オクラトキシンに対する抗体、その抗体を用いた親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キット
【課題】食物などの試料中に含まれる可能性のあるオクラトキシンＡおよびＢを検出・濃縮・精製すること、ならびにそれらの総量または個別の量を高感度に検出する方法を提供すること。
【解決手段】オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体を免疫原として用い、オクラトキシンＡおよびＢに対して同等の反応性を示すと同時に、有機溶媒に耐性の高い抗体を得て、当該抗体を用いた検出・濃縮・精製手段ならびに免疫学的検出手段を構築する。構築された検出手段は、高感度かつ定量性に優れている。
【解決手段】オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体を免疫原として用い、オクラトキシンＡおよびＢに対して同等の反応性を示すと同時に、有機溶媒に耐性の高い抗体を得て、当該抗体を用いた検出・濃縮・精製手段ならびに免疫学的検出手段を構築する。構築された検出手段は、高感度かつ定量性に優れている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オクラトキシンに対する新規な性質を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。さらに本発明は、このようなモノクローナル抗体またはそのフラグメントを用いた、オクラトキシンの捕捉用親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然毒オクラトキシンは、AspergillusとPenicilliumに属する多くの種類の菌が産生する二次代謝産物である。このうち、主な産生菌は、A. ochraceus とP. viridicatumである。これらの菌は、米、麦、トウモロコシ、小豆、大豆、グリーンコーヒー、煮干などに広く見出されている。
【０００３】
オクラトキシンには、オクラトキシンA、B、およびCの三つが知られている。毒性は、オクラトキシンAが一番強く、その障害は主として肝臓と腎臓に現れる。
【０００４】
わが国では、まだ、オクラトキシンに対する規制値はないが、欧米諸国や国際機関等では、オクラトキシンについてもリスクアセスメントが活発に行われている（非特許文献１）。例えば、ヨーロッパでは、ベビーフード、加工果物、加工穀類、ワイン、ジュース等で一定の規制値がある（非特許文献２）。オクラトキシンの毒性に鑑みて、日本に規制値がなくとも、その検出を行うことは、食の安全性確保の面から必要であると考えられる。そして、検査においては、多数のサンプルを迅速に処理し、かつ微量のオクラトキシンを検出する必要がある。
【０００５】
オクラトキシンの検出においては、サンプルを粉砕後有機溶媒で抽出し、その抽出液を、濃縮精製した上で、ＨＰＬＣなどで分析する手法がある。また、その濃縮精製方法としては、多機能カラムおよび抗体親和性カラムがある。これらの他にも、簡便法として免疫学的検出法が使用される。
【０００６】
オクラトキシンＡに特異的な抗体は、開発され公表されており、オクラトキシンＡに特異的に結合する抗体、ＡにもＢにも交差反応性を示す抗体などがある（特許文献１）。
【特許文献１】特開昭６１−１７１５００号公報
【非特許文献１】Takatoriら、Bull. Natl. Inst. Health Sci., 124, 21-29 (2006)
【非特許文献２】Akiyama, Hら、J. Food Hyg. Soc. Japan, 38, 406-411(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これまで得られているモノクローナル抗体は、有機溶媒に弱く、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーに利用する際や免疫学的測定法に利用する際には、抽出したサンプルを充分に水で希釈しなければならず、試料中に含まれるオクラトキシンの量およびオクラトキシン類縁体の含有比によっては正確に定量できなかった。また、オクラトキシンの濃縮精製に使用するにも困難があった。また、オクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を使うと回収率が低下する欠点があった。そのため、これらの一連の解決法が要望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オクラトキシンＡおよびＢのいずれをも同等に検出でき、極微量のオクラトキシンをも正確に検出するような検出方法を提供すべく鋭意研究を行った結果、オクラトキシンの上記２つのタイプに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持ち、親和性カラムの親和性マトリックスに用いる際にオクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を用いることが可能であるモノクローナル抗体またはそのフラグメント、それを用いた検出方法等を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、オクラトキシンＡに由来するハプテンと高分子化合物との結合体である抗原を用いて得られるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢに対して同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を有する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
【００１０】
上記モノクローナル抗体は、ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂであり得る。
【００１１】
本発明はまた、上記いずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドーマに関する。
【００１２】
上記ハイブリドーマは、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４または受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５で寄託されているハイブリドーマであり得る。
【００１３】
本発明はまた、上記のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いる、オクラトキシンの免疫学的検出用キットに関する。
【００１４】
本発明はまた、担体およびそれに固定化した上記モノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含む親和性マトリックスを含む、親和性カラムに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、オクラトキシンＡおよびＢに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持ち、親和性カラムの親和性マトリックスとして用いる際にオクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を用いることが可能である。その為、このモノクローナル抗体またはそのフラグメントを利用したオクラトキシンの検出方法においては、オクラトキシンの個別の量またはＡおよびＢを同時に、かつ微量でも正確に検出することが可能となる。また、このモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む親和性カラムを用いることにより各種試料中のオクラトキシンの精製・濃縮を効率良く行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する
本明細書において対象となる「オクラトキシン」とは、オクラトキシンＡ、Ｂ、およびＣのいずれか１種を表すかまたは２以上のすべてを総称するが、本発明における「オクラトキシンに対するモノクローナル抗体」は、主にオクラトキシンＡおよびＢのいずれをも同等に認識するモノクローナル抗体を指す。
【００１７】
オクラトキシンは、以下の式
【化１】
で表される化合物である。
【００１８】
本明細書において用いられる、「同等の結合能を有する」または「同等に反応する」とは、ＡおよびＢに対する反応性の違いが、ＡおよびＢに対するＩＣ50値（ng/mL）の比として３倍以内であることを指す。
【００１９】
本明細書において用いられる、「有機溶媒耐性」とは、被検試料を有機溶媒に溶解して親和性マトリックスと接触させる時点において、公知の各種有機溶媒に存在させても抗体またはそのフラグメントが変性を起さないことをいうが、特に、６０％メタノールあるいは５０％アセトニトリル又はエタノール中に常温で少なくとも１５分間存在させても、オクラトキシンＡおよびＢに対する反応性が変化しないことを指す。
【００２０】
本発明に用いられるオクラトキシンＡまたはその誘導体に由来する抗原は、オクラトキシンＡ自体、オクラトキシンＡから公知の様々な方法を用いて誘導される化合物と、高分子化合物との複合体が好都合に使用され得る。
【００２１】
ここで、オクラトキシンＡ誘導体は、オクラトキシンＡに、特に高分子化合物との結合を容易にする為の公知の様々な反応基を導入した化合物を指す。
【００２２】
本発明においては、オクラトキシンＡをそのまま高分子化合物との結合に用いることができ、例えばそのカルボキシル基を、高分子化合物と結合させ、抗原とすることも好ましい。
【００２３】
次に、オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体の作製は、限定はされないが、例えば以下のような方法を用いて、製造することができ、免疫用抗原として使用する。
【００２４】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）などがある。
【００２５】
オクラトキシンＡと高分子化合物との結合は、例えば、オクラトキシンＡ中のカルボキシル基と高分子化合物とを活性化エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋａｒｕ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，42， 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，234， 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって結合させることにより達成することができる。
【００２６】
さらに、上記と同様の方法により酵素等の標識物質をオクラトキシンＡに結合させたものを、免疫学的検出方法において使用することができる。標識物質としては、酵素の他に、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。
【００２７】
本発明では、オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、オクラトキシンに対するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２８】
モノクローナル抗体自体の製造は、通常の方法に従って調製できる。（例えば、Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、前記複合体を常法に従ってウサギ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。
【００２９】
このようにして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを一定の条件下にて培養し、抗体価を測定しながら、所望の性質を有する抗体をスクリーニングする。
【００３０】
モノクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法等に従って行われる。すなわち、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥなど）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などが含まれ、単独であるいは適宜組み合わせて行い得る。
【００３１】
また、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特に限定されないが、下記のような常法に従って調製されうる。
【００３２】
抗原をアジュバントと等量混合した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、定期的に追加免疫する。採取血液の血清中の抗体力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾臓細胞を完全に培地中に浮遊させる。細胞を洗浄後、マウスのミエローマ細胞と混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）などを用いて細胞融合を行う。細胞融合後、ＨＡＴ培地中などで懸濁し、適度な条件下にて培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、オクラトキシンに対する抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【００３３】
