エンベロープをもつウィルスに対する組み換え抗ウィルスペプチドとその調製方法
【課題】本発明は、コーディングＤＮＡ配列とアミノ酸配列とを有する、エンベロープをもつウィルスに抗する組み換えペプチドに関する。
【解決手段】本ペプチドは、チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、標的ウィルスのエンベロープ（膜）抗原の、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）テイラードドメインとを含む。標的ウィルスのエンベロープ抗原に結合した後、ｓｃＦｖのテイラードドメインは、ウィルスエンベロープに接近するペプチドのコリシンチャンネル形成ドメインを標的とすることができるようになり、そのチャンネル形成ドメインは、エンベロープ二重層内のイオンチャンネルを形成して、標的ウィルスに漏出と死をもたらす。本発明の組み換えペプチドは、宿主細胞以外の標的ウィルスのみを殺し、従来の抗ウィルス薬の宿主に対する副作用を大幅に低減する。
【解決手段】本ペプチドは、チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、標的ウィルスのエンベロープ（膜）抗原の、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）テイラードドメインとを含む。標的ウィルスのエンベロープ抗原に結合した後、ｓｃＦｖのテイラードドメインは、ウィルスエンベロープに接近するペプチドのコリシンチャンネル形成ドメインを標的とすることができるようになり、そのチャンネル形成ドメインは、エンベロープ二重層内のイオンチャンネルを形成して、標的ウィルスに漏出と死をもたらす。本発明の組み換えペプチドは、宿主細胞以外の標的ウィルスのみを殺し、従来の抗ウィルス薬の宿主に対する副作用を大幅に低減する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ウィルスに抗するように操作された抗ウィルスペプチドを提供し、より詳細には、エンベロープをもつウィルスに対する抗ウィルスペプチド、抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列、抗ウィルスペプチドのアミノ酸配列、及び抗ウィルスペプチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染は、人命にとって圧倒的な脅威となってきている。産業のグローバル化によって、肝炎、インフルエンザ、肺炎、脳炎、ウィルス誘発性癌腫およびＡＩＤＳなどのウィルス感染が流行性の現象となりつつある。抗ウィルス薬を発明し開発するための現行の手法は、通常はウィルス遺伝子の代謝を阻害したり、ウィルス酵素の活性を阻害したり、あるいは抗体や免疫因子などの免疫学的手法を用いてウィルスワクチンを製造しようとするものであった。残念なことに、ウィルスが変異を通じて耐性を獲得できるために、こうした薬剤は急速にその有効性を失ってしまう。たとえば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に抗するラミンブジン（Ｌａｍｉｎｖｕｄｉｎｅ）の有効性は、最初に導入したときには９０％を越えるが、数年間の臨床投与の後にはＨＢＶの変異によって１０％にまで落ち込む。
【０００３】
革新的な手法として、ウィルスの変異耐性を克服するために、変異の発生が比較的低いウィルス構造体を標的部位として選択すべきである。ウィルスのエンベロープを破壊することにより、ウィルスの反復感染を防止することができるであろう。エンベロープを本発明の標的として選ぶ理由は、エンベロープの基本構造である脂質二重層が比較的安定な構造であり、エンベロープをもつウィルスのタンパク質およびヌクレオチドと比べて、変異の可能性をほぼ欠いているためである。
【０００４】
自然界においては、多くのバクテリオシンが細菌細胞膜内に致命的なチャンネルを形成することにより標的細菌を殺傷するように働く。１つの典型的なモデルとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が、他の大腸菌株と関連細菌種を特異的に殺すために分泌する外毒素であるコリシンが挙げられる。１９５２年にＪａｃｏｂは、コリシンが、大腸菌の他の株と関連する桿菌を殺しうることを発見した（非特許文献１）。コリシンの殺菌効果は、細胞膜内に致命的なイオンチャンネルを形成することによって起こることが分かっている（非特許文献２）。最近になって、ＱｉｕとＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎらは、コリシンＩａ電圧依存性チャンネルの膜貫通構造が、リン脂質二重膜におけるゲーティングに関連していることを発見した（非特許文献３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
エンベロープをもつウィルスは、通常、自らの特異的な膜抗原または受容体を有している。例えば、ＨＢＶエンベロープ上には非常に特異的なＨｂｓＡｇおよびＰｒｅＳ１膜抗原が存在する。したがって、抗体または誂えた一本鎖抗体などの、上記抗原の特異的部分を用いて、エンベロープをもつウィルスの脂質二重層に接近するコリシンのチャンネル形成ドメインを標的とすることができる。
【非特許文献１】ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、Ｓｕｒ ｌａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｄ’ｕｎｅ ｃｏｌｉｃｉｎｅ ｅｔ ｓｏｎ ｍｏｄｅ ｄ’ａｃｔｉｏｎ，Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９５２年、８３：２９５〜３１５
【非特許文献２】シェイン（Ｓｃｈｅｉｎ）等、「リン脂質二重層膜における電圧依存性チャンネルを形成することによるコリシンＫの活動（Ｃｏｌｉｃｉｎ Ｋ ａｃｔｓ ｂｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｂｉｌａｙｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）」，１９７８年，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７６：１５９〜１６３頁
【非特許文献３】クイ（Ｑｕｉ）等、「コリシンＩａチャンネルゲーティングに関連する主たる膜貫通型移動（Ｍａｊｏｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｉｃｉｎ Ｉａ ｃｈａｎｎｅｌ ｇａｔｉｎｇ．）、１９９６年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７：３１３〜３２８頁
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分との融合ペプチドを含む組み換え抗ウィルスペプチドを提供するものである。
ウィルスエンベロープタンパク質は、標的ウィルスのエンベロープ抗原に特異的に結合するペプチドであってもよい。抗ウィルスペプチドは、標的のエンベロープに接近するコリシンのチャンネル形成ドメインを誘導し、コリシンチャンネルを形成することができる。このコリシンチャンネルは、ウィルスエンベロープを破壊して、ウィルス内容物を漏出させることができる。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、例えば、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）ペプチドのＮ末端を、抗ウィルスペプチドとして、コリシンＩａのＣ末端またはそのチャンネル形成ドメインに連結した。切断ＰｒｅＳ１ｓｃＦｖとコリシンＩａのペプチド鎖の長さを変えることよって、抗ウィルスペプチドの分子量は５，０００〜１００，０００の間で変化させることができる。このペプチドの選択されるコリシンは、コリシンＥ１，Ｉａ，Ｉｂ，Ａ，ＢおよびＮなどのチャンネル形成コリシンのうちの１つ、またはそれらのチャンネル形成ドメインであってもよい。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａチャンネル形成ドメインのＮ末端において連結し、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【０００９】
