エンドトキシン活性阻害剤
【課題】 ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質であって、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調製可能であり、臨床応用可能な低分子量のエンドトキシン活性阻害剤を提供すること。
【解決手段】 下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤である。
【化８】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
【解決手段】 下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤である。
【化８】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシン活性阻害剤に関し、詳しくは、サーファクチンの新規用途としてのエンドトキシン活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、病原体由来糖脂質は、免疫系を強く活性化することが知られており、これらの中でも、ＬＰＳ（ｌｙｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、グラム陰性菌に感染した生物に炎症を惹き起こすエンドトキシンであることが知られている。
ＬＰＳ等の病原体成分に対する生体の応答は、自然免疫と呼ばれ、外からの微生物の侵入に応答する初期の防御反応として機能しているが、過剰な防御反応は、免疫系、血管系、循環器系、血液凝固系、内分泌系、神経系等に作用し、発熱、エンドトキシンショック、及び多臓器不全等の病態を惹起することが知られている。
【０００３】
ＬＰＳは、グラム陰性菌の菌体膜を構成しており、菌体膜の中に存在している状態では細胞を活性化せず、該グラム陰性菌の増殖や溶菌等によって、単独で、又は細菌の膜タンパク質と複合体を形成して放出される。それを血清中のＬＢＰ（ＬＰＳ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が認識し、多量体ないしは複合体として存在するＬＰＳを単量体に分割する。単量体ＬＰＳは、ＬＢＰの働きによりＣＤ１４と結合し、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）を介して細胞内シグナルを発生し、炎症性サイトカインや細胞接着分子の発現を誘導することが知られており、特に、血管内皮細胞に対して（１）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインやケモカインの産生、（２）ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ等の細胞接着分子の発現、及び（３）ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒの発現を誘導することが報告されている（非特許文献１〜５参照）。
【０００４】
ＬＰＳによって活性化された血管内皮細胞がその表面に細胞接着分子を発現することにより、白血球が血管内皮細胞に接着し、白血球が血管壁を横断して組織中へ移行することが可能となる（非特許文献６参照）。しかしながら、このような白血球と血管内皮細胞との細胞−細胞間接着、及び白血球の組織への移行は、免疫反応に不可欠であると同時に、動脈硬化、自己免疫性血管炎、移植の拒絶反応などの様々な病的過程に共通のステップにもなっている（非特許文献７参照）。
そこで、細胞接着因子を制御することによって、白血球の血管壁への付着と侵入を調節可能な物質が求められており、特に、ＬＰＳによって誘導される血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質は、新たな抗炎症薬として有用性が期待される。
【０００５】
これまでに、ＬＰＳに対する中和活性を有し、ＬＰＳによるシグナル伝達を阻害する作用を有する物質としては、例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）が知られており、ポリミキシンＢを用いてエンドトキシンを除去する方法（特許文献１参照）等が提案されている。ポリミキシンＢは、ＬＰＳ中和活性を有する低分子化合物であり、ＳＰＲセンサーを用いた解析により、ＬｉｐｉｄＡ、ＬＰＳと直接的な結合能を有することが報告されている（非特許文献８〜９参照）。
しかしながら、ポリミキシンは比較的毒性が強く、毒性を軽減させた誘導体が提案されているが（非特許文献１０参照）、その毒性も無視できるほどのものではないため、臨床面では十分な応用がなされていないという問題がある。
【０００６】
また、ＬＰＳに対する活性阻害作用を有する物質としては、ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ（非特許文献１１参照）、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ ＩＡ（非特許文献１２参照）等が報告されている。これらは、ＬＰＳ中和活性以外の生理活性を有する物質として単離された化合物であるために特異性が低く、高濃度のＬＰＳに対して中和活性を示さないという問題がある。
【０００７】
このように、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質は、敗血症、エンドトキシンショック、クローン病を含む腸炎症疾患、歯周病、及び歯周病原性細菌に依存する動脈硬化等の過剰な免疫反応に基づく炎症性疾患の発症予防や治療のための有用物質として、大きな期待が持たれているが、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調整可能であり、臨床応用可能な低分子量の物質は、未だ見出されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５１０３５４号公報
【非特許文献１】Jirik, F.R., Podor, T.J., Hirano, T., Kishimoto, T., Loskutoff, D.J., Carson, D.A., Lotz, M. Bacterial lipopolysaccharide and inflammatory mediators augment IL-6 secretion by human endothelial cells. J. Immunol. 142, 144-147. 1989
【非特許文献２】Zhao, B., Bowden, R.A., Stavchansky, S.A., Bowman, P.D. Human endothelial cell response to gram-negative lipopolysaccharide assessed with cDNA microarrays. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C1587-1595. 2001
【非特許文献３】Libby, P., Ordovas, J.M., Auger, K.R., Robbins, A.H., Birinyi, L.K., Dinarello, C.A. Endotoxin and tumor necrosis factor induce interleukin-1 gene expression in adult human vascular endothelial cells. Am. J. Pathol. 124, 179-185. 1986
【非特許文献４】Jersmann, H.P., Hii, C.S., Ferrante, J.V., Ferrante, A. Bacterial lipopolysaccharide and tumor necrosis factor a synergistically increase expression of human endothelial adhesion molecules through activation of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Infect. Immun. 69, 1273-1279. 2001
【非特許文献５】Colucci, M., Balconi, G., Lorenzet, R., Pietra, A., Locati, D., Donati, M.B., Semeraro, N. Cultured human endothelial cells generate tissue factor in response to endotoxin. J. Clin. Invest. 71, 1893-1896. 1983
【非特許文献６】Gibbons, G.H., and Dzau, V.J. Molecular therapies for vascular diseases. Science 272, 689-693. 1996
【非特許文献７】Ross, R.Cell biology of atherosclerosis. Annu Rev Physiol. 57, 791-804. 1995
【非特許文献８】Thomas, C.J., Surolia, N., Surolia, A. Surface plasmon resonance studies resolve the enigmatic endotoxin neutralizing activity of polymyxin B. J. Biol. Chem. 274, 29624-29627. 1999
【非特許文献９】Thomas, C.J., Surolia, A. Kinetics of the interaction of endotoxin with polymyxin B and its analogs: a surface plasmon resonance analysis. FEBS Lett. 445, 420-424. 1999
【非特許文献１０】Tsubery, H., Ofek, I., Cohen, S., Fridkin, M. The functional association of polymyxin B with bacterial lipopolysaccharide is stereospecific: studies on polymyxin B nonapeptide. Biochemistry 39, 11837-11844. 2000
【非特許文献１１】Nagaoka, I., Hirota, S., Niyonsaba, F., Hirata, M., Adachi, Y., Tamura, H., Tanaka, S., Heumann, D. Augmentation of the lipopolysaccharide-neutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9, 972-982. 2002
【非特許文献１２】Okemoto, K., Nakajima, Y., Fujioka, T., Natori, S. Participation of two N-terminal residues in LPS-neutralizingactivity of sarcotoxin IA. J. Biochem. (Tokyo) 131. 277-281. 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記要望に応え、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質であって、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調製可能であり、臨床応用可能な低分子量のエンドトキシン活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、以下の知見を得た。即ち、微生物の二次代謝産物から、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する物質の探索を行い、有意な活性を示す物質を単離し、これを同定したところ、環状リポペプチドのサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）であることが明らかとなり、該サーファクチンが、エンドトキシン活性阻害剤として有用であるという知見である。
サーファクチンは、血栓溶解作用を有する薬剤としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液から単離された化合物であり、その生理活性としては、ホスホリパーゼＡ２を阻害することによる免疫抑制活性、プラスミノーゲンアクチベーターの活性化作用が知られている。また、サーファクチンは、界面活性能を有するバイオサーファクタントとしても知られている。しかしながら、エンドトキシン活性阻害能を有することは全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤である。
【化３】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
＜２＞ 下記構造式（２）で表されるサーファクチンＣ１（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１）である前記＜１＞に記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
【化４】
＜３＞ 微生物により産生された前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
＜４＞ 血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする薬用組成物である。
＜６＞ 抗炎症剤である前記＜５＞に記載の薬用組成物である。
＜７＞ 歯周病、敗血症、及び動脈硬化のいずれかの治療に用いられる前記＜５＞に記載の薬用組成物である。
＜８＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を、０．１〜１０００μＭとなる濃度で含有する前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の薬用組成物である。
＜９＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする細胞培養用培地である。
＜１０＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする飲食物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質であって、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調製可能であり、臨床応用可能な低分子量のエンドトキシン活性阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（エンドトキシン活性阻害剤）
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかである。
【化５】
【００１４】
前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかであり、これらの中でもＬ−ロイシンであることが好ましい。
また、前記一般式（１）中、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表し、炭素数８〜１６のアルキルが好ましく、炭素数１０〜１３のアルキルがより好ましい。
【００１５】
前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機塩及び有機塩のいずれかが好適に挙げられる。
前記無機塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、などが好適に挙げられる。なお、前記アルカリ金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、などが挙げられ、前記アルカリ土類金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、などが挙げられる。前記有機塩としては、例えば、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、などが挙げられる。
これらの中でも、ナトリウム塩、カリウム塩、第４級アンモニウム塩が好ましい。
【００１６】
前記一般式（１）で表されるサーファクチンの中でも、以下の構造式で表されるサーファクチンＣ１がより好ましい。
【化６】
【００１７】
前記エンドトキシン活性阻害剤の製造方法としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サーファクチンを産生する微生物を培養して得た培養液から精製する方法が挙げられる。
前記サーファクチンを産生する微生物としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ（枯草菌）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ（納豆菌）等のＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌が挙げられる。
