エリスロポイエチンを精製する方法
本発明は、エリスロポイエチンを精製する方法に関し、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：ａ）細胞成分の除去；およびｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程ｉ）逆相クロマトグラフィー；ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポイエチンを精製する方法に関し、この場合エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、確定された形式で順次に実施される一定のクロマトグラフ後処理工程によって後処理される。
【０００２】
エリスロポイエチン、略してＥＰＯと呼称される、は、グリコ蛋白質であり、このグリコ蛋白質は、骨髄中の赤血球の形成を刺激する。ＥＰＯは、主に腎臓内で形成され、そこから血液循環路を経て目的地に到達する。腎臓機能不全の場合、損傷された腎臓は、殆んどＥＰＯを産生しないかまたはそもそも全くＥＰＯを産生せず、このことは、骨髄の菌種細胞から殆んど赤血球を生じない結果をまねく。このいわゆる腎臓貧血は、赤血球の形成を骨髄中で刺激する生理的量でＥＰＯを投与することによって処置される。投与に使用されるＥＰＯは、ヒトの尿から取得されることができるか、または遺伝子工学的方法によって製造されることができる。ＥＰＯは、ヒトの体内に極く微少量で含まれているので、治療的用途のために天然の源からＥＰＯを単離することは、実際に不可能である。従って、遺伝子工学的方法は、前記物質を大量に産生する唯一の経済的方法を提供する。
【０００３】
エリスロポイエチンを組換えにより製造することは、エリスロポイエチン遺伝子を１９８４年に同定して以来、可能である。１９９０年の初頭以来、ヒトのエリスロポイエチンを含有する種々の医薬品が開発されており、この場合このエリスロポイエチンは、遺伝子工学的過程で真核細胞中、なかんずくＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）中で産生された。遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンの製造は、例えば欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書および欧州特許出願公開第２０５５６４号明細書中に記載されている。
【０００４】
エリスロポイエチンは、通常、ＣＨＯ宿主細胞中で遺伝子組換えにより製造される。このＣＨＯ宿主細胞は、早期には胎児子牛血清および多くの場合に牛インシュリンも添加された培地中で培養されたが、この培養は、今日では規則的に血清不含および蛋白質不含の培地中で行なわれている。こうして、ウシ蛋白質、ウシウィルス、ウシＤＮＡまたはウシに由来する別の望ましくない物質での汚染の危険性は、完全に排除される。真核細胞の培養に適した血清不含および蛋白質不含の培地は、種々の製造業者によって提供され、例えば培地ＭＡＭ−ＰＦ２は、特に、Bioconcept社, Allschwil, Schweiz在、によって販売されており、或いは培地ＤＭＥＭおよびＤＭＥＮＵ１２は、例えば、Invitrogen/Gibco社, Eggenstein, Deutschland在、によって提供されている。
【０００５】
また、エリスロポイエチンのための種々のクロマトグラフ精製法は、既に公知技術水準に記載されている。欧州特許出願公開第０２２８４５２号明細書には、クロマトグラフ工程の陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む、生物活性エリスロポイエチンを液体から精製する方法が記載されている。
【０００６】
欧州特許出願公開第０２６７６７８号明細書には、血清不含の培養で製造されたエリスロポイエチンを精製することが記載されており、この場合には、連続して透析、イオン交換クロマトグラフィー、分取逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィーが実施される。この場合、ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、イオン交換クロマトグラフィーによって置き換えられてよい。同様に、（第１の）イオン交換クロマトグラフィー前に染料アフィニティークロマトグラフィーをブルートリサクリルカラム（Blue Trisacryl-Saule）で実施することが提案されている。
【０００７】
欧州特許出願公開第０８３０３７６号明細書には、培養上澄液からのＥＰＯをクロマトグラフ精製の第１工程で染料アフィニティークロマトグラフィーに掛ける、エリスロポイエチンを精製する方法が記載されている。第２工程でクロマトグラフィーは、疎水化された担体上で行なわれ、この後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが続く。更に、これには、逆相ＨＰＬＣが引き続き、この後に最後のクロマトグラフィー工程としての陰イオン交換クロマトグラフィーが続く。
【０００８】
欧州特許出願公開第１１２７０６３号明細書には、次の工程を含むエリスロポイエチンのための精製方法が記載されている：示差沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー。個々の精製工程は、欧州特許出願公開第１１２７０６３号明細書に記載された順序で実施される。この方法の変法において、精製は、次の工程を含む：示差沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、もう１つのダイアフィルトレーションおよびサイズ排除クロマトグラフィー。全ての場合に、この方法は、第１工程に沈殿が設けられ、この後に遠心分離が設けられている。同様に、ゲル濾過は、クロマトグラフ精製の終結時に強制的に設けられている。
【０００９】
国際出願のＷＯ−Ａ−０３／０４５００６には、陰イオン交換クロマトグラフィー、この後に逆相クロマトグラフィーおよびもう１つの陰イオンクロマトグラフィーを含む、ＥＰＯのための精製方法が記載されている。第２の陰イオン交換クロマトグラフィーには、ゲル濾過媒体を使用しながらのサイズ排除クロマトグラフィーが引続く。
【００１０】
また、欧州特許出願公開第０４２８２６７号明細書の対象は、エリスロポイエチンを精製することである。この場合、クロマトグラフィーは、Ｑセファロースカラムで実施され、この後に一部分は、逆相クロマトグラフィーおよびゲル濾過が続く。
【００１１】
ＷＯ ２００５／１２１１７３には、発酵法により製造されたＥＰＯを後処理する方法が記載されている。この方法は、少なくとも４つの種々のクロマトグラフ分離法を有するクロマトグラフ精製から出発する。第１の陰イオン交換クロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが後に続き、この場合この最後に記載された３種類のクロマトグラフィーの順序は、任意であることができる。最終的に、再び陰イオン交換クロマトグラフィーが使用される。
【００１２】
即ち、前記方法により少なくとも５つのクロマトグラフィー工程が必要とされ、欧州薬局方によって要求された純度の判断基準を満足するＥＰＯを製造することができる。適したＥＰＯのための判断基準は、なかんずく１００ｐｐｍ未満の宿主細胞に由来する異質蛋白質の含量、ＥＰＯ１ｍｇ当たり１００ｐｇ未満の宿主細胞からのＤＮＡの含量、および最終的にアイソホーム組成物に関連して標準に相当する組成物である（Ph. Eur.:01/2001：1316）。
【００１３】
本発明の課題は、もう１つの精製法を記載することである。この精製法は、欧州薬局方（Ph. Eur. 04/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に相当し、および適当に工業的な、殊に発酵によるＥＰＯ生産に使用することができるＥＰＯ最終製品を提供するはずである。殊に、本発明による方法は、経済的な視点から公知技術水準の方法を凌駕するはずである。更に、本発明による方法は、僅かなクロマトグラフ精製工程で精製効率を殆んど劣化せずに間に合わせ、特殊な工業的に費用の掛かるクロマトグラフィー工程、例えばアフィニティークロマトグラフィーを省略することができるはずである。
【００１４】
工業的課題は、エリスロポイエチンを精製する方法によって解決され、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる。
【００１５】
本方法の好ましい実施態様において、工程ａ）の前および工程ａ）〜ｂｉｉｉ）の間には、クロマトグラフィー法は、全く使用されない。更に、その上、工程ｂｉｉｉ）後も別のクロマトグラフィー法が全く使用されないことは、好ましい。
【００１６】
本発明による方法を用いると、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に相当するエリスロポイエチン製品が製造される。この場合、抗して製造されたエリスロポイエチンは、次の判断基準を満たす：１００ｐｐｍ未満の宿主細胞に由来する異質蛋白質の含量、ＥＰＯ１ｍｇ当たり１００ｐｇ未満の宿主細胞からのＤＮＡの含量、および最終的にアイソホーム組成物に関連して標準に相当する組成物（Ph. Eur.:01/2002：1316）。更に、得られたＥＰＯ製品は、バイオアッセイにおいて１ｍｇ当たり少なくとも１５００００ＩＥの生物活性を有する。更に、ＩＥＦにおけるバンドパターンおよびグリコシル化パターンは、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートに相当する。
【００１７】
それにも拘わらず、哺乳動物細胞の培養による生物工学的ＥＰＯ製造の発酵上澄液を精製する方法において、細胞成分によって精製された発酵上澄液が次のクロマトグラフィー工程によって記載された順序で処理されることによって、
ｉ）逆相クロマトグラフィー（ＲＰクロマトグラフィー）、
