オリゴデオキシヌクレオチドおよびこれを利用する免疫修飾剤
【課題】 免疫修飾剤として強い活性を有しながら、安全性の高いオリゴデオキシヌクレオチドを開発すること。
【解決手段】 式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド、これを有効成分とする免疫修飾剤およびラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする上記式（Ｉ）で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【解決手段】 式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド、これを有効成分とする免疫修飾剤およびラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする上記式（Ｉ）で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌から得られた新規なオリゴデオキシヌクレオチドおよびこれを利用する免疫修飾剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫刺激をする病原菌由来ＤＮＡ中に、ＣｐＧモチーフと呼ばれる特異的配列が発見されて以来、ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に関する研究が盛んになった。２０００年に、Ａｋｉｒａらは、樹状細胞などの抗原提示細胞上に発現するＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）９がＣｐＧ ＯＤＮの受容体であり、種々の免疫応答に関与することを明らかにした。その後、ＣｐＧ ＯＤＮの免疫修飾剤としての応用を目指し、強い活性のあるＯＤＮの発見および開発が期待され、研究が進められている。
【０００３】
例えば、クリーグ（Krieg）らの免疫刺激オリゴヌクレオチドについての研究が報告されており（非特許文献１）、この研究については特許も出願されている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、従来から知られている免疫修飾ＤＮＡは、いずれも病原菌由来ＤＮＡ配列かもしくは化学合成ＯＤＮであり、その安全性については疑問の残るものであった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ１９９５，５４６−５４９
【特許文献１】特開２００４−２１５６７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、免疫修飾剤として強い活性を有しながら、安全性の高いＯＤＮの開発が求められており、本発明の課題は、このようなＯＤＮの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、人類の長い歴史の中で、長期間にわたり食品に利用され、ヒトに対する安全性が担保されている乳酸菌に着目し、研究を行った。そしてその結果、乳業用乳酸菌として世界で広く利用されている、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒトに対して強い免疫修飾作用を有する新規なＯＤＮ配列を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドである。
【０００９】
また本発明は、上記オリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤である。
【００１０】
更に本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択する前記オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「ＯＤＮ」という）は、リンパ球活性化、樹状細胞活性化、サイトカイン誘起等の免疫修飾作用を有するものである。そして、このＯＤＮは、長期間にわたり食品として利用された乳酸菌から導かれたものであるため、その安全性が高く、医薬品や健康食品などの食品等として有利に利用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中において免疫修飾剤とは、免疫応答の修飾作用を応用し、疾病の予防・治療に貢献する薬剤を意味する。より具体的には、ワクチン、抗アレルギー剤、抗感染症剤、抗リウマチ剤、抗癌剤などを意味する。
【００１３】
本発明のＯＤＮは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus GG）に属する微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、これを適当な手段により断片化した後、マウスやヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択し、これから、あるいはその配列に基づいてＯＤＮを合成することにより取得することができる。
【００１４】
本発明のＯＤＮを得るためのラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ ＴＭＣ０５１４株が有利に利用できる。この微生物の性質については、既に、バリー・Ｒ・ゴールディンら等により報告されており（"Digestive Diseases and Sciences" Vol.37, No.1,p121-128 および ＵＳＰ４,８３９,２８１）、微生物自体も、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ ５３１０３として寄託されている。上記菌株に限らず、他のラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物を使用しても、本発明ＯＤＮを得られることはいうまでもない。
【００１５】
前記ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、この微生物を培養後、適当な酵素、例えば、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リボヌクレアーゼ等を作用させ、次いで、適当な沈澱剤、例えば、エタノール等によりＤＮＡのみを沈澱させればよい。
【００１６】
