キャノーラタンパク質の生成
少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有し、主に２Ｓタンパク質からなり、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まないキャノーラタンパク質単離物を調製する。一態様では、キャノーラ油糧種子粗粉を、タンパク質水溶液を用いて高温で抽出して、粗粉から２Ｓタンパク質を優先的に抽出し、２Ｓタンパク質を主に含むキャノーラタンパク質溶液を生成する。２Ｓキャノーラタンパク質は単離物として回収される。別の態様では、キャノーラ油糧種子粗粉を最初に水で抽出して、７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を優先的に抽出し、その後キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液で抽出して、その粗粉から２Ｓタンパク質を抽出する。２Ｓキャノーラタンパク質単離物は塩抽出物から回収される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００５年７月１日出願の米国仮特許出願第６０／６９５，５３５号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、キャノーラの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を実質的には含まない、キャノーラの２Ｓタンパク質を調製するための新しい手順に関する。
【０００３】
（発明の背景）
キャノーラタンパク質単離物は、キャノーラ油糧種子粗粉から形成することができる。共に本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年５月３日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３０１２５５２６Ａ１号）、２００４年６月９日出願の第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４０２５４３５３Ａ１号）、および対応するＰＣＴ出願ＷＯ第０２／０８９５９７号には、キャノーラ油糧種子粗粉から、少なくとも１００ｗｔ％のタンパク質含量（Ｎ×６．２５）を有するキャノーラタンパク質単離物を生成する方法が記載されている。その手順は、塩溶液を使用してキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を使用することによってその水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持するステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水で希釈してタンパク質ミセルを形成させるステップと、タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成するステップと、上澄み液から、ケルダール窒素（Ｎ×６．２５）によって決定して、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を回収するステップと、を含む、多重ステップのプロセスを含む。本明細書では、タンパク質含量は乾燥重量ベースで決定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００４】
上記プロセスの一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、湿潤ＰＭＭおよび上澄み液から乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮上澄み液を湿潤ＰＭＭと混合し、その混合物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）の高い純度を有する。
【０００５】
上記プロセスの別の実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、上澄み液からタンパク質を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、その濃縮物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）の高い純度を有する。
【０００６】
上記の米国特許出願に記載の手順は、本質的には回分式手順である。本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年１１月１９日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４００３９１７４Ａ１号）および対応する公開済み国際出願ＷＯ第０３／０４３４３９号には、キャノーラタンパク質単離物を生成するための連続プロセスが記載されている。それによれば、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、パイプを介して搬送しながらキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を残留キャノーラ油糧種子粗粉から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に搬送して、タンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持し、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成させ、沈降容器に所望の量のＰＭＭが蓄積するまで、タンパク質ミセルを連続的に沈降させると同時に、上澄み液を連続的にオーバーフローさせる。ＰＭＭを沈降容器から取り出し、乾燥することができる。そのＰＭＭは、ケルダール窒素（Ｎ×６．２５）によって決定し、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００７】
上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号および同第１０／４７１，２３０号に記載のように、オーバーフローした上澄み液を処理して、その上澄み液からキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００８】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含むことが知られており、幾つかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質は、様々な沈降係数（Ｓ）によって識別される。同定されたこれら知られているタンパク質には、クルシフェリンとして知られている１２Ｓグロブリン、およびナピンとして知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。
【０００９】
キャノーラは、菜種または菜種油としても公知である。
【００１０】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００３年８月２５日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４００３４２０４号）および２００３年４月１５日出願の１０／５１０，７６６号、ならびに対応する公開済みＰＣＴ出願ＷＯ第０３／０８８７６号には、ＰＭＭキャノーラタンパク質単離物の組成物および上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の組成物が記載されている。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主に２Ｓタンパク質を含み、それより少量の７Ｓタンパク質および微量の１２Ｓタンパク質を含む。２Ｓタンパク質は低分子量のアルブミンである。生成されたＰＭＭは、主に７Ｓタンパク質を含み、２Ｓタンパク質および１２Ｓタンパク質は相対的に少量の成分である。７Ｓおよび１２Ｓタンパク質はより高い分子量のグロブリンであり、７Ｓ分子は１２Ｓタンパク質の半分子である。
【００１１】
それらに記載のように、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は以下のタンパク質プロファイルを示す。
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００１２】
ＰＭＭキャノーラタンパク質単離物は以下のタンパク質プロファイルを示す。
約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
好ましくは
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質。
【００１３】
主に２Ｓタンパク質からなる上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主に７Ｓタンパク質からなるＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物よりも幾つかの用途で優れた機能性を示すことが見出されている。従来の用途において説明されている手順では、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物を生成するために、ＰＭＭを形成し、上澄み液を用意して、実際にキャノーラタンパク質を分画するステップを経る必要があった。
【００１４】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年７月２１日出願の米国特許出願第１１／０３８，０８６号（米国特許出願公開第２００５−０１８１１１２Ａ１号）（ＷＯ第２００５／０６７７２９号）には、ＰＭＭ沈殿物からの上澄み液を、膜処理後に熱処理にかけて、７Ｓタンパク質を沈殿させ、２Ｓタンパク質に富んだタンパク質溶液を残す手順が記載されている。残りの溶液は、噴霧乾燥することができる。
【００１５】
最小割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を有する２Ｓタンパク質は、酸性ｐＨ値において未処理の２Ｓタンパク質よりも高い可溶性を示し、溶液の透明度を改善することができ、清涼飲料に関しては透明なタンパク質強化飲料を提供することができる。
【００１６】
（発明の概要）
驚くべきことに、本発明の一態様によれば、キャノーラ油糧種子粗粉の抽出を、相対的周囲温度ではなく高温で行う場合、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓタンパク質が抽出され、得られた抽出液中のキャノーラタンパク質は、主に２Ｓタンパク質からなり、その後その２Ｓタンパク質は、該抽出液から比較的純粋な形態で得られることが見出された。
【００１７】
いかなる理論にも拘泥するものではないが、高い抽出温度で、７Ｓおよび／または１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に抽出することができるのは、キャノーラ油糧種子粗粉の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が抽出ステップ中に分解し、沈殿するからであると考えられている。
【００１８】
したがって、本発明の一態様では、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて高温で抽出して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先してキャノーラ油糧種子粗粉から２Ｓタンパク質を優先的に抽出し、主に２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質抽出液を得るステップと、残留キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質抽出液を分離するステップと、キャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップと、を含む。
【００１９】
さらに驚くべきことに、本発明のさらなる一態様によれば、水を使用して第１の抽出を行い、塩水溶液を使用して第２の抽出を行う２段階でキャノーラ油糧種子粗粉の抽出を行う場合、第１の抽出ステップからは、主に７Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質水溶液が得られ、第２の抽出ステップからは、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質抽出水溶液が得られることが見出された。
【００２０】
水を用いたキャノーラ油糧種子粗粉の最初の抽出ステップは、著しい割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質、それより少ない割合の２Ｓタンパク質、ならびに可溶性不純物の大部分を可溶化する。塩水溶液を用いた第２の抽出によって、大部分の２Ｓタンパク質、少量の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質、ならびに低濃度の可溶性不純物を含むキャノーラタンパク質水溶液が得られる。
【００２１】
上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の手順に従って、キャノーラタンパク質塩水溶液抽出物を濃縮し、ダイアフィルトレーションして含塩量を低減し、次いで熱処理して、残留した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させる。
【００２２】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の調製方法が提供され、その方法は、キャノーラ油糧種子粗粉を水で抽出して、２Ｓタンパク質に優先して７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質および可溶性不純物を優先的に抽出し、第１のキャノーラタンパク質抽出液を形成するステップと、残留油糧種子粗粉から第１のキャノーラタンパク質抽出液を分離するステップと、残留油糧種子粗粉を塩水溶液で抽出して、残留油糧種子粗粉から２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を溶解し、第２のキャノーラタンパク質抽出液を形成するステップと、第２のキャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２３】
さらに驚くべきことに、本発明の別の態様によれば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の濃縮ステップからの濃縮キャノーラタンパク質溶液を、上記の米国特許出願第１１／０３８，５８６号の手順に従って熱処理して、それに含まれる７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大部分を沈殿させ、実質的には２Ｓタンパク質からなる濃縮キャノーラタンパク質水溶液を残すことができることが見出された。
【００２４】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、塩水溶液でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、残留油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、前記キャノーラタンパク質溶液を濃縮して、濃縮タンパク質溶液を保持液（retentate）として提供するステップと、その濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して濃縮キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成するステップと、沈殿したタンパク質から熱処理したキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、分離し熱処理したキャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２５】
さらに驚くべきことに、本発明のさらなる一態様によれば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号の手順に従って、キャノーラ油糧種子粗粉を塩抽出することによって得られたキャノーラタンパク質水溶液を、上記の米国特許出願第１１／０３８，５８６号の手順に従って熱処理して、それに含まれる７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大部分を沈殿させ、実質的には２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質水溶液を残すことができることが見出された。
【００２６】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、塩水溶液でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、残留油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先してキャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成するステップと、沈殿したタンパク質から熱処理したキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、分離し熱処理したキャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２７】
本発明の手順は、ＰＭＭ−沈殿分画ステップを採用する必要なく、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得ることを可能にし、したがってこの手順はかなり簡素化され、主として２Ｓタンパク質が占めるキャノーラタンパク質単離物を、より経済的に得ることが可能となる。
【００２８】
本明細書のプロセスに従って生成されたキャノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼成食品の質量増し（body formers）、および製品にガスを封入する発泡剤などの、タンパク質単離物の通常の用途に使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質単離物は、肉類似物に有用なタンパク質繊維に形成することができ、結合剤として卵白が使用される食品の卵白代用物または増量剤として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物は栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の使用には、タンパク質強化飲料、ペットフード、動物飼料、ならびに工業用途および化粧品用途、および個人用手入れ用品における使用がある。
【００２９】
（発明の一般的な説明）
上記のように、本発明は、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まず、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液の生成プロセスの４つの態様を提供する。
【００３０】
（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉の高温抽出を利用する態様
本発明のこの態様に従ってキャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００３１】
本発明の一態様では、塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００３２】
本発明のこの態様におけるキャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、高温、一般に約７０℃〜約１００℃、好ましくは約８０℃〜約９５℃の温度で行われ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓキャノーラタンパク質を油糧種子粗粉からタンパク質抽出液に優先的に抽出させる。
【００３３】
食品用塩水溶液は、一般に、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する。塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。
【００３４】
可溶化ステップの際の食品用塩溶液中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３５】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約２０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３６】
タンパク質溶液は、一般に以下のキャノーラタンパク質プロファイルを有する。
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００３７】
塩水溶液は酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液のフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００３８】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００３９】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、ダイアフィルトレーションを用いることもできる。
【００４０】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００４１】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００４２】
タンパク質抽出水溶液を処理して、その水溶液からキャノーラタンパク質単離物を回収する。本明細書で生成したキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有し、主に２Ｓタンパク質からなる。
【００４３】
このような処理では、タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通す一方でキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００４４】
周知のように、限外濾過および類似の選択的膜技術は、低分子量種をそれに通すと同時に、それより高い分子量種が通るのを防止する。低分子量種には、食品用塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および非栄養因子などの、供給材料から抽出された低分子量材料も含まれる。膜の分子量カットオフは、通常溶液中に相当高い割合のタンパク質を確実に保持すると同時に汚染物質を通すように、異なる膜材料および構成を考慮して選択される。
【００４５】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００４６】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲でよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００４７】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００４８】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００４９】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、上記の色除去操作の代替としての色除去操作にかけることができる。本明細書では、粉末状活性炭も、顆粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に使用することができる。色吸収剤として使用できる別の材料はポリビニルピロリドンである。
