キトサンを用いたＤＮＡ保存方法、及びその方法による生成物
もし、ヒト、動物、植物若しくはバクテリア、または血液のようなＤＮＡを含むバイオサンプルが、水溶性キトサンとよく混和され、液体状態、または紙のような固形媒体を用いて固体状態で保存されたならば、室温で長期間安定してＤＮＡを保存することが可能であり、この後の遺伝子アッセイにも有益となる。ＤＮＡ保存方法は、簡易で経済的であり、ＤＮＡカード及びＰＣＲキットのような方法に適用することで製造された生成物は、保存、運搬及び多数のＤＮＡサンプルの収集をすることができ、自動アッセイに対してもまた、とても有益である。加えて、ＤＮＡ ＩＤカードは、個人のＤＮＡを保存するＤＮＡバンクの役割を担うことができ、その上、個人の遺伝子情報を保存することにより、個人識別及び医療に役立つ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの保存方法に関するものであり、上述した方法及び前記方法による生成物に保存されたＤＮＡを分析する方法である。より詳しくは、本発明は、長期間にわたり安定した状態でＤＮＡを保存する方法であり、上述した方法により保存されたＤＮＡを分析する方法であり、上述した保存及び分析方法により生成された紙製又はプラスチック製のＤＮＡカードのようなＤＮＡ ＩＤカードに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物の持つ全ての遺伝子の集合は、ゲノム（全遺伝子情報）といわれる。ヒトゲノムは３０億の塩基で構成され、そして約３０，０００遺伝子を有していることが報告されている。近年、全てのヒトゲノムの塩基配列をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）するヒトゲノムプロジェクトは完了し、それにより診断の画期的な進歩及び遺伝子を用いることで解決困難な病気の治療が可能となった。いわば、オーダーメイド医療や予測医療の時代が始まっている。
【０００３】
生命現象は３つの事象（１）ゲノム遺伝子の遺伝情報、（２）遺伝子転写、（３）タンパク質の発現により決定される。生命現象を理解し解析するために、そして病気の診断と治療のための方法の発展のために、上記３つの事象を正確に解析することが重要である。個々の遺伝子の集合は、遺伝子又はゲノムといわれ、それ故に、個々の転写遺伝子（例えば、ｍＤＮＡ）の集合及び発現したタンパク質の集合は、それぞれトランスクリプトーム及びプロテオームといわれる。近年、このような総合的な情報の自動化した分析に関する研究が、活発に進められている。分析の自動化にとって、マイクロアレイやバイオチップは有益であり、そしてこれらの代表的な例に、ＤＮＡチップやタンパク質チップが含まれている。
【０００４】
ゲノムＤＮＡの遺伝情報の定性的及び定量的な分析のための一般的な方法に関して、ハイブリダイゼーション分析、シークエンシング、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップ、又はＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング及び作製されたライブラリーを活用したその類似方法、サザンブロット法、またはそれに類する方法（例えば、非特許文献１参照）が、言及されてもよい。
【０００５】
個人のＤＮＡを検査することにより、その個人の健康状態を理解することができ、そして、その個人が、遺伝病の将来発症する可能性及び子供への遺伝を予測するのと同様に、癌や感染症のような様々な病気にかかるかどうかの診断をすることができる。更に、ＤＮＡ検査は、身元や実父確定のような親族を探るための最も正確な方法である。家系や系図を探る上でもまた有用である。これらの理由から、ＤＮＡ検査は、法医学及び骨髄や他の内臓またはその類似物の供与の際における適合性を識別するための手段として、必然的に用いられている。更に、一塩基変異多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ：ＳＮＰ）を分析することにより、病気の将来発症する可能性、医薬品の作用、またはその類似することを予測する助けとなるかもしれない。
【０００６】
将来におけるＤＮＡの保存の必要性として、ＤＮＡ検査が認められており、各国は、にわかにＤＮＡバンクを設立している。そして、前記ＤＮＡバンクのサンプルの数は、ＤＮＡ保存を旅行保険や傷害保険と比較すると、米軍やそれに類するもののＤＮＡを保存することを理由として、大部分は増加の傾向にある。しかしながら、全国的な組織や営利団体で個人のＤＮＡを保存することは、個人の遺伝情報を悪用するような問題を有するかもしれない。加えて、既存技術を用いて長期間安全にＤＮＡを保存するために、冷凍庫と特定の試薬が必要となり、こうして、その結果、ＤＮＡの保存のためのコストは、大きいものとなる。
【０００７】
実際、細胞から分離、精製されたＤＮＡが、室温で立たせたまま放置されるとき、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によってＤＮＡが急速に分解または断片化される問題を生じるかもしれない。そのため、遺伝子の研究においてＤＮＡを保存する方法は、重要である。現在、広く用いられている、血液、細胞または組織への方法、冷凍庫で保存する方法、冷凍乾燥保存による方法、２−プロピルアルコール中に保存する方法、及びそれに類する方法である、ＤＮＡを保存または運搬する方法として、言及されてもよい。しかしながら、これらの方法は、コストと損失の視点から多くの不利点がある。液体状態で精製ＤＮＡを保存する方法は、ＤＮＡを直ちに使用するのに容易であるが、ＤＮＡは、長期間保存すると容易に損傷してしまうという問題がある。前記冷凍庫による保存方法及びフリーズドライ保存の方法は、サンプルを用いる過程において繰り返し冷凍と解凍をすることによって損傷するかもしれないという問題がある。更に、アルコールのような試薬を用いて保存する方法もまた、他の方法と同様に前処理及び後処理による過程でいくつかの問題がある。その上、上記過程における最も重要な問題は、保存のために血液のような体液から、ＤＮＡを先ず精製する必要があることである。
【０００８】
上記のＤＮＡ保存方法は、超低温冷凍庫、液体窒素またはそれに類するもののような特別高価な設備を必要とする。それゆえに、前記方法は、経済性の視点で負担を与えるかもしれなく、前記方法は分析のために保存していたＤＮＡを再利用するとき前処理及び後処理の過程を必要とし、そして前記方法は冷凍と解凍の過程を繰り返すことによりＤＮＡを損傷するかもしれないという不利点がある。
【０００９】
上述した方法に加えて、近年、ワットマン社及びそれに類するものによって、ＦＴＡカードまたはカード製品のようないくつかの市販製品が、室温でプラスミドＤＮＡ保存のために、導入された。しかしながら、この方法は、その有効性に制限があり、それ自身を室温の代わりに−15℃または−20℃でＤＮＡを保存することが勧められている。それゆえ原法を超える大きな利点はなく、コスト問題の上昇においてむしろ不利となる。
【００１０】
そのため、分子遺伝学及び薬学の分野において、ＤＮＡとの安定した結合を形成することにより、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを保護するために、室温で安定な状態でＤＮＡを保存し、更に、ＤＮＡを用いた研究や分析に直接適用することが可能な方法を発展させることは重要な課題である。保存の典型的な方法は、（１）ＤＮＡ分解を起こすことなしに室温で安定な方法であり、（２）簡易な方法であるべきであり、（３）費用を効率的にできる方法であるべきであり、（４）ＤＮＡ保存は、ＤＮＡ自身を分離、精製するためのみではなく、ＤＮＡに損傷を有することのない、血液のような体液や様々なＤＮＡを含むサンプルのためであるべきであり、（５）様々なＤＮＡサンプルは、限られた空間で保存されるべきであり、（６）個人は、その個人のＤＮＡを保存できるべきであり、（７）様々な遺伝子において、これ以降の分析でいかなる問題も有すべきではなく、そして、それらの遺伝子検査は実際の診断または研究に有益であるべきである。しかしながら、これらの状態を満足する方法または製品はこれまでのところ発表されておらず、個人の遺伝情報とともに個人のＤＮＡを保存する製品の報告は見つけることができない。
【００１１】
キトサンは、生体への安定性、生分解性及び適合性に優れる、生物学的に生産された高分子であり、薬学の分野において広く用いられている。キトサンを酸で処理すると、水溶性キトサン塩を形成し、強い正電荷に荷電される。それゆえに、近年、前記キトサン塩は薬剤、タンパク質及びＤＮＡの優れた運搬手段として注目されてきている。特に、ＤＮＡの保護のために、水溶性キトサンはアニオン性物質であるＤＮＡと強い結合を形成する。そのため、前記水溶性キトサンは、遺伝子運搬のための媒体物質として供給してもよい。
【００１２】
キトサンは、グルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンとの共重合体であり、キチンから得られる。キチンは、カニやエビのようなクラスタシィアンに豊富に含まれており、セルロースの次に最も豊富な天然高分子の物質である。キトサンは、カチオン性ポリマーの総称であり、キチンを強塩基で脱アセチル化させることにより得られる(例えば、非特許文献２参照)。
【００１３】
キトサンは、中性または塩基性ｐＨでは溶解しないが、グルタミン酸、塩酸、乳酸またはそれに類するもののような酸と反応すると、キトサン塩またはカチオン性キトサンを形成する。前記キトサン塩は、水に溶解し、その溶解性は、脱アセチル化及びｐＨの程度に比例する。水溶性キトサンの場合、アミン基にプロトンを加えることにより、正に荷電する。更に、水溶性キトサンは、フリーズドライ状態にすることができる。
【００１４】
水溶性キトサンは、強い正電荷を有する膜またはゲルを形成する特性を持つ。これに関連して、キトサンは、汚水、重金属または飲用水の精製に用いられており、そして抗カビ物質である。酒類、健康食品及び化粧品の原料としても用いられる。加えて、キトサンは薬学の分野における重要な手段として用いられる。例えば、キトサンは、ワクチンの運搬、ＤＮＡの運搬、タンパク質の運搬の円滑化、精製及び制御された薬の放出システムによる生成物を通じたペプチドおよび薬剤、ゲル、膜、湿潤剤、コーティング剤、マイクロスフィア、マイクロカプセル、生体接着及び粘膜、及びそれに類するものに広い範囲で用いられる(例えば、非特許文献３参照)。
【００１５】
キトサンは、非常に安全で、免疫性により引き起こされる副作用を示さない。キトサンが生体に吸収されると、リゾチームでＮ−アセチルグルコサミンに分解され、その後糖タンパク質の合成に用いられ、その後、生じた残余は、二酸化炭素の形態として排出される(例えば、非特許文献４参照)。
【００１６】
本発明による水溶性キトサンまたはカチオン性キトサンの最も重要な特性は、アニオン性物質であるＤＮＡと強い結合を形成することであり、ＤＮＡの防御及び運搬手段、すなわち、遺伝子運搬物質として用いることができる。プラスミドＤＮＡを用いた実験において、ＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮａｓｅ ＩＩのようなＤＮＡヌクレアーゼによって分解されず、ＤＮＡを安全に保存することに関するキトサンの機能が報告されており、キトサンとプラスミドＤＮＡの複合体がインビトロ培養細胞に注入されると、運搬遺伝子の発現の引き金となる(例えば、非特許文献５参照)。遺伝子運搬効果は、（１）キトサンの分子量、及び（２）キトサンのＤＮＡに対する割合、特に、アニオン性ＤＮＡのリン酸塩分子とカチオン性キトサンの窒素分子に対する割合である窒素／リン酸塩によって決定される(例えば、非特許文献６参照)。
【００１７】
プラスミドＤＮＡがＤＮＡとして室温で立たせたまま放置されるとき、前記プラスミドＤＮＡは数時間で分解される。しかしながら、プラスミドＤＮＡが、キトサンとの複合体の形態に維持されているとき、前記プラスミドＤＮＡは、３月以上保存することができる（例えば、非特許文献７参照）。一方、キトサン及びプラスミドＤＮＡの複合体が、フリーズドライ状態で保存されているとき、前記遺伝子運搬効果は４週間後まで持続させることができる（例えば、非特許文献８参照）。
【００１８】
しかしながら、室温で長期間のあいだ、キトサンと結合した哺乳類の巨大ゲノムＤＮＡを安定して保存する可能性における研究、及びキトサンと結合しＤＮＡを安定して保存する可能性における研究は、今までに報告されていない。その上、キトサンを用いてＤＮＡを保存するために生成された生成物は、大量生産されていない。また、キトサン結合ＤＮＡを用いた遺伝子発現の分析を行うことの可能性、並びにキトサン及び血液のような体液の混合形態でＤＮＡを保存する対象は、（ＤＮＡ自身以上に）報告されていない。更に、キトサンを用いてヒト又は動物のゲノムＤＮＡを保存、運搬及び分析するための生成物は、本発明の生成物を除いて、公開されていない。
【非特許文献１】Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (2001)
【非特許文献２】Errington N., Harding S.E., Varum K.M., Illum L., Int. J. Biol. Macromol., 15, 1123-1127 (1993)
【非特許文献３】Illum L., Pharmaceutical Research, 15, 1326-1331 (1998)
【非特許文献４】Chandy T., Sharma C.P., Biomat. Art. Cells Art. Org., 18, 1-24 (1990)
【非特許文献５】Lee M., Nah J-W., Kwon Y., Koh J.J., Jo K.S., Kim S.W., Pharmaceutical Research, 18(4), 427-531 (2001)
【非特許文献６】Borchard G., Advanced Drug Delivering Reviews, 52, 145-150 (2001)
【非特許文献７】(Leong K.W., Mao H.Q., Turong-Lee V.L., Roy K., Walsh S.M., August J.T., J. controlled Rel., 53, 183-193 (1998)
【非特許文献８】Mao H.Q., Turong-Lee V.L., August J.T., Leong K.W., Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24, 671-772 (1997)
【非特許文献９】Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1-7.88
【非特許文献１０】Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明における一つの側面は、水溶性キトサンを用いて、室温で安定状態でありＤＮＡサンプルを保存、運搬する方法を提供することである。
【００２０】
本発明における他の側面として、水溶性キトサンと、ＤＮＡ検査の様々な方法で用いることができる安定化されたＤＮＡとの複合体を提供することである。
【００２１】
本発明におけるキトサンを用いてＤＮＡを保存する方法によると、本発明における更なる側面は、室温で長期間ＤＮＡを運搬及び保存し、ＤＮＡを容易に研究及び分析し、または容易にアプリケーションに掛けることがために、ＤＮＡと安定な結合を形成することができるような適切な特性及び濃度を持つキトサン溶液を提供することである。
【００２２】
本発明による更なる側面は、キトサンを含む紙製カード（ＤＮＡカード）を製造する方法を提供することであり、液体状態として、及び最小限の空間中での多量のＤＮＡサンプルとしてのＤＮＡとキトサンとの結合物を保存することができ、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰのような遺伝分析、クローニング、配列分析及びサザンブロット法、マイクロアレイテスト及びそれに類するものを行うための方法であり、キトサンとＤＮＡとを、その結合された状態から分離する方法である。この場合、ＤＮＡカードは、タイプ１とタイプ２に大まかに分類することができ、タイプ１は、キトサンを含む紙製カードに、ＤＮＡ自身を保存し、タイプ２は、キトサンと細胞融解バッファーとを備える紙製カードにＤＮＡ以外に血液のようなＤＮＡを含むバイオサンプルを保存するものである。両方の場合において、該対象物は、室温で長期間安定した状態でＤＮＡを保存することができ、そして、もし必要であるならば様々な遺伝分析を行うことができる。
【００２３】
本発明のもう一つの側面として、キトサンとの混合物の形態で個々のＤＮＡサンプルが保存されるＤＮＡ身分証明書（ＤＮＡ ＩＤ ｃａｒｄ）を提供することであり、個々の遺伝情報は、身分証明のための遺伝子検査、ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）遺伝子型決定検査又はそれに類する検査を行うことにより得られ、プラスチックカードの磁気帯又はチップに保存される。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードは、様々なクレジットカード及びキャッシュカードのような個人情報、重要な組織への入場券、バイオパスポート、軍隊若しくはそれに類するもの、または骨髄移植のような臓器移植のための遺伝情報を共有するために用いられることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明における、動物及び植物の巨大ゲノムＤＮＡを保存する新しい方法で、結果として、水溶性キトサンは、ＤＮＡと混合されているとき、安定な結合は、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを保護するために形成され、室温で安定した状態で長期間保存することができ、こうして本発明は完成する。
【００２５】
本発明による方法及び生成物によって達成できる状態は以下の通りである。
【００２６】
１）ＤＮＡは、分解されることなしに室温で安定した状態で保存されるだろう。
【００２７】
２）ＤＮＡサンプルは、ここでは、ゲノムＤＮＡと、ヒト、動物、植物及びバクテリアのｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）と、プラスミドＤＮＡとを含むだろう。
【００２８】
３）前記方法は、容易であり、特別な装置や手段を用いる必要が無いだろう。
【００２９】
４）前記コストは経済的であるだろう。
【００３０】
５）ＤＮＡの保存は、ＤＮＡ自身の分離及び精製のためのみではなく、血液のような体液、及びＤＮＡ上に損傷を受けていない様々なＤＮＡを含むバイオサンプルのためでもあるだろう。
【００３１】
６）ＤＮＡサンプルは、紙またはカードのような単純な媒介物を用いて保存されるだろう。
【００３２】
７）多くのＤＮＡサンプルは限られた空間で保存されるだろう。
【００３３】
８）個人は、本人のＤＮＡを保存することができるだろう。
【００３４】
９）前記ＤＮＡサンプルに関して、前記ＤＮＡサンプルは、上記方法及び生成物によって保存及び運搬され、ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ハイブリダイゼーション、配列分析、ＳＮＰ分析及び、それに類するもののような様々な遺伝分析を長期間経った後でさえ正確且つ簡単に行うことができ、様々な臨床試験と同様に研究においても有益であるだろう。
【００３５】
１０）前記ＤＮＡ ＩＤカードは、個人のＤＮＡを保存するためのＤＮＡバンクとして機能し、前記ＤＮＡ ＩＤカードと一緒に個人の遺伝情報もまた保存できるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を、図面を参照して詳細を説明する。
【００３７】
図１は、本発明による、ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合生成物の製造及び分析工程を示すブロック図である。前記ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合生成物を製造する工程を調べるとき、まず図１を参照して、前記ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合の最適条件を確立し、そして、ＤＮＡヌクレアーゼに対する防御の効果、及び前記ＤＮＡとキトサンとの混合物の移動度シフトを分析する（Ｓ１０１）。その後、液体状態としての前記ＤＮＡとキトサンとの混合物に関して、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０２）。上記結果を用いて、前記タイプ１ＤＮＡカードは製造され、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０３）。同様に、タイプ２ＤＮＡカードを製造し、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０４）。上記製造されたタイプ１及びタイプ２ＤＮＡカードで長期間保存されたサンプルに基づく遺伝分析の可能性を分析する（Ｓ１０５）。続いて、キトサンを含む一体型ＰＣＲキットを製造する（Ｓ１０６）。その後、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードを製造する（Ｓ１０７）。
【００３８】
本発明において、ＤＮＡと安定な複合体を形成し、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを守り、室温で安定した状態でＤＮＡを保存するため、適切な特性及び濃度の水溶性キトサン溶液、紙製カードまたはこのような溶液を含むＰＣＲキット、及びプラスチックＤＮＡ ＩＤカード及びそれに類するものが用いられる。
【００３９】
本発明によるキトサンは、分子量１０〜５００ｋＤａであることが望ましい。１０ｋＤａより少ない分子量を有するキトサンは、ＤＮＡと安定した結合を形成する際に問題を有し、５００ｋＤａを超える分子量を有するキトサンは、ＤＮＡを用いた遺伝子発現分析で干渉を起こすかもしれない。更に、６０％以上の度合いで脱アセチル化しているキトサンが望ましく、脱アセチル化の度合いが６０％より少ない場合、キトサンの水溶性に関する問題が生じ、それ故、ＤＮＡと安定した結合を形成することが困難となる。調整されたキトサンの水溶液の濃度は、体積に対する重量の割合（ｗ／ｖ）に関して、０．０２〜１％であり、望ましくは０．１％である。キトサンの水溶液とＤＮＡの水溶液とを混合する際の混合比は、ＤＮＡの水溶液中のＤＮＡに対するキトサンの水溶液中のキトサンの重量比に関して、１：０．５以上であり、望ましくは１：０．５〜１：３（実施例１及び２）である。
【００４０】
本発明におけるＤＮＡ／キトサン結合生成物は、室温から−７０℃の広い範囲内で保存され、そして、湿気の無い暗所で保存される。
【００４１】
一方、本発明における水溶性キトサンと結合する形態で保存されるＤＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼによる分解が発生していてさえ、安定して保存され、それ故、遺伝分析のために用いられることができる（実施例２に示す）。
【００４２】
本発明によると、ヒト、動物または植物、バクテリア、及びプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡは、キトサンとの混合物として保存することができ、望ましくは、ｃＤＮＡを含む。キトサンとの混合物として保存されることができるＤＮＡの大きさは、数１０から数１０億塩基と様々である。
【００４３】
一方、本発明による水溶性キトサンと結合したＤＮＡの液体混合物は、安定して保存される。そして、本発明によるＤＮＡ保存のための方法の有効性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クローニング、ブロッティング、シークエンシング及びそれに類する方法のような検査を行うことにより、容易に確認することができる。
【００４４】
本発明によると、ＤＮＡ保存のためのカード（タイプ１ＤＮＡカード）は、適切なキトサンと尿酸とが混合され（詳しくは、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の前記水溶性キトサン溶液に対する、０．５ｍＭ〜２０ｍＭの尿酸の、混合物における割合は１：１である。）、ブロッティングのための紙に前記混合物を吸収させ、その後、乾燥させることにより製造することができる。上述したカードを用いることにより、多くのＤＮＡを長期間保存することができ、室温で、最小の空間で運搬することができる。ＤＮＡ保存のためのカードの製造に用いる紙としての、クロマトグラフィーまたはブロッティングのための様々な紙は、一般に用いられているものを用いてもよく、前記紙の厚さは、約０．３ｍｍ〜１．２ｍｍのものが望ましい。前記ＤＮＡ保存のためのカードの保存温度は、室温に適しているが、−２０℃〜−７０℃とより低い温度でも可能であり、室温で６ヶ月以上の保存が可能である（実施例５）。
【００４５】
本発明によるＰＣＲを行う際、ＤＮＡとキトサンとの混合物が液体である場合は、前記混合物自身は鋳型として用いられ、前記混合物がカード形態である場合は、前記カードの断片は切断され、ＰＣＲ増幅、クローニング及び配列分析の一般的方法を実行する鋳型として用いられる。その結果、本発明の方法により保存されたＤＮＡを用いて遺伝分析を充分に行えるように、ＤＮＡが保存されることが確認される(実施例５)。
【００４６】
本発明によると、ＤＮＡ保存のためのカード（タイプ２ＤＮＡカード）は、トリス、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び尿酸を備える細胞溶解バッファー（詳しくは、トリス（８ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＳＤＳ（０．１％ ｗ／ｖ）及び尿酸（２ｍＭ））と、適切なキトサン溶液の混合物を、ブロッティング用の紙に吸収させ、その後乾燥することにより製造することができる。上述したカードを用いることにより、ＤＮＡを長期間保存することができ、血液のようなＤＮＡを含むバイオサンプル状態として、室温で運搬することができる(実施例６)。
【００４７】
一方、本発明のＤＮＡカードを用いて保存されたＤＮＡは、安定して保たれ、ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング、配列分析及びそれに類するもののような検査をこれ以降行うことができる(実施例７〜１０)。
【００４８】
更に、サザンブロット法を行うために、前記ＤＮＡとキトサンの複合体は、ＤＮＡをアガロースゲルに移すために分離されるだろう。そのため、ＤＮＡは、ＤＮＡ上に損傷が無く、サザンブロット法の結果に影響を与えない硫酸塩を基礎としたカチオン塩を用いることにより分離される。上述した硫酸を基礎としたカチオン塩の例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、オクチル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）または臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含む(実施例１１)。
【００４９】
また、本発明は、個々のＤＮＡサンプルは、キトサンとの混合物の形態で保存されるＤＮＡ ＩＤカードを提供し、個人識別またはＨＬＡ遺伝型検査のような遺伝子検査を行うことによって得られた個々の遺伝情報は、前記プラスチックカードの磁気帯に保存される(実施例１２及び１３)。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードは、個人識別、個人の組織移植、個人の臨床診断またはそれに類するもののための遺伝子情報バンク同様に、個人のＤＮＡバンクとしても用いられることができる。
【００５０】