本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに精製・濃縮することができる。
【００３４】
本発明の用語で、抗体の「フラグメント」とは、抗原を認識する部位を含む抗体の断片を指す。具体的には、可変領域を含むＦａｂフラグメントＦ（ａｂ）２フラグメント等である。
【００３５】
また、本発明においては、オクラトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて、オクラトキシンを簡便に検出することができ、オクラトキシンの検出方法に好適に使用することができる。さらに、オクラトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体を、検出法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたオクラトキシンのハプテン化合物、緩衝液、検出試薬および／またはオクラトキシンの標準溶液等を含むキットに含めることもできる。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法や金コロイドを用いた検出法に用いられうるものであり、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、固相化されたオクラトキシンに対する抗体、抗体を保持する担体、酵素標識された抗原および検出試薬などを含む。
【００３６】
さらに、本発明は、前記抗体または検出手段を用いることを特徴とするオクラトキシンの検出用方法およびそのような方法に用いる検出用キットに関する。検出方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光もしくは発光検出法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol. II IRL Press Oxford (1989))が挙げられる。標識の手段としては、酵素、金コロイド、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。これらのうち、特に感度や簡便性等の点から、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素を用いるＥＬＩＳＡ、あるいは金コロイドを用いたイムノクロマトが好ましい。
【００３７】
代表的なＥＬＩＳＡによる検出法は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡまたは直接競合阻害ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡによってオクラトキシンの検出を行うことができる。
【００３８】
（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／mLから１００μｇ／mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００３９】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００４０】
（３）各種濃度のオクラトキシンを含む試料に、オクラトキシンのハプテン化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。酵素結合ハプテンの調製は、オクラトキシンのハプテン化合物を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
【００４１】
（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる。オクラトキシンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。オクラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、オクラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリル、エタノールなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を検出することにより、予め作成した検量線から試料中のオクラトキシンの量を決定する。
【００４２】
（５）担体に結合した標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を検出することによって検量線からオクラトキシンの量を算出することができる。標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を検出する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を検出する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に検出することが望ましい。
【００４３】
標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を検出する方法があげられる。
【００４４】
オクラトキシンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、オクラトキシンを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のオクラトキシンを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のオクラトキシンの濃度を算出することができる。
【００４５】
別の態様としてオクラトキシンの検出は以下のような手順により間接競合阻害ＥＬＩＳＡによって行うことができる。
（１）抗原を担体に固相化する。
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０.０１μｇ／mLから１００μｇ／mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００４６】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００４７】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面にオクラトキシンを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびオクラトキシンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびオクラトキシンに対する抗体複合体を生成させる。反応は、通常室温、１時間程度で行うことができる。オクラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することが必要である。前記有機溶媒としては、オクラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリル、エタノールなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶媒が使用できる。
【００４８】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（例えば、マウス抗体を認識する抗体）を添加して検出することができる。例えばオクラトキシンに対する抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したオクラトキシンに対する抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００４９】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、二次抗体に結合させた酵素に反応する発色基質溶液を前述の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を検出することによりあらかじめ作成した検量線からオクラトキシンの量を算出することができる。
【００５０】
前記本発明の検出方法においては、検出対象物に応じた前処理をして試料とした後、直接競合阻害ＥＬＩＳＡの工程または間接競合阻害ＥＬＩＳＡに供することができる。ほとんどの食品の場合、オクラトキシンが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノール、エタノールあるいはアセトニトリルに転溶させて緩衝液で希釈後、検出試料にする。簡便法として、メタノール、エタノールであるいはアセトニトリルで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。
【００５１】
本発明の検出用キットは、このような検出方法を好適に行い得るように、本発明のモノクローナル抗体あるいはそのフラグメントの他、所望により、標識酵素、二次抗体、緩衝液、指示書等を含む。
【００５２】
本発明の免疫検出法および免疫検出用キットとして、イムノクロマトグラフ法およびそれを利用することを目的にしたキットやデバイスを構築することもできる。イムノクロマトグラフ法として、例えば、競合阻害法を利用する方法であれば、本発明のモノクローナル抗体あるいはその断片を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（ナイロン膜又はセルロ−ス膜など）中に、オクラトキシンと特異的に結合する標識第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【００５３】
本発明のイムノクロマトグラフィー用の免疫検出用キットまたはデバイスとしては、従って、例えばＥＬＩＳＡあるいはその他の標識を用いた態様を実現できるものであれば、いかなるものも含まれる。特に限定はされないが、例えば、分析対象物を滴下するサンプルパッド、標識した抗体を含むコンジュゲートパッド、本発明のモノクローナル抗体またはその断片を固定化したテストライン、および標識抗体に特異的な抗体を固定化したコントロールラインを膜上に有するデバイスが好適である。膜は、不溶性薄膜状支持体であり、ガラス繊維、ナイロン膜又はセルロ−ス膜などからなるが、限定はされず、抗体の保持および毛細管現象による検体の移動を可能にする材料であればいずれのものでも使用できる。前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。キット又はデバイスは、さらに任意に、膜を支持するベースカード、余分な検体を吸収する吸収パッドを設けるのも好ましい。
【００５４】
このようなキットあるいはデバイスを用いることにより、分析対象物中に含まれるオクラトキシンを簡便に迅速に測定することが可能となる。
【００５５】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを担持した親和性カラムを用いてオクラトキシンの検出を行うこともできる。
【００５６】
本発明においては、オクラトキシンＡおよびＢの双方に結合し、かつ耐有機溶媒性を有する抗体を含むことにより、被検試料中に含まれるオクラトキシンの個別の量および総量を、固相吸着剤を用いて検出、濃縮および／または精製することができる。このような方法は、特に限定されないが、例えば以下に説明するような方法が用いられ得る。
【００５７】
精製された本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の方法によって親和性マトリックス材料をつくることができる。抗体としては、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントも使用することができるが、特にモノクローナル抗体を好適に用いることができる。この場合、十分量のモノクローナル抗体を、ＮａＨＣＯ3 とＮａＣｌとを含む結合緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、この抗体溶液を、例えば予めＨＣｌ中で一夜インキュベートした、臭化シアンによって活性化されたセファロース−４Ｂ（ＧＥ社）に加える。セファロースと抗体溶液とを反応させた後、この固相吸着材料を、例えば１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で適度な時間インキュベートすることによって、抗体が結合されたゲルの未結合部位をブロックする。固相吸着材料上に固定化されたモノクローナル抗体によって親和性マトリックスが形成され、これをオクラトキシンの検出用に用いることができる。
【００５８】
好ましい固相吸着材料は活性化されたセファロース４Ｂゲルであるが、これに限定されない。他の様々な材料を固相材料として用いることができる。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げることができる。同様に、モノクローナル抗体をそれぞれの化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知であり、種々記載されている。
【００５９】
本発明における液体試料中のオクラトキシンを検出、単離、濃縮および／または精製する方法には、次の工程を含む親和性クロマトグラフィー法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のオクラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。この際、被検試料を溶解した溶剤としてはアセトニトリル、メタノール、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。次に、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントからオクラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。この溶離剤は、アセトニトリル、エタノール、またはメタノールなどであるが、これらに限定されない。次に、このような親和性マトリックスからの回収された流出物中にオクラトキシンが存在するかどうか、どのタイプがどれだけ含まれるかを、例えばＨＰＬＣなどを用いて同定することができる。