【００５０】
色吸収剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸収剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸収剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００５１】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質水溶液を、所望に応じて熱処理ステップにかけて、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の量を低減することができる。このような熱処理は、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【００５２】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては熱処理したタンパク質水溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなり、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する乾燥キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【００５３】
（ｂ）キャノーラ油糧種子粗粉の多重抽出を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００５４】
本発明のこの態様では、タンパク質の可溶化を複数のステップで行う。第１のステップでは、抽出媒体として水を使用し、それによって２Ｓキャノーラタンパク質に加えて相当高い割合の可溶性不純物に優先し、キャノーラ油糧種子粗粉から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を優先的に抽出する。水抽出ステップは、キャノーラ油糧種子粗粉の単回水抽出またはキャノーラ油糧種子粗粉の約２〜約２５回の抽出、好ましくは約２〜約４回の抽出などの多重水抽出として行うことができる。
【００５５】
７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の水溶液を、任意の所望の方式で処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質をキャノーラタンパク質単離物として回収することができる。例えば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載のように、タンパク質水溶液を、食塩水の添加後に濃縮ステップおよびミセル形成ステップにかけることができる。
【００５６】
水を使用するキャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、約１０℃〜約７０℃、好ましくは約５５℃〜約６５℃の温度で実施することができる。可溶化ステップの際の水中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００５７】
水抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１０〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約２５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００５８】
可溶化の第２のステップでは、水抽出（１または複数回）からの残留キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液で抽出し、それによって大部分の２Ｓキャノーラタンパク質、少量の７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質、ならびに低濃度の不純物を含むキャノーラタンパク質抽出水溶液を得る。塩は、通常は塩化ナトリウムであるが、塩化ナトリウムなどの他の塩を使用することもできる。一般に、食品用塩溶液を使用するが、キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００５９】
可溶化の第２のステップで使用する塩水溶液は、一般に少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１、一般に最大約０．５のイオン強度を有する。
【００６０】
食品用塩水溶液は、一般に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを用いて、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。
【００６１】
食品用塩溶液での上記キャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、一般に、約５℃〜約６５℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃の温度で実施される。可溶化ステップの際の食品用塩溶液中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得、一般に約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００６２】
食塩水抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約５〜約２０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００６３】
油糧種子粗粉の食塩水可溶化から得られたタンパク質水溶液は、一般に以下のキャノーラタンパク質プロファイルを有する。
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００６４】
塩水溶液は酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液のフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００６５】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００６６】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するためにダイアフィルトレーションを用いることもできる。
【００６７】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００６８】
キャノーラタンパク質水溶液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質濃度を有し、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００６９】
このような処理では、タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通すと同時にキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００７０】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００７１】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００７２】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００７３】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００７４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質水溶液を、所望に応じて熱処理ステップにかけて、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の量を低減することができる。このような熱処理は、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去することができる。
【００７５】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては熱処理したタンパク質水溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなり、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する乾燥キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【００７６】
（ｃ）限外濾過保持液の熱処理を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００７７】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００７８】
回分式プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために撹拌を伴って、通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【００７９】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとプロセスが非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【００８０】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを、迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃で行うことが好ましい。
【００８１】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【００８２】
塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００８３】
可溶化ステップの際の塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００８４】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【００８５】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に、約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００８６】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００８７】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【００８８】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００８９】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは、第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００９０】
塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、上記の濃度の塩を、残留油糧種子粗粉からの分離後のタンパク質溶液に添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【００９１】
タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大する。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通す一方でキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００９２】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００９３】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００９４】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００９５】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００９６】
本発明のこの態様では、限外濾過し、場合によってはダイアフィルトレーションしたキャノーラタンパク質溶液を熱処理にかけて、その溶液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液を残す。このような熱処理は、上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の条件下で行うことができる。
【００９７】
このような熱処理は、濃縮液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【００９８】
次いで、得られたキャノーラタンパク質溶液を処理して、主に２Ｓが占めるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００９９】
沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を遠心分離などによって除去した後、熱処理した濃縮上澄み液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。このようなキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質濃度を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有し（ケルダールＮ×６．２５として算出）、実質的には非変性である（示差走査熱量測定によって決定）。
【０１００】
（ｄ）キャノーラタンパク質水溶液の熱処理を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【０１０１】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【０１０２】
回分式プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために撹拌を伴って、通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【０１０３】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとプロセスが非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【０１０４】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを、迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃で行うことが好ましい。
【０１０５】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【０１０６】
塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【０１０７】
可溶化ステップの際の塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【０１０８】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【０１０９】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【０１１０】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【０１１１】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【０１１２】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【０１１３】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【０１１４】
塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、上記の濃度の塩を、残留油糧種子粗粉からの分離後のタンパク質溶液に添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【０１１５】
本発明のこの態様によるキャノーラタンパク質水溶液を熱処理して、その水溶液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、キャノーラタンパク質が主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液を残す。このような熱処理は、上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の条件下で行うことができる。
【０１１６】
このような熱処理は、濃縮液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【０１１７】
沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を遠心分離などによって除去した後、熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【０１１８】
あるいは、熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、乾燥前に、態様（ａ）に関して記載した濃縮、ダイアフィルトレーションおよび色除去ステップにかけることができる。
【０１１９】
キャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質含量を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有し（ケルダールＮ×６．２５として算出）、実質的には非変性である（示差走査熱量測定によって決定）。
【０１２０】
本明細書で提供されるキャノーラタンパク質単離物は、単離物中に、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％、より好ましくは少なくとも約９５ｗｔ％のキャノーラタンパク質を含み、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まない。
【０１２１】
（実施例）
実施例１
この実施例は、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の高温抽出の、抽出液中のキャノーラタンパク質プロファイルに対する効果を示すものである。
【０１２２】
真空脱溶剤化したキャノーラ油糧種子粗粉のサンプル１５ｇ(３７．１５％タンパク質)を、逆浸透(ＲＯ)水、０．１ＭのＮａＣｌ水溶液、０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液、０．２ＭのＮａＣｌ水溶液、０．２５ＭのＮａＣｌ水溶液、および０．５ＭのＮａＣｌ水溶液の各サンプル１５０ｍｌそれぞれに、８５℃の温度で添加した。各混合物を、撹拌機／熱板を使用してその温度を維持しながら５分間撹拌した。
【０１２３】
抽出物を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、次いで２５μｍの縦溝付き濾紙を介して濾過した。濾液を、０．４５μｍのシリンジフィルターを介してさらに濾過した。
【０１２４】
濾過した抽出物を、タンパク質含量（ＬＥＣＯ ＦＰ５２８ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを使用）、色、およびタンパク質プロファイル（分析的ＨＰＬＣ ＳＥＣ ＢｉｏＳｅｐ２０００およびＳ３０００カラムを使用）について分析した。
【０１２５】
対照として比較のために、周囲温度にて０．１ＭのＮａＣｌ溶液による抽出を用いて、この実験を反復した。得られた結果を、以下の表１および２に記載する。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
表１に示した結果から分かるように、高温抽出の使用は、Ａ３３０(フェノール成分)およびＡ３９０(色)で決定される色に影響を与えていないと思われ、そのことは、高温ではフェノール成分のさらなる酸化が生じないことを示している。
【０１２９】
ＲＯ水の８５℃での見かけの抽出率は、塩抽出物よりも実質的に低く、そのことは、抽出ステップ中の塩の存在によって高温でも抽出率が有益に改善されることを示している。
【０１３０】
高温での塩抽出物の見かけの抽出率は平均約３２％であり、周囲温度で行った抽出よりも低いが、表２から分かるように、高温で抽出したタンパク質の大部分が２Ｓタンパク質である。
【０１３１】
実施例２
この実施例は、二重抽出手順を使用する、キャノーラ油糧種子粗粉の処理手順の一連の試験を示すものである。
【０１３２】
水性キャノーラ油糧種子粗粉を最初に水で抽出し、続いて塩水溶液で抽出する一連の試験を実施した。このような一連の試験の結果を、以下に示す。
【０１３３】
（ａ）試験１
キャノーラ油糧種子粗粉(回分Ａ)１５ｇを、６５℃に予熱され種子に添加される水１５０ｍｌを用いて、６０℃にて１０％ｗ／ｖで抽出した。後の方の抽出物は、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から取り出し、上澄み液を分離した後に、ペレット中の湿潤粗粉（３７ｇ）および結合水（２２ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１２８ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて、２２０ｒｐｍにて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。浄化した水抽出物および塩抽出物のサンプルを、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、そのサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。終夜冷蔵庫の中で保存して７Ｓタンパク質を沈殿させた後、水抽出物のタンパク質プロファイルも再分析した。
【０１３４】
第２の塩抽出物は、タンパク質含量が少ないが、最初の水抽出物よりも透明で清浄であり、色が薄かった（表３）。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
最初の水抽出は、７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働くとともに、第２の塩抽出は、２Ｓタンパク質の大部分を可溶化した（表４）。水抽出物を終夜冷却することによって、高い割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させた。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
（ｂ）試験２
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ａ）１５０ｇを、６０℃にて１０％ｗ／ｖで水１５００ｍｌを用いてオーバーヘッド型撹拌機で５分間抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、ペレット中の湿潤粗粉（３９２ｇ）および結合水（２４２ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２５８ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルをオーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜（安定剤セルロース）ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓを沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、濃縮物を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。
