ガラニン受容体および脳障害
脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療用の薬物の調製におけるＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用方法を提供する。脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果としての化学的損傷；放射線損傷；もしくは細菌またはウイルス感染の結果としての免疫学的損傷；のうちの１つによって引き起こされる。脳疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つであり得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、障害、損傷または疾病から中枢神経系を保護する分野に関する。
本発明は、特に（ａ）塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；（ｂ）脳または脊髄への直接的または間接的な外傷；（ｃ）脳または脊髄への外科手術；（ｄ）心肺バイパス手術、腎臓透析、および心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷によって生じる脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；（ｅ）アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ｖＣＪＤ（変異型クロイツフェルト・ヤコブ病）を始めとする神経損傷；（ｆ）細菌またはウイルス感染、アルコール、腫瘍の化学療法、および腫瘍の放射線療法により引き起こされるような免疫学的損傷、化学的損傷または放射線損傷；の有害な影響から脳を保護または治療することに関するが、それらに限定されるわけではない。
【０００２】
本発明は、特に、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療における第２のガラニン受容体サブタイプ（ＧＡＬＲ２）のリガンドの使用に関する。有利には、ＧＡＬＲ２特異的作動薬を使用して中枢神経系の一連の疾病を予防または治療することができ、ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３の活性化に起因する潜在的な副作用が最小限にされるかまたは除去される。本発明はさらに、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療に使用される薬物の候補を決定するための発見方法と、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療用の医薬組成物とに関する。
【背景技術】
【０００３】
脳卒中
脳卒中は、脳の一部の領域の酸素欠乏を引き起こし、関連する機能的な神経学的障害を伴う永久的な脳損傷につながる塞栓性、血栓性、または出血性の症状である。そのような脳卒中が西欧諸国での三番目に大きな死因であるにも拘わらず、そのような神経学的障害に対する満足のいく治療は存在しない。脳卒中は老齢人口で観察される大部分の身体障害の原因であり、脳卒中患者の３０％までが、日常活動に長期援助を必要とする。米国で毎年生じる脳卒中数は７００，０００件を超えると推定されており、英国では５００，０００人が一生のうちの何らかの時点で脳卒中に罹っている。脳卒中の影響を最小限にするために多くの神経保護薬が開発されているが、これらは実際満足のいくものではなく、広範にまたは定期的に臨床で使用されるものではない。そのような薬には、藤沢薬品工業（Fujisawa）製のニルヴァジピン（Nivadil、登録商標）およびバイエル（Bayer）社製のニモジピン（Nimotop、登録商標）、ファルマシア・アップジョン（Pharmacia&Upjohn）社の
抗酸化剤であるチリラザド（Freedox、登録商標）、インターニューロン（Interneuron）社のシチコリン（CerAxon、登録商標）、アサヒ（Asahi）社のプロテインキナーゼ阻害剤であるファスジル（Eril、登録商標）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。カルシウムチャネル拮抗薬およびフリーラジカルスカベンジャーに加えて、開発中の神経保護薬には、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、α−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾール（ＡＭＰＡ）拮抗薬、ならびにグルタミン酸拮抗薬およびグリシン拮抗薬を始めとする毒性の神経伝達物質の放出を阻害するように設計された他の化合物が含まれる。
【０００４】
外傷性または外科的な脳障害
脳卒中以外に、脳損傷が生じるのには、広範な条件が存在する。そのような条件には、心肺バイパス、腎臓透析、および心筋梗塞に伴う再潅流を含めた手術後の脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術が含まれる。これらは最も一般的に、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）の最中かまたはその後で起こる。米国では毎年、６００，０００件のＣＡＢＧ手術が行なわれており、心肺バイパス患者全体のうちの２５％は手術後
三ヶ月以内に神経障害を示す。 脳を損傷させる疾病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、西欧諸国の大きな健康上の負担である。ＡＤは高齢者の最も一般的な認知症の形式であり、世界で推定二千万人がこの病気にかかっている。ＡＤの発生率は老人増加の人口が増加するにつれて次の２５年間で二倍になると予想されている。英国ではＡＤ罹患者のケアにかかる年間コストが約一兆一千万円（５５億ポンド、１ポンド＝約２００円で換算）を超える。現在まで、アルツハイマー病のための基地の治療法は存在せず、アルツハイマー病の進行を実質的に遅らせる治療方法は（アセチルコリンエステラーゼ阻害因子以外は）ほとんど示されていない。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）は若年青年の間で最も一般的な身体に障害を引き起こす神経学的疾病であり、英国では約８５，０００人、西欧諸国では５０万人以上に常に影響を及ぼしている。ＭＳは２０歳から４０歳の間の人で最も頻繁に診断され、女性では男性のほぼ２倍その疾患を発現する可能性がある。多発性硬化症は優先的に北欧系の人々を優先的にターゲットにするように思われる。ＭＳは、ニューロンを取り囲むミエリン鞘の損失と、それによって生じる進行的なニューロンの機能不全および神経細胞損失により特徴付けられる自己免疫疾患である。患者は、視力障害および失明、運動および／または感覚機能の損失、ならびに腸機能および尿機能に関する問題を含む広範な問題を経験する。
【０００６】
神経の損傷および／または細胞死を引き起こすことが知られている他の疾病には、パーキンソン病および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病が含まれる。
他の脳障害の形式には、細菌またはウイルス感染、アルコール、腫瘍の化学療法、および腫瘍の放射線療法により引き起こされる免疫学的損傷、化学的損傷、または放射線損傷が含まれる。
【０００７】
ガラニン
２９アミノ酸から成る神経ペプチドであるガラニン（非特許文献１）は中枢神経系および末梢神経系の両方で広範に発現しており、また多くの典型的な神経伝達物質の数の放出を減少させることによりシナプス伝達に対する強い阻害作用を有している（非特許文献２−７）。このような阻害作用により、
ａ）作動記憶（非特許文献８）および長期電位（ＬＴＰ、記憶と電気生理学的相関があると考えられている）（非特許文献９）の低下、
ｂ）発作の機能活動が起こりやすい傾向の減少に伴う海馬の興奮の減少（非特許文献１０）、および
ｃ）無傷動物（intact animal）におけるおよび神経損傷後の侵害刺激反応の顕著な阻
害（非特許文献１１）、
を含む多様な生理学的効果が生じる。
【０００８】
ガラニンのこれらの神経調節作用は、神経系のペプチドによって果たされている主な役割と、長い間みなされていた。しかしながら現在、それらの多くの神経系への損傷がｍＲＮＡレベルとペプチドレベルの両方でガラニンの発現を顕著に引き起こすという大きな一連の証拠が存在する。そのような病変研究の例には、
ａ）末梢神経軸索切断後の後根神経節（ＤＲＧ）（非特許文献１２）、
ｂ）下垂体切除後の視床下部の大形細胞の分泌ニューロン（非特許文献１３）、
ｃ）前頭頭頂葉皮質の切除（剥皮術）後の背側縫線核および視床（非特許文献１４）、
ｄ）内嗅皮質病変後の海馬の分子層（非特許文献１５）、ならびに
ｅ）海馬采脳弓脚線維束の切断後の内側中隔（ＭＳ）および垂直脚対角帯（ｖｄＢ）（非特許文献１６）、
におけるガラニンのアップレギュレーションが含まれる。
【０００９】
これらの研究により、多くの研究者は、ガラニンがその典型的な神経調節効果に加えて
、細胞を生存させまたは増殖を促進する役割を果たす可能性があることを推測するに至った。
【００１０】
この仮説を試験するために、トランスジェニック動物を作製し、ガラニン遺伝子における機能喪失型変異および機能獲得型変異を生じさせた（非特許文献１７−２０）。ガラニンノックアウト動物の表現型分析から、驚いたことに、ガラニンが成長中の末梢および中枢神経系のニューロンのサブセットに対して生存因子として作用することが明らかとなった（非特許文献２１）。最近では、このニューロンの生存の役割が成人ＤＲＧにも関連することが明らかになっている。感覚ニューロンは、ＰＫＣ依存的な様式で第２のガラニン受容体サブタイプの活性化によって媒介され、ガラニンに依存して損傷後に軸索を伸長する（非特許文献２２）。従って、ガラニンは中枢神経系に同様の様式で作用し、脳障害、脳損傷または脳疾患の動物モデルにおける細胞死を低減する可能性があると仮定された。
【００１１】
特許文献１は、ヒトガラニンの配列を開示している。モルヒネの効果を増強するためにラットガラニンまたはそのＮ末端断片を投与することを含めて他の研究者による研究が論じられている。特許文献１が、ガラニンがそれ単独でまたは他の鎮痛剤と組み合わせて投与され得るように鎮痛効果を示すと期待できることを示唆している。特許文献１は痛みの治療におけるガラニンまたはその類似体（analog）の使用方法ならびに特定の他の症状の治療におけるガラニン拮抗薬の使用方法を権利主張している。
【００１２】
特許文献２は、多くの推定ガラニン拮抗薬を開示している。記載されている拮抗薬はすべて、ガラニンの最初の１２のアミノ酸に、他のペプチド（例えばキメラペプチド）の部分的配列が続いているものに基づいている。受容体のサブタイプに依存して、作動薬であると思われるものもあれば、拮抗薬であると思われるものもあり、その両方であると思われるものもある。特許文献２は、アルツハイマー病型の認知症および腸疾患を含むインスリン関連疾患、成長ホルモン関連疾患、アセチルコリン関連疾患、ドーパミン関連疾患、サブスタンスＰ関連疾患、ソマトスタチン関連疾患、およびノルアドレナリン関連疾患、ならびに内分泌学、摂食行動、神経病学および精神医学の分野における疾患の治療に有益な拮抗薬を開示している。かかる拮抗薬は鎮痛剤としても有用であり得る。特許文献２は、グルコース刺激によるインスリン放出のガラニンによる阻害；スコポラミン誘導のアセチルコリン（ＡＣｈ）の海馬での放出のガラニンによる阻害；屈筋反射のガラニンによる促進；膜結合試験における結合ヨウ化ガラニンの移動；を始めとする種々の効果に対する特許文献２に記載されているいくつかの拮抗薬を使用した研究結果を開示している。特許文献２には、そのような拮抗薬が鎮痛用に示され得ることを示唆しているが、そのような効果に対する結果を特許文献２では開示していない。ガラニン作動薬の使用方法に関しては積極的または有益な権利請求はなされてない。
【００１３】
非特許文献２３は、マウスの記憶過程に対するガラニンの影響の研究について記載している。結果は、ガラニンが記憶および他の認識機能を損ない、ガラニンの中間用量が特に記憶喪失を誘発することを示唆している。ガラニン作動薬の使用方法に関しては積極的または有益な権利請求はなされていない。
【００１４】
特許文献３は、アルツハイマー病の予防および治療のためのガラニン拮抗物質として有用と期待される、ガラニンのインシュリン分泌抑制作用を効果的に阻害する合成ペプチドおよび誘導体を開示している。
【００１５】
非特許文献２４は、その当時のガラニンの作用の知見を要約し、一連の高親和性ガラニン拮抗薬について説明した概要論文である。この概要は、ガラニン拮抗薬がアルツハイマー病の治療に有用であり得ることを示している。
【００１６】
非特許文献２５は、基本のおよび卵胞ホルモン刺激性のプロラクチン産生ならびにプロラクチンホルモンの放出へのガラニンの関与について論じている。
特許文献４は、ヒトガラニンのアミノ酸配列を有するペプチドおよび該ペプチドをコードするＤＮＡクローンを開示している。特許文献４は、ガラニンが膵活性に役割を果たす可能性を示唆しており、膵活性を調節する方法または成長ホルモンの生産を刺激する方法であって、開示されたペプチドの使用方法を含む方法について権利請求している。
【００１７】
特許文献５は、ガラニン拮抗薬を識別するためのヒトガラニンをコードするＤＮＡおよび方法を開示している。
特許文献６−９は、ＧＡＬＲ２（第２のガラニン受容体サブタイプ）をコードするＧＡＬＲ２ ｃＤＮＡならびにＧＡＬＲ２に特異的に結合する化合物を識別する方法を開示している。ＧＡＬＲ２拮抗薬がアルツハイマー病の治療に有効であり得るとの言及がある。化合物がＧＡＬＲ２作動薬か否かに基づいて、脳障害の予防用または治療用の化合物を選択する方法についての開示はない。
【００１８】
非特許文献２６は、その当時のガラニンの作用についての知見を概説した概要論文である。非特許文献２６は、中枢に投与したガラニンがラットの学習および記憶の作業に血管を生じさせること、およびガラニン拮抗薬の使用がアルツハイマー病の治療に有用であり得ることを示している。アルツハイマー病の治療のためのガラニン作動薬の使用については言及されていない。
【００１９】
非特許文献２７は、ラットの中枢流体振動によって引き起こされる外傷性脳障害（ＴＢＩ）の程度に対するガラニンの脳室内注射の影響について説明しており、ガラニン処理されたラットが様々な感覚運動作業において欠点が少ないことを示した。この論文は、そのような影響をガラニンの神経調節作用であって、グルタミン酸等の興奮性のアミノ酸の放出が減少することに起因すると考えているが、記憶試験（モリス水迷路試験）ではガラニン処理ラットと非処理ラットの間に差が無かった。
【００２０】
非特許文献２８は、慢性の苦痛状態の発達の測定手段としての、除脳し脊髄化した無麻酔状態のラットの屈筋反射の興奮性に対する坐骨神経の急性の切断の影響を調べた研究である。ガラニンが苦痛反応を阻害するのに有用であり得ることが判明した。脳障害、脳傷害または脳疾患の予防または治療へのＧＡＬＲ２作動薬の使用についての言及はない。
【００２１】
特許文献１０は、野生型マウスと比較して、ガラニン遺伝子欠損マウスで、破壊障害からの回復（坐骨神経の感覚軸索の再生能を示す）、成長中のニューロンの生存、および長期電位（ＬＴＰ）が低減されることを開示している。これらの結果から、ガラニン作動薬が神経損傷の修理用の薬剤の調製に使用するのに適当である可能性が示唆された。また、ガラニン作動薬がアルツハイマー病および関連の記憶喪失の治療においても有用であることが言及されている。しかしながら、どのガラニン受容体サブタイプがそのような結果を媒介するか、および、アルツハイマー病以外の障害、損傷または疾病から中枢神経系を保護する際のガラニン作動薬の影響については言及されていなかった。
【００２２】
さらに特許文献１０は、特許文献１１と共に、ガラニン遺伝子を欠損するように作製された哺乳動物、特にマウスについて説明している。
特許文献１２は、癲癇（てんかん）で起こるような痙攣を治療するために使用可能な一連のガラニン作動薬化合物を開示している。そのような化合物を無酸素症による損傷を予防するためにＣＮＳ障害にまたは心臓切開手術に使用し得ることを言及しているが、特許文献１２に含まれる実験結果はすべて痙攣の治療に関するため、その根拠は存在しない。特許文献１２の発明者がその一部を構成している研究グループは、続いて、それらの化合物のうちの一つである「ガルノン（galnon）」という化合物に関する情報を公表した（非
特許文献２９）ガルノンはＧＡＬＲ１とＧＡＬＲ２を等しく活性化し、両方に対して作動的な活性を有する。さらに、最近の仕事は、このガルノンがニューロテンシン受容体を含む多くの他のＧＰＣＲ受容体をも活性化することを示している（非特許文献３０，３１）。このガルノンはそのガラニン受容体の活性について特異的でなく、ＧＡＬＲ２特異的作動薬でもない。特許文献１２は苦痛、癲癇の治療におけるガルノンの使用方法を権利主張しているが、脳障害、脳外傷または脳疾病の治療でのそのような化合物の使用に関して特に権利主張しているわけではない。
【００２３】
非特許文献３２−３４は癲癇、オピオイド依存性、および摂食に関する研究におけるガルノンの使用についてそれぞれ論じている。
ガラニン受容体
３つのＧタンパク質共役型ガラニン受容体サブタイプであるＧＡＬＲ１，ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３が同定されている（非特許文献３５−４４）。ＧＡＬＲ１およびＧＡＬＲ３へのガラニンの結合は抑制性Ｇiタンパク質への共役によりアデニルシクラーゼを阻害
することが示されている（Wang, 1998、非特許文献３５、および非特許文献４４）。これとは対照的に、ＧＡＬＲ２の活性化は、Ｇq/11への共役によりホスホリパーゼＣおよびプロテインキナーゼＣ活性を刺激する（Fathi, 1997、非特許文献３７、非特許文献３９お
よび非特許文献４５）し、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）カスケードを活性化する。アデニリルシクラーゼへのＧＡＬＲ１およびＧＡＬＲ３の負の共役は、神経損傷または疾病後にニューロンの機能に抑制的効果を有すると予想される。また、そのような共役は、挙動（behavior）に否定的で望ましくない影響を及ぼし、傷害および疾病後の回復を阻害するかまたは遅延させるとも予想される。さらに、ＧＡＬＲ１とＧＡＬＲ３はいずれも心臓および腸で発現しており、ＧＡＬＲ１は肺および膀胱でも発現している。
【００２４】
受容体サブタイプに特異的な抗血清が無いことおよび受容体サブタイプに特異的なガラニンリガンドが不足していることで、各受容体によって果たされる機能的役割の分析が阻まれ続けていた。この分野における主な進歩は、ガラニン２−１１（ＡＲ−Ｍ１８９６と称する）が、ペプチドＧＡＬＲ１と比べて５００倍の特異性で、かつＧＡＬＲ１活性化をほぼ完全に喪失した状態で、ＧＡＬＲ２に優先的に結合することを発見したことである（非特許文献４６および非特許文献４７）。ＡＲ−Ｍ１８９６がＧＡＬＲ３に結合するか、または活性化させるか否かについて公表されたデータはない。ＡＲ−Ｍ１８９６は以前、ＧＡＬＲ２の活性化が、ガラニンが成人の末梢神経系の感覚ニューロンからの神経突起の成長を刺激する主要な機序であるらしいことを実証するために使用された（非特許文献２２）。ガラニン１−１５ペプチドおよびガラニン１−１６ペプチドもガラニン受容体を活性化する完全長ガラニン神経ペプチドの一部分であることがわかっている。