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥクロマトグラフィー）、
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡクロマトグラフィー）は、課された課題を解決するために意外にも極めて有利に達成される。当業者であっても、設定された課題と対比して、公知技術水準、殊にＲＰクロマトグラフィーはできるだけ回避させるべきであるというＷＯ ２００５／１２１１７３に照らしてみて、標準法によるＥＰＯを精製するために必要とされるクロマトグラフィー工程の数を減少させることが可能であることは、成果であるとは見なさなかった。それによって、よりいっそう僅かな装置費用、人件費および材料費ならびに時間の節約が生じるが、しかし、なかんずくウィルスによる汚染からの最も高度な安全性を生じる。また、本発明による方法を用いると、助剤および懸念する心配のない有機溶剤、例えばエタノールまたは２−プロパノールは、殆んど使用しなくともよい。前記目的は、適当に、上記のクロマトグラフィー工程を記載された順序で実施することによって達成される。
【００１８】
本発明による方法において利用されるクロマトグラフィーの原理は、刊行物に公知であり、当業者によく知られていることである（Muyer, Praxis der Hochleistungs-Flussigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004; Unger, Handbuch der HPLC, 第１部および第２部, GIT Verlag Darmstadt 1994）。更に、クロマトグラフィー媒体に関してさらに詳細に説明される情報は、それぞれの製造業者または刊行物の製品情報に見出される。
【００１９】
更に、エリスロポイエチンを産生する真核細胞が哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、この細胞が遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンを発現することは、好ましい。
【００２０】
更に、好ましい方法には、付加的にバンドパターンまたはグリコシル化パターンに点で参照材料に相当しない溶出液画分がｉｉ）によるもう１つの陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはｉｉｉ）によるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに掛けられることが設けられている。
【００２１】
更に、工程ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）により限外濾過が実施されることは、好ましい。
【００２２】
更に、好ましい方法において、工程ａ）は、マイクロ濾過および引続く限外濾過を含む。
【００２３】
好ましくは、逆相クロマトグラフィーは、固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この固定相は、Ｃ1〜Ｃ8変性シリカゲル、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする疎水化ポリマー担体およびシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料から選択され、溶出液としては、アルカノール水溶液が使用される。特に有利には、エタノールまたは２−プロパノール、またはこれらの混合物が使用され、殊に有利には、２−プロパノールが溶出液としての相応する緩衝された水性系と一緒に使用される。
【００２４】
更に、好ましい方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基を有する固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この官能基は、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第四アンモニウム基またはジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）から選択されている。
【００２５】
更に、陰イオン交換クロマトグラフィーが水性緩衝系、特に有機酸を基礎とする緩衝系、殊にアセテート緩衝液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含むことは、好ましい。
【００２６】
特に有利には、陰イオン交換クロマトグラフィーは、３．５〜５．５のｐＨ、特に有利に４．０〜５．０のｐＨ、殊に有利に約４．５のｐＨを有する緩衝水溶液を用いる少なくとも１つの洗浄工程を含む。緩衝液としては、なかんずくアセテート緩衝液、特に酢酸ナトリウム緩衝液が適している。
【００２７】
好ましくは、溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中の無機酸が使用される。更に、特に有利には、溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中のクロリドイオンが使用される。
【００２８】
更に、好ましい方法において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、無機酸を基礎とする緩衝系、特にアセテート緩衝液を用いる少なくとも１つの洗浄工程を含む。
【００２９】
同様に、溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に無機酸を基礎とする緩衝系、特に有利に燐酸塩緩衝液が使用される。
【００３０】
特に好ましい実施態様の説明
本発明は、エリスロポイエチンを精製する方法を提供し、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる。
【００３１】
逆相クロマトグラフィーは、"捕捉工程（Capture-Schritt）"として使用される。前記の第１の精製工程において、発酵上澄液からのＥＰＯは、含量増加される。この場合には、試料分子と固定相との間の異なる疎水性相互作用が重要である。試料成分は、この試料成分が水中での溶解が僅かであればあるほど、即ちよりいっそう非極性であればあれほど、ますます強く保持される。逆相クロマトグラフィーは、シリカゲルを基礎とし、ならびにポリマーを基礎とする、特に蛋白質分析に適している従来の市販の位相材料を用いて実施されることができる。典型的には、短鎖状炭素被覆、例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４を有する大孔径シリカゲル材料、例えば３００オングストロームまたは５００オングストローム、は、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする非多孔質の疎水化ポリマー担体および同様にシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料が使用される。前記固定相の製造業者または納入業者には、なかんずくＭｅｒｃｋ社、Ｗａｔｅｒｓ社、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｄｉｏｎｅｘ社、ＹＭＣ社、Ｐｈｅｏｍｅｎｅｘ社、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社およびＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社が挙げられる。
【００３２】
好ましい逆相材料は、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする非極性の疎水化ポリマー担体である。特に好ましいのは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＳＯＵＲＣＥ ３０ＲＰＣまたは相応する１５μｍ材料（ＳＯＵＲＣＥ １５ＲＰＣ）である。
【００３３】
溶出液として、特にアルコール、例えばエタノールまたは２−プロパノール、またはこれらの相応する緩衝水性系との混合物が使用されてよい。特に有利には、２−プロパノールが使用され、それというのも、溶出液中の有機溶剤含量は、エタノールと比較して明らかに僅かであり、こうして安全技術的および経済的な利点を有する。更に、２−プロパノールは、混合可能性および溶解性の性質に基づいて溶解助剤として卓越して好適である（Unger, Handbuch der HPLC, 第Ｉ部, GIT Verlag Darmstadt 1994, Nowotny et al., Chromatographia 1988, 25, 409-412）。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、試料溶液の帯電イオンと使用された緩衝液媒体との競合的相互作用に基づく。陰イオン交換クロマトグラフィーは、従来の市販の陰イオン交換樹脂を用いて、ジエチルアミノエチル官能化（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル官能化（ＱＡＥ）、第四アンモニウム官能化またはジメチルアミノエチル官能化（ＤＭＡＥ）で実施されてよい。前記の位相材料は、例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社またはＭｅｒｃｋ社から入手可能である。好ましくは、ジチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）官能化陰イオン交換樹脂が使用される。特に有利には、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社から入手可能なＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（３０μｍ）が使用される。このクロマトグラフィー工程は、ＥＰＯ最終製品において必要とされるグリコシル化パターンに関連して重要である。