【０１３９】
水抽出物を終夜４℃に冷却し、次いで５℃で７１００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって沈殿物を収集した。次いで収集した固体を冷凍乾燥した。
【０１４０】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また各溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を０．１ＭのＮａＣｌまたは水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な塩水または水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。
【０１４１】
試験１のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表５）。最初の水抽出物を冷却することによって、総タンパク質の半分を上回る量を沈殿させた。
【０１４２】
【表５】
【０１４３】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働き、第２の塩抽出は２Ｓタンパク質の大部分を可溶化した（表６）。ダイアフィルトレーション（ＤＦ）保持液の熱処理によって、残りの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。水抽出物を終夜冷却することによって、高い割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させた。
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
この試験で形成した「Ｃ２００Ｈ」は、良好な乾き色および許容可能な濡れ色を有していた（表７）。粉末のタンパク質含量（ｗ.ｂ.）は９３．９０ｗｔ％であり、そのサンプルが単離物であることを確認した。冷却沈殿物である７Ｓ／１２Ｓは、かなり濃い黄色の粉末であったが、許容可能な濡れ色を有していた。沈殿した７Ｓ／１２Ｓ生成物が比較的濃い色であったにも関わらず、その生成物の純度は、ＬＥＣＯによって試験すると非常に高かった。このサンプルのタンパク質含量（ｗ.ｂ.）を測定すると、１０３．４９ｗｔ％であった。７Ｓ／１２Ｓ沈殿物の濡れ色サンプルのクロマトグラフ分析によって、２Ｓタンパク質による４％未満のタンパク質ピーク面積および約２５％の非タンパク質ピーク面積を含む汚染が示された。これは、沈殿以外の精製ステップを実施しないことを考慮すると、非常に低濃度の汚染である。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
（ｃ）試験３
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ａ）１５０ｇを、１０％ｗ／ｖで、水１５００ｍｌを用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（３６６ｇ）および結合水（２１６ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２８４ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ−塩水」と示した。
【０１４８】
水抽出物を、終夜４℃で冷却し、次いで沈殿物を、５℃で７１００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって収集した。次いで、収集した固体を冷凍乾燥した。上澄み液を、３番のフィルターパッドを使用して濾過し、次いで平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜を使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることよって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ−水」と示した。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１４９】
先の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表８）。しかし、温水の代わりに周囲温度の水を使用すると、窒素を可溶化しにくく、汚染物質をわずかに可溶化するのみであった。この水抽出物は、Ａ３９０の読取りによれば、温水抽出物よりも色が濃かった。水抽出物を冷却すると、試験２において６０℃の抽出物を冷却したときよりも、タンパク質の沈殿が少なかった。
【０１５０】
【表８】
【０１５１】
粗粉の周囲温度における水抽出は、温水抽出ほどは７Ｓタンパク質を可溶化しなかった。塩抽出では、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合が高くなるという結果になった（表９）。しかし、ダイアフィルトレーション保持液の熱処理において、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を除去することに成功した。周囲温度の水抽出物を冷却することによって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させたが、温水抽出物を冷却したときほどではなかった。驚くべきことに、熱処理は、水によるプロセスストリームから調製されたダイアフィルトレーションした保持液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を除去するには、あまり有効ではなかった。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
塩水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」の色は、水ストリームからの「Ｃ２００Ｈ」の色よりもわずかに薄いのみであった（表９）。いずれのサンプルも、最初の抽出に温水を使用したときほど良好な色ではなかった（試験２）。水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」（７２．７８％のタンパク質ｗ．ｂ．）の純度は、塩水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」（９６．６８％のタンパク質ｗ．ｂ．）よりもかなり低かった。塩水由来の生成物（１６．４％の非タンパク質ピーク面積）のＨＰＬＣクロマトグラムも、水由来の生成物（２７．９％の非タンパク質ピーク面積）のクロマトグラムより、それが清浄であることを示した。すなわち、水抽出物中の汚染物質濃度は、塩抽出物よりも高かった。したがって水抽出には、精製のためのより広範なダイアフィルトレーションが必要となろう。この試験で得られた冷却沈殿７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、先の試験で得られたものよりもわずかに色が薄かったが、このことはおそらく、周囲温度での水抽出では、不純物が温水抽出ほど可溶化されないからである。この生成物の純度も非常に高く、タンパク質含量は１０２．７２％（ｗ．ｂ．）であった。
【０１５４】
【表１０】
【０１５５】
（ｄ）試験４
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）２００ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（２０００ｍｌ）を用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（６３９ｇ）および結合水（４３９ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１５６１ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生成し、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を２つの部分に分割し、一方は１ｗｔ％の粉末状活性炭と共に３０分間撹拌し、サンプルの他方半分は未処理とした。両方のサンプルを、８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過し、次いで冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」（炭素なし）および「Ｃ２００ＨＣ」（炭素処理）と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１５６】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１１）。
【０１５７】
【表１１】
【０１５８】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働いたが、第２の塩抽出は、両方のタンパク質クラスの同じ割合を可溶化した（表１２）。水抽出は、他の試験ほどはタンパク質を除去しなかったが、そのことは、様々な粗粉回分を反映した可能性が高かった。ダイアフィルトレーション保持液の熱処理によって、残りの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。得られた遠心分離液の炭素処理は、タンパク質プロファイルを変えなかった。炭素処理は、ＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積を、実に１５．７６％から４．８２％に低減した。
【０１５９】
【表１２】
【０１６０】
熱処理したダイアフィルトレーション保持液の遠心分離液の炭素処理によって、得られる生成物の色が改善された（表１３）。「Ｃ２００ＨＣ」の乾き色は、「Ｃ２００Ｈ」よりもわずかに色が薄く、かなり薄い黄色であった。濡れ色サンプルにおいても、改善が認められた。
【０１６１】
【表１３】
【０１６２】
（ｅ）試験５
ふるいにかけたキャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）２００ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（２０００ｍｌ）を用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（６４８ｇ）および結合水（４４８ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１５５２ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで２番および３番のフィルターパッドに通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を２つの部分に分割し、一方は１ｗｔ％の粉末状活性炭と共に３０分間撹拌し、サンプルの他方半分は未処理とした。両方のサンプルを、８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過し、次いで冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ（炭素なし）」および「Ｃ２００ＨＣ（炭素処理）」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１６３】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１４）。殻の含量がより多い標準の粗粉の代わりに、ふるいにかけた粗粉を使用することによって、抽出されるタンパク質、色、およびフェノール成分がより濃くなる結果となった。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に比例的に有利に働いたが、その抽出率は制限されており、第２の塩抽出は、同じ割合の両方のタンパク質を可溶化した（表１５）。ダイアフィルトレーション保持液の熱処理によって、残りの７Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。得られた遠心分離液の炭素処理は、タンパク質プロファイルを変えなかった。炭素処理は、ＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積を、実に１０．９４％から１．５８％に低減した。
【０１６６】
【表１５】
【０１６７】
熱処理したダイアフィルトレーション保持液の遠心分離液の炭素処理によって、得られる生成物の色が改善されたが、先の試験ほどではなかった（表１６）。この試験において、「Ｃ２００ＨＣ」の乾き色は、「Ｃ２００Ｈ」よりも薄い黄色であったが、炭素処理した生成物は、未処理サンプルよりもわずかに赤く、濃かった。炭素処理は、濡れ色を改善したが、より大きな改善は、やはり試験４において見られた。
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
（ｆ）試験６
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）１５０ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（１５００ｍｌ）を用いて６０℃で１５分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（４５８ｇ）および結合水（３０８ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１１９２ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１７０】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１７）。より長時間、６０℃で水抽出することによって、塩抽出物の質をわずかに改善することができたが、その効果は顕著ではなかったと思われる。
【０１７１】
【表１７】
【０１７２】
様々なサンプルのタンパク質プロファイルを、表１８に示す。より長時間、６０℃で水抽出することによって、同じ回分の粗粉の先の抽出よりも多くの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が可溶化したと思われた。このことは、塩抽出物の７Ｓ／１２Ｓ含量が低減され、それによって精製２Ｓタンパク質のサンプルの調製がより容易になるので望ましい。
【０１７３】
【表１８】
【０１７４】
このサンプルの乾き色は平均的であり（表１９）、その濡れ色は薄いが、炭素処理サンプルについて先に見られたほど良好ではなかった。
【０１７５】
【表１９】
【０１７６】
（ｇ）試験７
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）１６０ｇを、１ｗｔ％の粉末状活性炭（１６ｇ）と共に、１０％ｗ／ｖで、水（１６００ｍｌ）を用いて６０℃で５分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉および炭素から分離し、湿潤粗粉／炭素（５３３ｇ）および結合水（３５７ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２４３ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻した。さらに、別の新しい粉末状活性炭１６ｇをその系に添加して、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生成し、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１７７】
抽出ステップに炭素を含むことによって、プロセスストリームの色および不純物含量が大幅に低減した（表２０）。
【０１７８】
【表２０】
【０１７９】
様々なサンプルのタンパク質プロファイルを、表２１に示す。水抽出物中のタンパク質の割合は、試験６に見られたものと非常に類似していた。しかし、塩抽出物中のタンパク質量の割合は、２Ｓタンパク質に明らかに恵まれた試験６よりもはるかに多かった。これに関しては、この試験では水相によるタンパク質抽出率レベルが低いことと、おそらくは炭素に付着した２Ｓタンパク質が喪失したことによって説明が付くであろう。しかし、炭素は、試験４および５に適用した場合、タンパク質プロファイルを変えなかった。
【０１８０】
【表２１】
【０１８１】
このサンプルは、優れた乾き色および濡れ色を有していた（表２２）。「Ｃ２００Ｈ」粉末に関するＬＥＣＯの結果は、わずか８９．３％ｗ.ｂ.であったが、乾燥ベースでは、サンプルは単離物である可能性が高かった。ＨＰＬＣによる、最終生成物に対する非タンパク質不純物の濃度は、わずか１．１％であった。したがって、サンプルに存在する非タンパク質種の大部分は、２８０ｎｍでは吸光しない。塩が、これらの化合物であった可能性が最も高い。水を用いたさらなるダイアフィルトレーションを使用して、この塩を除去し、最終生成物のタンパク質含量を改善することができる。
【０１８２】
【表２２】
【０１８３】
試験１〜７の結果は、キャノーラ油糧種子粗粉に対して実施した二重抽出手順によって、７Ｓタンパク質に富み、２Ｓタンパク質に富んだストリームが生じたことを示している。
【０１８４】
実施例３
この実施例は、実施例２の二重抽出手順の一連の試験を記載するものであり、ここでは、複数回水抽出を塩抽出の前に実施した。
【０１８５】
この一連の試験結果をここに記載する。種子粗粉の水抽出は、向流抽出機を使用して工業的に実施されることに留意されたい。このようなプロセスでは、多数回に相当する個々の洗浄に粗粉を曝す。
【０１８６】
試験１
キャノーラ種子粗粉（回分Ｂ）１５ｇを、６０℃で５分間、水（１５０ｍｌ）を用いて抽出した。水を６５℃に予熱し、次いで２２０ｒｐｍで動作させたオービタルシェーカーを使用して、粗粉と混合した。抽出物を、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。その抽出物をデカントして湿潤粗粉を回収し、秤量し、溜まった水の体積を計算した。次いで、体積を１５０ｍｌに戻すための６５℃の十分な水を、使用済み粗粉に添加し、上記のように抽出を繰り返した。このプロセスを繰り返して、４回の水抽出を実施した。次いで、５回目の抽出を、室温にて０．５ＭのＮａＣｌで実施した。十分な塩水を添加して体積を１５０ｍｌに戻し、次いで、サンプルを室温で３０分間、２２０ｒｐｍで振とうすることによって抽出を実施した。表２３は、各抽出に添加した水または塩水の体積を示す。凝集ペレットは、第２および第３の抽出後に遠心分離にかけたときには得られなかったことに留意されたい。したがって、サンプルをデカントするときに粗粉を喪失しないよう、より多くの溶媒を保持した。理論上、最大体積の使用済みの水が除去され、新しい水で置き換えられるならば、より多くの汚染物質を抽出することができるはずである。
【０１８７】
【表２３】
【０１８８】
抽出サンプルのｐＨ、導電率、およびブリックスを測定し、次いで孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでサンプルを濾過し、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について試験した。
【０１８９】
連続的水抽出によって、相当な量のタンパク質および不純物を除去した（表２４）。この試験で生成した塩抽出物は、実施例２に報告した単回の水抽出試験で生成した塩抽出物よりも、かなり清浄であった。これらの試験では、塩抽出物は、ＨＰＬＣによって約７０％の非タンパク質ピーク面積を含むことが判明した。しかし、１回の水抽出後に塩抽出を用い、共に炭素処理を伴った試験から得られた塩抽出物は、現試験よりも、Ａ３３０（０．２９）、Ａ３９０（０．１０）、およびＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積％（２．３４％）がかなり少なかった。これらの差異は、複数回水抽出では、所望の生成物の色を得るのに十分清浄な塩抽出物を生成することができないことを示唆している。
【０１９０】
【表２４】
【０１９１】
温水を用いて、２Ｓタンパク質よりも容易に７Ｓタンパク質を抽出した（表２５）。予想通り、塩抽出物は２Ｓタンパク質に富んでいた。抽出した全２Ｓタンパク質の約３分の１は、７Ｓ／１２Ｓタンパク質の大部分および不純物を含んだ低純度の水ストリームに入ったと推測される。できるだけ多くの２Ｓタンパク質を、高純度ストリームに保持することが望ましい。水相と共に２Ｓタンパク質の喪失（低質な生成物として回収）および実際には多重抽出スキーム全体の値に対する許容限は、塩水ストリームから生じる２Ｓタンパク質の質および値に依存する。
【０１９２】
【表２５】
【０１９３】
試験２
キャノーラ種子粗粉（回分Ｂ）１５０ｇを、６０℃で５分間、水（１５００ｍｌ）で抽出した。水を６５℃に予熱し、次いでオーバーヘッド型撹拌機を使用して、粗粉と混合した。抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。その抽出物をデカントして湿潤粗粉を回収し、秤量し、溜まった水の体積を計算した。次いで、体積を１５００ｍｌに戻すための６５℃の十分な水を使用済み粗粉に添加し、上記のように抽出を繰り返した。４回の水抽出を実施するまで、このプロセスを繰り返した。次いで、５回目の抽出を、室温にて０．２ＭのＮａＣｌで実施した。ダイアフィルトレーションによって塩を除去しなければならず、５回のダイアフィルトレーション体積の処理に許容された時間しかなかったので、試験１よりも低濃度の塩を選択した。十分な０．２ＭのＮａＣｌを添加して体積を１５００ｍｌに戻し、次いで、サンプルを室温で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて混合することによって抽出を実施した。表２６は、各抽出に添加した水または塩水の体積を示す。
【０１９４】
【表２６】
【０１９５】
塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。
【０１９６】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を０．１ＭのＮａＣｌ（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な塩水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０１９７】
この実験の水抽出は、試験１と比較して、大体同じ量のタンパク質、色、および不純物を除去したように見えた（表２７）。塩抽出物の質は、わずかに異なっているように見え、この試験の抽出で見出されたタンパク質、遊離フェノール成分、不純物、および可視色は少なかった。水抽出に関する分析データがかなり類似していたように見えたことから、塩抽出における差異は、異なる塩濃度による可能性が高かった。
【０１９８】
【表２７】
【０１９９】
この試験の水抽出物のタンパク質プロファイル（表２８）は、試験１と類似していたが、塩抽出物は、高い割合の２Ｓタンパク質を有しているように見えた。このことは、この試験においてより少ない塩を使用したことと、高い塩分が、７Ｓタンパク質の抽出よりも２Ｓタンパク質の抽出に有利に働くと思われていたことから、多少驚きであった。
【０２００】
【表２８】
【０２０１】
塩抽出物を膜処理することによって、それがさらに精製され、そのダイアフィルトレーション保持液のＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積％がわずか２．３％であることが判明した。これは、単回の水抽出試験に一般に見られたものよりも低い（実施例２参照）。
【０２０２】
この試験で生成した「Ｃ２００Ｈ」の乾き色を、表２９に示す。この色は、同じ粗粉を用いた他の二重抽出試験で見られたものに非常に類似している。粉末状炭素を二重抽出と併用することによって、明度がほぼ９０であり、この試験の生成物よりも赤色味および黄色味が少ない「Ｃ２００Ｈ」が生成した。
