpGEM-Easyベクターにクローニングし、塩基配列を決定することによって所定のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。次いで、本遺伝子断片にコードされるＳｐａＣΔＣポリペプチドを大腸菌内でヒスチジンヘキサマーとの融合タンパクとして発現するため、実施例２と同様に、制限酵素BamHIとSalIで切断することにより遺伝子断片を切り出し、同じ酵素で切断したpQE30発現用ベクターにクローン化した。このプラスミドを形質転換した大腸菌では、ＳｐａＣΔＣポリペプチドの配列から予想される分子量である約４９ ｋＤａの位置に大量のポリペプチドの発現が認められた（図７）。一方、全長のｓｐａＣ遺伝子を含むプラスミドを形質転換した大腸菌では、ＳｐａＣの分子量に一致する７６ ｋＤａ付近とその分解産物と思われる５０〜４０ ｋＤａ付近に薄いバンドが認められた。ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、発現大腸菌を破砕して抽出し、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて実施例２と同様に精製を行った。
【００５６】
このＳｐａＣΔＣポリペプチドが、元のＳｐａＣ分子と同様に免疫原性があるか、そして、免疫したときに複数の血清型菌の攻撃に対する交差防御性が失われていないかの確認を試みた。５週齢のｄｄＹマウス９０匹を使用し、３０匹には全長のＳｐａＣポリペプチドを、他の３０匹にはＳｐａＣΔＣポリペプチドを、それぞれ１匹当たり４０μｇタンパク量となるように調製し、アジュバントとともに３週間隔で２回皮下に注射した。残りの３０匹は非免疫対照群とした。第２回注射後２週に各群をさらに１０匹ずつの３群に分け、それぞれＥｒ血清型１ａ、６または１８型の生菌を各０．１ｍｌずつ皮下接種して攻撃した。攻撃菌量はそれぞれ３．３×１０２ ＣＦＵ （１ａ型）， ４．６×１０４ ＣＦＵ （６型）、及び ７．１×１０２ ＣＦＵ （１８型）であった。攻撃後２週間観察し、生死により防御効果を判定した。
【００５７】
全長のＳｐａＣポリペプチドを免疫したマウスでは、１型菌攻撃で１０匹中７匹が、６型菌攻撃で７匹が、及び１８型菌攻撃で８匹がそれぞれ生残した（表３）。一方、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫したマウスでは、１型菌攻撃で１０匹が、６型菌攻撃で９匹が、及び１８型菌攻撃で９匹がそれぞれ生残した。
【００５８】
以上の成績から、Ｃ末端に存在する２３７アミノ酸を除去したＳｐａＣΔＣポリペプチドは、全長のＳｐａＣポリペプチドと比較して同等以上の免疫原性があり、交差防御能も担保されていた。このことは、Ｓｐａポリペプチドにおいて、防御抗原性はＮ末端から中間部分に渡って存在し、Ｃ末端付近のリピート領域には存在しないというShimojiら(Infect. Immun,67: 1646-1651, 1999)の報告と一致していた。ＳｐａＣΔＣポリペプチドは全長のＳｐａＣに比べて大腸菌での発現効率が１０倍以上であることから、豚丹毒予防ワクチンの成分として極めて有用であると考えられた。
【００５９】
【表３】
【実施例６】
【００６０】
ＳｐａＣΔＣポリペプチドの豚における免疫試験
SpaCΔCポリペプチドの免疫原性を、実際の対象動物である豚を用いて確認することとした。
【００６１】
試験には４週齢のＳＰＦ豚９頭を供試した。３頭ずつ３群に分け、第１群にはＳｐａＣΔＣポリペプチドを１頭当たり２００μｇタンパク量となるよう調製し、市販の豚用アジュバントＮｏ．１１（セピック社製）とともに３週間隔で２回注射した。第２群は第１群と同量のＳｐａＣΔＣポリペプチドを、市販の豚用アジュバントＮｏ．１３（セピック社製）とともに同様に注射した。第３群は非注射対照とした。各免疫豚は、最終免疫後２週に対照群とともに、Ｅｒ藤沢株（血清型１ａ）１．０×１０６ ＣＦＵを皮内接種することにより攻撃した。攻撃後１週間臨床観察を行い、試験終了時に剖検し、各臓器について肉眼的に観察するとともに、菌分離を行った。また各群の豚について免疫前と攻撃時に採血を行い、血清中に産生されたＳｐａＣΔＣポリペプチドに対する抗体を以下に記載するＥＬＩＳＡによって調べた。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ用の市販９６穴マイクロプレートの各穴に、炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９．６で10,000倍に希釈したSpaCΔCポリペプチドに対するウサギポリクロナール抗体を添加し、４℃で一夜静置して吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０添加生理食塩水で洗浄後、１％ゼラチン液を加え、室温で１時間以上静置してブロッキングした。洗浄後、０．２５μｇタンパク量のSpaCΔCポリペプチドを加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０−１％ゼラチン加ＰＢＳ（−）により１００倍に希釈された豚血清を加え、３７℃で約３０分間反応した。洗浄後、１０，０００倍に希釈した抗豚ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体（ロックランド社製）を加え、３７℃、１５分間反応させた。洗浄後、基質・発色剤混合液（０．０４％ オルソフェニレンジアミン、０．０２％ 過酸化水素を含むクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．０）を加えて３０℃、２０分間反応後、２Ｍ硫酸を加え発色を停止した。各穴について４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、Ｅ値［（被験血清のＯＤ値−指示陰性血清のＯＤ値）÷（指示陽性血清のＯＤ値−指示陰性血清のＯＤ値）］を算出した。Ｅ値０．１以上を陽性と判定した。
【００６３】
２種類の市販豚用アジュバントを用いてＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫したワクチン群の豚には、いずれも注射に伴う発熱、沈うつ等の副反応は認められず、また注射局所にも発赤、硬結等の異常はなく、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、豚用ワクチンの成分として安全に使用できることが確認された。
【００６４】
各群に対するＥｒ生菌攻撃後、対照群は重度の臨床症状を呈し、全頭が死亡した（表４）。これらの死亡豚の各臓器からは攻撃菌が純培養状に分離された。一方、二種類のアジュバントを用いてＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫した両ワクチン群では、いずれも臨床症状を示さず、死亡豚も認められなかった。剖検においても、いずれの豚の臓器からも攻撃菌は回収されなかった。
【００６５】
抗体検査において、試験開始前のすべての豚で、ＳｐａＣΔＣポリペプチドに対する抗体は検出されなかった。第２回注射後２週（攻撃時）には、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫した両ワクチン群のすべての豚で抗体が陽転した。一方、対照群の３頭は、すべて陰性に経過した。
【００６６】
以上の成績から、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、いずれの市販豚用アジュバントを用いた場合でも、豚において抗体産生が可能で、免疫することによってＥｒの生菌攻撃に対して高度な防御を付与できることが判明した。このことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは豚丹毒予防ワクチンの成分として有用であることが実証された。
【００６７】
また、ＳｐａＣΔＣポリペプチドに対するウサギポリクロナール抗体をＥＬＩＳＡによって、ワクチン注射により上昇した抗体を検出することが可能で、本ＥＬＩＳＡによる抗体検査成績と攻撃試験による防御効果とはよく一致していた。従って、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを抗原に用いた抗体測定を実施することによって、Ｅｒに対する抗体レベルを知ることができる。
【００６８】
【表４】
【実施例７】
【００６９】
単純工程で調製したSpaCΔCポリペプチドを用いた豚での免疫試験
実施例６では、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用い、高度に精製したＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫原に使用し、感染防御活性があることが確認された。けれども、実際にワクチンの抗原として用いるには、やや純度は劣るものの、大量かつ安価にポリペプチドを得る方法を確立することが必要となる。そこで、以下に述べるような単純な工程において調製されたＳｐａＣΔＣポリペプチドが、豚に対して免疫原性を保持しているかどうかの検討を行なった。
【００７０】