本発明を以下の実施例と共に更に詳細を示す。しかしながら、本発明の目的はそれらにより制限されるものではない。
【００５１】
実施例１：アガロースゲル電気泳動による、ＤＮＡとキトサンとの複合体の移動シフトアッセイ。
【００５２】
適切な特性（ＤＮＡと混合する際に安定した複合体を形成するためのキトサンの濃度及び混合条件）を確立するために、様々な濃度の水溶性キトサンを、様々な比率で正常成熟血液の単球から分離した全部のＤＮＡと混合し、その後、キトサンと結合したＤＮＡの移動シフトアッセイを、アガロースゲル電気泳動を介して行った。さらに、キトサンと結合したＤＮＡの移動シフトアッセイは、同様に、マウス肝組織のゲノムＤＮＡ及び４．０ｋｂサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）に対して行われた。実験の方法及び結果を以下に示す。
【００５３】
Ａ．ＤＮＡ分離及び準備
正常成熟白血球からの細胞の全ＤＮＡは、分離され、その実験は知られている方法（例えば、非特許文献９参照）により、三次蒸留水を用いて行われた。
【００５４】
末梢静脈血は、クエン酸ナトリウムを含むチューブ（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＴＡＤ ｔｕｂｅ，カタログＮｏ ＃３６７９４６、Ｂｅｔｏｃｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製造、米国）に貯められ、血漿及び単球の軟膜層は、遠心分離機により分けられた。前記単球（そのほとんどはリンパ球である。）ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製造、ドイツ）を用いて、次の方法により、分離された。
【００５５】
２０μｌのプロテインキナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ プロテアーゼ）は、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに入れ、２００μｌの軟膜層と２００μｌのバッファーＡＬは、順次、マイクロ遠心チューブに加えられた。そして、ボルテックスにより１５秒混和した。それを、５６℃で１０分間立たせたまま放置し、チューブのキャップを閉め、溶液を集めるために遠心分離した。前記溶液に２００μｌのエタノールを加え、ボルテックスにより１５秒混和した。そして、前記溶液の全てを、ＱＩＡａｍｐスピンカラムに加え、８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離した。その後、２ｍｌコレクションチューブを前記カラムに設置し、５００μｌのバッファーＡＷ１をカラムに加え、再度８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離した。こうして得られたろ液は、廃棄され、新しいチューブが供給され、さらに最大速度でもって１分間遠心分離した。再び、新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブを設置し、２００μｌの蒸留水またはバッファーＡＥを加え、立たせたまま室温で１分間放置し、その後さらに８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離し、ＤＮＡを溶出した。こうして分離されたＤＮＡは、分光光度計を用いて濃度を測定され、Ａ２６０／Ａ２８０比は、前記分離されたＤＮＡの純度を調べるために比較される。このとき、前記ＤＮＡの純度は、分光光度計測定上Ａ２６０／Ａ２８０は１．６〜１．８となるだろう。上記方法により、２００μｌのヒトの血液から、平均６μｇの純ＤＮＡを得ることができる。
【００５６】
Ｂ．キトサンの準備
もし水溶性キトサンが、脱アセチル化の程度が６０％以上であり、分子量が１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの生成物であるならば、本発明の用途として、具体的には、ＤＮＡとの安定な複合体を形成するために用いることができる。これらに該当する多くの水溶性キトサン生成物は、市販のものを用いることができる。それらのうち、本発明にあたる、平均脱アセチル化率が９０．１％であり、平均分子量が約３００ｋＤａである水溶性キトサン生成物は、Ｊａｋｗａｎｇ社（韓国 アンソンシ）から購入し、滅菌三次蒸留水で溶解した。このキトサンに加えて、類似した特性を有する他の水溶性キトサンをまた用いてもよい。
【００５７】
Ｃ．キトサンとＤＮＡとの複合体の準備の方法
前記水溶性キトサンは、滅菌三次蒸留水に溶解し、試験のため、０．０２％から０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％及び１％の重量対体積比率（ｗ／ｖ）となるよう様々な濃度に調整した。ここで、ＤＮＡは、滅菌三次蒸留水で希釈し、５００ｎμｇ／μｌ及び１μｇ／μｌの濃度にし、その後これを用いた。
【００５８】
１．５ｍｌ遠心チューブに、ＤＮＡ溶液及び上述した様々な濃度の前記キトサン溶液を、様々な体積比率で混和し、室温で１５分間立たせたまま放置し、複合体構造へ導いた。
【００５９】
Ｄ．アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡとキトサンの複合体の移動度シフトアッセイ
正常成熟単球及びプラスミドＤＮＡから分離したゲノムＤＮＡの１μｇ／μｌ濃度と、様々な濃度の前記水溶性キトサン溶液とを様々な比率で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体は、上記方法に従って０．８％アガロースゲルに装填され、１００Ｖで電気泳動された。その結果をそれぞれ図２及び図３に示す。その結果は、キトサンと混和されていない唯のＤＮＡが電気泳動されたとき、標準的に移動したＤＮＡ及びｒＤＮＡのバンドは、１８ｓ及び２８ｓに観察され、ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）は、０．０２％、０．１％または０．２５％キトサン溶液と混和され、それぞれ、１：０．２、１：１または１：２．５以上(この場合、混合物中のキトサンとＤＮＡとの重量比は１：１以上である。)の各体積比率であるため、ＤＮＡは前記アガロースゲルにおいて決して移動しないような、キトサンと完全に結合をした。そのため、次の実験において、０．１％キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のＤＮＡ溶液と体積比１：１（この場合、混合体中のキトサンとＤＮＡとの重量比は、１：１である。）で混和されたものであるキトサンとＤＮＡとの複合体の構成物はスタンダードとして作られた。しかしながら、これは構成の一つの例に過ぎず、適切な構成であれば、キトサン生成物の特性に従って、多様なものが使用されてもよい。
【００６０】
実施例２：キトサンのデオキシリボヌクレアーゼ防御アッセイ
前記水溶性キトサンは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）からＤＮＡを防御することができるのかを確認するため、そして、その適切な条件を確立するために、キトサン溶液で処理されたＤＮＡ及び未処理のＤＮＡは、それぞれデオキシリボヌクレアーゼ処理され、その効果をアガロースゲル電気泳動によって観察した。
【００６１】
その方法と結果は次の通りである。同様の実験を、ヒトリンパ球のゲノムＤＮＡ及びマウス肝組織のゲノムＤＮＡに、繰り返し行った。
【００６２】
８個のチューブを２つの群に分けた。一つの群は、蒸留水に溶解させたキトサン（２０ｇ）とＤＮＡ（１０ｇ）とをマイクロチューブ（１．５ｍｌ）中で混和し、複合体を生成した。もう一方の群は、キトサンを用いず、ＤＮＡ（１０ｇ）のみをマイクロチューブに加えた。第一群及び第二群のそれぞれのチューブに、１ｕｎｉｔ／ｌの濃度に溶解させたデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ Ｉ）５μｌを加え、その後、最終体積が１００μｌとなるように蒸留水を加えた。その後、反応させるため、それぞれ０分、２０分、４０分及び６０分の間、３７℃の恒温槽に保持した。反応終了後直ちに、２５μｌの停止液を加え、ＤＮａｓｅ Ｉ を不活性化するためよく混和した。反応を不活性化した４個のチューブのそれぞれに、１１０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、混和し、その後反応させるため６０℃で一晩保持した。その後、上澄みを回収し、新しいマイクロ遠心チューブに入れ、抽出した。３００μｌの無水ＥｔＯＨ(エタノール)及び１５μｌの３Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ(酢酸アンモニウム)をそこに加え、あらかじめ−７０℃にしてあるディープ・フリーザーで２０〜３０分間立たせたまま放置した。その後、得られたものを、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、液分を吸引除去した。付着した沈殿物は７０％エタノールで再度洗浄、乾燥され、ＤＮａｓｅを含まない蒸留水２０μｌで溶解された。１０μｌ（約１μｇＤＮＡ）の結果物が、こうして得られた計８個のチューブそれぞれから得られ、１％アガロースゲルで電気泳動された。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４から、キトサン処理されていないＤＮＡは、ＤＮａｓｅ Ｉ処理後４０分でほぼ開裂された一方、キトサン処理されたＤＮＡは、ＤＮａｓｅ処理後４０分では開裂されず、そのほとんどが、ウェル中に残っていた。これらの結果は、本発明の方法によるキトサンとＤＮＡとの重量比が、１：０．５で混和されているものでさえ、デオキシリボヌクレアーゼによるＤＮＡ開裂を効果的に抑制し、そして本発明による方法は、ＤＮＡの保存を効果的にすることがわかった。
【００６４】
実施例３：ＤＮＡとキトサンとの複合体のための遺伝子増幅可能性の試験
実施例１及び２で準備した水溶性キトサンとＤＮＡとの液状複合体を用いて、ＰＣＲは標的遺伝子が適切に増幅されているかどうかを確認するために行われ、それにより本発明によるＤＮＡ保存が、前記遺伝子アッセイに悪影響を及ぼさないかどうかを確認し、本発明によるＤＮＡ保存方法により保存されたＤＮＡを、ＰＣＲに用いるための、適切な条件を確立した。ヒト白血球ゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲは各？活動遺伝子を標的として行った。その方法と結果は以下の通りである。
【００６５】
標的遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ加えることにより、鋳型として、１００ｎｇの対象となるＤＮＡを用いることで、ＰＣＲ反応を行い、更に、２．５ｍＭ デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、１ｕｎｉｔのＴａｑポリメラーゼ及び１０ｘポリメラーゼバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ トリス‐Ｃｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ゼラチン）を加えた。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ２７００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製造、米国）を用い、先ず、９５℃で５分の第一条件下の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件を４０回繰り返し、最後に７２℃で７分間行い、ＰＣＲ生成物を得た。
【００６６】
０．１％キトサン及びＤＮＡ（１μｇ／ｕｌ）を１：１の体積比で混和することにより準備され、ヒト及びマウスのゲノムＤＮＡサンプルの各鋳型を用いて、β‐アクチン遺伝子に対して、ＰＣＲを行った。１．５％アガロースゲルでの電気泳動の結果を、図５に示す。キトサンと混和されたゲノムＤＮＡサンプルの両方は、同程度に、６６１ｂｐサイズのβ‐アクチン遺伝子の強いＤＮＡバンドを示した。これは、本発明のキトサン混合培地は、ＰＣＲに悪影響を有さないことを示し、遺伝子発現の調査に有益に用いることができる。
【００６７】
実施例４：長期間室温で保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体のＰＣＲ増幅実験
上記結果から、前記水溶性キトサンはＤＮＡとほぼ完全に結合し、デオキシリボヌクレアーゼの攻撃から安定してＤＮＡを保存することがわかった。本実施例では、前記水溶性キトサンとＤＮＡとの前記複合体が、長期間室温で、液体状態で保存されたときでも、前記保存されたＤＮＡは、開裂されることなしに維持され、遺伝子増幅及び遺伝子アッセイを行うことが可能である。ＰＣＲアッセイは、次の通りに行われた。
【００６８】
１μｌの０．１％水溶性キトサン溶液（ｗ／ｖ）と、１μｌの正常成熟血液（５００ｎμｇ／μｌ）の単球のゲノムＤＮＡとを、混和し、複合体を形成し、８μｌの蒸留水を更に加え、最終体積が１０μｌとなるように調整した。こうして、２４サンプルを前記遠心チューブに準備し、室温で保存した。１μｌの、キトサン処理していない、同様の白血球ＤＮＡは、最終体積が１０μｌになるよう調節され、９サンプル準備され、そのうちの３本は−７０℃で保存され、残りの６本は室温で保存された。前記水溶性キトサンと混和され、前記チューブ内に室温で保存されたＤＮＡに対して、実施例３の方法に従い、３本のＤＮＡサンプルに対してＰＣＲ反応を行い、それぞれを、１週間、２週間、３週間、４週間、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１年の各時点で、前記標的遺伝子が適切に増幅できるかどうか確認した。キトサンで処理されていない前記ＤＮＡサンプルのうち、−７０℃で保存されていた３本のサンプルに対して、３ヶ月後及び１年後に、それぞれにＰＣＲを行った。図６は、ＰＣＲを行った後の、β‐アクチン遺伝子に対する、０．８％アガロースゲルでの電気泳動の結果を表わす写真である。
【００６９】
図６から、室温で、３ヶ月間及び１年間マイクロ遠心チューブで、キトサンに結合していない（裸の）ものとして、ＤＮＡが保存された場合、ハウスキーピング遺伝子であるβ‐アクチンは、決して発現しないことがわかった。一方、一週間から１年間室温で、液体としてチューブ内で、キトサンと結合したものとして、ＤＮＡサンプルが保存された場合、β‐アクチン遺伝子ははっきりと検出された。従来の方法による、キトサンと結合せずに、−７０℃で保存された前記ＤＮＡサンプルに対して、本発明の方法による、室温で、キトサンと結合させて保存された前記ＤＮＡサンプルの、増幅されたβアクチンの量は、ほぼ同じである。
【００７０】
このような結果は、本発明の方法による前記水溶性キトサンに結合されたものとして、液中でＤＮＡを保存する方法は、少なくても一年間安定してＤＮＡを維持することができ、該保存されたＤＮＡは、ＰＣＲアッセイに用いる際に問題を有さず、前記方法は、ディープ・フリーザーによる従来の保存方法同様に、安定してＤＮＡを保存することができることを示した。本実施例の保存温度は、室温から−７０℃と様々であるが、湿気の無い暗所で保存されるのが望ましい。
【００７１】
実施例５：キトサンが紙に吸着されているＤＮＡカード（タイプ１）の準備、及びそれらの遺伝子増幅可能性の調査
室温で、最小限の空間で、多数のサンプルＤＮＡを保存、運搬し、自動アッセイに役立つように、キトサンが適する紙に吸着されたカードが発展してきており、それはＤＮＡカードといわれている。前記ＤＮＡカードは、様々な種類があり、その中で、ＤＮＡ自身を保存するために用いられる紙製カードは、タイプ１ＤＮＡカードといわれている。
【００７２】
最も効率的な水溶性キトサン溶液の濃度及び適切な紙の厚さを選択するために、次の実験を行った。
【００７３】
様々な種類のブロッティング用の紙は、充分な時間、０．０２％、０．１％または０．２５％（ｗ／ｖ）濃度の前記水溶性キトサン溶液に浸漬され、ＤＮＡカード製造に用いるために乾燥させられた。この時、前記紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社（英国）またはＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社（独国）のような会社から市販されており、適切な厚みを有するブロッティング用の紙から選ばれた。本発明において、厚さ０．３ｍｍ、０．９ｍｍまたは１．２ｍｍのブロッティング用の紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社から購入し、使用した。キトサンを用いたＤＮＡ保存用の前記ＤＮＡカードの種類及び大きさは、使用に応じて様々に準備することができる。キトサンが吸着された前記ブロッティング用紙は、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレート（マルチウェループレート）（８．１ｃｍ×１２．３ｃｍ）と同じ大きさに切断され、ほとんどのウェルは使用され、そして、前記ウェル及び区分けは、プレート同様に前記紙に印刷及び印をつけられた。前記ウェルのそれぞれに、ＤＮＡサンプルはピペットで滴下され、一週間から一年またはそれ以上、室温で保存された。それ故、一つのＤＮＡカードは、２４、９６または３８４個のＤＮＡサンプルを保存することができる。
【００７４】
前記水溶性キトサン浸漬ＤＮＡカード製造の方法は次の通りである。
【００７５】
Ｗｈａｔｍａｎ社の０．３ｍｍ厚ブロッティング用紙は、滅菌され、高温のオートクレーブで乾燥された。その後、あらかじめ生成しておいた０．１％（ｗ／ｖ）濃度の水溶性キトサン溶液及び２ｍＭ尿酸溶液を、１：１の体積比で混和し、前記紙を充分な時間浸漬し、その後乾燥させてタイプ１ＤＮＡカードを製造した。
【００７６】
スポットされ、長期間保存されたヒトゲノムＤＮＡは、上記のように用意した前記タイプ１ＤＮＡカードに滴下され、一定期間保存された。前記保存されたＤＮＡカードから、直径が約１ｍｍから２ｍｍのカード断片が、パンチ、鉗子またはピンセットを用いて取られ、ＰＣＲを行うためにチューブに加えられた。このカード断片の鋳型と共に、β‐アクチン遺伝子に対するＰＣＲは、実施例３の方法に従って行われた。このＰＣＲ反応の方法は次の通りである。
【００７７】
１．ＤＮＡが保存されているキトサン浸漬紙製カードから、直径が約１．２ｍｍの断片をパンチ等を用いて取り、ＰＣＲのためチューブに加えた。
【００７８】
２．２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を加え、混和し、その後、室温に５分間放置した。その後、前記ＴＥバッファーはピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００７９】
３．第２工程は、２回繰り返した。
【００８０】
４．室温に１時間または５６℃に１０分間で、乾燥させた。
【００８１】
５．上記工程によって処理された前記カード断片に、適切な組成物のＰＣＲサンプルを加え、β‐アクチン遺伝子を、実施例３の方法に従ってＰＣＲ増幅した。
【００８２】
図７は、アガロースゲル電気泳動実験の写真の結果を示し、比較の結果及びＰＣＲによる分析を表わしている。０．１％キトサン溶液に浸漬されることにより作られたＤＮＡカードのすべてにおいて、前記標的遺伝子は強く発現しており、０．９ｍｍまたは１．２ｍｍのような、より厚い紙は、より多くのＰＣＲ産物を生成した。加えて、本発明によるＤＮＡカードに吸着されて保存された場合、β‐アクチン遺伝子は、室温で３ヶ月から１年のような長期間の経過後でさえも、−７０℃で保存した場合と同様に、ＰＣＲにより強く増幅された。このような結果は、本発明によるＤＮＡカードで保存されたとき、多種多様なＤＮＡサンプルは室温で長期間でさえ安定して保存することができ、長期間の経過後でもアッセイを行うことができることを示す。そのため、本発明のＤＮＡカードは、多種多様なＤＮＡサンプルを簡単に室温で長期間保存し、運搬するために有益であり、更に、本実施例及び次からの実施例で示されるような、ＰＣＲまたは塩基シークエンシングのような多様な遺伝子アッセイに有益でもある。
【００８３】
実施例６：キトサンと細胞溶解バッファーとが前記紙に吸着されているＤＮＡカード(タイプ２)の準備、及びそれらの遺伝子増幅可能性の調査
この、タイプ２ＤＮＡカードは、キトサンと細胞溶解バッファーを、ブロッティング及び乾燥させるために、様々な種類の紙に吸着させることにより生成された。このタイプ２ＤＮＡカードは、血液のような細胞含有体液としてのサンプルを保存し、その後、遺伝子アッセイのためにＰＣＲにより増幅させるために用いることを目的とされた。このタイプ２ＤＮＡカード上に、ヒト血液を滴下し、一定期間後、その性能は比較され、ＰＣＲにより分析された。
【００８４】
実施例５で準備されたブロッティング用前記紙製カードは、ＤＮＡカードを製造するために、水溶性キトサン溶液及び細胞溶解バッファー中に、充分な時間浸漬された。この時、０．３ｍｍ厚、０．９ｍｍ厚及び１．２ｍｍ厚のブロッティング用紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社から購入し、使用した。血液として保存するためのタイプ２ＤＮＡカードを製造する方法は、次の通りである。
【００８５】
Ｗｈａｔｍａｎ社のブロッティング用０．３ｍｍ厚の紙は、高温で滅菌され、乾燥された。その後、あらかじめ生成された０．１％（ｗ／ｖ）濃度の前記水溶性キトサン溶液及び細胞溶解バッファー（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８ｍＭ トリス‐Ｃｌ、２ｍＭ 尿酸、１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ）は、体積比１：１で混和され、前記紙を、充分な時間浸漬し、その後、乾燥させ、タイプ２ＤＮＡカードを製造した。
【００８６】
上述したＤＮＡカードから、直径約１ｍｍ〜２ｍｍのカード断片を取り、実施例５にあるようなＰＣＲを行うためのチューブに加えた。このカード断片の鋳型と共に、β‐アクチン遺伝子に対するＰＣＲが行われた。このＰＣＲ反応の方法は、次の通りである。
【００８７】
１．ＤＮＡが保存されているキトサン浸漬紙製カードから、直径約１．２ｍｍの断片は、パンチなどを用いて取られ、ＰＣＲ用チューブに加えられた。
【００８８】
２．２００μｌの洗浄溶液（ＧＧ精製試薬；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８ｍＭ トリス‐Ｃｌ、２ｍＭ 尿酸、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）は、加えられ、混和され、そして、室温で５分間放置された。その後、前記洗浄溶液は、ピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００８９】
３．第２工程は、３回繰り返した。
【００９０】
４．その後、２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）は加えられ、混和され、室温で５分間放置された。その後、前記ＴＥバッファーは、ピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００９１】
５．第４工程は、２回または３回繰り返した。
【００９２】
６．室温に１時間または５６℃に１０分間で、乾燥させた。
【００９３】
７．上記工程で処理された前記カード断片に、適切な組成物のＰＣＲサンプルを加え、そして、β‐アクチン遺伝子を、実施例２の場合と同様の方法によりＰＣＲ増幅した。
【００９４】
この実験の結果、タイプ２ＤＮＡカードの全てに対して、前記標的遺伝子は強く発現しており、０．９ｍｍや１．２ｍｍのような、より厚い紙は、より多くのＰＣＲ生成物を生成した。加えて、本発明のＤＮＡカードに吸着されて保存された場合、β‐アクチン遺伝子は、室温で３ヶ月から１年のような長期間の後でさえも、ＰＣＲにより強く増幅された。このような結果は、ＤＮＡサンプルを、本発明によるＤＮＡカードで保存する場合、ＤＮＡの分離及び精製する必要なしに、血液として室温で長期間安定して保存することができ、長期間経過後でもアッセイが可能であることを示す。そのため、本発明のＤＮＡカードは、血液としてのＤＮＡサンプルを簡単に室温で長期間保存し、運搬するために有益であり、更に、ＰＣＲまたはそれに類するもののような多様な遺伝子アッセイに有益でもある。
【００９５】
実施例７：長期間保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体に対する標的遺伝子のクローニング及び塩基シークエンシング可能性調査
実施例４に従って室温で長期間、液体として保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体に対して、ＰＣＲを行い、得られた生成物はクローニングした。その後、自動塩基シークエンシングによって、本発明の方法により保存されたＤＮＡが、安定して維持でき、保存後に使用できるかどうかを確認した。
【００９６】
室温で３ヶ月、本発明の方法による０．１％水溶性キトサンと混和されたものとして保存された成熟結腸組織のゲノムＤＮＡサンプルの鋳型と共に、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子に対して、ＰＣＲを行った。その生成物は、ブラスミドベクター中でクローニングされ、その後、再度塩基シークエンシングによって調査された。その方法は、次の通りである。
【００９７】
遺伝子のＰＣＲ生成物を、前記シークエンシング反応における鋳型として用いるために、最適な濃度に調節することは重要である。本発明では、１０ｎｇのＡＰＣ遺伝子が用いられた。ＰＣＲチューブに、ＡＰＣ遺伝子の各エクソンのＰＣＲ生成物（３．２ｐｍｏｌのフォワードプライマーかリバースプライマーのどちらか及び８μｌの反応混合物（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製造、 米国））を加え、最終体積が２０μｌとなるように、滅菌蒸留水を加え、よく混和した。サイクルシークエンシング反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ２７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを用いて前記混合物に対して、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、及び６０℃で６分間のサイクルを２５回行った。得られた反応生成物は、エタノールで沈殿させ、遠心分離し、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）をプライマーを含まないように取り除き、前記反応混合物（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を乾燥させた。こうして得られたＤＮＡは、ホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡ：ブルーデキストラン及び１０μｌのローディングバッファーの混合物と混和され、５分間沸騰水中で変性させた。その後、前記サンプルは氷上に置かれ、該変性したＤＮＡサンプルは、５．５％のｌｏｎｇ ｒａｎｇｅｒ ｇｅｌ（ＢＭＡ、カタログＮｏ．、米国）をあらかじめ流し込まれたプレートの各ウェルに加えられた。電気泳動は、２〜４時間行われ、塩基シークエンシングは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製造、米国）のソフトウェアを用いて実施された。
【００９８】
ＡＰＣ遺伝子に対する自動塩基シークエンシングの結果を、図１０に示す。
【００９９】