【００６０】
本発明における液体試料中のオクラトキシンを濃縮・精製する方法には、本発明のモノクローナル抗体あるいはそのフラグメントを固定化した親和性マトリックス材料を用いた以下の方法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のオクラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。次に、夾雑物を洗浄除去する。そして、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントからオクラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。このようにして、液体試料中のオクラトキシンを、免疫学的に夾雑物の少ない状態で、元の試料中の濃度の数千から数万倍もの高倍率に濃縮できる。これにより、試料中に極微量しか存在しないオクラトキシンでも、抗体を利用しない他の濃縮方法と比較して、はるかに高倍率に濃縮することができ、しかも定量を妨害する夾雑物等の含量の少ない濃縮液を得ることができる。被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤は、アセトニトリル、エタノールまたはメタノールなどであるが、これらに限定されない。アセトニトリルまたはエタノールの場合は、１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度のものが使用できる。
【００６１】
本発明のオクラトキシンに対するモノクローナル抗体の重要な特徴は、オクラトキシンＡ抗原に対するだけでなく、Ｂに対しても同等の高い結合能（親和性）を有することである。さらに、通常の既存の抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体と比較して優れた有機溶媒耐性を有する。従って、被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤には、比較的高い濃度の有機溶媒を用いることができる。
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００６３】
（免疫原の調製）
免疫原としてスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）とオクラトキシンＡとの複合体を、活性エステル法を用いて作製した。
【００６４】
オクラトキシンＡ７．１ｍｇ、N-ヒドロキシスクシンイミド４．１ｍｇ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩６．８ｍｇをジメチルスルホキシド７．１mLに溶解し、この溶液を室温、暗所で１．５時間撹拌し、オクラトキシンＡ溶液とした。別途、０．１Mホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１mLにＫＬＨ １０ｍｇを加え、これにオクラトキシンＡ溶液１７９μｌを徐々に滴下し、室温、暗所で１．５時間撹拌した。反応終了後、４℃で２日間、生理的リン酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ リン酸緩衝液、以下「ＰＢＳ」と記す。）に対して透析した後、−４０℃で貯蔵した。このようにして得られたオクラトキシンとＫＬＨとの複合体を免疫原として使用した。同様にオクラトキシンとＢＳＡとの複合体を作製した。オクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体は、間接競合ＥＬＩＳＡ用の固相化抗原として使用した。
【実施例２】
【００６５】
（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例１で調製した免疫原を２ｍｇ／mLとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／mLの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価が十分に上がっていることを間接ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００６６】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるオクラトキシンの検出
（１）実施例１で得られたオクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体を、ＰＢＳを用いて１μｇ／mLに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよびＰＢＳを３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
【００６７】
（２）メタノールに溶解したオクラトキシンＡおよびＢを、それぞれ０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンの濃度が０．０、０．０６、０．３２、１．６０、８．００、４０．００、２００．００、１０００．００ｎｇ／mL、メタノール濃度が１％になるように調製した。一方、得られた抗血清は、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗血清希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンハプテンとＢＳＡとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置しオクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００６８】
（３）ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）と抗マウスIgG ヤギ抗体の複合体（ＰIＥＲＣＥ社）を、０．２％ＢＳＡおよびＰＢＳで８０００倍に希釈して２次抗体希釈液とした。
【００６９】
（４） （２）で反応させたウェルを、ＰＢＳで３回洗浄したあと、上記の２次抗体希釈液を１００μL／ウェル分注して、２５℃ １時間静置して反応させた。
【００７０】
（５）上記の（４）で反応させた後のウェルを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（１００μg／mLの３,３’,５,５’-テトラメチルベンチジンおよび０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｎ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５））１００μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μLをウェルに加えて発色反応を止め、４５０nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで検出した。この実施例におけるオクラトキシンＡについての結果を図１に示す。
【００７１】
モノクローナル抗体の確認
マウスの血中の抗体価が十分に高くなったマウスを用いて、最終免疫（２０μｇ／マウス）した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
【００７２】
摘出した脾臓を無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために５分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清ＤＭＥＭを添加して細胞を浮遊させた。この操作を２回繰り返した。
【００７３】
あらかじめ培養してあったミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を回収し、遠沈、上清除去、無血清ＤＭＥＭ培地で再浮遊を２回繰り返した。
【００７４】
それぞれの細胞数を計数して脾臓細胞とミエローマ細胞との比率が１０：１〜７．５：１になるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心して，上清を吸引除去した。
【００７５】
遠沈管を激しく攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液２mLを約６０秒かけて添加した。次いで約１０mLの無血清ＤＭＥＭを攪拌しながら３〜４分かけて添加した。
【００７６】
遠沈管を１０００ｒｐｍ，５分で遠心して上清を完全に吸引除去し、脾臓細胞が２．５×１０６個／mLになるようにＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）に浮遊させ、９６穴培養プレートに１００μＬ／ウェル分注し、３７℃、８％炭酸ガス、加湿条件下で培養を開始した。
【００７７】
翌日に約４０μＬ／ウェルのＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）を添加し、ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマ細胞のコロニーが形成されるまで観察を続け、以後は細胞の状態を見ながらＨＴ培地を添加した。
【００７８】
培養開始から１０日後に培養液を採取し、間接競合阻害法でオクラトキシンＡおよびＢに対する抗体を産生しているウェルをスクリーニングし、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェルと順次培養スケールを上げた。
【００７９】
２４ウェルの段階で限界希釈法によるクローニングを行ない、オクラトキシンＡおよびＢに対するＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。得られたハイブリドーマについては、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４およびＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５の下に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託した。
【００８０】
ここで、ハイブリドーマのスクリーニングは、オクラトキシンＡおよびＢとの反応性が1００ｐｐｂを下回りかつほぼ等価であることを指標に行った。また、濃度を変えたアセトニトリル、エタノールおよびメタノール存在下でのオクラトキシンＡとの反応性が、可能な限り高いものを選択することを指標にスクリーニングを行うことで、ＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂ抗体産生細胞以外にも複数の同様な反応特性を示す抗体産生細胞を選択することができた。
【実施例３】
【００８１】
（モノクローナル抗体の作製）
実施例２で得られたＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂ抗体産生ハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧ カラムによりＩｇＧ精製を行った。得られたモノクローナル抗体はサブクラスがＯＣＡ−１０ＡがＩｇＧ１、ＯＣＢ-1ＢがＩｇＧ２ａであり、軽鎖はいずれもκ鎖である。
【実施例４】
【００８２】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による精製抗体の阻害試験
（１）実施例１で得られたオクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体を、ＰＢＳで１μｇ／mLに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよびＰＢＳを３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
【００８３】
（２）メタノールに溶解したオクラトキシンＡまたはＢを、それぞれ０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンの濃度が０．０、０．０６、０．３２、１．６０、８．００、４０．００、２００．００、１０００．００ｎｇ／mL、メタノール濃度が１％になるよう調製した。一方、得られた精製抗体は、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗体希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置し、オクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００８４】
以降は実施例２と同様の操作を行った。
【００８５】