【００２５】
本明細書全体を通じて、用語「ＧＡＬＲ」は、ＧＡＬＲ１，ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３から成る受容体のグループのうちの１つである受容体を示す。かかるグループは、ヒト、ラットおよびマウスの受容体を含むが、それらに限定されるわけではない。さらに受容体は、キメラ型（すなわち異なる種由来のＧＡＬＲ配列を含む）、切断型（すなわち天然ＧＡＬＲ配列よりも短い）、または延長型（すなわち天然ＧＡＬＲ配列を超える追加配列を含む）であってもよい。受容体の活性化は、例えば、細胞内のカルシウムレベルの増加によって決定することが可能である。
【００２６】
本明細書全体を通じて、用語「ＧＡＬＲ２特異的作動薬」は、その物質によるＧＡＬＲ２の活性化の結果として細胞内での応答を引き起こすことができる物質であって、ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３を活性化しない（あるいは少しの効力でしか活性化しない）物質のことを示す。ある化合物がガラニン受容体の作動薬か否かを識別する方法は当該技術分野で周知である（例えば非特許文献４８および非特許文献４９）。ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ１の結合および活性化と比較して、少なくとも３０倍の選択性で、
好ましくはＧＡＬＲ１に比べて５０倍よりも大きい選択性で、より好ましくはＧＡＬＲ１に比べて１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２と優先的を結合および活性化する。ＧＡＬＲ２特異的作動薬はさらに、ＧＡＬＲ３の結合および活性化と比較して、少なくとも３０倍の選択性で、好ましくはＧＡＬＲ３と比べ５０倍よりも大きい選択性で、より好ましくはＧＡＬＲ３と比べ１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２と優先的を結合および活性化する。
【特許文献１】ＷＯ９２／１２９９７
【特許文献２】ＷＯ９２／２０７０９
【特許文献３】ＪＰ−Ａ−６１７２３８７
【特許文献４】ＷＯ９２／１５６８１
【特許文献５】ＷＯ９２／１５０１５
【特許文献６】ＷＯ９７／２６８５３
【特許文献７】ＵＳ２００３／０１２９７０２
【特許文献８】ＵＳ２００３／０２１５８２３
【特許文献９】ＵＳ６，５８６，１９１
【特許文献１０】ＥＰ−Ａ−０９１８４５５
【特許文献１１】ＥＰ−Ａ−１３４２４１０
【特許文献１２】ＷＯ０２／０９６９３４
【非特許文献１】Tatemoto et al. (1983) FEBS Lett. 164 124-128
【非特許文献２】Fisone et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 7339-7343
【非特許文献３】Misane et al. (1998) Eur. J. Neurosci. 10 1230-1240
【非特許文献４】Pieribone et al. (1995) Neurosci. 64 861-876
【非特許文献５】Hokfelt et al. (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 863 252-263
【非特許文献６】Kinney et al. (1998) J. Neurosci. 18 3489-3500
【非特許文献７】Zini et al. (1993) Eur. J. Pharmacol. 245 1-7
【非特許文献８】Mastropaolo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 9841-9845
【非特許文献９】Sakurai et al. (1996) Neurosci. Lett. 212 21- 24
【非特許文献１０】Mazarati et al. (1992) Brain Res. 589 164-166
【非特許文献１１】Wiesenfeld et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 3 334-3337
【非特許文献１２】Hokfelt et al. (1987) Neurosci. Lett. 83 217-220
【非特許文献１３】Villar et al. (1990) Neurosci. 36 181-199
【非特許文献１４】Cortes et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 7742-7746
【非特許文献１５】Harrison & Henderson (1999) Neurosci. Lett. 266 41-44
【非特許文献１６】Brecht et al. (1997) Brain Res. Mol. Brain Res. 48 7-16
【非特許文献１７】Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132
【非特許文献１８】Holmes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 11563-11568
【非特許文献１９】Steiner et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 4184-4189
【非特許文献２０】Blakeman et al. (2001) Neuroreport 12 423- 425
【非特許文献２１】Holmes, 2000; O'Meara et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 11569-11574
【非特許文献２２】Mahoney et al. (2003) J. Neurosci. 23 416-421
【非特許文献２３】Ukai et al. (1995) Peptides 16 1283-1286
【非特許文献２４】Bartfai et al. (1992) TiPS 13 312-3
【非特許文献２５】Wynick et al. (1993) Nature 364 529-532
【非特許文献２６】placeCrawley (1996) Life Sci. 58 2185-2199
【非特許文献２７】Liu et al. (1994) J. Neurotrauma 11 73-82
【非特許文献２８】Luo et al. (1995) Neuropeptide 28 161-166
【非特許文献２９】Wu et al. (2003) Eur. J. Pharmacol. 482 133- 137
【非特許文献３０】Wang et al., Functional activity of galanin peptide analogues. Program No. 960.4 2004 Abstract Viewer/Itinerary Planner. placeCityWashington StateDC
【非特許文献３１】非特許文献３１のオンライン版 Society for Neuroscience, 2004. Online. (http ://sfn. scholarone. com/itin2004/index. html
【非特許文献３２】Saar et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 7136-7141
【非特許文献３３】Zachariou e al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U . S. A. 100 9028-9033
【非特許文献３４】Abramov et al. (2003) Neuropeptides 38 55-61
【非特許文献３５】Habert-Ortoli et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9780-9783
【非特許文献３６】Burgevin et al. (1995) J. Mol. Neurosci. 6 33-41
【非特許文献３７】Howard et al. (1997) FEBS Letts. 405 285-290
【非特許文献３８】Smith et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 24612-24616
【非特許文献３９】Wang et al. (1997a) Mol. Pharmacol. 52 337-343
【非特許文献４０】Wang et al. (1997b) J. Biol. Chem. 272 31949-31953
【非特許文献４１】Ahmad et al. (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 863 108-119
【非特許文献４２】Bloomquist et al. (1998) Biophys. Res. Commun. 243 474-479
【非特許文献４３】Kolakowski et al. (1998) J. Neurochem. 71 2239-2251
【非特許文献４４】Smith et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 23321-23326
【非特許文献４５】Wittau et al. (2000) Oncogene 19 4199-4209
【非特許文献４６】Liu et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. placecountry-regionUSA 98 9960-9964
【非特許文献４７】Berger et al. (2004) Endocrinology 145 500-507
【非特許文献４８】Botella et al. (1995) Gastroenterology 108 3-11
【非特許文献４９】Barblivien et al. (1995) Neuroreport 6 1849-1852.
【００２７】
（発明の開示）
本発明の第１の態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療用の薬物の調製におけるＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用方法が提供される。
【００２８】
有利なことに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用により、ガラニンおよびガラニン作動薬がそのような状況での細胞死を減少させる能力がある結果として、脳障害、脳損傷または脳疾患を患っている個体の脳障害、脳損傷または脳疾患が予防されるか、またはそのような個体の症状が改善される。ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３を活性化させないＧＡＬＲ２特異的作動薬は脳障害または脳疾患を治療する効果があり、それら３つの受容体の各々により利用されるシグナルカスケードが異なる結果、ＧＡＬＲ１またはＧＡＬＲ３の活性化による望ましくないまたは有害な末梢の副作用を最小限にする。
【００２９】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷は過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷は放射線療法の結果であり得る。
【００３０】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００３１】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００３２】
本発明の第２の態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する方法であって、そのような予防または治療を必要とする個体に有効量のＧＡＬＲ２特異的作動薬を投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされ得る。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷は過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷は放射線療法の結果であり得る。
【００３４】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００３５】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００３６】
本発明の第２態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する化合物の候補を選択する方法であって、少なくとも１つの試験化合物はＧＡＬＲ２特異的作動薬であるか否かを決定し、少なくとも１つの試験化合物がＧＡＬＲ２特異的作動薬である場合に該少なくとも１つの試験化合物を候補化合物として選択することを含む方法が提供される。
【００３７】
少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間の結合親和性でＧＡＬＲ２と結合することが決定され得る。試験化合物は、ＧＡＬＲ１への結合に比べて３０倍よりも大きい選択性で、好ましくは５０倍よりも大きい選択性で、最も好ましくは１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２に結合する。好ましくは、試験化合物はさらに、ＧＡＬＲ３への結合に比べて３０倍よりも大きい選択性で、好ましく
は５０倍よりも大きい選択性で、最も好ましくは１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２に結合する。
【００３８】
ＧＡＬＲ２はヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一部分を含んでもよく、完全長のヒトＧＡＬＲ２であってもよい。
ＧＡＬＲ２は非ヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一の部分を含んでもよく、ラットＧＡＬＲ２またはマウスＧＡＬＲ２であってもよく、または完全長ＧＡＬＲ２であってもよい。
【００３９】
ＧＡＬＲ２はキメラ受容体構築物であってもよい。
本発明の上記態様による方法を用いて、試験化合物の選択がハイスループットスクリーニング検定によりスクリーニングされ得る。
【００４０】
本発明の第４態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療に使用される医薬組成物であって、
ａ）有効量の少なくとも１つのＧＡＬＲ２特異的作動薬または医薬として許容されるその塩；および
ｂ）医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤；
を含む組成物が提供される。
【００４１】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされ得る。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷が放射線療法の結果であり得る。
【００４２】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００４３】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００４４】
医薬組成物は経口投与されても非経口的に投与されてもよく、好ましくは経口投与される。
医薬組成物が経口投与される場合、それはカプセルまたは錠剤の形をしていてもよく、好ましくはラクトースおよび／またはコーンスターチを含んでいてもよい。医薬組成物はさらに、潤滑剤、好ましくはステアリン酸マグネシウムを含んでいてもよい。医薬組成物は水性懸濁液または水溶液の形をしていいてもよく、さらに乳化剤または懸濁剤のうちの少なくとも一つを含んでいてもよい。医薬組成物は甘味剤、着香料、または着色剤のうちの少なくとも一つを含んでいてもよい。
【００４５】
医薬組成物は、注射により、無針装置により、吸入スプレーにより、局所に、直腸に、
経鼻で、口腔に、膣内に、または埋設したリザーバを介して投与され得る。
医薬組成物が注射または無針装置によって投与される場合、それは無菌の注射可能な製剤の形をしていてもよく、無針装置による投与に適した剤形をしていてもよい。無菌の注射可能な製剤または無針装置による投与に適した剤形は、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液であってよい。水性懸濁液は、マンニトール、水、リンゲル液または等張食塩水に溶かして調製され得る。油性懸濁液は、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸または天然の医薬として許容される油に溶かして調製され得る。脂肪酸はオレイン酸またはオレイン酸グリセリド誘導体であり得る。天然の医薬として許容される油は、オリーブ油、ヒマシ油またはポリオキシエチル化オリーブ油、またはヒマシ油である。油性懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤、好ましくはＰｈ．Ｈｅｌｖを含んでもよい。
【００４６】
医薬組成物が直腸に投与される場合、それは直腸投与用の坐薬の形をしていてもよい。坐薬は、室温で固体かつ直腸温で液体になる非刺激性の補形剤を含んでよい。非刺激性の補形剤は、カカオ脂、蜜ろうまたはポリエチレングリコールのうちの１つであってよい。
【００４７】
医薬組成物が局所に投与される場合、それはミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水から選択されるキャリアを含む軟膏であってよい。代わりに、それはミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水から選択されたキャリアを含むローションまたはクリームであってもよい。
【００４８】
医薬組成物が経鼻で投与される場合、それは鼻エアゾールおよび／または吸入により投与されてもよい。
本発明の第５態様によれば、細胞死を抑制する方法であって、細胞死を抑制するのに有効な量のＧＡＬＲ２特異的作動薬と細胞を接触させることを含む方法が提供される。細胞がニューロンであってよく、好ましくは中枢神経系由来のニューロンであり、好ましくは海馬または皮質のニューロンである。好ましくは、細胞はヒト細胞である。この方法において、細胞中に存在するＧＡＬＲ２の活性化の結果として細胞死は抑制される。細胞死が起こる確率が下がるか、細胞の生命が延長されるかのいずれかが起これば、細胞死は抑制される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明の実施形態を図１−４を参照しながらあくまで例示として説明する。