上記のようにして抽出されたＤＮＡは、次に、適当な制限酵素を用いて切断し、適当な長さ、例えば、１００〜５００ｂ程度のＤＮＡ断片を取得する。切断に用いる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ等を利用することができ、切断されたＤＮＡ断片から目的とするものを得るためには、アガロースゲル電気泳動等の手段を用いることができる。
【００１７】
次いで、上記のようにして得られたＤＮＡ断片は、適当なベクターに組み込み、このベクターに対応した宿主細胞中で増殖させ、プラスミドＤＮＡとして分離、取得する。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１９ベクターが使用され、宿主細胞としては、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ５α等を利用することができる。
【００１８】
得られたプラスミドＤＮＡについて、例えば、リンパ球幼若化試験などの試験方法等により、マイトジェン活性を有するものを見いだし、これに組み込まれているＯＤＮ配列から、上記式（Ｉ）で表される断片が含まれているクローンを取得すればよい。
【００１９】
本発明のＯＤＮは、上記クローンから、適当な手段により切り出したものを使用することもできるし、また、上記クローンに含まれる配列を元に、例えば、ホスホアミダイド法等の方法により合成したものを使用することもできる。
【００２０】
かくして得られた本発明ＯＤＮを、免疫修飾剤として使用するには、例えば、前記式（Ｉ）のＯＤＮ、これを含むＤＮＡまたはこのＤＮＡを含む微生物を、経口または非経口で投与すればよい。このＯＤＮ（Ｉ）の投与量は、投与を受ける人や動物の状態によって異なるが、一般には、体重１ｋｇ当たり、１〜１００ｍｇ程度が好ましく、特に、３〜３０ｍｇが好ましい。また、本発明の免疫修飾剤は、通常の薬剤の製造方法に準じて製造することができ、更には、食品添加用剤とすることもできる。
【００２１】
上記した本発明の免疫修飾剤は、リンパ球および樹状細胞活性化や、サイトカイン誘起の他、ワクチンアジュバント等の作用を有するため、アレルギー、感染症、炎症性腸疾患、リウマチ、癌等の疾患の治療、予防薬として使用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、本実施例において、実験動物としては、日本エスエルシー（浜松、静岡）から購入した６ないし８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを使用し、微生物であるラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（Lactobacillus rhamnosus GG ）ＴＭＣ０５１４、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）ＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＴＭＣ３１１７は、高梨乳業（横浜）より提供を受けた。また、本試験で用いたリン酸ジエステルオリゴデオキシジヌクレオチド（ＯＤＮ）は、株式会社キアゲン（東京）により化学合成されたものであり、リムルスキット（生化学工業、東京）を用い、その使用説明書に従って、これらがエンドトキシンを含まないことを確認している。
【００２３】
実 施 例 １
ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）からＤＮＡの抽出：
ＬＧＧ ＴＭＣ０５１４を、ＭＲＳ培養液（Difco, Detroit, USA）中で、３７℃、１６時間培養し、更にルチャンスキー（Luchansky）ら（1991年）の方法により、染色体ＤＮＡを単離した。すなわち、培養したＬＧＧ細胞を、５０００ｇで１０分間遠心後、細胞を５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、１０ｍｇ／ｍＬ Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業、東京）および１００μｇ／ｍＬ ＲＮＡａｓｅ Ａを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に再懸濁した。
【００２４】
この懸濁液を、３７℃で１時間培養後、２００μＬ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、宝酒造、京都）を添加し、この混合液をさらに１６時間、３７℃で培養した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）の溶媒による抽出を繰り返してＤＮＡを精製し、酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた後、Ｍｉｌｉ Ｑ水に溶かし、ＤＮＡを得た。
【００２５】
上で得たＤＮＡ中の、エンドトキシン混入の有無の検査を、リムルスキットを用いて行ない、エンドトキシン混入のないことを確認した。更に、ＤＮＡの純度を、スマートスペック３０００スペクトロホトメーター（SmartSpec 3000 Spectrophotometer；Bio-Rad, Zarareth, Belgium）を用いて検査したところ、Ａ２６０／Ａ２８０は１.８であった。このＤＮＡは、−２０℃で保存した。
【００２６】
実 施 例 ２
リンパ球の精製および増殖の測定：
本発明者らが以前発表した方法（リンパ球幼若化活性試験：Kitazawaら、1992年）により、ネズミ脾臓からリンパ球を調製した。すなわち、ＭＡＣＳシステム（MACS、Miltenyi Biotec., Germany）を用いて脾細胞懸濁液からＢ細胞を精製した。ビオチン標識抗ＣＤ４５Ｒ ｍＡＢ（Caltag Laboratory, Burlingame, CA, USA）で脾細胞懸濁液を染色し、ストレプトアビジン（streptavidin）ミクロビーズで対比染色を行った。ＣＤ４５Ｒ＋細胞の陽性細胞をカラム（VarioMACS、Miltenyi Biotec., Germany）上で選別した。
【００２７】
フローサイトメトリー（FACSCalibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）により、Ｂ細胞の純度が９６％を超えることを確認した。この細胞懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した後、細胞（２×１０5個／ｍＬ）を９６穴のミクロプレートの各ウェルに入れ、２％ウシ胎児血清（FCS、Sigma）を添加したＲＰＭＩ １６４０完全培地（Sigma）中で、３７℃、４８時間、１００μＬの培養を３回実施した。