前記シークエンシングの結果、正常ＡＰＣ遺伝子は、正確に増幅され、そのため、本発明の方法によるＤＮＡとキトサンとの前記液状複合体は、室温で長期間保存した後でさえもとても安定してＤＮＡを保存し、クローニング及び塩基シークエンシングを行うことができる。これは、遺伝子突然変異検査及び癌検査にも、有益であることを意味している。
【０１００】
実施例８：長期間前記ＤＮＡカードで保存されていたＤＮＡの、遺伝子クローニング及び塩基シークエンシングの調査
室温で長期間ＤＮＡカードに吸着されて保存されたＤＮＡサンプルに対して、ＰＣＲ及び自動塩基シークエンシングによって得られた生成物のクローニングは、適切に行うことができるかどうか、確認された。
【０１０１】
３ヶ月間、実施例５に従って製造されたＤＮＡカードに滴下して保存されたヒト肺癌組織のゲノムＤＮＡサンプルの鋳型と共に、ＰＣＲを、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子に対して行った。その産物は、プラスミドベクター中でクローニングされ、その後、再度自動塩基シークエンシングで検査された。その方法は、実施例７の方法と同様である。その結果を図１１に示す。
【０１０２】
結果として、変異原性のｐ５３遺伝子は、正確に増幅され（図１１）、本発明の方法により製造されたＤＮＡカードを用いて保存されたＤＮＡの場合、ＤＮＡは、長期間経過後でさえ、そのクローニング及び自動塩基シークエンシング可能であるように保存され、更に、遺伝子突然変異検査及び癌検査にも有益であることがわかった。
【０１０３】
実施例９：ＤＮＡ／キトサン複合体の鋳型によるサザンブロット法
本発明の方法により保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体を用いて、サザンブロット法及びそれに類するもののようなハイブリダイゼーションアッセイによる特定遺伝子の存在及び量を検査する際、キトサンと結合したＤＮＡはアガロースゲル電気泳動で動かず、それでブロッティングアッセイを行うことが困難となっている。そのため、ブロッティングアッセイのために、前記ＤＮＡサンプルは、キトサンを取り除いて用いなければならない。そのため、本発明では、キトサンと結合したＤＮＡからＤＮＡの損傷なしでキトサンを取り除くための方法を確立させた。
【０１０４】
上述したように、前記水溶性キトサンは、カチオン塩であり、ＤＮＡと結合する。それで、キトサンは、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＯＳ（オクチル硫酸ナトリウム）及びＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）のような硫酸塩である強カチオン塩で処理することによってＤＮＡから分離することができる。この場合、前記カチオン塩は、安価で、ＤＮＡに損傷なしで前記ブロッティングに影響を及ぼさないものであるべきである。そのため、本発明では、安価でＤＮＡとプローブ間のハイブリダイゼーション反応に影響を及ぼさないＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ社製造、米国）を用いた。
【０１０５】
本発明の方法に従って、キトサン溶液と膵臓癌組織ＤＮＡを混和することによって得たＤＮＡ／キトサン複合体は、室温で３ヶ月保存された。その後、５〜１０μｇの前記ＤＮＡ／キトサン複合体は、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと混和され、サザンブロット法のためアガロースゲル電気泳動にかけられた。サザンブロット法は、公知の方法（例えば、非特許文献１０参照）によってＫ−ｒａｓ遺伝子に対して行われた。その結果は、それぞれ図１２及び図１３に示す。
【０１０６】
図１２から、５％ＳＤＳ電気泳動の場合、前記ＤＮＡ及びキトサンは分離され、前記ＤＮＡは、前記ゲル中を移動することがわかった。
【０１０７】
加えて、図１３は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、６ヶ月間、キトサンと結合させず−７０℃で保存したＤＮＡと、キトサン／ＤＮＡの形態で保存されたＤＮＡの両方において、強く発現するという、前記サザンブロット法の結果を示した。そのため、本発明のＤＮＡ保存方法によって長期間保存されたＤＮＡを用いてサザンブロット法を行うための方法は確立された。更に、本発明の方法により保存されたＤＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイに有益であることがわかった。
【０１０８】
実施例１０：長期間前記ＤＮＡカードで保存されたＤＮＡに対する遺伝子のＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ可能性の調査
ＰＣＲは、本発明のタイプ1ＤＮＡカードを用いて保存されたヒトゲノムＤＮＡサンプルに対して行われ、その後、ＲＦＬＰ（制限断片長多型：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）アッセイを用いて、遺伝子型決定試験が可能かどうか検査された。前記タイプ１ＤＮＡカードのＤＮＡのＰＣＲ後、前記ＲＦＬＰアッセイを用いた遺伝子型決定の結果を、図８に示す。更に、遺伝子型決定が、本発明のタイプ２ＤＮＡカード中に、血液として保存されたヒトサンプルに対して、ＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いて可能かどうか調査された。その結果は、図９に示す。本発明のＤＮＡカードが、実際に、遺伝子診断、心臓血管疾患の発病と関連する遺伝子に用いることができることを証明するために、ＰＣＲによって増幅され、特定の制限酵素で、次の通りに処理をされた。その結果は、電気泳動によって解析された。結果として、多重遺伝子型の調査に問題を有さないことが分かった。
【０１０９】
本実施例は、以下に記述される。
【０１１０】
本発明によるタイプ１ＤＮＡカード、タイプ２ＤＮＡカード及びプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、それぞれ、以下の表に示すように、反応液を用いてＰＣＲチューブ中に、老人病に関連する次の６つの遺伝子を準備した。
【０１１１】
【表１】
上記準備した反応液を含む前記ＰＣＲチューブを、ＰＥ２７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製造、米国）に加え、次の通り、それぞれの遺伝子の条件に従い増幅した。
【０１１２】
１．ｅＮＯＳ１／２遺伝子，ＭＴＨＦＲ１／２遺伝子，ＡＧＴ１／２遺伝子，ＡＴ１Ｒ遺伝子及びＡＣＥ１遺伝子に対して、
９５℃／５分、３５サイクル（９５℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／４０秒）、７２℃／１０分とし、
２．ＡＣＥ２遺伝子及びＡＰＯＥ１／２Ｅ遺伝子に対し、
９５℃／５分、３５サイクル（９５℃／３０秒、６５℃／３０秒、７２℃／４０秒）、７２℃／１０分とした。
【０１１３】
こうして得られた各遺伝子のＰＣＲ生成物は、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１．２％アガロースゲル電気泳動を行うことにより確認された。各遺伝子の生成物の大きさは、次の表２に示す。
【０１１４】
【表２】
こうして得られたＰＣＲ生成物にＲＦＬＰを行うために、第一に、ＡＣＥ遺伝子だけを除く他の５つの遺伝子のＰＣＲ生成物を、次の通り、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造、米国カリフォルニア州）を用いて生成した。
【０１１５】
１．前記ＰＣＲ生成物（約２５ｌ）に、ＤＮＡ結合溶液を２倍量（例えば５０μｌ）加えた。
【０１１６】
２．予め用意されたＺｙｍｏスピンカラム（Ｚｙｍｏ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に、上記１の混合物の全てを加え、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。
【０１１７】
３．コレクションチューブに集められた溶液は、ピペットで取り除いた。
【０１１８】
４．２００μlの洗浄バッファーを前記カラムに加え、１３，０００ｒｐｍで４０秒間遠心分離した（２回繰り返し）。
【０１１９】
５．残った洗浄バッファーは、１３，０００ｒｐｍで４０秒間、空のコレクションチューブ中で遠心分離することにより、完全に取り除いた。
【０１２０】
６．前記コレクションチューブを取り除き、きれいな１．５ｍｌマイクロ遠心チューブを新しいカラムのために用意し、その後、２０μlの滅菌蒸留水をそこに加え、１３，０００ｒｐｍで４０秒間、溶出のために遠心分離した。もう一つの方法として、６５℃くらいに温めた滅菌蒸留水を用いてもよい。
【０１２１】
上記方法により精製し、得られたＰＣＲ生成物に対して、以下の表で各遺伝子に対応した制限酵素は、各制限酵素に対応した条件化で用意された。その後、４〜６時間３７℃の恒温槽に、反応のために固定し、その後、各遺伝子の危険性が、２．５％アガロースゲル電気泳動によって調査された。
【０１２２】
【表３】
実施例１１：キトサンを含むＰＣＲキットの製造
本発明のキトサンを用いたＤＮＡ保存方法の適用として、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ及びバッファー及びそれに類するものが、キトサンと共に一つのチューブに加えられたもの（一体型チューブ：ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ ｔｕｂｅ）、並びにＤＮＡまたは血清のようなサンプルが、ＰＣＲを誘導するためにチューブに加えられたものからなる、ＰＣＲキットが製造された。特徴として、このＰＣＲキットは、ＤＮＡ保存及びＰＣＲアッセイの両方において用いることができる。
【０１２３】
本実施例において、Ｂ型肝炎患者の血液から得たＤＮＡを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの存在を、本発明のＰＣＲキットを用いて調査を行った。前記キットは、癌関連遺伝子による癌診断またはＢ型肝炎ウイルス若しくはヒト乳頭腫ウイルス感染における病原体の診断、性感染症、他の細菌感染、及びそれに類するものにもまた適用することができる。
【０１２４】
このキットの使用方法は次の通りである。
【０１２５】
１０μｌの５ＧＧ一段階ＰＣＲバッファーＴＭ及びホットスタートタイプＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製造、米国）、２．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、それぞれ１．０μｌの標的遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマー（５ｐｍｏｌ）、及び、０．１％濃度のキトサンを含む一体型チューブに、１〜３μｇの鋳型ＤＮＡを加えた。全容積が５０ｌとなるよう、前記キットに蒸留水を注入し、よく混和し、その後、ＰＣＲを行った。始めに、逆転写反応を５０℃、３０分間行い、９５℃１５分間で変性を行い、続いて９４℃で１分間、５３℃で４０秒間及び７２℃で１分間のサイクルを合計２５〜４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間の反応で、ＰＣＲ増幅を完了させた。結果として、前記Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡの存在は、本発明のＰＣＲキットを用いて検出された（データは添付されていない。）。
【０１２６】
実施例１２：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードの製造
図１４は、本発明のＤＮＡカードを用いたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを製造する手順を示したフローチャートである。図１４のフローチャートにある手順を行い、プラスチック素材のＤＮＡ ＩＤカードを開発した。
【０１２７】
１．血液または口腔の細胞、ＤＮＡカードまたはそれに類するもの、及び個人写真データのような輸送された個人サンプルの領収（Ｓ２０１）。
【０１２８】
２．前記サンプルからゲノムＤＮＡの分離及び血液型の検査（Ｓ２０２）。
【０１２９】
３．抽出されたゲノムＤＮＡを用いたＨＬＡ遺伝子型のアッセイ、ＳＴＲ（縦列型反復配列：ｓｈｏｒｔ ｔａｍｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）個人識別遺伝子の検査、及び結果に対する分析（Ｓ２０３）。図１５は、ＳＴＲ検査の１５の組み合わせ、個人遺伝子型分析結果の用意、及びエンコード遺伝子型データを用いた個人遺伝子型識別の手順を示す概略図である。
【０１３０】
４．前記プラスチックカードに添付するための紙製ＤＮＡカードの結合、そして熱及び圧力を加えることによる前記ＤＮＡ ＩＤカードの枠組みの準備（Ｓ２０５）。図１６は、本発明のＤＮＡ ＩＤカードを準備するための手順において、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）カードに、タイプ１またはタイプ２ＤＮＡカードを結合させることを示す概略図である。図１６に示すように、ＰＶＣ軟層は、最下部に配置され、タイプ１ＤＮＡカードまたはタイプ２ＤＮＡカードは、その上に配置される。その後、ＰＶＣコア層はその上に配置され、前記紙製ＤＮＡカードとほぼ同じ大きさの穴を有している。（紙製カード及び紙の厚さと、ＰＶＣの厚さが、それぞれ異なる材料からつくられており、それで熱による結合で、一緒に結合されないので、カードの大きさの穴を用意する必要がある。具体的には、前記紙製カードが、この穴に挿入されている。）上端部にはＰＶＣコア層が残され、さらに２つの小さな穴（ＤＮＡまたは血液を紙製ＤＮＡカードに注入するためものであり、熱処理による前記カードの結合により、ほぼ空いた空間が残されていないので、前記紙製カード上に配置されなくてはならない。）を有する。最後に、ＰＶＣ軟層はその上に配置される。その後、８〜３０分間の熱処理が行われ、それらが結合される。このとき、前記紙製ＤＮＡカードの位置は、前記磁気帯の位置と対向し、そして、写真転写の位置とも対向する。図１７は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図である。
【０１３１】
５．Ｓ２０４（Ｓ２０５）で製造した、プラスチックＤＮＡ ＩＤカード及び保存のためのカード上への個人のＤＮＡまたは血液の滴下。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカード上への前記ＤＮＡ及び血液の滴下は、針を用いることで、前記ＰＶＣ軟層を貫通する前記ＰＶＣコア層の穴を介して、前記紙製ＤＮＡカードにＤＮＡ及び血液を注入することで行われる。注入後、針による穴は、ホログラム、ステッカー及びそれに類するものによってふさがれる。
【０１３２】
６．前記磁気帯または前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのチップ（Ｓ２０６）上の分析されたデータのエンコード。前記磁気帯は、通常３つのトラックから構成されている。英語で書かれることのできる前記トラックは、第１トラックで、７８ビット使用可能である。第２トラックは、３８ビット使用可能で、第３トラックは１０７ビット使用可能である。そのため、図１７で示すように、主な個人情報は第１トラックにエンコードし、患者の特定の疾病コードは、前記第２トラックにエンコードされ（例えば、Ｃ６１−Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒ Ｎ４０−Ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）、ＳＴＲ型またはＨＬＡ型の結果を入力したものは、第３トラックにエンコードされる。しかしながら、バンク及びそれに類するものと通信する場合、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのエンコード方法は、遺伝子情報がメインサーバ内でのみ認められ、前記バンクにより要求された時にエンコードされ、個人遺伝子情報及びそれに類するもののデータは、ＰＯＳシステムを用いてこのメインサーバから伝達される。この方法は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカード（Ｓ２０６）の更なる実用性を、最大限にするためものである。図１８は、本発明のＤＮＡ ＩＤカード上にエンコードしている情報の一例の概略図である。
【０１３３】
７．個人写真の複写及び主な個人情報の、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードへのエンボス加工法による刻み込み（Ｓ２０７）。
【０１３４】
８．（サーバのための）スーパーコンピュータへの個人データの入力、特定個人ＩＤコードの前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードへの割り当て、及び個人パスワードの設定（Ｓ２０８）。
【０１３５】
９．もし必要であれば各個人、病院、各組織またはバンク及びそれに類するものにおいて国内外の両方で、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに記録されているＩＤ及びパスワードを用いて、安全保守状態の場合における情報へのアクセスを許可するＰＯＳシステムの構成と操作（Ｓ２０９）。
図１５は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図である。前記カードの前面は、個人写真及び名前、簡単な個人情報（病院で、緊急時に直ちに処置できる程度）及び住所が記録される。前記カードの背面は、個人遺伝子情報がエンコードされた磁気帯があり、書名及びＤＮＡ保存場所を保持するように設計されている。
【０１３６】
実施例１３：前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに結合して保存される紙製ＤＮＡカードの断片から、遺伝子を増幅する実験。
【０１３７】
ＰＣＲにより、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子を増幅することにより、高温、高圧力で処理することにより予め作られていたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードに結合されるタイプ１またはタイプ２紙製ＤＮＡカードに保存されたＤＮＡから、増幅することが可能かどうか確認された。前記方法は、上記実施例１０と同様に行われた。
【０１３８】
タイプ１ＤＮＡカード及びタイプ２ＤＮＡカードは、高温、高圧力で製造されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードにそれぞれ結合され、それらの中で浸漬されて保存されたヒトゲノムＤＮＡ及び血液を有する。その後、これらのプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子は、比較のためＰＣＲによって増幅された。その結果は、図１９に示す。この実験を通して、血液を吸収するのに、本発明によるタイプ２ＤＮＡカードが用いられる場合、血液サンプルは滴下される必要があり、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのプラスチックカバーは、ＰＣＲ増幅において最初に取り除かれる必要がある。
【０１３９】
図２０は、老人病の遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子に対してのＰＣＲ増幅の結果を示し、実験室において、人工的に高温で圧力をかけない処理をしたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード及び実質的に高温、高圧力で準備したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用い、サンプルは前記カードの準備をする前に加えられた場合と、サンプルは前記カードの準備後に加えられた場合とを比較した。この実験を通して、得られた結果は、保存されたサンプルがＤＮＡまたは血液であることに関わらず、予め準備したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードにサンプルを滴下することがより良いことを示した。
【０１４０】
ＤＮＡを滴下したタイプ１ＤＮＡカード及び血液を滴下したタイプ２ＤＮＡカードは、ＤＮＡ ＩＤカードを準備するのに高温、高圧力で準備されたプラスチックカード上にそれぞれ付着していた。これらカードのそれぞれに滴下するサンプルの適切な濃度及び量を見つけるために、ゲノムＤＮＡの場合、上述したように、準備したカード断片を用いて、ＤＮＡサンプルを１５０ｎｇ含む濃度となるようにさまざまな体積にして滴下し、ｅＮＯＳ遺伝子はＰＣＲで増幅され、測定された。その結果を図２１に示す。この実験を通して、タイプ１ＤＮＡカード（ＤＮＡ用）に血液を滴下することは適切ではなく、少なくても１．５μｇ程度を、ＤＮＡ滴下時に滴下することができる。
【０１４１】
高温、高圧力で準備されたプラスチックＤＮＡカードによって保存されたサンプルのＰＣＲ増幅中に、前記カード断片が、前処理手順として洗浄バッファーで処理された場合と処理されなかった場合との間の相違を、ＰＣＲにより老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子を増幅することにより、比較及び分析した。その結果を図２２で示す。結果として、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いたＰＣＲ中、洗浄バッファーで前処理をしない場合に、より良くＰＣＲ増幅された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明による水溶性キトサンを用いたＤＮＡ保存方法は、ＤＮＡ保存有効性に優れており、従来方法に反して、室温で長期間安定してＤＮＡを保存することを可能にする。この方法を用いて、小さいプラスミドＤＮＡだけではなく、植物及び動物の大きいゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、並びに菌類、バクテリア及びウイルスのＤＮＡを、室温で安定して長期間、保存し、運搬することができる。本方法により保存されたＤＮＡは、ＰＣＲ及びＲＦＬＰ、クローニング、塩基シークエンシング、サザンブロット法及びそれに類するもののような遺伝子アッセイの全てに有益である。更に、ＰＣＲキット及びそれに類するもので広く用いられることができ、そして、簡易及び経済的である。特に、本発明のタイプ１ＤＮＡカードは、多数のＤＮＡサンプルを室温で長期間保存し、運搬するためにとても有益であり、タイプ２ＤＮＡカードは、血液のような、ＤＮＡを含む多様なバイオサンプルを、ＤＮＡを損傷することなしに、長期間室温で保存することができる。加えて、これらのＤＮＡカードで保存されたサンプルに対して、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ハイブリダイゼーション、塩基シークエンシング、ＳＮＰアッセイ及びそれに類するもののような、多様な遺伝子アッセイを、長期間経過後でさえ、正確かつ簡易に行うことができ、基礎研究及び多様な臨床治療にとても役立つ。また、本発明のＤＮＡ ＩＤカードは、個人のＤＮＡを保存するＤＮＡバンクとしての役割を担うことができ、その上、個人の遺伝情報を保存することにより、個人識別及び臓器移植及びそれに類するもののような医療にも役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】本発明による、ＤＮＡと水溶性キトサンとの複合体の生成及び分析の工程を示すブロック図。
【図２】１μｇ／μｌの濃度の正常成熟単球から分離したゲノムＤＮＡとさまざまな濃度の水溶性キトサン溶液を、様々な割合で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体に対する０．８％アガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂ），レーン２：ＤＮＡ単体，レーン３：０．０２％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．２，レーン４：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．４：レーン５：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．６：レーン６：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：１：レーン７：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２：レーン８：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：３：レーン９：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２．５：レーン１０：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：５：レーン１１：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：７．５）
【図３】１μｇ／μｌの濃度で４．０ｋｂの大きさのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）と様々な濃度の水溶性キトサン溶液を様々な割合で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体に対する０．８％アガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂ）：レーン２：ＤＮＡ単体：レーン３：０．０２％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．２：レーン４：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．４：レーン５：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．６：レーン６：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：１：レーン７：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２：レーン８：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：３：レーン９：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２．５：レーン１０：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：５：レーン１１：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：７．５）
【図４】キトサンと結合したヒトリンパ球のゲノムＤＮＡと、キトサンと結合してないＤＮＡに対してデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ Ｉ）で処理することによるＤＮＡの開裂の度合いを１％アガロースゲルで比較、分析する写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂラダー），レーン２：ＤＮＡのみ，レーン３：キトサン／ＤＮＡ複合体、２０分後，レーン４：キトサン／ＤＮＡ複合体、４０分後，レーン５：キトサン／ＤＮＡ複合体、６０分後，レーン６：キトサンと結合していないＤＮＡ、２０分後，レーン７：キトサンと結合していないＤＮＡ、４０分後，レーン８：キトサンと結合していないＤＮＡ、６０分後）