本発明の他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａチャンネル形成ドメインのＣ末端において連結し、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【００１０】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａのＮ末端において連結し、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
また、本発明のさらに他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａのＣ末端において連結し、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、例えばＨｂｓＡｇ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２３６８１６）のＧ２８−Ｖ５０およびＥ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖（配列番号：２）のＮ末端を、コリシンＩａ（配列番号：１）のＣ末端に連結し、組み換え抗ウィルスペプチド（配列番号：５）を発現するコーディング核酸配列（配列番号：４）を得ることができる。
【００１２】
他の好ましい態様において、本発明は、組み換えベクターを提供することができる。つまり、Ｃ末端Ｉ６２６においてコリシンＩａの位置を選択した後、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖフェロモン遺伝子を、二本鎖部位特異的変異法によって挿入することができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、例えば、元のプラスミドは、コリシンＩａと免疫タンパク質の遺伝子を導入した市販のベクター（ｐＳＥＬＥＣＴＴＭ−１，Ｐｒｏｍｅｇａ）である。コリシンＩａおよび免疫タンパク質の遺伝子は、このプラスミドの９３０〜３３４７位の間に導入することができる。クイック−チェンジ（Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ）キット（ストラテジーン社）のプロトコールに従って、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの抗原結合部位の遺伝子を有する４対のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６〜配列番号：１３）を用いて、コリシン遺伝子の選択位置に挿入し、変異プラスミドで大腸菌（ＴＧ１株）をトランスフェクトし、変異配列を確認した後に、ペプチドを生産することができる。
【００１４】
本発明は、医薬品として利用可能な、本発明の抗ウィルスペプチドと適切な添加剤とを含む組成物も提供することもできる。
【００１５】
本発明は、例えばＨＢＶエンベロープ抗原ｓｃＦｖのコーディング遺伝子をチャンネル形成コリシンの遺伝子またはそのチャンネル形成ドメインの遺伝子と結合することにより、抗ウィルスペプチド遺伝子を得るように、本発明の抗ウィルスペプチドを調製するための方法を提供することができる。そして、得られる組み換えベクターを発現系に導入して、抗ウィルスペプチドを発現させることができる。
【００１６】
エンベロープをもつすべてのウィルスは、例えば、独自のエンベロープ抗原または受容体を有し、各抗ウィルスペプチドは、これらの抗原／受容体の結合ペプチドと、イオンチャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインとを連結することによって作り出すことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ウィルスエンベロープ内にイオンチャンネルを形成して、ウィルスを殺すことのできる新しい組み換え抗ウィルスペプチド、この抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列、この抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列を有する組み換えプラスミドを提供することができる。また、本発明の抗ウィルスペプチドのアミノ酸配列を提供し、本発明の抗ウィルスペプチドを含む組成物を提供することができる。さらに、抗ウィルスペプチドの調製方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［実施例１］
＜抗ウィルスペプチドを発現するプラスミドの構築と組み換え抗ウィルスペプチドの調製＞
ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２８６８１６）のＧ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖の遺伝子（配列番号：２）を、８．３ｋｂの市販のｐＳＥＬＥＣＴＴＭ−１（プロメガ社）内のコリシンＩａ遺伝子のＩ６２６位に、４回にわたる二本鎖オリゴヌクレオチド変異法により（クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標名））キット、ストラテジーン社）に挿入し、変異プラスミドをＴＧ１大腸菌細胞にトランスフェクトした後、変異プラスミドを保有するＴＧ１細胞をＦＢ培地中で増殖させてペプチドを生産した。
【００１９】
変異法は、以下のように、クイックチェンジ部位特異的変異法キット（カタログ番号２００５１８、ストラテジーン社）のプロトコールに従って行った。
【００２０】
変異法のための反応物質の準備：
５μＬ １０Ｘバッファ
２μ（１０ｎｇ） コリシンのプラスミドの野生型
１．２５μＬ（１２５ｎｇ） 設計された５’−３’オリゴヌクレオチドプライマー（下記プライマー配列参照）
１．２５μＬ（１２５ｎｇ） 設計された３’−５’オリゴヌクレオチドプライマー（下記プライマー配列参照）
１μＬ ｄＮＴＰ
５０μＬ ２回蒸留水
１μＬ ｐｆｕ
【００２１】
ＰＣＲ操作：
変性 ９５℃で３５秒
アニール ５３℃で７０秒
伸長 ６８℃で１７分
このサイクルを２０回行った。
【００２２】
Ｄｐｎｌ １μＬ（３７℃、１時間）によって親ＤＮＡを消化し、１μＬの反応物質を５０μＬのＸＬ−１ブルースーパーコンピテント細胞とともに氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、２分氷上に置く。
【００２３】
０．５ｍＬのＮＺＹ培地を加え、細菌を３７℃、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートし、５０〜１００μＬの反応物質を固体ＬＢ平板培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン）上に加え、３７℃で一晩インキュベートする。
【００２４】
１８時間インキュベートした後、クローンを増殖のためにＬＢ培地に接種する。様々な市販のＤＮＡ精製キットでプラスミドを回収し、シーケンシングによって変異の有無を確認する。
【００２５】
変異プラスミド（５０ｎｇ）とＴＧ１スーパーコンピテント細胞（５０μＬ）を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で９０秒間の熱ショックを与え、０．５ｍＬのＬＢ培地を加え、３７℃の楕円振盪機中、２２０ｒｐｍで１時間振盪した後、０．１ｍＬを取り出して固体ＬＢ平板培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン）上に加え、３７℃で一晩インキュベートする。
【００２６】