モノクローナル抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂ溶液についての間接競合阻害法によるオクラトキシンＡまたはＢのそれぞれの標準阻害曲線を図２に示す。モノクローナル抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂ溶液を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、ＯＣＡ−１０ＡのオクラトキシンＡに対するＩＣ５０値が２４ng/ml、オクラトキシンＢに対するＩＣ５０値が１７ng/ml、ＯＣＡ−１ＢのオクラトキシンAに対するＩＣ５０値が２８ng/ml、オクラトキシンＢに対するＩＣ５０値が１３ng/ml、であることから、反応性の違いがＩＣ50値の比として３倍以内にあり、同等の検出感度を表すことがわかった。
【００８６】
これらの値は、本発明の抗体が、オクラトキシンＡおよびＢのいずれに対しても優れた結合能を有することを示している。
【００８７】
以上の結果から、本発明のオクラトキシンＡを用いて得られるモノクローナル抗体を使用する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、オクラトキシンＡおよびＢ双方のタイプのオクラトキシンの総量分析および各オクラトキシン類縁体の分析が高感度で可能となることがわかる。
【実施例５】
【００８８】
間接競合ＥＬＩＳＡによる精製抗体の溶媒耐性試験
オクラトキシンＡ、Ｂを、それぞれ一定濃度のメタノールを含む０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンＡ、Ｂの濃度が、０．１、０．６、３．２、１６、８０、４００、２０００ｎｇ／mL、メタノール濃度が、２、２０、４０、６０、８０％になるよう調製した。一方、得られた精製抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂは、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗体希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置しオクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００８９】
また、ＯＣＡ−１０Ａについては、メタノールに代えてアセトニトリルとエタノールについて各々同様に、溶媒耐性試験を行った。これらの結果をそれぞれ、図３、図４、図５、に示す。さらに、ＯＣＡ−１Ｂについても、同様の実験を行った結果を図６に示す。
【００９０】
オクラトキシン抗体ＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂは、６０％メタノール中でも、阻害曲線が乱れず、メタノールに対し高い耐性を有していた。また、オクラトキシン抗体ＯＣＡ−１０Ａは、同様にアセトニトリル、エタノールに対しても高い耐性を有していた。食物中に存在しているオクラトキシンを抽出する際、メタノール、アセトニトリル、エタノールは一般的に使用される非常に優れた溶媒であり、メタノールに対し高い耐性を有することはオクラトキシン検出用の抗体としてＯＣＡ−１０Ａは極めて有用であることを示している。
【実施例６】
【００９１】
ゲルの調製
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）６０ｇを、１ｍＭ 冷塩酸１２Lで洗浄した。このゲルを２００mL量り取り、ここに、実施例３で得られた抗体（０．５ｍｇ／mL、ＰＢＳにて希釈した抗体溶液） ４００mLを入れ、３０分毎に撹拌しながら室温で２時間反応させた。このゲルを、モノエタノールアミン緩衝溶液１Ｌに加え、３０分毎に撹拌しながら室温で２時間経過後、モノエタノールアミン緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、の順に４００mLで３回ずつ洗浄した。これに、ＰＢＳ ４００mL、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液４００mL、ＰＢＳ ４００mLで洗浄した。
【実施例７】
【００９２】
オクラトキシン用アフィニティーカラムの調製
実施例６で調製したゲル０．２mLを市販のエンプティーカラム（直径３ｍｍ）につめ、ＰＢＳ緩衝液３mLで２回ずつ洗浄した。
【実施例８】
【００９３】
オクラトキシン用アフィニティーカラムによる添加回収実験
オクラトキシン検出用の抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＡおよびＢについて、各々２００ｎｇを含む４％メタノール溶液１０mLを添加した。次にこのカラムをさらにＰＢＳ ３mLにて２回、１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液３mLにて２回ずつ洗浄し、メタノール＋酢酸（９８＋２）溶液１mLにて３回溶出した。
【００９４】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０＋７０＋１）１０ｍＬを加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡおよびＢの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通りである。すなわち、カラムは、ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍ）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速１．０mL／分、カラム温度４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）、注入量：１００μＬ。
【００９５】
回収率（％）は、表１に示すとおりである。
【表１】
ここで、ＨＯＲ−ＯＣＡは、抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、およびＨＯＲ−ＯＣＢは、抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。表１から、オクラトキシンＡおよびＢについて、２００ｎｇずつ、ほぼ確実に回収できていることがわかった。
【実施例９】
【００９６】
オクラトキシン用アフィニティーカラムのメタノール耐性
実施例７において調製した、本発明のモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムと市販されているオクラトキシン用アフィニティーカラムを用いて、メタノール耐性について比較実験を行った。実施例７で調製したこのカラム、および市販カラムＡ、Ｂに、オクラトキシンＡおよびＢのそれぞれのタイプについて５ｎｇを含むメタノール溶液（メタノール濃度２０、４０、６０、８０％）１０mLを添加した。次にこのカラムをさらにＰＢＳ ３mLにて２回、１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液３mLにて２回ずつ洗浄し、メタノール＋酢酸（９８＋２）溶液１mLにて３回溶出した。
【００９７】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０＋７０＋１）に加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡおよびＢの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。すなわち、カラムは、ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍ）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速１．０mL／分、カラム温度４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）、注入量：１００μＬ。表２および図７に回収率（％）を示す。
【表２】
【００９８】
ここで、ＨＯＲ−ＯＣＡおよびＨＯＲ−ＯＣＢは、前述と同じであり、市販品１−ＯＣＡは、市販品カラム１に、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、および市販品１−ＯＣＢは、市販品カラム１に、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。市販品２−ＯＣＡは、市販品カラム２に、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、および市販品２−ＯＣＢは、市販品カラム２に、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。
【００９９】
本発明のカラムは、市販のカラムよりメタノール耐性が高く、メタノール濃度が６０％でも使用することができる。
【実施例１０】
【０１００】
実施例７で調整したカラムと市販されているオクラトキシン用アフィニティーカラムを用いて洗浄方法について比較実験を行った。実施例７で調整したカラム、および市販カラムに、オクラトキシンＡ、Ｂ各５ｎｇを含む４％メタノール溶液１０ｍＬを添加した。次に、このカラムをさらにＰＢＳで２回洗浄後、一方は１０ｍｍｏｌ/Ｌ 酢酸アンモニウム溶液 ３ ｍＬ、一方は精製水 ３ｍＬにて２回洗浄し、メタノール+酢酸（９８+２）溶液１ｍＬにて３回溶出した。
【０１０１】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０+７０+１）を加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡ、Ｂの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通りである。すなわち、カラムはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μm）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速 １．０ ｍＬ/ｍｉｎ.、カラム温度 ４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長 ４６０ ｎｍ）、注入量：１００μL。
回収率（％）は、表３に示すとおりである。
【表３】
【表４】
【０１０２】
ここで、ＯＣＡおよびＯＣＢは、各々、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢを指す。
【０１０３】
精製水による洗浄では、市販品ｂおよびｃでは極端に回収率が減少することがわかった。一方、本発明の特にＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムでは回収率はほとんど変わらず、良好であった。このように水洗が可能であることから、使用可能な洗浄溶媒を広げることができ、カラムを用いた濃縮・精製する際の操作性が向上する。
【０１０４】
以上より、本発明で得られたモノクローナル抗体ならびにその抗体を用いたオクラトキシン類を濃縮・精製することができるアフィニティーカラムを用いることで、高感度のオクラトキシン類の定量が可能になるばかりでなく、オクラトキシン類縁体の総量の定量も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】オクラトキシンＡ−ＫＬＨ免疫マウス抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図２】抗体[ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡおよびＢに対する阻害曲線を示す。
【図３】メタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図４】アセトニトリル存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図５】エタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図６】メタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１Ｂ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図７】抗体[ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂ]を用いて調製したゲルを用いたアフィニティークロマトカラム（自社）と市販アフィニティークロマトカラムとの、オクラトキシンＡおよびＢを含むメタノール溶液を添加したときの回収率の比較を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オクラトキシンに対する新規な性質を有するモノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。さらに本発明は、このようなモノクローナル抗体またはそのフラグメントを用いた、オクラトキシンの捕捉用親和性カラム、およびオクラトキシンの免疫学的検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
天然毒オクラトキシンは、AspergillusとPenicilliumに属する多くの種類の菌が産生する二次代謝産物である。このうち、主な産生菌は、A. ochraceus とP. viridicatumである。これらの菌は、米、麦、トウモロコシ、小豆、大豆、グリーンコーヒー、煮干などに広く見出されている。
【０００３】
オクラトキシンには、オクラトキシンA、B、およびCの三つが知られている。毒性は、オクラトキシンAが一番強く、その障害は主として肝臓と腎臓に現れる。
【０００４】