【図５】０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のヒト白血球ゲノムＤＮＡ水溶液を、体積比１：１で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体及びキトサンと結合していないヒト白血球のゲノムＤＮＡそれぞれの鋳型と、β‐アクチン遺伝子に対して行ったＰＣＲの０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を表す写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｋｂ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（白血球ゲノムＤＮＡは、直接分析された。），レーン４：ゲノムＤＮＡをＤＮＡカード（タイプ１）に滴下した後、その後、室温で１年間保存したもの，レーン５：ゲノムＤＮＡをＤＮＡカード（タイプ２）に滴下した後、その後、室温で１年間保存したもの，レーン６：ブロッティング用の紙に血液を吸着させた後、室温で１年間保存したものの分析，レーン７：ブロッティング用の紙に白血球のゲノムＤＮＡを吸着させた後、室温で１年間保存したものの分析）
【図６】様々な温度、及び期間保存された、０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のヒト白血球ゲノムＤＮＡ水溶液を体積比１：１で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体と、キトサンと結合していないＤＮＡ両方の鋳型と、β‐アクチン遺伝子に対して行ったＰＣＲの０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を表す写真（レーン１：サイズマーカー（１００ｂｐ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（血液から分離、精製された後、直ちにＰＣＲを行われたＤＮＡ），レーン４：−７０℃で３ヶ月間保存されたＤＮＡ単体，レーン５：室温で１週間保存されたＤＮＡ単体，レーン６：室温で１ヶ月間保存されたＤＮＡ単体，レーン７：室温で３週間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン８：室温で３ヶ月間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン９：室温で１年間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン１０：室温で３週間保存されたタイプ１ＤＮＡカードに滴下されたＤＮＡ，レーン１１：室温で３ヶ月間保存されたタイプ１ＤＮＡカードに滴下されたＤＮＡ）
【図７】様々な種類のブロッティング用の紙に、キトサンを吸着させ、ピペットで正常な成熟白血球ＤＮＡを滴下し、乾燥することで作られ、室温で６ヶ月保存されたタイプ１ＤＮＡカードを、ＰＣＲによって、それぞれを比較、分析した結果を表したアガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｋｂ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（血液から分離、精製された後、直ちにＰＣＲを行われたＤＮＡ），レーン４：０．０２％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン５：：０．０２％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン６：０．１％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン７：０．１％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン８：０．２５％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン９：０．２５％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン１０：０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理をしていないＤＮＡカード，レーン１１：０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理をしていないＤＮＡカード）
【図８】本発明のタイプ１ＤＮＡカードと、水溶性キトサンを用いて保存されたヒトゲノムＤＮＡサンプルに対してのＰＣＲ後のＲＦＬＰアッセイを用いた遺伝子型テストの結果を示す写真。（（ａ）：成熟白血球から直接分離・精製したＤＮＡサンプルである、ポジティブコントロール， （ｂ）：成熟白血球から直接分離・精製し、本発明のキトサン溶液と混和したＤＮＡサンプルで、室温で３ヶ月保存されたもの， （ｃ），成熟白血球から分離精製されたＤＮＡサンプルで、保存するために、本発明のタイプ１ＤＮＡカードに移し、室温で１年間保存したもの。（レーン１及び１２：１００ｂｐサイズマーカー， レーン１１：２５ｂｐサイズマーカー， レーン２及び３：アポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ）遺伝子に対するアッセイ， レーン４及び５：アンジオテンシン（ＡＧＴ）遺伝子に対するアッセイ， レーン６及び７：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子に対するアッセイ， レーン８：アンジオテンシン１受容体（ＡＧＴ１Ｒ）遺伝子に対するアッセイ， レーン９及び１０：内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子に対するアッセイ， レーン１３及び１４：ＭＴＨＦＲ遺伝子に対するアッセイ）
【図９】本発明のタイプ２ＤＮＡカードのサンプルに対する、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイを用いて、遺伝子型検査の結果を示す写真。（（ａ）：成熟白血球から直接、分離及び精製したＤＮＡサンプルであるポジティブコントロール， （ｂ）本発明のタイプ２ＤＮＡカードに吸着させた成熟した血液を有し、室温で３ヶ月間保存されることにより作られたＤＮＡサンプル， （ｃ）：本発明のタイプ２ＤＮＡカードに吸着させた成熟した血液を有し、室温で保存されることにより作られたＤＮＡサンプル， レーン１及び８：１００ｂｐサイズマーカー， レーン７及び１５:２５ｂｐサイズマーカー， レーン２及び３:アンジオテンシノーゲン遺伝子， レーン４及び５：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子， レーン６：アンジオテンシン受容体１（ＡＴ１Ｒ）遺伝子， レーン９及び１０：内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子， レーン１１及び１２：ＭＴＨＦＲ遺伝子， レーン１３及び１４：アポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ）遺伝子）
【図１０】成熟した結腸組織のゲノムＤＮＡの鋳型を用いて、ＰＣＲを行うために、本発明の方法による水溶性キトサン溶液と混和され、室温で１ヶ月間保存され、その産物をクローニングしたものの、自動塩基シークエンシングアッセイによるＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）遺伝子調査結果を表すグラフ。
【図１１】肺癌組織のゲノムＤＮＡの鋳型を用いて、ＰＣＲを行うために、本方法に従って本発明のＤＮＡカードに滴下し、室温で３ヶ月間保存され、その産物をクローニングしたものの、自動塩基シークエンシングアッセイによるｐ５３遺伝子調査結果を表すグラフ。
【図１２】ＳＤＳを用いて、キトサンとＤＮＡとの複合体から、キトサンとＤＮＡに分離する結果を表すアガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｂｐ）， レーン２：ＤＮＡ単体， レーン３：０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）， レーン４：０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体， レーン５：１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体， レーン６：５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体）
【図１３】本発明の方法による膵臓癌組織のゲノムＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）と０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を体積比１：１で混和し、室温で３ヶ月間保存することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体の鋳型を用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に対してサザンブロット法を行った写真。（レーン１：室温で１ヶ月間保存された膵臓癌組織のＤＮＡ， レーン２：室温で１ヶ月間保存された膵臓癌組織のＤＮＡ／キトサンの複合体， レーン３：−７０℃で１ヶ月間保存された、正常なヒトの末梢血中の白血球から得たＤＮＡ， レーン４：室温で１ヶ月間保存された、正常なヒトの末梢血中の白血球から得たＤＮＡ）
【図１４】本発明のＤＮＡカードを用いて作られた、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードの製造工程を示すフローチャート。
【図１５】ＳＴＲ検査の１５個の組み合わせを用いて、個人の遺伝子型の識別をし、個人の遺伝子型の分析結果、及び個人の遺伝子型データをエンコードする処理を示す概略図。
【図１６】本発明のＤＮＡ ＩＤカードの製造の手順において、前記ＰＶＣカードの内側にタイプ１またはタイプ２ＤＮＡカードを結合されることを示す概略図。
【図１７】本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図。
【図１８】本発明のＤＮＡ ＩＤカード上に情報をエンコードするものの一実施例の概略図。
【図１９】血液及びｇＤＮＡが、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに保存されたとき、高温及び高圧力で製造されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード(血液用)で、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を比較した結果を示す写真。（レーン１及び７：サイズマーカー（１００ｂｐ）， レーン２：ＤＮＡ ＩＤカードに血液を滴下したもの(血液用)， レーン３：ＤＮＡ ＩＤカードにｇＤＮＡを滴下したもの（血液用）， レーン４：ＤＮＡ ＩＤカード(血液用)に血液を滴下し、プラスチックカバーをしたもの， レーン５：ＤＮＡ ＩＤカード(血液用)にｇＤＮＡを滴下し、プラスチックカバーをしたもの， レーン６：ネガティブコントロール）
【図２０】研究室で、人工的に、サンプルを、高温で圧力をかけない処理及び実質的に高温で高圧力を掛ける処理状態に置く時間を変えて製造したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１：ＤＮＡのためのＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは室温で装填されたもの， レーン２：ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは１８０℃で３０分間燃焼後に装填， レーン３：ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは１８０℃で１時間燃焼後に装填， レーン４：室温でＤＮＡ装填後１８０℃で１時間処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン５：ＤＮＡ装填後１８０℃で３０分処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン６：ＤＮＡ装填後１８０℃で１時間処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン７：高圧力（１２５ｂａｒ）及び高温（１８０℃）を作り出され、その後血液を装填された、血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン８：高圧力（１２５ｂａｒ）及び高温（１８０℃）を作り出され、その後ＤＮＡを装填された、血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン９：血液を装填され、その後高温（１８０℃）及び高圧力（１２５ｂａｒ）で処理された血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン１０：ＤＮＡを装填され、その後高温（１８０℃）及び高圧力（１２５ｂａｒ）で処理された血液用のＤＮＡ ＩＤカード）
【図２１】高温及び高圧力で処理されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード、具体的には、１５０ｎμｇ／μｌのｇＤＮＡ及び血液をそれぞれ量を変えて滴下し、その後保存された、ＤＮＡ用及び血液用のカード断片を用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１：ネガティブコントロール， レーン２：ポジティブコントロール（血液のｇＤＮＡ）， レーン３：ｇＤＮＡ(５ｌ)は室温で装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン４：ｇＤＮＡ(１０ｌ)が装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン５：ｇＤＮＡ(５０ｌ)が装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン６：血液（１０ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用）， レーン７：血液（５０ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用）， レーン８：血液（１００ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用））
【図２２】高温及び高圧力で処理されたＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＰＣＲ増幅の前処理手順として洗浄バッファーで処理された、いくつかのカード断片で保存されたサンプルを用いて、老人病遺伝子の一つである内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１及び１０：１００ｂｐサイズマーカー， レーン２：ネガティブマーカー， レーン３：ＤＮＡが保存されたコレクティングカードを４日後に室温で洗浄バッファーにより処理することで作られたカード断片， レーン４：ＤＮＡが保存され、ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）が含まれるコレクションカードを、４日後に室温で洗浄バッファーで処理することで作られたカード断片， レーン５：ＤＮＡが保存されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを４日間室温で放置した後、洗浄バッファーで処理することにより作られたカード断片， レーン６：０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を３ｍｍ厚の紙に滴下することで作られたカード断片を、オートクレーブで滅菌し、室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン７：コレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することで作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン８：ＢＰＢコレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン９：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン１１：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたコレクションカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１２：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたＢＰＢコレクションカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１３：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１４：０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を３ｍｍ厚の紙に滴下することで作られたカード断片を、オートクレーブで滅菌し、室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１５：コレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することで作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１６：ＢＰＢコレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１７：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの保存方法に関するものであり、上述した方法及び前記方法による生成物に保存されたＤＮＡを分析する方法である。より詳しくは、本発明は、長期間にわたり安定した状態でＤＮＡを保存する方法であり、上述した方法により保存されたＤＮＡを分析する方法であり、上述した保存及び分析方法により生成された紙製又はプラスチック製のＤＮＡカードのようなＤＮＡ ＩＤカードに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物の持つ全ての遺伝子の集合は、ゲノム（全遺伝子情報）といわれる。ヒトゲノムは３０億の塩基で構成され、そして約３０，０００遺伝子を有していることが報告されている。近年、全てのヒトゲノムの塩基配列をエンコード（ｅｎｃｏｄｅ）するヒトゲノムプロジェクトは完了し、それにより診断の画期的な進歩及び遺伝子を用いることで解決困難な病気の治療が可能となった。いわば、オーダーメイド医療や予測医療の時代が始まっている。
【０００３】
生命現象は３つの事象（１）ゲノム遺伝子の遺伝情報、（２）遺伝子転写、（３）タンパク質の発現により決定される。生命現象を理解し解析するために、そして病気の診断と治療のための方法の発展のために、上記３つの事象を正確に解析することが重要である。個々の遺伝子の集合は、遺伝子又はゲノムといわれ、それ故に、個々の転写遺伝子（例えば、ｍＤＮＡ）の集合及び発現したタンパク質の集合は、それぞれトランスクリプトーム及びプロテオームといわれる。近年、このような総合的な情報の自動化した分析に関する研究が、活発に進められている。分析の自動化にとって、マイクロアレイやバイオチップは有益であり、そしてこれらの代表的な例に、ＤＮＡチップやタンパク質チップが含まれている。
【０００４】
ゲノムＤＮＡの遺伝情報の定性的及び定量的な分析のための一般的な方法に関して、ハイブリダイゼーション分析、シークエンシング、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップ、又はＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング及び作製されたライブラリーを活用したその類似方法、サザンブロット法、またはそれに類する方法（例えば、非特許文献１参照）が、言及されてもよい。
【０００５】
個人のＤＮＡを検査することにより、その個人の健康状態を理解することができ、そして、その個人が、遺伝病の将来発症する可能性及び子供への遺伝を予測するのと同様に、癌や感染症のような様々な病気にかかるかどうかの診断をすることができる。更に、ＤＮＡ検査は、身元や実父確定のような親族を探るための最も正確な方法である。家系や系図を探る上でもまた有用である。これらの理由から、ＤＮＡ検査は、法医学及び骨髄や他の内臓またはその類似物の供与の際における適合性を識別するための手段として、必然的に用いられている。更に、一塩基変異多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ：ＳＮＰ）を分析することにより、病気の将来発症する可能性、医薬品の作用、またはその類似することを予測する助けとなるかもしれない。
【０００６】
将来におけるＤＮＡの保存の必要性として、ＤＮＡ検査が認められており、各国は、にわかにＤＮＡバンクを設立している。そして、前記ＤＮＡバンクのサンプルの数は、ＤＮＡ保存を旅行保険や傷害保険と比較すると、米軍やそれに類するもののＤＮＡを保存することを理由として、大部分は増加の傾向にある。しかしながら、全国的な組織や営利団体で個人のＤＮＡを保存することは、個人の遺伝情報を悪用するような問題を有するかもしれない。加えて、既存技術を用いて長期間安全にＤＮＡを保存するために、冷凍庫と特定の試薬が必要となり、こうして、その結果、ＤＮＡの保存のためのコストは、大きいものとなる。
【０００７】
実際、細胞から分離、精製されたＤＮＡが、室温で立たせたまま放置されるとき、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によってＤＮＡが急速に分解または断片化される問題を生じるかもしれない。そのため、遺伝子の研究においてＤＮＡを保存する方法は、重要である。現在、広く用いられている、血液、細胞または組織への方法、冷凍庫で保存する方法、冷凍乾燥保存による方法、２−プロピルアルコール中に保存する方法、及びそれに類する方法である、ＤＮＡを保存または運搬する方法として、言及されてもよい。しかしながら、これらの方法は、コストと損失の視点から多くの不利点がある。液体状態で精製ＤＮＡを保存する方法は、ＤＮＡを直ちに使用するのに容易であるが、ＤＮＡは、長期間保存すると容易に損傷してしまうという問題がある。前記冷凍庫による保存方法及びフリーズドライ保存の方法は、サンプルを用いる過程において繰り返し冷凍と解凍をすることによって損傷するかもしれないという問題がある。更に、アルコールのような試薬を用いて保存する方法もまた、他の方法と同様に前処理及び後処理による過程でいくつかの問題がある。その上、上記過程における最も重要な問題は、保存のために血液のような体液から、ＤＮＡを先ず精製する必要があることである。
【０００８】
上記のＤＮＡ保存方法は、超低温冷凍庫、液体窒素またはそれに類するもののような特別高価な設備を必要とする。それゆえに、前記方法は、経済性の視点で負担を与えるかもしれなく、前記方法は分析のために保存していたＤＮＡを再利用するとき前処理及び後処理の過程を必要とし、そして前記方法は冷凍と解凍の過程を繰り返すことによりＤＮＡを損傷するかもしれないという不利点がある。
【０００９】
上述した方法に加えて、近年、ワットマン社及びそれに類するものによって、ＦＴＡカードまたはカード製品のようないくつかの市販製品が、室温でプラスミドＤＮＡ保存のために、導入された。しかしながら、この方法は、その有効性に制限があり、それ自身を室温の代わりに−15℃または−20℃でＤＮＡを保存することが勧められている。それゆえ原法を超える大きな利点はなく、コスト問題の上昇においてむしろ不利となる。
【００１０】
そのため、分子遺伝学及び薬学の分野において、ＤＮＡとの安定した結合を形成することにより、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを保護するために、室温で安定な状態でＤＮＡを保存し、更に、ＤＮＡを用いた研究や分析に直接適用することが可能な方法を発展させることは重要な課題である。保存の典型的な方法は、（１）ＤＮＡ分解を起こすことなしに室温で安定な方法であり、（２）簡易な方法であるべきであり、（３）費用を効率的にできる方法であるべきであり、（４）ＤＮＡ保存は、ＤＮＡ自身を分離、精製するためのみではなく、ＤＮＡに損傷を有することのない、血液のような体液や様々なＤＮＡを含むサンプルのためであるべきであり、（５）様々なＤＮＡサンプルは、限られた空間で保存されるべきであり、（６）個人は、その個人のＤＮＡを保存できるべきであり、（７）様々な遺伝子において、これ以降の分析でいかなる問題も有すべきではなく、そして、それらの遺伝子検査は実際の診断または研究に有益であるべきである。しかしながら、これらの状態を満足する方法または製品はこれまでのところ発表されておらず、個人の遺伝情報とともに個人のＤＮＡを保存する製品の報告は見つけることができない。
【００１１】
キトサンは、生体への安定性、生分解性及び適合性に優れる、生物学的に生産された高分子であり、薬学の分野において広く用いられている。キトサンを酸で処理すると、水溶性キトサン塩を形成し、強い正電荷に荷電される。それゆえに、近年、前記キトサン塩は薬剤、タンパク質及びＤＮＡの優れた運搬手段として注目されてきている。特に、ＤＮＡの保護のために、水溶性キトサンはアニオン性物質であるＤＮＡと強い結合を形成する。そのため、前記水溶性キトサンは、遺伝子運搬のための媒体物質として供給してもよい。
【００１２】
キトサンは、グルコサミンとＮ−アセチルグルコサミンとの共重合体であり、キチンから得られる。キチンは、カニやエビのようなクラスタシィアンに豊富に含まれており、セルロースの次に最も豊富な天然高分子の物質である。キトサンは、カチオン性ポリマーの総称であり、キチンを強塩基で脱アセチル化させることにより得られる(例えば、非特許文献２参照)。
【００１３】
キトサンは、中性または塩基性ｐＨでは溶解しないが、グルタミン酸、塩酸、乳酸またはそれに類するもののような酸と反応すると、キトサン塩またはカチオン性キトサンを形成する。前記キトサン塩は、水に溶解し、その溶解性は、脱アセチル化及びｐＨの程度に比例する。水溶性キトサンの場合、アミン基にプロトンを加えることにより、正に荷電する。更に、水溶性キトサンは、フリーズドライ状態にすることができる。
【００１４】
水溶性キトサンは、強い正電荷を有する膜またはゲルを形成する特性を持つ。これに関連して、キトサンは、汚水、重金属または飲用水の精製に用いられており、そして抗カビ物質である。酒類、健康食品及び化粧品の原料としても用いられる。加えて、キトサンは薬学の分野における重要な手段として用いられる。例えば、キトサンは、ワクチンの運搬、ＤＮＡの運搬、タンパク質の運搬の円滑化、精製及び制御された薬の放出システムによる生成物を通じたペプチドおよび薬剤、ゲル、膜、湿潤剤、コーティング剤、マイクロスフィア、マイクロカプセル、生体接着及び粘膜、及びそれに類するものに広い範囲で用いられる(例えば、非特許文献３参照)。