実施例３に述べたようにしてＳｐａＣΔＣポリペプチドを発現した大腸菌を、培養液から遠心して回収し、超音波破砕装置（Sonic Power、Branson社製）を用いてレベル５で２０秒、数回の超音波処理を行なうことにより菌体を破砕した。これを１０，０００×ｇで２０分間遠心し、沈殿に回収されたＳｐａＣΔＣポリペプチドを３．５Ｍグアニジンバッファー（ｐＨ ７．４）に浮遊して可溶化した。これを室温で１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心して不溶性の沈さを除去し、得られた上清をＳｐａＣΔＣポリペプチド溶液とし、これをワクチンの調製に用いた。
【００７１】
約４週齢のＳＰＦ豚６頭を用い、３頭を免疫群、残り３頭を非注射対照群とした。免疫群の豚には、上記のようにして調製したＳｐａＣΔＣポリペプチドを、１頭１回当たり１００μｇタンパク量となるよう調製し、Ｎｏ．１３アジュバントとともに３週間隔で２回、筋肉内に注射した。残り３頭は非注射対照とした。第２回注射後２週にＥｒ藤沢株（血清型１ａ）１．２ ×１０６ ＣＦＵを皮内に接種して攻撃した。攻撃後１週間臨床観察を行い、試験終了時に剖検し、各臓器からＥｒの分離を行った。
【００７２】
攻撃後、対照群は重度の臨床症状を呈して、全頭が死亡した（表５）。死亡豚の各臓器からはＥｒが純培養状に分離された。一方、単純工程で調製したＳｐａＣΔＣポリペプチドで免疫した豚はいずれも臨床症状を示さず、臓器からもＥｒは分離されなかった。
【００７３】
以上の成績から、大量かつ安価にポリペプチドの調製が可能な単純工程により得られたＳｐａＣΔＣポリペプチドにおいても、高度に精製されたものと同様に、豚に免疫することによってＥｒ強毒株の攻撃に対し、感染・発病を完全に防御できる活性を有することが確認された。従って、このような比較的単純な工程により、十分な防御抗原性をもつＳｐａＣΔＣポリペプチドが得られたことは、実際のワクチン製造を行なう上で、非常に有用であると考えられた。
【００７４】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本願の請求項１の発明によれば、豚に免疫したときにＥｒ強毒株の攻撃に対し感染、発病を完全に防御するポリペプチドを得ることができ、請求項７に記載した豚丹毒に対するワクチンとして用いることができる医薬品組成物を提供することができるので、本願発明は有用である。
【００７６】
また、請求項２の発明によれば、このポリペプチドをコードする遺伝子が得られ、請求項４、５および６の遺伝学的手法により発現させることで、当該ポリペプチドを単純工程で大量かつ安価に製造することができるので、本願発明は有用である。
【００７７】
更に請求項８および９の発明によれば、請求項１に示したポリペプチドに特異的な抗体を得、これを用いて豚丹毒の診断あるいはワクチン接種豚の免疫状態を把握するための抗体検出を実施することがでるので、本願発明は有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ｅｒ各血清型菌におけるＳｐａＡ、ＳｐａＢ、ＳｐａＣ およびＳｐａＣΔＣ遺伝子のＰＣＲクローニング用プライマー。
【図２】Ｅｒ各血清型菌におけるＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣ遺伝子のＰＣＲによる検出 （Ｍは分子量マ−カ−：上から１０、８， ６， ５、４、３、２．５、２、１．５、１および０．５ ｋｂ）
【図３】各Ｓｐａポリペプチドの分子構造比較。
【図４】ＳｐａＡ（血清型１ａ）とＳｐａＢ（血清型６）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図５】ＳｐａＡ（血清型１ａ）とＳｐａＣ（血清型１８）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図６】ＳｐａＢ（血清型６）とＳｐａＣ（血清型１８）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図７】ＳｐａＣの全長およびＣ末端領域欠損断片の大腸菌での発現の電気泳動写真。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリシペロトリックス属のその他の菌種である血清型１８由来の感染防御活性をもつ新規ポリペプチドとこれをコードする遺伝子および該ポリペプチドに対する抗体に関する。更に詳細には、免疫したときに豚丹毒を予防するワクチン等の医薬品組成物を提供するための免疫原としてのポリペプチドとその製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚丹毒は、豚丹毒菌を原因とする豚の伝染性疾患である。罹患豚は、急性に経過して急死する敗血症型、特徴的な蕁麻疹を呈する亜急性型、および明瞭な臨床症状は呈さないが、しばしば食肉処理場で発見されて問題となる心内膜炎型および関節炎型等の多様な病態を示す。急性型の発生例では高い死亡率が問題となる。一方、慢性型においては発育の遅延等による生産性の低下のほか、食肉処理場において本症が発見された場合には屠体が全部廃棄されるため、その経済的被害は多大となる。また、本菌はヒトに感染して類丹毒症を引き起こす例もあることから、人獣共通感染症の原因菌として公衆衛生面からも問題とされる。
【０００３】
豚丹毒菌は、菌体細胞壁に存在するペプチドグリカン中の耐熱性抗原の血清学的型別から現在２６種類の血清型と、その抗原を欠くＮ型に分類されている。近年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（非特許文献１）はＤＮＡ−ＤＮＡ相同性を用いた分類法を応用し、これらの血清型菌は４つの菌種に分けられることを提言した。すなわち、血清型１ａ、１ｂ、２、４、５、６、８、９、１１、１２、１５、１６、１７、１９、２１およびＮ型をＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（以下「Ｅｒ」と略称する）に、血清型３、７、１０、１４、２０、２２および２３をＥｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｔｏｎｓｉｌｌａｒｕｍ（以下「Ｅｔ」と略称する）に、血清型１３をその他のエリシペロトリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）属菌種１に、血清型１８をその他のエリシペロトリックス属菌種２に分類した。疫学調査から、豚に強い病原性を示す菌種はＥｒで、この中でも特に１ａ， １ｂおよび２型が豚丹毒症例からの分離率が高い。けれども、感染実験の結果からすると、Ｅｒの各血清型菌はすべて豚に対する病原性を有しているとされる。
【０００４】
本症の予防のために、わが国では生ワクチンが長く用いられ、その防圧に貢献してきた。生ワクチン株は、血清型１ａの強毒株であるＫｏｇａｎｅｉ株を、アクリフラビンを添加した培地で長期継代することによって弱毒化したものである。けれども、最近、食肉処理場での慢性型豚丹毒の摘発例が増加傾向となっており、次のような生ワクチンの弱点が指摘されるようになった。第一に、生ワクチンは移行抗体および抗菌剤の使用によりワクチンテイクが阻害されるため、農場によってはワクチン効果が十分発揮できないケースがある。第二に、最近の飼養形態の変化に伴ってＳＰＦ豚等の衛生状態のよい動物が多く飼養されるようになり、このような豚に本ワクチンを接種した場合、ワクチン株自体の病原性によって発症する例も認められるようになった。
【０００５】
このような豚丹毒生ワクチンの弱点を克服するため、１９９７年、わが国において初めて不活化ワクチンの製造が承認され、使用されるに至った。このように、不活化ワクチンには生ワクチンに比べて多くの利点があるものの、Ｅｒ自体を培養して製造するためコスト高となること、および豚に使用される他のワクチンと混合したとき他の成分と干渉作用を起こしやすく、混合製剤の開発が困難であるなどの問題点がある。従って、Ｅｒから、感染防御に関係した抗原ポリペプチドだけを抽出・精製したコンポーネントワクチンが最も望ましく、コスト面から考えると、組換え体を用いて生産することが好ましい。
【０００６】
本菌の感染防御を誘導する抗原に関しては、６５−７０ ｋＤａ の分子量をもつＳｐａＡとよばれる菌体表層に存在するポリペプチドが知られている。Ｅｒ血清型２型由来の当該遺伝子（ｓｐａＡ）はＭａｋｉｎｏら（非特許文献２）により、血清型１の遺伝子についてはＳｈｉｍｏｊｉら（非特許文献３）およびＩｍａｄａら（非特許文献４）により解析され、その配列が明らかにされている。組換え大腸菌により発現されたＳｐａＡポリペプチドで免疫されたマウスおよび豚は、Ｅｒ生菌による致死的な攻撃から発症が防御されることが明らかにされている。従って、このＳｐａＡポリペプチドは、豚丹毒症の予防ワクチンの重要な成分になり得るものと考えられる。一方で、このＳｐａＡポリペプチドの防御活性はＥｒ血清型１および２に対してしか実証されておらず、野外に常在しているその他のＥｒ血清型菌の攻撃に対し、同様の防御活性を示すかどうかについては不明である。ワクチンに利用する抗原ポリペプチドとしては、様々なＥｒ血清型菌に対して幅広くかつ高度な防御活性をもつもののほうがより好ましい。