動物
動物はすべて、標準固形飼料および水を自由摂取させた。動物の世話と手順は英国ホームオフィスのプロトコルおよびガイドラインの範囲で行なった。
【００５０】
ガラニンノックアウトマウス
系統と育種の履歴についての詳細は以前に刊行物で発表されている（Wynick et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 12671-12676）。簡単に説明すると、ガラニン遺伝子に標的変異についてホモ接合型のマウスをＥ１４細胞系を用いて作製した。逆方向のＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを使用して、エキソン１−５を置換し、突然変異体を同型接合性に育種し、１２９ ＯｌａＨｓｄ系統で同系交配した。週齢および性別が一致する野生型の同腹仔をすべての実験でコントロールとして使用した。
【００５１】
ガラニン過剰発現マウス
系統と育種の履歴についての詳細は以前に刊行物で発表されている（Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132）。簡単に説明すると、ガラニン過剰発現マウスをＣＢＡ
／Ｂ６第１世代雑種のバックグラウンドで作製した。マウス１２９ｓｖコスミドゲノムライブラリーをスクリーニングして、マウスガラニンのコード領域全体と約２０ｋｂの上流配列を含む約２５ｋｂの領域をサブクローニングした。導入遺伝子を制限酵素によって切断し、５ｎｇ／μｌの採集濃度で受精卵母細胞に微量注入した。以前に記載されていたように（Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132）、４つのガラニン過剰発現トランスジェニック系統が生じ、海馬におけるガラニン発現を免疫細胞化学によって評価した（以下を参照）。４６系統は、他の３つ系統および野生型コントロールと比較して、海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域ならびに歯状回において最も高レベルのガラニン発現を有することが判明した。したがって、後続のすべての実験には４６系統を使用した。
【００５２】
海馬の器官培養
器官培養は以前に記載されていた通りに準備した（Elliott-Hunt et al. (2002) J. Neurochem. 80 416-425; Stoppini et al. (1991) J. Neurosci. Methods 37 173-182）。
簡単に説明すると、５−６日齢の子からの海馬を、解剖顕微鏡下で迅速に除去し、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織切断機（Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.社、英国Gomshall所在）を使用して４００μｍで横方向に切断した。切片は、６ウェルプレートにＥａｒｌｅの塩類は含むがＬ−グルタミンは含まない５０％の最小基礎培地（Gibco BRL社、英国 Paisley所在）、５０％のハンクス平衡塩類溶液（Gibco BRL社）、２５％のウマ血清（加熱不活性化済；Harlan Serum Labs社、英国Loughborough所在）、５ｍｇ／ｍｌグルコース（Sigma Chemical Co. 社、英国Poole所在）、および１ｍｌグルタミン酸（Sigma社）を入れた微孔性膜貫通型ｂｉｏｐｏｒｅ（登録商標）膜（Millipore社,英国Poole所在）上で、
９５％の空気および５％のＣＯ2の中、３７℃で培養した。
【００５３】
初代ニューロン培養物の調製
２−３日齢の子から海馬を切除し、ハンクス平衡塩類溶液（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）（Gibco BRL社、英国 Paisley所在）、１０％（ｖ／ｖ） Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ICN Biomedicals Inc.社、米国オハイオ州Aurora所在）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（Britannia Pharmaceuticals Ltd.社、英国Surrey, Redhill所在）、１００ｍｌ量の０．０５ｍｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン（Sigma Chemical Company 社、英国Poole, Dorset所在）および０．５％（ｖ／ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ICN Biomedicals Inc.社、米国オハイオ州Aurora所在）を用いて調製した４℃の収集緩衝液に入れた。海馬ニューロンの酵素による消化、単離、および培養を以前に記載されている通りに行った（McManus & Brewer (1997) Neurosci. Lett. 224 193-196）細胞数を計測し、Ｄ−Ｌ−ポリ−オルニチン（Sigma社）コートした９６ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルになるよう蒔いた。２４時間後、１０μｇ／ｍｌ ５’フルオロ２’デオキシウリジン（Sigma社、 有糸分裂阻害剤）は添加した。実験前の９日間、培養物を周囲の酸素および５％ ＣＯ2で３７℃でイ
ンキュベートした。培地は最初の３日後と、その後は四日ごとに変えた。
【００５４】
免疫組織化学
マウスを４％ パラホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で心臓内潅流した。脳を室温で除去し、その後４時間固定した。その後、脳は２０％のスクロースで４℃にて一晩平衡化し、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Tissue Tek Ltd社、英国Eastbourne所在）の封入剤に包埋し、ドライアイスで冷凍し、低温切削した（３０μｍの切片）。切片を１０％ 正常ヤギ血清／ＰＢＳ ０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−１００（ＰＢＳＴ）で室温にて１時間ブロックし、透過処理した。その後、切片を、１：１０００でＰＢＳＴに溶かしたガラニンに対するウサギのポリクローナル抗体(Affinity社、英国Nottingham所在)で室温にて一晩インキュベートし、ＰＢＳで３×１０分洗浄し、１：８００でイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）−ヤギ（The Jackson La boratory社、米国ペンシル
ベニア州Westgrove所在）で室温にて３時間インキュベートした。洗浄後、切片をＶｅｃ
ｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Vector Laboratories Inc.社、米国カリフォルニア州Burlington所在）に装着した。画像を、ライカ蛍光顕微鏡（(Leica Microsystems社、英国Milton Keynes所在)を使用して、ＲＴ Ｃｏｌｏｒ ＳｐｏｔカメラおよびＳｐｏｔ Ａ
ｄｖａｎｃｅ画像撮像システム・ソフトウェア（Diagnostic Instruments社、米国ミズーリ州Sterling Heights所在）で得た。
【００５５】
４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ−１００で透過処理し、上述のように処理した分散された海馬ニューロンおよび器官培養物についても、ガラニン免疫組織化学を行った。
【００５６】
スタウロスポリンおよびグルタミン酸により誘発した海馬の損傷
１４日目の海馬の器官培養物を０．１％ＢＳＡの無血清培地に１６時間入れ、その後様々な濃度のグルタミン酸と共に３時間、スタウロスポリンと共に９時間、インキュベートした。スタウロスポリンおよびグルタミン酸はともにそのような細胞培養物に興奮毒性の損傷を引き起こすことが分かっている（Prehn et al. (1997) J. Neurochem. 68 1679-1685; Ohmori et al. (1996) Brain Res. 743 109-115）。培養物を無血清培地で洗浄し、
画像処理の前にさらに２４時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムの存在下で実験を行うことにより、器官培養物においてニューロンの障害の局所的パターンが観察された。細胞膜の障害後に、染料が細胞に入り、核酸に結合し、蓄積し、細胞を明るく蛍光にした（Vornov et al. (1994) Stroke 25 457-465）。ＣＡ１ニューロン亜領域が明視野イメージではっきり見えた。ＣＡ１領域を含むエリアにおけるニューロンの損傷を、背景を超えるシグナルを確立するために、ＮＩＨイメージソフトウェア（Scion Image社、米国メ
リーランド州所在）で密度スライス機能を使用して評価した。排他染料であるヨウ化プロピジウムを発現している亜領域のエリアを測定し、明視野イメージで評価される亜領域のエリアの合計面積の割合として表わした。さらに、密度スライス機能を使用する場合にパラメータを正確に設定することを一貫するために、１０ｍＭグルタミン酸に暴露した陽性コントロールの培養物のセットに対して閾値を設定した。
【００５７】
９日目に、初代海馬培養物を２４時間スタウロスポリンに暴露した。ニューロンの生存率は、生存／死亡キット（Molecular Probes社、オランダ国Lieden所在）を使用して、生きたニューロンと死んだニューロンをマニュアルで計数することにより測定した。
【００５８】
処理
器官型または分散型の初代海馬培養物を、以下の化学物質を添加するか添加しないで、様々な時間、培養した：スタウロスポリン（Sigma社）、Ｌ−グルタミン酸（Sigma社）、ガラニンペプチド（Bachem社、英国Merseyside所在）、高親和性ＧＡＬＲ２特異的作動薬ＡＲ−Ｍ１８９６［Ｇａｌ（２−１１）Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ2］（AstraZeneca社、カナダ国ケベック州Montreal所在）、アミロイド−ベータ（１−４２）（Ａβ（１−４２））および逆Ａβ（４２−１）ペプチド（American Peptide Company, ９３９０６ カリフォルニア州Sunnyvile所在）。以下の実験で使用する前に、Ａβ（１−４２）を培養培地中で予めインキュベ
ートすることにより原繊維を形成するよう誘導した。詳細には、０．４５ｍｇのＡβペプチドを２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−Sigma社）に溶解し、培地で１００
μＭのストック溶液になるよう希釈した。これを穏やかに振盪して室温で２４時間インキュベートした。
【００５９】
カイニン酸により誘発した海馬の障害
８週齢の雌のマウスにカイニン酸（Tocris Cookson社、英国 Bristol所在）（２０ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤（vehicle）（ＰＢＳ、１ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射した。カイニ
ン酸は以前に記載されているように海馬の障害を引き起こすことが分かっている(Beer et
al. (1998) Brain Res. 794 255-266; Mazarati et al (2000) J. Neurosci. 16 6276-6281).海馬の細胞死は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介フルオレセイン−ｄＵＴ
Ｐニック末端ラベル（ＴＵＮＥＬ）によって測定した。動物はカイニン酸または賦形剤を注射した７２時間後に屠殺した。マウスを、４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで心臓内潅流し、脳を迅速に除去し、その後室温で４時間固定した。脳を２０％のスクロースで４℃にて一晩平衡化し、最適切削温度（ＯＣＴ）封入剤に包埋し、ドライアイスで冷凍した。切片を低温保持装置で切断（１６μｍ）し、ゼラチンコートしたスライド上に載せて回答し、使用するまで−８０℃で保存した。アポトーシスは、インサイチュ細胞検出キット（Boehringer社、米国Berkshire所在）の使用により評価した。第６番目ごとの切片を
収集し、メタノールでブロックし、ｔｒｉｔｏｎ（０．１％）およびクエンナトリウム（０．１％）で透過処理し、加湿ボックス中で１時間、３７℃にてフルオレセインｄＵＴＰで標識した。その後、切片を西洋わさびペルオキシダーゼと結合させ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と共に共存させ、ヘマトキシンで対比染色した。コントロールは、フルオレセインｄＵＴＰの標識を付けるのを省略した以外は、同じ取り扱いを受けた。洗浄後に、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Vector Labs Inc.社）に装着した。細胞を、ライカ蛍光顕微鏡（(Leica Microsystems社、英国Milton Keynes所在)を使用して、Ｒ
Ｔ Ｃｏｌｏｒ ＳｐｏｔカメラおよびＳｐｏｔ Ａｄｖａｎｃｅ画像撮像システム・ソフトウェア（Diagnostic Instruments社、米国ミズーリ州Sterling Heights所在）で得た。
【００６０】
ＥＡＥモデル
ＭＳの標準的なＥＡＥモデルを以前に記載された通りに使用した（Radu et al. (2000)
Int. Immunol. 12 1553-60）マウスを、４ｍｇ／ｍｌのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト結核菌）株であるＨ３７ＲＡ（Difco社、ミシガン州Detroit所在）を添加した完全フロイントアジュバント（Sigma社）で懸濁した全量２００μ
ｇのＭＢＰ １−９（ＡｃＡＳＱＫＲＰＳＱＲ、Abimed社、ドイツ国Langenfeld所在により合成）で片方の後肢で皮下に免疫した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの生成タンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、UK Central Veterinary Laboratory (英国Weybridge所在)より入手した。マウスはＥＡＥの徴候に関して、以下のようにスコアを付けた：０、徴候無し；１、尾の弛緩；２、部分的な後肢の麻痺および／または立ち直り反射の障害；３、完全な後肢の麻痺；４、後肢と前肢の麻痺；５、瀕死または致死。
【００６１】
統計分析
データは平均＋ＳＥＭとして示す。グループ内のスタウロスポリン濃度の差を分析するのに、スチューデントｔ検定を使用した。遺伝子型と、異なるリガンドおよび／またはスタウロスポリンの点ならびにグルタミン酸の点との間の差を分析するのに、適宜、ＡＮＯＶＡまたはノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ事後検定を使用した。０．０５より小さいＰ値を有意であるとみなした。
【００６２】
候補化合物のスクリーニング方法
ヒトＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２またはＧＡＬＲのいずれかをコードするｃＤＮＡを形質導入し、そのｃＤＮＡを安定に発現しているＣＨＯ細胞を、Euroscreen（ベルギー国Brussels所在）より入手した。細胞は、３つの層培養フラスコ中に１０％ ウシ胎児血清（Gibco BRL社、英国Paisley所在）および０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Sigma社）を添加した
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘ（ＨＡＭＳ）Ｆ１２（Gibco BRL社）を入れて、３７℃で５％
ＣＯ2／９５％ 大気雰囲気で培養した。細胞を約８０％の今フルエンスまで増殖させ
、３７°Ｃで１０分間、０．０２％ ＥＤＴＡのＤ−ＰＢＳに入れて分離させた。細胞を５分間１０００ｒｐｍで遠心分離により収集し、実験の日に必要な密度になるよう培地に再懸濁した。その後、様々な化合物の添加に対する細胞の応答をＦＬＩＰＲ３８４（Molecular Devices Ltd社、英国Wokingham所在）を使用して測定した。細胞を２０，０００細
胞／３０ｕｌの密度で培養培地に懸濁し、３８４ウェル黒色／透明Ｇｒｅｉｎｅｒ培養プレート（３０μｌ／ウェル）に移動させ、３７℃で２時間、５％ ＣＯ2／９５％空気の
調湿雰囲気でインキュベートした。各ウェルに３０μｌのＦｌｕｏ−４−ＡＭ（０．８％
プルロニックＦ−１２７および１％ ＦＢＳを含む４μＭのアッセイバッファ）を追加することにより、細胞に染料をロードし、３７℃で１時間、５％ ＣＯ2／９５％空気の
調湿雰囲気でインキュベートした。細胞を、ＥＭＢＬＡプレート洗浄機（４×８０μｌ洗浄）を使用して、ＦＬＩＰＲアッセイバッファ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２．５ｍＭ プロベネシド、および０．１％ ＢＳＡを追加したカルシウムもマグネシウムも含まないＨＢＳＳ）で洗浄し、洗浄後に各ウェルに４５μｌが残るようにした。
【００６３】
化合物に対する反応をＦＬＩＰＲ３８４を使用して測定した。基本の蛍光を、化合物の添加前（５μｌ；最終濃度１０μＭ）に毎秒１０秒間記録し、蛍光を、毎秒６０回読取りの間、次ぎに６秒ごとにさらに２０回読取りの間記録した。データは相対蛍光単位（ＲＦＵ）として記録し、３分間の記録にわたる最大のＲＦＵを記録するデータ転送された統計について分析を行った。データはＸＬＦｉｔ ３．０を使用して分析した。データはすべて、リリースに先立った適切な品質管理（ＱＣ）手順を受けた。各化合物に対するＥＣ５０を、ＧＡＬＲを発現していえる細胞系の各々に対して計算し、そのデータからＧＡＬＲ特異的作動薬として作用している化合物を識別した。
【００６４】
結果
実験１
２０ｍｇ／ｋｇのカイニン酸の腹腔内投与を使用して、以前に記載された通りに興奮毒性の海馬損傷を誘発した（Beer, 1998; Mazarati, 2000; Tooyama et al. (2002) Epilepsia 43 Suppl 9 39-43）。三日後、脳を採取し、海馬の細胞死をＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を計測することにより評価した。その結果を図１に示す。系統を一致させた野生型のコントロール（ＷＴ）と比較して、ガラニンノックアウト動物（ＫＯ）のＣＡ１およびＣＡ３領域の両方ではアポトーシスを起こしたニューロンの数が有意に多くなり（図１）、それぞれ６２．９％および４４．８％増加した（**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）