【００２８】
種々の濃度のＬＰＳ(E. coli 0111:B4、Sigma由来）、２μｇ／ｍＬのコカナバリン（concanavalin）Ａ （Con A、Sigma）、または種々の濃度のゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡまたはＯＤＮでこの細胞を刺激した。１６時間の最終培養で、９.２５ｋＢｑ／ｗｅｌｌの［メチル−３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences、UK）によりこの細胞を放射性同位体標識した。細胞を回収し、液体シンチレーションカウンタ（Beckman Instruments, Palo Alto, Ca, USA）により放射能を計測した。下記の式によりリンパ球の増殖インデックスを算出し、結果をＳＩとして表示した。
【００２９】
ＳＩ＝ Ａｔ−Ａｂ／Ａｃ−Ａｂ
Ａｔ：１分あたりの処理培養液中放射能
Ａｂ：１分あたりのバックグラウンド中放射能
Ａｃ：１分あたりの対照培養液中放射能
【００３０】
ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７から実施例１に準じた方法で得たＤＮＡのＳＩを比較した結果を図１に示す。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。
【００３１】
実 施 例 ３
マイトジェン活性ＤＮＡクローンのクローニングと単離：
ＬＧＧの染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造、京都）で消化し、２％アガロースゲル電気泳動法により０.５ｋｂ、０.５‐１.０ｋｂおよび１.０ｋｂ以上の３画分に分別した。クアンタム・プレップ・キット（Quantum Prep kit；Bio-Rad、Nazareth、Belgium）を用いてＤＮＡを採取し、０.５ｋｂ未満のＤＮＡをｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造、京都）のＢａｍ ＨＩ部位に結紮した。組換体プラスミドを用いてコンピテント（Competent）Ｅ.コリＤＨ５α細胞を形質転換させた。コロニーの色調およびＰＣＲプライマー、Ｍ１３プライマーＭ４：５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３'およびＭ１３プライマーＲＶ：５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３'を用いた直接的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいて、形質転換細胞のスクリーニングを実施した。Ｅ.コリの組換体として６７個の白いコロニーを得た。
【００３２】
プラスミド・ミニプレップ・キット（Plasmid miniprep kit；Bio-Rad, Nazareth, Belgium）を用い、製造業者の使用説明書に従って、形質転換コロニーからプラスミドＤＮＡを分離した。すなわち、ベクターのマルチクローニング部位のＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡテンプレートを増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、最初の変性ステップ、９５℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３５サイクルとした。増殖したＤＮＡクローンを、ＱＩＡクイック・ＰＣＲ精製キット（QIAquick PCR Purification kit；株式会社キアゲン、東京）によりＰＣＲ混液から精製し、コッテン（Cotten）ら（１９９４年）の方法に従ってＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４で処理し、夾雑するＬＰＳを除いた。
【００３３】
各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果、ＳＩが１.２〜７.０６のものとして３９クローンからのＤＮＡを得た。この結果を図２に示す。
【００３４】
実 施 例 ４
クローンの配列決定：
精製した組換体プラスミドから、セクイサーム・エクセル ＩＩ・ロング−リード・シークエンシング・キット（SequiTherm EXCEL II Long-Read Sequencing kit；Epicenter Technology, Madison, WI, USA）を用いてマイトジェン性ＤＮＡ挿入断片の配列を決定した。一次配列を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ・バージョン６・ソフトウエア・パッケージ（GENETYX-SV Version 6 software package；ソフトウェア・デベロップメント、東京）を用いて解析した。
【００３５】
上記３９クローンについて配列を調べ、このうちから活性クローンにしばしば見いだされる１１個の配列を有するものについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、その脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた。この結果を図３に示す。この結果、ＯＤＮ ＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０に活性が見いだされた。なお、ＯＤＮ ＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ １８２６のそれと同程度であった。
【００３６】
実 施 例 ５
活性ＯＤＮ配列の確認：
実施例４で活性が認められたＤＮ ＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトしたＯＤＮを合成し、そのマイトジェン活性を調べた。この結果を図４に示す。この結果から、コア配列が失われることにより、活性も大幅に減少することが明らかになった。
【００３７】
実 施 例 ６
フローサイトメトリー：