【００１８】
前記サーファクチンを産生する微生物の培養方法としては、該微生物が増殖し、サーファクチンを産生する限り、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭素源、窒素源、消泡剤等を含む液体培地で、２５℃〜４２℃の温度条件下において、４８〜１２０時間振とう培養する方法が挙げられる。
前記炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉誘導体、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、デキストリン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース、などの炭水化物が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、例えば、有機窒素化合物、無機窒素化合物、及びこれらの混合物などが挙げられ、前記有機窒素化合物としては、例えば、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカーなどが挙げられ、前記無機窒素化合物としては、例えば、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
前記培養液から前記サーファクチンを精製する方法としては、特に制限は無く、公知の方法により精製することができ、例えば、培養液に硫酸や塩酸等の酸、又はカルシウム塩等を添加して沈殿物を生成させて、これを限外濾過し、有機溶媒により抽出した後、活性炭処理、結晶化等の方法で精製する方法が挙げられる。また、菌体を除いた前記培養液を等量のｎ−ヘキサン等で洗い、水層を等量の酢酸エチル等で抽出したものを減圧乾燥し、小量のクロロホルム等に溶解し、平衡化させたシリカゲルのカラムにのせて溶出させ、活性の見られた画分を回収して減圧乾固し、得られた固体を少量の溶媒に溶解し、ゲル濾過カラムに載せて溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して精製物を得る方法が挙げられる。
得られた精製物は、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル等により分子量や分子式を解析し、薄層クロマトグラフィーを用いて同定することができる。
【００２０】
前記エンドトキシン活性阻害剤は、エンドトキシンに対して特異的に結合することによりその活性を阻害し、エンドトキシンが誘導する炎症反応のシグナル伝達を阻害する作用を有する。この結果、血管内皮細胞における細胞接着分子の発現が抑制され、血管内皮細胞と白血球との接着が阻害される。
【００２１】
前記エンドトキシン活性阻害剤の活性阻害能としては、（１）エンドトキシンにより惹き起こされる血管内被細胞と白血球との接着を阻害する細胞接着阻害能と、（２）エンドトキシンに対して特異的に結合する中和能とから評価することができる。
【００２２】
前記接着阻害能としては、例えば、血管内皮細胞を培養し、その培養液中にエンドトキシンと前記エンドトキシン活性阻害剤とをともに添加し、細胞接着分子の発現誘導を行った後、白血球を加え、血管内皮細胞に接着した白血球の細胞数を、前記エンドトキシン活性阻害剤を添加しなかった場合の数と比較することにより評価することができる。
【００２３】
前記中和能としては、例えば、エンドトキシンと前記エンドトキシン活性阻害剤との分子間相互作用を結合表面プラズモン共鳴センサーによる解析や、限外ろ過フィルターを用いた接着解析等により評価することができる。
【００２４】
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、分子内に反応性の高い塩基性アミノ酸を含まないため、細胞毒性が低く、安全性が高い。また、分子量が小さいため、例えば、生体に投与した場合、血中へ移行しやすく、有利である。
また、本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、そのまま被添加物に添加してもよい。前記被添加物としては、例えば、細胞培養用培地、輸血用血液、飲食物、化粧料等が挙げられる。
前記細胞培養用培地としては、形質転換を目的として細胞へ導入される遺伝子を増殖させるための菌体を培養する培地、治療を目的として生体に導入されるタンパク質、ワクチン等を産生させるための菌体を培養する培地等が挙げられる。
更に、本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、以下のような本発明の薬用組成物として使用してもよい。
【００２５】
（薬用組成物）
本発明の薬用組成物は、本発明の前記エンドトキシン活性阻害剤を含むこと以外は、特に制限はなく、公知のものの中から適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２６】
前記薬用組成物における前記エンドトキシン活性阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、被投与物中のエンドトキシン量に応じて適宜選択することができるが、薬効を必要とする対象部位における濃度が、０．１〜１０００μＭであるのが好ましく、０．１〜１００μＭであるのがより好ましく、０．１〜１０μＭであるのが特に好ましい。
前記エンドトキシン活性阻害剤の濃度が、０．１μＭ未満であると、十分なエンドトキシン活性阻害効果、特に細胞接着阻害効果が得られないことがあり、１０μＭを超えると、投与した対象部位の細胞の増殖に影響を与えることがある。
【００２７】
前記薬剤組成物の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入、及び点眼などが挙げられる。
また、前記薬用組成物の剤型としては、特に制限はなく、投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、及び座剤などが挙げられる。
【００２８】
前記その他の成分としては、例えば、製薬学的に許容できる常用の担体（賦形剤、結合剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤等）などが挙げられる。
【００２９】
前記薬用組成物は、例えば、グラム陰性菌感染に起因する炎症性疾患に対する抗炎症剤として好適に使用することができる。また、エンドトキシンが関与する歯周病、敗血症、動脈硬化、及び腸炎性疾患等の治療乃至予防、並びにエンドトキシンショックに対する治療に好適に使用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３１】
（実験例）
＜エンドトキシン活性阻害剤の探索及び同定＞
ＬＰＳ刺激により活性化した血管内皮細胞への白血球の接着を測定する実験系において、接着を抑制する物質を探索するスクリーニング系を用いてサーファクチンサンプルを評価し、エンドトキシン活性阻害剤の同定を行った。
血管内皮細胞として正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）を用い、白血球としてヒト急性骨髄球性白血病細胞株ＨＬ‐６０細胞を用いた。前記ＨＵＶＥＣはＬＰＳにより活性化され、細胞表面にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ等の接着分子を発現するため、それらの接着分子のリガンドを有する細胞（ＨＬ−６０細胞等）を前記ＨＵＶＥＣ上にまくと顕著な細胞接着が起こり、顕微鏡観察での評価が可能となる。
【００３２】
（１）血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
前記ＨＵＶＥＣは（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｌａｋｅ Ｋｉｒｋｌａｎｄ、ＷＡ）から購入）は、５６℃に３０分静置して非働化した１０%子牛胎児血清（ＦＢＳ、ＪＨＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）社製）、及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＭＣＤＢ−１３１培地（Ｓｉｇｍａ社製）に、カナマイシン０．０５ｇ／Ｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ヘパリン５，０００Ｕ／ｍＬ（０．２７６４ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３１．１８ｇ／Ｌを加えたものを培養液として、Ｉ型コラーゲン（（株）高研製）でコートしたプラスチックフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）社製）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。前記ＨＵＶＥＣの継代操作は、以下のように行った。
前記ＨＵＶＥＣの培養液を除去した後、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ（−）；ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ１．１５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ）８ｍＬで細胞を2回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＨＵＶＥＣ用；トリプシン０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ０．１２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ、フェノールレッド０．０１ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ０．２ｇ／Ｌ）を２ｍＬ加え、３７℃で５分間インキュベートして細胞をはがし、細胞懸濁液とした。次に、培養液を８ｍＬ加えてトリプシンを失活させた後、前記細胞懸濁液を１８０Ｇで５分間遠心分離し、上清を取り除いた。新しい培養液で細胞を再び懸濁させ、その一部を新しい培養液入れたフラスコ中に移して継代を行った。
また、前記ＨＵＶＥＣ用の培養器具は、濃度が０．０２５％となるように０．０２Ｎの酢酸水溶液で調製したＩ型コラーゲン（（株）高研製）でコートし、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ（＋）；ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ１．１５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．１３０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．１０ｇ／Ｌ）で２回洗ったものを使用した。
【００３３】
（２）白血球（ＨＬ−６０細胞）の培養
ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞はＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｒｃｅｓより供与していただいた。ＨＬ−６０細胞は非働化した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）製）にグルタミン０．３ｇ／Ｌ、カナマイシン０．１ｇ／Ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ＮａＨＣＯ３２．２５ｇ／Ｌを加えたものを培養液として、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。前記ＨＬ−６０細胞の継代操作は、細胞を含む培養液を１８０Ｇで５分間遠心分離し上清を取り除き、新しい培養液で細胞を再び懸濁させ、その一部を新しい培養液入れたフラスコ中に移すことにより行った。
【００３４】
（３）サーファクチンサンプルの調製
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（関東化学社製）０．０００５％、大豆粉（味の素（株）製）１．５％、グリセロール（関東化学社製）２％、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４；関東化学社製）０．１％、及びシリコン消泡剤を含む液体培地（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ６．２に調整）を、坂口フラスコに１２５ｍＬずつ分注し、１２０℃、２気圧で２０分間滅菌した。これに、ＢＭＬ７５２−１２１Ｆ２株を斜面培地より接種し、２７℃で好気的に毎分１８０回転の振盪培養を９６時間行った。
このようにして得られた１Ｌの培養液から菌体を除き、等量のｎ−ヘキサン（関東化学社製）で１回洗い、水層を等量の酢酸エチル（関東化学社製）で１回抽出した。得られた有機層（酢酸エチル抽出液）を減圧乾燥して、３７５．２ｍｇの物質を得た。これを少量のクロロホルムに溶解し、予めクロロホルムで平衡化させた３５ｇのシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）のカラムにのせ、クロロホルム−メタノール（６：１）２００ｍＬを流した後、クロロホルム−メタノール（６：１）に３％の酢酸を加えた溶液２００ｍＬで溶出してサーファクチンサンプルを調製し、これを以下の接着試験に供した。
【００３５】
（４）接着試験
前記（１）で調製した前記ＨＵＶＥＣを、４８ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウェルに４．０×１０４個（５００μＬ）ずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、前記（３）で調製した前記サーファクチンサンプルを５μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。その後、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ社製）を添加し３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した後、各ウェルを３７℃に加温したＰＢＳで洗い、未反応のＬＰＳを除去し、新たな培地を各ウェルに２００μＬずつ加えた。
続いて、各ウェルに前記（２）で調製した前記ＨＬ−６０細胞を６．０×１０４個（２０μＬ）ずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間培養した。その後、各ウェルを再び３７℃に加温したＰＢＳで洗い、未接着の前記ＨＬ−６０細胞を除去し、新たな培地を各ウェルに２００μＬずつ加えた。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サーファクチンサンプルの細胞接着阻害能を評価した。
なお、陽性基準としては、前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞数が８０個未満であったものを、細胞接着阻害活性を有するものと評価した。この結果、試験に供した前記サーファクチンサンプルは、３〜１０μｇ／ｍＬの濃度において、細胞接着阻害活性を有することが確認された。
【００３６】
（５）細胞毒性試験
前記ＨＵＶＥＣを、コラーゲンコートした２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１．６×１０５個／ウェル（５００μＬ／ウェル）まき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記（４）で細胞接着阻害能を示した前記サーファクチンサンプルを５μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートした。次いで、細胞培養液をエッペンドルフチューブに移した後、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ（−）で２回洗い、これをエッペンドルフチューブに移した。
続いて各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液２００μＬを加え、３７℃でインキュベートした後、ウェルに接着した細胞を剥がしとり、エッペンドルフチューブに回収した。これを１５００Ｇで５分間遠心分離して細胞を落とし、上清を除去し、新しい培養液を加えた。ここに５倍濃縮のトリパンブルー染色液（４ｍｇ／ｍＬトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ社製）、９ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム（関東化学（株）製））を加えて攪拌し、測定用細胞懸濁液を得た。該細胞懸濁液１０μＬを血球計算板（エルマ販売（株）製）に乗せて顕微鏡で観察し、顕微鏡視野内の全細胞数、及び細胞内が青く染色された死細胞数を測定し、細胞生存率を求めて細胞毒性の有無を調べた。細胞生存率が８０％以上であることを確認し、以下の方法により前記サーファクチンサンプル中の化合物の精製を行った。
【００３７】
（６）化合物の精製