。逆に、ガラニン過剰発現動物（ＯＥ）のＣＡ１およびＣＡ３領域の両方では、系統を一致させた野生型のコントロール（ＷＴ）よりも、細胞死の程度が有意に低下し（図１）、それぞれ５５．６％および５０．４％減少した（ｐ＜０．０５）。
【００６５】
実験２
ガラニンにより果たされている神経保護の役割をより制御しやすいインビトロ系でさらに細かく調べるために、初代分散型海馬培養物および器官型海馬培養物の両方（Elliott-Hunt, 2002）を使用した。分散型海馬培養物は観察された効果がニューロン特異的であることを保証し、器官型培養物はニューロンの回路のシナプスおよび解剖学的構成を保存する（Elliott-Hunt, 2002）と共にインビボで見出される機能持性の多くを保持しているため（Adamschik et al. (2000) Brain Res. Prot. 5 153-158）、これらの２つの技術は相互に補い合う関係にある。海馬培養物におけるニューロンの細胞死にスタウロスポリンおよびグルタミン酸が及ぼす効果（Prehn, 1997; Ohmori, 1996）を研究した。細胞死はヨ
ウ化プロピジウム染色により目に見えるようにした。結果を、未処理の「コントロール」培養物と比較した蛍光を示すエリアの百分率として表す。１μＭおよび１００ｎＭのスタウロスポリンは、野生型（ＷＴ）およびガラニンノックアウト（ＫＯ）培養物の両方で有意かつ一貫したレベルの神経毒性を引き起こした。図２Ａに示されるように、いずれの用量でも、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト動物では細胞死の百分率が有意に過剰であった（１μＭ：６８±０．５％ 対 ３８±８％；１００ｎＭ：６５±１０％ 対 ４０±２６％；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。同様に、４ｍＭグルタミン酸に９時間暴露した後では、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト器官型培養物での細
胞死は顕著かつ有意に多かった（８５±８．６％ 対 ６１±９．３％；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【００６６】
上記の効果がニューロン特異的であることを確かめるために、分散型の初代海馬ニューロンにおけるスタウロスポリンの効果も調査した。やはり、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト培養物では、１０ｎＭ−１μＭのスタウロスポリンの範囲にわたって、有意に過剰な細胞死が観察された。主要な海馬のニューロンも研究された（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。
【００６７】
実験３
ガラニンが欠如していると海馬の細胞死に対する感受性が増加することが実証されたため、調査をガラニン過剰発現マウスにまで拡張した。５０ｎＭまたは１００ｎＭのスタウロスポリンへの暴露後、系統を一致させた野生型コントロール（ＷＴ）と比較して、ガラニン過剰発現動物（ＯＥ）では細胞死の有意な減少が観察された（図２Ｃ；ｎ＝４および**ｐ＜０．０１）。
【００６８】
実験４
外因性のガラニンが野生型の海馬ニューロンを損傷から保護するか否かを試験するために、野生型の器官型培養物に、１００ｍＭ ガラニンを１００ｎＭ スタウロスポリンと同時投与した。この同時投与はそれらの培養物に有意な神経保護を与えた（ｎ＝４およびｐ＜０．０５）（図３Ａ）。同様に、野生型の器官型培養物に４ｍＭ グルタミン酸と同時投与した場合にも、ガラニンは１０ｎＭ−１μＭの範囲で保護的であった（図３Ｂ）。器官型培養物を使用したこれらの知見と一致して、１００ｎＭ ガラニンは１０ｎＭ スタウロスポリンによって誘発される細胞死から野生型の分散型初代海馬ニューロンをも保護した（図３Ｃ；ｎ＝３およびｐ＜０．０５）。
【００６９】
実験５
海馬におけるガラニンの神経保護効果は、Ｇタンパク質共役型ガラニン受容体サブタイプであるＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３のうちの１または複数の活性化により媒介されていると考えられる。ＧＡＬＲ２の活性化が、ガラニンが成人の末梢神経系の感覚ニューロンからの神経突起の成長を刺激する主要な機序であるらしいことが先に示された（Mahoney, 2003）。したがって、１００ｎＭ ＡＲ−Ｍ１８９６（高親和性ＧＡＬＲ
２特異的作動薬）の影響も、野生型動物由来の器官型培養物に１００ｎＭ スタウロスポリンを同時投与する時に、同様に試験した。ＡＲ−Ｍ１８９６がＧＡＬＲ１を弱く活性化するとしても、これはＧＡＬＲ１に対するＩＣ50が８７９ｎＭである１００ｎＭの濃度ではほぼ起こり得ないことに留意する。ＡＲ−Ｍ１８９６は等モル濃度のガラニンで観察されたのと同様な量に、野生型の器官型培養物の細胞死の量を有意に減少させた（ｐ＜０．０５、図３Ａ）。さらにＡＲ−Ｍ１８９６の追加は、野生型の器官型培養物で観察されたのと同様にガラニンノックアウト培養物におけるスタウロスポリン誘導細胞死について効果的であった（データは図示しない）。分散型の初代海馬ニューロンもＡＲ−Ｍ１８９６およびスタウロスポリンで処理したところ、完全長ガラニンで観察されるのと同様のＡＲ−Ｍ１８９６の同様な保護効果が実証された（図３Ｃ）器官型または初代培養物でスタウロスポリンがない場合には、ガラニンまたはＡＲ−Ｍ１８９６の有意な効果は見られなかった。
【００７０】
実験６
ＡＤ（アルツハイマー病）における病気の進行は、脳内でアミロイド−β原繊維が蓄積し、α−セクレターゼによるアミロイド前駆タンパク質の開裂に由来するペプチドから成る老人斑の形成に関連する（Gamblin et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 10032-10037）。原繊維のアミロイド−βの蓄積はＡＤの神経病発生における原因と
なる役割を有すると仮定されている。内因性ガラニンが原繊維Ａβにより誘発された神経毒性に対して保護的な効果を有するか否かを試験するために、１４日目の海馬の器官型培養物をガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および系統を一致させた野生型コントロールトランスジェニック動物から得た。これらの培養物を１０μＭの原繊維Ａβ（１−４２）で、逆のコントロールペプチドＡβ（４２−１）で、またはペプチドの添加なしで、７２時間まで処理した。１０μＭの原繊維Ａβ（１−４２）は先に記載されている通りに使用した（Zheng et al. (2002) Neuroscience 115 201-211）。実験は三連（triplicate）で行ない、細胞死をヨウ化プロピジウム蛍光（ＰＩＦ）強度を使用して上述のように測定した。画像はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア使用して撮像し、分析した。結果は、ガラニンノックアウト動物では野生型コントロールに比べて統計的に多くの量の原繊維Ａβ（１−４２）誘発の海馬の細胞死が実証された。逆に、ガラニン過剰発生動物では系統を一致させた野生型コントロールに比べて統計的に少ない繊維Ａβ（１−４２）誘発の海馬の細胞死が実証された。
【００７１】
実験７
上述の以前に記載されたＥＡＥモデルを使用して、ガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および系統を一致させた野生型コントロールのトランスジェニック動物にＭＳの表現型を引き起こした。図４Ａはガラニンノックアウト動物が系統を一致させた野生型コントロールよりもより進行性で重篤な疾病の形式を進展させたことを実証している（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。逆に、ガラニン過剰発現マウスではその野生型コントロールと比べて著しく異なるような疾病の徴候を発達させていない（図４Ｂ；Ｎ＝５、ｐ＜０．００１）。繰り返しになるが、これらのデータは、中枢神経系におけるニューロン傷害の炎症性のモデルにガラニンが保護的な役割を果たすことを実証している。
【００７２】
要約
障害の多くのインビボおよびインビトロのモデルにおいて、ガラニンが海馬への内因性の神経保護因子として作用することが実証された。さらに、外因性ガラニンと先に記載された高親和性のＧＡＬＲ−２特異的作動薬とは、いずれも細胞死を減少させる。従って、ＧＡＬＲ２はこれらの保護効果を媒介する主要な受容体サブタイプである。これらのデータは、ＧＡＬＲ２特異的作動薬が様々な形式の脳障害、脳損傷または脳疾病の治療または予防に治療の用途を有するであろうことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】インビボにおける海馬の細胞死に対する２０ｍｇ／ｋｇのカイニン酸の腹腔内投与の効果を示すグラフ。
【図２】インビトロにおける１０ｎＭ−１μＭのスタウロスポリン（Ｓｔ）とのインキュベート後のガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および野生型海馬培養物の応答を示すグラフ。
【図３】インビトロにおけるガラニン野生型海馬培養物に対する、スタウロスポリンまたはグルタミン酸の、ガラニンまたはＡＲ−Ｍ１８９６との同時投与の効果を示すグラフ。
【図４】インビボにおけるＭＳの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルのノックアウト、過剰発現、および野生型動物の応答を示すグラフ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、障害、損傷または疾病から中枢神経系を保護する分野に関する。
本発明は、特に（ａ）塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；（ｂ）脳または脊髄への直接的または間接的な外傷；（ｃ）脳または脊髄への外科手術；（ｄ）心肺バイパス手術、腎臓透析、および心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷によって生じる脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；（ｅ）アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ｖＣＪＤ（変異型クロイツフェルト・ヤコブ病）を始めとする神経損傷；（ｆ）細菌またはウイルス感染、アルコール、腫瘍の化学療法、および腫瘍の放射線療法により引き起こされるような免疫学的損傷、化学的損傷または放射線損傷；の有害な影響から脳を保護または治療することに関するが、それらに限定されるわけではない。
【０００２】
本発明は、特に、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療における第２のガラニン受容体サブタイプ（ＧＡＬＲ２）のリガンドの使用に関する。有利には、ＧＡＬＲ２特異的作動薬を使用して中枢神経系の一連の疾病を予防または治療することができ、ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３の活性化に起因する潜在的な副作用が最小限にされるかまたは除去される。本発明はさらに、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療に使用される薬物の候補を決定するための発見方法と、脳障害、脳損傷または脳疾病の予防または治療用の医薬組成物とに関する。
【背景技術】
【０００３】
脳卒中
脳卒中は、脳の一部の領域の酸素欠乏を引き起こし、関連する機能的な神経学的障害を伴う永久的な脳損傷につながる塞栓性、血栓性、または出血性の症状である。そのような脳卒中が西欧諸国での三番目に大きな死因であるにも拘わらず、そのような神経学的障害に対する満足のいく治療は存在しない。脳卒中は老齢人口で観察される大部分の身体障害の原因であり、脳卒中患者の３０％までが、日常活動に長期援助を必要とする。米国で毎年生じる脳卒中数は７００，０００件を超えると推定されており、英国では５００，０００人が一生のうちの何らかの時点で脳卒中に罹っている。脳卒中の影響を最小限にするために多くの神経保護薬が開発されているが、これらは実際満足のいくものではなく、広範にまたは定期的に臨床で使用されるものではない。そのような薬には、藤沢薬品工業（Fujisawa）製のニルヴァジピン（Nivadil、登録商標）およびバイエル（Bayer）社製のニモジピン（Nimotop、登録商標）、ファルマシア・アップジョン（Pharmacia&Upjohn）社の
抗酸化剤であるチリラザド（Freedox、登録商標）、インターニューロン（Interneuron）社のシチコリン（CerAxon、登録商標）、アサヒ（Asahi）社のプロテインキナーゼ阻害剤であるファスジル（Eril、登録商標）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。カルシウムチャネル拮抗薬およびフリーラジカルスカベンジャーに加えて、開発中の神経保護薬には、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、α−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾール（ＡＭＰＡ）拮抗薬、ならびにグルタミン酸拮抗薬およびグリシン拮抗薬を始めとする毒性の神経伝達物質の放出を阻害するように設計された他の化合物が含まれる。
【０００４】
外傷性または外科的な脳障害
脳卒中以外に、脳損傷が生じるのには、広範な条件が存在する。そのような条件には、心肺バイパス、腎臓透析、および心筋梗塞に伴う再潅流を含めた手術後の脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術が含まれる。これらは最も一般的に、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）の最中かまたはその後で起こる。米国では毎年、６００，０００件のＣＡＢＧ手術が行なわれており、心肺バイパス患者全体のうちの２５％は手術後
三ヶ月以内に神経障害を示す。 脳を損傷させる疾病
アルツハイマー病（ＡＤ）は、西欧諸国の大きな健康上の負担である。ＡＤは高齢者の最も一般的な認知症の形式であり、世界で推定二千万人がこの病気にかかっている。ＡＤの発生率は老人増加の人口が増加するにつれて次の２５年間で二倍になると予想されている。英国ではＡＤ罹患者のケアにかかる年間コストが約一兆一千万円（５５億ポンド、１ポンド＝約２００円で換算）を超える。現在まで、アルツハイマー病のための基地の治療法は存在せず、アルツハイマー病の進行を実質的に遅らせる治療方法は（アセチルコリンエステラーゼ阻害因子以外は）ほとんど示されていない。
【０００５】
多発性硬化症（ＭＳ）は若年青年の間で最も一般的な身体に障害を引き起こす神経学的疾病であり、英国では約８５，０００人、西欧諸国では５０万人以上に常に影響を及ぼしている。ＭＳは２０歳から４０歳の間の人で最も頻繁に診断され、女性では男性のほぼ２倍その疾患を発現する可能性がある。多発性硬化症は優先的に北欧系の人々を優先的にターゲットにするように思われる。ＭＳは、ニューロンを取り囲むミエリン鞘の損失と、それによって生じる進行的なニューロンの機能不全および神経細胞損失により特徴付けられる自己免疫疾患である。患者は、視力障害および失明、運動および／または感覚機能の損失、ならびに腸機能および尿機能に関する問題を含む広範な問題を経験する。
【０００６】
神経の損傷および／または細胞死を引き起こすことが知られている他の疾病には、パーキンソン病および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病が含まれる。
他の脳障害の形式には、細菌またはウイルス感染、アルコール、腫瘍の化学療法、および腫瘍の放射線療法により引き起こされる免疫学的損傷、化学的損傷、または放射線損傷が含まれる。
【０００７】
ガラニン
２９アミノ酸から成る神経ペプチドであるガラニン（非特許文献１）は中枢神経系および末梢神経系の両方で広範に発現しており、また多くの典型的な神経伝達物質の数の放出を減少させることによりシナプス伝達に対する強い阻害作用を有している（非特許文献２−７）。このような阻害作用により、
ａ）作動記憶（非特許文献８）および長期電位（ＬＴＰ、記憶と電気生理学的相関があると考えられている）（非特許文献９）の低下、
ｂ）発作の機能活動が起こりやすい傾向の減少に伴う海馬の興奮の減少（非特許文献１０）、および
ｃ）無傷動物（intact animal）におけるおよび神経損傷後の侵害刺激反応の顕著な阻
害（非特許文献１１）、
を含む多様な生理学的効果が生じる。
【０００８】
ガラニンのこれらの神経調節作用は、神経系のペプチドによって果たされている主な役割と、長い間みなされていた。しかしながら現在、それらの多くの神経系への損傷がｍＲＮＡレベルとペプチドレベルの両方でガラニンの発現を顕著に引き起こすという大きな一連の証拠が存在する。そのような病変研究の例には、
ａ）末梢神経軸索切断後の後根神経節（ＤＲＧ）（非特許文献１２）、
ｂ）下垂体切除後の視床下部の大形細胞の分泌ニューロン（非特許文献１３）、
ｃ）前頭頭頂葉皮質の切除（剥皮術）後の背側縫線核および視床（非特許文献１４）、
ｄ）内嗅皮質病変後の海馬の分子層（非特許文献１５）、ならびに
ｅ）海馬采脳弓脚線維束の切断後の内側中隔（ＭＳ）および垂直脚対角帯（ｖｄＢ）（非特許文献１６）、
におけるガラニンのアップレギュレーションが含まれる。
【０００９】
これらの研究により、多くの研究者は、ガラニンがその典型的な神経調節効果に加えて
、細胞を生存させまたは増殖を促進する役割を果たす可能性があることを推測するに至った。
【００１０】
この仮説を試験するために、トランスジェニック動物を作製し、ガラニン遺伝子における機能喪失型変異および機能獲得型変異を生じさせた（非特許文献１７−２０）。ガラニンノックアウト動物の表現型分析から、驚いたことに、ガラニンが成長中の末梢および中枢神経系のニューロンのサブセットに対して生存因子として作用することが明らかとなった（非特許文献２１）。最近では、このニューロンの生存の役割が成人ＤＲＧにも関連することが明らかになっている。感覚ニューロンは、ＰＫＣ依存的な様式で第２のガラニン受容体サブタイプの活性化によって媒介され、ガラニンに依存して損傷後に軸索を伸長する（非特許文献２２）。従って、ガラニンは中枢神経系に同様の様式で作用し、脳障害、脳損傷または脳疾患の動物モデルにおける細胞死を低減する可能性があると仮定された。
【００１１】
特許文献１は、ヒトガラニンの配列を開示している。モルヒネの効果を増強するためにラットガラニンまたはそのＮ末端断片を投与することを含めて他の研究者による研究が論じられている。特許文献１が、ガラニンがそれ単独でまたは他の鎮痛剤と組み合わせて投与され得るように鎮痛効果を示すと期待できることを示唆している。特許文献１は痛みの治療におけるガラニンまたはその類似体（analog）の使用方法ならびに特定の他の症状の治療におけるガラニン拮抗薬の使用方法を権利主張している。