【０００７】
Ｍａｋｉｎｏらの報告によると、ｓｐａＡ遺伝子はＥｒの１６血清型のうち１１の血清型菌（１ａ， １ｂ， ２， ５， ８， ９， １２， １５， １６， １７およびＮ）に存在し、残りの血清型菌（４，６，１１，１９および２１）には認められないとした。そこで、本特許において発明者らは、Ｅｒの残りの血清型菌に加えて、その他のエリシペロトリックス属菌種（血清型１８）にもｓｐａ遺伝子が存在することを見出した。そして、これらの遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を調べると、Ｅｒおよびその他のエリシペロトリックス属菌種には、お互いに６０％程度の低い相同性をもった３種類のＳｐａが存在することを見出した。そして、特に、その他のエリシペロトリックス属菌種（血清型１８）の有するＳｐａは、多様な血清型菌の感染に対し最も幅広い防御活性を有することを見出した。従って、今回発見された新しいＳｐａは、豚丹毒予防ワクチンの有用な成分となることが示され、本発明を完成するに至った。
【非特許文献１】J.Syst.Bacteriol., 42, 469-437, 1992
【非特許文献２】Microb.Pathog., 25, 101-109, 1998
【非特許文献３】Infect.Immun., 67, 1646-1651, 1999
【非特許文献４】Infect.Immun., 67, 4376-4382, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、高い安全性と優れた有効性を有するＥｒの多数の血清型に対して防御抗原活性を示すポリペプチド、およびその製造方法を提供することである。本発明の別の目的は、上記ポリペプチドを豚丹毒感染症予防のためのサブユニットワクチンの成分として利用すること、ならびにＥｒに対する抗体測定および診断に用いる抗原に使用することである。
【０００９】
このため、本発明者らは、（ａ）Ｅｒ各血清型参考株、特にｓｐａＡ遺伝子の存在の知られていない血清型４，６，１１，１９および２１ならびにその他のエリシペロトリックス属菌種よりＳｐａ関連遺伝子をクローン化すること、（ｂ）それらの全塩基配列を決定し、塩基配列から予測されるアミノ酸配列に基づいて相同性検索を行うことによりＳｐａ関連ポリペプチドの分類を行なうこと、（ｃ）分類されたＳｐａ関連遺伝子の全長を発現ベクターに組込み、その組換えポリペプチドを発現・精製する。これをマウスに免疫し、交差防御試験により最も幅広い防御スペクトルをもつポリペプチドを選定すること、（ｄ）選択したＳｐａポリペプチドにつき、最も発現量が多く、収量に優れた部分断片を特定すること、（ｅ）得られたポリペプチドをワクチンの成分として実際に豚に免疫し、Ｅｒの生菌で攻撃して感染・発症防御効果を確認すること、ならびに（ｆ） 当該ポリペプチドを用いて、免疫した豚の抗体を測定すること、等を目的として鋭意研究を行なってきた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
その結果、本発明者らは、ｓｐａＡ遺伝子の塩基配列を元に、改変したＤＮＡプライマーを合成し、ｓｐａＡの存在が知られていなかったＥｒの血清型４，６，１１，１９および２１参考株、およびその他のエリシペロトリックス属菌種２に属する血清型１８菌株にもＳｐａ関連遺伝子が存在することを確認した。そこで、すべてのＥｒ各血清型参考株のＳｐａ関連遺伝子をそれぞれベクターＤＮＡにクローン化し、それらの全塩基配列を決定したところ、血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、９、１２、１５、１６、１７およびＮが保有するｓｐａＡ遺伝子、血清型４、６、１１、１９および２１が保有する別のＳｐａ関連遺伝子（ｓｐａＢと名づけた）、および血清型１８が保有するさらに別のＳｐａ関連遺伝子（ｓｐａＣと名づけた）の３種類の遺伝子が存在することを見出した。次に、ｓｐａＡ、ｓｐａＢおよびｓｐａＣ 遺伝子をそれぞれ大腸菌で発現させ、各Ｓｐａポリペプチドでマウスを免疫した。これに対し、それぞれ異なるＳｐａをもつＥｒ血清型菌により攻撃して交差防御試験を行ったところ、ＳｐａＣポリペプチドが最も幅広い血清型菌に対して防御効果を示すことが判明した。次に、大腸菌内でのＳｐａＣポリペプチドの発現量を向上させる目的で、Ｃ末端付近の２３７アミノ酸を除去した新たな欠失変異ポリペプチド（ＳｐａＣΔＣと名づけた）を構築した。その結果、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは全長のＳｐａＣポリペプチドに比べて、大腸菌内での発現量は約１０倍上昇し、タンパク量あたりの防御活性も、ＳｐａＣポリペプチドと変わらなかった。このことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、全長のＳｐａＣに比べて、豚丹毒予防ワクチンの成分としてより好適であることが判明した。また、当該ポリペプチドを抗原としたＥＬＩＳＡを行なうことによって、免疫豚の血清中のＳｐａポリペプチドに対する抗体が検出されたことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドはＥｒに対する抗体を検出するための抗原としても有用であることがあわせて示され、本発明に至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下を要点とするものである。
（１） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すポリペプチド。
（ａ） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ） 配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド、
（ｃ） 配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ） 配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド。
【００１２】
（２） （１）に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１３】
（３） 配列表の配列番号２および４に示すヌクレオチド配列を有する、（２）に記載のＤＮＡ。
【００１４】
（４） （２）に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【００１５】
（５） （４）に記載の発現ベクターによりＥｒの感染防御免疫活性を有するポリペプチドを生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【００１６】
（６） （５）に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に（１）に記載のポリペプチドを生産させ、該ポリペプチドを精製することを特徴とする（１）に記載のポリペプチドの製造方法。
【００１７】
（７） （１）に記載のポリペプチドを成分として含有することを特徴とする豚丹毒症に対する予防ワクチン。
【００１８】
（８） （１）に記載のポリペプチドを認識することを特徴とするモノクローナルおよびポリクローナル抗体。
【００１９】
（９） （１）に記載のポリペプチド、（２）に記載のＤＮＡ、（５）に記載の形質転換体または（８）に記載の抗体を用いることを特徴とするＥｒの検出方法、抗体検査方法および豚丹毒症の診断試薬。
【発明の効果】
【００２０】
本願の請求項１の発明によれば、豚に免疫したときにＥｒ強毒株の攻撃に対し感染、発病を完全に防御するポリペプチドを得ることができ、請求項７に記載した豚丹毒に対するワクチンとして用いることができる医薬品組成物を提供することができる。
【００２１】
また、請求項２の発明によれば、このポリペプチドをコードする遺伝子が得られ、請求項４、５および６の遺伝学的手法により発現させることで、当該ポリペプチドを単純工程で大量かつ安価に製造することができる。
【００２２】
更に請求項８および９の発明によれば、請求項１に示したポリペプチドに特異的な抗体を得、これを用いて豚丹毒の診断あるいはワクチン接種豚の免疫状態を把握するための抗体検出を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
＜１＞本発明ポリペプチド
本発明ポリペプチドはＥｒに対する感染防御免疫を誘導する上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定する例えば配列番号１および３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体を提供する。配列番号１に示したＳｐａＣポリペプチドはその他のエリシペロトリックス属菌種２血清型１８に特異的な分子量７６ ｋＤａのポリペプチドである。本ポリペプチドは、これをコードする配列番号２に示したＤＮＡをもとに、種々の方法によりポリペプチドに翻訳することによって得られる。
【００２４】