前記（４）及び（５）の試験で評価した結果、細胞接着阻害活性がみられ、かつ細胞毒性を示さなかった前記サーファクチンサンプルを、エンドトキシン活性阻害を有する化合物として精製した。
前記サーファクチンサンプルを減圧乾固し、６９．５ｍｇの固体を得た。次いで、得られた固体を少量のメタノールに溶解し、ゲル濾過カラムＳｈｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０にのせ、メタノール１００ｍＬで溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して４１．８ｍｇの白色固体を得た。得られた固体を小量のメタノールに溶解し再度、ゲル濾過カラムＳｈｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０にのせ、メタノール１００ｍＬで溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して３０．０ｍｇの無色の結晶を得た。
【００３８】
（７）接着阻害物質の同定
前記（６）で精製して得られた結晶について、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＳＸ１０２（日本電子（株）製）を用いてＨＲＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで解析したところ、前記化合物の分子量が１０３６、分子式がＣ４５Ｈ８１Ｎ１１Ｏ１２であることが明らかになった。また、重ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定した１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルから、該化合物がリポペプチドであることが予想された。
分子量、分子式が同一であって、かつリポペプチドである既知化合物としてサーファクチンＣ１を選択し、前記化合物と薄層クロマトグラフィーを用いて比較したところ、各種展開系において既知化合物サーファクチンＣ１と、前記化合物とのＲｆ値が完全に一致することがわかった。また、サーファクチンＣ１の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで解析したところ、前記化合物と同様のスペクトルパターンを示した。
これらのことから、前記サーファクチンサンプル中のエンドトキシン活性阻害剤としての化合物が、下記一般式（２）で表されるサーファクチンＣ１であると同定した。
【００３９】
【化７】
【００４０】
（実施例１）
−サーファクチンの細胞接着阻害能−
前記サーファクチンサンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、細胞処理条件を下記表１に示す条件（Ａ）〜（Ｄ）とした以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サーファクチンの細胞接着阻害能を評価した。結果を表１にあわせて示す。また、条件（Ａ）〜（Ｄ）それぞれについて、顕微鏡で観察された前記ＨＵＶＥＣ及び前記ＨＬ−６０細胞の状態を図１に示す。
【００４１】
【表１】
＊：ＨＵＶＥＣに接着したＨＬ−６０細胞の数が、顕微鏡視野内において８０個未満のものを「○」、８０個以上のものを「×」として評価した。
【００４２】
表１及び図１から、前記ＨＵＶＥＣに対して無刺激の場合、及びサーファクチンのみを添加した場合には、前記ＨＬ−６０細胞の接着がほとんどみられないことがわかった。前記ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間刺激することにより、前記ＨＬ−６０細胞の接着が引き起こされるが、３μｇ／ｍＬのサーファクチンで処理することにより、前記ＨＬ−６０細胞の接着が顕著に阻害されることがわかった。
【００４３】
（実施例２）
−サーファクチンの細胞接着阻害能の濃度依存性−
サンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、白血球として、前記ＨＬ−６０細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞をそれぞれ使用した以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞、前記ＴＨＰ−１細胞、及び前記Ｊｕｒｋａｔ細胞の数をそれぞれ測定することにより、前記サーファクチンの細胞接着阻害能を評価した。結果を図２に示す。図２中、コントロールはＬＰＳ及びサーファクチンのいずれも添加しなかった場合の測定結果である。
なお、前記ＴＨＰ−１細胞（ヒト骨髄単球性白血病細胞株）は、理研バイオリサーチセンターより供与されたものを使用し、前記Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株）は、東京大学医科学研究所井上純一郎教授より供与されたものを使用し、これらの細胞の継代操作は、前記ＨＬ−６０細胞と同様にして行った。
【００４４】
図２から、サーファクチンは、ＬＰＳで刺激した前記ＨＵＶＥＣへの各白血球細胞の接着を濃度依存的に抑制し、３μｇ／ｍＬ以上の濃度において、ほぼ完全に接着を阻害することがわかった。各白血球細胞の接着阻害において、５０％の阻害率を示すサーファクチン濃度（ＩＣ５０値）は、前記ＨＬ−６０細胞が１．１０μｇ／ｍＬ、前記ＴＨＰ−１細胞が１．４５μｇ／ｍＬ、前記Ｊｕｒｋａｔ細胞が１．４３μｇ／ｍＬであった。
【００４５】
（実施例３）
−サーファクチンのＬＰＳ特異的細胞接着阻害能−
サンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、血管内皮細胞を活性化する物質として、ＬＰＳ、ＬｉｐｉｄＡ（１，４´−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｆｏｒｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｆ−５８３由来品、Ｓｉｇｍａ社製）１μｇ／ｍＬ、ＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ社製）１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）１０ｎｇ／ｍＬをそれぞれ添加した以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サンプルの細胞接着阻害能を評価した。結果を図３に示す。図３中、コントロールは、サーファクチン及び血管内皮細胞活性化物質のいずれも無添加の場合の測定結果である。
【００４６】
図３から、前記ＨＵＶＥＣはＬＰＳと同様、ＬｉｐｉｄＡ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βにより活性化されて、前記ＨＬ−６０細胞の接着を誘導するが、サーファクチンは、ＬｉｐｉｄＡにより誘導された前記ＨＬ−６０細胞の接着のみ阻害することがわかった（ＩＣ５０＝１．０３μｇ／ｍＬ）。これに対し、炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βによって誘導された前記ＨＬ−６０細胞の接着は阻害されなかったことから、サーファクチンが、エンドトキシン（ＬＰＳ）によって刺激された血管内皮細胞の活性化に対して、選択的な阻害作用を有する可能性が明らかになった。
【００４７】
（実施例４）
−サーファクチンの細胞接着分子の発現阻害能−
実施例３において示された、サーファクチンの選択的阻害作用を確認するために、ＬＰＳ刺激によって前記ＨＵＶＥＣに誘導される細胞接着分子ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現に与えるサーファクチンの影響を、ウェスタンブロッティング法により確認した。
【００４８】
−−ウェスタンブロッティング法による細胞接着因子発現抑制の確認−−
前記ＨＵＶＥＣを、コラーゲンコートした１００ｍｍプラスチックディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ社製）に８×１０５個となるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。比較対照としてＬＰＳを添加しないものも同様に培養した。
次いで前記プラスチックディッシュを氷冷しながら、ラバーポリスマンを用いて前記ＨＵＶＥＣを剥がして回収し、５０μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ＝８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＦ、４００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／ｍＬ ａｎｔｉｐａｉｎ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えて４℃にて３０分間処理し、細胞を粉砕して細胞懸濁液を得た。
得られた前記細胞懸濁液を１４，０００Ｇで１０分間遠心分離操作を行い、不溶物を除去した。各サンプルのタンパク質濃度を均一に調整した後、半分量のｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３％ｂｒｏｍｏｐｈｏｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、３％ＳＤＳ、１５％２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）を加え、１００℃で５分間煮沸し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００４９】
縦型電気泳動槽に作成した９％ポリアクリルアミドゲルを設置し、泳動用ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（３８０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を泳動槽に流し入れた。前記アクリルアミドゲルの各ウェルに、調製した前記電気泳動用サンプルを注入し、５５Ｖの定電圧で電気泳動を行った。泳動終了後にゲルを取り出し、ＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）社製）と共に転写槽のカセットに挟み、６０Ｖの定電圧で３時間静置し、前記アクリルアミドゲル中のタンパク質を前記ＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、前記ＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）中で室温にて３０分間振盪してブロッキングを行った。
次いで、前記ＰＶＤＦ膜を、１μｇ／ｍＬの濃度のＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１のポリクローナル抗体を希釈した５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ３ｍＬにそれぞれ１時間浸した。続いて、前記ＰＶＤＦ膜を振盪し、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．５］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で１時間に６回の洗浄を行った。続いて、前記ＰＶＤＦ膜を、二次抗体（horseradish-peroxidase-conjugated anti-rabbit ＩｇＧ；Amersham Biosciences社製）を希釈した５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ２０ｍＬ中に振盪しながら浸した。その後前記ＰＶＤＦ膜を０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮ ｂｕｆｆｅｒで８０分間に８回の洗浄を行った後、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）社製）により発光させ、Ｘ線フィルム（ＨＲ−Ｈ、フジ写真フイルム（株）製）に感光させた。結果を図４に示す。
【００５０】
図４から、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間刺激することにより、前記ＨＵＶＥＣにＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現が顕著に誘導され、サーファクチンは、実施例２及び３において白血球の接着を阻害した濃度である３μｇ／ｍＬ以上の濃度で、ＬＰＳによって誘導されたＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現を顕著に抑制することが確認された。
実施例１〜４の結果から、サーファクチンは、ＬＰＳのシグナル伝達を特異的に阻害することにより、ＬＰＳにより引き起こされる血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することが示された。
【００５１】
（実施例５）
−サーファクチンの細胞毒性評価−
実施例１〜４において示されたサーファクチンがＬＰＳによる前記ＨＵＶＥＣの活性化を阻害した作用が、サーファクチンによる細胞毒性に起因するものではないことを確認するために、サーファクチンで処理した前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率、及び細胞増殖性の測定を行った。
【００５２】
（１）細胞生存率
サーファクチンの前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率に対して与える影響を調べるために、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、さらにＬＰＳ１μｇ／ｍＬを加えたサンプルを同時に試験した以外は、上記実験例の（５）と同様にしてトリパンブルー細胞外排出試験を行った。結果を図５に示す。なお、図５中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【００５３】
図５から、０〜３０μｇ／ｍＬのサーファクチンで２４時間処理した前記ＨＵＶＥＣには、細胞死がみられず、サーファクチンは前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率に影響を与えないことがわかった。
【００５４】
（２）細胞増殖性
サーファクチンの前記ＨＵＶＥＣの細胞増殖性に対して与える影響を調べるために、下記の方法（ＭＴＴ法）により解析を行った。
前記ＨＵＶＥＣの培養液を、細胞数１×１０４個／ｍＬlに調製し、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ社製）の各ウェルに２００μＬずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。次いで、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加した群、及びＬＰＳを添加しない群それぞれについて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養した。
各ウェルに５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ社製）水溶液を２０μＬ加え、３７℃に加温したインキュベータ中に４時間静置した。その後、各ウェルから培地を除去し、ＤＭＳＯを１００μＬずつ加え、ホルマザン沈殿を溶解させた後、５７０ｎｍのフィルターを用いてマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ、東ソー（株）製）により吸光度を測定し、細胞数の割合を求めた。結果を図６に示す。なお、図６中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【００５５】
図６から、サーファクチンは、１０μｇ／ｍＬ以上の濃度で添加された場合には、前記ＨＵＶＥＣに対して増殖抑制作用を示すが、細胞接着阻害能を示した濃度である３μｇ／ｍＬの濃度においては、増殖抑制作用を示さないことがわかった。
【００５６】
これらの結果から、サーファクチンは、前記ＨＵＶＥＣに対して高濃度で添加された場合に弱い増殖抑制作用を示すが、ＬＰＳ刺激による前記ＨＵＶＥＣと前記ＨＬ−６０細胞との接着は、細胞毒性を示すことなく阻害する作用を有することがわかった。このことから、サーファクチンは生体に投与した場合であっても、安全性が高く、エンドトキシン活性を阻害する薬用組成物の有効成分として有用であることが明らかになった。
【００５７】
（実施例６）
−サーファクチンのＬＰＳシグナル伝達上流における阻害作用−
ＬＰＳは、その活性部分であるＬｉｐｉｄＡに、血清中のＬＢＰ（ＬＰＳ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合することにより活性化し、その受容体であるＣＤ−１４及びＴＬＲ４／ＭＤ−２との結合能を獲得することが知られている。そこで、サーファクチンがＬｉｐｉｄＡとＬＢＰとの結合に与える影響を調べた。
【００５８】