【００１２】
特許文献２は、多くの推定ガラニン拮抗薬を開示している。記載されている拮抗薬はすべて、ガラニンの最初の１２のアミノ酸に、他のペプチド（例えばキメラペプチド）の部分的配列が続いているものに基づいている。受容体のサブタイプに依存して、作動薬であると思われるものもあれば、拮抗薬であると思われるものもあり、その両方であると思われるものもある。特許文献２は、アルツハイマー病型の認知症および腸疾患を含むインスリン関連疾患、成長ホルモン関連疾患、アセチルコリン関連疾患、ドーパミン関連疾患、サブスタンスＰ関連疾患、ソマトスタチン関連疾患、およびノルアドレナリン関連疾患、ならびに内分泌学、摂食行動、神経病学および精神医学の分野における疾患の治療に有益な拮抗薬を開示している。かかる拮抗薬は鎮痛剤としても有用であり得る。特許文献２は、グルコース刺激によるインスリン放出のガラニンによる阻害；スコポラミン誘導のアセチルコリン（ＡＣｈ）の海馬での放出のガラニンによる阻害；屈筋反射のガラニンによる促進；膜結合試験における結合ヨウ化ガラニンの移動；を始めとする種々の効果に対する特許文献２に記載されているいくつかの拮抗薬を使用した研究結果を開示している。特許文献２には、そのような拮抗薬が鎮痛用に示され得ることを示唆しているが、そのような効果に対する結果を特許文献２では開示していない。ガラニン作動薬の使用方法に関しては積極的または有益な権利請求はなされてない。
【００１３】
非特許文献２３は、マウスの記憶過程に対するガラニンの影響の研究について記載している。結果は、ガラニンが記憶および他の認識機能を損ない、ガラニンの中間用量が特に記憶喪失を誘発することを示唆している。ガラニン作動薬の使用方法に関しては積極的または有益な権利請求はなされていない。
【００１４】
特許文献３は、アルツハイマー病の予防および治療のためのガラニン拮抗物質として有用と期待される、ガラニンのインシュリン分泌抑制作用を効果的に阻害する合成ペプチドおよび誘導体を開示している。
【００１５】
非特許文献２４は、その当時のガラニンの作用の知見を要約し、一連の高親和性ガラニン拮抗薬について説明した概要論文である。この概要は、ガラニン拮抗薬がアルツハイマー病の治療に有用であり得ることを示している。
【００１６】
非特許文献２５は、基本のおよび卵胞ホルモン刺激性のプロラクチン産生ならびにプロラクチンホルモンの放出へのガラニンの関与について論じている。
特許文献４は、ヒトガラニンのアミノ酸配列を有するペプチドおよび該ペプチドをコードするＤＮＡクローンを開示している。特許文献４は、ガラニンが膵活性に役割を果たす可能性を示唆しており、膵活性を調節する方法または成長ホルモンの生産を刺激する方法であって、開示されたペプチドの使用方法を含む方法について権利請求している。
【００１７】
特許文献５は、ガラニン拮抗薬を識別するためのヒトガラニンをコードするＤＮＡおよび方法を開示している。
特許文献６−９は、ＧＡＬＲ２（第２のガラニン受容体サブタイプ）をコードするＧＡＬＲ２ ｃＤＮＡならびにＧＡＬＲ２に特異的に結合する化合物を識別する方法を開示している。ＧＡＬＲ２拮抗薬がアルツハイマー病の治療に有効であり得るとの言及がある。化合物がＧＡＬＲ２作動薬か否かに基づいて、脳障害の予防用または治療用の化合物を選択する方法についての開示はない。
【００１８】
非特許文献２６は、その当時のガラニンの作用についての知見を概説した概要論文である。非特許文献２６は、中枢に投与したガラニンがラットの学習および記憶の作業に血管を生じさせること、およびガラニン拮抗薬の使用がアルツハイマー病の治療に有用であり得ることを示している。アルツハイマー病の治療のためのガラニン作動薬の使用については言及されていない。
【００１９】
非特許文献２７は、ラットの中枢流体振動によって引き起こされる外傷性脳障害（ＴＢＩ）の程度に対するガラニンの脳室内注射の影響について説明しており、ガラニン処理されたラットが様々な感覚運動作業において欠点が少ないことを示した。この論文は、そのような影響をガラニンの神経調節作用であって、グルタミン酸等の興奮性のアミノ酸の放出が減少することに起因すると考えているが、記憶試験（モリス水迷路試験）ではガラニン処理ラットと非処理ラットの間に差が無かった。
【００２０】
非特許文献２８は、慢性の苦痛状態の発達の測定手段としての、除脳し脊髄化した無麻酔状態のラットの屈筋反射の興奮性に対する坐骨神経の急性の切断の影響を調べた研究である。ガラニンが苦痛反応を阻害するのに有用であり得ることが判明した。脳障害、脳傷害または脳疾患の予防または治療へのＧＡＬＲ２作動薬の使用についての言及はない。
【００２１】
特許文献１０は、野生型マウスと比較して、ガラニン遺伝子欠損マウスで、破壊障害からの回復（坐骨神経の感覚軸索の再生能を示す）、成長中のニューロンの生存、および長期電位（ＬＴＰ）が低減されることを開示している。これらの結果から、ガラニン作動薬が神経損傷の修理用の薬剤の調製に使用するのに適当である可能性が示唆された。また、ガラニン作動薬がアルツハイマー病および関連の記憶喪失の治療においても有用であることが言及されている。しかしながら、どのガラニン受容体サブタイプがそのような結果を媒介するか、および、アルツハイマー病以外の障害、損傷または疾病から中枢神経系を保護する際のガラニン作動薬の影響については言及されていなかった。
【００２２】
さらに特許文献１０は、特許文献１１と共に、ガラニン遺伝子を欠損するように作製された哺乳動物、特にマウスについて説明している。
特許文献１２は、癲癇（てんかん）で起こるような痙攣を治療するために使用可能な一連のガラニン作動薬化合物を開示している。そのような化合物を無酸素症による損傷を予防するためにＣＮＳ障害にまたは心臓切開手術に使用し得ることを言及しているが、特許文献１２に含まれる実験結果はすべて痙攣の治療に関するため、その根拠は存在しない。特許文献１２の発明者がその一部を構成している研究グループは、続いて、それらの化合物のうちの一つである「ガルノン（galnon）」という化合物に関する情報を公表した（非
特許文献２９）ガルノンはＧＡＬＲ１とＧＡＬＲ２を等しく活性化し、両方に対して作動的な活性を有する。さらに、最近の仕事は、このガルノンがニューロテンシン受容体を含む多くの他のＧＰＣＲ受容体をも活性化することを示している（非特許文献３０，３１）。このガルノンはそのガラニン受容体の活性について特異的でなく、ＧＡＬＲ２特異的作動薬でもない。特許文献１２は苦痛、癲癇の治療におけるガルノンの使用方法を権利主張しているが、脳障害、脳外傷または脳疾病の治療でのそのような化合物の使用に関して特に権利主張しているわけではない。
【００２３】
非特許文献３２−３４は癲癇、オピオイド依存性、および摂食に関する研究におけるガルノンの使用についてそれぞれ論じている。
ガラニン受容体
３つのＧタンパク質共役型ガラニン受容体サブタイプであるＧＡＬＲ１，ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３が同定されている（非特許文献３５−４４）。ＧＡＬＲ１およびＧＡＬＲ３へのガラニンの結合は抑制性Ｇiタンパク質への共役によりアデニルシクラーゼを阻害
することが示されている（Wang, 1998、非特許文献３５、および非特許文献４４）。これとは対照的に、ＧＡＬＲ２の活性化は、Ｇq/11への共役によりホスホリパーゼＣおよびプロテインキナーゼＣ活性を刺激する（Fathi, 1997、非特許文献３７、非特許文献３９お
よび非特許文献４５）し、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）カスケードを活性化する。アデニリルシクラーゼへのＧＡＬＲ１およびＧＡＬＲ３の負の共役は、神経損傷または疾病後にニューロンの機能に抑制的効果を有すると予想される。また、そのような共役は、挙動（behavior）に否定的で望ましくない影響を及ぼし、傷害および疾病後の回復を阻害するかまたは遅延させるとも予想される。さらに、ＧＡＬＲ１とＧＡＬＲ３はいずれも心臓および腸で発現しており、ＧＡＬＲ１は肺および膀胱でも発現している。
【００２４】
受容体サブタイプに特異的な抗血清が無いことおよび受容体サブタイプに特異的なガラニンリガンドが不足していることで、各受容体によって果たされる機能的役割の分析が阻まれ続けていた。この分野における主な進歩は、ガラニン２−１１（ＡＲ−Ｍ１８９６と称する）が、ペプチドＧＡＬＲ１と比べて５００倍の特異性で、かつＧＡＬＲ１活性化をほぼ完全に喪失した状態で、ＧＡＬＲ２に優先的に結合することを発見したことである（非特許文献４６および非特許文献４７）。ＡＲ−Ｍ１８９６がＧＡＬＲ３に結合するか、または活性化させるか否かについて公表されたデータはない。ＡＲ−Ｍ１８９６は以前、ＧＡＬＲ２の活性化が、ガラニンが成人の末梢神経系の感覚ニューロンからの神経突起の成長を刺激する主要な機序であるらしいことを実証するために使用された（非特許文献２２）。ガラニン１−１５ペプチドおよびガラニン１−１６ペプチドもガラニン受容体を活性化する完全長ガラニン神経ペプチドの一部分であることがわかっている。
【００２５】
本明細書全体を通じて、用語「ＧＡＬＲ」は、ＧＡＬＲ１，ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３から成る受容体のグループのうちの１つである受容体を示す。かかるグループは、ヒト、ラットおよびマウスの受容体を含むが、それらに限定されるわけではない。さらに受容体は、キメラ型（すなわち異なる種由来のＧＡＬＲ配列を含む）、切断型（すなわち天然ＧＡＬＲ配列よりも短い）、または延長型（すなわち天然ＧＡＬＲ配列を超える追加配列を含む）であってもよい。受容体の活性化は、例えば、細胞内のカルシウムレベルの増加によって決定することが可能である。
【００２６】
本明細書全体を通じて、用語「ＧＡＬＲ２特異的作動薬」は、その物質によるＧＡＬＲ２の活性化の結果として細胞内での応答を引き起こすことができる物質であって、ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３を活性化しない（あるいは少しの効力でしか活性化しない）物質のことを示す。ある化合物がガラニン受容体の作動薬か否かを識別する方法は当該技術分野で周知である（例えば非特許文献４８および非特許文献４９）。ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ１の結合および活性化と比較して、少なくとも３０倍の選択性で、
好ましくはＧＡＬＲ１に比べて５０倍よりも大きい選択性で、より好ましくはＧＡＬＲ１に比べて１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２と優先的を結合および活性化する。ＧＡＬＲ２特異的作動薬はさらに、ＧＡＬＲ３の結合および活性化と比較して、少なくとも３０倍の選択性で、好ましくはＧＡＬＲ３と比べ５０倍よりも大きい選択性で、より好ましくはＧＡＬＲ３と比べ１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２と優先的を結合および活性化する。
【特許文献１】ＷＯ９２／１２９９７
【特許文献２】ＷＯ９２／２０７０９
【特許文献３】ＪＰ−Ａ−６１７２３８７
【特許文献４】ＷＯ９２／１５６８１
【特許文献５】ＷＯ９２／１５０１５
【特許文献６】ＷＯ９７／２６８５３
【特許文献７】ＵＳ２００３／０１２９７０２
【特許文献８】ＵＳ２００３／０２１５８２３
【特許文献９】ＵＳ６，５８６，１９１
【特許文献１０】ＥＰ−Ａ−０９１８４５５
【特許文献１１】ＥＰ−Ａ−１３４２４１０
【特許文献１２】ＷＯ０２／０９６９３４
【非特許文献１】Tatemoto et al. (1983) FEBS Lett. 164 124-128
【非特許文献２】Fisone et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 7339-7343
【非特許文献３】Misane et al. (1998) Eur. J. Neurosci. 10 1230-1240
【非特許文献４】Pieribone et al. (1995) Neurosci. 64 861-876
【非特許文献５】Hokfelt et al. (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 863 252-263
【非特許文献６】Kinney et al. (1998) J. Neurosci. 18 3489-3500
【非特許文献７】Zini et al. (1993) Eur. J. Pharmacol. 245 1-7
【非特許文献８】Mastropaolo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 9841-9845
【非特許文献９】Sakurai et al. (1996) Neurosci. Lett. 212 21- 24
【非特許文献１０】Mazarati et al. (1992) Brain Res. 589 164-166
【非特許文献１１】Wiesenfeld et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 3 334-3337
【非特許文献１２】Hokfelt et al. (1987) Neurosci. Lett. 83 217-220
【非特許文献１３】Villar et al. (1990) Neurosci. 36 181-199
【非特許文献１４】Cortes et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 7742-7746
【非特許文献１５】Harrison & Henderson (1999) Neurosci. Lett. 266 41-44
【非特許文献１６】Brecht et al. (1997) Brain Res. Mol. Brain Res. 48 7-16
【非特許文献１７】Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132
【非特許文献１８】Holmes et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 11563-11568
【非特許文献１９】Steiner et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 4184-4189
【非特許文献２０】Blakeman et al. (2001) Neuroreport 12 423- 425
【非特許文献２１】Holmes, 2000; O'Meara et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 11569-11574
【非特許文献２２】Mahoney et al. (2003) J. Neurosci. 23 416-421
【非特許文献２３】Ukai et al. (1995) Peptides 16 1283-1286
【非特許文献２４】Bartfai et al. (1992) TiPS 13 312-3
【非特許文献２５】Wynick et al. (1993) Nature 364 529-532
【非特許文献２６】placeCrawley (1996) Life Sci. 58 2185-2199
【非特許文献２７】Liu et al. (1994) J. Neurotrauma 11 73-82
【非特許文献２８】Luo et al. (1995) Neuropeptide 28 161-166
【非特許文献２９】Wu et al. (2003) Eur. J. Pharmacol. 482 133- 137
【非特許文献３０】Wang et al., Functional activity of galanin peptide analogues. Program No. 960.4 2004 Abstract Viewer/Itinerary Planner. placeCityWashington StateDC
【非特許文献３１】非特許文献３１のオンライン版 Society for Neuroscience, 2004. Online. (http ://sfn. scholarone. com/itin2004/index. html
【非特許文献３２】Saar et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 7136-7141
【非特許文献３３】Zachariou e al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U . S. A. 100 9028-9033
【非特許文献３４】Abramov et al. (2003) Neuropeptides 38 55-61
【非特許文献３５】Habert-Ortoli et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 9780-9783
【非特許文献３６】Burgevin et al. (1995) J. Mol. Neurosci. 6 33-41
【非特許文献３７】Howard et al. (1997) FEBS Letts. 405 285-290
【非特許文献３８】Smith et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 24612-24616
【非特許文献３９】Wang et al. (1997a) Mol. Pharmacol. 52 337-343
【非特許文献４０】Wang et al. (1997b) J. Biol. Chem. 272 31949-31953
【非特許文献４１】Ahmad et al. (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 863 108-119
【非特許文献４２】Bloomquist et al. (1998) Biophys. Res. Commun. 243 474-479
【非特許文献４３】Kolakowski et al. (1998) J. Neurochem. 71 2239-2251
【非特許文献４４】Smith et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 23321-23326
【非特許文献４５】Wittau et al. (2000) Oncogene 19 4199-4209
【非特許文献４６】Liu et al, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. placecountry-regionUSA 98 9960-9964
【非特許文献４７】Berger et al. (2004) Endocrinology 145 500-507
【非特許文献４８】Botella et al. (1995) Gastroenterology 108 3-11
【非特許文献４９】Barblivien et al. (1995) Neuroreport 6 1849-1852.