【０２０３】
【表２９】
【０２０４】
試験２で生成した「Ｃ２００Ｈ」の濡れ色は、吸着剤なしの他の二重抽出試験（６０℃の水）で見られたものとやはり同じであり、吸収剤を伴って生成したサンプルよりも明らかに濃かった。
【０２０５】
これらの試験結果は、実施例２の結果と比較すると、塩抽出前に粗粉を複数回水抽出することによって不純物をさらに除去したが（吸収剤なし）、最終生成物の質には大きな影響を与えなかったように見えたことを示している。
【０２０６】
実施例４
この実施例は、限外濾過保持液からの単離２Ｓタンパク質生成物の調製を例示するものである。
【０２０７】
キャノーラ粗粉４０ｋｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液４００Ｌに周囲温度で添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得る。残留キャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を、遠心分離および濾過によって浄化して、１．８７重量％のタンパク質含量を有する濾過タンパク質溶液１３９Ｌを生成した。
【０２０８】
タンパク質抽出液の一定分量１３９Ｌを、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜で濃縮することによって、体積を８．９Ｌに低減した。次いで、濃縮タンパク質溶液の一定分量５Ｌを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液２４．８Ｌを用いて、１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜でダイアフィルトレーションした。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を、６０℃で１０分間低温殺菌した。
【０２０９】
ダイアフィルトレーションし、低温殺菌した限外濾過（ＵＦ１）保持液のサンプルを得た。この保持液のタンパク質含量は、１８．３０ｗｔ％であった。ＵＦ１保持液に存在する高い割合の７Ｓと組み合わせた高いタンパク質濃度によって、加熱の際に、沈殿だけではなくゲル化が生じるはずであると考えられた。その結果、熱処理の前に、保持液１００ｍｌを１００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌと混合することによって、サンプルのタンパク質濃度を調節した。
【０２１０】
希釈したサンプルを８５℃で１０分間熱処理し、次いで冷水で３０℃未満に急冷した。次いでサンプルを、１０２００ｇの遠心分離に１５分間かけた。遠心分離後に、ペレットといくらかの浮遊沈殿粒子とを得た。上澄み液をデカントし、孔径２５μｍの濾紙を介して濾過することによって、浮遊粒子を除去した。回収した上澄み液（１２０ｍｌ）を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ１００００ＨＹ膜ユニットで濃縮し、次いで逆浸透精製水１０体積でダイアフィルトレーションして塩を除去した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を冷凍乾燥し、Ｃ５００Ｈと示した。
【０２１１】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、オーブン乾燥法を使用して含水量について分析し、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを７８００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な水を添加して、タンパク質含量を５ｗｔ％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０２１２】
ＵＰ１保持液の熱処理によって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半をサンプルから除去することに成功した。最初の保持液中の７Ｓおよび１２ＳによるＨＰＬＣタンパク質ピーク面積の割合は、それぞれ６１．４％および２％であった。これが、熱処理サンプルの上澄み液では、７Ｓが４．４％に、１２Ｓが０．４％に低減した。得られた最終生成物は、９０．３２％のタンパク質含量（湿潤ベース）および４．８２％の含水量を有する単離物であり、結果として９４．８９％のタンパク質含量（乾燥ベース）であった。生成物の乾き色は、これまでＣ２００Ｈ生成物に見られたものより少し濃かった（表３０）。
【０２１３】
【表３０】
【０２１４】
生成物の濡れ色は、かなり良好であったが、Ｃ２００Ｈで見られたものよりもおそらくわずかに濃かった。サンプルは、わずかに濁っていた。
【０２１５】
本明細書に記載の結果から分かるように、ＵＦ１保持液から、本質的には２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を生成することに成功した。
【０２１６】
実施例５
この実施例は、キャノーラ油糧種子粗粉から形成されたキャノーラタンパク質抽出液の熱処理を例示するものである。
【０２１７】
キャノーラ油糧種子粗粉（ＳＢ０６２）１５０ｇを、１５００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌで、室温で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。その混合物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけて、使用済み粗粉から抽出物を分離した。収集した抽出物を、ダブルボイラー中、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓ／１２Ｓを沈殿させた。熱処理後、サンプルを冷水浴に浸水することによって、３０℃未満に急冷した。沈殿した固体を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって除去し、次いでその遠心分離液を、３番のフィルターパッドで洗練させた。次いで、清浄化した遠心分離液を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ１００００ＨＹ限外濾過ユニットで濃縮し、逆浸透精製水１０体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによっていくらか沈殿物が形成され、サンプルを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、その沈殿物を再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーションした保持液を冷凍乾燥して、最終生成物を形成した。
【０２１８】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、オーブン乾燥法を使用して含水量について分析し、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．８ｇ）を水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを７８００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０２１９】
抽出物の熱処理によって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半をサンプルから除去することに成功した。最初の抽出物中の７Ｓおよび１２ＳによるＨＰＬＣタンパク質ピーク面積の割合は、それぞれ６３．８％および３．８％であった。これが、熱処理サンプルの遠心分離液では、７Ｓが２．０％に、１２Ｓが０．８％に低減した。抽出物の加熱によって形成された沈殿物は、遠心分離によって容易に除去された。得られた最終生成物は、８４．１５％のタンパク質含量（湿潤ベース）および７．２２％の含水量を有する単離物であり、結果として９０．７０％のタンパク質含量（乾燥ベース）であった。生成物の乾き色は、単離した２Ｓ生成物の大部分にこれまで見られたものよりわずかに濃く、赤かった（表３１）。
【０２２０】
【表３１】
【０２２１】
開示の概要
本開示を概説すると、本質的には２Ｓキャノーラタンパク質からなり、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まないキャノーラタンパク質単離物の調製手順が提供される。本発明の範囲においては改変が可能である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２００５年７月１日出願の米国仮特許出願第６０／６９５，５３５号の優先権を主張するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、キャノーラの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を実質的には含まない、キャノーラの２Ｓタンパク質を調製するための新しい手順に関する。
【０００３】
（発明の背景）
キャノーラタンパク質単離物は、キャノーラ油糧種子粗粉から形成することができる。共に本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年５月３日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（米国特許出願公開第２００３０１２５５２６Ａ１号）、２００４年６月９日出願の第１０／４７６，２３０号（米国特許出願公開第２００４０２５４３５３Ａ１号）、および対応するＰＣＴ出願ＷＯ第０２／０８９５９７号には、キャノーラ油糧種子粗粉から、少なくとも１００ｗｔ％のタンパク質含量（Ｎ×６．２５）を有するキャノーラタンパク質単離物を生成する方法が記載されている。その手順は、塩溶液を使用してキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を使用することによってその水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持するステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水で希釈してタンパク質ミセルを形成させるステップと、タンパク質ミセルを沈降させて、非晶質で粘着性の、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成するステップと、上澄み液から、ケルダール窒素（Ｎ×６．２５）によって決定して、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を回収するステップと、を含む、多重ステップのプロセスを含む。本明細書では、タンパク質含量は乾燥重量ベースで決定される。回収したＰＭＭは乾燥することができる。
【０００４】
上記プロセスの一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、湿潤ＰＭＭおよび上澄み液から乾燥タンパク質を含むタンパク質単離物を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、濃縮上澄み液を湿潤ＰＭＭと混合し、その混合物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）の高い純度を有する。
【０００５】
上記プロセスの別の実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理して、上澄み液からタンパク質を回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を使用して上澄み液を濃縮し、その濃縮物を乾燥することによって行うことができる。得られたキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質（Ｎ×６．２５）の高い純度を有する。
【０００６】
上記の米国特許出願に記載の手順は、本質的には回分式手順である。本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００２年１１月１９日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（米国特許出願公開第２００４００３９１７４Ａ１号）および対応する公開済み国際出願ＷＯ第０３／０４３４３９号には、キャノーラタンパク質単離物を生成するための連続プロセスが記載されている。それによれば、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、パイプを介して搬送しながらキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を形成し、そのタンパク質水溶液を残留キャノーラ油糧種子粗粉から連続的に分離し、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に搬送して、タンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大すると同時に、イオン強度を実質的に一定に維持し、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルを形成させ、沈降容器に所望の量のＰＭＭが蓄積するまで、タンパク質ミセルを連続的に沈降させると同時に、上澄み液を連続的にオーバーフローさせる。ＰＭＭを沈降容器から取り出し、乾燥することができる。そのＰＭＭは、ケルダール窒素（Ｎ×６．２５）によって決定し、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。
【０００７】
上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号および同第１０／４７１，２３０号に記載のように、オーバーフローした上澄み液を処理して、その上澄み液からキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【０００８】
キャノーラ種子は、約１０〜約３０ｗｔ％のタンパク質を含むことが知られており、幾つかの異なるタンパク質成分が同定されている。これらのタンパク質は、様々な沈降係数（Ｓ）によって識別される。同定されたこれら知られているタンパク質には、クルシフェリンとして知られている１２Ｓグロブリン、およびナピンとして知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。
【０００９】
キャノーラは、菜種または菜種油としても公知である。
【００１０】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００３年８月２５日出願の同時係属中の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（米国特許出願公開第２００４００３４２０４号）および２００３年４月１５日出願の１０／５１０，７６６号、ならびに対応する公開済みＰＣＴ出願ＷＯ第０３／０８８７６号には、ＰＭＭキャノーラタンパク質単離物の組成物および上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物の組成物が記載されている。上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主に２Ｓタンパク質を含み、それより少量の７Ｓタンパク質および微量の１２Ｓタンパク質を含む。２Ｓタンパク質は低分子量のアルブミンである。生成されたＰＭＭは、主に７Ｓタンパク質を含み、２Ｓタンパク質および１２Ｓタンパク質は相対的に少量の成分である。７Ｓおよび１２Ｓタンパク質はより高い分子量のグロブリンであり、７Ｓ分子は１２Ｓタンパク質の半分子である。
【００１１】
それらに記載のように、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は以下のタンパク質プロファイルを示す。
約６０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約４０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは
約７０〜約９５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
約５〜約３０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約２ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００１２】
ＰＭＭキャノーラタンパク質単離物は以下のタンパク質プロファイルを示す。
約６０〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約２５ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
好ましくは
約８８〜約９８ｗｔ％の７Ｓタンパク質、
約１〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、および
０〜約６ｗｔ％の２Ｓタンパク質。
【００１３】
主に２Ｓタンパク質からなる上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物は、主に７Ｓタンパク質からなるＰＭＭ由来のキャノーラタンパク質単離物よりも幾つかの用途で優れた機能性を示すことが見出されている。従来の用途において説明されている手順では、上澄み液由来のキャノーラタンパク質単離物を生成するために、ＰＭＭを形成し、上澄み液を用意して、実際にキャノーラタンパク質を分画するステップを経る必要があった。
【００１４】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、２００５年７月２１日出願の米国特許出願第１１／０３８，０８６号（米国特許出願公開第２００５−０１８１１１２Ａ１号）（ＷＯ第２００５／０６７７２９号）には、ＰＭＭ沈殿物からの上澄み液を、膜処理後に熱処理にかけて、７Ｓタンパク質を沈殿させ、２Ｓタンパク質に富んだタンパク質溶液を残す手順が記載されている。残りの溶液は、噴霧乾燥することができる。
【００１５】
最小割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を有する２Ｓタンパク質は、酸性ｐＨ値において未処理の２Ｓタンパク質よりも高い可溶性を示し、溶液の透明度を改善することができ、清涼飲料に関しては透明なタンパク質強化飲料を提供することができる。
【００１６】
（発明の概要）
驚くべきことに、本発明の一態様によれば、キャノーラ油糧種子粗粉の抽出を、相対的周囲温度ではなく高温で行う場合、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓタンパク質が抽出され、得られた抽出液中のキャノーラタンパク質は、主に２Ｓタンパク質からなり、その後その２Ｓタンパク質は、該抽出液から比較的純粋な形態で得られることが見出された。
【００１７】
いかなる理論にも拘泥するものではないが、高い抽出温度で、７Ｓおよび／または１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に抽出することができるのは、キャノーラ油糧種子粗粉の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が抽出ステップ中に分解し、沈殿するからであると考えられている。
【００１８】
したがって、本発明の一態様では、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて高温で抽出して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先してキャノーラ油糧種子粗粉から２Ｓタンパク質を優先的に抽出し、主に２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質抽出液を得るステップと、残留キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質抽出液を分離するステップと、キャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップと、を含む。
【００１９】
さらに驚くべきことに、本発明のさらなる一態様によれば、水を使用して第１の抽出を行い、塩水溶液を使用して第２の抽出を行う２段階でキャノーラ油糧種子粗粉の抽出を行う場合、第１の抽出ステップからは、主に７Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質水溶液が得られ、第２の抽出ステップからは、主に２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質抽出水溶液が得られることが見出された。
【００２０】
水を用いたキャノーラ油糧種子粗粉の最初の抽出ステップは、著しい割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質、それより少ない割合の２Ｓタンパク質、ならびに可溶性不純物の大部分を可溶化する。塩水溶液を用いた第２の抽出によって、大部分の２Ｓタンパク質、少量の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質、ならびに低濃度の可溶性不純物を含むキャノーラタンパク質水溶液が得られる。
【００２１】
上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の手順に従って、キャノーラタンパク質塩水溶液抽出物を濃縮し、ダイアフィルトレーションして含塩量を低減し、次いで熱処理して、残留した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させる。
【００２２】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の調製方法が提供され、その方法は、キャノーラ油糧種子粗粉を水で抽出して、２Ｓタンパク質に優先して７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質および可溶性不純物を優先的に抽出し、第１のキャノーラタンパク質抽出液を形成するステップと、残留油糧種子粗粉から第１のキャノーラタンパク質抽出液を分離するステップと、残留油糧種子粗粉を塩水溶液で抽出して、残留油糧種子粗粉から２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を溶解し、第２のキャノーラタンパク質抽出液を形成するステップと、第２のキャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２３】
さらに驚くべきことに、本発明の別の態様によれば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の濃縮ステップからの濃縮キャノーラタンパク質溶液を、上記の米国特許出願第１１／０３８，５８６号の手順に従って熱処理して、それに含まれる７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大部分を沈殿させ、実質的には２Ｓタンパク質からなる濃縮キャノーラタンパク質水溶液を残すことができることが見出された。
【００２４】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、塩水溶液でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、残留油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、前記キャノーラタンパク質溶液を濃縮して、濃縮タンパク質溶液を保持液（retentate）として提供するステップと、その濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して濃縮キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成するステップと、沈殿したタンパク質から熱処理したキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、分離し熱処理したキャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２５】