配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＳｐａＣΔＣポリペプチドは、配列番号１のポリペプチドのうち、Ｎ末端から４２７アミノ酸の部分で、すなわち、ＳｐａＣポリペプチドのＣ末端の２３７アミノ酸を欠失した２７ｋＤａの分子量をもつ欠失変異体である。本ポリペプチドは、ＳｐａＣポリペプチドのＣ末端領域に位置する菌体表層へのアンカリング領域と疎水性領域の一部を除去し、感染防御免疫に関係する領域のみに限定したものである。このＳｐａＣΔＣポリペプチドは、大腸菌等の形質転換体を利用して遺伝子からポリペプチドに翻訳する際、全長のＳｐａＣに比べてその翻訳効率が非常に高いという利点をもつ。加えて、ＳｐａＣΔＣポリペプチドのタンパク量当たりの防御免疫誘導能は、ＳｐａＣポリペプチドと同等である。本ポリペプチドは、これをコードする配列番号４に示したＤＮＡを種々の方法により翻訳することで得られる。
【００２５】
本発明のポリペプチドには、配列番号１および３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつＥｒに対する感染防御免疫誘導能を示すポリペプチドも含まれる。このような変異の仕方に制限はないが、例えば配列番号１および２に示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異などの技術を用いて人工的に変異ＤＮＡを作製し、これをポリペプチドに翻訳することにより得る事ができる。また、血清型１８の他の菌株からｓｐａＣ遺伝子をクローン化して翻訳したとき、自然に配列番号１および３と数個のアミノ酸の異なるポリペプチドが得られるかもしれないが、これも本発明に包括される。さらに、配列番号３に示すＳｐａＣΔＣポリペプチドはＳｐａＣをもとにＣ末端の２３７アミノ酸を欠失した変異体であるから、実際にはＳｐａＣからＳｐａＣΔＣの間にあるＣ末端の１〜２３７個のアミノ酸欠失変異体もすべて本発明に包括される。本発明に包括されるポリペプチドを別に表現すると、配列番号１および３のアミノ酸配列との相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に９５％以上であるべきである。
【００２６】
＜２＞ 本発明ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に規定する配列番号１および３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその変異体をコードするＤＮＡを提供する。好適実施態様により、該ＤＮＡは配列番号２および４に示す塩基配列を有するＤＮＡである。本発明のＤＮＡはその他のエリシペロトリックス属菌種２の好ましくは血清型１８の染色体ＤＮＡからクローン化することにより得ることができる。例えば、当該菌の染色体ＤＮＡからゲノムライブラリーを作製し、各クローンを大腸菌等の宿主に形質転換してコードするポリペプチドを宿主内に発現させ、該ポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてこの発現ライブラリーをスクリーニングする方法、あるいは配列番号２または４の塩基配列の一部を含むＤＮＡに放射性化合物やＤＩＧ等で標識し、これをプローブとしてハイブリダイゼーションによりスクリーニングする方法により得る事ができる。また、別の方法として、配列番号２または４の配列の一部をオリゴヌクレオチドプライマーとし、当該菌の染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行ない、増幅したＤＮＡ断片をベクターＤＮＡにクローン化する方法も可能である。また、配列番号２または４の塩基配列をもとに、ＤＮＡ合成機を用いて、直接化学的に配列を合成することも可能である。
【００２７】
請求項２または３に規定されるＤＮＡは、配列番号２または４に示す塩基配列において複数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された配列を有し、かつＥｒに対する感染防御免疫を誘導する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。このような変異の仕方に制限はないが、例えば配列番号２または４に示す塩基配列を基に、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異技術などを用いて人工的に変異ＤＮＡを作製することができる。また、その他エリシペロトリックス属菌種２ 血清型１８の他の菌株由来のｓｐａＣ遺伝子は、配列番号２と複数個の塩基が置換されている可能性がある。また、配列番号４は配列番号２の３’末端の７１４塩基対を欠失したものであるので、この欠失が１個から７１４個の範囲にあるものは本発明に含有される。配列番号２および４との塩基配列の相同性で言えば、上記変異体は７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に９５％以上の相同性を有しているべきである。これら変異ＤＮＡは、例えば、５０％ホルムアルデヒドを含むハイブリダイゼーション溶液中で、３７℃下といったストリンジェントな条件下で、配列番号２または４のＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして例示することができる。
【００２８】
＜３＞ 本発明のベクター、形質転換体および形質転換体を用いるポリペプチドの製造方法
本発明は、本発明ＤＮＡをベクターに組み込むことにより得られる組換えＤＮＡ、この組換えＤＮＡを形質転換することにより得られた形質転換体、およびこの形質転換体を培養し、得られた培養液からＳｐａＣまたはＳｐａＣΔＣポリペプチドを回収することを特徴とする該ポリペプチドの製造法を提供する。
【００２９】
請求項（２）および（３）に規定されるｓｐａＣおよびｓｐａＣΔＣ遺伝子とその変異体遺伝子を形質転換する際、原核または真核生物である宿主細胞において自立複製または染色体中への組み込みが可能なものを選択することができる。例えば、原核細胞用としてpUCシリーズ（宝酒造社製）、pQEシリーズ（プロメガ社製）、pBluescriptIIシリーズ（ストラタジーン社製）、ｐＥＴシリーズ（ノバジェン社製）、pHY300PLK（宝酒造社製）など、酵母用ベクターとしてｐＳＧ５（ストラタジーン社製）、pBPV（ファルマシア社製）など、動物細胞用としてpcDM8（フナコシ社製）、pREP4（インビトローゲン社製）など、昆虫細胞用としてpBlueBacIII（インビトローゲン社製）など、植物細胞用として、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクターなどを例示することができるが、これらに限定されない。勿論、必要に応じて、市販または文献記載のベクターを任意に改変することも可能であろう。
【００３０】
形質転換体は、本発明ＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換することにより得ることができる。宿主細胞には、例えば原核生物としてエシェリシア属、バチルス属などの微生物、真核生物としてサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ピチア属などの酵母類、ヒト胎児腎細胞チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ〉細胞などの哺乳動物細胞、バキュロウイルス感受性昆虫細胞および昆虫体などがあげられる。形質転換法としては、以下のものに限定されないが、塩化カルシウム法、燐酸カルシウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、スフェロプラスト法，リポフェクション法およびアグロバクテリウム法などを用いることができる。
【００３１】
形質転換された宿主細胞を培養し、発現ベクターに組込まれた目的ＤＮＡを発現させ、タンパク質精製に関する公知の方法を利用してＳｐａＣ、ＳｐａＣΔＣおよびその変異ポリペプチドを分離・精製することができる。通常、超音波処理、ホモジナイザー処理および高圧圧縮処理等により宿主細胞を破壊して抽出液を得、この抽出液から、溶媒抽出、塩析、脱塩、有機溶媒沈殿、限外濾過、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣ、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動などの方法を組合せることによって、分離・精製された当該ポリペプチドを得ることができる。
【００３２】
〈４〉本発明ポリペプチドを成分とする豚丹毒予防ワクチン、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、ならびに抗体を用いた菌検出方法および抗体検査方法