３７℃の楕円振盪機上、２５０ｒｐｍにて６〜８時間、８〜１６リットルのＦＢ培地中で細胞を増殖させ、４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離して細胞を回収し、回収した細胞を、４℃において、５０〜８０ｍＬの５０ｍＭホウ酸バッファ（２ｍＭ ＥＤＴＡ＋２ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、０．２Ｍ ＰＭＳＦ２５０μＬで超音波破砕（４℃、４００ｗ、２分間）し、４℃、７５０００ｒｐｍで１．５時間遠心分離し、１／５体積の硫酸ストレプトマイシンを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、４℃で一晩透析した後、ＣＭ樹脂カラムにロードし、４℃において０．３ＭＮａＣｌ＋５０ｍＭホウ酸バッファで溶出したところ、９０％を越える精製率と１〜５ｍｇ／ｍＬのタンパク質含量の組み換えペプチドが得られる。組み換えペプチドは、該ペプチドを細胞培養に加えるか、腹腔内注射によって投与した場合に、ヒト細胞系列およびマウスに対していかなる毒性や副作用も示さなかった。
【００２７】
上記方法において用いたプライマーのオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
１回目用
５’−３’（配列番号：６）
gcg aat aag ttc tgg ggt att GGA TTC ACC TTC AGT GAC TAC TAC ATG AGC taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：７）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GCT CAT GTA GTA GTC ACT GAA GGT GAA TCC aat acc cca gaa ctt att cgc
２回目用
５’−３’（配列番号：８）
acc ttc agt gac tac tac atg agc TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG AAG taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：９）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTT CCC TGG AGC CTG GCG GAT CCA gct cat gta gta gtc act gaa ggt
３回目用
５’−３’（配列番号：１０）
tgg atc cgc cag gct cca ggg aag GGG CTG GAG TGG GTT TCA GAT GAG taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：１１）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTC ATC TGA AAC CCA CTC CAG CCC ctt ccc tgg agc ctg gcg gat cca
４回目用
５’−３’（配列番号：１２）
ggg ctg gag tgg gtt tca gat gag GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：１３）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GTC GTC CCG GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC ctc atc tga aac cca ctc cag ccc
【００２８】
［実施例２］
実施例１に記載した手順に従って、Ｇ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖の遺伝子を、コリシンＩａ（Ｋ５４４−Ｉ６２２）の孔形成領域のＣ末端に連結して組み換えペプチドを得た。
【００２９】
［実施例３］
実施例１に記載した手順に従って、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の遺伝子を、コリシンＩａの孔形成領域のＮ末端に連結して、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａの孔形成領域のＣ末端に連結して、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａのＮ末端に連結して、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａのＣ末端に連結して、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得た。
【００３０】
［実施例４］
＜生体外における抗ＨＢＶペプチドの抗ウィルス効果＞
ＨＢＶをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞系列（Ｓ−０１−０３）であるＨｅｐＧ２．２．１５は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｕｄａｎ−Ｙｕｅｄａ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国、上海）より入手した。
ＨＢＶ（デイン粒子）は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培養液を、１００，０００ｇ、４℃で３時間遠心分離することによって得た。ＨＢＶを実施例１の抗ＨＢＶペプチドとともに（体積５：１）３７℃で１時間インキュベートした。数マイクロリットルの試料をグリッド上で１％のリンタングステン酸によって染色した。
図２（Ｂ）は、本発明の抗ウィルスペプチドで１時間処理したウィルスを示す電子顕微鏡写真（撮影倍率は、５０，０００倍）である。図２の左図（Ａ）は、ＨＢＶの正常な形態である。ウィルス粒子が暗くなっているが、これはウィルスエンベロープの透過性が増大し、染料（リンタングステン酸）がウィルスに進入したことを示す（撮影倍率は、５０，０００倍である）。このように、電子顕微鏡（ＥＭ）観察によって、ＨＢＶのウィルスエンベロープが破壊されていることが分かった（図２（Ｂ））。
【００３１】
トランスフェクトさせたＨＢＶ遺伝子ＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞を１０μｇ／ｍＬの実施例１の抗ウィルスペプチドによって処理し、１６４０培地中で６６時間培養した。細胞を光学顕微鏡によって観察し、非処理ＨｅｐＧ２．２．１５細胞と比較した。
その結果を図４ＡからＤに示す。図４Ａは、実施例１の抗ウィルスペプチド１０μｇ／ｍＬで処理し、１６４０培地中で６６時間培養したＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。殆どの細胞が膨張し、粒状内容物でいっぱいになっていた。裸の核は視野全体に散らばっていた。
図４Ｂは、５ｍＭのヨウ化プロピジウムによって染色した図４Ａの細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。大半の細胞が死んでいることが分かった。
図４Ｃは、１６４０培地中で、６６時間増殖させたＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。正常な細胞増殖が観察された。
図４Ｄは、５ｍＭヨウ化プロピジウムによって染色した図４Ｃの細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。少数の細胞だけが死んでいることが分かった。６６時間細胞増殖としては、常に少数の死細胞が見られた。
【００３２】
［実施例５］
＜生体内における抗ＨＢＶペプチドの抗ウィルス効果＞
ＨＢＶウィルス血症のマウスモデルを、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等の方法によって準備した（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等（２０００年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第３１巻、１７３〜１８０頁）。
生化学的かつ組織学的に肝炎の徴候を示す９匹のマウスを３つの群に分けた。
対照群ａ（ｎ＝３）の個体には、０．９％ＰＢＳを毎週１ｍＬずつ腹腔内注射した。
対照群ｂ（ｎ＝３）の個体には、野生型コリシンＩａを毎週０．５ｍｇずつ腹腔内注射した。
試験群（ｎ＝３）の個体には、実施例１の抗ウィルスペプチドを毎週０．５ｍｇずつ腹腔内投与した。
【００３３】