さらに驚くべきことに、本発明のさらなる一態様によれば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号の手順に従って、キャノーラ油糧種子粗粉を塩抽出することによって得られたキャノーラタンパク質水溶液を、上記の米国特許出願第１１／０３８，５８６号の手順に従って熱処理して、それに含まれる７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大部分を沈殿させ、実質的には２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質水溶液を残すことができることが見出された。
【００２６】
本発明のこのさらなる態様によれば、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法が提供され、その方法は、塩水溶液でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出して、キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得るステップと、残留油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先してキャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成するステップと、沈殿したタンパク質から熱処理したキャノーラタンパク質溶液を分離するステップと、分離し熱処理したキャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む。
【００２７】
本発明の手順は、ＰＭＭ−沈殿分画ステップを採用する必要なく、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得ることを可能にし、したがってこの手順はかなり簡素化され、主として２Ｓタンパク質が占めるキャノーラタンパク質単離物を、より経済的に得ることが可能となる。
【００２８】
本明細書のプロセスに従って生成されたキャノーラタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼成食品の質量増し（body formers）、および製品にガスを封入する発泡剤などの、タンパク質単離物の通常の用途に使用することができる。さらに、キャノーラタンパク質単離物は、肉類似物に有用なタンパク質繊維に形成することができ、結合剤として卵白が使用される食品の卵白代用物または増量剤として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物は栄養補助食品として使用することができる。キャノーラタンパク質単離物の他の使用には、タンパク質強化飲料、ペットフード、動物飼料、ならびに工業用途および化粧品用途、および個人用手入れ用品における使用がある。
【００２９】
（発明の一般的な説明）
上記のように、本発明は、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まず、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液の生成プロセスの４つの態様を提供する。
【００３０】
（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉の高温抽出を利用する態様
本発明のこの態様に従ってキャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００３１】
本発明の一態様では、塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００３２】
本発明のこの態様におけるキャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、高温、一般に約７０℃〜約１００℃、好ましくは約８０℃〜約９５℃の温度で行われ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して２Ｓキャノーラタンパク質を油糧種子粗粉からタンパク質抽出液に優先的に抽出させる。
【００３３】
食品用塩水溶液は、一般に、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する。塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。
【００３４】
可溶化ステップの際の食品用塩溶液中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３５】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約２０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３６】
タンパク質溶液は、一般に以下のキャノーラタンパク質プロファイルを有する。
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００３７】
塩水溶液は酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液のフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００３８】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００３９】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、ダイアフィルトレーションを用いることもできる。
【００４０】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００４１】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００４２】
タンパク質抽出水溶液を処理して、その水溶液からキャノーラタンパク質単離物を回収する。本明細書で生成したキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有し、主に２Ｓタンパク質からなる。
【００４３】
このような処理では、タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通す一方でキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００４４】
周知のように、限外濾過および類似の選択的膜技術は、低分子量種をそれに通すと同時に、それより高い分子量種が通るのを防止する。低分子量種には、食品用塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および非栄養因子などの、供給材料から抽出された低分子量材料も含まれる。膜の分子量カットオフは、通常溶液中に相当高い割合のタンパク質を確実に保持すると同時に汚染物質を通すように、異なる膜材料および構成を考慮して選択される。
【００４５】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００４６】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲でよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００４７】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００４８】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００４９】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、上記の色除去操作の代替としての色除去操作にかけることができる。本明細書では、粉末状活性炭も、顆粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に使用することができる。色吸収剤として使用できる別の材料はポリビニルピロリドンである。
【００５０】
色吸収剤処理ステップは、任意の好都合な条件下、一般にはキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸収剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％〜約３％ｗ／ｖの量を使用することができる。色吸収剤は、濾過などの任意の好都合な手段によって、キャノーラタンパク質溶液から除去することができる。
【００５１】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質水溶液を、所望に応じて熱処理ステップにかけて、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の量を低減することができる。このような熱処理は、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【００５２】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては熱処理したタンパク質水溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなり、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する乾燥キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【００５３】
（ｂ）キャノーラ油糧種子粗粉の多重抽出を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００５４】
本発明のこの態様では、タンパク質の可溶化を複数のステップで行う。第１のステップでは、抽出媒体として水を使用し、それによって２Ｓキャノーラタンパク質に加えて相当高い割合の可溶性不純物に優先し、キャノーラ油糧種子粗粉から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を優先的に抽出する。水抽出ステップは、キャノーラ油糧種子粗粉の単回水抽出またはキャノーラ油糧種子粗粉の約２〜約２５回の抽出、好ましくは約２〜約４回の抽出などの多重水抽出として行うことができる。
【００５５】
７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の水溶液を、任意の所望の方式で処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質をキャノーラタンパク質単離物として回収することができる。例えば、上記の米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載のように、タンパク質水溶液を、食塩水の添加後に濃縮ステップおよびミセル形成ステップにかけることができる。
【００５６】
水を使用するキャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、約１０℃〜約７０℃、好ましくは約５５℃〜約６５℃の温度で実施することができる。可溶化ステップの際の水中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００５７】
水抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１０〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約２５ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００５８】
可溶化の第２のステップでは、水抽出（１または複数回）からの残留キャノーラ油糧種子粗粉を塩水溶液で抽出し、それによって大部分の２Ｓキャノーラタンパク質、少量の７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質、ならびに低濃度の不純物を含むキャノーラタンパク質抽出水溶液を得る。塩は、通常は塩化ナトリウムであるが、塩化ナトリウムなどの他の塩を使用することもできる。一般に、食品用塩溶液を使用するが、キャノーラタンパク質単離物が食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００５９】
可溶化の第２のステップで使用する塩水溶液は、一般に少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１、一般に最大約０．５のイオン強度を有する。
【００６０】
食品用塩水溶液は、一般に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを用いて、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。
【００６１】
食品用塩溶液での上記キャノーラ油糧種子粗粉の抽出は、一般に、約５℃〜約６５℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃の温度で実施される。可溶化ステップの際の食品用塩溶液中のキャノーラ油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得、一般に約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００６２】
食塩水抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約１〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約５〜約２０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００６３】
油糧種子粗粉の食塩水可溶化から得られたタンパク質水溶液は、一般に以下のキャノーラタンパク質プロファイルを有する。
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質、
好ましくは約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質。
【００６４】
塩水溶液は酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。使用する酸化防止剤の量は、溶液の約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液のフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００６５】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００６６】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するためにダイアフィルトレーションを用いることもできる。
【００６７】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００６８】
キャノーラタンパク質水溶液を処理して、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質濃度を有し、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００６９】
このような処理では、タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大することができる。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通すと同時にキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００７０】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００７１】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００７２】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００７３】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００７４】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質水溶液を、所望に応じて熱処理ステップにかけて、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の量を低減することができる。このような熱処理は、溶液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去することができる。
【００７５】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションし、場合によっては熱処理したタンパク質水溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなり、少なくとも約９０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する乾燥キャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【００７６】
（ｃ）限外濾過保持液の熱処理を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【００７７】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【００７８】
回分式プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために撹拌を伴って、通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【００７９】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとプロセスが非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【００８０】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを、迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃で行うことが好ましい。
【００８１】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【００８２】
塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【００８３】
可溶化ステップの際の塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００８４】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【００８５】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に、約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００８６】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【００８７】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【００８８】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【００８９】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは、第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【００９０】
塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、上記の濃度の塩を、残留油糧種子粗粉からの分離後のタンパク質溶液に添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【００９１】
タンパク質抽出液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増大する。このような濃縮は、限外濾過などの任意の好都合な選択的膜技術を使用して行われ、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の低分子量の非タンパク質材料を含む低分子量種を膜に通す一方でキャノーラタンパク質を溶液に保持する、適切な分子量カットオフを有する膜を使用する。異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方式でタンパク質抽出液を濃縮することによって、タンパク質を回収するために乾燥を要する液体の体積も低減される。タンパク質抽出液は、一般に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮される。このような濃縮操作は、回分式モードまたは連続操作で実施することができる。
【００９２】
次いで、濃縮タンパク質抽出液を、水を使用するダイアフィルトレーションステップにかけることができる。このようなダイアフィルトレーションは、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション溶液を使用して行うことができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過膜を通すことによって、さらなる量の汚染物質をタンパク質抽出水溶液から除去する。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中に相当多量のさらなるフェノール成分および可視色が存在しなくなるまで行うことができる。このようなダイアフィルトレーションは、濃縮ステップで使用したものと同じ膜を使用して行うことができる。しかし、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構成を考慮して、約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの別の膜を使用して、所望に応じて行うことができる。
【００９３】
ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの任意の好都合な酸化防止剤であってよい。ダイアフィルトレーション媒体中に使用する酸化防止剤の量は、使用する材料に依存し、約０．０１〜約１ｗｔ％の範囲であってよく、好ましくは約０．０５ｗｔ％である。酸化防止剤は、濃縮タンパク質抽出液に存在するフェノール成分の酸化を抑制する働きをする。
【００９４】
濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、任意の好都合な温度で、一般には約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の濃度を実現する時間をかけて行うことができる。使用する温度および他の条件は、濃縮を行うために使用する膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度にある程度依存する。
【００９５】
濃縮し、場合によってはダイアフィルトレーションしたタンパク質溶液を、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のように、必要に応じてさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００９６】