わが国では、まだ、オクラトキシンに対する規制値はないが、欧米諸国や国際機関等では、オクラトキシンについてもリスクアセスメントが活発に行われている（非特許文献１）。例えば、ヨーロッパでは、ベビーフード、加工果物、加工穀類、ワイン、ジュース等で一定の規制値がある（非特許文献２）。オクラトキシンの毒性に鑑みて、日本に規制値がなくとも、その検出を行うことは、食の安全性確保の面から必要であると考えられる。そして、検査においては、多数のサンプルを迅速に処理し、かつ微量のオクラトキシンを検出する必要がある。
【０００５】
オクラトキシンの検出においては、サンプルを粉砕後有機溶媒で抽出し、その抽出液を、濃縮精製した上で、ＨＰＬＣなどで分析する手法がある。また、その濃縮精製方法としては、多機能カラムおよび抗体親和性カラムがある。これらの他にも、簡便法として免疫学的検出法が使用される。
【０００６】
オクラトキシンＡに特異的な抗体は、開発され公表されており、オクラトキシンＡに特異的に結合する抗体、ＡにもＢにも交差反応性を示す抗体などがある（特許文献１）。
【特許文献１】特開昭６１−１７１５００号公報
【非特許文献１】Takatoriら、Bull. Natl. Inst. Health Sci., 124, 21-29 (2006)
【非特許文献２】Akiyama, Hら、J. Food Hyg. Soc. Japan, 38, 406-411(1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これまで得られているモノクローナル抗体は、有機溶媒に弱く、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーに利用する際や免疫学的測定法に利用する際には、抽出したサンプルを充分に水で希釈しなければならず、試料中に含まれるオクラトキシンの量およびオクラトキシン類縁体の含有比によっては正確に定量できなかった。また、オクラトキシンの濃縮精製に使用するにも困難があった。また、オクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を使うと回収率が低下する欠点があった。そのため、これらの一連の解決法が要望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、オクラトキシンＡおよびＢのいずれをも同等に検出でき、極微量のオクラトキシンをも正確に検出するような検出方法を提供すべく鋭意研究を行った結果、オクラトキシンの上記２つのタイプに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持ち、親和性カラムの親和性マトリックスに用いる際にオクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を用いることが可能であるモノクローナル抗体またはそのフラグメント、それを用いた検出方法等を見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、オクラトキシンＡに由来するハプテンと高分子化合物との結合体である抗原を用いて得られるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢに対して同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を有する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントに関する。
【００１０】
上記モノクローナル抗体は、ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂであり得る。
【００１１】
本発明はまた、上記いずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドーマに関する。
【００１２】
上記ハイブリドーマは、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４または受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５で寄託されているハイブリドーマであり得る。
【００１３】
本発明はまた、上記のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いる、オクラトキシンの免疫学的検出用キットに関する。
【００１４】
本発明はまた、担体およびそれに固定化した上記モノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含む親和性マトリックスを含む、親和性カラムに関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントは、オクラトキシンＡおよびＢに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持ち、親和性カラムの親和性マトリックスとして用いる際にオクラトキシン吸着後のカラム洗浄に水を用いることが可能である。その為、このモノクローナル抗体またはそのフラグメントを利用したオクラトキシンの検出方法においては、オクラトキシンの個別の量またはＡおよびＢを同時に、かつ微量でも正確に検出することが可能となる。また、このモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む親和性カラムを用いることにより各種試料中のオクラトキシンの精製・濃縮を効率良く行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する
本明細書において対象となる「オクラトキシン」とは、オクラトキシンＡ、Ｂ、およびＣのいずれか１種を表すかまたは２以上のすべてを総称するが、本発明における「オクラトキシンに対するモノクローナル抗体」は、主にオクラトキシンＡおよびＢのいずれをも同等に認識するモノクローナル抗体を指す。
【００１７】
オクラトキシンは、以下の式
【化１】
で表される化合物である。
【００１８】
本明細書において用いられる、「同等の結合能を有する」または「同等に反応する」とは、ＡおよびＢに対する反応性の違いが、ＡおよびＢに対するＩＣ50値（ng/mL）の比として３倍以内であることを指す。
【００１９】
本明細書において用いられる、「有機溶媒耐性」とは、被検試料を有機溶媒に溶解して親和性マトリックスと接触させる時点において、公知の各種有機溶媒に存在させても抗体またはそのフラグメントが変性を起さないことをいうが、特に、６０％メタノールあるいは５０％アセトニトリル又はエタノール中に常温で少なくとも１５分間存在させても、オクラトキシンＡおよびＢに対する反応性が変化しないことを指す。
【００２０】
本発明に用いられるオクラトキシンＡまたはその誘導体に由来する抗原は、オクラトキシンＡ自体、オクラトキシンＡから公知の様々な方法を用いて誘導される化合物と、高分子化合物との複合体が好都合に使用され得る。
【００２１】
ここで、オクラトキシンＡ誘導体は、オクラトキシンＡに、特に高分子化合物との結合を容易にする為の公知の様々な反応基を導入した化合物を指す。
【００２２】
本発明においては、オクラトキシンＡをそのまま高分子化合物との結合に用いることができ、例えばそのカルボキシル基を、高分子化合物と結合させ、抗原とすることも好ましい。
【００２３】
次に、オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体の作製は、限定はされないが、例えば以下のような方法を用いて、製造することができ、免疫用抗原として使用する。
【００２４】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）などがある。
【００２５】
オクラトキシンＡと高分子化合物との結合は、例えば、オクラトキシンＡ中のカルボキシル基と高分子化合物とを活性化エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋａｒｕ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，42， 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，234， 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって結合させることにより達成することができる。
【００２６】
さらに、上記と同様の方法により酵素等の標識物質をオクラトキシンＡに結合させたものを、免疫学的検出方法において使用することができる。標識物質としては、酵素の他に、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。
【００２７】
本発明では、オクラトキシンＡと高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、オクラトキシンに対するモノクローナル抗体を得ることができる。
【００２８】
モノクローナル抗体自体の製造は、通常の方法に従って調製できる。（例えば、Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、前記複合体を常法に従ってウサギ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。
【００２９】
このようにして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを一定の条件下にて培養し、抗体価を測定しながら、所望の性質を有する抗体をスクリーニングする。
【００３０】
モノクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法等に従って行われる。すなわち、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥなど）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などが含まれ、単独であるいは適宜組み合わせて行い得る。
【００３１】
また、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特に限定されないが、下記のような常法に従って調製されうる。
【００３２】
抗原をアジュバントと等量混合した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、定期的に追加免疫する。採取血液の血清中の抗体力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾臓細胞を完全に培地中に浮遊させる。細胞を洗浄後、マウスのミエローマ細胞と混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）などを用いて細胞融合を行う。細胞融合後、ＨＡＴ培地中などで懸濁し、適度な条件下にて培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、オクラトキシンに対する抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。
【００３３】
本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに精製・濃縮することができる。
【００３４】
本発明の用語で、抗体の「フラグメント」とは、抗原を認識する部位を含む抗体の断片を指す。具体的には、可変領域を含むＦａｂフラグメントＦ（ａｂ）２フラグメント等である。
【００３５】
また、本発明においては、オクラトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いて、オクラトキシンを簡便に検出することができ、オクラトキシンの検出方法に好適に使用することができる。さらに、オクラトキシンに特異的に結合するモノクローナル抗体を、検出法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたオクラトキシンのハプテン化合物、緩衝液、検出試薬および／またはオクラトキシンの標準溶液等を含むキットに含めることもできる。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法や金コロイドを用いた検出法に用いられうるものであり、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、固相化されたオクラトキシンに対する抗体、抗体を保持する担体、酵素標識された抗原および検出試薬などを含む。
【００３６】
さらに、本発明は、前記抗体または検出手段を用いることを特徴とするオクラトキシンの検出用方法およびそのような方法に用いる検出用キットに関する。検出方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光もしくは発光検出法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol. II IRL Press Oxford (1989))が挙げられる。標識の手段としては、酵素、金コロイド、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。これらのうち、特に感度や簡便性等の点から、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素を用いるＥＬＩＳＡ、あるいは金コロイドを用いたイムノクロマトが好ましい。
【００３７】