本発明の抗ウィルスペプチドの抗ウィルス効果は、ＨＢｓＡｇ（ＥＩＡによって）および抗ＨＢｃ抗体（ＥＬＩＳＡによって、９６ウェルプレートを組み換えＨｂｃＡｇによってコーティング）の血清中の濃度を、最初の週、第４週目および第８週目に検定することにより評価することができる。結果を図３および表１に示す。図３は、ヒト肝細胞を含む生体内異種移植マウスモデルにおいて、本発明の抗ウィルスペプチドで処理した後の、抗体の力価を示す図であり、マウス血清内でＨＢｓＡｇおよび抗ＨｂｃＡｂ抗体が、本発明の抗ウイルスペプチドを注射した後に明らかに減少していることを示している。ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ抗体は、第４週目から抗ウィルスペプチドを注射したマウスの血清中で劇的に減少した。
【００３４】
（表１）
血清中の抗ＨＢｃ抗体の最終力価
群 試料回収時間
第０週 第２週 第４週
試験群 36450 12150 4050
対照群ａ 36450 109350 109350
対照群ｂ 36450 109350 109350
【００３５】
上記の結果は、本発明の抗ウィルスペプチドが生体外および生体内の両方においてＨＢＶウィルスに対して高い活性を有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖとコリシンＩａの２つの抗原結合部位を含むプラスミド構造の模式図である。
【図２】本発明の抗ウィルスペプチドで１時間処理したウィルスを示す電子顕微鏡写真であって、左図（図２Ａ）は、ＨＢＶの正常な形態であり、右図（図２Ｂ）は、抗ウィルスペプチドで１時間処理した後である。
【図３】本発明の抗ウィルスペプチドで処理した後の、マウス血清内の抗体の力価を示す図である。
【図４】本発明の抗ウィルスペプチドで処理したＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ａ及びＢ）、あるいは処理していないＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｃ及びＤ）の顕微鏡写真である。
【配列表】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ウィルスに抗するように操作された抗ウィルスペプチドを提供し、より詳細には、エンベロープをもつウィルスに対する抗ウィルスペプチド、抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列、抗ウィルスペプチドのアミノ酸配列、及び抗ウィルスペプチドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウィルス感染は、人命にとって圧倒的な脅威となってきている。産業のグローバル化によって、肝炎、インフルエンザ、肺炎、脳炎、ウィルス誘発性癌腫およびＡＩＤＳなどのウィルス感染が流行性の現象となりつつある。抗ウィルス薬を発明し開発するための現行の手法は、通常はウィルス遺伝子の代謝を阻害したり、ウィルス酵素の活性を阻害したり、あるいは抗体や免疫因子などの免疫学的手法を用いてウィルスワクチンを製造しようとするものであった。残念なことに、ウィルスが変異を通じて耐性を獲得できるために、こうした薬剤は急速にその有効性を失ってしまう。たとえば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）に抗するラミンブジン（Ｌａｍｉｎｖｕｄｉｎｅ）の有効性は、最初に導入したときには９０％を越えるが、数年間の臨床投与の後にはＨＢＶの変異によって１０％にまで落ち込む。
【０００３】
革新的な手法として、ウィルスの変異耐性を克服するために、変異の発生が比較的低いウィルス構造体を標的部位として選択すべきである。ウィルスのエンベロープを破壊することにより、ウィルスの反復感染を防止することができるであろう。エンベロープを本発明の標的として選ぶ理由は、エンベロープの基本構造である脂質二重層が比較的安定な構造であり、エンベロープをもつウィルスのタンパク質およびヌクレオチドと比べて、変異の可能性をほぼ欠いているためである。
【０００４】
自然界においては、多くのバクテリオシンが細菌細胞膜内に致命的なチャンネルを形成することにより標的細菌を殺傷するように働く。１つの典型的なモデルとして、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が、他の大腸菌株と関連細菌種を特異的に殺すために分泌する外毒素であるコリシンが挙げられる。１９５２年にＪａｃｏｂは、コリシンが、大腸菌の他の株と関連する桿菌を殺しうることを発見した（非特許文献１）。コリシンの殺菌効果は、細胞膜内に致命的なイオンチャンネルを形成することによって起こることが分かっている（非特許文献２）。最近になって、ＱｉｕとＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎらは、コリシンＩａ電圧依存性チャンネルの膜貫通構造が、リン脂質二重膜におけるゲーティングに関連していることを発見した（非特許文献３）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
エンベロープをもつウィルスは、通常、自らの特異的な膜抗原または受容体を有している。例えば、ＨＢＶエンベロープ上には非常に特異的なＨｂｓＡｇおよびＰｒｅＳ１膜抗原が存在する。したがって、抗体または誂えた一本鎖抗体などの、上記抗原の特異的部分を用いて、エンベロープをもつウィルスの脂質二重層に接近するコリシンのチャンネル形成ドメインを標的とすることができる。
【非特許文献１】ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）等、Ｓｕｒ ｌａ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｄ’ｕｎｅ ｃｏｌｉｃｉｎｅ ｅｔ ｓｏｎ ｍｏｄｅ ｄ’ａｃｔｉｏｎ，Ａｎｎｕａｌｓ ｏｆ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９５２年、８３：２９５〜３１５
【非特許文献２】シェイン（Ｓｃｈｅｉｎ）等、「リン脂質二重層膜における電圧依存性チャンネルを形成することによるコリシンＫの活動（Ｃｏｌｉｃｉｎ Ｋ ａｃｔｓ ｂｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｏｌｔａｇｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｂｉｌａｙｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）」，１９７８年，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２７６：１５９〜１６３頁
【非特許文献３】クイ（Ｑｕｉ）等、「コリシンＩａチャンネルゲーティングに関連する主たる膜貫通型移動（Ｍａｊｏｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｌｉｃｉｎ Ｉａ ｃｈａｎｎｅｌ ｇａｔｉｎｇ．）、１９９６年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７：３１３〜３２８頁
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分との融合ペプチドを含む組み換え抗ウィルスペプチドを提供するものである。
ウィルスエンベロープタンパク質は、標的ウィルスのエンベロープ抗原に特異的に結合するペプチドであってもよい。抗ウィルスペプチドは、標的のエンベロープに接近するコリシンのチャンネル形成ドメインを誘導し、コリシンチャンネルを形成することができる。このコリシンチャンネルは、ウィルスエンベロープを破壊して、ウィルス内容物を漏出させることができる。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態において、例えば、切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）ペプチドのＮ末端を、抗ウィルスペプチドとして、コリシンＩａのＣ末端またはそのチャンネル形成ドメインに連結した。切断ＰｒｅＳ１ｓｃＦｖとコリシンＩａのペプチド鎖の長さを変えることよって、抗ウィルスペプチドの分子量は５，０００〜１００，０００の間で変化させることができる。このペプチドの選択されるコリシンは、コリシンＥ１，Ｉａ，Ｉｂ，Ａ，ＢおよびＮなどのチャンネル形成コリシンのうちの１つ、またはそれらのチャンネル形成ドメインであってもよい。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａチャンネル形成ドメインのＮ末端において連結し、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【０００９】