【００１５】
キトサンは、非常に安全で、免疫性により引き起こされる副作用を示さない。キトサンが生体に吸収されると、リゾチームでＮ−アセチルグルコサミンに分解され、その後糖タンパク質の合成に用いられ、その後、生じた残余は、二酸化炭素の形態として排出される(例えば、非特許文献４参照)。
【００１６】
本発明による水溶性キトサンまたはカチオン性キトサンの最も重要な特性は、アニオン性物質であるＤＮＡと強い結合を形成することであり、ＤＮＡの防御及び運搬手段、すなわち、遺伝子運搬物質として用いることができる。プラスミドＤＮＡを用いた実験において、ＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮａｓｅ ＩＩのようなＤＮＡヌクレアーゼによって分解されず、ＤＮＡを安全に保存することに関するキトサンの機能が報告されており、キトサンとプラスミドＤＮＡの複合体がインビトロ培養細胞に注入されると、運搬遺伝子の発現の引き金となる(例えば、非特許文献５参照)。遺伝子運搬効果は、（１）キトサンの分子量、及び（２）キトサンのＤＮＡに対する割合、特に、アニオン性ＤＮＡのリン酸塩分子とカチオン性キトサンの窒素分子に対する割合である窒素／リン酸塩によって決定される(例えば、非特許文献６参照)。
【００１７】
プラスミドＤＮＡがＤＮＡとして室温で立たせたまま放置されるとき、前記プラスミドＤＮＡは数時間で分解される。しかしながら、プラスミドＤＮＡが、キトサンとの複合体の形態に維持されているとき、前記プラスミドＤＮＡは、３月以上保存することができる（例えば、非特許文献７参照）。一方、キトサン及びプラスミドＤＮＡの複合体が、フリーズドライ状態で保存されているとき、前記遺伝子運搬効果は４週間後まで持続させることができる（例えば、非特許文献８参照）。
【００１８】
しかしながら、室温で長期間のあいだ、キトサンと結合した哺乳類の巨大ゲノムＤＮＡを安定して保存する可能性における研究、及びキトサンと結合しＤＮＡを安定して保存する可能性における研究は、今までに報告されていない。その上、キトサンを用いてＤＮＡを保存するために生成された生成物は、大量生産されていない。また、キトサン結合ＤＮＡを用いた遺伝子発現の分析を行うことの可能性、並びにキトサン及び血液のような体液の混合形態でＤＮＡを保存する対象は、（ＤＮＡ自身以上に）報告されていない。更に、キトサンを用いてヒト又は動物のゲノムＤＮＡを保存、運搬及び分析するための生成物は、本発明の生成物を除いて、公開されていない。
【非特許文献１】Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (2001)
【非特許文献２】Errington N., Harding S.E., Varum K.M., Illum L., Int. J. Biol. Macromol., 15, 1123-1127 (1993)
【非特許文献３】Illum L., Pharmaceutical Research, 15, 1326-1331 (1998)
【非特許文献４】Chandy T., Sharma C.P., Biomat. Art. Cells Art. Org., 18, 1-24 (1990)
【非特許文献５】Lee M., Nah J-W., Kwon Y., Koh J.J., Jo K.S., Kim S.W., Pharmaceutical Research, 18(4), 427-531 (2001)
【非特許文献６】Borchard G., Advanced Drug Delivering Reviews, 52, 145-150 (2001)
【非特許文献７】(Leong K.W., Mao H.Q., Turong-Lee V.L., Roy K., Walsh S.M., August J.T., J. controlled Rel., 53, 183-193 (1998)
【非特許文献８】Mao H.Q., Turong-Lee V.L., August J.T., Leong K.W., Proc. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24, 671-772 (1997)
【非特許文献９】Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press. 2001:7.1-7.88
【非特許文献１０】Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明における一つの側面は、水溶性キトサンを用いて、室温で安定状態でありＤＮＡサンプルを保存、運搬する方法を提供することである。
【００２０】
本発明における他の側面として、水溶性キトサンと、ＤＮＡ検査の様々な方法で用いることができる安定化されたＤＮＡとの複合体を提供することである。
【００２１】
本発明におけるキトサンを用いてＤＮＡを保存する方法によると、本発明における更なる側面は、室温で長期間ＤＮＡを運搬及び保存し、ＤＮＡを容易に研究及び分析し、または容易にアプリケーションに掛けることがために、ＤＮＡと安定な結合を形成することができるような適切な特性及び濃度を持つキトサン溶液を提供することである。
【００２２】
本発明による更なる側面は、キトサンを含む紙製カード（ＤＮＡカード）を製造する方法を提供することであり、液体状態として、及び最小限の空間中での多量のＤＮＡサンプルとしてのＤＮＡとキトサンとの結合物を保存することができ、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰのような遺伝分析、クローニング、配列分析及びサザンブロット法、マイクロアレイテスト及びそれに類するものを行うための方法であり、キトサンとＤＮＡとを、その結合された状態から分離する方法である。この場合、ＤＮＡカードは、タイプ１とタイプ２に大まかに分類することができ、タイプ１は、キトサンを含む紙製カードに、ＤＮＡ自身を保存し、タイプ２は、キトサンと細胞融解バッファーとを備える紙製カードにＤＮＡ以外に血液のようなＤＮＡを含むバイオサンプルを保存するものである。両方の場合において、該対象物は、室温で長期間安定した状態でＤＮＡを保存することができ、そして、もし必要であるならば様々な遺伝分析を行うことができる。
【００２３】
本発明のもう一つの側面として、キトサンとの混合物の形態で個々のＤＮＡサンプルが保存されるＤＮＡ身分証明書（ＤＮＡ ＩＤ ｃａｒｄ）を提供することであり、個々の遺伝情報は、身分証明のための遺伝子検査、ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）遺伝子型決定検査又はそれに類する検査を行うことにより得られ、プラスチックカードの磁気帯又はチップに保存される。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードは、様々なクレジットカード及びキャッシュカードのような個人情報、重要な組織への入場券、バイオパスポート、軍隊若しくはそれに類するもの、または骨髄移植のような臓器移植のための遺伝情報を共有するために用いられることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明における、動物及び植物の巨大ゲノムＤＮＡを保存する新しい方法で、結果として、水溶性キトサンは、ＤＮＡと混合されているとき、安定な結合は、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを保護するために形成され、室温で安定した状態で長期間保存することができ、こうして本発明は完成する。
【００２５】
本発明による方法及び生成物によって達成できる状態は以下の通りである。
【００２６】
１）ＤＮＡは、分解されることなしに室温で安定した状態で保存されるだろう。
【００２７】
２）ＤＮＡサンプルは、ここでは、ゲノムＤＮＡと、ヒト、動物、植物及びバクテリアのｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ）と、プラスミドＤＮＡとを含むだろう。
【００２８】
３）前記方法は、容易であり、特別な装置や手段を用いる必要が無いだろう。
【００２９】
４）前記コストは経済的であるだろう。
【００３０】
５）ＤＮＡの保存は、ＤＮＡ自身の分離及び精製のためのみではなく、血液のような体液、及びＤＮＡ上に損傷を受けていない様々なＤＮＡを含むバイオサンプルのためでもあるだろう。
【００３１】
６）ＤＮＡサンプルは、紙またはカードのような単純な媒介物を用いて保存されるだろう。
【００３２】
７）多くのＤＮＡサンプルは限られた空間で保存されるだろう。
【００３３】
８）個人は、本人のＤＮＡを保存することができるだろう。
【００３４】
９）前記ＤＮＡサンプルに関して、前記ＤＮＡサンプルは、上記方法及び生成物によって保存及び運搬され、ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ハイブリダイゼーション、配列分析、ＳＮＰ分析及び、それに類するもののような様々な遺伝分析を長期間経った後でさえ正確且つ簡単に行うことができ、様々な臨床試験と同様に研究においても有益であるだろう。
【００３５】
１０）前記ＤＮＡ ＩＤカードは、個人のＤＮＡを保存するためのＤＮＡバンクとして機能し、前記ＤＮＡ ＩＤカードと一緒に個人の遺伝情報もまた保存できるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下、本発明を、図面を参照して詳細を説明する。
【００３７】
図１は、本発明による、ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合生成物の製造及び分析工程を示すブロック図である。前記ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合生成物を製造する工程を調べるとき、まず図１を参照して、前記ＤＮＡと水溶性キトサンとの結合の最適条件を確立し、そして、ＤＮＡヌクレアーゼに対する防御の効果、及び前記ＤＮＡとキトサンとの混合物の移動度シフトを分析する（Ｓ１０１）。その後、液体状態としての前記ＤＮＡとキトサンとの混合物に関して、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０２）。上記結果を用いて、前記タイプ１ＤＮＡカードは製造され、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０３）。同様に、タイプ２ＤＮＡカードを製造し、ＰＣＲアッセイ及びＤＮＡ保存の効果の分析を実施する（Ｓ１０４）。上記製造されたタイプ１及びタイプ２ＤＮＡカードで長期間保存されたサンプルに基づく遺伝分析の可能性を分析する（Ｓ１０５）。続いて、キトサンを含む一体型ＰＣＲキットを製造する（Ｓ１０６）。その後、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードを製造する（Ｓ１０７）。
【００３８】
本発明において、ＤＮＡと安定な複合体を形成し、デオキシリボヌクレアーゼによる分解からＤＮＡを守り、室温で安定した状態でＤＮＡを保存するため、適切な特性及び濃度の水溶性キトサン溶液、紙製カードまたはこのような溶液を含むＰＣＲキット、及びプラスチックＤＮＡ ＩＤカード及びそれに類するものが用いられる。
【００３９】
本発明によるキトサンは、分子量１０〜５００ｋＤａであることが望ましい。１０ｋＤａより少ない分子量を有するキトサンは、ＤＮＡと安定した結合を形成する際に問題を有し、５００ｋＤａを超える分子量を有するキトサンは、ＤＮＡを用いた遺伝子発現分析で干渉を起こすかもしれない。更に、６０％以上の度合いで脱アセチル化しているキトサンが望ましく、脱アセチル化の度合いが６０％より少ない場合、キトサンの水溶性に関する問題が生じ、それ故、ＤＮＡと安定した結合を形成することが困難となる。調整されたキトサンの水溶液の濃度は、体積に対する重量の割合（ｗ／ｖ）に関して、０．０２〜１％であり、望ましくは０．１％である。キトサンの水溶液とＤＮＡの水溶液とを混合する際の混合比は、ＤＮＡの水溶液中のＤＮＡに対するキトサンの水溶液中のキトサンの重量比に関して、１：０．５以上であり、望ましくは１：０．５〜１：３（実施例１及び２）である。
【００４０】
本発明におけるＤＮＡ／キトサン結合生成物は、室温から−７０℃の広い範囲内で保存され、そして、湿気の無い暗所で保存される。
【００４１】
一方、本発明における水溶性キトサンと結合する形態で保存されるＤＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼによる分解が発生していてさえ、安定して保存され、それ故、遺伝分析のために用いられることができる（実施例２に示す）。
【００４２】
本発明によると、ヒト、動物または植物、バクテリア、及びプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡは、キトサンとの混合物として保存することができ、望ましくは、ｃＤＮＡを含む。キトサンとの混合物として保存されることができるＤＮＡの大きさは、数１０から数１０億塩基と様々である。
【００４３】
一方、本発明による水溶性キトサンと結合したＤＮＡの液体混合物は、安定して保存される。そして、本発明によるＤＮＡ保存のための方法の有効性は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、クローニング、ブロッティング、シークエンシング及びそれに類する方法のような検査を行うことにより、容易に確認することができる。
【００４４】
本発明によると、ＤＮＡ保存のためのカード（タイプ１ＤＮＡカード）は、適切なキトサンと尿酸とが混合され（詳しくは、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の前記水溶性キトサン溶液に対する、０．５ｍＭ〜２０ｍＭの尿酸の、混合物における割合は１：１である。）、ブロッティングのための紙に前記混合物を吸収させ、その後、乾燥させることにより製造することができる。上述したカードを用いることにより、多くのＤＮＡを長期間保存することができ、室温で、最小の空間で運搬することができる。ＤＮＡ保存のためのカードの製造に用いる紙としての、クロマトグラフィーまたはブロッティングのための様々な紙は、一般に用いられているものを用いてもよく、前記紙の厚さは、約０．３ｍｍ〜１．２ｍｍのものが望ましい。前記ＤＮＡ保存のためのカードの保存温度は、室温に適しているが、−２０℃〜−７０℃とより低い温度でも可能であり、室温で６ヶ月以上の保存が可能である（実施例５）。
【００４５】
本発明によるＰＣＲを行う際、ＤＮＡとキトサンとの混合物が液体である場合は、前記混合物自身は鋳型として用いられ、前記混合物がカード形態である場合は、前記カードの断片は切断され、ＰＣＲ増幅、クローニング及び配列分析の一般的方法を実行する鋳型として用いられる。その結果、本発明の方法により保存されたＤＮＡを用いて遺伝分析を充分に行えるように、ＤＮＡが保存されることが確認される(実施例５)。
【００４６】
本発明によると、ＤＮＡ保存のためのカード（タイプ２ＤＮＡカード）は、トリス、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）及び尿酸を備える細胞溶解バッファー（詳しくは、トリス（８ｍＭ）、ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）、ＳＤＳ（０．１％ ｗ／ｖ）及び尿酸（２ｍＭ））と、適切なキトサン溶液の混合物を、ブロッティング用の紙に吸収させ、その後乾燥することにより製造することができる。上述したカードを用いることにより、ＤＮＡを長期間保存することができ、血液のようなＤＮＡを含むバイオサンプル状態として、室温で運搬することができる(実施例６)。
【００４７】
一方、本発明のＤＮＡカードを用いて保存されたＤＮＡは、安定して保たれ、ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング、配列分析及びそれに類するもののような検査をこれ以降行うことができる(実施例７〜１０)。
【００４８】
更に、サザンブロット法を行うために、前記ＤＮＡとキトサンの複合体は、ＤＮＡをアガロースゲルに移すために分離されるだろう。そのため、ＤＮＡは、ＤＮＡ上に損傷が無く、サザンブロット法の結果に影響を与えない硫酸塩を基礎としたカチオン塩を用いることにより分離される。上述した硫酸を基礎としたカチオン塩の例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、オクチル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）または臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含む(実施例１１)。
【００４９】
また、本発明は、個々のＤＮＡサンプルは、キトサンとの混合物の形態で保存されるＤＮＡ ＩＤカードを提供し、個人識別またはＨＬＡ遺伝型検査のような遺伝子検査を行うことによって得られた個々の遺伝情報は、前記プラスチックカードの磁気帯に保存される(実施例１２及び１３)。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードは、個人識別、個人の組織移植、個人の臨床診断またはそれに類するもののための遺伝子情報バンク同様に、個人のＤＮＡバンクとしても用いられることができる。
【００５０】
本発明を以下の実施例と共に更に詳細を示す。しかしながら、本発明の目的はそれらにより制限されるものではない。
【００５１】
実施例１：アガロースゲル電気泳動による、ＤＮＡとキトサンとの複合体の移動シフトアッセイ。
【００５２】
適切な特性（ＤＮＡと混合する際に安定した複合体を形成するためのキトサンの濃度及び混合条件）を確立するために、様々な濃度の水溶性キトサンを、様々な比率で正常成熟血液の単球から分離した全部のＤＮＡと混合し、その後、キトサンと結合したＤＮＡの移動シフトアッセイを、アガロースゲル電気泳動を介して行った。さらに、キトサンと結合したＤＮＡの移動シフトアッセイは、同様に、マウス肝組織のゲノムＤＮＡ及び４．０ｋｂサイズのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）に対して行われた。実験の方法及び結果を以下に示す。
【００５３】
Ａ．ＤＮＡ分離及び準備
正常成熟白血球からの細胞の全ＤＮＡは、分離され、その実験は知られている方法（例えば、非特許文献９参照）により、三次蒸留水を用いて行われた。
【００５４】
末梢静脈血は、クエン酸ナトリウムを含むチューブ（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＴＡＤ ｔｕｂｅ，カタログＮｏ ＃３６７９４６、Ｂｅｔｏｃｏｎ ＆ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製造、米国）に貯められ、血漿及び単球の軟膜層は、遠心分離機により分けられた。前記単球（そのほとんどはリンパ球である。）ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製造、ドイツ）を用いて、次の方法により、分離された。
【００５５】
２０μｌのプロテインキナーゼＫ（ＱＩＡＧＥＮ プロテアーゼ）は、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに入れ、２００μｌの軟膜層と２００μｌのバッファーＡＬは、順次、マイクロ遠心チューブに加えられた。そして、ボルテックスにより１５秒混和した。それを、５６℃で１０分間立たせたまま放置し、チューブのキャップを閉め、溶液を集めるために遠心分離した。前記溶液に２００μｌのエタノールを加え、ボルテックスにより１５秒混和した。そして、前記溶液の全てを、ＱＩＡａｍｐスピンカラムに加え、８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離した。その後、２ｍｌコレクションチューブを前記カラムに設置し、５００μｌのバッファーＡＷ１をカラムに加え、再度８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離した。こうして得られたろ液は、廃棄され、新しいチューブが供給され、さらに最大速度でもって１分間遠心分離した。再び、新しい１．５ｍｌマイクロ遠心チューブを設置し、２００μｌの蒸留水またはバッファーＡＥを加え、立たせたまま室温で１分間放置し、その後さらに８，０００ｒｐｍでもって１分間遠心分離し、ＤＮＡを溶出した。こうして分離されたＤＮＡは、分光光度計を用いて濃度を測定され、Ａ２６０／Ａ２８０比は、前記分離されたＤＮＡの純度を調べるために比較される。このとき、前記ＤＮＡの純度は、分光光度計測定上Ａ２６０／Ａ２８０は１．６〜１．８となるだろう。上記方法により、２００μｌのヒトの血液から、平均６μｇの純ＤＮＡを得ることができる。
【００５６】
Ｂ．キトサンの準備
もし水溶性キトサンが、脱アセチル化の程度が６０％以上であり、分子量が１０ｋＤａ〜５００ｋＤａの生成物であるならば、本発明の用途として、具体的には、ＤＮＡとの安定な複合体を形成するために用いることができる。これらに該当する多くの水溶性キトサン生成物は、市販のものを用いることができる。それらのうち、本発明にあたる、平均脱アセチル化率が９０．１％であり、平均分子量が約３００ｋＤａである水溶性キトサン生成物は、Ｊａｋｗａｎｇ社（韓国 アンソンシ）から購入し、滅菌三次蒸留水で溶解した。このキトサンに加えて、類似した特性を有する他の水溶性キトサンをまた用いてもよい。
【００５７】
Ｃ．キトサンとＤＮＡとの複合体の準備の方法
前記水溶性キトサンは、滅菌三次蒸留水に溶解し、試験のため、０．０２％から０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％及び１％の重量対体積比率（ｗ／ｖ）となるよう様々な濃度に調整した。ここで、ＤＮＡは、滅菌三次蒸留水で希釈し、５００ｎμｇ／μｌ及び１μｇ／μｌの濃度にし、その後これを用いた。
【００５８】
１．５ｍｌ遠心チューブに、ＤＮＡ溶液及び上述した様々な濃度の前記キトサン溶液を、様々な体積比率で混和し、室温で１５分間立たせたまま放置し、複合体構造へ導いた。
【００５９】
Ｄ．アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡとキトサンの複合体の移動度シフトアッセイ
正常成熟単球及びプラスミドＤＮＡから分離したゲノムＤＮＡの１μｇ／μｌ濃度と、様々な濃度の前記水溶性キトサン溶液とを様々な比率で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体は、上記方法に従って０．８％アガロースゲルに装填され、１００Ｖで電気泳動された。その結果をそれぞれ図２及び図３に示す。その結果は、キトサンと混和されていない唯のＤＮＡが電気泳動されたとき、標準的に移動したＤＮＡ及びｒＤＮＡのバンドは、１８ｓ及び２８ｓに観察され、ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）は、０．０２％、０．１％または０．２５％キトサン溶液と混和され、それぞれ、１：０．２、１：１または１：２．５以上(この場合、混合物中のキトサンとＤＮＡとの重量比は１：１以上である。)の各体積比率であるため、ＤＮＡは前記アガロースゲルにおいて決して移動しないような、キトサンと完全に結合をした。そのため、次の実験において、０．１％キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のＤＮＡ溶液と体積比１：１（この場合、混合体中のキトサンとＤＮＡとの重量比は、１：１である。）で混和されたものであるキトサンとＤＮＡとの複合体の構成物はスタンダードとして作られた。しかしながら、これは構成の一つの例に過ぎず、適切な構成であれば、キトサン生成物の特性に従って、多様なものが使用されてもよい。
【００６０】
実施例２：キトサンのデオキシリボヌクレアーゼ防御アッセイ
前記水溶性キトサンは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）からＤＮＡを防御することができるのかを確認するため、そして、その適切な条件を確立するために、キトサン溶液で処理されたＤＮＡ及び未処理のＤＮＡは、それぞれデオキシリボヌクレアーゼ処理され、その効果をアガロースゲル電気泳動によって観察した。
【００６１】
その方法と結果は次の通りである。同様の実験を、ヒトリンパ球のゲノムＤＮＡ及びマウス肝組織のゲノムＤＮＡに、繰り返し行った。
【００６２】
８個のチューブを２つの群に分けた。一つの群は、蒸留水に溶解させたキトサン（２０ｇ）とＤＮＡ（１０ｇ）とをマイクロチューブ（１．５ｍｌ）中で混和し、複合体を生成した。もう一方の群は、キトサンを用いず、ＤＮＡ（１０ｇ）のみをマイクロチューブに加えた。第一群及び第二群のそれぞれのチューブに、１ｕｎｉｔ／ｌの濃度に溶解させたデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ Ｉ）５μｌを加え、その後、最終体積が１００μｌとなるように蒸留水を加えた。その後、反応させるため、それぞれ０分、２０分、４０分及び６０分の間、３７℃の恒温槽に保持した。反応終了後直ちに、２５μｌの停止液を加え、ＤＮａｓｅ Ｉ を不活性化するためよく混和した。反応を不活性化した４個のチューブのそれぞれに、１１０μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ）を加え、混和し、その後反応させるため６０℃で一晩保持した。その後、上澄みを回収し、新しいマイクロ遠心チューブに入れ、抽出した。３００μｌの無水ＥｔＯＨ(エタノール)及び１５μｌの３Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ(酢酸アンモニウム)をそこに加え、あらかじめ−７０℃にしてあるディープ・フリーザーで２０〜３０分間立たせたまま放置した。その後、得られたものを、４℃、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、液分を吸引除去した。付着した沈殿物は７０％エタノールで再度洗浄、乾燥され、ＤＮａｓｅを含まない蒸留水２０μｌで溶解された。１０μｌ（約１μｇＤＮＡ）の結果物が、こうして得られた計８個のチューブそれぞれから得られ、１％アガロースゲルで電気泳動された。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４から、キトサン処理されていないＤＮＡは、ＤＮａｓｅ Ｉ処理後４０分でほぼ開裂された一方、キトサン処理されたＤＮＡは、ＤＮａｓｅ処理後４０分では開裂されず、そのほとんどが、ウェル中に残っていた。これらの結果は、本発明の方法によるキトサンとＤＮＡとの重量比が、１：０．５で混和されているものでさえ、デオキシリボヌクレアーゼによるＤＮＡ開裂を効果的に抑制し、そして本発明による方法は、ＤＮＡの保存を効果的にすることがわかった。
【００６４】
実施例３：ＤＮＡとキトサンとの複合体のための遺伝子増幅可能性の試験
実施例１及び２で準備した水溶性キトサンとＤＮＡとの液状複合体を用いて、ＰＣＲは標的遺伝子が適切に増幅されているかどうかを確認するために行われ、それにより本発明によるＤＮＡ保存が、前記遺伝子アッセイに悪影響を及ぼさないかどうかを確認し、本発明によるＤＮＡ保存方法により保存されたＤＮＡを、ＰＣＲに用いるための、適切な条件を確立した。ヒト白血球ゲノムＤＮＡに対して、ＰＣＲは各？活動遺伝子を標的として行った。その方法と結果は以下の通りである。
【００６５】