代表的なＥＬＩＳＡによる検出法は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡまたは直接競合阻害ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。例えば以下に述べるような本発明のモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡによってオクラトキシンの検出を行うことができる。
【００３８】
（１）本発明のモノクローナル抗体を、担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／mLから１００μｇ／mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００３９】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００４０】
（３）各種濃度のオクラトキシンを含む試料に、オクラトキシンのハプテン化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。酵素結合ハプテンの調製は、オクラトキシンのハプテン化合物を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。
【００４１】
（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる。オクラトキシンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。オクラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、オクラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリル、エタノールなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を検出することにより、予め作成した検量線から試料中のオクラトキシンの量を決定する。
【００４２】
（５）担体に結合した標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を検出することによって検量線からオクラトキシンの量を算出することができる。標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を検出する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を検出する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に検出することが望ましい。
【００４３】
標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を検出する方法があげられる。
【００４４】
オクラトキシンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、オクラトキシンを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のオクラトキシンを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のオクラトキシンの濃度を算出することができる。
【００４５】
別の態様としてオクラトキシンの検出は以下のような手順により間接競合阻害ＥＬＩＳＡによって行うことができる。
（１）抗原を担体に固相化する。
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０.０１μｇ／mLから１００μｇ／mL程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。
【００４６】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。
【００４７】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面にオクラトキシンを含む試料および本発明のモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびオクラトキシンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびオクラトキシンに対する抗体複合体を生成させる。反応は、通常室温、１時間程度で行うことができる。オクラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することが必要である。前記有機溶媒としては、オクラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリル、エタノールなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶媒が使用できる。
【００４８】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（例えば、マウス抗体を認識する抗体）を添加して検出することができる。例えばオクラトキシンに対する抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したオクラトキシンに対する抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。
【００４９】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、二次抗体に結合させた酵素に反応する発色基質溶液を前述の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を検出することによりあらかじめ作成した検量線からオクラトキシンの量を算出することができる。
【００５０】
前記本発明の検出方法においては、検出対象物に応じた前処理をして試料とした後、直接競合阻害ＥＬＩＳＡの工程または間接競合阻害ＥＬＩＳＡに供することができる。ほとんどの食品の場合、オクラトキシンが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノール、エタノールあるいはアセトニトリルに転溶させて緩衝液で希釈後、検出試料にする。簡便法として、メタノール、エタノールであるいはアセトニトリルで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。
【００５１】
本発明の検出用キットは、このような検出方法を好適に行い得るように、本発明のモノクローナル抗体あるいはそのフラグメントの他、所望により、標識酵素、二次抗体、緩衝液、指示書等を含む。
【００５２】
本発明の免疫検出法および免疫検出用キットとして、イムノクロマトグラフ法およびそれを利用することを目的にしたキットやデバイスを構築することもできる。イムノクロマトグラフ法として、例えば、競合阻害法を利用する方法であれば、本発明のモノクローナル抗体あるいはその断片を特定の領域に固定した不溶性薄膜状支持体（ナイロン膜又はセルロ−ス膜など）中に、オクラトキシンと特異的に結合する標識第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、不溶性薄膜状支持体の抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などの信号を検出し、分析対象物を測定することができる。なお、前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。
【００５３】
本発明のイムノクロマトグラフィー用の免疫検出用キットまたはデバイスとしては、従って、例えばＥＬＩＳＡあるいはその他の標識を用いた態様を実現できるものであれば、いかなるものも含まれる。特に限定はされないが、例えば、分析対象物を滴下するサンプルパッド、標識した抗体を含むコンジュゲートパッド、本発明のモノクローナル抗体またはその断片を固定化したテストライン、および標識抗体に特異的な抗体を固定化したコントロールラインを膜上に有するデバイスが好適である。膜は、不溶性薄膜状支持体であり、ガラス繊維、ナイロン膜又はセルロ−ス膜などからなるが、限定はされず、抗体の保持および毛細管現象による検体の移動を可能にする材料であればいずれのものでも使用できる。前記標識としては、例えば、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子、金属コロイド、又は炭素粒子を使用することができる。キット又はデバイスは、さらに任意に、膜を支持するベースカード、余分な検体を吸収する吸収パッドを設けるのも好ましい。
【００５４】
このようなキットあるいはデバイスを用いることにより、分析対象物中に含まれるオクラトキシンを簡便に迅速に測定することが可能となる。
【００５５】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを担持した親和性カラムを用いてオクラトキシンの検出を行うこともできる。
【００５６】
本発明においては、オクラトキシンＡおよびＢの双方に結合し、かつ耐有機溶媒性を有する抗体を含むことにより、被検試料中に含まれるオクラトキシンの個別の量および総量を、固相吸着剤を用いて検出、濃縮および／または精製することができる。このような方法は、特に限定されないが、例えば以下に説明するような方法が用いられ得る。
【００５７】
精製された本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の方法によって親和性マトリックス材料をつくることができる。抗体としては、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントも使用することができるが、特にモノクローナル抗体を好適に用いることができる。この場合、十分量のモノクローナル抗体を、ＮａＨＣＯ3 とＮａＣｌとを含む結合緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、この抗体溶液を、例えば予めＨＣｌ中で一夜インキュベートした、臭化シアンによって活性化されたセファロース−４Ｂ（ＧＥ社）に加える。セファロースと抗体溶液とを反応させた後、この固相吸着材料を、例えば１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で適度な時間インキュベートすることによって、抗体が結合されたゲルの未結合部位をブロックする。固相吸着材料上に固定化されたモノクローナル抗体によって親和性マトリックスが形成され、これをオクラトキシンの検出用に用いることができる。
【００５８】
好ましい固相吸着材料は活性化されたセファロース４Ｂゲルであるが、これに限定されない。他の様々な材料を固相材料として用いることができる。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げることができる。同様に、モノクローナル抗体をそれぞれの化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知であり、種々記載されている。
【００５９】
本発明における液体試料中のオクラトキシンを検出、単離、濃縮および／または精製する方法には、次の工程を含む親和性クロマトグラフィー法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のオクラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。この際、被検試料を溶解した溶剤としてはアセトニトリル、メタノール、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。アセトニトリルまたはエタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。次に、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントからオクラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。この溶離剤は、アセトニトリル、エタノール、またはメタノールなどであるが、これらに限定されない。次に、このような親和性マトリックスからの回収された流出物中にオクラトキシンが存在するかどうか、どのタイプがどれだけ含まれるかを、例えばＨＰＬＣなどを用いて同定することができる。
【００６０】
本発明における液体試料中のオクラトキシンを濃縮・精製する方法には、本発明のモノクローナル抗体あるいはそのフラグメントを固定化した親和性マトリックス材料を用いた以下の方法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のオクラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。次に、夾雑物を洗浄除去する。そして、本発明のモノクローナル抗体またはそのフラグメントからオクラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。このようにして、液体試料中のオクラトキシンを、免疫学的に夾雑物の少ない状態で、元の試料中の濃度の数千から数万倍もの高倍率に濃縮できる。これにより、試料中に極微量しか存在しないオクラトキシンでも、抗体を利用しない他の濃縮方法と比較して、はるかに高倍率に濃縮することができ、しかも定量を妨害する夾雑物等の含量の少ない濃縮液を得ることができる。被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤は、アセトニトリル、エタノールまたはメタノールなどであるが、これらに限定されない。アセトニトリルまたはエタノールの場合は、１％（ｖ／ｖ）以上５０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上６０％（v/v）以下の濃度のものが使用できる。