本発明の他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａチャンネル形成ドメインのＣ末端において連結し、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【００１０】
本発明のさらに他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａのＮ末端において連結し、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
また、本発明のさらに他の好ましい実施形態において、例えばＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の抗原結合部位を、コリシンＩａのＣ末端において連結し、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得ることができる。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、例えばＨｂｓＡｇ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２３６８１６）のＧ２８−Ｖ５０およびＥ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖（配列番号：２）のＮ末端を、コリシンＩａ（配列番号：１）のＣ末端に連結し、組み換え抗ウィルスペプチド（配列番号：５）を発現するコーディング核酸配列（配列番号：４）を得ることができる。
【００１２】
他の好ましい態様において、本発明は、組み換えベクターを提供することができる。つまり、Ｃ末端Ｉ６２６においてコリシンＩａの位置を選択した後、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖフェロモン遺伝子を、二本鎖部位特異的変異法によって挿入することができる。
【００１３】
好ましい実施形態において、例えば、元のプラスミドは、コリシンＩａと免疫タンパク質の遺伝子を導入した市販のベクター（ｐＳＥＬＥＣＴＴＭ−１，Ｐｒｏｍｅｇａ）である。コリシンＩａおよび免疫タンパク質の遺伝子は、このプラスミドの９３０〜３３４７位の間に導入することができる。クイック−チェンジ（Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ）キット（ストラテジーン社）のプロトコールに従って、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの抗原結合部位の遺伝子を有する４対のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：６〜配列番号：１３）を用いて、コリシン遺伝子の選択位置に挿入し、変異プラスミドで大腸菌（ＴＧ１株）をトランスフェクトし、変異配列を確認した後に、ペプチドを生産することができる。
【００１４】
本発明は、医薬品として利用可能な、本発明の抗ウィルスペプチドと適切な添加剤とを含む組成物も提供することもできる。
【００１５】
本発明は、例えばＨＢＶエンベロープ抗原ｓｃＦｖのコーディング遺伝子をチャンネル形成コリシンの遺伝子またはそのチャンネル形成ドメインの遺伝子と結合することにより、抗ウィルスペプチド遺伝子を得るように、本発明の抗ウィルスペプチドを調製するための方法を提供することができる。そして、得られる組み換えベクターを発現系に導入して、抗ウィルスペプチドを発現させることができる。
【００１６】
エンベロープをもつすべてのウィルスは、例えば、独自のエンベロープ抗原または受容体を有し、各抗ウィルスペプチドは、これらの抗原／受容体の結合ペプチドと、イオンチャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインとを連結することによって作り出すことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、ウィルスエンベロープ内にイオンチャンネルを形成して、ウィルスを殺すことのできる新しい組み換え抗ウィルスペプチド、この抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列、この抗ウィルスペプチドのコーディングＤＮＡ配列を有する組み換えプラスミドを提供することができる。また、本発明の抗ウィルスペプチドのアミノ酸配列を提供し、本発明の抗ウィルスペプチドを含む組成物を提供することができる。さらに、抗ウィルスペプチドの調製方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
［実施例１］
＜抗ウィルスペプチドを発現するプラスミドの構築と組み換え抗ウィルスペプチドの調製＞
ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖ（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２８６８１６）のＧ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖の遺伝子（配列番号：２）を、８．３ｋｂの市販のｐＳＥＬＥＣＴＴＭ−１（プロメガ社）内のコリシンＩａ遺伝子のＩ６２６位に、４回にわたる二本鎖オリゴヌクレオチド変異法により（クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標名））キット、ストラテジーン社）に挿入し、変異プラスミドをＴＧ１大腸菌細胞にトランスフェクトした後、変異プラスミドを保有するＴＧ１細胞をＦＢ培地中で増殖させてペプチドを生産した。
【００１９】
変異法は、以下のように、クイックチェンジ部位特異的変異法キット（カタログ番号２００５１８、ストラテジーン社）のプロトコールに従って行った。
【００２０】
変異法のための反応物質の準備：
５μＬ １０Ｘバッファ
２μ（１０ｎｇ） コリシンのプラスミドの野生型
１．２５μＬ（１２５ｎｇ） 設計された５’−３’オリゴヌクレオチドプライマー（下記プライマー配列参照）
１．２５μＬ（１２５ｎｇ） 設計された３’−５’オリゴヌクレオチドプライマー（下記プライマー配列参照）
１μＬ ｄＮＴＰ
５０μＬ ２回蒸留水
１μＬ ｐｆｕ
【００２１】
ＰＣＲ操作：
変性 ９５℃で３５秒
アニール ５３℃で７０秒
伸長 ６８℃で１７分
このサイクルを２０回行った。
【００２２】
Ｄｐｎｌ １μＬ（３７℃、１時間）によって親ＤＮＡを消化し、１μＬの反応物質を５０μＬのＸＬ−１ブルースーパーコンピテント細胞とともに氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で４５秒間熱ショックを与え、２分氷上に置く。
【００２３】
０．５ｍＬのＮＺＹ培地を加え、細菌を３７℃、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートし、５０〜１００μＬの反応物質を固体ＬＢ平板培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン）上に加え、３７℃で一晩インキュベートする。
【００２４】
１８時間インキュベートした後、クローンを増殖のためにＬＢ培地に接種する。様々な市販のＤＮＡ精製キットでプラスミドを回収し、シーケンシングによって変異の有無を確認する。
【００２５】
変異プラスミド（５０ｎｇ）とＴＧ１スーパーコンピテント細胞（５０μＬ）を氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で９０秒間の熱ショックを与え、０．５ｍＬのＬＢ培地を加え、３７℃の楕円振盪機中、２２０ｒｐｍで１時間振盪した後、０．１ｍＬを取り出して固体ＬＢ平板培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン）上に加え、３７℃で一晩インキュベートする。