【００２７】
（発明の開示）
本発明の第１の態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療用の薬物の調製におけるＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用方法が提供される。
【００２８】
有利なことに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用により、ガラニンおよびガラニン作動薬がそのような状況での細胞死を減少させる能力がある結果として、脳障害、脳損傷または脳疾患を患っている個体の脳障害、脳損傷または脳疾患が予防されるか、またはそのような個体の症状が改善される。ＧＡＬＲ１および／またはＧＡＬＲ３を活性化させないＧＡＬＲ２特異的作動薬は脳障害または脳疾患を治療する効果があり、それら３つの受容体の各々により利用されるシグナルカスケードが異なる結果、ＧＡＬＲ１またはＧＡＬＲ３の活性化による望ましくないまたは有害な末梢の副作用を最小限にする。
【００２９】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷は過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷は放射線療法の結果であり得る。
【００３０】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００３１】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００３２】
本発明の第２の態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する方法であって、そのような予防または治療を必要とする個体に有効量のＧＡＬＲ２特異的作動薬を投与することを含む方法が提供される。
【００３３】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされ得る。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷は過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷は放射線療法の結果であり得る。
【００３４】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００３５】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００３６】
本発明の第２態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する化合物の候補を選択する方法であって、少なくとも１つの試験化合物はＧＡＬＲ２特異的作動薬であるか否かを決定し、少なくとも１つの試験化合物がＧＡＬＲ２特異的作動薬である場合に該少なくとも１つの試験化合物を候補化合物として選択することを含む方法が提供される。
【００３７】
少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間の結合親和性でＧＡＬＲ２と結合することが決定され得る。試験化合物は、ＧＡＬＲ１への結合に比べて３０倍よりも大きい選択性で、好ましくは５０倍よりも大きい選択性で、最も好ましくは１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２に結合する。好ましくは、試験化合物はさらに、ＧＡＬＲ３への結合に比べて３０倍よりも大きい選択性で、好ましく
は５０倍よりも大きい選択性で、最も好ましくは１００倍よりも大きい選択性で、ＧＡＬＲ２に結合する。
【００３８】
ＧＡＬＲ２はヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一部分を含んでもよく、完全長のヒトＧＡＬＲ２であってもよい。
ＧＡＬＲ２は非ヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一の部分を含んでもよく、ラットＧＡＬＲ２またはマウスＧＡＬＲ２であってもよく、または完全長ＧＡＬＲ２であってもよい。
【００３９】
ＧＡＬＲ２はキメラ受容体構築物であってもよい。
本発明の上記態様による方法を用いて、試験化合物の選択がハイスループットスクリーニング検定によりスクリーニングされ得る。
【００４０】
本発明の第４態様によれば、脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療に使用される医薬組成物であって、
ａ）有効量の少なくとも１つのＧＡＬＲ２特異的作動薬または医薬として許容されるその塩；および
ｂ）医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤；
を含む組成物が提供される。
【００４１】
脳障害または脳損傷は、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされ得る。免疫学的損傷は細菌またはウイルス感染の結果であり得る。化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果であり得る。放射線損傷が放射線療法の結果であり得る。
【００４２】
脳疾患は、好ましくはアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬はガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドであってよく、好ましくはＡＲ−Ｍ１８９６である。
【００４３】
代わりに、ＧＡＬＲ２特異的作動薬は非ペプチドの小さな化学物質であってもよい。
ＧＡＬＲ２特異的作動薬は、０から１００μＭの間、好ましくは０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有し、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。さらにＧＡＬＲ２特異的作動薬は、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性、好ましくは５０倍よりも大きい結合特異性、最も好ましくは１００倍よりも大きい結合特異性を有し得る。
【００４４】
医薬組成物は経口投与されても非経口的に投与されてもよく、好ましくは経口投与される。
医薬組成物が経口投与される場合、それはカプセルまたは錠剤の形をしていてもよく、好ましくはラクトースおよび／またはコーンスターチを含んでいてもよい。医薬組成物はさらに、潤滑剤、好ましくはステアリン酸マグネシウムを含んでいてもよい。医薬組成物は水性懸濁液または水溶液の形をしていいてもよく、さらに乳化剤または懸濁剤のうちの少なくとも一つを含んでいてもよい。医薬組成物は甘味剤、着香料、または着色剤のうちの少なくとも一つを含んでいてもよい。
【００４５】
医薬組成物は、注射により、無針装置により、吸入スプレーにより、局所に、直腸に、
経鼻で、口腔に、膣内に、または埋設したリザーバを介して投与され得る。
医薬組成物が注射または無針装置によって投与される場合、それは無菌の注射可能な製剤の形をしていてもよく、無針装置による投与に適した剤形をしていてもよい。無菌の注射可能な製剤または無針装置による投与に適した剤形は、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液であってよい。水性懸濁液は、マンニトール、水、リンゲル液または等張食塩水に溶かして調製され得る。油性懸濁液は、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸または天然の医薬として許容される油に溶かして調製され得る。脂肪酸はオレイン酸またはオレイン酸グリセリド誘導体であり得る。天然の医薬として許容される油は、オリーブ油、ヒマシ油またはポリオキシエチル化オリーブ油、またはヒマシ油である。油性懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤、好ましくはＰｈ．Ｈｅｌｖを含んでもよい。
【００４６】
医薬組成物が直腸に投与される場合、それは直腸投与用の坐薬の形をしていてもよい。坐薬は、室温で固体かつ直腸温で液体になる非刺激性の補形剤を含んでよい。非刺激性の補形剤は、カカオ脂、蜜ろうまたはポリエチレングリコールのうちの１つであってよい。
【００４７】
医薬組成物が局所に投与される場合、それはミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水から選択されるキャリアを含む軟膏であってよい。代わりに、それはミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水から選択されたキャリアを含むローションまたはクリームであってもよい。
【００４８】
医薬組成物が経鼻で投与される場合、それは鼻エアゾールおよび／または吸入により投与されてもよい。
本発明の第５態様によれば、細胞死を抑制する方法であって、細胞死を抑制するのに有効な量のＧＡＬＲ２特異的作動薬と細胞を接触させることを含む方法が提供される。細胞がニューロンであってよく、好ましくは中枢神経系由来のニューロンであり、好ましくは海馬または皮質のニューロンである。好ましくは、細胞はヒト細胞である。この方法において、細胞中に存在するＧＡＬＲ２の活性化の結果として細胞死は抑制される。細胞死が起こる確率が下がるか、細胞の生命が延長されるかのいずれかが起これば、細胞死は抑制される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明の実施形態を図１−４を参照しながらあくまで例示として説明する。
動物
動物はすべて、標準固形飼料および水を自由摂取させた。動物の世話と手順は英国ホームオフィスのプロトコルおよびガイドラインの範囲で行なった。
【００５０】
ガラニンノックアウトマウス
系統と育種の履歴についての詳細は以前に刊行物で発表されている（Wynick et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 12671-12676）。簡単に説明すると、ガラニン遺伝子に標的変異についてホモ接合型のマウスをＥ１４細胞系を用いて作製した。逆方向のＰＧＫ−Ｎｅｏカセットを使用して、エキソン１−５を置換し、突然変異体を同型接合性に育種し、１２９ ＯｌａＨｓｄ系統で同系交配した。週齢および性別が一致する野生型の同腹仔をすべての実験でコントロールとして使用した。
【００５１】
ガラニン過剰発現マウス
系統と育種の履歴についての詳細は以前に刊行物で発表されている（Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132）。簡単に説明すると、ガラニン過剰発現マウスをＣＢＡ
／Ｂ６第１世代雑種のバックグラウンドで作製した。マウス１２９ｓｖコスミドゲノムライブラリーをスクリーニングして、マウスガラニンのコード領域全体と約２０ｋｂの上流配列を含む約２５ｋｂの領域をサブクローニングした。導入遺伝子を制限酵素によって切断し、５ｎｇ／μｌの採集濃度で受精卵母細胞に微量注入した。以前に記載されていたように（Bacon et al. (2002) Neuroreport 13 2129-2132）、４つのガラニン過剰発現トランスジェニック系統が生じ、海馬におけるガラニン発現を免疫細胞化学によって評価した（以下を参照）。４６系統は、他の３つ系統および野生型コントロールと比較して、海馬のＣＡ１およびＣＡ３領域ならびに歯状回において最も高レベルのガラニン発現を有することが判明した。したがって、後続のすべての実験には４６系統を使用した。
【００５２】
海馬の器官培養
器官培養は以前に記載されていた通りに準備した（Elliott-Hunt et al. (2002) J. Neurochem. 80 416-425; Stoppini et al. (1991) J. Neurosci. Methods 37 173-182）。
簡単に説明すると、５−６日齢の子からの海馬を、解剖顕微鏡下で迅速に除去し、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織切断機（Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.社、英国Gomshall所在）を使用して４００μｍで横方向に切断した。切片は、６ウェルプレートにＥａｒｌｅの塩類は含むがＬ−グルタミンは含まない５０％の最小基礎培地（Gibco BRL社、英国 Paisley所在）、５０％のハンクス平衡塩類溶液（Gibco BRL社）、２５％のウマ血清（加熱不活性化済；Harlan Serum Labs社、英国Loughborough所在）、５ｍｇ／ｍｌグルコース（Sigma Chemical Co. 社、英国Poole所在）、および１ｍｌグルタミン酸（Sigma社）を入れた微孔性膜貫通型ｂｉｏｐｏｒｅ（登録商標）膜（Millipore社,英国Poole所在）上で、
９５％の空気および５％のＣＯ2の中、３７℃で培養した。
【００５３】
初代ニューロン培養物の調製
２−３日齢の子から海馬を切除し、ハンクス平衡塩類溶液（カルシウムおよびマグネシウムを含まない）（Gibco BRL社、英国 Paisley所在）、１０％（ｖ／ｖ） Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ICN Biomedicals Inc.社、米国オハイオ州Aurora所在）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン（Britannia Pharmaceuticals Ltd.社、英国Surrey, Redhill所在）、１００ｍｌ量の０．０５ｍｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン（Sigma Chemical Company 社、英国Poole, Dorset所在）および０．５％（ｖ／ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ICN Biomedicals Inc.社、米国オハイオ州Aurora所在）を用いて調製した４℃の収集緩衝液に入れた。海馬ニューロンの酵素による消化、単離、および培養を以前に記載されている通りに行った（McManus & Brewer (1997) Neurosci. Lett. 224 193-196）細胞数を計測し、Ｄ−Ｌ−ポリ−オルニチン（Sigma社）コートした９６ウェルプレートに４０，０００細胞／ウェルになるよう蒔いた。２４時間後、１０μｇ／ｍｌ ５’フルオロ２’デオキシウリジン（Sigma社、 有糸分裂阻害剤）は添加した。実験前の９日間、培養物を周囲の酸素および５％ ＣＯ2で３７℃でイ
ンキュベートした。培地は最初の３日後と、その後は四日ごとに変えた。
【００５４】
免疫組織化学
マウスを４％ パラホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）で心臓内潅流した。脳を室温で除去し、その後４時間固定した。その後、脳は２０％のスクロースで４℃にて一晩平衡化し、最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（Tissue Tek Ltd社、英国Eastbourne所在）の封入剤に包埋し、ドライアイスで冷凍し、低温切削した（３０μｍの切片）。切片を１０％ 正常ヤギ血清／ＰＢＳ ０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ−１００（ＰＢＳＴ）で室温にて１時間ブロックし、透過処理した。その後、切片を、１：１０００でＰＢＳＴに溶かしたガラニンに対するウサギのポリクローナル抗体(Affinity社、英国Nottingham所在)で室温にて一晩インキュベートし、ＰＢＳで３×１０分洗浄し、１：８００でイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）−ヤギ（The Jackson La boratory社、米国ペンシル
ベニア州Westgrove所在）で室温にて３時間インキュベートした。洗浄後、切片をＶｅｃ
ｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Vector Laboratories Inc.社、米国カリフォルニア州Burlington所在）に装着した。画像を、ライカ蛍光顕微鏡（(Leica Microsystems社、英国Milton Keynes所在)を使用して、ＲＴ Ｃｏｌｏｒ ＳｐｏｔカメラおよびＳｐｏｔ Ａ
ｄｖａｎｃｅ画像撮像システム・ソフトウェア（Diagnostic Instruments社、米国ミズーリ州Sterling Heights所在）で得た。
【００５５】
４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｔｒｉｔｏｎ−１００で透過処理し、上述のように処理した分散された海馬ニューロンおよび器官培養物についても、ガラニン免疫組織化学を行った。
【００５６】
スタウロスポリンおよびグルタミン酸により誘発した海馬の損傷
１４日目の海馬の器官培養物を０．１％ＢＳＡの無血清培地に１６時間入れ、その後様々な濃度のグルタミン酸と共に３時間、スタウロスポリンと共に９時間、インキュベートした。スタウロスポリンおよびグルタミン酸はともにそのような細胞培養物に興奮毒性の損傷を引き起こすことが分かっている（Prehn et al. (1997) J. Neurochem. 68 1679-1685; Ohmori et al. (1996) Brain Res. 743 109-115）。培養物を無血清培地で洗浄し、
画像処理の前にさらに２４時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウムの存在下で実験を行うことにより、器官培養物においてニューロンの障害の局所的パターンが観察された。細胞膜の障害後に、染料が細胞に入り、核酸に結合し、蓄積し、細胞を明るく蛍光にした（Vornov et al. (1994) Stroke 25 457-465）。ＣＡ１ニューロン亜領域が明視野イメージではっきり見えた。ＣＡ１領域を含むエリアにおけるニューロンの損傷を、背景を超えるシグナルを確立するために、ＮＩＨイメージソフトウェア（Scion Image社、米国メ
リーランド州所在）で密度スライス機能を使用して評価した。排他染料であるヨウ化プロピジウムを発現している亜領域のエリアを測定し、明視野イメージで評価される亜領域のエリアの合計面積の割合として表わした。さらに、密度スライス機能を使用する場合にパラメータを正確に設定することを一貫するために、１０ｍＭグルタミン酸に暴露した陽性コントロールの培養物のセットに対して閾値を設定した。
【００５７】
９日目に、初代海馬培養物を２４時間スタウロスポリンに暴露した。ニューロンの生存率は、生存／死亡キット（Molecular Probes社、オランダ国Lieden所在）を使用して、生きたニューロンと死んだニューロンをマニュアルで計数することにより測定した。
【００５８】
処理
器官型または分散型の初代海馬培養物を、以下の化学物質を添加するか添加しないで、様々な時間、培養した：スタウロスポリン（Sigma社）、Ｌ−グルタミン酸（Sigma社）、ガラニンペプチド（Bachem社、英国Merseyside所在）、高親和性ＧＡＬＲ２特異的作動薬ＡＲ−Ｍ１８９６［Ｇａｌ（２−１１）Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＮＨ2］（AstraZeneca社、カナダ国ケベック州Montreal所在）、アミロイド−ベータ（１−４２）（Ａβ（１−４２））および逆Ａβ（４２−１）ペプチド（American Peptide Company, ９３９０６ カリフォルニア州Sunnyvile所在）。以下の実験で使用する前に、Ａβ（１−４２）を培養培地中で予めインキュベ
ートすることにより原繊維を形成するよう誘導した。詳細には、０．４５ｍｇのＡβペプチドを２０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−Sigma社）に溶解し、培地で１００
μＭのストック溶液になるよう希釈した。これを穏やかに振盪して室温で２４時間インキュベートした。
【００５９】
カイニン酸により誘発した海馬の障害
８週齢の雌のマウスにカイニン酸（Tocris Cookson社、英国 Bristol所在）（２０ｍｇ／ｋｇ）または賦形剤（vehicle）（ＰＢＳ、１ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射した。カイニ
ン酸は以前に記載されているように海馬の障害を引き起こすことが分かっている(Beer et
al. (1998) Brain Res. 794 255-266; Mazarati et al (2000) J. Neurosci. 16 6276-6281).海馬の細胞死は、末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介フルオレセイン−ｄＵＴ
Ｐニック末端ラベル（ＴＵＮＥＬ）によって測定した。動物はカイニン酸または賦形剤を注射した７２時間後に屠殺した。マウスを、４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳで心臓内潅流し、脳を迅速に除去し、その後室温で４時間固定した。脳を２０％のスクロースで４℃にて一晩平衡化し、最適切削温度（ＯＣＴ）封入剤に包埋し、ドライアイスで冷凍した。切片を低温保持装置で切断（１６μｍ）し、ゼラチンコートしたスライド上に載せて回答し、使用するまで−８０℃で保存した。アポトーシスは、インサイチュ細胞検出キット（Boehringer社、米国Berkshire所在）の使用により評価した。第６番目ごとの切片を
収集し、メタノールでブロックし、ｔｒｉｔｏｎ（０．１％）およびクエンナトリウム（０．１％）で透過処理し、加湿ボックス中で１時間、３７℃にてフルオレセインｄＵＴＰで標識した。その後、切片を西洋わさびペルオキシダーゼと結合させ、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と共に共存させ、ヘマトキシンで対比染色した。コントロールは、フルオレセインｄＵＴＰの標識を付けるのを省略した以外は、同じ取り扱いを受けた。洗浄後に、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）（Vector Labs Inc.社）に装着した。細胞を、ライカ蛍光顕微鏡（(Leica Microsystems社、英国Milton Keynes所在)を使用して、Ｒ