【００６１】
本発明のオクラトキシンに対するモノクローナル抗体の重要な特徴は、オクラトキシンＡ抗原に対するだけでなく、Ｂに対しても同等の高い結合能（親和性）を有することである。さらに、通常の既存の抗オクラトキシンＡモノクローナル抗体と比較して優れた有機溶媒耐性を有する。従って、被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤には、比較的高い濃度の有機溶媒を用いることができる。
【００６２】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００６３】
（免疫原の調製）
免疫原としてスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）とオクラトキシンＡとの複合体を、活性エステル法を用いて作製した。
【００６４】
オクラトキシンＡ７．１ｍｇ、N-ヒドロキシスクシンイミド４．１ｍｇ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩６．８ｍｇをジメチルスルホキシド７．１mLに溶解し、この溶液を室温、暗所で１．５時間撹拌し、オクラトキシンＡ溶液とした。別途、０．１Mホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１mLにＫＬＨ １０ｍｇを加え、これにオクラトキシンＡ溶液１７９μｌを徐々に滴下し、室温、暗所で１．５時間撹拌した。反応終了後、４℃で２日間、生理的リン酸緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ リン酸緩衝液、以下「ＰＢＳ」と記す。）に対して透析した後、−４０℃で貯蔵した。このようにして得られたオクラトキシンとＫＬＨとの複合体を免疫原として使用した。同様にオクラトキシンとＢＳＡとの複合体を作製した。オクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体は、間接競合ＥＬＩＳＡ用の固相化抗原として使用した。
【実施例２】
【００６５】
（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例１で調製した免疫原を２ｍｇ／mLとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／mLの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価が十分に上がっていることを間接ＥＬＩＳＡにて確認した。
【００６６】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるオクラトキシンの検出
（１）実施例１で得られたオクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体を、ＰＢＳを用いて１μｇ／mLに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよびＰＢＳを３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
【００６７】
（２）メタノールに溶解したオクラトキシンＡおよびＢを、それぞれ０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンの濃度が０．０、０．０６、０．３２、１．６０、８．００、４０．００、２００．００、１０００．００ｎｇ／mL、メタノール濃度が１％になるように調製した。一方、得られた抗血清は、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗血清希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンハプテンとＢＳＡとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置しオクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００６８】
（３）ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）と抗マウスIgG ヤギ抗体の複合体（ＰIＥＲＣＥ社）を、０．２％ＢＳＡおよびＰＢＳで８０００倍に希釈して２次抗体希釈液とした。
【００６９】
（４） （２）で反応させたウェルを、ＰＢＳで３回洗浄したあと、上記の２次抗体希釈液を１００μL／ウェル分注して、２５℃ １時間静置して反応させた。
【００７０】
（５）上記の（４）で反応させた後のウェルを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（１００μg／mLの３,３’,５,５’-テトラメチルベンチジンおよび０．００６％過酸化水素を添加した０．１Ｎ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５））１００μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μLをウェルに加えて発色反応を止め、４５０nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで検出した。この実施例におけるオクラトキシンＡについての結果を図１に示す。
【００７１】
モノクローナル抗体の確認
マウスの血中の抗体価が十分に高くなったマウスを用いて、最終免疫（２０μｇ／マウス）した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。
【００７２】
摘出した脾臓を無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために５分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清ＤＭＥＭを添加して細胞を浮遊させた。この操作を２回繰り返した。
【００７３】
あらかじめ培養してあったミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を回収し、遠沈、上清除去、無血清ＤＭＥＭ培地で再浮遊を２回繰り返した。
【００７４】
それぞれの細胞数を計数して脾臓細胞とミエローマ細胞との比率が１０：１〜７．５：１になるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心して，上清を吸引除去した。
【００７５】
遠沈管を激しく攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液２mLを約６０秒かけて添加した。次いで約１０mLの無血清ＤＭＥＭを攪拌しながら３〜４分かけて添加した。
【００７６】
遠沈管を１０００ｒｐｍ，５分で遠心して上清を完全に吸引除去し、脾臓細胞が２．５×１０６個／mLになるようにＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）に浮遊させ、９６穴培養プレートに１００μＬ／ウェル分注し、３７℃、８％炭酸ガス、加湿条件下で培養を開始した。
【００７７】
翌日に約４０μＬ／ウェルのＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）を添加し、ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマ細胞のコロニーが形成されるまで観察を続け、以後は細胞の状態を見ながらＨＴ培地を添加した。
【００７８】
培養開始から１０日後に培養液を採取し、間接競合阻害法でオクラトキシンＡおよびＢに対する抗体を産生しているウェルをスクリーニングし、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェルと順次培養スケールを上げた。
【００７９】
２４ウェルの段階で限界希釈法によるクローニングを行ない、オクラトキシンＡおよびＢに対するＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。得られたハイブリドーマについては、受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４およびＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５の下に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託した。
【００８０】
ここで、ハイブリドーマのスクリーニングは、オクラトキシンＡおよびＢとの反応性が1００ｐｐｂを下回りかつほぼ等価であることを指標に行った。また、濃度を変えたアセトニトリル、エタノールおよびメタノール存在下でのオクラトキシンＡとの反応性が、可能な限り高いものを選択することを指標にスクリーニングを行うことで、ＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂ抗体産生細胞以外にも複数の同様な反応特性を示す抗体産生細胞を選択することができた。
【実施例３】
【００８１】
（モノクローナル抗体の作製）
実施例２で得られたＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂ抗体産生ハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧ カラムによりＩｇＧ精製を行った。得られたモノクローナル抗体はサブクラスがＯＣＡ−１０ＡがＩｇＧ１、ＯＣＢ-1ＢがＩｇＧ２ａであり、軽鎖はいずれもκ鎖である。
【実施例４】
【００８２】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法による精製抗体の阻害試験
（１）実施例１で得られたオクラトキシンＡとＢＳＡとの複合体を、ＰＢＳで１μｇ／mLに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよびＰＢＳを３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。
【００８３】
（２）メタノールに溶解したオクラトキシンＡまたはＢを、それぞれ０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンの濃度が０．０、０．０６、０．３２、１．６０、８．００、４０．００、２００．００、１０００．００ｎｇ／mL、メタノール濃度が１％になるよう調製した。一方、得られた精製抗体は、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗体希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置し、オクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００８４】
以降は実施例２と同様の操作を行った。
【００８５】
モノクローナル抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂ溶液についての間接競合阻害法によるオクラトキシンＡまたはＢのそれぞれの標準阻害曲線を図２に示す。モノクローナル抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂ溶液を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、ＯＣＡ−１０ＡのオクラトキシンＡに対するＩＣ５０値が２４ng/ml、オクラトキシンＢに対するＩＣ５０値が１７ng/ml、ＯＣＡ−１ＢのオクラトキシンAに対するＩＣ５０値が２８ng/ml、オクラトキシンＢに対するＩＣ５０値が１３ng/ml、であることから、反応性の違いがＩＣ50値の比として３倍以内にあり、同等の検出感度を表すことがわかった。
【００８６】
これらの値は、本発明の抗体が、オクラトキシンＡおよびＢのいずれに対しても優れた結合能を有することを示している。
【００８７】
以上の結果から、本発明のオクラトキシンＡを用いて得られるモノクローナル抗体を使用する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、オクラトキシンＡおよびＢ双方のタイプのオクラトキシンの総量分析および各オクラトキシン類縁体の分析が高感度で可能となることがわかる。
【実施例５】
【００８８】
間接競合ＥＬＩＳＡによる精製抗体の溶媒耐性試験
オクラトキシンＡ、Ｂを、それぞれ一定濃度のメタノールを含む０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳに加え、オクラトキシンＡ、Ｂの濃度が、０．１、０．６、３．２、１６、８０、４００、２０００ｎｇ／mL、メタノール濃度が、２、２０、４０、６０、８０％になるよう調製した。一方、得られた精製抗体ＯＣＡ−１０Ａ、ＯＣＡ−１Ｂは、０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳで５０ｎｇ／mLに希釈した。オクラトキシンの希釈溶液と抗体希釈液を、（１）で作製したオクラトキシンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、２５℃で１時間静置しオクラトキシンの競合阻害反応をさせた。