【００３５】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、好ましい実施態様において酸洗浄工程（"酸性洗浄液"）を含み、この場合エリスロポイエチンの塩基性アイソホームは、ｐＨの低下によって溶離され、それによって分離される（欧州特許第１４２８８７８号明細書）。この場合、"酸性洗浄液"は、洗浄緩衝液のｐＨ値が３．５〜５．５、特に有利に４．０〜５．０、殊に有利に約４．５であることを意味する。緩衝液としては、なかんずく酢酸ナトリウム緩衝液が適している。
【００３６】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーには、通常のヒドロキシアパタイト（またはヒドロキシルアパタイト）材料が使用されてよい。ヒドロキシルアパタイトは、六方晶燐酸カルシウムであり、特に蛋白質と別のバイオポリマーとの分離に適している。この精製工程は、"燐酸塩処理された"ＥＰＯ分子の除去のために実施される。好ましくは、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（Bio-Rad社）が使用され、特に有利には、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト タイプ１（Bio-Rad社）が使用される。
【００３７】
逆相クロマトグラフィーならびに陰イオン交換クロマトグラフィーならびにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、全ての生成物収量の向上のために、製品品質の点、殊にバンドパターンまたはグリコシル化パターンの点で参照材料に相当しないような溶出液画分のための再処理の範囲内で繰り返されてよい。この場合、典型的には、主要画分の早期の縁部画分または後の縁部画分が問題であり、この場合この主要画分は、それ自体既に第１の精製工程後に望ましい生成物の性質を有する。種々の精製工程での画分の利点は、標準法で等級付けられる（等電集束法（ＩＥＦ）およびパルス化電流滴定検出での高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）：Lasne, Nature 2000, 405 605-635;Hollander et al., LaborPraxis 2004, 56-59, Hokke et al., ,Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981-1008; Dionex Technical Note 42, 1997）。参照材料として、それぞれ市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）が使用される。
【００３８】
記載されたクロマトグラフィー法での培養上澄液の精製前に、細胞分離のためにマイクロ濾過が１．２μｍおよび０．６５μｍのフィルターを介して実施される。引き続き、細胞不含の濾液は、出発容量の１／１０に限界濾過される（カットオフ１００００Ｄａ）。限外濾過後、濃縮された細胞上澄液は、滅菌濾過され、第１のクロマトグラフィー工程（逆相クロマトグラフィー）に使用される。濾過工程、殊に滅菌濾過は、刊行物に公知であり、当業者によく知られている（Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990; Ullmann B2, 10-2, 10-21およびB3 11-6; Gasper, Handbuch der industriellen Fest-Flussig-Filtration, Huthig Heiderberg 1990; Ullmann A16, 187-258）。
【００３９】
本発明による方法で得られたＥＰＯは、欧州薬局方に定義された品質判断基準を満たすことが見い出された。殊に、アイソホーム組成物およびグリコシル化パターンは、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に定義された標準に相当する。参照材料として市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）が使用される。
【００４０】
蛋白質の活性は、少なくとも１０００００ ＩＥ／ｍｇ、特に少なくとも１２５０００ ＩＥ／ｍｇ、殊に有利に少なくとも１５００００ ＩＥ／ｍｇである（欧州薬局方 01/2002:1316も参照のこと）。
【００４１】
本発明により精製されたＥＰＯは、真核細胞中で製造された、有利に遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンである。好ましくは、遺伝子組換えＥＰＯは、例えば欧州特許出願公開第０２０５５６４号明細書および欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書中に記載されているように哺乳動物細胞中、特に有利にＣＨＯ細胞中で製造される。発酵は、市販の培地中での従来のプロトコルにより行なわれる。
【００４２】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、本発明の範囲内で、エリスロポイエチン形成を骨髄中で刺激し、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に記載されたアッセイにより明らかにエリスロポイエチンとして同定することができる状態にある全ての蛋白質である（赤血球増加症または正赤血球症（normocythaemic）のマウスの活性の測定）。エリスロポイエチンは、野生型ヒトエリスロポイエチン、または１つ以上のアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物を有する前記野生型ヒトエリスロポイエチンの変形であることができる。エリスロポイエチンの変形が問題である場合には、この変形がアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物による野生型ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸位置 単に１〜２０、有利に単に１〜１５、特に有利に単に１〜１０で区別されることは、好ましい。
【００４３】
エリスロポイエチンの精製またはエリスロポイエチンの含量増加は、本発明において、蛋白質のエリスロポイエチンが混合物から極めて純粋な形で得られ、即ち混合物中に含有されたエリスロポイエチンが、本質的に標準的なエリスロポイエチンと共に他の蛋白質をもはや含有しなくなるまで含量増加されることである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、例示的に逆相クロマトグラフィーの際のエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図２】図２は、例示的に陰イオン交換クロマトグラフィーの条件下でエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図３】図３は、例示的にＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートと比較した、陰イオン交換クロマトグラフィーによる単離されたＥＰＯ溶出液画分のＩＥＦゲルを示す。
【図４】図４は、例示的にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際のエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図５】図５は、例示的にＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートと比較した、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる単離されたＥＰＯ溶出液画分のＩＥＦゲルを示す。
【図６】図６は、精製されたＥＰＯ最終製品の天然のグリコシル化状態を示す。
【図７】図７は、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）のグリコシル化状態を示す。
【００４５】
次の実施例は、本発明を説明するが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ＣＨＯ細胞中のＥＰＯの産生
ＥＰＯを、発酵によりＣＨＯ細胞中で産生する。発酵は、真核細胞、殊にＣＨＯ細胞についての特許刊行物および学術論文中の記載と同様に標準法により行なわれる。培養は、灌流反応器中で動物成分を含まない培地中で行なわれる。収穫は、５０日間までの期間で連続的に行なわれる。細胞分離のために、マイクロ濾過を適当なフィルター（例えば、Milligard培地０．５〜１．２μｍを有するOpticap XL T30 Capsule, MilloporeおよびSartobran P Midi-caps０．４５〜０．６５μｍ、Sartorius）上で１〜２ ｌ／分の流速で実施する。引続き、最初に細胞不含の濾液（例えば、Ultran Pilot,ポリエーテルスルホン４×０．４５ｍ2、Schleicher & Schull）の限外濾過（カットオフ１００００Ｄａ）を行ない、次に滅菌濾過（例えば、０．５μｍのMilligard前フィルターおよび０．２μｍのDurapore滅菌フィルターを備えたOpticapフィルターユニットを介して）行なう。
【００４７】
実施例２：逆相クロマトグラフィー（"捕捉工程"）
"捕捉工程"として、逆相クロマトグラフィーをＳＯＵＲＣＥ ３０ＲＰＣで実施する。前記の第１の精製工程において、発酵上澄液からのＥＰＯは、含量増加される。この場合、複数の洗浄工程を実施する。第１の洗浄工程をＰＢＳ緩衝液（燐酸塩緩衝食塩水）を用いて実施する。直ぐ次の洗浄工程を水／イソプロパノール／ＴＦＡからなる混合物で１０／２／０．１〜１０／１／０．１の容量比で４０〜５０ｍｌ／分の流速で実施する。生成物の溶離を水／イソプロパノール／ＴＦＡからなる混合物で１０／４／０．１の容量比で３０〜４０ｍｌ／分の流速で実施する。流速を前記分離に対応するように最適化し、適合させた。その後に、洗浄工程をイソプロパノール／０．１％ＴＦＡ溶液で容量比５０／４０で実施する。