本発明により得られるポリペプチドは、豚丹毒症の対象動物である豚および実験動物に免疫することにより、該動物の血液中に該ポリペプチドに対する抗体が誘導され、その抗体の作用によって該動物はＥｒの強毒菌での攻撃に対し、感染および発病から防御される。このような効果により、該ポリペプチドを豚丹毒症に対するワクチンとして利用することができる。また、該ポリペプチドは上記のように高い免疫原性を有することから、種々の動物に対して抗体産生が可能で、血清中に産生された抗体はポリクローナル抗体として、免疫マウスの脾細胞を元に得られたハイブリドーマの産生する抗体はモノクローナル抗体として、それぞれ利用することができる。このポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、Ｅｒ特異的に反応することから、種々の抗原抗体反応を応用することにより、感染動物からのＥｒの検出、感染および免疫動物中に産生されたＥｒに対する抗体の検出および定量に応用することができる。
【００３３】
ワクチン製剤に使用する場合の該ポリペプチドの単回投与量は、通常１μｇタンパク量以上、好ましくは１０μｇタンパク量以上、より好ましくは１００μｇタンパク量以上、特に１００μｇから１０００μｇタンパク量である。ポリペプチドをワクチンとする場合、その抗体応答をさらに高めるため、免疫賦活剤（アジュバント）を加えることが好ましい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル、植物性または鉱物性油脂と界面活性剤との混合物等を使用することができ、それぞれのアジュバントの特性に従った免疫刺激可能量で配合される。
【００３４】
また、本発明のワクチン製剤には、本発明ポリペプチドの他に、抗原性を有する物質を混合してもよい。例えば、豚由来病原性細菌または病原ウイルス由来抗原が好適であり、より具体的には、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchiseptica）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、 マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Mycoplasma hyopeumoniae）、アクチノバシラス・ブルロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）、ヘモフィルス・バラスイス（Haemophilus parasuis）、大腸菌（Esherichia coli）、サルモネラ・コレレエスイス（Salmonella choleraesuis）、連鎖球菌（Streptococcus suis）、豚繁殖呼吸障害症候群ウイルス（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、豚パルボウイルス（porcine parvovirus）、豚サーコウイルス（porcine circovirus）、豚インフルエンザウイルス（swine influenza virus）、オーエスキー病ウイルス（Aujesky’s disease virus）等を挙げることができる。病原体由来抗原とは、当該菌またはウイルスそのもの、あるいは当該菌またはウイルスより抽出・精製したもの、あるいはその遺伝子をもとに大腸菌やバキュロウイルス等の他の生物で発現させた組換えタンパク質であってもよい。
【００３５】
ワクチン効果の評価は、マウス等の実験動物、あるいは対象動物である豚を用いた免疫・攻撃試験により行うことができるが、例えば次のようにしてもよい。該ポリペプチドをアジュバントと混合し、豚の頚部筋肉内に３〜４週間隔で１ ｍＬずつ２回注射する。対照群は非免疫とする。２回目注射後２週にＥｒ強毒菌の生菌を皮内に注射することにより攻撃し、攻撃後約１週間観察する。ワクチン注射群および対照群の死亡数、豚丹毒症の臨床症状の発現頭数を比較したとき、ワクチン注射群の方が対照群に比べて有意に少ないことでワクチンの効果を判定することができる。マウスを用いて評価する場合は、該ポリペプチドをアジュバントと混合したものを０．２ ｍＬずつ３週間隔で２回皮下に注射する。対照群は非免疫とする。２回注射後２週にＥｒ強毒菌の生菌を各マウスの皮内に注射することにより攻撃し、攻撃後約２週間観察する。ワクチン注射群の死亡数は対照群に比べて有意に少ないことから、ワクチンの効果を判定することができる。
【００３６】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、例えば以下のようにして得られる。該ポリペプチドをアジュバントと混合し、ウサギの背部皮下に２〜４週間隔で３〜５回免疫する。最終免疫から２〜３週後に全採血して免疫血清を得る。この血清から、硫安分画法または市販の抗体精製キットを用いてイムノグロブリン分画を採取することによりポリクローナル抗体が得られる。本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、例えば以下のようにして得られる。上記のようにして免疫したマウスから脾臓細胞を回収し、常法（MONOCLONAL ANTIBODYTECHNOLOGY, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1984）に従ってマウスミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）を作製する。この中から、該ポリペプチドに対する抗体産生が確認されたハイブリドーマをスクリーニングし、さらにその細胞株をクローニングしたのち、その細胞株の培養上清から、あるいは細胞株を移植されたヌードマウスの腹水から先に述べた方法によりイムノグロブリン分画を採取することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、豚丹毒罹患豚および豚丹毒ワクチン免疫豚の血清中に存在する抗体の検出および定量に応用することができる。その抗体測定結果は、豚丹毒症の診断、あるいは豚丹毒ワクチン注射による免疫状態の把握において重要な指標となる。また、豚丹毒罹患豚の臓器や関節からのErの検出のための試薬として応用することができる。Erを検出することにより、当該動物が豚丹毒症に罹患しているかどうかを診断することが可能となる。
【００３８】
例えば、豚丹毒症罹患豚の血清中の抗体測定に、当該ポリペプチドに対する抗体を用いた酵素免疫測定法（Enzyme linked immunosorbent assay:ＥＬＩＳＡ）を以下のようにして応用することができる。炭酸・重炭酸緩衝液 ｐＨ９．６等で希釈したウサギポリクロナール抗体を、市販のＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一夜吸着する。１％ゼラチン溶液等でブロッキングした後、緩衝液で希釈した本発明ポリペプチドを添加し、３７℃で約３０分間反応させる。次いで被験豚血清を添加し、３７℃で約３０分間反応後、抗豚ＩｇＧ酵素標識抗体を加えて３７℃で１５分間反応させる。洗浄後、基質・発色剤混合液（０．０４％ オルソフェニレンジアミン、０．０２％の過酸化水素を含むクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．０等）を加えて室温で２０分程度反応させる。停止液（４Ｎ 硫酸等）を加えて反応を停止させ、４９２ ｎｍでの吸光度値を測定する。この吸光度の程度が、被験血清中に含まれる該ポリペプチドに対する抗体レベルを示しており、ワクチン非注射豚においてこの数値が高い場合にはＥｒの感染あったものと診断できる。一方、ワクチン注射豚において、この数値の高低を調べることにより、ワクチン注射により誘導された防御免疫の獲得程度を知ることができる。
【００３９】
一方、同じＥＬＩＳＡ法を応用して、Ｅｒの検出を行なうことができる。前記と同様に炭酸・重炭酸緩衝液等により希釈した本発明ポリペプチドに対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡプレートに吸着させる。ブロッキング後、次いでＥｒの感染の疑われる豚の血液や関節液、臓器やリンパ節などの乳剤を緩衝液で希釈し、プレートに加えて３７℃で３０分程度反応させる。洗浄後、本発明ポリペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を加え、３７℃で３０分程度反応させ、洗浄後、これに市販の抗ウサギＩｇＧ酵素標識抗体を加えて、さらに３７℃で１５分程度反応させる。洗浄後、基質・発色剤混合液を加え、室温で２０分程度反応させた後、停止液を加えて反応を停止させ、４９２ ｎｍでの吸光度値を測定する。検体中にＥｒが存在した場合には高い吸光度値を示すことから、検体中のＥｒの存在を、培養法に比べてより迅速に検出でき、これにより、検査豚が豚丹毒症に罹患しているか否かを迅速に診断することができる。
【００４０】
上記に例示した他にも、本発明ポリペプチドを用いて周知の抗原抗体反応、例えばウエスタンブロット法、ラテックス凝集反応、蛍光抗体法およびラジオイムノアッセイなどにより、抗体測定およびＥｒの検出を実施することができる。
【００４１】
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００４２】
ＥｒのｓｐａＡ及びその関連遺伝子のクローン化
ＥｒのｓｐａＡ遺伝子を保有することが判明している各血清型菌、及びこれまでｓｐａＡ遺伝子が検出されていなかったＥｒ血清型菌およびその他のエリシペロトリックス属菌種から、ｓｐａＡ及びその関連遺伝子のクローン化を試みた。