本発明のこの態様では、限外濾過し、場合によってはダイアフィルトレーションしたキャノーラタンパク質溶液を熱処理にかけて、その溶液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液を残す。このような熱処理は、上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の条件下で行うことができる。
【００９７】
このような熱処理は、濃縮液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【００９８】
次いで、得られたキャノーラタンパク質溶液を処理して、主に２Ｓが占めるキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。
【００９９】
沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を遠心分離などによって除去した後、熱処理した濃縮上澄み液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。このようなキャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質濃度を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有し（ケルダールＮ×６．２５として算出）、実質的には非変性である（示差走査熱量測定によって決定）。
【０１００】
（ｄ）キャノーラタンパク質水溶液の熱処理を利用する態様
キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉由来のタンパク質材料を可溶化することを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料は、キャノーラ種子に天然に存在するタンパク質であってよく、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性を有するタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からキャノーラ油糧を除去することによって、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラ油糧の除去は、通常、本明細書に記載されるタンパク質単離物の回収手順とは別の操作として行われる。
【０１０１】
塩の存在によって、油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去が増進されるため、タンパク質の可溶化は、食品用塩溶液を使用することによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。塩は、通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩を使用することもできる。相当多量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０、最大約０．２のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するに従って、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶度は最初増大し、その後最大値に達する。その後、イオン強度がいくら増大しようとも、可溶化タンパク質全体を増加することはない。タンパク質の可溶化を最大にする食品用塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択されるキャノーラ油糧種子粗粉に応じて変わる。
【０１０２】
回分式プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大約３５℃の温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために撹拌を伴って、通常約１０〜約６０分行う。可溶化は、全体的に高い生成収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように行うことが好ましい。
【０１０３】
可溶化は、約５℃の温度より低いと実際的ではない程に遅くなるので、約５℃の下限温度が選択されると同時に、回分式モードにおいて温度レベルが高くなるとプロセスが非経済的となることから、約３５℃の好ましい上限温度が選択される。
【０１０４】
連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出を、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続抽出の実施に合致する任意の方式で行う。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物を、ある長さを有するパイプまたは導管を介して、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間に合わせた流速で搬送する。このような連続手順では、好ましくはキャノーラ油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くの使用可能なタンパク質を抽出するように可溶化を行うために、塩可溶化ステップを、迅速に最大約１０分間行う。連続手順における可溶化は、高温で、好ましくは約３５℃を超え、一般には最大約６５℃で行うことが好ましい。
【０１０５】
塩水溶液およびキャノーラ油糧種子粗粉は、約５〜約６．８の中性ｐＨを有し、約５．３〜約６．２のｐＨ値が好ましい。
【０１０６】
塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて任意の好都合な酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを使用することによって、約５〜約６．８の範囲の任意の所望の値に調節することができる。キャノーラタンパク質単離物が、食品以外の使用に企図される場合には、非食品用化学物質を使用することができる。
【０１０７】
可溶化ステップの際の塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は、幅広く変わり得る。一般的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【０１０８】
塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉に存在し得る脂肪を可溶化するという追加の効果を有し、結果として該脂肪は水相中に存在する。
【０１０９】
抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【０１１０】
次いで、抽出ステップから得られた水相を、デカンター型遠心分離機を使用するなどの任意の好都合な方式で残留キャノーラ粗粉から分離し、その後ディスク型遠心分離および／または濾過によって残留粗粉を除去することができる。分離した残留粗粉は、乾燥して処分することができる。
【０１１１】
粉末状活性炭または他の色素吸着剤を分離タンパク質水溶液と混合し、次いで濾過によって吸着剤を好都合に除去してタンパク質溶液を提供することによって、最終キャノーラタンパク質単離物の色を、薄い色で、より淡い黄色に改善することができる。色素を除去するために、分離タンパク質水溶液のダイアフィルトレーションを、濃縮の前または後に、以下に記載のように用いることもできる。
【０１１２】
このような色素除去ステップは、任意の好都合な条件下、一般には分離タンパク質水溶液の周囲温度で、任意の適切な色素吸着剤を使用して実施することができる。粉末状活性炭については、約０．０２５％〜約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％〜約２％ｗ／ｖの量が使用される。
【０１１３】
本発明の譲渡人に譲渡され、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当多量の脂肪を含む場合には、分離タンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して、前記特許に記載の脱脂ステップを行うことができる。色を改善するステップが実施される場合、かかるステップは第１の脱脂ステップの後に行うことができる。
【０１１４】
塩水溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出する代わりに、水だけを使用してかかる抽出を行うこともできるが、水だけを使用する場合、油糧種子粗粉からのタンパク質抽出量が、塩水溶液の場合よりも減少する傾向にある。このような代替案を用いる場合、以下に記載の濃縮ステップ中、溶液にタンパク質を維持するために、上記の濃度の塩を、残留油糧種子粗粉からの分離後のタンパク質溶液に添加することができる。色除去ステップおよび／または第１の脂肪除去ステップを実施する場合、塩は、一般にこのような操作の完了後に添加される。
【０１１５】
本発明のこの態様によるキャノーラタンパク質水溶液を熱処理して、その水溶液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、キャノーラタンパク質が主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質溶液を残す。このような熱処理は、上記の米国特許出願第１１／０３８，０８６号に記載の条件下で行うことができる。
【０１１６】
このような熱処理は、濃縮液に存在する７Ｓおよび１２Ｓの割合を低減するのに十分な、好ましくは７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合をかなり大きな程度低減するのに十分な温度および時間プロファイルを使用して行うことができる。一般に、溶液の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量は、熱処理によって、少なくとも約５０ｗｔ％、好ましくは少なくとも約７５ｗｔ％低減される。一般に、熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５℃〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間行うことができる。沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、遠心分離または濾過などの任意の好都合な方式で除去し、回収することができる。
【０１１７】
沈殿した７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を遠心分離などによって除去した後、熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、噴霧乾燥または冷凍乾燥などの任意の好都合な技術によって乾燥して乾燥形態にし、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。
【０１１８】
あるいは、熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、乾燥前に、態様（ａ）に関して記載した濃縮、ダイアフィルトレーションおよび色除去ステップにかけることができる。
【０１１９】
キャノーラタンパク質単離物は、約９０ｗｔ％を超える高いタンパク質含量を有し、好ましくはタンパク質を少なくとも約１００ｗｔ％有し（ケルダールＮ×６．２５として算出）、実質的には非変性である（示差走査熱量測定によって決定）。
【０１２０】
本明細書で提供されるキャノーラタンパク質単離物は、単離物中に、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは少なくとも約９０ｗｔ％、より好ましくは少なくとも約９５ｗｔ％のキャノーラタンパク質を含み、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まない。
【０１２１】
（実施例）
実施例１
この実施例は、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の高温抽出の、抽出液中のキャノーラタンパク質プロファイルに対する効果を示すものである。
【０１２２】
真空脱溶剤化したキャノーラ油糧種子粗粉のサンプル１５ｇ(３７．１５％タンパク質)を、逆浸透(ＲＯ)水、０．１ＭのＮａＣｌ水溶液、０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液、０．２ＭのＮａＣｌ水溶液、０．２５ＭのＮａＣｌ水溶液、および０．５ＭのＮａＣｌ水溶液の各サンプル１５０ｍｌそれぞれに、８５℃の温度で添加した。各混合物を、撹拌機／熱板を使用してその温度を維持しながら５分間撹拌した。
【０１２３】
抽出物を、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、次いで２５μｍの縦溝付き濾紙を介して濾過した。濾液を、０．４５μｍのシリンジフィルターを介してさらに濾過した。
【０１２４】
濾過した抽出物を、タンパク質含量（ＬＥＣＯ ＦＰ５２８ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒを使用）、色、およびタンパク質プロファイル（分析的ＨＰＬＣ ＳＥＣ ＢｉｏＳｅｐ２０００およびＳ３０００カラムを使用）について分析した。
【０１２５】
対照として比較のために、周囲温度にて０．１ＭのＮａＣｌ溶液による抽出を用いて、この実験を反復した。得られた結果を、以下の表１および２に記載する。
【０１２６】
【表１】
【０１２７】
【表２】
【０１２８】
表１に示した結果から分かるように、高温抽出の使用は、Ａ３３０(フェノール成分)およびＡ３９０(色)で決定される色に影響を与えていないと思われ、そのことは、高温ではフェノール成分のさらなる酸化が生じないことを示している。
【０１２９】
ＲＯ水の８５℃での見かけの抽出率は、塩抽出物よりも実質的に低く、そのことは、抽出ステップ中の塩の存在によって高温でも抽出率が有益に改善されることを示している。
【０１３０】
高温での塩抽出物の見かけの抽出率は平均約３２％であり、周囲温度で行った抽出よりも低いが、表２から分かるように、高温で抽出したタンパク質の大部分が２Ｓタンパク質である。
【０１３１】
実施例２
この実施例は、二重抽出手順を使用する、キャノーラ油糧種子粗粉の処理手順の一連の試験を示すものである。
【０１３２】
水性キャノーラ油糧種子粗粉を最初に水で抽出し、続いて塩水溶液で抽出する一連の試験を実施した。このような一連の試験の結果を、以下に示す。
【０１３３】
（ａ）試験１
キャノーラ油糧種子粗粉(回分Ａ)１５ｇを、６５℃に予熱され種子に添加される水１５０ｍｌを用いて、６０℃にて１０％ｗ／ｖで抽出した。後の方の抽出物は、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から取り出し、上澄み液を分離した後に、ペレット中の湿潤粗粉（３７ｇ）および結合水（２２ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１２８ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて、２２０ｒｐｍにて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。浄化した水抽出物および塩抽出物のサンプルを、孔径０．４５μｍのフィルターで濾過し、そのサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。終夜冷蔵庫の中で保存して７Ｓタンパク質を沈殿させた後、水抽出物のタンパク質プロファイルも再分析した。
【０１３４】
第２の塩抽出物は、タンパク質含量が少ないが、最初の水抽出物よりも透明で清浄であり、色が薄かった（表３）。
【０１３５】
【表３】
【０１３６】
最初の水抽出は、７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働くとともに、第２の塩抽出は、２Ｓタンパク質の大部分を可溶化した（表４）。水抽出物を終夜冷却することによって、高い割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させた。
【０１３７】
【表４】
【０１３８】
（ｂ）試験２
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ａ）１５０ｇを、６０℃にて１０％ｗ／ｖで水１５００ｍｌを用いてオーバーヘッド型撹拌機で５分間抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、ペレット中の湿潤粗粉（３９２ｇ）および結合水（２４２ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２５８ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルをオーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜（安定剤セルロース）ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓを沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、濃縮物を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。
【０１３９】
水抽出物を終夜４℃に冷却し、次いで５℃で７１００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって沈殿物を収集した。次いで収集した固体を冷凍乾燥した。
【０１４０】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また各溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を０．１ＭのＮａＣｌまたは水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な塩水または水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。
【０１４１】
試験１のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表５）。最初の水抽出物を冷却することによって、総タンパク質の半分を上回る量を沈殿させた。
【０１４２】
【表５】
【０１４３】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働き、第２の塩抽出は２Ｓタンパク質の大部分を可溶化した（表６）。ダイアフィルトレーション（ＤＦ）保持液の熱処理によって、残りの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。水抽出物を終夜冷却することによって、高い割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させた。
【０１４４】
【表６】
【０１４５】
この試験で形成した「Ｃ２００Ｈ」は、良好な乾き色および許容可能な濡れ色を有していた（表７）。粉末のタンパク質含量（ｗ.ｂ.）は９３．９０ｗｔ％であり、そのサンプルが単離物であることを確認した。冷却沈殿物である７Ｓ／１２Ｓは、かなり濃い黄色の粉末であったが、許容可能な濡れ色を有していた。沈殿した７Ｓ／１２Ｓ生成物が比較的濃い色であったにも関わらず、その生成物の純度は、ＬＥＣＯによって試験すると非常に高かった。このサンプルのタンパク質含量（ｗ.ｂ.）を測定すると、１０３．４９ｗｔ％であった。７Ｓ／１２Ｓ沈殿物の濡れ色サンプルのクロマトグラフ分析によって、２Ｓタンパク質による４％未満のタンパク質ピーク面積および約２５％の非タンパク質ピーク面積を含む汚染が示された。これは、沈殿以外の精製ステップを実施しないことを考慮すると、非常に低濃度の汚染である。
【０１４６】
【表７】
【０１４７】
（ｃ）試験３
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ａ）１５０ｇを、１０％ｗ／ｖで、水１５００ｍｌを用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（３６６ｇ）および結合水（２１６ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２８４ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ−塩水」と示した。
【０１４８】
水抽出物を、終夜４℃で冷却し、次いで沈殿物を、５℃で７１００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって収集した。次いで、収集した固体を冷凍乾燥した。上澄み液を、３番のフィルターパッドを使用して濾過し、次いで平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜を使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることよって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ−水」と示した。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１４９】
先の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表８）。しかし、温水の代わりに周囲温度の水を使用すると、窒素を可溶化しにくく、汚染物質をわずかに可溶化するのみであった。この水抽出物は、Ａ３９０の読取りによれば、温水抽出物よりも色が濃かった。水抽出物を冷却すると、試験２において６０℃の抽出物を冷却したときよりも、タンパク質の沈殿が少なかった。
【０１５０】
【表８】
【０１５１】
粗粉の周囲温度における水抽出は、温水抽出ほどは７Ｓタンパク質を可溶化しなかった。塩抽出では、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合が高くなるという結果になった（表９）。しかし、ダイアフィルトレーション保持液の熱処理において、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を除去することに成功した。周囲温度の水抽出物を冷却することによって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させたが、温水抽出物を冷却したときほどではなかった。驚くべきことに、熱処理は、水によるプロセスストリームから調製されたダイアフィルトレーションした保持液から７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を除去するには、あまり有効ではなかった。
【０１５２】
【表９】
【０１５３】
塩水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」の色は、水ストリームからの「Ｃ２００Ｈ」の色よりもわずかに薄いのみであった（表９）。いずれのサンプルも、最初の抽出に温水を使用したときほど良好な色ではなかった（試験２）。水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」（７２．７８％のタンパク質ｗ．ｂ．）の純度は、塩水ストリームから生成した「Ｃ２００Ｈ」（９６．６８％のタンパク質ｗ．ｂ．）よりもかなり低かった。塩水由来の生成物（１６．４％の非タンパク質ピーク面積）のＨＰＬＣクロマトグラムも、水由来の生成物（２７．９％の非タンパク質ピーク面積）のクロマトグラムより、それが清浄であることを示した。すなわち、水抽出物中の汚染物質濃度は、塩抽出物よりも高かった。したがって水抽出には、精製のためのより広範なダイアフィルトレーションが必要となろう。この試験で得られた冷却沈殿７Ｓおよび１２Ｓタンパク質は、先の試験で得られたものよりもわずかに色が薄かったが、このことはおそらく、周囲温度での水抽出では、不純物が温水抽出ほど可溶化されないからである。この生成物の純度も非常に高く、タンパク質含量は１０２．７２％（ｗ．ｂ．）であった。