【００４８】
トリフルオロ酢酸産生物画分に５回の溶離直後に１：１の比で燐酸塩緩衝液（ｐＨ値１０）を添加し、１５ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．２になるまで希釈する。この場合に中和されたＥＰＯ含有溶液をさらに滅菌濾過する。
【００４９】
ＥＰＯ含量増加のための工程間対照（ＩＰＣ）をＴＦＡ／アセトニトリル系中の分析にＲＰ−ＨＰＬＣ分離カラムに掛ける。このクロマトグラフィー工程後のＥＰＯの収率は、少なくとも５０％、有利に少なくとも６５％、特に有利に少なくとも８０％である。
【００５０】
実施例３：陰イオン交換クロマトグラフィー
逆相クロマトグラフィーからの中和されたＥＰＯ産生物画分を２０ｍｌ／分の運搬効率で塗布する。更に、ＥＰＯ含有溶液を３つの洗浄工程によって４０ｍｌ／分の一定の流速で精製し、その際に第１の洗浄工程および第３の洗浄工程をそれぞれ７．２のｐＨで２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を用いて実施し、第２の洗浄工程を４．５のｐＨで相応する酢酸ナトリウム溶液を用いて実施する。産生物の溶離を勾配条件下で酢酸ナトリウム／塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて実施する（流速３０〜４０ｍｌ／分）。この場合、緩衝液の割合は、徐々に線状に０から８０％へ上昇される。
【００５１】
等電集束法（ＩＥＦ）により、溶出液画分を分析し、ＩＥＦにおけるバンド状態に相応して産生物プール（主要画分）と縁部画分とに区分する。参照材料として市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートを使用する。主要画分のＥＰＯ含量をＲＰクロマトグラフィーにより算出する。選択された溶出液画分を限外濾過により濃縮し、次のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのために再び緩衝液を用いて処理する。このクロマトグラフィー工程後のエリスロポイエチンの収率は、少なくとも２０％、有利に少なくとも３０％、特に有利に少なくとも４０％である。
【００５２】
等電集束法を超希薄層のポリアクリルアミドゲル上で実施する。そのために、試料溶液を塗布前にマイクロ遠心分離キット（カットオフ１００００Ｄａ）を用いて脱塩し、および濃縮しなければならない。前記集束は、３００〜２０００Ｖの電圧で行なわれる。５０００Ｖｈ後、発生は終結する。引続き、ゲルを硝酸銀またはクマシー（Coomassie）で染色し、および評価する。
【００５３】
実施例４：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
この精製工程は、"燐酸塩処理された"ＥＰＯ分子の除去に適している。陰イオン交換クロマトグラフィーの主要画分を限外濾過によりヒドロキシアパタイトカラムの出発緩衝液中で再び緩衝液を用いて処理し、引続き滅菌する。
【００５４】
試料は、３０ｍｌ／分の輸送効率でＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト タイプ１の相上に注入される。洗浄工程を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて実施し、試料の溶離を燐酸塩緩衝液を用いてｐＨ６．８および５０ｍｌ／分の流速で勾配条件下で実施する。この場合、燐酸塩緩衝液の割合は、徐々に線状に０から２５％へ上昇される。
【００５５】
規格通りのＥＰＯ画分は、酢酸ナトリウム−燐酸ナトリウム緩衝液中に存在し、このＥＰＯ画分をＰＢＳ（最終充填緩衝液）を用いて限外濾過により再び緩衝液処理し、および−２０℃で深冷凍結する。個々の画分のＥＰＯ含量をＲＰクロマトグラフィーにより算出する。このクロマトグラフィー工程後のエリスロポイエチンの収率は、少なくとも３０％、有利に少なくとも４０％、特に有利に少なくとも５０％である。
【００５６】
ＨＰＡＥＣ-ＰＡＤによるグリコシル化パターンの分析は、蛋白質のＰＮＧアーゼＦ（Roche Diagnostics GmbH）による炭水化物鎖の酵素分解により行なわれる。単離および脱塩の後、糖基は、高性能陰イオン交換器上でパルス化電流滴定検出で分析される。
【００５７】
最終的に得られたＥＰＯ産生物は、バイオアッセイにおいて１ｍｇ当たり少なくとも１５００００ＩＥの生物活性を有し、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）の全ての要件、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）の全ての要件を満たす。更に、ＩＥＦにおけるバンドパターンおよびグリコシル化パターンは、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートに対応する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポイエチンを精製する方法に関し、この場合エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、確定された形式で順次に実施される一定のクロマトグラフ後処理工程によって後処理される。
【０００２】
エリスロポイエチン、略してＥＰＯと呼称される、は、グリコ蛋白質であり、このグリコ蛋白質は、骨髄中の赤血球の形成を刺激する。ＥＰＯは、主に腎臓内で形成され、そこから血液循環路を経て目的地に到達する。腎臓機能不全の場合、損傷された腎臓は、殆んどＥＰＯを産生しないかまたはそもそも全くＥＰＯを産生せず、このことは、骨髄の菌種細胞から殆んど赤血球を生じない結果をまねく。このいわゆる腎臓貧血は、赤血球の形成を骨髄中で刺激する生理的量でＥＰＯを投与することによって処置される。投与に使用されるＥＰＯは、ヒトの尿から取得されることができるか、または遺伝子工学的方法によって製造されることができる。ＥＰＯは、ヒトの体内に極く微少量で含まれているので、治療的用途のために天然の源からＥＰＯを単離することは、実際に不可能である。従って、遺伝子工学的方法は、前記物質を大量に産生する唯一の経済的方法を提供する。
【０００３】
エリスロポイエチンを組換えにより製造することは、エリスロポイエチン遺伝子を１９８４年に同定して以来、可能である。１９９０年の初頭以来、ヒトのエリスロポイエチンを含有する種々の医薬品が開発されており、この場合このエリスロポイエチンは、遺伝子工学的過程で真核細胞中、なかんずくＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）中で産生された。遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンの製造は、例えば欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書および欧州特許出願公開第２０５５６４号明細書中に記載されている。
【０００４】
エリスロポイエチンは、通常、ＣＨＯ宿主細胞中で遺伝子組換えにより製造される。このＣＨＯ宿主細胞は、早期には胎児子牛血清および多くの場合に牛インシュリンも添加された培地中で培養されたが、この培養は、今日では規則的に血清不含および蛋白質不含の培地中で行なわれている。こうして、ウシ蛋白質、ウシウィルス、ウシＤＮＡまたはウシに由来する別の望ましくない物質での汚染の危険性は、完全に排除される。真核細胞の培養に適した血清不含および蛋白質不含の培地は、種々の製造業者によって提供され、例えば培地ＭＡＭ−ＰＦ２は、特に、Bioconcept社, Allschwil, Schweiz在、によって販売されており、或いは培地ＤＭＥＭおよびＤＭＥＮＵ１２は、例えば、Invitrogen/Gibco社, Eggenstein, Deutschland在、によって提供されている。
【０００５】
また、エリスロポイエチンのための種々のクロマトグラフ精製法は、既に公知技術水準に記載されている。欧州特許出願公開第０２２８４５２号明細書には、クロマトグラフ工程の陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む、生物活性エリスロポイエチンを液体から精製する方法が記載されている。
【０００６】
欧州特許出願公開第０２６７６７８号明細書には、血清不含の培養で製造されたエリスロポイエチンを精製することが記載されており、この場合には、連続して透析、イオン交換クロマトグラフィー、分取逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過クロマトグラフィーが実施される。この場合、ゲル濾過クロマトグラフィー工程は、イオン交換クロマトグラフィーによって置き換えられてよい。同様に、（第１の）イオン交換クロマトグラフィー前に染料アフィニティークロマトグラフィーをブルートリサクリルカラム（Blue Trisacryl-Saule）で実施することが提案されている。
【０００７】
欧州特許出願公開第０８３０３７６号明細書には、培養上澄液からのＥＰＯをクロマトグラフ精製の第１工程で染料アフィニティークロマトグラフィーに掛ける、エリスロポイエチンを精製する方法が記載されている。第２工程でクロマトグラフィーは、疎水化された担体上で行なわれ、この後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが続く。更に、これには、逆相ＨＰＬＣが引き続き、この後に最後のクロマトグラフィー工程としての陰イオン交換クロマトグラフィーが続く。
【０００８】