脂質の結合に適した９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ １Ｂ、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｓｈｆｏｌｄ、Ｕ．Ｋ．）社製）に、エタノールで希釈した５μｇ／ウェル（０．２５ｍｇ／ｍＬで２０μＬ／ウェル）のＬｉｐｉｄＡを加え、室温で一晩静置してエタノールを蒸発させることにより、ＬｉｐｉｄＡを固定化させた。
各ウェルに、ＬＢＰ源であるＦＢＳの濃度を振って処理し、固定化したＬｉｐｉｄＡに結合したＬＢＰ量を検出した。結果を図７Ａに示す。図７Ａから、ＦＢＳの濃度依存的にそのＬｉｐｉｄＡへのＬＢＰ結合量の増加が確認された。検討の結果、ＦＢＳは１０％の濃度で用いることとし、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡの結合に与えるサーファクチンの影響を調べた。
【００５９】
各ウェルに１％（１０ｍｇ／ｍＬ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を１００μＬずつ入れ、３７℃で３０分間インキュベートすることによりブロッキングを行った。各ウェルを２００μＬの０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で２回ずつ洗った後、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で各種濃度に希釈した溶液を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
次に、各ウェルに１０％ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで２回ずつ洗った後、ＬＢＰのモノクローナル抗体（６Ｇ３、ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）社製）を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で６６．７倍に希釈した溶液を５０μＬずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで２回ずつ洗った後、二次抗体（horseradish-peroxidase-conjugated anti-mouse ＩｇＧ；Amersham Biosciences社製）を希釈した０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で１，０００倍に希釈した溶液を５０μＬずつ加え、室温、暗所で１時間静置した。
各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで５回ずつ洗った後、３，３´，５´，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）Ｌｉｑｕｉｄ（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μＬずつ加えて室温、暗所で１５分間静置して発色させた。０．１８Ｍの硫酸水溶液を１００μＬずつ入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍ／５７０ｎｍのフィルターを用いてマイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により吸光度を測定し、ＬＢＰのＬｉｐｉｄＡへの結合量の割合を求めた。結果を図７Ｂに示す。
【００６０】
図７Ｂから、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡとの結合率は、サーファクチンの濃度依存的に阻害されることがわかった。この結果から、サーファクチンは、ＬＢＰの活性化も阻害することがわかった。
【００６１】
（実施例７）
−サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合解析−
サーファクチンが、ＬＰＳと直接結合することにより、活性を阻害している可能性を確認するために、サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの分子間相互作用について、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）社製）を用い、表面プラズモン共鳴センサーによる経時的解析を行った。
【００６２】
ＬｉｐｉｄＡのＨＰＡセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ社製）への固定化は、過去の報告（例えば、Zhu, Y., Ho, B., Ding, J.L. Sequence and structural diversity in endotoxin-binding dodecapeptides. Biochim. Biophys. Acta. 1611, 234-242. 2003）等に記載の方法により行った。前記ＨＰＡセンサーチップを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘに挿入し、前記ＨＰＡセンサーチップ表面にＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝液）を流した。続いて、４０ｍＭのｎ−ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を前記ＨＰＡセンサーチップ表面の測定用セルに５μＬ／分の流速で５分間流して洗浄した。次に、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＬｉｐｉｄＡを前記ＨＰＡセンサーチップ表面の測定用セルに１μＬ／分の流速で３０分以上流して固定化した。固定化終了後は２ｍＭのＮａＯＨを２０μＬ／分の流速で１分間ずつ数回流し、過剰に結合したＬｉｐｉｄＡを除去した。ＬｉｐｉｄＡの結合により、レゾナンスシグナルの測定値は、ベースラインから約１，０００ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）上昇した。
一方、センサーチップ表面の対照用セルには、ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ（ＤＭＰ、Ｓｉｇｍａ社製）を、ＬｉｐｉｄＡと同様にして固定化した。
【００６３】
サーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、シグマ社製）は、ＴＢＳに溶かして最終濃度を０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬとし、２０μＬ／分の流速で２分間注入し、その前後のレゾナンスシグナルの変化を調べることにより、測定を行った。測定の概念図を、図８に示す。
測定終了後は、その都度センサーチップ表面に２ｍＭのＮａＯＨを２０μＬ／分の流速で１分間ずつ数回注入し、センサーチップ表面の再生を行った。測定は全て２５℃の温度条件下で行った。結果を図９に示す。
【００６４】
図９から、サーファクチンの注入直後よりレゾナンスシグナルの上昇が観測され、該レゾナンスシグナルの上昇はサーファクチンの濃度の上昇に伴い増大し、０．５μｇ／ｍＬのサーファクチンを流した時に、最大で約８０ＲＵの上昇が観測された。
この結果から、サーファクチンは、濃度依存的にセンサーチップ表面に固定化したＬｉｐｉｄＡと特異的に結合することが確認された。また、サーファクチン注入終了後、経時的なレゾナンスシグナルの減少が見られたことから、サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合は、可逆的な結合であることがわかった。
【００６５】
（実施例８）
−サーファクチンとＬＰＳとの特異的結合の解析−
サーファクチンが、ＬＰＳと特異的に直接結合することにより、活性を阻害している可能性を確認するために、限外濾過フィルターを用いた解析を行った。
解析方法の概略を図１０に示す。図１０に示すとおり、サーファクチンとＬＰＳとの混合溶液を、分子量３，０００の限外濾過フィルターデバイス（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ社製）に入れ、１４，０００Ｇで１時間の遠心分離を行うことにより、高分子（分子量３，０００以上）の存在する保持液と、低分子（分子量３，０００未満）が存在する濾過液とを分けた。この操作によって、分子量１０３６のサーファクチンは、限外濾過フィルターを通り抜け濾過液中に存在すると考えられるが、ＬＰＳ（分子量は３，０００以上）と結合した場合には、保持液側に残ることが予想される。そこで、濾過液のみを回収し、サーファクチン含有量を調べることにより、サーファクチンとＬＰＳとの結合の有無を判定した。
なお、ＬＰＳの対象サンプルとして、牛血清製アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、及びグラム陽性菌の細胞壁由来の毒素であるリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ：ＬＴＡ）を用いて測定を行った。ＢＳＡの分子量は６８，０００、ＬＴＡの分子量は３，０００以上であることが報告されており、これらの分子は、限外濾過フィルターを通り抜けない。
【００６６】
１０μｇのサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｇのＬＰＳ、ＢＳＡ、及びＬＴＡのいずれかと共に１００μＬのＰＢＳ（−）に溶解した混合溶液を調製し、３７℃で１時間インキュベートしたものを用い、図１０に示すように限外濾過を行い、濾過液を回収した。
得られた濾過液をサンプルとして、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。結果を図１１に示す。
【００６７】
図１１から、サーファクチンとＬＰＳとの混合溶液を限外濾過して得た濾過液は、ＬＰＳが誘導する細胞接着に対する阻害作用を示さなかった。一方、サーファクチンとＢＳＡとの混合溶液、及びサーファクチンとＬＴＡとの混合溶液を限外濾過して得た濾過液は、ＬＰＳが誘導する細胞接着に対して阻害作用を示した。これらの結果から、サーファクチンはＬＰＳと直接、特異的に結合することがわかった。
【００６８】
（実施例９）
−サーファクチンと各種界面活性剤とのエンドトキシン活性阻害の比較−
サーファクチンは、界面活性を有するため、他の界面活性剤を比較対照としてエンドトキシン活性阻害能の評価を行うことにより、エンドトキシン活性阻害への界面活性能の影響を調べた。
比較対照の界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；分子量２８８．３８）、陽イオン性界面活性剤であるＣＴＡＣ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；分子量３２０）、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（分子量６４６）、Ｔｗｅｅｎ−２０（分子量１２２６）、ＯＧ（ｎ−ｏｃｔｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；分子量２９２．４）の５種類を使用した。
サーファクチンと、前記５種の各界面活性剤をサンプルとした以外は、上記実験例（４）及び（５）と同様にして、接着試験、及び細胞毒性試験を行った。結果を図１２、及び表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
図１２、及び表２から、サーファクチン以外の界面活性剤は、細胞毒性を示さない濃度において細胞接着を顕著に阻害しなかった。このことから、サーファクチンのエンドトキシン活性阻害は、界面活性能によるものではないことが示された。
【００７１】
以上の結果から、微生物培養液より効率よく得られ、エンドトキシン活性阻害剤として同定されたサーファクチンは、細胞毒性が低く、低濃度で選択的なＬＰＳシグナル伝達の阻害作用を示すことが明らかになった。また、サーファクチンの作用メカニズムの解析により、ＬＰＳと特異的に結合することによって、エンドトキシン活性を抑制し、血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することがわかった。
更に、これらの結果から、サーファクチンは、動物に対する毒性が報告されているポリミキシンＢ（J. Bacteriol. 93, 1463-1464, 1967）、及び高分子であるため薬剤組成物としての利用が困難なｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎやｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ ＩＡ等の既存のエンドトキシン活性阻害剤と比べても、安全性及び有用性に優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、細胞毒性が低く、安全性が高く、更に分子量が小さいため、例えば、生体に投与した場合、血中へ移行しやすく、有利である。
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、そのまま被添加物に添加してもよく、細胞培養用培地、輸血用血液、飲食物、化粧料等の添加剤として好適に使用することができる。
また、他の薬効成分等と混合して本発明の薬用組成物として好適に使用することができ、本発明の薬用組成物は、グラム陰性菌感染に起因する炎症性疾患に対する抗炎症剤として好適に使用することができる。また、エンドトキシンが関与する歯周病、敗血症、動脈硬化、及び腸炎性疾患等の治療乃至予防、並びにエンドトキシンショックに対する治療に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、実施例１の細胞接着試験の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実施例２の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４の細胞接着分子の発現抑制試験の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例５のサーファクチンによる細胞生存率への影響を示すグラフである。なお、図５中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【図６】図６は、実施例５のサーファクチンによる細胞増殖への影響を示すグラフである。なお、図６中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例６で調べたＦＢＳの濃度と、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡの結合量との関係を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例６で調べたサーファクチンのＬＢＰとＬｉｐｉｄＡとの結合率に与える影響を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例７のサーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて解析する方法を説明する概念図である。
【図９】図９は、実施例７の結果のレゾナンスシグナルの経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例８のサーファクチンとＬＰＳとの結合を、限外濾過フィルターを用いて解析する方法を説明する概念図である。
【図１１】図１１は、実施例８の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例９の結果の細胞接着阻害及び細胞生存率を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシン活性阻害剤に関し、詳しくは、サーファクチンの新規用途としてのエンドトキシン活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、病原体由来糖脂質は、免疫系を強く活性化することが知られており、これらの中でも、ＬＰＳ（ｌｙｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、グラム陰性菌に感染した生物に炎症を惹き起こすエンドトキシンであることが知られている。
ＬＰＳ等の病原体成分に対する生体の応答は、自然免疫と呼ばれ、外からの微生物の侵入に応答する初期の防御反応として機能しているが、過剰な防御反応は、免疫系、血管系、循環器系、血液凝固系、内分泌系、神経系等に作用し、発熱、エンドトキシンショック、及び多臓器不全等の病態を惹起することが知られている。
【０００３】