脾細胞（４×１０５個／ウェル）をゲノムＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＯＤＮ（１０μＭ）で６時間、１２時間および２４時間にわたり刺激した。刺激後、２％ＦＣＳ＋０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で細胞をよく洗浄し、ＣＤ４５Ｒ、３３Ｄ１、ＣＤ６９およびＣＤ８６（PharMingen, San Diego, Ca, USA）に対する抗体とインキュベートした後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（streptavidin-phycoerythrin；PharMingen）とともにインキュベートした。続いて細胞を、４℃の１％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＦＡＣＳキャリバーＴＭ（FACSCaliburTM；Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）を用いて分析した（細胞４００００個／試料）。この結果、ＯＤＮ ＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ １８２６のそれとほぼ同じであった。
【００３８】
実 施 例 ７
培養上清中サイトカインの測定および脾細胞における遺伝子発現：
ネズミ脾細胞懸濁液を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ １６４０完全培地（Sigma）中で最終濃度１×１０７個／ｍＬ（計２００μＬ／ウェル）で３通り培養した。５０μｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡあるいは１０μＭのリン酸ジエステルＯＤＮを培養液に添加した。培地のみで培養した細胞を非刺激対照とした。２４時間刺激後に培養上清を採取し、サイトカインの分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度（１：２あるいは１：４に希釈）を、ｅバイオサイエンス（eBioscience；San Diego, CA, USA）より購入した試薬を含むサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。この結果を図５に示す。
【００３９】
サイトカインの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法による分析のため、トライゾール・リージェント（Trizol reagent；Invitrogen, CA, USA）を用いて、６時間刺激後の脾細胞からＲＮＡを分離した。２.５μｇのＲＮＡを用いて、特異的プライマーを有する総量２０μＬの所定の各遺伝子について、別々にＲＴ−ＰＣＲ・キット（RT-PCR kit；Invitrogen, CA, USA）を用いて逆転写反応を実施した。１μｇのｃＤＮＡと５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、京都）を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのプライマーは株式会社キアゲン（東京）から入手した。アガロースゲル中の製品バンド強度を、ＦＡＳ ＩＩＩ システム（東洋紡、大阪）を用い、スキオン・イメージ・ソフトウエア（Scion Image Software；Frederick, Maryland, USA）により定量した。
【００４０】
上記方法により、細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、抗炎症ないし免疫調節サイトカインについての作用を試験した結果を図６に示す。
【００４１】
実 施 例 ８
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する作用：
末梢血単核細胞を、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いる密度勾配遠心法により分離した。２％ ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma）中にＰＢＭＣを懸濁した。この細胞を２×１０５個／ウェルの濃度で、９６穴培養プレート中、４８時間培養した。また、各ＯＤＮの濃度は、１０μとした。ネズミＢ細胞の増殖測定の項に記載した方法により、ＰＢＭＣの培養、刺激および増殖測定を実施した結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のＯＤＮは、免疫調節作用を有し、しかも、乳酸菌由来のものであるので、食品、医薬品等として安全に使用しうるものである。従って、医薬や、食品等の成分として使用しうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７からのＤＮＡのＳＩを比較した図である。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。
【図２】各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果を示す図である。
【図３】活性クローンにしばしば見いだされる配列を有するクローンのＯＤＮについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。
【図４】ＯＤＮＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトするように合成したＯＤＮのマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。
【図５】培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図６】細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、杭炎症ないし免疫調整サイトカインについて試験した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌から得られた新規なオリゴデオキシヌクレオチドおよびこれを利用する免疫修飾剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫刺激をする病原菌由来ＤＮＡ中に、ＣｐＧモチーフと呼ばれる特異的配列が発見されて以来、ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）に関する研究が盛んになった。２０００年に、Ａｋｉｒａらは、樹状細胞などの抗原提示細胞上に発現するＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）９がＣｐＧ ＯＤＮの受容体であり、種々の免疫応答に関与することを明らかにした。その後、ＣｐＧ ＯＤＮの免疫修飾剤としての応用を目指し、強い活性のあるＯＤＮの発見および開発が期待され、研究が進められている。