標的遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ加えることにより、鋳型として、１００ｎｇの対象となるＤＮＡを用いることで、ＰＣＲ反応を行い、更に、２．５ｍＭ デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、１ｕｎｉｔのＴａｑポリメラーゼ及び１０ｘポリメラーゼバッファー（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ トリス‐Ｃｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ ゼラチン）を加えた。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ ２７００ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製造、米国）を用い、先ず、９５℃で５分の第一条件下の後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件を４０回繰り返し、最後に７２℃で７分間行い、ＰＣＲ生成物を得た。
【００６６】
０．１％キトサン及びＤＮＡ（１μｇ／ｕｌ）を１：１の体積比で混和することにより準備され、ヒト及びマウスのゲノムＤＮＡサンプルの各鋳型を用いて、β‐アクチン遺伝子に対して、ＰＣＲを行った。１．５％アガロースゲルでの電気泳動の結果を、図５に示す。キトサンと混和されたゲノムＤＮＡサンプルの両方は、同程度に、６６１ｂｐサイズのβ‐アクチン遺伝子の強いＤＮＡバンドを示した。これは、本発明のキトサン混合培地は、ＰＣＲに悪影響を有さないことを示し、遺伝子発現の調査に有益に用いることができる。
【００６７】
実施例４：長期間室温で保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体のＰＣＲ増幅実験
上記結果から、前記水溶性キトサンはＤＮＡとほぼ完全に結合し、デオキシリボヌクレアーゼの攻撃から安定してＤＮＡを保存することがわかった。本実施例では、前記水溶性キトサンとＤＮＡとの前記複合体が、長期間室温で、液体状態で保存されたときでも、前記保存されたＤＮＡは、開裂されることなしに維持され、遺伝子増幅及び遺伝子アッセイを行うことが可能である。ＰＣＲアッセイは、次の通りに行われた。
【００６８】
１μｌの０．１％水溶性キトサン溶液（ｗ／ｖ）と、１μｌの正常成熟血液（５００ｎμｇ／μｌ）の単球のゲノムＤＮＡとを、混和し、複合体を形成し、８μｌの蒸留水を更に加え、最終体積が１０μｌとなるように調整した。こうして、２４サンプルを前記遠心チューブに準備し、室温で保存した。１μｌの、キトサン処理していない、同様の白血球ＤＮＡは、最終体積が１０μｌになるよう調節され、９サンプル準備され、そのうちの３本は−７０℃で保存され、残りの６本は室温で保存された。前記水溶性キトサンと混和され、前記チューブ内に室温で保存されたＤＮＡに対して、実施例３の方法に従い、３本のＤＮＡサンプルに対してＰＣＲ反応を行い、それぞれを、１週間、２週間、３週間、４週間、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、及び１年の各時点で、前記標的遺伝子が適切に増幅できるかどうか確認した。キトサンで処理されていない前記ＤＮＡサンプルのうち、−７０℃で保存されていた３本のサンプルに対して、３ヶ月後及び１年後に、それぞれにＰＣＲを行った。図６は、ＰＣＲを行った後の、β‐アクチン遺伝子に対する、０．８％アガロースゲルでの電気泳動の結果を表わす写真である。
【００６９】
図６から、室温で、３ヶ月間及び１年間マイクロ遠心チューブで、キトサンに結合していない（裸の）ものとして、ＤＮＡが保存された場合、ハウスキーピング遺伝子であるβ‐アクチンは、決して発現しないことがわかった。一方、一週間から１年間室温で、液体としてチューブ内で、キトサンと結合したものとして、ＤＮＡサンプルが保存された場合、β‐アクチン遺伝子ははっきりと検出された。従来の方法による、キトサンと結合せずに、−７０℃で保存された前記ＤＮＡサンプルに対して、本発明の方法による、室温で、キトサンと結合させて保存された前記ＤＮＡサンプルの、増幅されたβアクチンの量は、ほぼ同じである。
【００７０】
このような結果は、本発明の方法による前記水溶性キトサンに結合されたものとして、液中でＤＮＡを保存する方法は、少なくても一年間安定してＤＮＡを維持することができ、該保存されたＤＮＡは、ＰＣＲアッセイに用いる際に問題を有さず、前記方法は、ディープ・フリーザーによる従来の保存方法同様に、安定してＤＮＡを保存することができることを示した。本実施例の保存温度は、室温から−７０℃と様々であるが、湿気の無い暗所で保存されるのが望ましい。
【００７１】
実施例５：キトサンが紙に吸着されているＤＮＡカード（タイプ１）の準備、及びそれらの遺伝子増幅可能性の調査
室温で、最小限の空間で、多数のサンプルＤＮＡを保存、運搬し、自動アッセイに役立つように、キトサンが適する紙に吸着されたカードが発展してきており、それはＤＮＡカードといわれている。前記ＤＮＡカードは、様々な種類があり、その中で、ＤＮＡ自身を保存するために用いられる紙製カードは、タイプ１ＤＮＡカードといわれている。
【００７２】
最も効率的な水溶性キトサン溶液の濃度及び適切な紙の厚さを選択するために、次の実験を行った。
【００７３】
様々な種類のブロッティング用の紙は、充分な時間、０．０２％、０．１％または０．２５％（ｗ／ｖ）濃度の前記水溶性キトサン溶液に浸漬され、ＤＮＡカード製造に用いるために乾燥させられた。この時、前記紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社（英国）またはＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社（独国）のような会社から市販されており、適切な厚みを有するブロッティング用の紙から選ばれた。本発明において、厚さ０．３ｍｍ、０．９ｍｍまたは１．２ｍｍのブロッティング用の紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社から購入し、使用した。キトサンを用いたＤＮＡ保存用の前記ＤＮＡカードの種類及び大きさは、使用に応じて様々に準備することができる。キトサンが吸着された前記ブロッティング用紙は、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート及び３８４ウェルプレート（マルチウェループレート）（８．１ｃｍ×１２．３ｃｍ）と同じ大きさに切断され、ほとんどのウェルは使用され、そして、前記ウェル及び区分けは、プレート同様に前記紙に印刷及び印をつけられた。前記ウェルのそれぞれに、ＤＮＡサンプルはピペットで滴下され、一週間から一年またはそれ以上、室温で保存された。それ故、一つのＤＮＡカードは、２４、９６または３８４個のＤＮＡサンプルを保存することができる。
【００７４】
前記水溶性キトサン浸漬ＤＮＡカード製造の方法は次の通りである。
【００７５】
Ｗｈａｔｍａｎ社の０．３ｍｍ厚ブロッティング用紙は、滅菌され、高温のオートクレーブで乾燥された。その後、あらかじめ生成しておいた０．１％（ｗ／ｖ）濃度の水溶性キトサン溶液及び２ｍＭ尿酸溶液を、１：１の体積比で混和し、前記紙を充分な時間浸漬し、その後乾燥させてタイプ１ＤＮＡカードを製造した。
【００７６】
スポットされ、長期間保存されたヒトゲノムＤＮＡは、上記のように用意した前記タイプ１ＤＮＡカードに滴下され、一定期間保存された。前記保存されたＤＮＡカードから、直径が約１ｍｍから２ｍｍのカード断片が、パンチ、鉗子またはピンセットを用いて取られ、ＰＣＲを行うためにチューブに加えられた。このカード断片の鋳型と共に、β‐アクチン遺伝子に対するＰＣＲは、実施例３の方法に従って行われた。このＰＣＲ反応の方法は次の通りである。
【００７７】
１．ＤＮＡが保存されているキトサン浸漬紙製カードから、直径が約１．２ｍｍの断片をパンチ等を用いて取り、ＰＣＲのためチューブに加えた。
【００７８】
２．２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を加え、混和し、その後、室温に５分間放置した。その後、前記ＴＥバッファーはピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００７９】
３．第２工程は、２回繰り返した。
【００８０】
４．室温に１時間または５６℃に１０分間で、乾燥させた。
【００８１】
５．上記工程によって処理された前記カード断片に、適切な組成物のＰＣＲサンプルを加え、β‐アクチン遺伝子を、実施例３の方法に従ってＰＣＲ増幅した。
【００８２】
図７は、アガロースゲル電気泳動実験の写真の結果を示し、比較の結果及びＰＣＲによる分析を表わしている。０．１％キトサン溶液に浸漬されることにより作られたＤＮＡカードのすべてにおいて、前記標的遺伝子は強く発現しており、０．９ｍｍまたは１．２ｍｍのような、より厚い紙は、より多くのＰＣＲ産物を生成した。加えて、本発明によるＤＮＡカードに吸着されて保存された場合、β‐アクチン遺伝子は、室温で３ヶ月から１年のような長期間の経過後でさえも、−７０℃で保存した場合と同様に、ＰＣＲにより強く増幅された。このような結果は、本発明によるＤＮＡカードで保存されたとき、多種多様なＤＮＡサンプルは室温で長期間でさえ安定して保存することができ、長期間の経過後でもアッセイを行うことができることを示す。そのため、本発明のＤＮＡカードは、多種多様なＤＮＡサンプルを簡単に室温で長期間保存し、運搬するために有益であり、更に、本実施例及び次からの実施例で示されるような、ＰＣＲまたは塩基シークエンシングのような多様な遺伝子アッセイに有益でもある。
【００８３】
実施例６：キトサンと細胞溶解バッファーとが前記紙に吸着されているＤＮＡカード(タイプ２)の準備、及びそれらの遺伝子増幅可能性の調査
この、タイプ２ＤＮＡカードは、キトサンと細胞溶解バッファーを、ブロッティング及び乾燥させるために、様々な種類の紙に吸着させることにより生成された。このタイプ２ＤＮＡカードは、血液のような細胞含有体液としてのサンプルを保存し、その後、遺伝子アッセイのためにＰＣＲにより増幅させるために用いることを目的とされた。このタイプ２ＤＮＡカード上に、ヒト血液を滴下し、一定期間後、その性能は比較され、ＰＣＲにより分析された。
【００８４】
実施例５で準備されたブロッティング用前記紙製カードは、ＤＮＡカードを製造するために、水溶性キトサン溶液及び細胞溶解バッファー中に、充分な時間浸漬された。この時、０．３ｍｍ厚、０．９ｍｍ厚及び１．２ｍｍ厚のブロッティング用紙は、Ｗｈａｔｍａｎ社から購入し、使用した。血液として保存するためのタイプ２ＤＮＡカードを製造する方法は、次の通りである。
【００８５】
Ｗｈａｔｍａｎ社のブロッティング用０．３ｍｍ厚の紙は、高温で滅菌され、乾燥された。その後、あらかじめ生成された０．１％（ｗ／ｖ）濃度の前記水溶性キトサン溶液及び細胞溶解バッファー（０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８ｍＭ トリス‐Ｃｌ、２ｍＭ 尿酸、１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ）は、体積比１：１で混和され、前記紙を、充分な時間浸漬し、その後、乾燥させ、タイプ２ＤＮＡカードを製造した。
【００８６】
上述したＤＮＡカードから、直径約１ｍｍ〜２ｍｍのカード断片を取り、実施例５にあるようなＰＣＲを行うためのチューブに加えた。このカード断片の鋳型と共に、β‐アクチン遺伝子に対するＰＣＲが行われた。このＰＣＲ反応の方法は、次の通りである。
【００８７】
１．ＤＮＡが保存されているキトサン浸漬紙製カードから、直径約１．２ｍｍの断片は、パンチなどを用いて取られ、ＰＣＲ用チューブに加えられた。
【００８８】
２．２００μｌの洗浄溶液（ＧＧ精製試薬；０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、８ｍＭ トリス‐Ｃｌ、２ｍＭ 尿酸、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）は、加えられ、混和され、そして、室温で５分間放置された。その後、前記洗浄溶液は、ピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００８９】
３．第２工程は、３回繰り返した。
【００９０】
４．その後、２００μｌのＴＥバッファー（１０ｍＭ トリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）は加えられ、混和され、室温で５分間放置された。その後、前記ＴＥバッファーは、ピペットを用いて完全に取り除かれた。
【００９１】
５．第４工程は、２回または３回繰り返した。
【００９２】
６．室温に１時間または５６℃に１０分間で、乾燥させた。
【００９３】
７．上記工程で処理された前記カード断片に、適切な組成物のＰＣＲサンプルを加え、そして、β‐アクチン遺伝子を、実施例２の場合と同様の方法によりＰＣＲ増幅した。
【００９４】
この実験の結果、タイプ２ＤＮＡカードの全てに対して、前記標的遺伝子は強く発現しており、０．９ｍｍや１．２ｍｍのような、より厚い紙は、より多くのＰＣＲ生成物を生成した。加えて、本発明のＤＮＡカードに吸着されて保存された場合、β‐アクチン遺伝子は、室温で３ヶ月から１年のような長期間の後でさえも、ＰＣＲにより強く増幅された。このような結果は、ＤＮＡサンプルを、本発明によるＤＮＡカードで保存する場合、ＤＮＡの分離及び精製する必要なしに、血液として室温で長期間安定して保存することができ、長期間経過後でもアッセイが可能であることを示す。そのため、本発明のＤＮＡカードは、血液としてのＤＮＡサンプルを簡単に室温で長期間保存し、運搬するために有益であり、更に、ＰＣＲまたはそれに類するもののような多様な遺伝子アッセイに有益でもある。
【００９５】
実施例７：長期間保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体に対する標的遺伝子のクローニング及び塩基シークエンシング可能性調査
実施例４に従って室温で長期間、液体として保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体に対して、ＰＣＲを行い、得られた生成物はクローニングした。その後、自動塩基シークエンシングによって、本発明の方法により保存されたＤＮＡが、安定して維持でき、保存後に使用できるかどうかを確認した。
【００９６】
室温で３ヶ月、本発明の方法による０．１％水溶性キトサンと混和されたものとして保存された成熟結腸組織のゲノムＤＮＡサンプルの鋳型と共に、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子に対して、ＰＣＲを行った。その生成物は、ブラスミドベクター中でクローニングされ、その後、再度塩基シークエンシングによって調査された。その方法は、次の通りである。
【００９７】
遺伝子のＰＣＲ生成物を、前記シークエンシング反応における鋳型として用いるために、最適な濃度に調節することは重要である。本発明では、１０ｎｇのＡＰＣ遺伝子が用いられた。ＰＣＲチューブに、ＡＰＣ遺伝子の各エクソンのＰＣＲ生成物（３．２ｐｍｏｌのフォワードプライマーかリバースプライマーのどちらか及び８μｌの反応混合物（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製造、 米国））を加え、最終体積が２０μｌとなるように、滅菌蒸留水を加え、よく混和した。サイクルシークエンシング反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ２７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒを用いて前記混合物に対して、９６℃で１０秒間、５０℃で５秒間、及び６０℃で６分間のサイクルを２５回行った。得られた反応生成物は、エタノールで沈殿させ、遠心分離し、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）をプライマーを含まないように取り除き、前記反応混合物（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）を乾燥させた。こうして得られたＤＮＡは、ホルムアミド：２５ｍＭ ＥＤＴＡ：ブルーデキストラン及び１０μｌのローディングバッファーの混合物と混和され、５分間沸騰水中で変性させた。その後、前記サンプルは氷上に置かれ、該変性したＤＮＡサンプルは、５．５％のｌｏｎｇ ｒａｎｇｅｒ ｇｅｌ（ＢＭＡ、カタログＮｏ．、米国）をあらかじめ流し込まれたプレートの各ウェルに加えられた。電気泳動は、２〜４時間行われ、塩基シークエンシングは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製造、米国）のソフトウェアを用いて実施された。
【００９８】
ＡＰＣ遺伝子に対する自動塩基シークエンシングの結果を、図１０に示す。
【００９９】
前記シークエンシングの結果、正常ＡＰＣ遺伝子は、正確に増幅され、そのため、本発明の方法によるＤＮＡとキトサンとの前記液状複合体は、室温で長期間保存した後でさえもとても安定してＤＮＡを保存し、クローニング及び塩基シークエンシングを行うことができる。これは、遺伝子突然変異検査及び癌検査にも、有益であることを意味している。
【０１００】
実施例８：長期間前記ＤＮＡカードで保存されていたＤＮＡの、遺伝子クローニング及び塩基シークエンシングの調査
室温で長期間ＤＮＡカードに吸着されて保存されたＤＮＡサンプルに対して、ＰＣＲ及び自動塩基シークエンシングによって得られた生成物のクローニングは、適切に行うことができるかどうか、確認された。
【０１０１】
３ヶ月間、実施例５に従って製造されたＤＮＡカードに滴下して保存されたヒト肺癌組織のゲノムＤＮＡサンプルの鋳型と共に、ＰＣＲを、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子に対して行った。その産物は、プラスミドベクター中でクローニングされ、その後、再度自動塩基シークエンシングで検査された。その方法は、実施例７の方法と同様である。その結果を図１１に示す。
【０１０２】
結果として、変異原性のｐ５３遺伝子は、正確に増幅され（図１１）、本発明の方法により製造されたＤＮＡカードを用いて保存されたＤＮＡの場合、ＤＮＡは、長期間経過後でさえ、そのクローニング及び自動塩基シークエンシング可能であるように保存され、更に、遺伝子突然変異検査及び癌検査にも有益であることがわかった。
【０１０３】
実施例９：ＤＮＡ／キトサン複合体の鋳型によるサザンブロット法
本発明の方法により保存されたＤＮＡとキトサンとの複合体を用いて、サザンブロット法及びそれに類するもののようなハイブリダイゼーションアッセイによる特定遺伝子の存在及び量を検査する際、キトサンと結合したＤＮＡはアガロースゲル電気泳動で動かず、それでブロッティングアッセイを行うことが困難となっている。そのため、ブロッティングアッセイのために、前記ＤＮＡサンプルは、キトサンを取り除いて用いなければならない。そのため、本発明では、キトサンと結合したＤＮＡからＤＮＡの損傷なしでキトサンを取り除くための方法を確立させた。
【０１０４】
上述したように、前記水溶性キトサンは、カチオン塩であり、ＤＮＡと結合する。それで、キトサンは、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＯＳ（オクチル硫酸ナトリウム）及びＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）のような硫酸塩である強カチオン塩で処理することによってＤＮＡから分離することができる。この場合、前記カチオン塩は、安価で、ＤＮＡに損傷なしで前記ブロッティングに影響を及ぼさないものであるべきである。そのため、本発明では、安価でＤＮＡとプローブ間のハイブリダイゼーション反応に影響を及ぼさないＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ社製造、米国）を用いた。
【０１０５】
本発明の方法に従って、キトサン溶液と膵臓癌組織ＤＮＡを混和することによって得たＤＮＡ／キトサン複合体は、室温で３ヶ月保存された。その後、５〜１０μｇの前記ＤＮＡ／キトサン複合体は、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳと混和され、サザンブロット法のためアガロースゲル電気泳動にかけられた。サザンブロット法は、公知の方法（例えば、非特許文献１０参照）によってＫ−ｒａｓ遺伝子に対して行われた。その結果は、それぞれ図１２及び図１３に示す。
【０１０６】
図１２から、５％ＳＤＳ電気泳動の場合、前記ＤＮＡ及びキトサンは分離され、前記ＤＮＡは、前記ゲル中を移動することがわかった。
【０１０７】
加えて、図１３は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子が、６ヶ月間、キトサンと結合させず−７０℃で保存したＤＮＡと、キトサン／ＤＮＡの形態で保存されたＤＮＡの両方において、強く発現するという、前記サザンブロット法の結果を示した。そのため、本発明のＤＮＡ保存方法によって長期間保存されたＤＮＡを用いてサザンブロット法を行うための方法は確立された。更に、本発明の方法により保存されたＤＮＡは、ハイブリダイゼーションアッセイに有益であることがわかった。
【０１０８】
実施例１０：長期間前記ＤＮＡカードで保存されたＤＮＡに対する遺伝子のＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイ可能性の調査
ＰＣＲは、本発明のタイプ1ＤＮＡカードを用いて保存されたヒトゲノムＤＮＡサンプルに対して行われ、その後、ＲＦＬＰ（制限断片長多型：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）アッセイを用いて、遺伝子型決定試験が可能かどうか検査された。前記タイプ１ＤＮＡカードのＤＮＡのＰＣＲ後、前記ＲＦＬＰアッセイを用いた遺伝子型決定の結果を、図８に示す。更に、遺伝子型決定が、本発明のタイプ２ＤＮＡカード中に、血液として保存されたヒトサンプルに対して、ＰＣＲ−ＲＦＬＰを用いて可能かどうか調査された。その結果は、図９に示す。本発明のＤＮＡカードが、実際に、遺伝子診断、心臓血管疾患の発病と関連する遺伝子に用いることができることを証明するために、ＰＣＲによって増幅され、特定の制限酵素で、次の通りに処理をされた。その結果は、電気泳動によって解析された。結果として、多重遺伝子型の調査に問題を有さないことが分かった。
【０１０９】
本実施例は、以下に記述される。
【０１１０】
本発明によるタイプ１ＤＮＡカード、タイプ２ＤＮＡカード及びプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、それぞれ、以下の表に示すように、反応液を用いてＰＣＲチューブ中に、老人病に関連する次の６つの遺伝子を準備した。
【０１１１】
【表１】
上記準備した反応液を含む前記ＰＣＲチューブを、ＰＥ２７００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製造、米国）に加え、次の通り、それぞれの遺伝子の条件に従い増幅した。
【０１１２】
１．ｅＮＯＳ１／２遺伝子，ＭＴＨＦＲ１／２遺伝子，ＡＧＴ１／２遺伝子，ＡＴ１Ｒ遺伝子及びＡＣＥ１遺伝子に対して、
９５℃／５分、３５サイクル（９５℃／３０秒、５８℃／３０秒、７２℃／４０秒）、７２℃／１０分とし、
２．ＡＣＥ２遺伝子及びＡＰＯＥ１／２Ｅ遺伝子に対し、
９５℃／５分、３５サイクル（９５℃／３０秒、６５℃／３０秒、７２℃／４０秒）、７２℃／１０分とした。
【０１１３】
こうして得られた各遺伝子のＰＣＲ生成物は、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む１．２％アガロースゲル電気泳動を行うことにより確認された。各遺伝子の生成物の大きさは、次の表２に示す。
【０１１４】
【表２】
こうして得られたＰＣＲ生成物にＲＦＬＰを行うために、第一に、ＡＣＥ遺伝子だけを除く他の５つの遺伝子のＰＣＲ生成物を、次の通り、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造、米国カリフォルニア州）を用いて生成した。
【０１１５】
１．前記ＰＣＲ生成物（約２５ｌ）に、ＤＮＡ結合溶液を２倍量（例えば５０μｌ）加えた。
【０１１６】
２．予め用意されたＺｙｍｏスピンカラム（Ｚｙｍｏ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に、上記１の混合物の全てを加え、１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。
【０１１７】
３．コレクションチューブに集められた溶液は、ピペットで取り除いた。
【０１１８】
４．２００μlの洗浄バッファーを前記カラムに加え、１３，０００ｒｐｍで４０秒間遠心分離した（２回繰り返し）。
【０１１９】
５．残った洗浄バッファーは、１３，０００ｒｐｍで４０秒間、空のコレクションチューブ中で遠心分離することにより、完全に取り除いた。
【０１２０】
６．前記コレクションチューブを取り除き、きれいな１．５ｍｌマイクロ遠心チューブを新しいカラムのために用意し、その後、２０μlの滅菌蒸留水をそこに加え、１３，０００ｒｐｍで４０秒間、溶出のために遠心分離した。もう一つの方法として、６５℃くらいに温めた滅菌蒸留水を用いてもよい。
【０１２１】
上記方法により精製し、得られたＰＣＲ生成物に対して、以下の表で各遺伝子に対応した制限酵素は、各制限酵素に対応した条件化で用意された。その後、４〜６時間３７℃の恒温槽に、反応のために固定し、その後、各遺伝子の危険性が、２．５％アガロースゲル電気泳動によって調査された。
【０１２２】
【表３】
実施例１１：キトサンを含むＰＣＲキットの製造
本発明のキトサンを用いたＤＮＡ保存方法の適用として、Ｔａｑポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ及びバッファー及びそれに類するものが、キトサンと共に一つのチューブに加えられたもの（一体型チューブ：ａｌｌ ｉｎ ｏｎｅ ｔｕｂｅ）、並びにＤＮＡまたは血清のようなサンプルが、ＰＣＲを誘導するためにチューブに加えられたものからなる、ＰＣＲキットが製造された。特徴として、このＰＣＲキットは、ＤＮＡ保存及びＰＣＲアッセイの両方において用いることができる。
【０１２３】
本実施例において、Ｂ型肝炎患者の血液から得たＤＮＡを用いて、Ｂ型肝炎ウイルスの存在を、本発明のＰＣＲキットを用いて調査を行った。前記キットは、癌関連遺伝子による癌診断またはＢ型肝炎ウイルス若しくはヒト乳頭腫ウイルス感染における病原体の診断、性感染症、他の細菌感染、及びそれに類するものにもまた適用することができる。
【０１２４】
このキットの使用方法は次の通りである。
【０１２５】
１０μｌの５ＧＧ一段階ＰＣＲバッファーＴＭ及びホットスタートタイプＴａｑポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製造、米国）、２．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、それぞれ１．０μｌの標的遺伝子のフォワードプライマー及びリバースプライマー（５ｐｍｏｌ）、及び、０．１％濃度のキトサンを含む一体型チューブに、１〜３μｇの鋳型ＤＮＡを加えた。全容積が５０ｌとなるよう、前記キットに蒸留水を注入し、よく混和し、その後、ＰＣＲを行った。始めに、逆転写反応を５０℃、３０分間行い、９５℃１５分間で変性を行い、続いて９４℃で１分間、５３℃で４０秒間及び７２℃で１分間のサイクルを合計２５〜４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間の反応で、ＰＣＲ増幅を完了させた。結果として、前記Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡの存在は、本発明のＰＣＲキットを用いて検出された（データは添付されていない。）。