ＬＰＳは、グラム陰性菌の菌体膜を構成しており、菌体膜の中に存在している状態では細胞を活性化せず、該グラム陰性菌の増殖や溶菌等によって、単独で、又は細菌の膜タンパク質と複合体を形成して放出される。それを血清中のＬＢＰ（ＬＰＳ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が認識し、多量体ないしは複合体として存在するＬＰＳを単量体に分割する。単量体ＬＰＳは、ＬＢＰの働きによりＣＤ１４と結合し、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）を介して細胞内シグナルを発生し、炎症性サイトカインや細胞接着分子の発現を誘導することが知られており、特に、血管内皮細胞に対して（１）ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインやケモカインの産生、（２）ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、ＶＣＡＭ−１（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ等の細胞接着分子の発現、及び（３）ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒの発現を誘導することが報告されている（非特許文献１〜５参照）。
【０００４】
ＬＰＳによって活性化された血管内皮細胞がその表面に細胞接着分子を発現することにより、白血球が血管内皮細胞に接着し、白血球が血管壁を横断して組織中へ移行することが可能となる（非特許文献６参照）。しかしながら、このような白血球と血管内皮細胞との細胞−細胞間接着、及び白血球の組織への移行は、免疫反応に不可欠であると同時に、動脈硬化、自己免疫性血管炎、移植の拒絶反応などの様々な病的過程に共通のステップにもなっている（非特許文献７参照）。
そこで、細胞接着因子を制御することによって、白血球の血管壁への付着と侵入を調節可能な物質が求められており、特に、ＬＰＳによって誘導される血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質は、新たな抗炎症薬として有用性が期待される。
【０００５】
これまでに、ＬＰＳに対する中和活性を有し、ＬＰＳによるシグナル伝達を阻害する作用を有する物質としては、例えば、ポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ）が知られており、ポリミキシンＢを用いてエンドトキシンを除去する方法（特許文献１参照）等が提案されている。ポリミキシンＢは、ＬＰＳ中和活性を有する低分子化合物であり、ＳＰＲセンサーを用いた解析により、ＬｉｐｉｄＡ、ＬＰＳと直接的な結合能を有することが報告されている（非特許文献８〜９参照）。
しかしながら、ポリミキシンは比較的毒性が強く、毒性を軽減させた誘導体が提案されているが（非特許文献１０参照）、その毒性も無視できるほどのものではないため、臨床面では十分な応用がなされていないという問題がある。
【０００６】
また、ＬＰＳに対する活性阻害作用を有する物質としては、ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ（非特許文献１１参照）、ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ ＩＡ（非特許文献１２参照）等が報告されている。これらは、ＬＰＳ中和活性以外の生理活性を有する物質として単離された化合物であるために特異性が低く、高濃度のＬＰＳに対して中和活性を示さないという問題がある。
【０００７】
このように、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質は、敗血症、エンドトキシンショック、クローン病を含む腸炎症疾患、歯周病、及び歯周病原性細菌に依存する動脈硬化等の過剰な免疫反応に基づく炎症性疾患の発症予防や治療のための有用物質として、大きな期待が持たれているが、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調整可能であり、臨床応用可能な低分子量の物質は、未だ見出されていないのが現状である。
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５１０３５４号公報
【非特許文献１】Jirik, F.R., Podor, T.J., Hirano, T., Kishimoto, T., Loskutoff, D.J., Carson, D.A., Lotz, M. Bacterial lipopolysaccharide and inflammatory mediators augment IL-6 secretion by human endothelial cells. J. Immunol. 142, 144-147. 1989
【非特許文献２】Zhao, B., Bowden, R.A., Stavchansky, S.A., Bowman, P.D. Human endothelial cell response to gram-negative lipopolysaccharide assessed with cDNA microarrays. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, C1587-1595. 2001
【非特許文献３】Libby, P., Ordovas, J.M., Auger, K.R., Robbins, A.H., Birinyi, L.K., Dinarello, C.A. Endotoxin and tumor necrosis factor induce interleukin-1 gene expression in adult human vascular endothelial cells. Am. J. Pathol. 124, 179-185. 1986
【非特許文献４】Jersmann, H.P., Hii, C.S., Ferrante, J.V., Ferrante, A. Bacterial lipopolysaccharide and tumor necrosis factor a synergistically increase expression of human endothelial adhesion molecules through activation of NF-kB and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Infect. Immun. 69, 1273-1279. 2001
【非特許文献５】Colucci, M., Balconi, G., Lorenzet, R., Pietra, A., Locati, D., Donati, M.B., Semeraro, N. Cultured human endothelial cells generate tissue factor in response to endotoxin. J. Clin. Invest. 71, 1893-1896. 1983
【非特許文献６】Gibbons, G.H., and Dzau, V.J. Molecular therapies for vascular diseases. Science 272, 689-693. 1996
【非特許文献７】Ross, R.Cell biology of atherosclerosis. Annu Rev Physiol. 57, 791-804. 1995
【非特許文献８】Thomas, C.J., Surolia, N., Surolia, A. Surface plasmon resonance studies resolve the enigmatic endotoxin neutralizing activity of polymyxin B. J. Biol. Chem. 274, 29624-29627. 1999
【非特許文献９】Thomas, C.J., Surolia, A. Kinetics of the interaction of endotoxin with polymyxin B and its analogs: a surface plasmon resonance analysis. FEBS Lett. 445, 420-424. 1999
【非特許文献１０】Tsubery, H., Ofek, I., Cohen, S., Fridkin, M. The functional association of polymyxin B with bacterial lipopolysaccharide is stereospecific: studies on polymyxin B nonapeptide. Biochemistry 39, 11837-11844. 2000
【非特許文献１１】Nagaoka, I., Hirota, S., Niyonsaba, F., Hirata, M., Adachi, Y., Tamura, H., Tanaka, S., Heumann, D. Augmentation of the lipopolysaccharide-neutralizing activities of human cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 9, 972-982. 2002
【非特許文献１２】Okemoto, K., Nakajima, Y., Fujioka, T., Natori, S. Participation of two N-terminal residues in LPS-neutralizingactivity of sarcotoxin IA. J. Biochem. (Tokyo) 131. 277-281. 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、前記要望に応え、従来における問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質であって、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調製可能であり、臨床応用可能な低分子量のエンドトキシン活性阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意検討した結果、以下の知見を得た。即ち、微生物の二次代謝産物から、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する物質の探索を行い、有意な活性を示す物質を単離し、これを同定したところ、環状リポペプチドのサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）であることが明らかとなり、該サーファクチンが、エンドトキシン活性阻害剤として有用であるという知見である。
サーファクチンは、血栓溶解作用を有する薬剤としてＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの培養液から単離された化合物であり、その生理活性としては、ホスホリパーゼＡ２を阻害することによる免疫抑制活性、プラスミノーゲンアクチベーターの活性化作用が知られている。また、サーファクチンは、界面活性能を有するバイオサーファクタントとしても知られている。しかしながら、エンドトキシン活性阻害能を有することは全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤である。
【化３】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
＜２＞ 下記構造式（２）で表されるサーファクチンＣ１（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１）である前記＜１＞に記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
【化４】
＜３＞ 微生物により産生された前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
＜４＞ 血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤である。
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする薬用組成物である。
＜６＞ 抗炎症剤である前記＜５＞に記載の薬用組成物である。
＜７＞ 歯周病、敗血症、及び動脈硬化のいずれかの治療に用いられる前記＜５＞に記載の薬用組成物である。
＜８＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を、０．１〜１０００μＭとなる濃度で含有する前記＜５＞から＜７＞のいずれかに記載の薬用組成物である。
＜９＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする細胞培養用培地である。
＜１０＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする飲食物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、従来における問題を解決することができ、ＬＰＳの活性を中和し、ＬＰＳが誘導する血管内皮細胞への白血球の接着を阻害する物質であって、ＬＰＳに対する高い特異性を有するとともに、細胞毒性が低く、かつ収率が高く大量に調製可能であり、臨床応用可能な低分子量のエンドトキシン活性阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（エンドトキシン活性阻害剤）
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかである。
【化５】
【００１４】
前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかであり、これらの中でもＬ−ロイシンであることが好ましい。
また、前記一般式（１）中、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表し、炭素数８〜１６のアルキルが好ましく、炭素数１０〜１３のアルキルがより好ましい。
【００１５】
前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、無機塩及び有機塩のいずれかが好適に挙げられる。
前記無機塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、などが好適に挙げられる。なお、前記アルカリ金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、などが挙げられ、前記アルカリ土類金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、などが挙げられる。前記有機塩としては、例えば、第４級アンモニウム塩、ピリジニウム塩、などが挙げられる。
これらの中でも、ナトリウム塩、カリウム塩、第４級アンモニウム塩が好ましい。
【００１６】
前記一般式（１）で表されるサーファクチンの中でも、以下の構造式で表されるサーファクチンＣ１がより好ましい。
【化６】
【００１７】
前記エンドトキシン活性阻害剤の製造方法としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、サーファクチンを産生する微生物を培養して得た培養液から精製する方法が挙げられる。
前記サーファクチンを産生する微生物としては、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ（枯草菌）、及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ（納豆菌）等のＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌が挙げられる。
【００１８】
前記サーファクチンを産生する微生物の培養方法としては、該微生物が増殖し、サーファクチンを産生する限り、特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、炭素源、窒素源、消泡剤等を含む液体培地で、２５℃〜４２℃の温度条件下において、４８〜１２０時間振とう培養する方法が挙げられる。
前記炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉誘導体、アミロース、アミロペクチン、マルトオリゴ糖、シクロデキストリン、プルラン、デキストリン、グリセリン、ソルビトール、麦芽汁、グルコース、などの炭水化物が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記窒素源としては、例えば、有機窒素化合物、無機窒素化合物、及びこれらの混合物などが挙げられ、前記有機窒素化合物としては、例えば、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン、大豆由来のポリペプトン（例えば、ポリペプトン−Ｓ）、酵母エキス、味液（大豆タンパク酸加水分解物）、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカーなどが挙げられ、前記無機窒素化合物としては、例えば、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１９】