【０００３】
例えば、クリーグ（Krieg）らの免疫刺激オリゴヌクレオチドについての研究が報告されており（非特許文献１）、この研究については特許も出願されている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、従来から知られている免疫修飾ＤＮＡは、いずれも病原菌由来ＤＮＡ配列かもしくは化学合成ＯＤＮであり、その安全性については疑問の残るものであった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ１９９５，５４６−５４９
【特許文献１】特開２００４−２１５６７０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、免疫修飾剤として強い活性を有しながら、安全性の高いＯＤＮの開発が求められており、本発明の課題は、このようなＯＤＮの提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、人類の長い歴史の中で、長期間にわたり食品に利用され、ヒトに対する安全性が担保されている乳酸菌に着目し、研究を行った。そしてその結果、乳業用乳酸菌として世界で広く利用されている、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒトに対して強い免疫修飾作用を有する新規なＯＤＮ配列を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドである。
【０００９】
また本発明は、上記オリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤である。
【００１０】
更に本発明は、ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択する前記オリゴデオキシヌクレオチドの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「ＯＤＮ」という）は、リンパ球活性化、樹状細胞活性化、サイトカイン誘起等の免疫修飾作用を有するものである。そして、このＯＤＮは、長期間にわたり食品として利用された乳酸菌から導かれたものであるため、その安全性が高く、医薬品や健康食品などの食品等として有利に利用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書中において免疫修飾剤とは、免疫応答の修飾作用を応用し、疾病の予防・治療に貢献する薬剤を意味する。より具体的には、ワクチン、抗アレルギー剤、抗感染症剤、抗リウマチ剤、抗癌剤などを意味する。
【００１３】
本発明のＯＤＮは、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus GG）に属する微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、これを適当な手段により断片化した後、マウスやヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択し、これから、あるいはその配列に基づいてＯＤＮを合成することにより取得することができる。
【００１４】
本発明のＯＤＮを得るためのラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物としては、特に限定されるものではないが、例えば、ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ ＴＭＣ０５１４株が有利に利用できる。この微生物の性質については、既に、バリー・Ｒ・ゴールディンら等により報告されており（"Digestive Diseases and Sciences" Vol.37, No.1,p121-128 および ＵＳＰ４,８３９,２８１）、微生物自体も、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）に、ＡＴＣＣ ５３１０３として寄託されている。上記菌株に限らず、他のラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物を使用しても、本発明ＯＤＮを得られることはいうまでもない。
【００１５】
前記ラクトバチルス・ラムノーサスに属する微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、この微生物を培養後、適当な酵素、例えば、リゾチーム、Ｎ−アセチルムラミダーゼ、リボヌクレアーゼ等を作用させ、次いで、適当な沈澱剤、例えば、エタノール等によりＤＮＡのみを沈澱させればよい。
【００１６】
上記のようにして抽出されたＤＮＡは、次に、適当な制限酵素を用いて切断し、適当な長さ、例えば、１００〜５００ｂ程度のＤＮＡ断片を取得する。切断に用いる制限酵素としては、Ｓａｕ３ＡＩ等を利用することができ、切断されたＤＮＡ断片から目的とするものを得るためには、アガロースゲル電気泳動等の手段を用いることができる。
【００１７】
次いで、上記のようにして得られたＤＮＡ断片は、適当なベクターに組み込み、このベクターに対応した宿主細胞中で増殖させ、プラスミドＤＮＡとして分離、取得する。ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１１９ベクターが使用され、宿主細胞としては、Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ５α等を利用することができる。
【００１８】
得られたプラスミドＤＮＡについて、例えば、リンパ球幼若化試験などの試験方法等により、マイトジェン活性を有するものを見いだし、これに組み込まれているＯＤＮ配列から、上記式（Ｉ）で表される断片が含まれているクローンを取得すればよい。
【００１９】
本発明のＯＤＮは、上記クローンから、適当な手段により切り出したものを使用することもできるし、また、上記クローンに含まれる配列を元に、例えば、ホスホアミダイド法等の方法により合成したものを使用することもできる。
【００２０】
かくして得られた本発明ＯＤＮを、免疫修飾剤として使用するには、例えば、前記式（Ｉ）のＯＤＮ、これを含むＤＮＡまたはこのＤＮＡを含む微生物を、経口または非経口で投与すればよい。このＯＤＮ（Ｉ）の投与量は、投与を受ける人や動物の状態によって異なるが、一般には、体重１ｋｇ当たり、１〜１００ｍｇ程度が好ましく、特に、３〜３０ｍｇが好ましい。また、本発明の免疫修飾剤は、通常の薬剤の製造方法に準じて製造することができ、更には、食品添加用剤とすることもできる。