欧州特許出願公開第１１２７０６３号明細書には、次の工程を含むエリスロポイエチンのための精製方法が記載されている：示差沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー。個々の精製工程は、欧州特許出願公開第１１２７０６３号明細書に記載された順序で実施される。この方法の変法において、精製は、次の工程を含む：示差沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、もう１つのダイアフィルトレーションおよびサイズ排除クロマトグラフィー。全ての場合に、この方法は、第１工程に沈殿が設けられ、この後に遠心分離が設けられている。同様に、ゲル濾過は、クロマトグラフ精製の終結時に強制的に設けられている。
【０００９】
国際出願のＷＯ−Ａ−０３／０４５００６には、陰イオン交換クロマトグラフィー、この後に逆相クロマトグラフィーおよびもう１つの陰イオンクロマトグラフィーを含む、ＥＰＯのための精製方法が記載されている。第２の陰イオン交換クロマトグラフィーには、ゲル濾過媒体を使用しながらのサイズ排除クロマトグラフィーが引続く。
【００１０】
また、欧州特許出願公開第０４２８２６７号明細書の対象は、エリスロポイエチンを精製することである。この場合、クロマトグラフィーは、Ｑセファロースカラムで実施され、この後に一部分は、逆相クロマトグラフィーおよびゲル濾過が続く。
【００１１】
ＷＯ ２００５／１２１１７３には、発酵法により製造されたＥＰＯを後処理する方法が記載されている。この方法は、少なくとも４つの種々のクロマトグラフ分離法を有するクロマトグラフ精製から出発する。第１の陰イオン交換クロマトグラフィーには、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが後に続き、この場合この最後に記載された３種類のクロマトグラフィーの順序は、任意であることができる。最終的に、再び陰イオン交換クロマトグラフィーが使用される。
【００１２】
即ち、前記方法により少なくとも５つのクロマトグラフィー工程が必要とされ、欧州薬局方によって要求された純度の判断基準を満足するＥＰＯを製造することができる。適したＥＰＯのための判断基準は、なかんずく１００ｐｐｍ未満の宿主細胞に由来する異質蛋白質の含量、ＥＰＯ１ｍｇ当たり１００ｐｇ未満の宿主細胞からのＤＮＡの含量、および最終的にアイソホーム組成物に関連して標準に相当する組成物である（Ph. Eur.:01/2001：1316）。
【００１３】
本発明の課題は、もう１つの精製法を記載することである。この精製法は、欧州薬局方（Ph. Eur. 04/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に相当し、および適当に工業的な、殊に発酵によるＥＰＯ生産に使用することができるＥＰＯ最終製品を提供するはずである。殊に、本発明による方法は、経済的な視点から公知技術水準の方法を凌駕するはずである。更に、本発明による方法は、僅かなクロマトグラフ精製工程で精製効率を殆んど劣化せずに間に合わせ、特殊な工業的に費用の掛かるクロマトグラフィー工程、例えばアフィニティークロマトグラフィーを省略することができるはずである。
【００１４】
工業的課題は、エリスロポイエチンを精製する方法によって解決され、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる。
【００１５】
本方法の好ましい実施態様において、工程ａ）の前および工程ａ）〜ｂｉｉｉ）の間には、クロマトグラフィー法は、全く使用されない。更に、その上、工程ｂｉｉｉ）後も別のクロマトグラフィー法が全く使用されないことは、好ましい。
【００１６】
本発明による方法を用いると、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に相当するエリスロポイエチン製品が製造される。この場合、抗して製造されたエリスロポイエチンは、次の判断基準を満たす：１００ｐｐｍ未満の宿主細胞に由来する異質蛋白質の含量、ＥＰＯ１ｍｇ当たり１００ｐｇ未満の宿主細胞からのＤＮＡの含量、および最終的にアイソホーム組成物に関連して標準に相当する組成物（Ph. Eur.:01/2002：1316）。更に、得られたＥＰＯ製品は、バイオアッセイにおいて１ｍｇ当たり少なくとも１５００００ＩＥの生物活性を有する。更に、ＩＥＦにおけるバンドパターンおよびグリコシル化パターンは、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートに相当する。
【００１７】
それにも拘わらず、哺乳動物細胞の培養による生物工学的ＥＰＯ製造の発酵上澄液を精製する方法において、細胞成分によって精製された発酵上澄液が次のクロマトグラフィー工程によって記載された順序で処理されることによって、
ｉ）逆相クロマトグラフィー（ＲＰクロマトグラフィー）、
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥクロマトグラフィー）、
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＡクロマトグラフィー）は、課された課題を解決するために意外にも極めて有利に達成される。当業者であっても、設定された課題と対比して、公知技術水準、殊にＲＰクロマトグラフィーはできるだけ回避させるべきであるというＷＯ ２００５／１２１１７３に照らしてみて、標準法によるＥＰＯを精製するために必要とされるクロマトグラフィー工程の数を減少させることが可能であることは、成果であるとは見なさなかった。それによって、よりいっそう僅かな装置費用、人件費および材料費ならびに時間の節約が生じるが、しかし、なかんずくウィルスによる汚染からの最も高度な安全性を生じる。また、本発明による方法を用いると、助剤および懸念する心配のない有機溶剤、例えばエタノールまたは２−プロパノールは、殆んど使用しなくともよい。前記目的は、適当に、上記のクロマトグラフィー工程を記載された順序で実施することによって達成される。
【００１８】
本発明による方法において利用されるクロマトグラフィーの原理は、刊行物に公知であり、当業者によく知られていることである（Muyer, Praxis der Hochleistungs-Flussigchromatographie, Wiley-VCH Weinheim 2004; Unger, Handbuch der HPLC, 第１部および第２部, GIT Verlag Darmstadt 1994）。更に、クロマトグラフィー媒体に関してさらに詳細に説明される情報は、それぞれの製造業者または刊行物の製品情報に見出される。
【００１９】
更に、エリスロポイエチンを産生する真核細胞が哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、この細胞が遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンを発現することは、好ましい。
【００２０】
更に、好ましい方法には、付加的にバンドパターンまたはグリコシル化パターンに点で参照材料に相当しない溶出液画分がｉｉ）によるもう１つの陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはｉｉｉ）によるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに掛けられることが設けられている。
【００２１】
更に、工程ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）により限外濾過が実施されることは、好ましい。
【００２２】
更に、好ましい方法において、工程ａ）は、マイクロ濾過および引続く限外濾過を含む。
【００２３】
好ましくは、逆相クロマトグラフィーは、固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この固定相は、Ｃ1〜Ｃ8変性シリカゲル、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする疎水化ポリマー担体およびシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料から選択され、溶出液としては、アルカノール水溶液が使用される。特に有利には、エタノールまたは２−プロパノール、またはこれらの混合物が使用され、殊に有利には、２−プロパノールが溶出液としての相応する緩衝された水性系と一緒に使用される。
【００２４】
更に、好ましい方法において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基を有する固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この官能基は、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第四アンモニウム基またはジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）から選択されている。
【００２５】
更に、陰イオン交換クロマトグラフィーが水性緩衝系、特に有機酸を基礎とする緩衝系、殊にアセテート緩衝液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含むことは、好ましい。
【００２６】
特に有利には、陰イオン交換クロマトグラフィーは、３．５〜５．５のｐＨ、特に有利に４．０〜５．０のｐＨ、殊に有利に約４．５のｐＨを有する緩衝水溶液を用いる少なくとも１つの洗浄工程を含む。緩衝液としては、なかんずくアセテート緩衝液、特に酢酸ナトリウム緩衝液が適している。
【００２７】
好ましくは、溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中の無機酸が使用される。更に、特に有利には、溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中のクロリドイオンが使用される。
【００２８】