前記培養液から前記サーファクチンを精製する方法としては、特に制限は無く、公知の方法により精製することができ、例えば、培養液に硫酸や塩酸等の酸、又はカルシウム塩等を添加して沈殿物を生成させて、これを限外濾過し、有機溶媒により抽出した後、活性炭処理、結晶化等の方法で精製する方法が挙げられる。また、菌体を除いた前記培養液を等量のｎ−ヘキサン等で洗い、水層を等量の酢酸エチル等で抽出したものを減圧乾燥し、小量のクロロホルム等に溶解し、平衡化させたシリカゲルのカラムにのせて溶出させ、活性の見られた画分を回収して減圧乾固し、得られた固体を少量の溶媒に溶解し、ゲル濾過カラムに載せて溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して精製物を得る方法が挙げられる。
得られた精製物は、ＨＲＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル等により分子量や分子式を解析し、薄層クロマトグラフィーを用いて同定することができる。
【００２０】
前記エンドトキシン活性阻害剤は、エンドトキシンに対して特異的に結合することによりその活性を阻害し、エンドトキシンが誘導する炎症反応のシグナル伝達を阻害する作用を有する。この結果、血管内皮細胞における細胞接着分子の発現が抑制され、血管内皮細胞と白血球との接着が阻害される。
【００２１】
前記エンドトキシン活性阻害剤の活性阻害能としては、（１）エンドトキシンにより惹き起こされる血管内被細胞と白血球との接着を阻害する細胞接着阻害能と、（２）エンドトキシンに対して特異的に結合する中和能とから評価することができる。
【００２２】
前記接着阻害能としては、例えば、血管内皮細胞を培養し、その培養液中にエンドトキシンと前記エンドトキシン活性阻害剤とをともに添加し、細胞接着分子の発現誘導を行った後、白血球を加え、血管内皮細胞に接着した白血球の細胞数を、前記エンドトキシン活性阻害剤を添加しなかった場合の数と比較することにより評価することができる。
【００２３】
前記中和能としては、例えば、エンドトキシンと前記エンドトキシン活性阻害剤との分子間相互作用を結合表面プラズモン共鳴センサーによる解析や、限外ろ過フィルターを用いた接着解析等により評価することができる。
【００２４】
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、分子内に反応性の高い塩基性アミノ酸を含まないため、細胞毒性が低く、安全性が高い。また、分子量が小さいため、例えば、生体に投与した場合、血中へ移行しやすく、有利である。
また、本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、そのまま被添加物に添加してもよい。前記被添加物としては、例えば、細胞培養用培地、輸血用血液、飲食物、化粧料等が挙げられる。
前記細胞培養用培地としては、形質転換を目的として細胞へ導入される遺伝子を増殖させるための菌体を培養する培地、治療を目的として生体に導入されるタンパク質、ワクチン等を産生させるための菌体を培養する培地等が挙げられる。
更に、本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、以下のような本発明の薬用組成物として使用してもよい。
【００２５】
（薬用組成物）
本発明の薬用組成物は、本発明の前記エンドトキシン活性阻害剤を含むこと以外は、特に制限はなく、公知のものの中から適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２６】
前記薬用組成物における前記エンドトキシン活性阻害剤の含有量としては、特に制限はなく、被投与物中のエンドトキシン量に応じて適宜選択することができるが、薬効を必要とする対象部位における濃度が、０．１〜１０００μＭであるのが好ましく、０．１〜１００μＭであるのがより好ましく、０．１〜１０μＭであるのが特に好ましい。
前記エンドトキシン活性阻害剤の濃度が、０．１μＭ未満であると、十分なエンドトキシン活性阻害効果、特に細胞接着阻害効果が得られないことがあり、１０μＭを超えると、投与した対象部位の細胞の増殖に影響を与えることがある。
【００２７】
前記薬剤組成物の投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射（皮下、皮内、静脈内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入、及び点眼などが挙げられる。
また、前記薬用組成物の剤型としては、特に制限はなく、投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤、点眼剤、及び座剤などが挙げられる。
【００２８】
前記その他の成分としては、例えば、製薬学的に許容できる常用の担体（賦形剤、結合剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、保存剤等）などが挙げられる。
【００２９】
前記薬用組成物は、例えば、グラム陰性菌感染に起因する炎症性疾患に対する抗炎症剤として好適に使用することができる。また、エンドトキシンが関与する歯周病、敗血症、動脈硬化、及び腸炎性疾患等の治療乃至予防、並びにエンドトキシンショックに対する治療に好適に使用することができる。
【実施例】
【００３０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３１】
（実験例）
＜エンドトキシン活性阻害剤の探索及び同定＞
ＬＰＳ刺激により活性化した血管内皮細胞への白血球の接着を測定する実験系において、接着を抑制する物質を探索するスクリーニング系を用いてサーファクチンサンプルを評価し、エンドトキシン活性阻害剤の同定を行った。
血管内皮細胞として正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＨＵＶＥＣ）を用い、白血球としてヒト急性骨髄球性白血病細胞株ＨＬ‐６０細胞を用いた。前記ＨＵＶＥＣはＬＰＳにより活性化され、細胞表面にＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ等の接着分子を発現するため、それらの接着分子のリガンドを有する細胞（ＨＬ−６０細胞等）を前記ＨＵＶＥＣ上にまくと顕著な細胞接着が起こり、顕微鏡観察での評価が可能となる。
【００３２】
（１）血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の培養
前記ＨＵＶＥＣは（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｌａｋｅ Ｋｉｒｋｌａｎｄ、ＷＡ）から購入）は、５６℃に３０分静置して非働化した１０%子牛胎児血清（ＦＢＳ、ＪＨＰ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）社製）、及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＭＣＤＢ−１３１培地（Ｓｉｇｍａ社製）に、カナマイシン０．０５ｇ／Ｌ、ペニシリン５０Ｕ／ｍＬ、ヘパリン５，０００Ｕ／ｍＬ（０．２７６４ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ３１．１８ｇ／Ｌを加えたものを培養液として、Ｉ型コラーゲン（（株）高研製）でコートしたプラスチックフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）社製）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。前記ＨＵＶＥＣの継代操作は、以下のように行った。
前記ＨＵＶＥＣの培養液を除去した後、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋不含リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ（−）；ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ１．１５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ）８ｍＬで細胞を2回洗浄後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＨＵＶＥＣ用；トリプシン０．２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ０．１２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ、フェノールレッド０．０１ｇ／Ｌ、ＮａＨＣＯ３０．３５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ０．２ｇ／Ｌ）を２ｍＬ加え、３７℃で５分間インキュベートして細胞をはがし、細胞懸濁液とした。次に、培養液を８ｍＬ加えてトリプシンを失活させた後、前記細胞懸濁液を１８０Ｇで５分間遠心分離し、上清を取り除いた。新しい培養液で細胞を再び懸濁させ、その一部を新しい培養液入れたフラスコ中に移して継代を行った。
また、前記ＨＵＶＥＣ用の培養器具は、濃度が０．０２５％となるように０．０２Ｎの酢酸水溶液で調製したＩ型コラーゲン（（株）高研製）でコートし、リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ（＋）；ＮａＣｌ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ１．１５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ０．１３０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ０．１０ｇ／Ｌ）で２回洗ったものを使用した。
【００３３】
（２）白血球（ＨＬ−６０細胞）の培養
ヒト急性前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０細胞はＪａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｒｃｅｓより供与していただいた。ＨＬ−６０細胞は非働化した１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）製）にグルタミン０．３ｇ／Ｌ、カナマイシン０．１ｇ／Ｌ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ＮａＨＣＯ３２．２５ｇ／Ｌを加えたものを培養液として、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で培養した。前記ＨＬ−６０細胞の継代操作は、細胞を含む培養液を１８０Ｇで５分間遠心分離し上清を取り除き、新しい培養液で細胞を再び懸濁させ、その一部を新しい培養液入れたフラスコ中に移すことにより行った。
【００３４】
（３）サーファクチンサンプルの調製
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（関東化学社製）０．０００５％、大豆粉（味の素（株）製）１．５％、グリセロール（関東化学社製）２％、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４；関東化学社製）０．１％、及びシリコン消泡剤を含む液体培地（１Ｍ ＫＨ２ＰＯ４でｐＨ６．２に調整）を、坂口フラスコに１２５ｍＬずつ分注し、１２０℃、２気圧で２０分間滅菌した。これに、ＢＭＬ７５２−１２１Ｆ２株を斜面培地より接種し、２７℃で好気的に毎分１８０回転の振盪培養を９６時間行った。
このようにして得られた１Ｌの培養液から菌体を除き、等量のｎ−ヘキサン（関東化学社製）で１回洗い、水層を等量の酢酸エチル（関東化学社製）で１回抽出した。得られた有機層（酢酸エチル抽出液）を減圧乾燥して、３７５．２ｍｇの物質を得た。これを少量のクロロホルムに溶解し、予めクロロホルムで平衡化させた３５ｇのシリカゲル６０（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）社製）のカラムにのせ、クロロホルム−メタノール（６：１）２００ｍＬを流した後、クロロホルム−メタノール（６：１）に３％の酢酸を加えた溶液２００ｍＬで溶出してサーファクチンサンプルを調製し、これを以下の接着試験に供した。
【００３５】
（４）接着試験
前記（１）で調製した前記ＨＵＶＥＣを、４８ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）の各ウェルに４．０×１０４個（５００μＬ）ずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後、前記（３）で調製した前記サーファクチンサンプルを５μＬ／ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。その後、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ０５５：Ｂ５、Ｓｉｇｍａ社製）を添加し３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した後、各ウェルを３７℃に加温したＰＢＳで洗い、未反応のＬＰＳを除去し、新たな培地を各ウェルに２００μＬずつ加えた。
続いて、各ウェルに前記（２）で調製した前記ＨＬ−６０細胞を６．０×１０４個（２０μＬ）ずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１時間培養した。その後、各ウェルを再び３７℃に加温したＰＢＳで洗い、未接着の前記ＨＬ−６０細胞を除去し、新たな培地を各ウェルに２００μＬずつ加えた。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サーファクチンサンプルの細胞接着阻害能を評価した。
なお、陽性基準としては、前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞数が８０個未満であったものを、細胞接着阻害活性を有するものと評価した。この結果、試験に供した前記サーファクチンサンプルは、３〜１０μｇ／ｍＬの濃度において、細胞接着阻害活性を有することが確認された。
【００３６】
（５）細胞毒性試験
前記ＨＵＶＥＣを、コラーゲンコートした２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１．６×１０５個／ウェル（５００μＬ／ウェル）まき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記（４）で細胞接着阻害能を示した前記サーファクチンサンプルを５μＬ／ウェルずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間インキュベートした。次いで、細胞培養液をエッペンドルフチューブに移した後、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ（−）で２回洗い、これをエッペンドルフチューブに移した。
続いて各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ溶液２００μＬを加え、３７℃でインキュベートした後、ウェルに接着した細胞を剥がしとり、エッペンドルフチューブに回収した。これを１５００Ｇで５分間遠心分離して細胞を落とし、上清を除去し、新しい培養液を加えた。ここに５倍濃縮のトリパンブルー染色液（４ｍｇ／ｍＬトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ社製）、９ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム（関東化学（株）製））を加えて攪拌し、測定用細胞懸濁液を得た。該細胞懸濁液１０μＬを血球計算板（エルマ販売（株）製）に乗せて顕微鏡で観察し、顕微鏡視野内の全細胞数、及び細胞内が青く染色された死細胞数を測定し、細胞生存率を求めて細胞毒性の有無を調べた。細胞生存率が８０％以上であることを確認し、以下の方法により前記サーファクチンサンプル中の化合物の精製を行った。
【００３７】
（６）化合物の精製
前記（４）及び（５）の試験で評価した結果、細胞接着阻害活性がみられ、かつ細胞毒性を示さなかった前記サーファクチンサンプルを、エンドトキシン活性阻害を有する化合物として精製した。
前記サーファクチンサンプルを減圧乾固し、６９．５ｍｇの固体を得た。次いで、得られた固体を少量のメタノールに溶解し、ゲル濾過カラムＳｈｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０にのせ、メタノール１００ｍＬで溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して４１．８ｍｇの白色固体を得た。得られた固体を小量のメタノールに溶解し再度、ゲル濾過カラムＳｈｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０にのせ、メタノール１００ｍＬで溶出させ、活性画分を回収し、減圧乾固して３０．０ｍｇの無色の結晶を得た。
【００３８】
（７）接着阻害物質の同定
前記（６）で精製して得られた結晶について、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＳＸ１０２（日本電子（株）製）を用いてＨＲＦＡＢ−ＭＳ、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで解析したところ、前記化合物の分子量が１０３６、分子式がＣ４５Ｈ８１Ｎ１１Ｏ１２であることが明らかになった。また、重ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定した１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルから、該化合物がリポペプチドであることが予想された。