【００２１】
上記した本発明の免疫修飾剤は、リンパ球および樹状細胞活性化や、サイトカイン誘起の他、ワクチンアジュバント等の作用を有するため、アレルギー、感染症、炎症性腸疾患、リウマチ、癌等の疾患の治療、予防薬として使用することができる。
【実施例】
【００２２】
以下実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。なお、本実施例において、実験動物としては、日本エスエルシー（浜松、静岡）から購入した６ないし８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮマウスを使用し、微生物であるラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（Lactobacillus rhamnosus GG ）ＴＭＣ０５１４、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）ＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＴＭＣ３１１７は、高梨乳業（横浜）より提供を受けた。また、本試験で用いたリン酸ジエステルオリゴデオキシジヌクレオチド（ＯＤＮ）は、株式会社キアゲン（東京）により化学合成されたものであり、リムルスキット（生化学工業、東京）を用い、その使用説明書に従って、これらがエンドトキシンを含まないことを確認している。
【００２３】
実 施 例 １
ラクトバチルス・ラムノーサスＧＧ（ＬＧＧ）からＤＮＡの抽出：
ＬＧＧ ＴＭＣ０５１４を、ＭＲＳ培養液（Difco, Detroit, USA）中で、３７℃、１６時間培養し、更にルチャンスキー（Luchansky）ら（1991年）の方法により、染色体ＤＮＡを単離した。すなわち、培養したＬＧＧ細胞を、５０００ｇで１０分間遠心後、細胞を５０ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、０.５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍｇ／ｍＬ リゾチーム、１０ｍｇ／ｍＬ Ｎ−アセチルムラミダーゼＳＧ（生化学工業、東京）および１００μｇ／ｍＬ ＲＮＡａｓｅ Ａを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）に再懸濁した。
【００２４】
この懸濁液を、３７℃で１時間培養後、２００μＬ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、宝酒造、京都）を添加し、この混合液をさらに１６時間、３７℃で培養した。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｖ／ｖ）の溶媒による抽出を繰り返してＤＮＡを精製し、酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた後、Ｍｉｌｉ Ｑ水に溶かし、ＤＮＡを得た。
【００２５】
上で得たＤＮＡ中の、エンドトキシン混入の有無の検査を、リムルスキットを用いて行ない、エンドトキシン混入のないことを確認した。更に、ＤＮＡの純度を、スマートスペック３０００スペクトロホトメーター（SmartSpec 3000 Spectrophotometer；Bio-Rad, Zarareth, Belgium）を用いて検査したところ、Ａ２６０／Ａ２８０は１.８であった。このＤＮＡは、−２０℃で保存した。
【００２６】
実 施 例 ２
リンパ球の精製および増殖の測定：
本発明者らが以前発表した方法（リンパ球幼若化活性試験：Kitazawaら、1992年）により、ネズミ脾臓からリンパ球を調製した。すなわち、ＭＡＣＳシステム（MACS、Miltenyi Biotec., Germany）を用いて脾細胞懸濁液からＢ細胞を精製した。ビオチン標識抗ＣＤ４５Ｒ ｍＡＢ（Caltag Laboratory, Burlingame, CA, USA）で脾細胞懸濁液を染色し、ストレプトアビジン（streptavidin）ミクロビーズで対比染色を行った。ＣＤ４５Ｒ＋細胞の陽性細胞をカラム（VarioMACS、Miltenyi Biotec., Germany）上で選別した。
【００２７】
フローサイトメトリー（FACSCalibur, Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）により、Ｂ細胞の純度が９６％を超えることを確認した。この細胞懸濁液をＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した後、細胞（２×１０5個／ｍＬ）を９６穴のミクロプレートの各ウェルに入れ、２％ウシ胎児血清（FCS、Sigma）を添加したＲＰＭＩ １６４０完全培地（Sigma）中で、３７℃、４８時間、１００μＬの培養を３回実施した。
【００２８】
種々の濃度のＬＰＳ(E. coli 0111:B4、Sigma由来）、２μｇ／ｍＬのコカナバリン（concanavalin）Ａ （Con A、Sigma）、または種々の濃度のゲノムＤＮＡ、クローンＤＮＡまたはＯＤＮでこの細胞を刺激した。１６時間の最終培養で、９.２５ｋＢｑ／ｗｅｌｌの［メチル−３Ｈ］チミジン（Amersham Biosciences、UK）によりこの細胞を放射性同位体標識した。細胞を回収し、液体シンチレーションカウンタ（Beckman Instruments, Palo Alto, Ca, USA）により放射能を計測した。下記の式によりリンパ球の増殖インデックスを算出し、結果をＳＩとして表示した。
【００２９】
ＳＩ＝ Ａｔ−Ａｂ／Ａｃ−Ａｂ
Ａｔ：１分あたりの処理培養液中放射能
Ａｂ：１分あたりのバックグラウンド中放射能
Ａｃ：１分あたりの対照培養液中放射能
【００３０】
ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７から実施例１に準じた方法で得たＤＮＡのＳＩを比較した結果を図１に示す。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。
【００３１】
実 施 例 ３
マイトジェン活性ＤＮＡクローンのクローニングと単離：
