【課題】シュードモナス・エルギノーサとエルシニア・ペスティスの中心的なＤＮＡ複製装置を阻害する新規な治療剤の提供。
【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物に単離されたレプリカーゼを接触させ；ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そしてｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標である。レプリカーゼは単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）レプリカーゼ活性に関して許容する条件下で少なくとも一つの試験化合物に単離されたレプリカーゼを接触させ；
ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そして
ｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性における変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標であり、
レプリカーゼが単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である、方法。
【請求項２】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＤＮＡ分子、ＤＮＡポリメラーゼαサブユニット、候補化合物、ｄＮＴＰｓの混合物、及び任意に、βサブユニット、τ複合体、及びβサブユニットとτサブユニットの両方の複合体からなる群から選択されるメンバーを含む反応混合物を形成することによりレプリカーゼを形成させ；
ｂ）候補化合物の不在下で核酸の重合を達成するのに有効な条件に反応混合物を供し；
ｃ）試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性を比較するが、その際、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であり、
但し、上記レプリカーゼは単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項３】
ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）プライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ、βサブユニット、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）と、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）上記反応混合物を、候補薬剤の不在下で、核酸重合を達成するのに有効な条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での核酸の重合を試験化合物の不在下での核酸の重合と比較し、その際、試験化合物存在下での核酸重合の変化がＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する化合物の指標であり、但し、ＤｎａＸ複合体とβサブユニットはシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項４】
βサブユニットとＤｎａＸ複合体が相互作用能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）βサブユニットを、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）と上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）とβサブユニットがと上記化合物の不在下で相互作用する条件に、上記反応混合物を供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での相互作用の程度と試験化合物の不在下での相互作用の程度を比較し、その際、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）の間の相互作用の変化が相互作用を変調する化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項５】
ＤＮＡ分子上でＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットと集合する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）環状のプライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）及びβサブユニットと、上記化合物、及びＡＴＰ及又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又は亜集合体）が上記化合物の不在下でＤｎａＸ分子上でべサブユニットと集合する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での集合の程度を試験化合物の不在下での集合の程度と比較し、その際、ＤｎａＸ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットとＤＮＡ分子上で集合する能力を変調する化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項６】
ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットをＤＮＡ分子から解離する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）βサブユニットが集合していたＤＮＡ分子を、上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）が上記化合物の不在下でＤＮＡ分子からβサブユニットを解離する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での集合の程度を試験化合物の不在下での集合の程度と比較し、その際、ＤｎａＸ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がβサブユニットをＤＮＡ分子から解離する能力を変調する化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体の亜集合体）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項７】
ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰと、ＤｎａＸ分子の存在又は不在下及び／又は上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又は亜集合体）がｄＡＴＰ／ＡＴＰと上記化合物の不在下で相互作用する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での結合の程度を試験化合物の不在下での結合の程度と比較し、その際、ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項８】
ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニットのｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）を、ｄＡＴＰ／ＡＴＰと、ＤｎａＸ分子の存在又は不在下及び／又は上記化合物の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成させ；
ｂ）上記反応混合物を、ＤｎａＸサブユニット（又は複合体）がｄＡＴＰ／ＡＴＰを上記化合物の不在下で加水分解する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での加水分解の程度を試験化合物の不在下での加水分解の程度と比較し、その際、加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の量の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調する化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸ複合体（又はサブユニット）はシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調させる化合物を 同定する方法であって、
ａ）任意にＳＳＢでコートされている環状のプライムされたＤＮＡ分子を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニットと、上記化合物及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
ｂ）反応混合物を、上記化合物の不在下で、核酸重合に影響する条件に供し；そして ｃ）試験化合物存在下での核酸重合を、試験化合物不在下での核酸重合と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調させる化合物の指標であり、
ＤｎａＸ複合体がシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質である、方法。
【請求項１０】
δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）δサブユニットをδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットと上記化合物の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
ｂ）反応混合物を、δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが上記化合物の不在下で相互作用するはずの条件に供し；そして
ｃ）試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較し、その際、δサブユニットとδ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が、相互作用を変調させる化合物の指標であり、
但し、ＤｎａＸサブユニットがシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのサブユニット蛋白質である、方法。
【請求項１１】
単離されたシュードモナス・エルギノーサのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質が、
ａ）配列番号：６５、配列番号：７０、配列番号：７５、配列番号：８０、配列番号：８５、配列番号：９０、配列番号：９５、配列番号：１０２、配列番号：１０７、及び配列番号：１１２；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然サブユニット蛋白質の機能を果たす；及び
ｃ）ａ）に記載された何れの核酸分子にも完全に相補な単離された細菌核酸分子からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項１、２、又は９記載の方法
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのδサブユニット蛋白質が、
ａ）配列番号：８０、配列番号：８５、及び配列番号：９０；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然サブユニット蛋白質の機能を果たす；及び
ｃ）ａ）に記載された何れの核酸分子にも完全に相補な単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項３、４、５、６、７、８、又は１０記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図４】

【図５−１】

【図５−２】

【図６−１】

【図６−２】

【図７−１】

【図７−２】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２２】

【図２４】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３９】

【図４０】

【図４２】

【図４３】

【図４５】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【図７７】

【図７８】

【図１７】

【図２１】

【図２３】

【図２５】

【図３８】

【図４１】

【図４４】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５３】

【公開番号】特開２００８−２７１９６７（Ｐ２００８−２７１９６７Ａ）
【公開日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−９９１９４（Ｐ２００８−９９１９４）
【出願日】平成２０年４月７日（２００８．４．７）
【分割の表示】特願２００２−５８９６３７（Ｐ２００２−５８９６３７）の分割
【原出願日】平成１４年５月１４日（２００２．５．１４）
【出願人】（５０２３５４９５９）レプリダイン・インコーポレーテッド (7)
【Ｆターム（参考）】