クラステリンのペプチドリガンド及びその使用
分子イメージング、又はクラステリンが上方制御されている癌などの病状の診断に有用なペプチドが開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
基礎研究における分子イメージングは、新しい技術ではないが、その使用は、分子生物学の技術の出現及び様々なゲノムシークエンシングプロジェクトの成果と共に重要な成長を示している。この技術は、神経学的疾患、心血管疾患及び癌などの疾患の診断における適用に潜在可能性を有することから、将来的に臨床ケアに対して著しく影響を及ぼし得るものである。
【０００３】
生物における標的を特異的に探し出すプローブ又は分子イメージング剤の開発は、この研究分野において非常に重要な基礎の１つである。ゲノム及びプロテオミクスの研究は、多くの新しい潜在的な標的を既に明らかにしてきた。これらの新しい標的に対するイメージング剤は、疾患の進行におけるそれらの役割の理解の一助となるだけでなく、新しい治療を生み出し、評価する一助にもなろう。プローブは一般に、プローブを標的分子上にホーミングすることができる標的化部分、及びプローブの検出を可能にするイメージング部分を含む。
【０００４】
理想的には、分子イメージング剤は、インビボで検出可能にするための十分な濃度及び保持時間にわたってその標的上にホーミングできるように、適切な親和性、特異性及び代謝安定性を有するべきである。また理想的には、分子イメージング剤は、循環において相対的に短い半減期を有し、非常に低い非特異的結合を示すべきである。多くの種類のイメージング部分、例えば放射標識、フルオロフォア及び近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素が、分子イメージングに使用されている。標的化部分には、モノクローナル抗体、リポタンパク質及びポリペプチドが含まれる。これら及び他の種類の標的化部分は、光プローブを生成するために利用されており、この光プローブは、様々な種類の腫瘍の光学イメージングのために多くの研究者によって使用されているものである（Ｗａｇｎｉｅｒｅｓら、１９９８年；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、２００７年；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、２００７年；Ｐｅｎｇら、２００８年）。ＮＩＲプローブの１つの利点は、高浸透、組織による吸収の低さ、及び散乱といったそれらの特性に起因する、より深い組織を画像化するそれらの能力である。
【０００５】
ゲノムバイオテクノロジー及び創薬研究後、より多目的な標的化部分の新しい世代として、新しい標的にホーミングするペプチド系分子の開発に高い関心が寄せられている。ペプチド系標的化部分は、一般に、それらの標的に対してモノクローナル抗体よりも低い親和性を示す。しかし、抗体は拡散しにくく、標的への到達性が低いことに関連する制限を有するが、ペプチドは、寸法の小ささ（良好な組織浸透を意味する）、合成の容易さ、及び循環からのクリアランス速度の速さ（良好なコントラストをもたらすことができる）などの利点を有する。現在まで、有効なペプチド系標的化部分の同定は、主に血管標的と相互作用するペプチドに焦点が当てられていた。
【０００６】
分子イメージング分野の中でも特に興味深いのは、癌の診断及び治療への応答の評価のためのツールとしてのその潜在可能性である。癌腫は、最も一般的なヒトの悪性腫瘍であり、上皮細胞から生じる。上皮癌の進行は、細胞と細胞の接触の崩壊、並びに遊走性（間葉系様の）表現型の獲得によって開始する。この現象は上皮間葉移行（ＥＭＴ）と呼ばれ、後期の腫瘍進行及び転移における重大な事象とみなされる（Ｇｕｐｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２００６年；Ｂｅｒｘら、２００７年）。ＥＭＴにおける非常に重要な役割の担い手の１つが分泌タンパク質ＴＧＦ−βであり、これは上皮起源の腫瘍細胞に対するその増殖抑制作用が主因となり、最初は腫瘍増殖を抑制するが、次いで後期では腫瘍細胞の進行及び転移を促進する（Ｍａｓｓａｇｕｅ、２００８年）。ＴＧＦ−βが腫瘍の進行を促進し得る１つの機構は、ＥＭＴの誘発によるものである。
【０００７】
腫瘍の形成及び進行に関連する分子機構を標的とする改善されたイメージングプローブの開発は、癌の診断及び進行の評価に有益となり、場合によっては治療の開発及び評価に有益となり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【０００９】
本発明は、
ａ）配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）、
ｂ）配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（配列番号２）、及び
ｃ）配列ＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（配列番号３）、
又はそれと実質的に同一の配列を含むペプチドを対象とする。
【００１０】
本発明はまた、カーゴ分子と連結している上述のペプチドを提供する。
【００１１】
上述のペプチドは、分子イメージングに使用することができ、又はクラステリンが上方制御されている癌などの病状の診断若しくは治療において使用することができる。
【００１２】
本発明の新規のクラステリン結合性ペプチドは、クラステリンと特異的に相互作用し、固形腫瘍に選択的にホーミングすることが示されている。これらのペプチドは、それらの有利な結合特異性、親和性及び循環からのクリアランス速度により、分子イメージングのためのツールとして使用することができる。したがってこの種のペプチド系分子は、より多目的な標的化薬剤の次の世代となり得る。
【００１３】
一態様では、本発明はまた、イメージング部分を含むカーゴ分子に上述のペプチドを連結させるステップと、カーゴ分子に連結したペプチドを対象に投与するステップと、対象におけるイメージング部分を検出するステップとを含む、腫瘍のイメージング方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の説明から明らかとなろう。詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、本発明の範囲に含まれる様々な変更及び改変が本発明の教示に照らして当業者に明らかとなる通り、単に例示的なものである。
【００１５】