ＬＧＧの染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（宝酒造、京都）で消化し、２％アガロースゲル電気泳動法により０.５ｋｂ、０.５‐１.０ｋｂおよび１.０ｋｂ以上の３画分に分別した。クアンタム・プレップ・キット（Quantum Prep kit；Bio-Rad、Nazareth、Belgium）を用いてＤＮＡを採取し、０.５ｋｂ未満のＤＮＡをｐＵＣ１１９ベクター（宝酒造、京都）のＢａｍ ＨＩ部位に結紮した。組換体プラスミドを用いてコンピテント（Competent）Ｅ.コリＤＨ５α細胞を形質転換させた。コロニーの色調およびＰＣＲプライマー、Ｍ１３プライマーＭ４：５'−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３'およびＭ１３プライマーＲＶ：５'−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３'を用いた直接的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいて、形質転換細胞のスクリーニングを実施した。Ｅ.コリの組換体として６７個の白いコロニーを得た。
【００３２】
プラスミド・ミニプレップ・キット（Plasmid miniprep kit；Bio-Rad, Nazareth, Belgium）を用い、製造業者の使用説明書に従って、形質転換コロニーからプラスミドＤＮＡを分離した。すなわち、ベクターのマルチクローニング部位のＭ１３プライマーＭ４およびＭ１３プライマーＲＶを用いてＰＣＲ法によりＤＮＡテンプレートを増幅した。ＰＣＲ反応の条件は、最初の変性ステップ、９５℃で５分間、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間の３５サイクルとした。増殖したＤＮＡクローンを、ＱＩＡクイック・ＰＣＲ精製キット（QIAquick PCR Purification kit；株式会社キアゲン、東京）によりＰＣＲ混液から精製し、コッテン（Cotten）ら（１９９４年）の方法に従ってＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４で処理し、夾雑するＬＰＳを除いた。
【００３３】
各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果、ＳＩが１.２〜７.０６のものとして３９クローンからのＤＮＡを得た。この結果を図２に示す。
【００３４】
実 施 例 ４
クローンの配列決定：
精製した組換体プラスミドから、セクイサーム・エクセル ＩＩ・ロング−リード・シークエンシング・キット（SequiTherm EXCEL II Long-Read Sequencing kit；Epicenter Technology, Madison, WI, USA）を用いてマイトジェン性ＤＮＡ挿入断片の配列を決定した。一次配列を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ・バージョン６・ソフトウエア・パッケージ（GENETYX-SV Version 6 software package；ソフトウェア・デベロップメント、東京）を用いて解析した。
【００３５】
上記３９クローンについて配列を調べ、このうちから活性クローンにしばしば見いだされる１１個の配列を有するものについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、その脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた。この結果を図３に示す。この結果、ＯＤＮ ＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０に活性が見いだされた。なお、ＯＤＮ ＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ １８２６のそれと同程度であった。
【００３６】
実 施 例 ５
活性ＯＤＮ配列の確認：
実施例４で活性が認められたＤＮ ＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトしたＯＤＮを合成し、そのマイトジェン活性を調べた。この結果を図４に示す。この結果から、コア配列が失われることにより、活性も大幅に減少することが明らかになった。
【００３７】
実 施 例 ６
フローサイトメトリー：
脾細胞（４×１０５個／ウェル）をゲノムＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）またはＯＤＮ（１０μＭ）で６時間、１２時間および２４時間にわたり刺激した。刺激後、２％ＦＣＳ＋０．０１％アジ化ナトリウムを含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で細胞をよく洗浄し、ＣＤ４５Ｒ、３３Ｄ１、ＣＤ６９およびＣＤ８６（PharMingen, San Diego, Ca, USA）に対する抗体とインキュベートした後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（streptavidin-phycoerythrin；PharMingen）とともにインキュベートした。続いて細胞を、４℃の１％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＦＡＣＳキャリバーＴＭ（FACSCaliburTM；Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA）を用いて分析した（細胞４００００個／試料）。この結果、ＯＤＮ ＩＤ３５の活性は、ＯＤＮ １８２６のそれとほぼ同じであった。
【００３８】
実 施 例 ７
培養上清中サイトカインの測定および脾細胞における遺伝子発現：
ネズミ脾細胞懸濁液を、１０％ＦＣＳ添加ＲＰＭＩ １６４０完全培地（Sigma）中で最終濃度１×１０７個／ｍＬ（計２００μＬ／ウェル）で３通り培養した。５０μｇ／ｍＬのゲノムＤＮＡあるいは１０μＭのリン酸ジエステルＯＤＮを培養液に添加した。培地のみで培養した細胞を非刺激対照とした。２４時間刺激後に培養上清を採取し、サイトカインの分析まで−８０℃で保存した。ＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度（１：２あるいは１：４に希釈）を、ｅバイオサイエンス（eBioscience；San Diego, CA, USA）より購入した試薬を含むサンドウィッチＥＬＩＳＡを用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。この結果を図５に示す。