【００２６】
３７℃の楕円振盪機上、２５０ｒｐｍにて６〜８時間、８〜１６リットルのＦＢ培地中で細胞を増殖させ、４℃、６０００ｇで２０分間遠心分離して細胞を回収し、回収した細胞を、４℃において、５０〜８０ｍＬの５０ｍＭホウ酸バッファ（２ｍＭ ＥＤＴＡ＋２ｍＭ ＤＴＴ）に懸濁し、０．２Ｍ ＰＭＳＦ２５０μＬで超音波破砕（４℃、４００ｗ、２分間）し、４℃、７５０００ｒｐｍで１．５時間遠心分離し、１／５体積の硫酸ストレプトマイシンを添加することによりＤＮＡを沈殿させ、４℃で一晩透析した後、ＣＭ樹脂カラムにロードし、４℃において０．３ＭＮａＣｌ＋５０ｍＭホウ酸バッファで溶出したところ、９０％を越える精製率と１〜５ｍｇ／ｍＬのタンパク質含量の組み換えペプチドが得られる。組み換えペプチドは、該ペプチドを細胞培養に加えるか、腹腔内注射によって投与した場合に、ヒト細胞系列およびマウスに対していかなる毒性や副作用も示さなかった。
【００２７】
上記方法において用いたプライマーのオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
１回目用
５’−３’（配列番号：６）
gcg aat aag ttc tgg ggt att GGA TTC ACC TTC AGT GAC TAC TAC ATG AGC taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：７）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GCT CAT GTA GTA GTC ACT GAA GGT GAA TCC aat acc cca gaa ctt att cgc
２回目用
５’−３’（配列番号：８）
acc ttc agt gac tac tac atg agc TGG ATC CGC CAG GCT CCA GGG AAG taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：９）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTT CCC TGG AGC CTG GCG GAT CCA gct cat gta gta gtc act gaa ggt
３回目用
５’−３’（配列番号：１０）
tgg atc cgc cag gct cca ggg aag GGG CTG GAG TGG GTT TCA GAT GAG taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：１１）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTC ATC TGA AAC CCA CTC CAG CCC ctt ccc tgg agc ctg gcg gat cca
４回目用
５’−３’（配列番号：１２）
ggg ctg gag tgg gtt tca gat gag GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC taa ata aaa tat aag aca ggc
３’−５’（配列番号：１３）
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GTC GTC CCG GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC ctc atc tga aac cca ctc cag ccc
【００２８】
［実施例２］
実施例１に記載した手順に従って、Ｇ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８ペプチド鎖の遺伝子を、コリシンＩａ（Ｋ５４４−Ｉ６２２）の孔形成領域のＣ末端に連結して組み換えペプチドを得た。
【００２９】
［実施例３］
実施例１に記載した手順に従って、ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）の遺伝子を、コリシンＩａの孔形成領域のＮ末端に連結して、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａの孔形成領域のＣ末端に連結して、分子量が約４０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａのＮ末端に連結して、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得た。
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖフェロモンの遺伝子（遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８）をコリシンＩａのＣ末端に連結して、分子量が約９０，０００の組み換えペプチドを得た。
【００３０】
［実施例４］
＜生体外における抗ＨＢＶペプチドの抗ウィルス効果＞
ＨＢＶをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞系列（Ｓ−０１−０３）であるＨｅｐＧ２．２．１５は、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｆｕｄａｎ−Ｙｕｅｄａ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（中国、上海）より入手した。
ＨＢＶ（デイン粒子）は、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の培養液を、１００，０００ｇ、４℃で３時間遠心分離することによって得た。ＨＢＶを実施例１の抗ＨＢＶペプチドとともに（体積５：１）３７℃で１時間インキュベートした。数マイクロリットルの試料をグリッド上で１％のリンタングステン酸によって染色した。
図２（Ｂ）は、本発明の抗ウィルスペプチドで１時間処理したウィルスを示す電子顕微鏡写真（撮影倍率は、５０，０００倍）である。図２の左図（Ａ）は、ＨＢＶの正常な形態である。ウィルス粒子が暗くなっているが、これはウィルスエンベロープの透過性が増大し、染料（リンタングステン酸）がウィルスに進入したことを示す（撮影倍率は、５０，０００倍である）。このように、電子顕微鏡（ＥＭ）観察によって、ＨＢＶのウィルスエンベロープが破壊されていることが分かった（図２（Ｂ））。
【００３１】
トランスフェクトさせたＨＢＶ遺伝子ＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞を１０μｇ／ｍＬの実施例１の抗ウィルスペプチドによって処理し、１６４０培地中で６６時間培養した。細胞を光学顕微鏡によって観察し、非処理ＨｅｐＧ２．２．１５細胞と比較した。
その結果を図４ＡからＤに示す。図４Ａは、実施例１の抗ウィルスペプチド１０μｇ／ｍＬで処理し、１６４０培地中で６６時間培養したＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。殆どの細胞が膨張し、粒状内容物でいっぱいになっていた。裸の核は視野全体に散らばっていた。
図４Ｂは、５ｍＭのヨウ化プロピジウムによって染色した図４Ａの細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。大半の細胞が死んでいることが分かった。
図４Ｃは、１６４０培地中で、６６時間増殖させたＨｅｐＧ２．２．１５肝芽腫細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。正常な細胞増殖が観察された。
図４Ｄは、５ｍＭヨウ化プロピジウムによって染色した図４Ｃの細胞の顕微鏡写真（撮影倍率は４００倍）である。少数の細胞だけが死んでいることが分かった。６６時間細胞増殖としては、常に少数の死細胞が見られた。
【００３２】
［実施例５］
＜生体内における抗ＨＢＶペプチドの抗ウィルス効果＞
ＨＢＶウィルス血症のマウスモデルを、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等の方法によって準備した（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）等（２０００年）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、第３１巻、１７３〜１８０頁）。