更に、好ましい方法において、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、無機酸を基礎とする緩衝系、特にアセテート緩衝液を用いる少なくとも１つの洗浄工程を含む。
【００２９】
同様に、溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に無機酸を基礎とする緩衝系、特に有利に燐酸塩緩衝液が使用される。
【００３０】
特に好ましい実施態様の説明
本発明は、エリスロポイエチンを精製する方法を提供し、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる。
【００３１】
逆相クロマトグラフィーは、"捕捉工程（Capture-Schritt）"として使用される。前記の第１の精製工程において、発酵上澄液からのＥＰＯは、含量増加される。この場合には、試料分子と固定相との間の異なる疎水性相互作用が重要である。試料成分は、この試料成分が水中での溶解が僅かであればあるほど、即ちよりいっそう非極性であればあれほど、ますます強く保持される。逆相クロマトグラフィーは、シリカゲルを基礎とし、ならびにポリマーを基礎とする、特に蛋白質分析に適している従来の市販の位相材料を用いて実施されることができる。典型的には、短鎖状炭素被覆、例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４を有する大孔径シリカゲル材料、例えば３００オングストロームまたは５００オングストローム、は、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする非多孔質の疎水化ポリマー担体および同様にシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料が使用される。前記固定相の製造業者または納入業者には、なかんずくＭｅｒｃｋ社、Ｗａｔｅｒｓ社、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｄｉｏｎｅｘ社、ＹＭＣ社、Ｐｈｅｏｍｅｎｅｘ社、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社およびＢＩＡ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社が挙げられる。
【００３２】
好ましい逆相材料は、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする非極性の疎水化ポリマー担体である。特に好ましいのは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＳＯＵＲＣＥ ３０ＲＰＣまたは相応する１５μｍ材料（ＳＯＵＲＣＥ １５ＲＰＣ）である。
【００３３】
溶出液として、特にアルコール、例えばエタノールまたは２−プロパノール、またはこれらの相応する緩衝水性系との混合物が使用されてよい。特に有利には、２−プロパノールが使用され、それというのも、溶出液中の有機溶剤含量は、エタノールと比較して明らかに僅かであり、こうして安全技術的および経済的な利点を有する。更に、２−プロパノールは、混合可能性および溶解性の性質に基づいて溶解助剤として卓越して好適である（Unger, Handbuch der HPLC, 第Ｉ部, GIT Verlag Darmstadt 1994, Nowotny et al., Chromatographia 1988, 25, 409-412）。
【００３４】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、試料溶液の帯電イオンと使用された緩衝液媒体との競合的相互作用に基づく。陰イオン交換クロマトグラフィーは、従来の市販の陰イオン交換樹脂を用いて、ジエチルアミノエチル官能化（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル官能化（ＱＡＥ）、第四アンモニウム官能化またはジメチルアミノエチル官能化（ＤＭＡＥ）で実施されてよい。前記の位相材料は、例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社またはＭｅｒｃｋ社から入手可能である。好ましくは、ジチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）官能化陰イオン交換樹脂が使用される。特に有利には、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅ社から入手可能なＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷ（３０μｍ）が使用される。このクロマトグラフィー工程は、ＥＰＯ最終製品において必要とされるグリコシル化パターンに関連して重要である。
【００３５】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、好ましい実施態様において酸洗浄工程（"酸性洗浄液"）を含み、この場合エリスロポイエチンの塩基性アイソホームは、ｐＨの低下によって溶離され、それによって分離される（欧州特許第１４２８８７８号明細書）。この場合、"酸性洗浄液"は、洗浄緩衝液のｐＨ値が３．５〜５．５、特に有利に４．０〜５．０、殊に有利に約４．５であることを意味する。緩衝液としては、なかんずく酢酸ナトリウム緩衝液が適している。
【００３６】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーには、通常のヒドロキシアパタイト（またはヒドロキシルアパタイト）材料が使用されてよい。ヒドロキシルアパタイトは、六方晶燐酸カルシウムであり、特に蛋白質と別のバイオポリマーとの分離に適している。この精製工程は、"燐酸塩処理された"ＥＰＯ分子の除去のために実施される。好ましくは、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（Bio-Rad社）が使用され、特に有利には、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト タイプ１（Bio-Rad社）が使用される。
【００３７】
逆相クロマトグラフィーならびに陰イオン交換クロマトグラフィーならびにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、全ての生成物収量の向上のために、製品品質の点、殊にバンドパターンまたはグリコシル化パターンの点で参照材料に相当しないような溶出液画分のための再処理の範囲内で繰り返されてよい。この場合、典型的には、主要画分の早期の縁部画分または後の縁部画分が問題であり、この場合この主要画分は、それ自体既に第１の精製工程後に望ましい生成物の性質を有する。種々の精製工程での画分の利点は、標準法で等級付けられる（等電集束法（ＩＥＦ）およびパルス化電流滴定検出での高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（HPAEC-PAD）：Lasne, Nature 2000, 405 605-635;Hollander et al., LaborPraxis 2004, 56-59, Hokke et al., ,Eur. J. Biochem. 1995, 228, 981-1008; Dionex Technical Note 42, 1997）。参照材料として、それぞれ市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）が使用される。
【００３８】
記載されたクロマトグラフィー法での培養上澄液の精製前に、細胞分離のためにマイクロ濾過が１．２μｍおよび０．６５μｍのフィルターを介して実施される。引き続き、細胞不含の濾液は、出発容量の１／１０に限界濾過される（カットオフ１００００Ｄａ）。限外濾過後、濃縮された細胞上澄液は、滅菌濾過され、第１のクロマトグラフィー工程（逆相クロマトグラフィー）に使用される。濾過工程、殊に滅菌濾過は、刊行物に公知であり、当業者によく知られている（Munir, Handbuch Ultrafiltration, Behr Hamburg 1990; Ullmann B2, 10-2, 10-21およびB3 11-6; Gasper, Handbuch der industriellen Fest-Flussig-Filtration, Huthig Heiderberg 1990; Ullmann A16, 187-258）。
【００３９】
本発明による方法で得られたＥＰＯは、欧州薬局方に定義された品質判断基準を満たすことが見い出された。殊に、アイソホーム組成物およびグリコシル化パターンは、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に定義された標準、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）に定義された標準に相当する。参照材料として市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）が使用される。
【００４０】
蛋白質の活性は、少なくとも１０００００ ＩＥ／ｍｇ、特に少なくとも１２５０００ ＩＥ／ｍｇ、殊に有利に少なくとも１５００００ ＩＥ／ｍｇである（欧州薬局方 01/2002:1316も参照のこと）。
【００４１】
本発明により精製されたＥＰＯは、真核細胞中で製造された、有利に遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンである。好ましくは、遺伝子組換えＥＰＯは、例えば欧州特許出願公開第０２０５５６４号明細書および欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書中に記載されているように哺乳動物細胞中、特に有利にＣＨＯ細胞中で製造される。発酵は、市販の培地中での従来のプロトコルにより行なわれる。