分子量、分子式が同一であって、かつリポペプチドである既知化合物としてサーファクチンＣ１を選択し、前記化合物と薄層クロマトグラフィーを用いて比較したところ、各種展開系において既知化合物サーファクチンＣ１と、前記化合物とのＲｆ値が完全に一致することがわかった。また、サーファクチンＣ１の１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルで解析したところ、前記化合物と同様のスペクトルパターンを示した。
これらのことから、前記サーファクチンサンプル中のエンドトキシン活性阻害剤としての化合物が、下記一般式（２）で表されるサーファクチンＣ１であると同定した。
【００３９】
【化７】
【００４０】
（実施例１）
−サーファクチンの細胞接着阻害能−
前記サーファクチンサンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、細胞処理条件を下記表１に示す条件（Ａ）〜（Ｄ）とした以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サーファクチンの細胞接着阻害能を評価した。結果を表１にあわせて示す。また、条件（Ａ）〜（Ｄ）それぞれについて、顕微鏡で観察された前記ＨＵＶＥＣ及び前記ＨＬ−６０細胞の状態を図１に示す。
【００４１】
【表１】
＊：ＨＵＶＥＣに接着したＨＬ−６０細胞の数が、顕微鏡視野内において８０個未満のものを「○」、８０個以上のものを「×」として評価した。
【００４２】
表１及び図１から、前記ＨＵＶＥＣに対して無刺激の場合、及びサーファクチンのみを添加した場合には、前記ＨＬ−６０細胞の接着がほとんどみられないことがわかった。前記ＨＵＶＥＣを１μｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間刺激することにより、前記ＨＬ−６０細胞の接着が引き起こされるが、３μｇ／ｍＬのサーファクチンで処理することにより、前記ＨＬ−６０細胞の接着が顕著に阻害されることがわかった。
【００４３】
（実施例２）
−サーファクチンの細胞接着阻害能の濃度依存性−
サンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、白血球として、前記ＨＬ−６０細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞をそれぞれ使用した以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞、前記ＴＨＰ−１細胞、及び前記Ｊｕｒｋａｔ細胞の数をそれぞれ測定することにより、前記サーファクチンの細胞接着阻害能を評価した。結果を図２に示す。図２中、コントロールはＬＰＳ及びサーファクチンのいずれも添加しなかった場合の測定結果である。
なお、前記ＴＨＰ−１細胞（ヒト骨髄単球性白血病細胞株）は、理研バイオリサーチセンターより供与されたものを使用し、前記Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔ細胞白血病細胞株）は、東京大学医科学研究所井上純一郎教授より供与されたものを使用し、これらの細胞の継代操作は、前記ＨＬ−６０細胞と同様にして行った。
【００４４】
図２から、サーファクチンは、ＬＰＳで刺激した前記ＨＵＶＥＣへの各白血球細胞の接着を濃度依存的に抑制し、３μｇ／ｍＬ以上の濃度において、ほぼ完全に接着を阻害することがわかった。各白血球細胞の接着阻害において、５０％の阻害率を示すサーファクチン濃度（ＩＣ５０値）は、前記ＨＬ−６０細胞が１．１０μｇ／ｍＬ、前記ＴＨＰ−１細胞が１．４５μｇ／ｍＬ、前記Ｊｕｒｋａｔ細胞が１．４３μｇ／ｍＬであった。
【００４５】
（実施例３）
−サーファクチンのＬＰＳ特異的細胞接着阻害能−
サンプルとして、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、血管内皮細胞を活性化する物質として、ＬＰＳ、ＬｉｐｉｄＡ（１，４´−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ ｆｏｒｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｆ−５８３由来品、Ｓｉｇｍａ社製）１μｇ／ｍＬ、ＴＮＦ−α（Ｇｅｎｚｙｍｅ−Ｔｅｃｈｎｅ社製）１０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ−１β（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）１０ｎｇ／ｍＬをそれぞれ添加した以外は、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。
各ウェルを顕微鏡で確認し、顕微鏡視野内において前記ＨＵＶＥＣ細胞に接着した前記ＨＬ−６０細胞の数を測定することにより、前記サンプルの細胞接着阻害能を評価した。結果を図３に示す。図３中、コントロールは、サーファクチン及び血管内皮細胞活性化物質のいずれも無添加の場合の測定結果である。
【００４６】
図３から、前記ＨＵＶＥＣはＬＰＳと同様、ＬｉｐｉｄＡ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βにより活性化されて、前記ＨＬ−６０細胞の接着を誘導するが、サーファクチンは、ＬｉｐｉｄＡにより誘導された前記ＨＬ−６０細胞の接着のみ阻害することがわかった（ＩＣ５０＝１．０３μｇ／ｍＬ）。これに対し、炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、及びＩＬ−１βによって誘導された前記ＨＬ−６０細胞の接着は阻害されなかったことから、サーファクチンが、エンドトキシン（ＬＰＳ）によって刺激された血管内皮細胞の活性化に対して、選択的な阻害作用を有する可能性が明らかになった。
【００４７】
（実施例４）
−サーファクチンの細胞接着分子の発現阻害能−
実施例３において示された、サーファクチンの選択的阻害作用を確認するために、ＬＰＳ刺激によって前記ＨＵＶＥＣに誘導される細胞接着分子ＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現に与えるサーファクチンの影響を、ウェスタンブロッティング法により確認した。
【００４８】
−−ウェスタンブロッティング法による細胞接着因子発現抑制の確認−−
前記ＨＵＶＥＣを、コラーゲンコートした１００ｍｍプラスチックディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ社製）に８×１０５個となるようにまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。比較対照としてＬＰＳを添加しないものも同様に培養した。
次いで前記プラスチックディッシュを氷冷しながら、ラバーポリスマンを用いて前記ＨＵＶＥＣを剥がして回収し、５０μＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ＝８．０］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＦ、４００μＭ Ｎａ３ＶＯ４、１％ＮＰ−４０、１μｇ／ｍＬ ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１μｇ／ｍＬ ａｎｔｉｐａｉｎ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えて４℃にて３０分間処理し、細胞を粉砕して細胞懸濁液を得た。
得られた前記細胞懸濁液を１４，０００Ｇで１０分間遠心分離操作を行い、不溶物を除去した。各サンプルのタンパク質濃度を均一に調整した後、半分量のｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３％ｂｒｏｍｏｐｈｏｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、３％ＳＤＳ、１５％２−ｍｅｒｃａｐｔｅｔｈａｎｏｌ）を加え、１００℃で５分間煮沸し、電気泳動用サンプルを調製した。
【００４９】
縦型電気泳動槽に作成した９％ポリアクリルアミドゲルを設置し、泳動用ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（３８０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＳＤＳ）を泳動槽に流し入れた。前記アクリルアミドゲルの各ウェルに、調製した前記電気泳動用サンプルを注入し、５５Ｖの定電圧で電気泳動を行った。泳動終了後にゲルを取り出し、ＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）社製）と共に転写槽のカセットに挟み、６０Ｖの定電圧で３時間静置し、前記アクリルアミドゲル中のタンパク質を前記ＰＶＤＦ膜に転写した。
転写後、前記ＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．６］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）中で室温にて３０分間振盪してブロッキングを行った。
次いで、前記ＰＶＤＦ膜を、１μｇ／ｍＬの濃度のＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１のポリクローナル抗体を希釈した５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ３ｍＬにそれぞれ１時間浸した。続いて、前記ＰＶＤＦ膜を振盪し、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．５］、１３７ｍＭ ＮａＣｌ）で１時間に６回の洗浄を行った。続いて、前記ＰＶＤＦ膜を、二次抗体（horseradish-peroxidase-conjugated anti-rabbit ＩｇＧ；Amersham Biosciences社製）を希釈した５％スキムミルクを含むＴＢＳ ｂｕｆｆｅｒ２０ｍＬ中に振盪しながら浸した。その後前記ＰＶＤＦ膜を０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＮ ｂｕｆｆｅｒで８０分間に８回の洗浄を行った後、ＥＣＬ化学発光キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）社製）により発光させ、Ｘ線フィルム（ＨＲ−Ｈ、フジ写真フイルム（株）製）に感光させた。結果を図４に示す。
【００５０】
図４から、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで４時間刺激することにより、前記ＨＵＶＥＣにＩＣＡＭ−１、及びＶＣＡＭ−１の発現が顕著に誘導され、サーファクチンは、実施例２及び３において白血球の接着を阻害した濃度である３μｇ／ｍＬ以上の濃度で、ＬＰＳによって誘導されたＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１の発現を顕著に抑制することが確認された。
実施例１〜４の結果から、サーファクチンは、ＬＰＳのシグナル伝達を特異的に阻害することにより、ＬＰＳにより引き起こされる血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することが示された。
【００５１】
（実施例５）
−サーファクチンの細胞毒性評価−
実施例１〜４において示されたサーファクチンがＬＰＳによる前記ＨＵＶＥＣの活性化を阻害した作用が、サーファクチンによる細胞毒性に起因するものではないことを確認するために、サーファクチンで処理した前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率、及び細胞増殖性の測定を行った。
【００５２】
（１）細胞生存率
サーファクチンの前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率に対して与える影響を調べるために、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、さらにＬＰＳ１μｇ／ｍＬを加えたサンプルを同時に試験した以外は、上記実験例の（５）と同様にしてトリパンブルー細胞外排出試験を行った。結果を図５に示す。なお、図５中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【００５３】
図５から、０〜３０μｇ／ｍＬのサーファクチンで２４時間処理した前記ＨＵＶＥＣには、細胞死がみられず、サーファクチンは前記ＨＵＶＥＣの細胞生存率に影響を与えないことがわかった。
【００５４】
（２）細胞増殖性
サーファクチンの前記ＨＵＶＥＣの細胞増殖性に対して与える影響を調べるために、下記の方法（ＭＴＴ法）により解析を行った。
前記ＨＵＶＥＣの培養液を、細胞数１×１０４個／ｍＬlに調製し、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔｅｒ社製）の各ウェルに２００μＬずつまき、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、無添加、又は１μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの各濃度の条件で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間培養した。次いで、１μｇ／ｍＬのＬＰＳを添加した群、及びＬＰＳを添加しない群それぞれについて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７２時間培養した。
各ウェルに５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ社製）水溶液を２０μＬ加え、３７℃に加温したインキュベータ中に４時間静置した。その後、各ウェルから培地を除去し、ＤＭＳＯを１００μＬずつ加え、ホルマザン沈殿を溶解させた後、５７０ｎｍのフィルターを用いてマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ、東ソー（株）製）により吸光度を測定し、細胞数の割合を求めた。結果を図６に示す。なお、図６中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【００５５】
図６から、サーファクチンは、１０μｇ／ｍＬ以上の濃度で添加された場合には、前記ＨＵＶＥＣに対して増殖抑制作用を示すが、細胞接着阻害能を示した濃度である３μｇ／ｍＬの濃度においては、増殖抑制作用を示さないことがわかった。
【００５６】
これらの結果から、サーファクチンは、前記ＨＵＶＥＣに対して高濃度で添加された場合に弱い増殖抑制作用を示すが、ＬＰＳ刺激による前記ＨＵＶＥＣと前記ＨＬ−６０細胞との接着は、細胞毒性を示すことなく阻害する作用を有することがわかった。このことから、サーファクチンは生体に投与した場合であっても、安全性が高く、エンドトキシン活性を阻害する薬用組成物の有効成分として有用であることが明らかになった。
【００５７】
（実施例６）
−サーファクチンのＬＰＳシグナル伝達上流における阻害作用−
ＬＰＳは、その活性部分であるＬｉｐｉｄＡに、血清中のＬＢＰ（ＬＰＳ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合することにより活性化し、その受容体であるＣＤ−１４及びＴＬＲ４／ＭＤ−２との結合能を獲得することが知られている。そこで、サーファクチンがＬｉｐｉｄＡとＬＢＰとの結合に与える影響を調べた。
【００５８】
脂質の結合に適した９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ １Ｂ、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｓｈｆｏｌｄ、Ｕ．Ｋ．）社製）に、エタノールで希釈した５μｇ／ウェル（０．２５ｍｇ／ｍＬで２０μＬ／ウェル）のＬｉｐｉｄＡを加え、室温で一晩静置してエタノールを蒸発させることにより、ＬｉｐｉｄＡを固定化させた。
各ウェルに、ＬＢＰ源であるＦＢＳの濃度を振って処理し、固定化したＬｉｐｉｄＡに結合したＬＢＰ量を検出した。結果を図７Ａに示す。図７Ａから、ＦＢＳの濃度依存的にそのＬｉｐｉｄＡへのＬＢＰ結合量の増加が確認された。検討の結果、ＦＢＳは１０％の濃度で用いることとし、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡの結合に与えるサーファクチンの影響を調べた。
【００５９】
各ウェルに１％（１０ｍｇ／ｍＬ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を１００μＬずつ入れ、３７℃で３０分間インキュベートすることによりブロッキングを行った。各ウェルを２００μＬの０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で２回ずつ洗った後、前記一般式（２）で表されるサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で各種濃度に希釈した溶液を５０μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。