生化学的かつ組織学的に肝炎の徴候を示す９匹のマウスを３つの群に分けた。
対照群ａ（ｎ＝３）の個体には、０．９％ＰＢＳを毎週１ｍＬずつ腹腔内注射した。
対照群ｂ（ｎ＝３）の個体には、野生型コリシンＩａを毎週０．５ｍｇずつ腹腔内注射した。
試験群（ｎ＝３）の個体には、実施例１の抗ウィルスペプチドを毎週０．５ｍｇずつ腹腔内投与した。
【００３３】
本発明の抗ウィルスペプチドの抗ウィルス効果は、ＨＢｓＡｇ（ＥＩＡによって）および抗ＨＢｃ抗体（ＥＬＩＳＡによって、９６ウェルプレートを組み換えＨｂｃＡｇによってコーティング）の血清中の濃度を、最初の週、第４週目および第８週目に検定することにより評価することができる。結果を図３および表１に示す。図３は、ヒト肝細胞を含む生体内異種移植マウスモデルにおいて、本発明の抗ウィルスペプチドで処理した後の、抗体の力価を示す図であり、マウス血清内でＨＢｓＡｇおよび抗ＨｂｃＡｂ抗体が、本発明の抗ウイルスペプチドを注射した後に明らかに減少していることを示している。ＨＢｓＡｇおよび抗ＨＢｃ抗体は、第４週目から抗ウィルスペプチドを注射したマウスの血清中で劇的に減少した。
【００３４】
（表１）
血清中の抗ＨＢｃ抗体の最終力価
群 試料回収時間
第０週 第２週 第４週
試験群 36450 12150 4050
対照群ａ 36450 109350 109350
対照群ｂ 36450 109350 109350
【００３５】
上記の結果は、本発明の抗ウィルスペプチドが生体外および生体内の両方においてＨＢＶウィルスに対して高い活性を有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖとコリシンＩａの２つの抗原結合部位を含むプラスミド構造の模式図である。
【図２】本発明の抗ウィルスペプチドで１時間処理したウィルスを示す電子顕微鏡写真であって、左図（図２Ａ）は、ＨＢＶの正常な形態であり、右図（図２Ｂ）は、抗ウィルスペプチドで１時間処理した後である。
【図３】本発明の抗ウィルスペプチドで処理した後の、マウス血清内の抗体の力価を示す図である。
【図４】本発明の抗ウィルスペプチドで処理したＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ａ及びＢ）、あるいは処理していないＨｅｐＧ２．２．１５細胞（Ｃ及びＤ）の顕微鏡写真である。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分との融合ペプチドを含む、エンベロープをもつウィルスに抗する組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項２】
チャンネル形成コリシンがコリシンＥ１，Ｉａ，Ｉｂ，Ａ，ＢおよびＮからなる群より選択される請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項３】
ウィルスエンベロープタンパク質がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウィルスエンベロープタンパク質である請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項４】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８としてのＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖを含む請求項３に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項５】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのＮ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項６】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのＣ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項７】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのチャンネル形成ドメインのＮ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項８】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのチャンネル形成ドメインのＣ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項９】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２３６８１６としてのＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖを含む請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１０】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの抗原結合部位を1個以上含む請求項９に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１１】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖ Ｇ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８の２つのセグメントを含む請求項１０に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１２】
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの２つのセグメントのＮ末端が、コリシンＩａのＣ末端と連結されている請求項１１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１３】
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの２つのセグメントのＮ末端が、コリシンＩａの孔形成領域のＣ末端に連結されている請求項１１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１４】
配列番号：５のヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１５】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインをコードする遺伝子と、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分をコードする遺伝子とを含む抗ウィルスペプチドの組み換えＤＮＡ配列。
【請求項１６】
配列番号：４のヌクレオチド配列を含む請求項１５に記載の組み換えＤＮＡ配列。
【請求項１７】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインをコードする遺伝子と、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分をコードする遺伝子とを含む組み換えプラスミド。
【請求項１８】
配列番号：４のヌクレオチド配列を含む請求項１７に記載の組み換えプラスミド。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか一項記載の抗ウィルスペプチドを含む組成物。
【請求項２０】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分の遺伝子と、チャンネル形成コリシン遺伝子またはそのチャンネル形成ドメイン遺伝子とを連結して、融合遺伝子を作成する工程と、融合遺伝子を発現系に導入する工程と、発現する工程と、発現系から抗ウィルスペプチドを回収する工程とを含む、組み換え抗ウィルスペプチドの調製方法。