【００４３】
Ｅｒの各血清型参考株を０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０、１％ 牛血清加トリプトース・ホスフェイト・ブロスにて３７℃、１８時間静置培養した。遠心により回収した菌体を、滅菌蒸留水に浮遊し、１００℃、５分間加熱処理後、遠心して上清を回収した。この上清中に含まれる染色体ＤＮＡをテンプレートとし、２種類のオリゴヌクレオチドプライマー Er60K-1F（図１、配列番号７）及びEr60K-2RH（図１、配列番号８）を用いてＰＣＲを行なった。その結果、これまでｓｐａＡを保有していることが知られているＥｒ血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、１２、１５、１６、１７及びＮの各血清型菌株において、約１．９ ｋｂの遺伝子断片が増幅された（図２）。次に、ｓｐａＡ遺伝子の存在が知られておらず、上記プライマーによって増幅産物が得られなかったＥｒの血清型菌およびその他のエリシペロトリックス属菌種である血清型４、６、１１、１９、２１および１８については、上記プライマーと配列が異なる新たな２種類のオリゴヌクレオチドプライマー Er70-1F（図１、配列番号９）及びEr70-2R（図１、配列番号１０）を合成し、これを用いて再度ＰＣＲを行なった。その結果、Ｅｒの血清型４、６、１１、１９および２１からは約１．９ ｋｂの、その他のエリシペロトリックス属菌種である血清型１８から約２ ｋｂのＤＮＡ増幅産物が認められた（図２）。これらの血清型菌より増幅されたＰＣＲ産物は、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製後、常法に従いそれぞれベクタープラスミド（pGEM-T Easy、Promega社製）にクローン化した。これをエレクトロポレーション法により大腸菌XL-1 Blue（Stratagene社製）に形質転換し、５０μｇ力価／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ寒天培地にて、３７℃、１８時間培養した。形成されたコロニーを、アンピシリン含有ＬＢ液体培地に接種して、３７℃、１８時間振盪培養し、得られた菌液から市販のキット（Qiagen Plasmid Kit、Qiagen社製）を用いて、各プラスミドＤＮＡを抽出、精製した。
【実施例２】
【００４４】
ｓｐａＡおよびその関連遺伝子の塩基配列解析とこれにコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列の比較
プラスミドにクローン化された各血清型菌由来ｓｐａＡ及びその関連遺伝子は、市販キット（BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit、Applied Biosystem (ABI)社製）を用いたジデオキシシークエンス反応後、全自動塩基配列決定装置（A310型、ABI社製）を用いてその全塩基配列を決定した。得られた塩基配列を元にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を検索し、このＯＲＦにコードされるＥｒ各血清型菌由来のＳｐａＡとその関連ポリペプチドのアミノ酸配列を推定した。
【００４５】
今回のＰＣＲにより増幅産物の認められたＥｒ各血清型菌とその他のエリシペロトリックス属菌種由来のＳｐａＡ関連ポリペプチドの推定アミノ酸配列について、相互に相同性検索を行なった成績を表1に示した。９５％以上の相同性を示すポリペプチドを一つのグループとすると、各ポリペプチドは明確に３つのグループに区分された。ＳｐａＡと９５％以上の相同性を示すグループ１には血清型１ａ、１ｂ、２、５、８、１２、１５、１６、１７およびＮのポリペプチドが属した。一方、ＳｐａＡとは６０％程度しか相同性を示さないが、お互いには９５％以上の相同性を示すグループ２として、血清型４、６、１１、１９および２１由来のポリペプチドが属した。さらに、ＳｐａＡ及びグループ２のいずれのポリペプチドとも約６０％程度の相同性しか示さないグループ３には、血清型１８（その他のエリシペロトリックス属菌種）由来のポリペプチドが属した。このように、Ｅｒ及びその他のエリシペロトリックス属菌種には、菌体表層防御抗原としてＳｐａＡを含めて少なくとも明確に異なる三種類のポリペプチドが存在することが明らかになった。そこで、従来報告のある血清型１および２型のポリペプチドはＳｐａＡと名づけられていることから、今回発見したＥｒの血清型４、６、１１、１９および２１が保有するポリペプチドをＳｐａＢ、その他のエリシペロトリックス属菌種の血清型１８が保有するポリペプチドをＳｐａＣとそれぞれ新たに命名することとした。
【００４６】
３種類のＳｐａポリペプチドを、分子内機能ドメイン別にアミノ酸の相同性を比較すると、Ｎ末端から２９アミノ酸を含むシグナル領域は、ＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣとも、同一の配列であった（図３、４、５および６）。Ｃ末端周辺のリピートユニット領域ではそれぞれのポリペプチド間で高い相同性が認められたが、リピートの回数はＳｐａＡ及びＳｐａＢは９回であったのに対して、ＳｐａＣは１０回であった。防御抗原性に関与すると考えられる中間部分のドメインについては、各ポリペプチド間で最も低い相同性を示し、４０−５０％程度であった。従って、各Ｓｐａポリペプチドをワクチンの成分として用いた場合、それぞれ異なった防御抗原性を示す可能性が示唆された。
【００４７】
以上の成績から、Ｅｒとその他のエリシペロトリックス属菌種には３種類の菌体表層防御抗原が存在することがはじめて明らかになった。以下、ＳｐａＡは血清型１ａのFujisawa株、ＳｐａＢは血清型６のDolphin E-1株、及びＳｐａＣにはその他のエリシペロトリックス属菌種に属する血清型１８の７１５株由来のポリペプチドをそれぞれ用い、以降の試験に供した。
【００４８】
【表１】
【実施例３】
【００４９】
各Ｓｐａポリペプチドの発現と精製
各Ｓｐａポリペプチドを、ヒスチジンヘキサマーとの融合タンパク質として組換え大腸菌で発現するために、各遺伝子をｐＱＥシリーズのベクターへ以下のようにしてクローン化した。
【００５０】
ｓｐａＡとｓｐａＢ遺伝子については、各プラスミドＤＮＡをBamHIとHindIIIで二重消化して約１．９ ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、同じ制限酵素で切断したｐＱＥ９ベクターに連結した。ｓｐａＣ遺伝子については、BamHIとSalIで二重消化して約２ ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、これを同じ制限酵素で切断したｐＱＥ３０ベクターに連結した。エレクトロポレーション法により各連結体を大腸菌XL-1 Blueに形質転換し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地で培養し、コロニーを形成させた。
【００５１】
平板上に形成されたコロニーをそれぞれ選択し、アンピシリンを含むＬＢ液体培地２５０ ｍＬに接種し、３７℃、１８時間振盪培養した。この培養液から、遠心により菌体を回収し、これを１ ｍＭ イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地２５０ ｍＬに再浮遊し、さらに３７℃、４時間振盪培養することによって各Ｓｐａポリペプチドを発現した。各ポリペプチドを発現した大腸菌は、遠心により回収し、超音波破砕装置（Sonic Power、Branson社製）を用いてレベル５で２０秒、数回の超音波処理によって菌体を破砕した。これを１０，０００×ｇで２０分間遠心し、沈殿した各Ｓｐａポリペプチドを３．５Ｍグアニジンバッファー（ｐＨ ７．４）に浮遊して可溶化した。可溶化された各Ｓｐａポリペプチドは、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィー（キアージエン社製）により、付属の取扱い説明書に従って精製操作を行った。
【実施例４】
【００５２】
ＳｐａＡ、Ｂ及びＣポリペプチドの交差防御免疫誘導能
５週齢のｄｄＹマウス１６０匹を使用し、４０匹ずつ４群に分け、それぞれＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣの各ポリペプチド４０μｇタンパク量／匹を市販水中油滴型アジュバント（セピック社製）と等量混合し、３週間隔で２回皮下に注射して免疫した。残りの４０匹は非注射対照とした。第２回注射後２週に各群をさらに１０匹ずつ４区に分け、Ｅｒ血清型１ａ、２、６および１８の生菌をそれぞれ０．１ｍｌ皮下接種して攻撃した。攻撃菌量は順に２．９×１０２、３．８×１０２、４．１×１０４および６．９×１０２ ＣＦＵであった。攻撃後２週間観察し、生死により防御効果を判定した。
【００５３】