【０１５４】
【表１０】
【０１５５】
（ｄ）試験４
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）２００ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（２０００ｍｌ）を用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（６３９ｇ）および結合水（４３９ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１５６１ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドに２回通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生成し、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を２つの部分に分割し、一方は１ｗｔ％の粉末状活性炭と共に３０分間撹拌し、サンプルの他方半分は未処理とした。両方のサンプルを、８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過し、次いで冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」（炭素なし）および「Ｃ２００ＨＣ」（炭素処理）と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１５６】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１１）。
【０１５７】
【表１１】
【０１５８】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に有利に働いたが、第２の塩抽出は、両方のタンパク質クラスの同じ割合を可溶化した（表１２）。水抽出は、他の試験ほどはタンパク質を除去しなかったが、そのことは、様々な粗粉回分を反映した可能性が高かった。ダイアフィルトレーション保持液の熱処理によって、残りの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。得られた遠心分離液の炭素処理は、タンパク質プロファイルを変えなかった。炭素処理は、ＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積を、実に１５．７６％から４．８２％に低減した。
【０１５９】
【表１２】
【０１６０】
熱処理したダイアフィルトレーション保持液の遠心分離液の炭素処理によって、得られる生成物の色が改善された（表１３）。「Ｃ２００ＨＣ」の乾き色は、「Ｃ２００Ｈ」よりもわずかに色が薄く、かなり薄い黄色であった。濡れ色サンプルにおいても、改善が認められた。
【０１６１】
【表１３】
【０１６２】
（ｅ）試験５
ふるいにかけたキャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）２００ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（２０００ｍｌ）を用いて周囲温度で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（６４８ｇ）および結合水（４４８ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１５５２ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで２番および３番のフィルターパッドに通過させることによって濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を２つの部分に分割し、一方は１ｗｔ％の粉末状活性炭と共に３０分間撹拌し、サンプルの他方半分は未処理とした。両方のサンプルを、８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、孔径０．４５μｍのシリンジフィルターで濾過し、次いで冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ（炭素なし）」および「Ｃ２００ＨＣ（炭素処理）」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１６３】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１４）。殻の含量がより多い標準の粗粉の代わりに、ふるいにかけた粗粉を使用することによって、抽出されるタンパク質、色、およびフェノール成分がより濃くなる結果となった。
【０１６４】
【表１４】
【０１６５】
この場合も、最初の水抽出は７Ｓタンパク質の可溶化に比例的に有利に働いたが、その抽出率は制限されており、第２の塩抽出は、同じ割合の両方のタンパク質を可溶化した（表１５）。ダイアフィルトレーション保持液の熱処理によって、残りの７Ｓタンパク質の大半を除去することに成功した。得られた遠心分離液の炭素処理は、タンパク質プロファイルを変えなかった。炭素処理は、ＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積を、実に１０．９４％から１．５８％に低減した。
【０１６６】
【表１５】
【０１６７】
熱処理したダイアフィルトレーション保持液の遠心分離液の炭素処理によって、得られる生成物の色が改善されたが、先の試験ほどではなかった（表１６）。この試験において、「Ｃ２００ＨＣ」の乾き色は、「Ｃ２００Ｈ」よりも薄い黄色であったが、炭素処理した生成物は、未処理サンプルよりもわずかに赤く、濃かった。炭素処理は、濡れ色を改善したが、より大きな改善は、やはり試験４において見られた。
【０１６８】
【表１６】
【０１６９】
（ｆ）試験６
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）１５０ｇを、１０％ｗ／ｖで、水（１５００ｍｌ）を用いて６０℃で１５分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、湿潤粗粉（４５８ｇ）および結合水（３０８ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２５ＭのＮａＣｌ（１１９２ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻し、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを５２００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１７０】
他の試験のように、第２の塩抽出物は、最初の水抽出物よりも清浄であり、色が薄かった（表１７）。より長時間、６０℃で水抽出することによって、塩抽出物の質をわずかに改善することができたが、その効果は顕著ではなかったと思われる。
【０１７１】
【表１７】
【０１７２】
様々なサンプルのタンパク質プロファイルを、表１８に示す。より長時間、６０℃で水抽出することによって、同じ回分の粗粉の先の抽出よりも多くの７Ｓおよび１２Ｓタンパク質が可溶化したと思われた。このことは、塩抽出物の７Ｓ／１２Ｓ含量が低減され、それによって精製２Ｓタンパク質のサンプルの調製がより容易になるので望ましい。
【０１７３】
【表１８】
【０１７４】
このサンプルの乾き色は平均的であり（表１９）、その濡れ色は薄いが、炭素処理サンプルについて先に見られたほど良好ではなかった。
【０１７５】
【表１９】
【０１７６】
（ｇ）試験７
キャノーラ油糧種子粗粉（回分Ｂ）１６０ｇを、１ｗｔ％の粉末状活性炭（１６ｇ）と共に、１０％ｗ／ｖで、水（１６００ｍｌ）を用いて６０℃で５分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。水抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉および炭素から分離し、湿潤粗粉／炭素（５３３ｇ）および結合水（３５７ｇ）の重量を決定した。次いで、十分な０．２ＭのＮａＣｌ（１２４３ｍｌ）を添加して濃度を１０％ｗ／ｖに戻した。さらに、別の新しい粉末状活性炭１６ｇをその系に添加して、そのサンプルを、オーバーヘッド型撹拌機を用いて室温で３０分間混合した。塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１００００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生成し、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。最初の水抽出物は、この試験では処理しなかった。様々なサンプルを、試験２に詳説のように分析した。
【０１７７】
抽出ステップに炭素を含むことによって、プロセスストリームの色および不純物含量が大幅に低減した（表２０）。
【０１７８】
【表２０】
【０１７９】
様々なサンプルのタンパク質プロファイルを、表２１に示す。水抽出物中のタンパク質の割合は、試験６に見られたものと非常に類似していた。しかし、塩抽出物中のタンパク質量の割合は、２Ｓタンパク質に明らかに恵まれた試験６よりもはるかに多かった。これに関しては、この試験では水相によるタンパク質抽出率レベルが低いことと、おそらくは炭素に付着した２Ｓタンパク質が喪失したことによって説明が付くであろう。しかし、炭素は、試験４および５に適用した場合、タンパク質プロファイルを変えなかった。
【０１８０】
【表２１】
【０１８１】
このサンプルは、優れた乾き色および濡れ色を有していた（表２２）。「Ｃ２００Ｈ」粉末に関するＬＥＣＯの結果は、わずか８９．３％ｗ.ｂ.であったが、乾燥ベースでは、サンプルは単離物である可能性が高かった。ＨＰＬＣによる、最終生成物に対する非タンパク質不純物の濃度は、わずか１．１％であった。したがって、サンプルに存在する非タンパク質種の大部分は、２８０ｎｍでは吸光しない。塩が、これらの化合物であった可能性が最も高い。水を用いたさらなるダイアフィルトレーションを使用して、この塩を除去し、最終生成物のタンパク質含量を改善することができる。
【０１８２】
【表２２】
【０１８３】
試験１〜７の結果は、キャノーラ油糧種子粗粉に対して実施した二重抽出手順によって、７Ｓタンパク質に富み、２Ｓタンパク質に富んだストリームが生じたことを示している。
【０１８４】
実施例３
この実施例は、実施例２の二重抽出手順の一連の試験を記載するものであり、ここでは、複数回水抽出を塩抽出の前に実施した。
【０１８５】
この一連の試験結果をここに記載する。種子粗粉の水抽出は、向流抽出機を使用して工業的に実施されることに留意されたい。このようなプロセスでは、多数回に相当する個々の洗浄に粗粉を曝す。
【０１８６】
試験１
キャノーラ種子粗粉（回分Ｂ）１５ｇを、６０℃で５分間、水（１５０ｍｌ）を用いて抽出した。水を６５℃に予熱し、次いで２２０ｒｐｍで動作させたオービタルシェーカーを使用して、粗粉と混合した。抽出物を、１０，０００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。その抽出物をデカントして湿潤粗粉を回収し、秤量し、溜まった水の体積を計算した。次いで、体積を１５０ｍｌに戻すための６５℃の十分な水を、使用済み粗粉に添加し、上記のように抽出を繰り返した。このプロセスを繰り返して、４回の水抽出を実施した。次いで、５回目の抽出を、室温にて０．５ＭのＮａＣｌで実施した。十分な塩水を添加して体積を１５０ｍｌに戻し、次いで、サンプルを室温で３０分間、２２０ｒｐｍで振とうすることによって抽出を実施した。表２３は、各抽出に添加した水または塩水の体積を示す。凝集ペレットは、第２および第３の抽出後に遠心分離にかけたときには得られなかったことに留意されたい。したがって、サンプルをデカントするときに粗粉を喪失しないよう、より多くの溶媒を保持した。理論上、最大体積の使用済みの水が除去され、新しい水で置き換えられるならば、より多くの汚染物質を抽出することができるはずである。
【０１８７】
【表２３】
【０１８８】
抽出サンプルのｐＨ、導電率、およびブリックスを測定し、次いで孔径０．４５μｍのシリンジフィルターでサンプルを濾過し、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について試験した。
【０１８９】
連続的水抽出によって、相当な量のタンパク質および不純物を除去した（表２４）。この試験で生成した塩抽出物は、実施例２に報告した単回の水抽出試験で生成した塩抽出物よりも、かなり清浄であった。これらの試験では、塩抽出物は、ＨＰＬＣによって約７０％の非タンパク質ピーク面積を含むことが判明した。しかし、１回の水抽出後に塩抽出を用い、共に炭素処理を伴った試験から得られた塩抽出物は、現試験よりも、Ａ３３０（０．２９）、Ａ３９０（０．１０）、およびＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積％（２．３４％）がかなり少なかった。これらの差異は、複数回水抽出では、所望の生成物の色を得るのに十分清浄な塩抽出物を生成することができないことを示唆している。
【０１９０】
【表２４】
【０１９１】
温水を用いて、２Ｓタンパク質よりも容易に７Ｓタンパク質を抽出した（表２５）。予想通り、塩抽出物は２Ｓタンパク質に富んでいた。抽出した全２Ｓタンパク質の約３分の１は、７Ｓ／１２Ｓタンパク質の大部分および不純物を含んだ低純度の水ストリームに入ったと推測される。できるだけ多くの２Ｓタンパク質を、高純度ストリームに保持することが望ましい。水相と共に２Ｓタンパク質の喪失（低質な生成物として回収）および実際には多重抽出スキーム全体の値に対する許容限は、塩水ストリームから生じる２Ｓタンパク質の質および値に依存する。
【０１９２】
【表２５】
【０１９３】
試験２
キャノーラ種子粗粉（回分Ｂ）１５０ｇを、６０℃で５分間、水（１５００ｍｌ）で抽出した。水を６５℃に予熱し、次いでオーバーヘッド型撹拌機を使用して、粗粉と混合した。抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離した。その抽出物をデカントして湿潤粗粉を回収し、秤量し、溜まった水の体積を計算した。次いで、体積を１５００ｍｌに戻すための６５℃の十分な水を使用済み粗粉に添加し、上記のように抽出を繰り返した。４回の水抽出を実施するまで、このプロセスを繰り返した。次いで、５回目の抽出を、室温にて０．２ＭのＮａＣｌで実施した。ダイアフィルトレーションによって塩を除去しなければならず、５回のダイアフィルトレーション体積の処理に許容された時間しかなかったので、試験１よりも低濃度の塩を選択した。十分な０．２ＭのＮａＣｌを添加して体積を１５００ｍｌに戻し、次いで、サンプルを室温で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて混合することによって抽出を実施した。表２６は、各抽出に添加した水または塩水の体積を示す。
【０１９４】
【表２６】
【０１９５】
塩抽出物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって使用済み粗粉から分離し、次いで３番のフィルターパッドで濾過した。次いで、浄化した塩抽出物を、平行に連結させた２つの１０，０００ＭＷＣＯのＶｉｖａｆｌｏｗ ＨＹ膜ユニットを使用して処理した。抽出物を濃縮し、次いで逆浸透（ＲＯ）精製水５体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによって沈殿物が生じ、それを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーション保持液を、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を沈殿させ、それを８０００ｇの遠心分離に１５分間かけることによって除去した。次いで、遠心分離液を冷凍乾燥し、「Ｃ２００Ｈ」と示した。
【０１９６】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を０．１ＭのＮａＣｌ（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを８０００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な塩水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０１９７】
この実験の水抽出は、試験１と比較して、大体同じ量のタンパク質、色、および不純物を除去したように見えた（表２７）。塩抽出物の質は、わずかに異なっているように見え、この試験の抽出で見出されたタンパク質、遊離フェノール成分、不純物、および可視色は少なかった。水抽出に関する分析データがかなり類似していたように見えたことから、塩抽出における差異は、異なる塩濃度による可能性が高かった。
【０１９８】
【表２７】
【０１９９】
この試験の水抽出物のタンパク質プロファイル（表２８）は、試験１と類似していたが、塩抽出物は、高い割合の２Ｓタンパク質を有しているように見えた。このことは、この試験においてより少ない塩を使用したことと、高い塩分が、７Ｓタンパク質の抽出よりも２Ｓタンパク質の抽出に有利に働くと思われていたことから、多少驚きであった。
【０２００】
【表２８】
【０２０１】
塩抽出物を膜処理することによって、それがさらに精製され、そのダイアフィルトレーション保持液のＨＰＬＣ非タンパク質ピーク面積％がわずか２．３％であることが判明した。これは、単回の水抽出試験に一般に見られたものよりも低い（実施例２参照）。
【０２０２】
この試験で生成した「Ｃ２００Ｈ」の乾き色を、表２９に示す。この色は、同じ粗粉を用いた他の二重抽出試験で見られたものに非常に類似している。粉末状炭素を二重抽出と併用することによって、明度がほぼ９０であり、この試験の生成物よりも赤色味および黄色味が少ない「Ｃ２００Ｈ」が生成した。
【０２０３】
【表２９】
【０２０４】
試験２で生成した「Ｃ２００Ｈ」の濡れ色は、吸着剤なしの他の二重抽出試験（６０℃の水）で見られたものとやはり同じであり、吸収剤を伴って生成したサンプルよりも明らかに濃かった。
【０２０５】
これらの試験結果は、実施例２の結果と比較すると、塩抽出前に粗粉を複数回水抽出することによって不純物をさらに除去したが（吸収剤なし）、最終生成物の質には大きな影響を与えなかったように見えたことを示している。
【０２０６】
実施例４
この実施例は、限外濾過保持液からの単離２Ｓタンパク質生成物の調製を例示するものである。
【０２０７】
キャノーラ粗粉４０ｋｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液４００Ｌに周囲温度で添加し、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得る。残留キャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を、遠心分離および濾過によって浄化して、１．８７重量％のタンパク質含量を有する濾過タンパク質溶液１３９Ｌを生成した。
【０２０８】
タンパク質抽出液の一定分量１３９Ｌを、３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＶＤＦ膜で濃縮することによって、体積を８．９Ｌに低減した。次いで、濃縮タンパク質溶液の一定分量５Ｌを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液２４．８Ｌを用いて、１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＥＳ膜でダイアフィルトレーションした。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を、６０℃で１０分間低温殺菌した。
【０２０９】
ダイアフィルトレーションし、低温殺菌した限外濾過（ＵＦ１）保持液のサンプルを得た。この保持液のタンパク質含量は、１８．３０ｗｔ％であった。ＵＦ１保持液に存在する高い割合の７Ｓと組み合わせた高いタンパク質濃度によって、加熱の際に、沈殿だけではなくゲル化が生じるはずであると考えられた。その結果、熱処理の前に、保持液１００ｍｌを１００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌと混合することによって、サンプルのタンパク質濃度を調節した。
【０２１０】
希釈したサンプルを８５℃で１０分間熱処理し、次いで冷水で３０℃未満に急冷した。次いでサンプルを、１０２００ｇの遠心分離に１５分間かけた。遠心分離後に、ペレットといくらかの浮遊沈殿粒子とを得た。上澄み液をデカントし、孔径２５μｍの濾紙を介して濾過することによって、浮遊粒子を除去した。回収した上澄み液（１２０ｍｌ）を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ１００００ＨＹ膜ユニットで濃縮し、次いで逆浸透精製水１０体積でダイアフィルトレーションして塩を除去した。次いで、ダイアフィルトレーションした保持液を冷凍乾燥し、Ｃ５００Ｈと示した。
【０２１１】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、オーブン乾燥法を使用して含水量について分析し、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．７ｇ）を水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを７８００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な水を添加して、タンパク質含量を５ｗｔ％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０２１２】
ＵＰ１保持液の熱処理によって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半をサンプルから除去することに成功した。最初の保持液中の７Ｓおよび１２ＳによるＨＰＬＣタンパク質ピーク面積の割合は、それぞれ６１．４％および２％であった。これが、熱処理サンプルの上澄み液では、７Ｓが４．４％に、１２Ｓが０．４％に低減した。得られた最終生成物は、９０．３２％のタンパク質含量（湿潤ベース）および４．８２％の含水量を有する単離物であり、結果として９４．８９％のタンパク質含量（乾燥ベース）であった。生成物の乾き色は、これまでＣ２００Ｈ生成物に見られたものより少し濃かった（表３０）。
【０２１３】
【表３０】
【０２１４】
生成物の濡れ色は、かなり良好であったが、Ｃ２００Ｈで見られたものよりもおそらくわずかに濃かった。サンプルは、わずかに濁っていた。
【０２１５】
本明細書に記載の結果から分かるように、ＵＦ１保持液から、本質的には２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を生成することに成功した。
【０２１６】
実施例５
この実施例は、キャノーラ油糧種子粗粉から形成されたキャノーラタンパク質抽出液の熱処理を例示するものである。
【０２１７】
キャノーラ油糧種子粗粉（ＳＢ０６２）１５０ｇを、１５００ｍｌの０．１ＭのＮａＣｌで、室温で３０分間、オーバーヘッド型撹拌機を用いて抽出した。その混合物を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけて、使用済み粗粉から抽出物を分離した。収集した抽出物を、ダブルボイラー中、８５℃で１０分間熱処理して、７Ｓ／１２Ｓを沈殿させた。熱処理後、サンプルを冷水浴に浸水することによって、３０℃未満に急冷した。沈殿した固体を、７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって除去し、次いでその遠心分離液を、３番のフィルターパッドで洗練させた。次いで、清浄化した遠心分離液を、Ｖｉｖａｆｌｏｗ１００００ＨＹ限外濾過ユニットで濃縮し、逆浸透精製水１０体積でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーション水を添加することによっていくらか沈殿物が形成され、サンプルを７１００ｇの遠心分離に１０分間かけることによって、その沈殿物を再濃縮前に除去した。ダイアフィルトレーションした保持液を冷凍乾燥して、最終生成物を形成した。