【請求項１】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインと、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分との融合ペプチドを含む、エンベロープをもつウィルスに抗する組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項２】
チャンネル形成コリシンがコリシンＥ１，Ｉａ，Ｉｂ，Ａ，ＢおよびＮからなる群より選択される請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項３】
ウィルスエンベロープタンパク質がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウィルスエンベロープタンパク質である請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項４】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ４２７１４８としてのＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖを含む請求項３に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項５】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのＮ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項６】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのＣ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項７】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのチャンネル形成ドメインのＮ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項８】
ＨＢＶ ＰｒｅＳ１ ｓｃＦｖが、コリシンＩａのチャンネル形成ドメインのＣ末端において連結されている請求項４に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項９】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、遺伝子銀行アクセス番号ＡＦ２３６８１６としてのＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖを含む請求項１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１０】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの抗原結合部位を1個以上含む請求項９に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１１】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分が、ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖ Ｇ２８−Ｖ５０／Ｅ２１６−Ｓ２２８の２つのセグメントを含む請求項１０に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１２】
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの２つのセグメントのＮ末端が、コリシンＩａのＣ末端と連結されている請求項１１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１３】
ＨＢＶ ＨＢｓＡｇ ｓｃＦｖの２つのセグメントのＮ末端が、コリシンＩａの孔形成領域のＣ末端に連結されている請求項１１に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１４】
配列番号：５のヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の組み換え抗ウィルスペプチド。
【請求項１５】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインをコードする遺伝子と、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分をコードする遺伝子とを含む抗ウィルスペプチドの組み換えＤＮＡ配列。
【請求項１６】
配列番号：４のヌクレオチド配列を含む請求項１５に記載の組み換えＤＮＡ配列。
【請求項１７】
チャンネル形成コリシンまたはそのチャンネル形成ドメインをコードする遺伝子と、ウィルスエンベロープタンパク質標的部分をコードする遺伝子とを含む組み換えプラスミド。
【請求項１８】
配列番号：４のヌクレオチド配列を含む請求項１７に記載の組み換えプラスミド。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか一項記載の抗ウィルスペプチドを含む組成物。
【請求項２０】
ウィルスエンベロープタンパク質標的部分の遺伝子と、チャンネル形成コリシン遺伝子またはそのチャンネル形成ドメイン遺伝子とを連結して、融合遺伝子を作成する工程と、融合遺伝子を発現系に導入する工程と、発現する工程と、発現系から抗ウィルスペプチドを回収する工程とを含む、組み換え抗ウィルスペプチドの調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５０６９６５（Ｐ２００６−５０６９６５Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５１３３１４（Ｐ２００４−５１３３１４）
【出願日】平成１５年６月１７日（２００３．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００４６９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０６４８３
【国際公開日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５０４４６３７６３）チェンドゥ フォトン バイオテクノロジー リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＥＮＧＤＵ ＰＨＯＴＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１５Ｆ， ５ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｒａｉｎｂｏｗ Ｇａｒｄｅｎ， Ｎｏ．１ Ｎａｎｐｕ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１００００， Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年６月１７日（２００３．６．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００３／０００４６９
【国際公開番号】ＷＯ２００３／１０６４８３
【国際公開日】平成１５年１２月２４日（２００３．１２．２４）
【出願人】（５０４４６３７６３）チェンドゥ フォトン バイオテクノロジー リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＥＮＧＤＵ ＰＨＯＴＯＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１５Ｆ， ５ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｒａｉｎｂｏｗ Ｇａｒｄｅｎ， Ｎｏ．１ Ｎａｎｐｕ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈｅｎｇｄｕ， Ｓｉｃｈｕａｎ ６１００００， Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡ
【Ｆターム（参考）】
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