【００８９】
また、ＯＣＡ−１０Ａについては、メタノールに代えてアセトニトリルとエタノールについて各々同様に、溶媒耐性試験を行った。これらの結果をそれぞれ、図３、図４、図５、に示す。さらに、ＯＣＡ−１Ｂについても、同様の実験を行った結果を図６に示す。
【００９０】
オクラトキシン抗体ＯＣＡ−１０ＡおよびＯＣＡ−１Ｂは、６０％メタノール中でも、阻害曲線が乱れず、メタノールに対し高い耐性を有していた。また、オクラトキシン抗体ＯＣＡ−１０Ａは、同様にアセトニトリル、エタノールに対しても高い耐性を有していた。食物中に存在しているオクラトキシンを抽出する際、メタノール、アセトニトリル、エタノールは一般的に使用される非常に優れた溶媒であり、メタノールに対し高い耐性を有することはオクラトキシン検出用の抗体としてＯＣＡ−１０Ａは極めて有用であることを示している。
【実施例６】
【００９１】
ゲルの調製
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）６０ｇを、１ｍＭ 冷塩酸１２Lで洗浄した。このゲルを２００mL量り取り、ここに、実施例３で得られた抗体（０．５ｍｇ／mL、ＰＢＳにて希釈した抗体溶液） ４００mLを入れ、３０分毎に撹拌しながら室温で２時間反応させた。このゲルを、モノエタノールアミン緩衝溶液１Ｌに加え、３０分毎に撹拌しながら室温で２時間経過後、モノエタノールアミン緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、の順に４００mLで３回ずつ洗浄した。これに、ＰＢＳ ４００mL、２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液４００mL、ＰＢＳ ４００mLで洗浄した。
【実施例７】
【００９２】
オクラトキシン用アフィニティーカラムの調製
実施例６で調製したゲル０．２mLを市販のエンプティーカラム（直径３ｍｍ）につめ、ＰＢＳ緩衝液３mLで２回ずつ洗浄した。
【実施例８】
【００９３】
オクラトキシン用アフィニティーカラムによる添加回収実験
オクラトキシン検出用の抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＡおよびＢについて、各々２００ｎｇを含む４％メタノール溶液１０mLを添加した。次にこのカラムをさらにＰＢＳ ３mLにて２回、１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液３mLにて２回ずつ洗浄し、メタノール＋酢酸（９８＋２）溶液１mLにて３回溶出した。
【００９４】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０＋７０＋１）１０ｍＬを加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡおよびＢの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通りである。すなわち、カラムは、ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍ）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速１．０mL／分、カラム温度４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）、注入量：１００μＬ。
【００９５】
回収率（％）は、表１に示すとおりである。
【表１】
ここで、ＨＯＲ−ＯＣＡは、抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、およびＨＯＲ−ＯＣＢは、抗体ＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムに、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。表１から、オクラトキシンＡおよびＢについて、２００ｎｇずつ、ほぼ確実に回収できていることがわかった。
【実施例９】
【００９６】
オクラトキシン用アフィニティーカラムのメタノール耐性
実施例７において調製した、本発明のモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムと市販されているオクラトキシン用アフィニティーカラムを用いて、メタノール耐性について比較実験を行った。実施例７で調製したこのカラム、および市販カラムＡ、Ｂに、オクラトキシンＡおよびＢのそれぞれのタイプについて５ｎｇを含むメタノール溶液（メタノール濃度２０、４０、６０、８０％）１０mLを添加した。次にこのカラムをさらにＰＢＳ ３mLにて２回、１０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液３mLにて２回ずつ洗浄し、メタノール＋酢酸（９８＋２）溶液１mLにて３回溶出した。
【００９７】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０＋７０＋１）に加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡおよびＢの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。すなわち、カラムは、ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍ）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速１．０mL／分、カラム温度４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）、注入量：１００μＬ。表２および図７に回収率（％）を示す。
【表２】
【００９８】
ここで、ＨＯＲ−ＯＣＡおよびＨＯＲ−ＯＣＢは、前述と同じであり、市販品１−ＯＣＡは、市販品カラム１に、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、および市販品１−ＯＣＢは、市販品カラム１に、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。市販品２−ＯＣＡは、市販品カラム２に、オクラトキシンＡを添加して回収率を調べた場合、および市販品２−ＯＣＢは、市販品カラム２に、オクラトキシンＢを添加して回収率を調べた場合を指す。
【００９９】
本発明のカラムは、市販のカラムよりメタノール耐性が高く、メタノール濃度が６０％でも使用することができる。
【実施例１０】
【０１００】
実施例７で調整したカラムと市販されているオクラトキシン用アフィニティーカラムを用いて洗浄方法について比較実験を行った。実施例７で調整したカラム、および市販カラムに、オクラトキシンＡ、Ｂ各５ｎｇを含む４％メタノール溶液１０ｍＬを添加した。次に、このカラムをさらにＰＢＳで２回洗浄後、一方は１０ｍｍｏｌ/Ｌ 酢酸アンモニウム溶液 ３ ｍＬ、一方は精製水 ３ｍＬにて２回洗浄し、メタノール+酢酸（９８+２）溶液１ｍＬにて３回溶出した。
【０１０１】
次に、得られた溶出液を蒸発乾固し、ここにアセトニトリル＋精製水＋酢酸（３０+７０+１）を加え、溶解後、ＨＰＬＣで分析し、オクラトキシンＡ、Ｂの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの測定条件は、以下の通りである。すなわち、カラムはＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、粒径５μm）、移動相：アセトニトリル−水−酢酸（５５：４３：２）、流速 １．０ ｍＬ/ｍｉｎ.、カラム温度 ４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長 ３３３ｎｍ、蛍光波長 ４６０ ｎｍ）、注入量：１００μL。
回収率（％）は、表３に示すとおりである。
【表３】
【表４】
【０１０２】
ここで、ＯＣＡおよびＯＣＢは、各々、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢを指す。
【０１０３】
精製水による洗浄では、市販品ｂおよびｃでは極端に回収率が減少することがわかった。一方、本発明の特にＯＣＡ−１０Ａを用いたカラムでは回収率はほとんど変わらず、良好であった。このように水洗が可能であることから、使用可能な洗浄溶媒を広げることができ、カラムを用いた濃縮・精製する際の操作性が向上する。
【０１０４】
以上より、本発明で得られたモノクローナル抗体ならびにその抗体を用いたオクラトキシン類を濃縮・精製することができるアフィニティーカラムを用いることで、高感度のオクラトキシン類の定量が可能になるばかりでなく、オクラトキシン類縁体の総量の定量も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】オクラトキシンＡ−ＫＬＨ免疫マウス抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図２】抗体[ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡおよびＢに対する阻害曲線を示す。
【図３】メタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図４】アセトニトリル存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図５】エタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１０Ａ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図６】メタノール存在下での抗体[ＯＣＡ−１Ｂ]を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるオクラトキシンＡに対する阻害曲線を示す。
【図７】抗体[ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂ]を用いて調製したゲルを用いたアフィニティークロマトカラム（自社）と市販アフィニティークロマトカラムとの、オクラトキシンＡおよびＢを含むメタノール溶液を添加したときの回収率の比較を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクラトキシンＡに由来するハプテンと高分子化合物との結合体である抗原を用いて得られるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢに対して同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を有する、モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂである、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４または受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５で寄託されている、請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いる、オクラトキシンの免疫学的検出用キット。
【請求項６】
担体およびそれに固定化した請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含む親和性マトリックスを含む、親和性カラム。
【請求項１】
オクラトキシンＡに由来するハプテンと高分子化合物との結合体である抗原を用いて得られるモノクローナル抗体またはそのフラグメントであって、オクラトキシンＡおよびオクラトキシンＢに対して同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を有する、モノクローナル抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、ＯＣＡ−１０ＡまたはＯＣＡ−１Ｂである、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４４または受領番号ＦＥＲＭ ＡＰ−２１６４５で寄託されている、請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを用いる、オクラトキシンの免疫学的検出用キット。
【請求項６】
担体およびそれに固定化した請求項１または２に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントとを含む親和性マトリックスを含む、親和性カラム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−４７５５５（Ｐ２０１０−４７５５５Ａ）
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２１５７４７（Ｐ２００８−２１５７４７）
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（０００１５５０２３）株式会社堀場製作所 (638)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２５日（２００８．８．２５）
【出願人】（０００１５５０２３）株式会社堀場製作所 (638)
【Ｆターム（参考）】
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