非注射対照群は、いずれの血清型菌の攻撃に対してもすべて死亡した（表２）。ＳｐａＡを保有する血清型１ａおよび２型菌の攻撃に対しては、ＳｐａＡおよびＳｐａＣの両免疫群で高度な防御が認められたが、ＳｐａＢ免疫群では１ａ型菌攻撃に対して９匹、２型菌攻撃に対して５匹が死亡し、防御効果が認められなかった。同様に、ＳｐａＢを保有する血清型６の攻撃に対しては、ＳｐａＢおよびＳｐａＣ免疫群では防御されたが、ＳｐａＡ免疫群では５匹が死亡し、防御の程度は不十分であった。ＳｐａＣを保有する血清型１８の攻撃に対しては、ＳｐａＣ免疫群で高度な防御がみられたが、ＳｐａＡおよびＳｐａＢ免疫群でそれぞれ３および４匹が死亡し、防御の程度は中等度であった。以上の成績から、３種類のＳｐａのうち、各血清型菌の攻撃に対して最も高い交差防御抗原性を示すものはＳｐａＣポリペプチドであることが判明した。
【００５４】
【表２】
【実施例５】
【００５５】
ＳｐａＣΔＣポリペプチドの作出とその免疫原性
大腸菌における全長のＳｐａＣポリペプチドの発現量は低かった。そこで、ＳｐａＣ分子を機能領域（ドメイン）ごとに見ると、Ｃ末端付近に存在するリピート領域及びプロリンおよびグリシンを多く含む疎水性領域は、StreptococcusやClostridiumなどの他のグラム陽性菌の例（Pancholi, V. and Fischetti, V.A., J.Bacteriol.,170, 2618-2624, 1988; Yother, J. and Briles, D.E., J.Bacteriol.,174, 601-609, 1992）から類推して、当該ポリペプチドの菌体表層への結合にかかわるものと思われた。従って、本領域は防御抗原性には直接関与しないと考えられたため、Ｃ末端から２３７アミノ酸を除去したポリペプチド（以下ＳｐａＣΔＣと呼ぶ）を作出する目的で、ｓｐａＣ遺伝子の３’末端から７１４ｂｐを欠損したＤＮＡ断片を構築した。当該断片を増幅するため、Er70-1F（図１、配列番号９）及びEr70K18-2R（図１、配列番号１１）という２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、ｓｐａＣ遺伝子をテンプレートとしてＰＣＲを行なった。増幅された約１．３ ｋｂのＤＮＡ断片は、実施例２と同様にpGEM-Easyベクターにクローニングし、塩基配列を決定することによって所定のＤＮＡ断片が挿入されていることを確認した。次いで、本遺伝子断片にコードされるＳｐａＣΔＣポリペプチドを大腸菌内でヒスチジンヘキサマーとの融合タンパクとして発現するため、実施例２と同様に、制限酵素BamHIとSalIで切断することにより遺伝子断片を切り出し、同じ酵素で切断したpQE30発現用ベクターにクローン化した。このプラスミドを形質転換した大腸菌では、ＳｐａＣΔＣポリペプチドの配列から予想される分子量である約４９ ｋＤａの位置に大量のポリペプチドの発現が認められた（図７）。一方、全長のｓｐａＣ遺伝子を含むプラスミドを形質転換した大腸菌では、ＳｐａＣの分子量に一致する７６ ｋＤａ付近とその分解産物と思われる５０〜４０ ｋＤａ付近に薄いバンドが認められた。ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、発現大腸菌を破砕して抽出し、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いて実施例２と同様に精製を行った。
【００５６】
このＳｐａＣΔＣポリペプチドが、元のＳｐａＣ分子と同様に免疫原性があるか、そして、免疫したときに複数の血清型菌の攻撃に対する交差防御性が失われていないかの確認を試みた。５週齢のｄｄＹマウス９０匹を使用し、３０匹には全長のＳｐａＣポリペプチドを、他の３０匹にはＳｐａＣΔＣポリペプチドを、それぞれ１匹当たり４０μｇタンパク量となるように調製し、アジュバントとともに３週間隔で２回皮下に注射した。残りの３０匹は非免疫対照群とした。第２回注射後２週に各群をさらに１０匹ずつの３群に分け、それぞれＥｒ血清型１ａ、６または１８型の生菌を各０．１ｍｌずつ皮下接種して攻撃した。攻撃菌量はそれぞれ３．３×１０２ ＣＦＵ （１ａ型）， ４．６×１０４ ＣＦＵ （６型）、及び ７．１×１０２ ＣＦＵ （１８型）であった。攻撃後２週間観察し、生死により防御効果を判定した。
【００５７】
全長のＳｐａＣポリペプチドを免疫したマウスでは、１型菌攻撃で１０匹中７匹が、６型菌攻撃で７匹が、及び１８型菌攻撃で８匹がそれぞれ生残した（表３）。一方、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫したマウスでは、１型菌攻撃で１０匹が、６型菌攻撃で９匹が、及び１８型菌攻撃で９匹がそれぞれ生残した。
【００５８】
以上の成績から、Ｃ末端に存在する２３７アミノ酸を除去したＳｐａＣΔＣポリペプチドは、全長のＳｐａＣポリペプチドと比較して同等以上の免疫原性があり、交差防御能も担保されていた。このことは、Ｓｐａポリペプチドにおいて、防御抗原性はＮ末端から中間部分に渡って存在し、Ｃ末端付近のリピート領域には存在しないというShimojiら(Infect. Immun,67: 1646-1651, 1999)の報告と一致していた。ＳｐａＣΔＣポリペプチドは全長のＳｐａＣに比べて大腸菌での発現効率が１０倍以上であることから、豚丹毒予防ワクチンの成分として極めて有用であると考えられた。
【００５９】
【表３】
【実施例６】
【００６０】
ＳｐａＣΔＣポリペプチドの豚における免疫試験
SpaCΔCポリペプチドの免疫原性を、実際の対象動物である豚を用いて確認することとした。
【００６１】
試験には４週齢のＳＰＦ豚９頭を供試した。３頭ずつ３群に分け、第１群にはＳｐａＣΔＣポリペプチドを１頭当たり２００μｇタンパク量となるよう調製し、市販の豚用アジュバントＮｏ．１１（セピック社製）とともに３週間隔で２回注射した。第２群は第１群と同量のＳｐａＣΔＣポリペプチドを、市販の豚用アジュバントＮｏ．１３（セピック社製）とともに同様に注射した。第３群は非注射対照とした。各免疫豚は、最終免疫後２週に対照群とともに、Ｅｒ藤沢株（血清型１ａ）１．０×１０６ ＣＦＵを皮内接種することにより攻撃した。攻撃後１週間臨床観察を行い、試験終了時に剖検し、各臓器について肉眼的に観察するとともに、菌分離を行った。また各群の豚について免疫前と攻撃時に採血を行い、血清中に産生されたＳｐａＣΔＣポリペプチドに対する抗体を以下に記載するＥＬＩＳＡによって調べた。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ用の市販９６穴マイクロプレートの各穴に、炭酸重炭酸緩衝液ｐＨ９．６で10,000倍に希釈したSpaCΔCポリペプチドに対するウサギポリクロナール抗体を添加し、４℃で一夜静置して吸着させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０添加生理食塩水で洗浄後、１％ゼラチン液を加え、室温で１時間以上静置してブロッキングした。洗浄後、０．２５μｇタンパク量のSpaCΔCポリペプチドを加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０−１％ゼラチン加ＰＢＳ（−）により１００倍に希釈された豚血清を加え、３７℃で約３０分間反応した。洗浄後、１０，０００倍に希釈した抗豚ＩｇＧペルオキシダーゼ標識抗体（ロックランド社製）を加え、３７℃、１５分間反応させた。洗浄後、基質・発色剤混合液（０．０４％ オルソフェニレンジアミン、０．０２％ 過酸化水素を含むクエン酸・リン酸緩衝液 ｐＨ５．０）を加えて３０℃、２０分間反応後、２Ｍ硫酸を加え発色を停止した。各穴について４９２ｎｍにおける吸光度（ＯＤ）を測定し、Ｅ値［（被験血清のＯＤ値−指示陰性血清のＯＤ値）÷（指示陽性血清のＯＤ値−指示陰性血清のＯＤ値）］を算出した。Ｅ値０．１以上を陽性と判定した。
【００６３】
２種類の市販豚用アジュバントを用いてＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫したワクチン群の豚には、いずれも注射に伴う発熱、沈うつ等の副反応は認められず、また注射局所にも発赤、硬結等の異常はなく、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、豚用ワクチンの成分として安全に使用できることが確認された。
【００６４】
各群に対するＥｒ生菌攻撃後、対照群は重度の臨床症状を呈し、全頭が死亡した（表４）。これらの死亡豚の各臓器からは攻撃菌が純培養状に分離された。一方、二種類のアジュバントを用いてＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫した両ワクチン群では、いずれも臨床症状を示さず、死亡豚も認められなかった。剖検においても、いずれの豚の臓器からも攻撃菌は回収されなかった。
【００６５】
抗体検査において、試験開始前のすべての豚で、ＳｐａＣΔＣポリペプチドに対する抗体は検出されなかった。第２回注射後２週（攻撃時）には、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫した両ワクチン群のすべての豚で抗体が陽転した。一方、対照群の３頭は、すべて陰性に経過した。
【００６６】
以上の成績から、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは、いずれの市販豚用アジュバントを用いた場合でも、豚において抗体産生が可能で、免疫することによってＥｒの生菌攻撃に対して高度な防御を付与できることが判明した。このことから、ＳｐａＣΔＣポリペプチドは豚丹毒予防ワクチンの成分として有用であることが実証された。