【０１２６】
実施例１２：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードの製造
図１４は、本発明のＤＮＡカードを用いたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを製造する手順を示したフローチャートである。図１４のフローチャートにある手順を行い、プラスチック素材のＤＮＡ ＩＤカードを開発した。
【０１２７】
１．血液または口腔の細胞、ＤＮＡカードまたはそれに類するもの、及び個人写真データのような輸送された個人サンプルの領収（Ｓ２０１）。
【０１２８】
２．前記サンプルからゲノムＤＮＡの分離及び血液型の検査（Ｓ２０２）。
【０１２９】
３．抽出されたゲノムＤＮＡを用いたＨＬＡ遺伝子型のアッセイ、ＳＴＲ（縦列型反復配列：ｓｈｏｒｔ ｔａｍｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）個人識別遺伝子の検査、及び結果に対する分析（Ｓ２０３）。図１５は、ＳＴＲ検査の１５の組み合わせ、個人遺伝子型分析結果の用意、及びエンコード遺伝子型データを用いた個人遺伝子型識別の手順を示す概略図である。
【０１３０】
４．前記プラスチックカードに添付するための紙製ＤＮＡカードの結合、そして熱及び圧力を加えることによる前記ＤＮＡ ＩＤカードの枠組みの準備（Ｓ２０５）。図１６は、本発明のＤＮＡ ＩＤカードを準備するための手順において、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）カードに、タイプ１またはタイプ２ＤＮＡカードを結合させることを示す概略図である。図１６に示すように、ＰＶＣ軟層は、最下部に配置され、タイプ１ＤＮＡカードまたはタイプ２ＤＮＡカードは、その上に配置される。その後、ＰＶＣコア層はその上に配置され、前記紙製ＤＮＡカードとほぼ同じ大きさの穴を有している。（紙製カード及び紙の厚さと、ＰＶＣの厚さが、それぞれ異なる材料からつくられており、それで熱による結合で、一緒に結合されないので、カードの大きさの穴を用意する必要がある。具体的には、前記紙製カードが、この穴に挿入されている。）上端部にはＰＶＣコア層が残され、さらに２つの小さな穴（ＤＮＡまたは血液を紙製ＤＮＡカードに注入するためものであり、熱処理による前記カードの結合により、ほぼ空いた空間が残されていないので、前記紙製カード上に配置されなくてはならない。）を有する。最後に、ＰＶＣ軟層はその上に配置される。その後、８〜３０分間の熱処理が行われ、それらが結合される。このとき、前記紙製ＤＮＡカードの位置は、前記磁気帯の位置と対向し、そして、写真転写の位置とも対向する。図１７は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図である。
【０１３１】
５．Ｓ２０４（Ｓ２０５）で製造した、プラスチックＤＮＡ ＩＤカード及び保存のためのカード上への個人のＤＮＡまたは血液の滴下。前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカード上への前記ＤＮＡ及び血液の滴下は、針を用いることで、前記ＰＶＣ軟層を貫通する前記ＰＶＣコア層の穴を介して、前記紙製ＤＮＡカードにＤＮＡ及び血液を注入することで行われる。注入後、針による穴は、ホログラム、ステッカー及びそれに類するものによってふさがれる。
【０１３２】
６．前記磁気帯または前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのチップ（Ｓ２０６）上の分析されたデータのエンコード。前記磁気帯は、通常３つのトラックから構成されている。英語で書かれることのできる前記トラックは、第１トラックで、７８ビット使用可能である。第２トラックは、３８ビット使用可能で、第３トラックは１０７ビット使用可能である。そのため、図１７で示すように、主な個人情報は第１トラックにエンコードし、患者の特定の疾病コードは、前記第２トラックにエンコードされ（例えば、Ｃ６１−Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｏｒ Ｎ４０−Ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）、ＳＴＲ型またはＨＬＡ型の結果を入力したものは、第３トラックにエンコードされる。しかしながら、バンク及びそれに類するものと通信する場合、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのエンコード方法は、遺伝子情報がメインサーバ内でのみ認められ、前記バンクにより要求された時にエンコードされ、個人遺伝子情報及びそれに類するもののデータは、ＰＯＳシステムを用いてこのメインサーバから伝達される。この方法は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカード（Ｓ２０６）の更なる実用性を、最大限にするためものである。図１８は、本発明のＤＮＡ ＩＤカード上にエンコードしている情報の一例の概略図である。
【０１３３】
７．個人写真の複写及び主な個人情報の、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードへのエンボス加工法による刻み込み（Ｓ２０７）。
【０１３４】
８．（サーバのための）スーパーコンピュータへの個人データの入力、特定個人ＩＤコードの前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードへの割り当て、及び個人パスワードの設定（Ｓ２０８）。
【０１３５】
９．もし必要であれば各個人、病院、各組織またはバンク及びそれに類するものにおいて国内外の両方で、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに記録されているＩＤ及びパスワードを用いて、安全保守状態の場合における情報へのアクセスを許可するＰＯＳシステムの構成と操作（Ｓ２０９）。
図１５は、本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図である。前記カードの前面は、個人写真及び名前、簡単な個人情報（病院で、緊急時に直ちに処置できる程度）及び住所が記録される。前記カードの背面は、個人遺伝子情報がエンコードされた磁気帯があり、書名及びＤＮＡ保存場所を保持するように設計されている。
【０１３６】
実施例１３：前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに結合して保存される紙製ＤＮＡカードの断片から、遺伝子を増幅する実験。
【０１３７】
ＰＣＲにより、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子を増幅することにより、高温、高圧力で処理することにより予め作られていたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードに結合されるタイプ１またはタイプ２紙製ＤＮＡカードに保存されたＤＮＡから、増幅することが可能かどうか確認された。前記方法は、上記実施例１０と同様に行われた。
【０１３８】
タイプ１ＤＮＡカード及びタイプ２ＤＮＡカードは、高温、高圧力で製造されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードにそれぞれ結合され、それらの中で浸漬されて保存されたヒトゲノムＤＮＡ及び血液を有する。その後、これらのプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子は、比較のためＰＣＲによって増幅された。その結果は、図１９に示す。この実験を通して、血液を吸収するのに、本発明によるタイプ２ＤＮＡカードが用いられる場合、血液サンプルは滴下される必要があり、前記プラスチックＤＮＡ ＩＤカードのプラスチックカバーは、ＰＣＲ増幅において最初に取り除かれる必要がある。
【０１３９】
図２０は、老人病の遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子に対してのＰＣＲ増幅の結果を示し、実験室において、人工的に高温で圧力をかけない処理をしたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード及び実質的に高温、高圧力で準備したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用い、サンプルは前記カードの準備をする前に加えられた場合と、サンプルは前記カードの準備後に加えられた場合とを比較した。この実験を通して、得られた結果は、保存されたサンプルがＤＮＡまたは血液であることに関わらず、予め準備したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードにサンプルを滴下することがより良いことを示した。
【０１４０】
ＤＮＡを滴下したタイプ１ＤＮＡカード及び血液を滴下したタイプ２ＤＮＡカードは、ＤＮＡ ＩＤカードを準備するのに高温、高圧力で準備されたプラスチックカード上にそれぞれ付着していた。これらカードのそれぞれに滴下するサンプルの適切な濃度及び量を見つけるために、ゲノムＤＮＡの場合、上述したように、準備したカード断片を用いて、ＤＮＡサンプルを１５０ｎｇ含む濃度となるようにさまざまな体積にして滴下し、ｅＮＯＳ遺伝子はＰＣＲで増幅され、測定された。その結果を図２１に示す。この実験を通して、タイプ１ＤＮＡカード（ＤＮＡ用）に血液を滴下することは適切ではなく、少なくても１．５μｇ程度を、ＤＮＡ滴下時に滴下することができる。
【０１４１】
高温、高圧力で準備されたプラスチックＤＮＡカードによって保存されたサンプルのＰＣＲ増幅中に、前記カード断片が、前処理手順として洗浄バッファーで処理された場合と処理されなかった場合との間の相違を、ＰＣＲにより老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子を増幅することにより、比較及び分析した。その結果を図２２で示す。結果として、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いたＰＣＲ中、洗浄バッファーで前処理をしない場合に、より良くＰＣＲ増幅された。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明による水溶性キトサンを用いたＤＮＡ保存方法は、ＤＮＡ保存有効性に優れており、従来方法に反して、室温で長期間安定してＤＮＡを保存することを可能にする。この方法を用いて、小さいプラスミドＤＮＡだけではなく、植物及び動物の大きいゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡ、並びに菌類、バクテリア及びウイルスのＤＮＡを、室温で安定して長期間、保存し、運搬することができる。本方法により保存されたＤＮＡは、ＰＣＲ及びＲＦＬＰ、クローニング、塩基シークエンシング、サザンブロット法及びそれに類するもののような遺伝子アッセイの全てに有益である。更に、ＰＣＲキット及びそれに類するもので広く用いられることができ、そして、簡易及び経済的である。特に、本発明のタイプ１ＤＮＡカードは、多数のＤＮＡサンプルを室温で長期間保存し、運搬するためにとても有益であり、タイプ２ＤＮＡカードは、血液のような、ＤＮＡを含む多様なバイオサンプルを、ＤＮＡを損傷することなしに、長期間室温で保存することができる。加えて、これらのＤＮＡカードで保存されたサンプルに対して、ＰＣＲ及びＰＣＲ−ＲＦＬＰ、ハイブリダイゼーション、塩基シークエンシング、ＳＮＰアッセイ及びそれに類するもののような、多様な遺伝子アッセイを、長期間経過後でさえ、正確かつ簡易に行うことができ、基礎研究及び多様な臨床治療にとても役立つ。また、本発明のＤＮＡ ＩＤカードは、個人のＤＮＡを保存するＤＮＡバンクとしての役割を担うことができ、その上、個人の遺伝情報を保存することにより、個人識別及び臓器移植及びそれに類するもののような医療にも役立つ。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】本発明による、ＤＮＡと水溶性キトサンとの複合体の生成及び分析の工程を示すブロック図。
【図２】１μｇ／μｌの濃度の正常成熟単球から分離したゲノムＤＮＡとさまざまな濃度の水溶性キトサン溶液を、様々な割合で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体に対する０．８％アガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂ），レーン２：ＤＮＡ単体，レーン３：０．０２％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．２，レーン４：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．４：レーン５：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．６：レーン６：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：１：レーン７：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２：レーン８：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：３：レーン９：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２．５：レーン１０：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：５：レーン１１：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：７．５）
【図３】１μｇ／μｌの濃度で４．０ｋｂの大きさのプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）と様々な濃度の水溶性キトサン溶液を様々な割合で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体に対する０．８％アガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂ）：レーン２：ＤＮＡ単体：レーン３：０．０２％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．２：レーン４：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．４：レーン５：０．０２％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：０．６：レーン６：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：１：レーン７：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２：レーン８：０．１％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：３：レーン９：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：２．５：レーン１０：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：５：レーン１１：０．２５％（ｗ／ｖ）のキトサン溶液：ＤＮＡ水溶液＝１：７．５）
【図４】キトサンと結合したヒトリンパ球のゲノムＤＮＡと、キトサンと結合してないＤＮＡに対してデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ Ｉ）で処理することによるＤＮＡの開裂の度合いを１％アガロースゲルで比較、分析する写真。（レーン１：サイズマーカー（１ｋｂラダー），レーン２：ＤＮＡのみ，レーン３：キトサン／ＤＮＡ複合体、２０分後，レーン４：キトサン／ＤＮＡ複合体、４０分後，レーン５：キトサン／ＤＮＡ複合体、６０分後，レーン６：キトサンと結合していないＤＮＡ、２０分後，レーン７：キトサンと結合していないＤＮＡ、４０分後，レーン８：キトサンと結合していないＤＮＡ、６０分後）
【図５】０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のヒト白血球ゲノムＤＮＡ水溶液を、体積比１：１で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体及びキトサンと結合していないヒト白血球のゲノムＤＮＡそれぞれの鋳型と、β‐アクチン遺伝子に対して行ったＰＣＲの０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を表す写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｋｂ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（白血球ゲノムＤＮＡは、直接分析された。），レーン４：ゲノムＤＮＡをＤＮＡカード（タイプ１）に滴下した後、その後、室温で１年間保存したもの，レーン５：ゲノムＤＮＡをＤＮＡカード（タイプ２）に滴下した後、その後、室温で１年間保存したもの，レーン６：ブロッティング用の紙に血液を吸着させた後、室温で１年間保存したものの分析，レーン７：ブロッティング用の紙に白血球のゲノムＤＮＡを吸着させた後、室温で１年間保存したものの分析）
【図６】様々な温度、及び期間保存された、０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液と１μｇ／μｌ濃度のヒト白血球ゲノムＤＮＡ水溶液を体積比１：１で混和することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体と、キトサンと結合していないＤＮＡ両方の鋳型と、β‐アクチン遺伝子に対して行ったＰＣＲの０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を表す写真（レーン１：サイズマーカー（１００ｂｐ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（血液から分離、精製された後、直ちにＰＣＲを行われたＤＮＡ），レーン４：−７０℃で３ヶ月間保存されたＤＮＡ単体，レーン５：室温で１週間保存されたＤＮＡ単体，レーン６：室温で１ヶ月間保存されたＤＮＡ単体，レーン７：室温で３週間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン８：室温で３ヶ月間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン９：室温で１年間保存されたＤＮＡ／キトサン複合体，レーン１０：室温で３週間保存されたタイプ１ＤＮＡカードに滴下されたＤＮＡ，レーン１１：室温で３ヶ月間保存されたタイプ１ＤＮＡカードに滴下されたＤＮＡ）
【図７】様々な種類のブロッティング用の紙に、キトサンを吸着させ、ピペットで正常な成熟白血球ＤＮＡを滴下し、乾燥することで作られ、室温で６ヶ月保存されたタイプ１ＤＮＡカードを、ＰＣＲによって、それぞれを比較、分析した結果を表したアガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｋｂ），レーン２：ネガティブコントロール，レーン３：ポジティブコントロール（血液から分離、精製された後、直ちにＰＣＲを行われたＤＮＡ），レーン４：０．０２％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン５：：０．０２％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン６：０．１％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン７：０．１％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン８：０．２５％キトサン溶液を０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン９：０．２５％キトサン溶液を０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理したＤＮＡカード，レーン１０：０．３ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理をしていないＤＮＡカード，レーン１１：０．９ｍｍ厚のブロッティング用の紙に処理をしていないＤＮＡカード）
【図８】本発明のタイプ１ＤＮＡカードと、水溶性キトサンを用いて保存されたヒトゲノムＤＮＡサンプルに対してのＰＣＲ後のＲＦＬＰアッセイを用いた遺伝子型テストの結果を示す写真。（（ａ）：成熟白血球から直接分離・精製したＤＮＡサンプルである、ポジティブコントロール， （ｂ）：成熟白血球から直接分離・精製し、本発明のキトサン溶液と混和したＤＮＡサンプルで、室温で３ヶ月保存されたもの， （ｃ），成熟白血球から分離精製されたＤＮＡサンプルで、保存するために、本発明のタイプ１ＤＮＡカードに移し、室温で１年間保存したもの。（レーン１及び１２：１００ｂｐサイズマーカー， レーン１１：２５ｂｐサイズマーカー， レーン２及び３：アポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ）遺伝子に対するアッセイ， レーン４及び５：アンジオテンシン（ＡＧＴ）遺伝子に対するアッセイ， レーン６及び７：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子に対するアッセイ， レーン８：アンジオテンシン１受容体（ＡＧＴ１Ｒ）遺伝子に対するアッセイ， レーン９及び１０：内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子に対するアッセイ， レーン１３及び１４：ＭＴＨＦＲ遺伝子に対するアッセイ）
【図９】本発明のタイプ２ＤＮＡカードのサンプルに対する、ＰＣＲ−ＲＦＬＰアッセイを用いて、遺伝子型検査の結果を示す写真。（（ａ）：成熟白血球から直接、分離及び精製したＤＮＡサンプルであるポジティブコントロール， （ｂ）本発明のタイプ２ＤＮＡカードに吸着させた成熟した血液を有し、室温で３ヶ月間保存されることにより作られたＤＮＡサンプル， （ｃ）：本発明のタイプ２ＤＮＡカードに吸着させた成熟した血液を有し、室温で保存されることにより作られたＤＮＡサンプル， レーン１及び８：１００ｂｐサイズマーカー， レーン７及び１５:２５ｂｐサイズマーカー， レーン２及び３:アンジオテンシノーゲン遺伝子， レーン４及び５：アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）遺伝子， レーン６：アンジオテンシン受容体１（ＡＴ１Ｒ）遺伝子， レーン９及び１０：内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子， レーン１１及び１２：ＭＴＨＦＲ遺伝子， レーン１３及び１４：アポリポプロテインＥ（Ａｐｏ Ｅ）遺伝子）
【図１０】成熟した結腸組織のゲノムＤＮＡの鋳型を用いて、ＰＣＲを行うために、本発明の方法による水溶性キトサン溶液と混和され、室温で１ヶ月間保存され、その産物をクローニングしたものの、自動塩基シークエンシングアッセイによるＡＰＣ（大腸腺腫様ポリポーシス）遺伝子調査結果を表すグラフ。
【図１１】肺癌組織のゲノムＤＮＡの鋳型を用いて、ＰＣＲを行うために、本方法に従って本発明のＤＮＡカードに滴下し、室温で３ヶ月間保存され、その産物をクローニングしたものの、自動塩基シークエンシングアッセイによるｐ５３遺伝子調査結果を表すグラフ。
【図１２】ＳＤＳを用いて、キトサンとＤＮＡとの複合体から、キトサンとＤＮＡに分離する結果を表すアガロースゲル電気泳動の写真。（レーン１：サイズマーカー（１００ｂｐ）， レーン２：ＤＮＡ単体， レーン３：０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）， レーン４：０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体， レーン５：１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体， レーン６：５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで処理をした０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液／ＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）の複合体）
【図１３】本発明の方法による膵臓癌組織のゲノムＤＮＡ水溶液（１μｇ／μｌ）と０．１％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を体積比１：１で混和し、室温で３ヶ月間保存することにより得られたＤＮＡ／キトサン複合体の鋳型を用いて、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に対してサザンブロット法を行った写真。（レーン１：室温で１ヶ月間保存された膵臓癌組織のＤＮＡ， レーン２：室温で１ヶ月間保存された膵臓癌組織のＤＮＡ／キトサンの複合体， レーン３：−７０℃で１ヶ月間保存された、正常なヒトの末梢血中の白血球から得たＤＮＡ， レーン４：室温で１ヶ月間保存された、正常なヒトの末梢血中の白血球から得たＤＮＡ）
【図１４】本発明のＤＮＡカードを用いて作られた、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードの製造工程を示すフローチャート。
【図１５】ＳＴＲ検査の１５個の組み合わせを用いて、個人の遺伝子型の識別をし、個人の遺伝子型の分析結果、及び個人の遺伝子型データをエンコードする処理を示す概略図。
【図１６】本発明のＤＮＡ ＩＤカードの製造の手順において、前記ＰＶＣカードの内側にタイプ１またはタイプ２ＤＮＡカードを結合されることを示す概略図。
【図１７】本発明のプラスチックＤＮＡ ＩＤカードの一実施例の概略図。
【図１８】本発明のＤＮＡ ＩＤカード上に情報をエンコードするものの一実施例の概略図。
【図１９】血液及びｇＤＮＡが、プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに保存されたとき、高温及び高圧力で製造されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード(血液用)で、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を比較した結果を示す写真。（レーン１及び７：サイズマーカー（１００ｂｐ）， レーン２：ＤＮＡ ＩＤカードに血液を滴下したもの(血液用)， レーン３：ＤＮＡ ＩＤカードにｇＤＮＡを滴下したもの（血液用）， レーン４：ＤＮＡ ＩＤカード(血液用)に血液を滴下し、プラスチックカバーをしたもの， レーン５：ＤＮＡ ＩＤカード(血液用)にｇＤＮＡを滴下し、プラスチックカバーをしたもの， レーン６：ネガティブコントロール）