Ｔ Ｃｏｌｏｒ ＳｐｏｔカメラおよびＳｐｏｔ Ａｄｖａｎｃｅ画像撮像システム・ソフトウェア（Diagnostic Instruments社、米国ミズーリ州Sterling Heights所在）で得た。
【００６０】
ＥＡＥモデル
ＭＳの標準的なＥＡＥモデルを以前に記載された通りに使用した（Radu et al. (2000)
Int. Immunol. 12 1553-60）マウスを、４ｍｇ／ｍｌのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト結核菌）株であるＨ３７ＲＡ（Difco社、ミシガン州Detroit所在）を添加した完全フロイントアジュバント（Sigma社）で懸濁した全量２００μ
ｇのＭＢＰ １−９（ＡｃＡＳＱＫＲＰＳＱＲ、Abimed社、ドイツ国Langenfeld所在により合成）で片方の後肢で皮下に免疫した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの生成タンパク質誘導体（ＰＰＤ）は、UK Central Veterinary Laboratory (英国Weybridge所在)より入手した。マウスはＥＡＥの徴候に関して、以下のようにスコアを付けた：０、徴候無し；１、尾の弛緩；２、部分的な後肢の麻痺および／または立ち直り反射の障害；３、完全な後肢の麻痺；４、後肢と前肢の麻痺；５、瀕死または致死。
【００６１】
統計分析
データは平均＋ＳＥＭとして示す。グループ内のスタウロスポリン濃度の差を分析するのに、スチューデントｔ検定を使用した。遺伝子型と、異なるリガンドおよび／またはスタウロスポリンの点ならびにグルタミン酸の点との間の差を分析するのに、適宜、ＡＮＯＶＡまたはノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ事後検定を使用した。０．０５より小さいＰ値を有意であるとみなした。
【００６２】
候補化合物のスクリーニング方法
ヒトＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２またはＧＡＬＲのいずれかをコードするｃＤＮＡを形質導入し、そのｃＤＮＡを安定に発現しているＣＨＯ細胞を、Euroscreen（ベルギー国Brussels所在）より入手した。細胞は、３つの層培養フラスコ中に１０％ ウシ胎児血清（Gibco BRL社、英国Paisley所在）および０．４ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Sigma社）を添加した
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘ（ＨＡＭＳ）Ｆ１２（Gibco BRL社）を入れて、３７℃で５％
ＣＯ2／９５％ 大気雰囲気で培養した。細胞を約８０％の今フルエンスまで増殖させ
、３７°Ｃで１０分間、０．０２％ ＥＤＴＡのＤ−ＰＢＳに入れて分離させた。細胞を５分間１０００ｒｐｍで遠心分離により収集し、実験の日に必要な密度になるよう培地に再懸濁した。その後、様々な化合物の添加に対する細胞の応答をＦＬＩＰＲ３８４（Molecular Devices Ltd社、英国Wokingham所在）を使用して測定した。細胞を２０，０００細
胞／３０ｕｌの密度で培養培地に懸濁し、３８４ウェル黒色／透明Ｇｒｅｉｎｅｒ培養プレート（３０μｌ／ウェル）に移動させ、３７℃で２時間、５％ ＣＯ2／９５％空気の
調湿雰囲気でインキュベートした。各ウェルに３０μｌのＦｌｕｏ−４−ＡＭ（０．８％
プルロニックＦ−１２７および１％ ＦＢＳを含む４μＭのアッセイバッファ）を追加することにより、細胞に染料をロードし、３７℃で１時間、５％ ＣＯ2／９５％空気の
調湿雰囲気でインキュベートした。細胞を、ＥＭＢＬＡプレート洗浄機（４×８０μｌ洗浄）を使用して、ＦＬＩＰＲアッセイバッファ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２．５ｍＭ プロベネシド、および０．１％ ＢＳＡを追加したカルシウムもマグネシウムも含まないＨＢＳＳ）で洗浄し、洗浄後に各ウェルに４５μｌが残るようにした。
【００６３】
化合物に対する反応をＦＬＩＰＲ３８４を使用して測定した。基本の蛍光を、化合物の添加前（５μｌ；最終濃度１０μＭ）に毎秒１０秒間記録し、蛍光を、毎秒６０回読取りの間、次ぎに６秒ごとにさらに２０回読取りの間記録した。データは相対蛍光単位（ＲＦＵ）として記録し、３分間の記録にわたる最大のＲＦＵを記録するデータ転送された統計について分析を行った。データはＸＬＦｉｔ ３．０を使用して分析した。データはすべて、リリースに先立った適切な品質管理（ＱＣ）手順を受けた。各化合物に対するＥＣ５０を、ＧＡＬＲを発現していえる細胞系の各々に対して計算し、そのデータからＧＡＬＲ特異的作動薬として作用している化合物を識別した。
【００６４】
結果
実験１
２０ｍｇ／ｋｇのカイニン酸の腹腔内投与を使用して、以前に記載された通りに興奮毒性の海馬損傷を誘発した（Beer, 1998; Mazarati, 2000; Tooyama et al. (2002) Epilepsia 43 Suppl 9 39-43）。三日後、脳を採取し、海馬の細胞死をＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を計測することにより評価した。その結果を図１に示す。系統を一致させた野生型のコントロール（ＷＴ）と比較して、ガラニンノックアウト動物（ＫＯ）のＣＡ１およびＣＡ３領域の両方ではアポトーシスを起こしたニューロンの数が有意に多くなり（図１）、それぞれ６２．９％および４４．８％増加した（**Ｐ＜０．０１および***Ｐ＜０．００１）
。逆に、ガラニン過剰発現動物（ＯＥ）のＣＡ１およびＣＡ３領域の両方では、系統を一致させた野生型のコントロール（ＷＴ）よりも、細胞死の程度が有意に低下し（図１）、それぞれ５５．６％および５０．４％減少した（ｐ＜０．０５）。
【００６５】
実験２
ガラニンにより果たされている神経保護の役割をより制御しやすいインビトロ系でさらに細かく調べるために、初代分散型海馬培養物および器官型海馬培養物の両方（Elliott-Hunt, 2002）を使用した。分散型海馬培養物は観察された効果がニューロン特異的であることを保証し、器官型培養物はニューロンの回路のシナプスおよび解剖学的構成を保存する（Elliott-Hunt, 2002）と共にインビボで見出される機能持性の多くを保持しているため（Adamschik et al. (2000) Brain Res. Prot. 5 153-158）、これらの２つの技術は相互に補い合う関係にある。海馬培養物におけるニューロンの細胞死にスタウロスポリンおよびグルタミン酸が及ぼす効果（Prehn, 1997; Ohmori, 1996）を研究した。細胞死はヨ
ウ化プロピジウム染色により目に見えるようにした。結果を、未処理の「コントロール」培養物と比較した蛍光を示すエリアの百分率として表す。１μＭおよび１００ｎＭのスタウロスポリンは、野生型（ＷＴ）およびガラニンノックアウト（ＫＯ）培養物の両方で有意かつ一貫したレベルの神経毒性を引き起こした。図２Ａに示されるように、いずれの用量でも、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト動物では細胞死の百分率が有意に過剰であった（１μＭ：６８±０．５％ 対 ３８±８％；１００ｎＭ：６５±１０％ 対 ４０±２６％；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。同様に、４ｍＭグルタミン酸に９時間暴露した後では、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト器官型培養物での細
胞死は顕著かつ有意に多かった（８５±８．６％ 対 ６１±９．３％；ｎ＝４、ｐ＜０．０５）。
【００６６】
上記の効果がニューロン特異的であることを確かめるために、分散型の初代海馬ニューロンにおけるスタウロスポリンの効果も調査した。やはり、野生型コントロールに比べてガラニンノックアウト培養物では、１０ｎＭ−１μＭのスタウロスポリンの範囲にわたって、有意に過剰な細胞死が観察された。主要な海馬のニューロンも研究された（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）（図２Ｂ）。
【００６７】
実験３
ガラニンが欠如していると海馬の細胞死に対する感受性が増加することが実証されたため、調査をガラニン過剰発現マウスにまで拡張した。５０ｎＭまたは１００ｎＭのスタウロスポリンへの暴露後、系統を一致させた野生型コントロール（ＷＴ）と比較して、ガラニン過剰発現動物（ＯＥ）では細胞死の有意な減少が観察された（図２Ｃ；ｎ＝４および**ｐ＜０．０１）。
【００６８】
実験４
外因性のガラニンが野生型の海馬ニューロンを損傷から保護するか否かを試験するために、野生型の器官型培養物に、１００ｍＭ ガラニンを１００ｎＭ スタウロスポリンと同時投与した。この同時投与はそれらの培養物に有意な神経保護を与えた（ｎ＝４およびｐ＜０．０５）（図３Ａ）。同様に、野生型の器官型培養物に４ｍＭ グルタミン酸と同時投与した場合にも、ガラニンは１０ｎＭ−１μＭの範囲で保護的であった（図３Ｂ）。器官型培養物を使用したこれらの知見と一致して、１００ｎＭ ガラニンは１０ｎＭ スタウロスポリンによって誘発される細胞死から野生型の分散型初代海馬ニューロンをも保護した（図３Ｃ；ｎ＝３およびｐ＜０．０５）。
【００６９】
実験５
海馬におけるガラニンの神経保護効果は、Ｇタンパク質共役型ガラニン受容体サブタイプであるＧＡＬＲ１、ＧＡＬＲ２およびＧＡＬＲ３のうちの１または複数の活性化により媒介されていると考えられる。ＧＡＬＲ２の活性化が、ガラニンが成人の末梢神経系の感覚ニューロンからの神経突起の成長を刺激する主要な機序であるらしいことが先に示された（Mahoney, 2003）。したがって、１００ｎＭ ＡＲ−Ｍ１８９６（高親和性ＧＡＬＲ
２特異的作動薬）の影響も、野生型動物由来の器官型培養物に１００ｎＭ スタウロスポリンを同時投与する時に、同様に試験した。ＡＲ−Ｍ１８９６がＧＡＬＲ１を弱く活性化するとしても、これはＧＡＬＲ１に対するＩＣ50が８７９ｎＭである１００ｎＭの濃度ではほぼ起こり得ないことに留意する。ＡＲ−Ｍ１８９６は等モル濃度のガラニンで観察されたのと同様な量に、野生型の器官型培養物の細胞死の量を有意に減少させた（ｐ＜０．０５、図３Ａ）。さらにＡＲ−Ｍ１８９６の追加は、野生型の器官型培養物で観察されたのと同様にガラニンノックアウト培養物におけるスタウロスポリン誘導細胞死について効果的であった（データは図示しない）。分散型の初代海馬ニューロンもＡＲ−Ｍ１８９６およびスタウロスポリンで処理したところ、完全長ガラニンで観察されるのと同様のＡＲ−Ｍ１８９６の同様な保護効果が実証された（図３Ｃ）器官型または初代培養物でスタウロスポリンがない場合には、ガラニンまたはＡＲ−Ｍ１８９６の有意な効果は見られなかった。
【００７０】
実験６
ＡＤ（アルツハイマー病）における病気の進行は、脳内でアミロイド−β原繊維が蓄積し、α−セクレターゼによるアミロイド前駆タンパク質の開裂に由来するペプチドから成る老人斑の形成に関連する（Gamblin et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 10032-10037）。原繊維のアミロイド−βの蓄積はＡＤの神経病発生における原因と
なる役割を有すると仮定されている。内因性ガラニンが原繊維Ａβにより誘発された神経毒性に対して保護的な効果を有するか否かを試験するために、１４日目の海馬の器官型培養物をガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および系統を一致させた野生型コントロールトランスジェニック動物から得た。これらの培養物を１０μＭの原繊維Ａβ（１−４２）で、逆のコントロールペプチドＡβ（４２−１）で、またはペプチドの添加なしで、７２時間まで処理した。１０μＭの原繊維Ａβ（１−４２）は先に記載されている通りに使用した（Zheng et al. (2002) Neuroscience 115 201-211）。実験は三連（triplicate）で行ない、細胞死をヨウ化プロピジウム蛍光（ＰＩＦ）強度を使用して上述のように測定した。画像はＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ分析ソフトウェア使用して撮像し、分析した。結果は、ガラニンノックアウト動物では野生型コントロールに比べて統計的に多くの量の原繊維Ａβ（１−４２）誘発の海馬の細胞死が実証された。逆に、ガラニン過剰発生動物では系統を一致させた野生型コントロールに比べて統計的に少ない繊維Ａβ（１−４２）誘発の海馬の細胞死が実証された。
【００７１】
実験７
上述の以前に記載されたＥＡＥモデルを使用して、ガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および系統を一致させた野生型コントロールのトランスジェニック動物にＭＳの表現型を引き起こした。図４Ａはガラニンノックアウト動物が系統を一致させた野生型コントロールよりもより進行性で重篤な疾病の形式を進展させたことを実証している（Ｎ＝５、Ｐ＜０．０１）。逆に、ガラニン過剰発現マウスではその野生型コントロールと比べて著しく異なるような疾病の徴候を発達させていない（図４Ｂ；Ｎ＝５、ｐ＜０．００１）。繰り返しになるが、これらのデータは、中枢神経系におけるニューロン傷害の炎症性のモデルにガラニンが保護的な役割を果たすことを実証している。
【００７２】
要約
障害の多くのインビボおよびインビトロのモデルにおいて、ガラニンが海馬への内因性の神経保護因子として作用することが実証された。さらに、外因性ガラニンと先に記載された高親和性のＧＡＬＲ−２特異的作動薬とは、いずれも細胞死を減少させる。従って、ＧＡＬＲ２はこれらの保護効果を媒介する主要な受容体サブタイプである。これらのデータは、ＧＡＬＲ２特異的作動薬が様々な形式の脳障害、脳損傷または脳疾病の治療または予防に治療の用途を有するであろうことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】インビボにおける海馬の細胞死に対する２０ｍｇ／ｋｇのカイニン酸の腹腔内投与の効果を示すグラフ。
【図２】インビトロにおける１０ｎＭ−１μＭのスタウロスポリン（Ｓｔ）とのインキュベート後のガラニンノックアウト、ガラニン過剰発現、および野生型海馬培養物の応答を示すグラフ。
【図３】インビトロにおけるガラニン野生型海馬培養物に対する、スタウロスポリンまたはグルタミン酸の、ガラニンまたはＡＲ−Ｍ１８９６との同時投与の効果を示すグラフ。
【図４】インビボにおけるＭＳの実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルのノックアウト、過剰発現、および野生型動物の応答を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療用の薬物の調製におけるＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用方法。
【請求項２】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項１−６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項７に記載の使用方法。
【請求項９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項１−６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−１０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項１０−１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する方法であって、そのような予防または治療を必要とする個体に有効量のＧＡＬＲ２特異的作動薬を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項１７−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項１７−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項２６−２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項２６−２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大
きい結合特異性を有する、請求項２６−３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項２６−３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する化合物の候補を選択する方法であって、少なくとも１つの試験化合物はＧＡＬＲ２特異的作動薬であるか否かを決定し、少なくとも１つの試験化合物がＧＡＬＲ２特異的作動薬である場合に該少なくとも１つの試験化合物を候補化合物として選択することを含む、方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３、３４、または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性でＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＧＡＬＲ２がヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一部分を含む、請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＧＡＬＲ２が完全長のヒトＧＡＬＲ２である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＧＡＬＲ２が非ヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一の部分を含む、請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＧＡＬＲ２がラットＧＡＬＲ２またはマウスＧＡＬＲ２である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＧＡＬＲ２が完全長ＧＡＬＲ２である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＧＡＬＲ２がキメラ受容体構築物である請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物の選択がハイスループットスクリーニング検定によりスクリーニングされる、請求項３３−４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療に使用される医薬組成物であって、
ａ）有効量の少なくとも１つのＧＡＬＲ２特異的作動薬または医薬として許容されるその塩；および
ｂ）医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤；
を含む組成物。
【請求項４９】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項４８または４９に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項４８−５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項４８−５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項５７−６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤が、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンを始めとする血清タンパク質、リン酸塩を始めとするバッファ物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸、水、塩類、または硫酸プロタミンを始めとする電解質の部分的グリセリド混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂、から選択される、請求項４８−６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
経口または非経口的に投与される、請求項４８−６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
経口投与される、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
カプセルまたは錠剤の形をしている、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
ラクトースおよび／またはコーンスターチを含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
潤滑剤をさらに含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
潤滑剤がステアリン酸マグネシウムである、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
水性懸濁液または水溶液の形をしている、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
乳化剤または懸濁剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
甘味剤、着香料、または着色剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項６６−７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
注射により、無針装置により、吸入スプレーにより、局所に、直腸に、経鼻で、口腔に、膣内に、または埋設したリザーバを介して投与される、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
注射によって投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
無菌の注射可能な製剤の形をしている、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