【００６７】
また、ＳｐａＣΔＣポリペプチドに対するウサギポリクロナール抗体をＥＬＩＳＡによって、ワクチン注射により上昇した抗体を検出することが可能で、本ＥＬＩＳＡによる抗体検査成績と攻撃試験による防御効果とはよく一致していた。従って、ＳｐａＣΔＣポリペプチドを抗原に用いた抗体測定を実施することによって、Ｅｒに対する抗体レベルを知ることができる。
【００６８】
【表４】
【実施例７】
【００６９】
単純工程で調製したSpaCΔCポリペプチドを用いた豚での免疫試験
実施例６では、ニッケルレジンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用い、高度に精製したＳｐａＣΔＣポリペプチドを免疫原に使用し、感染防御活性があることが確認された。けれども、実際にワクチンの抗原として用いるには、やや純度は劣るものの、大量かつ安価にポリペプチドを得る方法を確立することが必要となる。そこで、以下に述べるような単純な工程において調製されたＳｐａＣΔＣポリペプチドが、豚に対して免疫原性を保持しているかどうかの検討を行なった。
【００７０】
実施例３に述べたようにしてＳｐａＣΔＣポリペプチドを発現した大腸菌を、培養液から遠心して回収し、超音波破砕装置（Sonic Power、Branson社製）を用いてレベル５で２０秒、数回の超音波処理を行なうことにより菌体を破砕した。これを１０，０００×ｇで２０分間遠心し、沈殿に回収されたＳｐａＣΔＣポリペプチドを３．５Ｍグアニジンバッファー（ｐＨ ７．４）に浮遊して可溶化した。これを室温で１５，０００ｒｐｍ、５分間遠心して不溶性の沈さを除去し、得られた上清をＳｐａＣΔＣポリペプチド溶液とし、これをワクチンの調製に用いた。
【００７１】
約４週齢のＳＰＦ豚６頭を用い、３頭を免疫群、残り３頭を非注射対照群とした。免疫群の豚には、上記のようにして調製したＳｐａＣΔＣポリペプチドを、１頭１回当たり１００μｇタンパク量となるよう調製し、Ｎｏ．１３アジュバントとともに３週間隔で２回、筋肉内に注射した。残り３頭は非注射対照とした。第２回注射後２週にＥｒ藤沢株（血清型１ａ）１．２ ×１０６ ＣＦＵを皮内に接種して攻撃した。攻撃後１週間臨床観察を行い、試験終了時に剖検し、各臓器からＥｒの分離を行った。
【００７２】
攻撃後、対照群は重度の臨床症状を呈して、全頭が死亡した（表５）。死亡豚の各臓器からはＥｒが純培養状に分離された。一方、単純工程で調製したＳｐａＣΔＣポリペプチドで免疫した豚はいずれも臨床症状を示さず、臓器からもＥｒは分離されなかった。
【００７３】
以上の成績から、大量かつ安価にポリペプチドの調製が可能な単純工程により得られたＳｐａＣΔＣポリペプチドにおいても、高度に精製されたものと同様に、豚に免疫することによってＥｒ強毒株の攻撃に対し、感染・発病を完全に防御できる活性を有することが確認された。従って、このような比較的単純な工程により、十分な防御抗原性をもつＳｐａＣΔＣポリペプチドが得られたことは、実際のワクチン製造を行なう上で、非常に有用であると考えられた。
【００７４】
【表５】
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本願の請求項１の発明によれば、豚に免疫したときにＥｒ強毒株の攻撃に対し感染、発病を完全に防御するポリペプチドを得ることができ、請求項７に記載した豚丹毒に対するワクチンとして用いることができる医薬品組成物を提供することができるので、本願発明は有用である。
【００７６】
また、請求項２の発明によれば、このポリペプチドをコードする遺伝子が得られ、請求項４、５および６の遺伝学的手法により発現させることで、当該ポリペプチドを単純工程で大量かつ安価に製造することができるので、本願発明は有用である。
【００７７】
更に請求項８および９の発明によれば、請求項１に示したポリペプチドに特異的な抗体を得、これを用いて豚丹毒の診断あるいはワクチン接種豚の免疫状態を把握するための抗体検出を実施することがでるので、本願発明は有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Ｅｒ各血清型菌におけるＳｐａＡ、ＳｐａＢ、ＳｐａＣ およびＳｐａＣΔＣ遺伝子のＰＣＲクローニング用プライマー。
【図２】Ｅｒ各血清型菌におけるＳｐａＡ、ＳｐａＢおよびＳｐａＣ遺伝子のＰＣＲによる検出 （Ｍは分子量マ−カ−：上から１０、８， ６， ５、４、３、２．５、２、１．５、１および０．５ ｋｂ）
【図３】各Ｓｐａポリペプチドの分子構造比較。
【図４】ＳｐａＡ（血清型１ａ）とＳｐａＢ（血清型６）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図５】ＳｐａＡ（血清型１ａ）とＳｐａＣ（血清型１８）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図６】ＳｐａＢ（血清型６）とＳｐａＣ（血清型１８）各ポリペプチドのアミノ酸配列の比較。
【図７】ＳｐａＣの全長およびＣ末端領域欠損断片の大腸菌での発現の電気泳動写真。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚丹毒菌に対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚丹毒菌に対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２および４に示すヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターにより豚丹毒菌の感染防御免疫活性を有するポリペプチドを生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に請求項１に記載のポリペプチドを生産させ、該ポリペプチドを精製することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを成分として含有することを特徴とする豚丹毒症に対する予防ワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを認識することを特徴とするモノクローナルおよびポリクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項２に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の形質転換体または請求項８に記載の抗体を用いることを特徴とする豚丹毒菌の検出方法、抗体検査方法および豚丹毒症の診断試薬。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚丹毒菌に対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（ｄ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ豚丹毒菌に対する感染、発病防御免疫活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号２および４に示すヌクレオチド配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターにより豚丹毒菌の感染防御免疫活性を有するポリペプチドを生産するように形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、形質転換体に請求項１に記載のポリペプチドを生産させ、該ポリペプチドを精製することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドを成分として含有することを特徴とする豚丹毒症に対する予防ワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドを認識することを特徴とするモノクローナルおよびポリクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチド、請求項２に記載のＤＮＡ、請求項５に記載の形質転換体または請求項８に記載の抗体を用いることを特徴とする豚丹毒菌の検出方法、抗体検査方法および豚丹毒症の診断試薬。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図７】
【公開番号】特開２００６−２５６５９（Ｐ２００６−２５６５９Ａ）
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２０７１１９（Ｐ２００４−２０７１１９）
【出願日】平成１６年７月１４日（２００４．７．１４）
【出願人】（５９３１６９５００）日生研株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１４日（２００４．７．１４）
【出願人】（５９３１６９５００）日生研株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]