【０２１８】
様々なサンプルを、遊離フェノール成分（Ａ３３０）、可視色（Ａ３９０）、タンパク質含量（ＬＥＣＯ）、およびタンパク質プロファイル（ＳＥＣ ＨＰＬＣ）について分析した。最終生成物を、オーブン乾燥法を使用して含水量について分析し、Ｍｉｎｏｌｔａ測色機を使用して乾き色について分析し、また溶液を、濡れ色分析のために調製した。ボルテックス混合機を使用して、タンパク質粉末（０．８ｇ）を水（１０ｍｌ）と混合した。次いで、サンプルを７８００ｇの遠心分離に１０分間かけ、上澄み液のタンパク質含量をＬＥＣＯによって決定した。上澄み液の一定分量（８ｍｌ）を小型ビーカーに移し、十分な水を添加して、タンパク質含量を５％に調節した。次いで、そのサンプルを撮影した。
【０２１９】
抽出物の熱処理によって、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の大半をサンプルから除去することに成功した。最初の抽出物中の７Ｓおよび１２ＳによるＨＰＬＣタンパク質ピーク面積の割合は、それぞれ６３．８％および３．８％であった。これが、熱処理サンプルの遠心分離液では、７Ｓが２．０％に、１２Ｓが０．８％に低減した。抽出物の加熱によって形成された沈殿物は、遠心分離によって容易に除去された。得られた最終生成物は、８４．１５％のタンパク質含量（湿潤ベース）および７．２２％の含水量を有する単離物であり、結果として９０．７０％のタンパク質含量（乾燥ベース）であった。生成物の乾き色は、単離した２Ｓ生成物の大部分にこれまで見られたものよりわずかに濃く、赤かった（表３１）。
【０２２０】
【表３１】
【０２２１】
開示の概要
本開示を概説すると、本質的には２Ｓキャノーラタンパク質からなり、実質的には７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含まないキャノーラタンパク質単離物の調製手順が提供される。本発明の範囲においては改変が可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて高温で抽出して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して前記キャノーラ油糧種子粗粉から２Ｓタンパク質を優先的に抽出し、主に２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質抽出液を得る、
前記キャノーラタンパク質抽出液を、残留キャノーラ油糧種子粗粉から分離する、
前記キャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．０５のイオン強度および約５〜約６．８のｐＨを有し、前記高温が約７０℃〜約１００℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５．３〜約６．２のｐＨを有し、前記高温が約８０℃〜約９５℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャノーラタンパク質抽出液が、
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャノーラタンパク質抽出液が、
約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、水を用いて抽出して、２Ｓタンパク質に優先して７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質および可溶性不純物を優先的に抽出し、第１のキャノーラタンパク質抽出液を形成する、
前記第１のキャノーラタンパク質抽出液を、前記残留油糧種子粗粉から分離する、
前記残留油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、残留油糧種子粗粉由来の２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を溶解し、第２のキャノーラタンパク質抽出液を形成する、
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項７】
前記キャノーラ油糧種子粗粉を、水を用いて約１０℃〜約７０℃の温度で抽出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が約５５℃〜約６５℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を、第１のキャノーラタンパク質抽出液からキャノーラタンパク質単離物として回収する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記水での抽出を、約２〜約２５回の水抽出、好ましくは約２〜約４回の抽出で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて、約５℃〜約６５℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃の温度で、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度で抽出する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩水溶液が、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャノーラタンパク質抽出液を濃縮して少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度にし、得られた濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を乾燥することによって、前記キャノーラタンパク質単離物を前記第２の抽出水溶液から回収する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液が、
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液が、
約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得る、
前記キャノーラタンパク質溶液を、残留油糧種子粗粉から分離する、
前記キャノーラタンパク質溶液を濃縮して、濃縮タンパク質溶液を保持液として準備する、
前記濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して前記濃縮キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成する、
前記熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、前記沈殿したタンパク質から分離する、
前記熱処理した分離キャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項１７】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得る、
前記キャノーラタンパク質溶液を、残留油糧種子粗粉から分離する、
濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して前記キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成する、
前記熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、前記沈殿したタンパク質から分離する、
前記熱処理した分離キャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項１８】
前記熱処理ステップを、約７０℃〜約１００℃の温度で約２〜約３０分間行って、前記７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記熱処理ステップを、約７５℃〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間行って、前記７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約７５ｗｔ％低減する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．０５のイオン強度および約５〜約６．８のｐＨを有する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５．３〜約６．２のｐＨを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
主に２Ｓタンパク質からなる前記キャノーラタンパク質単離物が、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項２３】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなる前記キャノーラタンパク質単離物を回収する前記回収ステップを、前記キャノーラタンパク質抽出液を少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度に濃縮し、得られた濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を乾燥することによって行う、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャノーラタンパク質抽出水溶液を、約１００ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮キャノーラタンパク質水性抽出物を、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション媒体を使用してダイアフィルトレーションにかける、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ダイアフィルトレーションを、約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション媒体を使用して実施する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間に、酸化防止剤が存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を、前記乾燥ステップの前に熱処理ステップにかけて、前記溶液中の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合を、溶液から沈殿させることによって少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記熱処理を、約７０℃〜約１００℃の温度で約２〜約３０分間行い、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記熱処理を、約７５℃〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間行い、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約７５ｗｔ％低減する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物が、存在する前記キャノーラタンパク質のうち２Ｓタンパク質を少なくとも約９０ｗｔ％含む、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物が、存在する前記キャノーラタンパク質のうち２Ｓタンパク質を少なくとも約９５ｗｔ％含む、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項１】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて高温で抽出して、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質に優先して前記キャノーラ油糧種子粗粉から２Ｓタンパク質を優先的に抽出し、主に２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質抽出液を得る、
前記キャノーラタンパク質抽出液を、残留キャノーラ油糧種子粗粉から分離する、
前記キャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．０５のイオン強度および約５〜約６．８のｐＨを有し、前記高温が約７０℃〜約１００℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５．３〜約６．２のｐＨを有し、前記高温が約８０℃〜約９５℃である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キャノーラタンパク質抽出液が、
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キャノーラタンパク質抽出液が、
約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、水を用いて抽出して、２Ｓタンパク質に優先して７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質および可溶性不純物を優先的に抽出し、第１のキャノーラタンパク質抽出液を形成する、
前記第１のキャノーラタンパク質抽出液を、前記残留油糧種子粗粉から分離する、
前記残留油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、残留油糧種子粗粉由来の２Ｓ、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を溶解し、第２のキャノーラタンパク質抽出液を形成する、
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項７】
前記キャノーラ油糧種子粗粉を、水を用いて約１０℃〜約７０℃の温度で抽出する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記温度が約５５℃〜約６５℃である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を、第１のキャノーラタンパク質抽出液からキャノーラタンパク質単離物として回収する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記水での抽出を、約２〜約２５回の水抽出、好ましくは約２〜約４回の抽出で行う、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて、約５℃〜約６５℃、好ましくは約２０℃〜約３０℃の温度で、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度で抽出する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩水溶液が、約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記キャノーラタンパク質抽出液を濃縮して少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度にし、得られた濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を乾燥することによって、前記キャノーラタンパク質単離物を前記第２の抽出水溶液から回収する、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液が、
約８０〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１０ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約１０ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のキャノーラタンパク質抽出液が、
約８５〜約１００ｗｔ％の２Ｓタンパク質、
０〜約１５ｗｔ％の７Ｓタンパク質、および
０〜約５ｗｔ％の１２Ｓタンパク質
であるキャノーラタンパク質プロファイルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得る、
前記キャノーラタンパク質溶液を、残留油糧種子粗粉から分離する、
前記キャノーラタンパク質溶液を濃縮して、濃縮タンパク質溶液を保持液として準備する、
前記濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して前記濃縮キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成する、
前記熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、前記沈殿したタンパク質から分離する、
前記熱処理した分離キャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項１７】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物の生成方法であって、
キャノーラ油糧種子粗粉を、塩水溶液を用いて抽出して、前記キャノーラ油糧種子粗粉からキャノーラタンパク質を抽出し、キャノーラタンパク質溶液を得る、
前記キャノーラタンパク質溶液を、残留油糧種子粗粉から分離する、
濃縮タンパク質溶液を熱処理して、２Ｓキャノーラタンパク質に優先して前記キャノーラタンパク質溶液から７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に沈殿させ、主に２Ｓキャノーラタンパク質を含む熱処理したキャノーラタンパク質溶液を形成する、
前記熱処理したキャノーラタンパク質溶液を、前記沈殿したタンパク質から分離する、
前記熱処理した分離キャノーラタンパク質溶液から、少なくとも約９０ｗｔ％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、主に２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を回収する、
ことを含む方法。
【請求項１８】
前記熱処理ステップを、約７０℃〜約１００℃の温度で約２〜約３０分間行って、前記７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記熱処理ステップを、約７５℃〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間行って、前記７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約７５ｗｔ％低減する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．０５のイオン強度および約５〜約６．８のｐＨを有する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩水溶液が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５．３〜約６．２のｐＨを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
主に２Ｓタンパク質からなる前記キャノーラタンパク質単離物が、少なくとも約１００ｗｔ％のタンパク質含量を有する、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項２３】
主に２Ｓキャノーラタンパク質からなる前記キャノーラタンパク質単離物を回収する前記回収ステップを、前記キャノーラタンパク質抽出液を少なくとも約５０ｇ／Ｌの濃度に濃縮し、得られた濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を乾燥することによって行う、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記キャノーラタンパク質抽出水溶液を、約１００ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮キャノーラタンパク質水性抽出物を、約２〜約２０体積のダイアフィルトレーション媒体を使用してダイアフィルトレーションにかける、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ダイアフィルトレーションを、約５〜約１０体積のダイアフィルトレーション媒体を使用して実施する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間に、酸化防止剤が存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記濃縮キャノーラタンパク質抽出水溶液を、前記乾燥ステップの前に熱処理ステップにかけて、前記溶液中の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質の割合を、溶液から沈殿させることによって少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記熱処理を、約７０℃〜約１００℃の温度で約２〜約３０分間行い、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約５０ｗｔ％低減する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記熱処理を、約７５℃〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間行い、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質含量を少なくとも約７５ｗｔ％低減する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物が、存在する前記キャノーラタンパク質のうち２Ｓタンパク質を少なくとも約９０ｗｔ％含む、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記主に２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物が、存在する前記キャノーラタンパク質のうち２Ｓタンパク質を少なくとも約９５ｗｔ％含む、請求項１、６、１６、または１７に記載の方法。
【公表番号】特表２００８−５４６４２５（Ｐ２００８−５４６４２５Ａ）
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１９７７７（Ｐ２００８−５１９７７７）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１０８４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３０４４
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月２５日（２００８．１２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１０８４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／００３０４４
【国際公開日】平成１９年１月１１日（２００７．１．１１）
【出願人】（５０３４０３８６９）バーコン ニュートラサイエンス （エムビー） コーポレイション (25)
【氏名又は名称原語表記】ＢＵＲＣＯＮ ＮＵＴＲＡＳＣＩＥＮＣＥ （ＭＢ） ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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