【００３９】
サイトカインの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法による分析のため、トライゾール・リージェント（Trizol reagent；Invitrogen, CA, USA）を用いて、６時間刺激後の脾細胞からＲＮＡを分離した。２.５μｇのＲＮＡを用いて、特異的プライマーを有する総量２０μＬの所定の各遺伝子について、別々にＲＴ−ＰＣＲ・キット（RT-PCR kit；Invitrogen, CA, USA）を用いて逆転写反応を実施した。１μｇのｃＤＮＡと５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造、京都）を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ３５、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−αおよびＩＮＦ−γのプライマーは株式会社キアゲン（東京）から入手した。アガロースゲル中の製品バンド強度を、ＦＡＳ ＩＩＩ システム（東洋紡、大阪）を用い、スキオン・イメージ・ソフトウエア（Scion Image Software；Frederick, Maryland, USA）により定量した。
【００４０】
上記方法により、細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、抗炎症ないし免疫調節サイトカインについての作用を試験した結果を図６に示す。
【００４１】
実 施 例 ８
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する作用：
末梢血単核細胞を、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いる密度勾配遠心法により分離した。２％ ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０（Sigma）中にＰＢＭＣを懸濁した。この細胞を２×１０５個／ウェルの濃度で、９６穴培養プレート中、４８時間培養した。また、各ＯＤＮの濃度は、１０μとした。ネズミＢ細胞の増殖測定の項に記載した方法により、ＰＢＭＣの培養、刺激および増殖測定を実施した結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のＯＤＮは、免疫調節作用を有し、しかも、乳酸菌由来のものであるので、食品、医薬品等として安全に使用しうるものである。従って、医薬や、食品等の成分として使用しうるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＬＧＧ細胞からのＤＮＡのＳＩ並びにラクトバチルス・ガッセリＴＭＣ０３５６およびビフィドバクテリウム・ロンガムＴＭＣ３１１７からのＤＮＡのＳＩを比較した図である。図中、塗りつぶした棒グラフは、５０μｇ／ｍｌ、斜線が付された棒グラフは５μｇ／ｍｌでの結果である。
【図２】各クローンから精製したＤＮＡについて、最終濃度１０μｇ／ｍｌでのマイトジェン活性を、マウスリンパ球を用いて検査した結果を示す図である。
【図３】活性クローンにしばしば見いだされる配列を有するクローンのＯＤＮについて、ホスホジエステルＯＤＮを合成し、脾臓Ｂ細胞に対するマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。
【図４】ＯＤＮＩＤ３５、ＯＤＮ ＩＤ２４２０およびＯＤＮ ＩＤ２０について、配列を３'方向あるいは５'方向へ一部シフトするように合成したＯＤＮのマイトジェン活性を調べた結果を示す図である。
【図５】培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０およびＩＦＮ−γの濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す図である。
【図６】細胞ＤＮＡおよび種々の合成ＤＮＡの、杭炎症ないし免疫調整サイトカインについて試験した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤。
【請求項３】
ラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【請求項１】
下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項２】
下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを有効成分とする免疫修飾剤。
【請求項３】
ラクトバチルスラムノーサスに属する微生物のゲノムＤＮＡから、マウスおよびヒト由来Ｂリンパ球に対するマイトジェン活性を有するＤＮＡ断片を選択することを特徴とする下式（Ｉ）
５'−ＡＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡ−３' （Ｉ）
で示される塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−３２５５４０（Ｐ２００６−３２５５４０Ａ）
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１５７２２４（Ｐ２００５−１５７２２４）
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月２９日 社団法人日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会において文書をもって発表
【出願人】（５９１１５２５８４）高梨乳業株式会社 (9)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１２月７日（２００６．１２．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月３０日（２００５．５．３０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１７年３月２９日 社団法人日本農芸化学会主催の「日本農芸化学会 ２００５年度（平成１７年度）大会において文書をもって発表
【出願人】（５９１１５２５８４）高梨乳業株式会社 (9)
【出願人】（５０４１５７０２４）国立大学法人東北大学 (2,297)
【Ｆターム（参考）】
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