次に、各ウェルに１０％ＦＢＳ、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで２回ずつ洗った後、ＬＢＰのモノクローナル抗体（６Ｇ３、ＨｙＣｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）社製）を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で６６．７倍に希釈した溶液を５０μＬずつ入れ、３７℃で１時間インキュベートした。各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで２回ずつ洗った後、二次抗体（horseradish-peroxidase-conjugated anti-mouse ＩｇＧ；Amersham Biosciences社製）を希釈した０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）で１，０００倍に希釈した溶液を５０μＬずつ加え、室温、暗所で１時間静置した。
各ウェルを０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）２００μＬで５回ずつ洗った後、３，３´，５´，５−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）Ｌｉｑｕｉｄ（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を１００μＬずつ加えて室温、暗所で１５分間静置して発色させた。０．１８Ｍの硫酸水溶液を１００μＬずつ入れて反応を停止させた後、４５０ｎｍ／５７０ｎｍのフィルターを用いてマイクロプレートリーダー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により吸光度を測定し、ＬＢＰのＬｉｐｉｄＡへの結合量の割合を求めた。結果を図７Ｂに示す。
【００６０】
図７Ｂから、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡとの結合率は、サーファクチンの濃度依存的に阻害されることがわかった。この結果から、サーファクチンは、ＬＢＰの活性化も阻害することがわかった。
【００６１】
（実施例７）
−サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合解析−
サーファクチンが、ＬＰＳと直接結合することにより、活性を阻害している可能性を確認するために、サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの分子間相互作用について、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）社製）を用い、表面プラズモン共鳴センサーによる経時的解析を行った。
【００６２】
ＬｉｐｉｄＡのＨＰＡセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ社製）への固定化は、過去の報告（例えば、Zhu, Y., Ho, B., Ding, J.L. Sequence and structural diversity in endotoxin-binding dodecapeptides. Biochim. Biophys. Acta. 1611, 234-242. 2003）等に記載の方法により行った。前記ＨＰＡセンサーチップを、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｘに挿入し、前記ＨＰＡセンサーチップ表面にＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝液）を流した。続いて、４０ｍＭのｎ−ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を前記ＨＰＡセンサーチップ表面の測定用セルに５μＬ／分の流速で５分間流して洗浄した。次に、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＬｉｐｉｄＡを前記ＨＰＡセンサーチップ表面の測定用セルに１μＬ／分の流速で３０分以上流して固定化した。固定化終了後は２ｍＭのＮａＯＨを２０μＬ／分の流速で１分間ずつ数回流し、過剰に結合したＬｉｐｉｄＡを除去した。ＬｉｐｉｄＡの結合により、レゾナンスシグナルの測定値は、ベースラインから約１，０００ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）上昇した。
一方、センサーチップ表面の対照用セルには、ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ（ＤＭＰ、Ｓｉｇｍａ社製）を、ＬｉｐｉｄＡと同様にして固定化した。
【００６３】
サーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、シグマ社製）は、ＴＢＳに溶かして最終濃度を０．１μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬとし、２０μＬ／分の流速で２分間注入し、その前後のレゾナンスシグナルの変化を調べることにより、測定を行った。測定の概念図を、図８に示す。
測定終了後は、その都度センサーチップ表面に２ｍＭのＮａＯＨを２０μＬ／分の流速で１分間ずつ数回注入し、センサーチップ表面の再生を行った。測定は全て２５℃の温度条件下で行った。結果を図９に示す。
【００６４】
図９から、サーファクチンの注入直後よりレゾナンスシグナルの上昇が観測され、該レゾナンスシグナルの上昇はサーファクチンの濃度の上昇に伴い増大し、０．５μｇ／ｍＬのサーファクチンを流した時に、最大で約８０ＲＵの上昇が観測された。
この結果から、サーファクチンは、濃度依存的にセンサーチップ表面に固定化したＬｉｐｉｄＡと特異的に結合することが確認された。また、サーファクチン注入終了後、経時的なレゾナンスシグナルの減少が見られたことから、サーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合は、可逆的な結合であることがわかった。
【００６５】
（実施例８）
−サーファクチンとＬＰＳとの特異的結合の解析−
サーファクチンが、ＬＰＳと特異的に直接結合することにより、活性を阻害している可能性を確認するために、限外濾過フィルターを用いた解析を行った。
解析方法の概略を図１０に示す。図１０に示すとおり、サーファクチンとＬＰＳとの混合溶液を、分子量３，０００の限外濾過フィルターデバイス（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−３、Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ社製）に入れ、１４，０００Ｇで１時間の遠心分離を行うことにより、高分子（分子量３，０００以上）の存在する保持液と、低分子（分子量３，０００未満）が存在する濾過液とを分けた。この操作によって、分子量１０３６のサーファクチンは、限外濾過フィルターを通り抜け濾過液中に存在すると考えられるが、ＬＰＳ（分子量は３，０００以上）と結合した場合には、保持液側に残ることが予想される。そこで、濾過液のみを回収し、サーファクチン含有量を調べることにより、サーファクチンとＬＰＳとの結合の有無を判定した。
なお、ＬＰＳの対象サンプルとして、牛血清製アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、及びグラム陽性菌の細胞壁由来の毒素であるリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ：ＬＴＡ）を用いて測定を行った。ＢＳＡの分子量は６８，０００、ＬＴＡの分子量は３，０００以上であることが報告されており、これらの分子は、限外濾過フィルターを通り抜けない。
【００６６】
１０μｇのサーファクチン（サーファクチンＣ１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来品、Ｓｉｇｍａ社製）を１００μｇのＬＰＳ、ＢＳＡ、及びＬＴＡのいずれかと共に１００μＬのＰＢＳ（−）に溶解した混合溶液を調製し、３７℃で１時間インキュベートしたものを用い、図１０に示すように限外濾過を行い、濾過液を回収した。
得られた濾過液をサンプルとして、上記実験例の（４）と同様にして接着試験を行った。結果を図１１に示す。
【００６７】
図１１から、サーファクチンとＬＰＳとの混合溶液を限外濾過して得た濾過液は、ＬＰＳが誘導する細胞接着に対する阻害作用を示さなかった。一方、サーファクチンとＢＳＡとの混合溶液、及びサーファクチンとＬＴＡとの混合溶液を限外濾過して得た濾過液は、ＬＰＳが誘導する細胞接着に対して阻害作用を示した。これらの結果から、サーファクチンはＬＰＳと直接、特異的に結合することがわかった。
【００６８】
（実施例９）
−サーファクチンと各種界面活性剤とのエンドトキシン活性阻害の比較−
サーファクチンは、界面活性を有するため、他の界面活性剤を比較対照としてエンドトキシン活性阻害能の評価を行うことにより、エンドトキシン活性阻害への界面活性能の影響を調べた。
比較対照の界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｎ−ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；分子量２８８．３８）、陽イオン性界面活性剤であるＣＴＡＣ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；分子量３２０）、非イオン性界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（分子量６４６）、Ｔｗｅｅｎ−２０（分子量１２２６）、ＯＧ（ｎ−ｏｃｔｙｌ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；分子量２９２．４）の５種類を使用した。
サーファクチンと、前記５種の各界面活性剤をサンプルとした以外は、上記実験例（４）及び（５）と同様にして、接着試験、及び細胞毒性試験を行った。結果を図１２、及び表２に示す。
【００６９】
【表２】
【００７０】
図１２、及び表２から、サーファクチン以外の界面活性剤は、細胞毒性を示さない濃度において細胞接着を顕著に阻害しなかった。このことから、サーファクチンのエンドトキシン活性阻害は、界面活性能によるものではないことが示された。
【００７１】
以上の結果から、微生物培養液より効率よく得られ、エンドトキシン活性阻害剤として同定されたサーファクチンは、細胞毒性が低く、低濃度で選択的なＬＰＳシグナル伝達の阻害作用を示すことが明らかになった。また、サーファクチンの作用メカニズムの解析により、ＬＰＳと特異的に結合することによって、エンドトキシン活性を抑制し、血管内皮細胞と白血球との接着を阻害することがわかった。
更に、これらの結果から、サーファクチンは、動物に対する毒性が報告されているポリミキシンＢ（J. Bacteriol. 93, 1463-1464, 1967）、及び高分子であるため薬剤組成物としての利用が困難なｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎやｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ ＩＡ等の既存のエンドトキシン活性阻害剤と比べても、安全性及び有用性に優れていることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、細胞毒性が低く、安全性が高く、更に分子量が小さいため、例えば、生体に投与した場合、血中へ移行しやすく、有利である。
本発明のエンドトキシン活性阻害剤は、そのまま被添加物に添加してもよく、細胞培養用培地、輸血用血液、飲食物、化粧料等の添加剤として好適に使用することができる。
また、他の薬効成分等と混合して本発明の薬用組成物として好適に使用することができ、本発明の薬用組成物は、グラム陰性菌感染に起因する炎症性疾患に対する抗炎症剤として好適に使用することができる。また、エンドトキシンが関与する歯周病、敗血症、動脈硬化、及び腸炎性疾患等の治療乃至予防、並びにエンドトキシンショックに対する治療に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、実施例１の細胞接着試験の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２】図２は、実施例２の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４の細胞接着分子の発現抑制試験の結果を示す写真である。
【図５】図５は、実施例５のサーファクチンによる細胞生存率への影響を示すグラフである。なお、図５中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【図６】図６は、実施例５のサーファクチンによる細胞増殖への影響を示すグラフである。なお、図６中、「●」はＬＰＳを添加しなかったサンプルの結果を表し、「○」はＬＰＳ１μｇ／ｍＬを添加したサンプルの結果を表す。
【図７Ａ】図７Ａは、実施例６で調べたＦＢＳの濃度と、ＬＢＰとＬｉｐｉｄＡの結合量との関係を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、実施例６で調べたサーファクチンのＬＢＰとＬｉｐｉｄＡとの結合率に与える影響を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例７のサーファクチンとＬｉｐｉｄＡとの結合を、表面プラズモン共鳴センサーを用いて解析する方法を説明する概念図である。
【図９】図９は、実施例７の結果のレゾナンスシグナルの経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例８のサーファクチンとＬＰＳとの結合を、限外濾過フィルターを用いて解析する方法を説明する概念図である。
【図１１】図１１は、実施例８の細胞接着試験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例９の結果の細胞接着阻害及び細胞生存率を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤。
【化１】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
【請求項２】
下記構造式（２）で表されるサーファクチンＣ１（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１）である請求項１に記載のエンドトキシン活性阻害剤。
【化２】
【請求項３】
血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する請求項１から２のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする薬用組成物。
【請求項５】
抗炎症剤である請求項４に記載の薬用組成物。
【請求項６】
歯周病、敗血症、及び動脈硬化のいずれかの治療に用いられる請求項４に記載の薬用組成物。
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるサーファクチン、及びその誘導体のいずれかであることを特徴とするエンドトキシン活性阻害剤。
【化１】
ただし、前記一般式（１）中、Ｒ１は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、及びＬ−バリンから選ばれるいずれかを表し、Ｒ２は、炭素数８〜２２のアルキルを表す。
【請求項２】
下記構造式（２）で表されるサーファクチンＣ１（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ Ｃ１）である請求項１に記載のエンドトキシン活性阻害剤。
【化２】
【請求項３】
血管内皮細胞と白血球との接着を阻害する請求項１から２のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のエンドトキシン活性阻害剤を含むことを特徴とする薬用組成物。
【請求項５】
抗炎症剤である請求項４に記載の薬用組成物。
【請求項６】
歯周病、敗血症、及び動脈硬化のいずれかの治療に用いられる請求項４に記載の薬用組成物。
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１９３４５７（Ｐ２００６−１９３４５７Ａ）
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５７２２（Ｐ２００５−５７２２）
【出願日】平成１７年１月１２日（２００５．１．１２）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１２日（２００５．１．１２）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
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