【図２０】研究室で、人工的に、サンプルを、高温で圧力をかけない処理及び実質的に高温で高圧力を掛ける処理状態に置く時間を変えて製造したプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１：ＤＮＡのためのＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは室温で装填されたもの， レーン２：ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは１８０℃で３０分間燃焼後に装填， レーン３：ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＤＮＡは１８０℃で１時間燃焼後に装填， レーン４：室温でＤＮＡ装填後１８０℃で１時間処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン５：ＤＮＡ装填後１８０℃で３０分処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン６：ＤＮＡ装填後１８０℃で１時間処理したＤＮＡ ＩＤカード， レーン７：高圧力（１２５ｂａｒ）及び高温（１８０℃）を作り出され、その後血液を装填された、血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン８：高圧力（１２５ｂａｒ）及び高温（１８０℃）を作り出され、その後ＤＮＡを装填された、血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン９：血液を装填され、その後高温（１８０℃）及び高圧力（１２５ｂａｒ）で処理された血液用のＤＮＡ ＩＤカード， レーン１０：ＤＮＡを装填され、その後高温（１８０℃）及び高圧力（１２５ｂａｒ）で処理された血液用のＤＮＡ ＩＤカード）
【図２１】高温及び高圧力で処理されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカード、具体的には、１５０ｎμｇ／μｌのｇＤＮＡ及び血液をそれぞれ量を変えて滴下し、その後保存された、ＤＮＡ用及び血液用のカード断片を用いて、老人病遺伝子の一つであるｅＮＯＳ遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１：ネガティブコントロール， レーン２：ポジティブコントロール（血液のｇＤＮＡ）， レーン３：ｇＤＮＡ(５ｌ)は室温で装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン４：ｇＤＮＡ(１０ｌ)が装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン５：ｇＤＮＡ(５０ｌ)が装填されたＤＮＡ ＩＤカード(ＤＮＡ用)， レーン６：血液（１０ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用）， レーン７：血液（５０ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用）， レーン８：血液（１００ｌ）が装填されたＤＮＡ ＩＤカード（ＤＮＡ用））
【図２２】高温及び高圧力で処理されたＤＮＡ ＩＤカードにおいて、ＰＣＲ増幅の前処理手順として洗浄バッファーで処理された、いくつかのカード断片で保存されたサンプルを用いて、老人病遺伝子の一つである内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）遺伝子のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真。（レーン１及び１０：１００ｂｐサイズマーカー， レーン２：ネガティブマーカー， レーン３：ＤＮＡが保存されたコレクティングカードを４日後に室温で洗浄バッファーにより処理することで作られたカード断片， レーン４：ＤＮＡが保存され、ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）が含まれるコレクションカードを、４日後に室温で洗浄バッファーで処理することで作られたカード断片， レーン５：ＤＮＡが保存されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを４日間室温で放置した後、洗浄バッファーで処理することにより作られたカード断片， レーン６：０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を３ｍｍ厚の紙に滴下することで作られたカード断片を、オートクレーブで滅菌し、室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン７：コレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することで作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン８：ＢＰＢコレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン９：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理したもの， レーン１１：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたコレクションカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１２：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたＢＰＢコレクションカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１３：ＤＮＡが室温で４日間、洗浄バッファーで処理することなく、血液状態として保存されたプラスチックＤＮＡ ＩＤカードを保存することにより作られたカード断片， レーン１４：０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を３ｍｍ厚の紙に滴下することで作られたカード断片を、オートクレーブで滅菌し、室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１５：コレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することで作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１６：ＢＰＢコレクションカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの， レーン１７：プラスチックＤＮＡ ＩＤカードに、０．１％キトサン／ＤＮＡ複合体を滴下することにより作られたカード断片を室温で４日間放置し、洗浄バッファーで処理しなかったもの）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ溶液及び水溶性キトサン溶液を混和することにより生成されたキトサン／ＤＮＡの形態としてＤＮＡを保存する方法において、前記水溶性キトサンは６０％以上の度合いで脱アセチル化しており、分子量は１０ｋＤａ〜５００ｋＤａであることを特徴とするＤＮＡ保存方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、動物、植物、菌類、バクテリア及びウイルスのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの大きさは、数１０〜数１０億塩基対であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、０．０２％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）であり、前記水溶性キトサンの、混合物中のＤＮＡに対する重量比は１：０．５以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．２５％（ｗ／ｖ）であり、前記ＤＮＡ溶液の濃度は、１μｇ／μｌ以下であり、水溶性キトサンの、混合物中のＤＮＡ量に対する重量比は、１：０．５〜１：３であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡとキトサンとの複合体は、−７０℃から室温で保存されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
キトサンと結合したＤＮＡの前記複合体は、液体状態として保存されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡを保存する紙製ＤＮＡカードにおいて、前記ＤＮＡカードは水溶性キトサン及び尿酸を備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてＤＮＡは、ＤＮＡ溶液を前記水溶性キトサンと結合しているＤＮＡとしてカードに滴下することによって保存されることを特徴とするＤＮＡカード。
【請求項８】
ＤＮＡを保存する紙製ＤＮＡカードにおいて、前記ＤＮＡカードは水溶性キトサン及び尿酸を含む細胞溶解バッファーを備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてＤＮＡは、前記水溶性キトサンと結合しているＤＮＡとしての前記カードに、ＤＮＡを含むバイオサンプルを滴下することにより保存されることを特徴とするＤＮＡカード。
【請求項９】
前記紙は、ブロッティング用またはクロマトグラフィー用であり、該紙の厚さは０．３〜１．２ｍｍであることを特徴とする請求項７または８に記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１０】
前記カードは、１２．３ｃｍ×８．１ｃｍ内に、６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェルとなるよう、各ウェルの大きさに応じた印をつけられており、ＤＮＡまたは血液サンプルは各ウェルに滴下され、保存されることを特徴とする請求項７または８に記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１１】
前記組成物は、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサンと０．５ｍＭ〜２０ｍＭの尿酸とを、体積比１：１で混和することにより生成されることを特徴とする請求項７記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１２】
前記細胞溶解バッファーは、トリス（８ｍＭ）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（０．５ｍＭ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（０．１％ ｗ／ｖ）及び尿酸（２ｍＭ）を含むことを特徴とする請求項８記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１３】
ａ）請求項７記載のＤＮＡカードの断片をＰＣＲチューブに加える工程；
ｂ）ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてＴＥバッファーを取り除く工程；
ｃ）工程ｂ）を２回繰り返す工程；
ｄ）室温で１時間または５６℃で１０分間で、前記チューブを乾燥させる工程；及び、
ｅ）ＰＣＲサンプルを前記チューブに加え、ＰＣＲによる増幅を行う工程；を備えることを特徴とするＤＮＡカードを用いたＰＣＲアッセイ方法。
【請求項１４】
ａ）請求項８記載のＤＮＡカードの断片をＰＣＲチューブに加える工程；
ｂ）洗浄バッファー（ＧＧ精製試薬；０．５ｍＭのＥＤＴＡ、８ｍＭのトリス‐Ｃｌ、２ｍＭの尿酸、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後ピペットを用いて洗浄バッファーを取り除く工程；
ｃ）工程ｂ）を３回繰り返す工程；
ｄ）ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてＴＥバッファーを取り除く工程；
ｅ）工程ｄ）を２回または３回繰り返す工程；
ｆ）室温で１時間または５６℃で１０分間で、前記チューブを乾燥させる工程；及び、
ｇ）ＰＣＲサンプルを前記チューブに加え、ＰＣＲによる増幅を行う工程；を備えることを特徴とするＤＮＡカードを用いたＰＣＲアッセイ方法。
【請求項１５】
分析方法において、請求項６記載の保存方法により保存されたＤＮＡまたは請求項７若しくは８によるＤＮＡカードで保存されたＤＮＡは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング、ライブラリー合成、シークエンシング分析またはサザンブロッティングに用いられることを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ分析方法において、請求項６の保存方法により液体状態で保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体または、請求項７若しくは８によりＤＮＡカードに保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体から、サルフェートを基礎としたカチオン塩を用いて、分離された前記ＤＮＡは、遺伝子分析に用いられることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項１７】
前記サルフェートを基礎としたカチオン塩は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＯＳ（オクチル硫酸ナトリウム）、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）を含むことを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ分析方法。
【請求項１８】
オリゴｄ（Ｔ）、プライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー溶液、ｄＮＴＰ及び水溶性キトサンを含むチューブを備えるＰＣＲキットにおいて、前記チューブは、更に、ＤＮＡまたは血清サンプルを含み、そして前記チューブは、ＰＣＲを行うために用いられることを特徴とするＰＣＲキット。
【請求項１９】
ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、キトサンと個人のＤＮＡとの混合物は、請求項１のＤＮＡ保存方法により、前記混合物の一部が保存され、個人の遺伝子情報は、磁気帯または組み込みチップに保存されることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ ＩＤカードの基本素材はプラスチックであることを特徴とする請求項１９記載の前記ＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２１】
ａ）ＰＶＣ軟層に、請求項７または８の紙製ＤＮＡカードを積み重ねる工程；
ｂ）前記紙製ＤＮＡカードに、前記紙製カードと同じ大きさの穴を有した第一ＰＶＣコア層を積み重ねる工程；
ｃ）前記第一ＰＶＣコア層の穴の上に、前記第一ＰＶＣコア層の穴より小さい二つの穴を有する第二ＰＶＣコア層を積み重ねる工程；
ｄ）第二ＰＶＣコア層に、ＰＶＣ軟層を積み重ねる工程；及び、
ｅ）該積み重ねられた層を互いに熱接着するために、熱と圧力を加える工程；を備えることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカードの生成方法。
【請求項２２】
請求項２０によるＤＮＡ ＩＤカードは、
第一ＰＶＣ軟層、紙製ＤＮＡカード、紙製ＤＮＡカードの大きさと等しい大きさの穴を有する第一ＰＶＣコア層、ＤＮＡまたはＤＮＡを含むバイオサンプルを滴下した時、前記紙製ＤＮＡカードに通じる穴を有する第二ＰＶＣコア層、及び第二ＰＶＣ軟層を備え、
前記磁気帯は、前記紙製ＤＮＡカード上に前記ＤＮＡまたはバイオサンプルが保存されている側面に、対向する側面に位置していることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２３】
情報、疾病コード、個人のＳＴＲ(縦列型反復配列）型またはＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）型は、前記磁気帯にエンコードされていることを特徴とする請求項２２記載のＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ ＩＤカードに滴下するｇＤＮＡの量は、１．５μｇ以上であることを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ ＩＤカード
【請求項２５】
分析方法において、請求項１９のＤＮＡ ＩＤカードの断片は、洗浄バッファーで処理されずにＰＣＲ増幅に用いられることを特徴とする分析方法。
【請求項１】
ＤＮＡ溶液及び水溶性キトサン溶液を混和することにより生成されたキトサン／ＤＮＡの形態としてＤＮＡを保存する方法において、前記水溶性キトサンは６０％以上の度合いで脱アセチル化しており、分子量は１０ｋＤａ〜５００ｋＤａであることを特徴とするＤＮＡ保存方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、動物、植物、菌類、バクテリア及びウイルスのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを含み、前記ＤＮＡの大きさは、数１０〜数１０億塩基対であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、０．０２％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）であり、前記水溶性キトサンの、混合物中のＤＮＡに対する重量比は１：０．５以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記水溶性キトサンの水溶液の濃度は、０．０２％（ｗ／ｖ）〜０．２５％（ｗ／ｖ）であり、前記ＤＮＡ溶液の濃度は、１μｇ／μｌ以下であり、水溶性キトサンの、混合物中のＤＮＡ量に対する重量比は、１：０．５〜１：３であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡとキトサンとの複合体は、−７０℃から室温で保存されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
キトサンと結合したＤＮＡの前記複合体は、液体状態として保存されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡを保存する紙製ＤＮＡカードにおいて、前記ＤＮＡカードは水溶性キトサン及び尿酸を備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてＤＮＡは、ＤＮＡ溶液を前記水溶性キトサンと結合しているＤＮＡとしてカードに滴下することによって保存されることを特徴とするＤＮＡカード。
【請求項８】
ＤＮＡを保存する紙製ＤＮＡカードにおいて、前記ＤＮＡカードは水溶性キトサン及び尿酸を含む細胞溶解バッファーを備える組成物中に浸漬され、乾燥され、そしてＤＮＡは、前記水溶性キトサンと結合しているＤＮＡとしての前記カードに、ＤＮＡを含むバイオサンプルを滴下することにより保存されることを特徴とするＤＮＡカード。
【請求項９】
前記紙は、ブロッティング用またはクロマトグラフィー用であり、該紙の厚さは０．３〜１．２ｍｍであることを特徴とする請求項７または８に記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１０】
前記カードは、１２．３ｃｍ×８．１ｃｍ内に、６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェルとなるよう、各ウェルの大きさに応じた印をつけられており、ＤＮＡまたは血液サンプルは各ウェルに滴下され、保存されることを特徴とする請求項７または８に記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１１】
前記組成物は、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の水溶性キトサンと０．５ｍＭ〜２０ｍＭの尿酸とを、体積比１：１で混和することにより生成されることを特徴とする請求項７記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１２】
前記細胞溶解バッファーは、トリス（８ｍＭ）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）（０．５ｍＭ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）（０．１％ ｗ／ｖ）及び尿酸（２ｍＭ）を含むことを特徴とする請求項８記載の紙製ＤＮＡカード。
【請求項１３】
ａ）請求項７記載のＤＮＡカードの断片をＰＣＲチューブに加える工程；
ｂ）ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてＴＥバッファーを取り除く工程；
ｃ）工程ｂ）を２回繰り返す工程；
ｄ）室温で１時間または５６℃で１０分間で、前記チューブを乾燥させる工程；及び、
ｅ）ＰＣＲサンプルを前記チューブに加え、ＰＣＲによる増幅を行う工程；を備えることを特徴とするＤＮＡカードを用いたＰＣＲアッセイ方法。
【請求項１４】
ａ）請求項８記載のＤＮＡカードの断片をＰＣＲチューブに加える工程；
ｂ）洗浄バッファー（ＧＧ精製試薬；０．５ｍＭのＥＤＴＡ、８ｍＭのトリス‐Ｃｌ、２ｍＭの尿酸、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後ピペットを用いて洗浄バッファーを取り除く工程；
ｃ）工程ｂ）を３回繰り返す工程；
ｄ）ＴＥバッファー（１０ｍＭのトリス‐Ｃｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）を前記チューブに加え、混和後、前記チューブを室温で５分間立たせたまま放置し、その後、ピペットを用いてＴＥバッファーを取り除く工程；
ｅ）工程ｄ）を２回または３回繰り返す工程；
ｆ）室温で１時間または５６℃で１０分間で、前記チューブを乾燥させる工程；及び、
ｇ）ＰＣＲサンプルを前記チューブに加え、ＰＣＲによる増幅を行う工程；を備えることを特徴とするＤＮＡカードを用いたＰＣＲアッセイ方法。
【請求項１５】
分析方法において、請求項６記載の保存方法により保存されたＤＮＡまたは請求項７若しくは８によるＤＮＡカードで保存されたＤＮＡは、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ、クローニング、ライブラリー合成、シークエンシング分析またはサザンブロッティングに用いられることを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ分析方法において、請求項６の保存方法により液体状態で保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体または、請求項７若しくは８によりＤＮＡカードに保存されたキトサン／ＤＮＡ複合体から、サルフェートを基礎としたカチオン塩を用いて、分離された前記ＤＮＡは、遺伝子分析に用いられることを特徴とするＤＮＡ分析方法。
【請求項１７】
前記サルフェートを基礎としたカチオン塩は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＳＯＳ（オクチル硫酸ナトリウム）、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）を含むことを特徴とする請求項１６記載のＤＮＡ分析方法。
【請求項１８】
オリゴｄ（Ｔ）、プライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー溶液、ｄＮＴＰ及び水溶性キトサンを含むチューブを備えるＰＣＲキットにおいて、前記チューブは、更に、ＤＮＡまたは血清サンプルを含み、そして前記チューブは、ＰＣＲを行うために用いられることを特徴とするＰＣＲキット。
【請求項１９】
ＤＮＡ ＩＤカードにおいて、キトサンと個人のＤＮＡとの混合物は、請求項１のＤＮＡ保存方法により、前記混合物の一部が保存され、個人の遺伝子情報は、磁気帯または組み込みチップに保存されることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ ＩＤカードの基本素材はプラスチックであることを特徴とする請求項１９記載の前記ＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２１】
ａ）ＰＶＣ軟層に、請求項７または８の紙製ＤＮＡカードを積み重ねる工程；
ｂ）前記紙製ＤＮＡカードに、前記紙製カードと同じ大きさの穴を有した第一ＰＶＣコア層を積み重ねる工程；
ｃ）前記第一ＰＶＣコア層の穴の上に、前記第一ＰＶＣコア層の穴より小さい二つの穴を有する第二ＰＶＣコア層を積み重ねる工程；
ｄ）第二ＰＶＣコア層に、ＰＶＣ軟層を積み重ねる工程；及び、
ｅ）該積み重ねられた層を互いに熱接着するために、熱と圧力を加える工程；を備えることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカードの生成方法。
【請求項２２】
請求項２０によるＤＮＡ ＩＤカードは、
第一ＰＶＣ軟層、紙製ＤＮＡカード、紙製ＤＮＡカードの大きさと等しい大きさの穴を有する第一ＰＶＣコア層、ＤＮＡまたはＤＮＡを含むバイオサンプルを滴下した時、前記紙製ＤＮＡカードに通じる穴を有する第二ＰＶＣコア層、及び第二ＰＶＣ軟層を備え、
前記磁気帯は、前記紙製ＤＮＡカード上に前記ＤＮＡまたはバイオサンプルが保存されている側面に、対向する側面に位置していることを特徴とするＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２３】
情報、疾病コード、個人のＳＴＲ(縦列型反復配列）型またはＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）型は、前記磁気帯にエンコードされていることを特徴とする請求項２２記載のＤＮＡ ＩＤカード。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ ＩＤカードに滴下するｇＤＮＡの量は、１．５μｇ以上であることを特徴とする請求項２２に記載のＤＮＡ ＩＤカード
【請求項２５】
分析方法において、請求項１９のＤＮＡ ＩＤカードの断片は、洗浄バッファーで処理されずにＰＣＲ増幅に用いられることを特徴とする分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【公表番号】特表２００８−５１２０９０（Ｐ２００８−５１２０９０Ａ）
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２９６６０（Ｐ２００７−５２９６６０）
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２８３２３
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７０７３３５４）グッジェン インク (4)
【氏名又は名称原語表記】ＧＯＯＤＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００７７４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２８３２３
【国際公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【出願人】（５０７０７３３５４）グッジェン インク (4)
【氏名又は名称原語表記】ＧＯＯＤＧＥＮＥ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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