【００４２】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、本発明の範囲内で、エリスロポイエチン形成を骨髄中で刺激し、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）に記載されたアッセイにより明らかにエリスロポイエチンとして同定することができる状態にある全ての蛋白質である（赤血球増加症または正赤血球症（normocythaemic）のマウスの活性の測定）。エリスロポイエチンは、野生型ヒトエリスロポイエチン、または１つ以上のアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物を有する前記野生型ヒトエリスロポイエチンの変形であることができる。エリスロポイエチンの変形が問題である場合には、この変形がアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物による野生型ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸位置 単に１〜２０、有利に単に１〜１５、特に有利に単に１〜１０で区別されることは、好ましい。
【００４３】
エリスロポイエチンの精製またはエリスロポイエチンの含量増加は、本発明において、蛋白質のエリスロポイエチンが混合物から極めて純粋な形で得られ、即ち混合物中に含有されたエリスロポイエチンが、本質的に標準的なエリスロポイエチンと共に他の蛋白質をもはや含有しなくなるまで含量増加されることである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、例示的に逆相クロマトグラフィーの際のエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図２】図２は、例示的に陰イオン交換クロマトグラフィーの条件下でエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図３】図３は、例示的にＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートと比較した、陰イオン交換クロマトグラフィーによる単離されたＥＰＯ溶出液画分のＩＥＦゲルを示す。
【図４】図４は、例示的にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際のエリスロポイエチンのピークをクロマトグラフ分離することを示す。ピークの強さは、ミリでの吸収ユニットの形（ｍＡＵ）で２８０ｎｍのＵＶ波長で溶離時間（分）に亘ってプロットされている。
【図５】図５は、例示的にＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートと比較した、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる単離されたＥＰＯ溶出液画分のＩＥＦゲルを示す。
【図６】図６は、精製されたＥＰＯ最終製品の天然のグリコシル化状態を示す。
【図７】図７は、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラート（JANSSEN-CILAG）のグリコシル化状態を示す。
【００４５】
次の実施例は、本発明を説明するが、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ＣＨＯ細胞中のＥＰＯの産生
ＥＰＯを、発酵によりＣＨＯ細胞中で産生する。発酵は、真核細胞、殊にＣＨＯ細胞についての特許刊行物および学術論文中の記載と同様に標準法により行なわれる。培養は、灌流反応器中で動物成分を含まない培地中で行なわれる。収穫は、５０日間までの期間で連続的に行なわれる。細胞分離のために、マイクロ濾過を適当なフィルター（例えば、Milligard培地０．５〜１．２μｍを有するOpticap XL T30 Capsule, MilloporeおよびSartobran P Midi-caps０．４５〜０．６５μｍ、Sartorius）上で１〜２ ｌ／分の流速で実施する。引続き、最初に細胞不含の濾液（例えば、Ultran Pilot,ポリエーテルスルホン４×０．４５ｍ2、Schleicher & Schull）の限外濾過（カットオフ１００００Ｄａ）を行ない、次に滅菌濾過（例えば、０．５μｍのMilligard前フィルターおよび０．２μｍのDurapore滅菌フィルターを備えたOpticapフィルターユニットを介して）行なう。
【００４７】
実施例２：逆相クロマトグラフィー（"捕捉工程"）
"捕捉工程"として、逆相クロマトグラフィーをＳＯＵＲＣＥ ３０ＲＰＣで実施する。前記の第１の精製工程において、発酵上澄液からのＥＰＯは、含量増加される。この場合、複数の洗浄工程を実施する。第１の洗浄工程をＰＢＳ緩衝液（燐酸塩緩衝食塩水）を用いて実施する。直ぐ次の洗浄工程を水／イソプロパノール／ＴＦＡからなる混合物で１０／２／０．１〜１０／１／０．１の容量比で４０〜５０ｍｌ／分の流速で実施する。生成物の溶離を水／イソプロパノール／ＴＦＡからなる混合物で１０／４／０．１の容量比で３０〜４０ｍｌ／分の流速で実施する。流速を前記分離に対応するように最適化し、適合させた。その後に、洗浄工程をイソプロパノール／０．１％ＴＦＡ溶液で容量比５０／４０で実施する。
【００４８】
トリフルオロ酢酸産生物画分に５回の溶離直後に１：１の比で燐酸塩緩衝液（ｐＨ値１０）を添加し、１５ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７．２になるまで希釈する。この場合に中和されたＥＰＯ含有溶液をさらに滅菌濾過する。
【００４９】
ＥＰＯ含量増加のための工程間対照（ＩＰＣ）をＴＦＡ／アセトニトリル系中の分析にＲＰ−ＨＰＬＣ分離カラムに掛ける。このクロマトグラフィー工程後のＥＰＯの収率は、少なくとも５０％、有利に少なくとも６５％、特に有利に少なくとも８０％である。
【００５０】
実施例３：陰イオン交換クロマトグラフィー
逆相クロマトグラフィーからの中和されたＥＰＯ産生物画分を２０ｍｌ／分の運搬効率で塗布する。更に、ＥＰＯ含有溶液を３つの洗浄工程によって４０ｍｌ／分の一定の流速で精製し、その際に第１の洗浄工程および第３の洗浄工程をそれぞれ７．２のｐＨで２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を用いて実施し、第２の洗浄工程を４．５のｐＨで相応する酢酸ナトリウム溶液を用いて実施する。産生物の溶離を勾配条件下で酢酸ナトリウム／塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて実施する（流速３０〜４０ｍｌ／分）。この場合、緩衝液の割合は、徐々に線状に０から８０％へ上昇される。
【００５１】
等電集束法（ＩＥＦ）により、溶出液画分を分析し、ＩＥＦにおけるバンド状態に相応して産生物プール（主要画分）と縁部画分とに区分する。参照材料として市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートを使用する。主要画分のＥＰＯ含量をＲＰクロマトグラフィーにより算出する。選択された溶出液画分を限外濾過により濃縮し、次のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのために再び緩衝液を用いて処理する。このクロマトグラフィー工程後のエリスロポイエチンの収率は、少なくとも２０％、有利に少なくとも３０％、特に有利に少なくとも４０％である。
【００５２】
等電集束法を超希薄層のポリアクリルアミドゲル上で実施する。そのために、試料溶液を塗布前にマイクロ遠心分離キット（カットオフ１００００Ｄａ）を用いて脱塩し、および濃縮しなければならない。前記集束は、３００〜２０００Ｖの電圧で行なわれる。５０００Ｖｈ後、発生は終結する。引続き、ゲルを硝酸銀またはクマシー（Coomassie）で染色し、および評価する。
【００５３】
実施例４：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
この精製工程は、"燐酸塩処理された"ＥＰＯ分子の除去に適している。陰イオン交換クロマトグラフィーの主要画分を限外濾過によりヒドロキシアパタイトカラムの出発緩衝液中で再び緩衝液を用いて処理し、引続き滅菌する。
【００５４】
試料は、３０ｍｌ／分の輸送効率でＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト タイプ１の相上に注入される。洗浄工程を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて実施し、試料の溶離を燐酸塩緩衝液を用いてｐＨ６．８および５０ｍｌ／分の流速で勾配条件下で実施する。この場合、燐酸塩緩衝液の割合は、徐々に線状に０から２５％へ上昇される。
【００５５】
規格通りのＥＰＯ画分は、酢酸ナトリウム−燐酸ナトリウム緩衝液中に存在し、このＥＰＯ画分をＰＢＳ（最終充填緩衝液）を用いて限外濾過により再び緩衝液処理し、および−２０℃で深冷凍結する。個々の画分のＥＰＯ含量をＲＰクロマトグラフィーにより算出する。このクロマトグラフィー工程後のエリスロポイエチンの収率は、少なくとも３０％、有利に少なくとも４０％、特に有利に少なくとも５０％である。
【００５６】
ＨＰＡＥＣ-ＰＡＤによるグリコシル化パターンの分析は、蛋白質のＰＮＧアーゼＦ（Roche Diagnostics GmbH）による炭水化物鎖の酵素分解により行なわれる。単離および脱塩の後、糖基は、高性能陰イオン交換器上でパルス化電流滴定検出で分析される。
【００５７】