無菌の注射可能な製剤が、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液である、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
無針装置によって投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
無針装置による投与に適した剤形である、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
無針装置による投与に適した剤形が、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液である、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記水性懸濁液が、マンニトール、水、リンゲル液または等張食塩水に溶かして調製される、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
前記油性懸濁液が、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸または天然の医薬として許容される油に溶かして調製される、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記脂肪酸はオレイン酸またはオレイン酸グリセリド誘導体である、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記天然の医薬として許容される油は、オリーブ油、ヒマシ油またはポリオキシエチル化オリーブ油、またはヒマシ油である、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記油性懸濁液が、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤を含む、請求項８２、８３または８４に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
前記長鎖アルコールの希釈剤または分散剤がＰｈ．Ｈｅｌｖである、請求項８５に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
直腸に投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
直腸投与用の坐薬の形をしている、請求項８７に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
坐薬が室温で固体かつ直腸温で液体になる非刺激性の補形剤を含む、請求項８８に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
非刺激性の補形剤が、カカオ脂、蜜ろうまたはポリエチレングリコールのうちの１つである、請求項８９に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
局所に投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水から選択されるキャリアを含む軟膏である、請求項９１に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水から選択されたキャリアを含むローションまたはクリームである。請求項９１に記載の医
薬組成物。
【請求項９４】
経鼻で投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
鼻エアゾールおよび／または吸入により投与される請求項９４に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
細胞死を抑制する方法であって、細胞死を抑制するのに有効な量のＧＡＬＲ２特異的作動薬と細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項９７】
前記細胞がニューロンである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞は中枢神経系由来のニューロンである、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞は海馬または皮質のニューロンである、請求項９６、９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞がヒト細胞である、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療用の薬物の調製におけるＧＡＬＲ２特異的作動薬の使用方法。
【請求項２】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項５】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項２に記載の使用方法。
【請求項６】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項１または２に記載の使用方法。
【請求項７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項１−６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項７に記載の使用方法。
【請求項９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項１−６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−１０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１−１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１０−１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項１０−１５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１７】
脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する方法であって、そのような予防または治療を必要とする個体に有効量のＧＡＬＲ２特異的作動薬を投与することを含む、方法。
【請求項１８】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項１７−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項１７−２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項１７−２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項２６−２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項２６−２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大
きい結合特異性を有する、請求項２６−３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項２６−３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
脳障害、脳損傷または脳疾患を予防または治療する化合物の候補を選択する方法であって、少なくとも１つの試験化合物はＧＡＬＲ２特異的作動薬であるか否かを決定し、少なくとも１つの試験化合物がＧＡＬＲ２特異的作動薬である場合に該少なくとも１つの試験化合物を候補化合物として選択することを含む、方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性と、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３３、３４、または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの試験化合物が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい特異性で、ＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの試験化合物が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性でＧＡＬＲ２に結合することが決定される、請求項３４−３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ＧＡＬＲ２がヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一部分を含む、請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＧＡＬＲ２が完全長のヒトＧＡＬＲ２である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＧＡＬＲ２が非ヒトＧＡＬＲ２の少なくとも一の部分を含む、請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ＧＡＬＲ２がラットＧＡＬＲ２またはマウスＧＡＬＲ２である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＧＡＬＲ２が完全長ＧＡＬＲ２である、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＧＡＬＲ２がキメラ受容体構築物である請求項３３−４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
試験化合物の選択がハイスループットスクリーニング検定によりスクリーニングされる、請求項３３−４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
脳障害、脳損傷または脳疾患の予防または治療に使用される医薬組成物であって、
ａ）有効量の少なくとも１つのＧＡＬＲ２特異的作動薬または医薬として許容されるその塩；および
ｂ）医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤；
を含む組成物。
【請求項４９】
脳障害または脳損傷が、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、または出血性脳卒中；脳または脊髄への直接的または間接的な外傷または外科手術；心肺バイパス手術または腎臓透析中の脳への虚血性損傷または塞栓性損傷；心筋梗塞に伴う再潅流脳損傷；脳疾患；免疫学的損傷；化学的損傷；または放射線損傷；のうちの１つによって引き起こされる、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
免疫学的損傷が細菌またはウイルス感染の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
化学的損傷が過剰なアルコール消費または癌治療のための化学療法薬剤の投与の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
放射線損傷が放射線療法の結果である、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
脳疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症または変異型クロイツフェルト・ヤコブ病のうちの１つである、請求項４８または４９に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がガラニンのアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドである、請求項４８−５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬がＡＲ−Ｍ１８９６である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が非ペプチドの小さな化学物質である、請求項４８−５３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１００μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有すると共に、ＧＡＬＲ１に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項４８−５８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して３０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して５０倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、ＧＡＬＲ３に比べてＧＡＬＲ２に対して１００倍よりも大きい結合特異性を有する、請求項５７−６１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
ＧＡＬＲ２特異的作動薬が、０から１μＭの間のＧＡＬＲ２に対する結合親和性を有する、請求項５７−６２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記医薬として適切なアジュバント、キャリアまたは賦形剤が、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンを始めとする血清タンパク質、リン酸塩を始めとするバッファ物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸、水、塩類、または硫酸プロタミンを始めとする電解質の部分的グリセリド混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ろう、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂、から選択される、請求項４８−６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
経口または非経口的に投与される、請求項４８−６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
経口投与される、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
カプセルまたは錠剤の形をしている、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
ラクトースおよび／またはコーンスターチを含む、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
潤滑剤をさらに含む、請求項６８に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
潤滑剤がステアリン酸マグネシウムである、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
水性懸濁液または水溶液の形をしている、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
乳化剤または懸濁剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
甘味剤、着香料、または着色剤のうちの少なくとも一つを含む、請求項６６−７２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
注射により、無針装置により、吸入スプレーにより、局所に、直腸に、経鼻で、口腔に、膣内に、または埋設したリザーバを介して投与される、請求項６５に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
注射によって投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
無菌の注射可能な製剤の形をしている、請求項７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
無菌の注射可能な製剤が、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液である、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
無針装置によって投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
無針装置による投与に適した剤形である、請求項７８に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
無針装置による投与に適した剤形が、水性または油性の懸濁液、もしくは非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤に溶かした懸濁液である、請求項７９に記載の医薬組成物。
【請求項８１】
前記水性懸濁液が、マンニトール、水、リンゲル液または等張食塩水に溶かして調製される、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８２】
前記油性懸濁液が、合成モノグリセリド、合成ジグリセリド、脂肪酸または天然の医薬として許容される油に溶かして調製される、請求項７７〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８３】
前記脂肪酸はオレイン酸またはオレイン酸グリセリド誘導体である、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８４】
前記天然の医薬として許容される油は、オリーブ油、ヒマシ油またはポリオキシエチル化オリーブ油、またはヒマシ油である、請求項８２に記載の医薬組成物。
【請求項８５】
前記油性懸濁液が、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤を含む、請求項８２、８３または８４に記載の医薬組成物。
【請求項８６】
前記長鎖アルコールの希釈剤または分散剤がＰｈ．Ｈｅｌｖである、請求項８５に記載の医薬組成物。
【請求項８７】
直腸に投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項８８】
直腸投与用の坐薬の形をしている、請求項８７に記載の医薬組成物。
【請求項８９】
坐薬が室温で固体かつ直腸温で液体になる非刺激性の補形剤を含む、請求項８８に記載の医薬組成物。
【請求項９０】
非刺激性の補形剤が、カカオ脂、蜜ろうまたはポリエチレングリコールのうちの１つである、請求項８９に記載の医薬組成物。
【請求項９１】
局所に投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項９２】
ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水から選択されるキャリアを含む軟膏である、請求項９１に記載の医薬組成物。
【請求項９３】
ミネラルオイル、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルろう、ステアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水から選択されたキャリアを含むローションまたはクリームである。請求項９１に記載の医
薬組成物。
【請求項９４】
経鼻で投与される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
鼻エアゾールおよび／または吸入により投与される請求項９４に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
細胞死を抑制する方法であって、細胞死を抑制するのに有効な量のＧＡＬＲ２特異的作動薬と細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項９７】
前記細胞がニューロンである、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記細胞は中枢神経系由来のニューロンである、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞は海馬または皮質のニューロンである、請求項９６、９７または９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞がヒト細胞である、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００８−５０１６３２（Ｐ２００８−５０１６３２Ａ）
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５２６７６（Ｐ２００６−５５２６７６）
【出願日】平成１７年１月１８日（２００５．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００１８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０４２７
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０６２７６２３９）ニューロターゲッツ リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＵＲＯＴＡＲＧＥＴＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月１８日（２００５．１．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００５／０００１８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８０４２７
【国際公開日】平成１７年９月１日（２００５．９．１）
【出願人】（５０６２７６２３９）ニューロターゲッツ リミテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＵＲＯＴＡＲＧＥＴＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]