最終的に得られたＥＰＯ産生物は、バイオアッセイにおいて１ｍｇ当たり少なくとも１５００００ＩＥの生物活性を有し、欧州薬局方（Ph. Eur. 01/2002:1316）の全ての要件、またはガイダンス・オン・バイオシミラー・メディシナル・プロダクツツ・コンテイニング・リコンビナント・エリスロポイエチンズ（Guidance on Biosimilar Medicinal Products Containing Recombinant Erythropoietins）（EMEA/CHMP/94256/2005）の全ての要件を満たす。更に、ＩＥＦにおけるバンドパターンおよびグリコシル化パターンは、市販のＥｒｙｐｏ（登録商標）プレパラートに対応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポイエチンを精製する方法であって、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる、エリスロポイエチンを精製する方法。
【請求項２】
工程ａ）の前および工程ａ）〜ｂｉｉｉ）の間には、別のクロマトグラフィー法を全く使用しない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞は、哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣細胞であり、この卵巣細胞は、遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンを発現する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
付加的に製品品質が参照材料に相当しない溶出液画分は、ｉ）によるもう１つの逆相クロマトグラフィーおよび／またはｉｉ）によるもう１つの陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはｉｉｉ）によるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに掛けられる、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の後に限外濾過を実施する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）は、マイクロ濾過および引続く限外濾過を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
逆相クロマトグラフィーは、固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この固定相は、Ｃ1〜Ｃ8変性シリカゲル、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする疎水化ポリマー担体およびシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料から選択され、溶出液としては、アルカノール水溶液が使用される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基を有する固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この官能基は、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第四アンモニウム基またはジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）から選択されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、水性緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、有機酸を基礎とする緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、３．５〜５．５のｐＨを有する緩衝水溶液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中の無機酸を使用する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中のクロリドイオンを使用する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、有機酸を基礎とする緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、アセテート緩衝液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に無機酸を基礎とする緩衝液系を使用する、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に燐酸塩緩衝液を使用する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
エリスロポイエチンを精製する方法であって、この場合、エリスロポイエチンを含有する、エリスロポイエチンを産生する真核細胞の培養上澄液は、次の工程：
ａ）細胞成分の除去；および
ｂ）記載した順序での次のクロマトグラフィー工程
ｉ）逆相クロマトグラフィー；
ｉｉ）陰イオン交換クロマトグラフィー；
ｉｉｉ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるａ）からの生成物の処理に掛けられる、エリスロポイエチンを精製する方法。
【請求項２】
工程ａ）の前および工程ａ）〜ｂｉｉｉ）の間には、別のクロマトグラフィー法を全く使用しない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞は、哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣細胞であり、この卵巣細胞は、遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンを発現する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
付加的に製品品質が参照材料に相当しない溶出液画分は、ｉ）によるもう１つの逆相クロマトグラフィーおよび／またはｉｉ）によるもう１つの陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはｉｉｉ）によるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに掛けられる、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の後に限外濾過を実施する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）は、マイクロ濾過および引続く限外濾過を含む、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
逆相クロマトグラフィーは、固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この固定相は、Ｃ1〜Ｃ8変性シリカゲル、ポリスチレン／ジビニルベンゼンを基礎とする疎水化ポリマー担体およびシリカゲルまたはポリマーを基礎とする疎水化モノリス位相材料から選択され、溶出液としては、アルカノール水溶液が使用される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、官能基を有する固定相としての担持材料上で行なわれ、この場合この官能基は、ジエチルアミノエチル基（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル基（ＱＡＥ）、第四アンモニウム基またはジメチルアミノエチル基（ＤＭＡＥ）から選択されている、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、水性緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、有機酸を基礎とする緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、３．５〜５．５のｐＨを有する緩衝水溶液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中の無機酸を使用する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
溶出液として陰イオン交換クロマトグラフィーの際に緩衝水溶液中のクロリドイオンを使用する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、有機酸を基礎とする緩衝系を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、アセテート緩衝液を有する少なくとも１つの洗浄工程を含む、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に無機酸を基礎とする緩衝液系を使用する、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
溶出液としてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際に燐酸塩緩衝液を使用する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５２１９９３（Ｐ２０１１−５２１９９３Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２０７５（Ｐ２０１１−５１２０７５）
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７０６０
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６５４４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７０６０
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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