本発明のこれら及び他の特徴を以下に、添付の図を参照することによって実施例により記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＴＧＦ−β及び組換えヒトクラステリン（ｒｈＣＬＵ）が上皮間葉移行（ＥＭＴ）を誘発することを示す図である。ＥＭＴは、細胞の伸長を特徴とする（他の特徴の中でも特に）。
【図２】同定されたペプチドとクラステリンとの結合を示す核磁気共鳴飽和移動差（ＮＭＲ−ＳＴＤ）スペクトルを示す図である。上のパネルはＰ３３７６／クラステリン複合体であり、中間のパネルはＰ３３７５／クラステリン複合体であり、下のパネルはＰ３３７８／クラステリン複合体及びＰ３３７８単独のオーバーレイである。クラステリンなし（実線の矢印）のＳＴＤスペクトルと、クラステリンの存在下（破線の矢印）のＳＴＤスペクトルとの差異は、結合を示す。
【図３】Ａ−Ｃは、ペプチド（Ｐ３３７８）とｒｈＣＬＵとの結合を示す、Ｐ３３７８−クラステリン複合体（実線の矢印）及びＰ３３７８単独（破線の矢印）のＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルを示す図である。図３Ａ及び３Ｂは、図２（下のパネル）及び図３Ｃに示したＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルの拡大図である。
【図４】対照ペプチド（Ｐ３３７８Ｒ）がｒｈＣＬＵに結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図５】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７８との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図６】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７５との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図７】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７６との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図８】応答（ＲＵ）の欠如によって明らかになる通り、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体が固定化Ｐ３３７８（図８Ａ）又はＰ３３７５（図８Ｂ）に結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図９】線形スキャッチャードプロット（右パネル）によって明らかになる通り、上皮増殖因子受容体が固定化Ｐ３３７５（図９Ａ）又はＰ３３７８（図９Ｂ）に結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図１０】クラステリンを、Ｐ３３７８の無作為化型（Ｐ３３７８Ｒ；図１０Ａ）、Ｐ３３７５の無作為化型（Ｐ３３７５Ｒ；図１０Ｂ）及びＰ３３７６の無作為化型（Ｐ３３７６Ｒ；図１０Ｃ）配列を有する固定化ペプチド上にフローさせて得たＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図１１】Ｐ３３７８及びモノクローナル抗体１６Ｂ５についてクラステリン上の結合部位を比較するオーバーレイプロットの図である。図１１Ａはクラステリンと固定化Ｐ３３７８との結合を示し、図１１Ｂはクラステリン：１６Ｂ５の混合物と固定化Ｐ３３７８との結合を示す。
【図１２】Ａは、４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞が、ＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した場合に、未処理細胞（ＣＴＬ）と比較して非常にわずかな間葉系様の形態変化を受けることを示す図である。Ｂは、ＴＧＦ−βなし（ＣＴＬ）又はＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した細胞から得られた順化培地中のクラステリンの量についてのウエスタンブロット分析を示す図である。培地対照を「Ｍｅｄ」と表示する。Ｃは、創傷治癒アッセイで示される通り、４Ｔ１細胞の内因性運動がＴＧＦ−βの存在下で増大することを示す図である。上のパネルは、低拡大率における細胞の単層を示し、下のパネルは高拡大率における細胞の単層を示し、線は創傷の元の幅を示す。
【図１３】ペプチド注入の１４〜１３０分後の、共にアレクサ（Ａｌｅｘａ）６８０フルオロフォアで標識化したクラステリン結合性ペプチドＰ３３７８（図１３Ａ）及びスクランブル対照ペプチドＰ３３７８Ｒ（図１３Ｂ）の４Ｔ１腫瘍担持マウスにおける分布に従う時間依存性の蛍光強度マップの代表的な画像である。点線の輪は、腫瘍部位におけるＰ３３７８−アレクサ６８０ペプチドを示し、実線の輪は、腎臓におけるＰ３３７８Ｒペプチドを示す。
【図１４】ペプチド注入の１１〜１１０分後（Ｐ３３７８−ＤＬ６８０）又は２０〜１２０分後（Ｐ３３７８Ｒ−ＤＬ８００）の、ディライト（ＤｙＬｉｇｈｔ）６８０（Ｐ３３７８Ｒ−ＤＬ６８０）フルオロフォアで標識化したクラステリン結合性ペプチドＰ３３７８（図１４Ａ）又はディライト（商標）８００（Ｐ３３７８ＲＤＬ８００）フルオロフォアで標識化したスクランブル対照ペプチドＰ３３７８Ｒ（図１４Ｂ）の４Ｔ１腫瘍担持マウスにおける分布に従う時間依存性の蛍光強度マップの代表的な画像である。
【図１５】Ｐ３３７８及びＰ３３７８Ｒペプチドに曝露した４Ｔ１腫瘍担持マウスにおいて得られた腫瘍測定値から算出した腫瘍体積（ｐｉ／６（長さ×幅×高さ））の増大を示すグラフである。
【図１６】マウス乳房４Ｔ１腫瘍細胞がクラステリンを発現し、分泌する図である。Ａは、２Ｄで培養した場合の４Ｔ１細胞の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｇｙ）の図である（拡大率：４０×）。Ｂは、ホールセル溶菌液（ＷＣＬ）及び順化培地（ＣＭ）のウエスタンブロットが、ＷＣＬ中未処理の（ｐＣＬＵ）クラステリン及び処理され分泌された（ｓＣＬＵ）クラステリンの存在を示す図であり、処理され分泌されたｓＣＬＵのみを、ＣＭに見出すことができる。Ｃは、免疫蛍光顕微鏡が、ＤＡＰＩ染色核と比較して、単離した４Ｔ１腫瘍において分泌されたＣＬＵの存在を示す図である（拡大率１０×）。
【図１７】腫瘍（ＡＵＴ）及び非腫瘍を含有する反対側（ＡＵＮ）の関心領域（ＲＯＩ）に対する平均蛍光強度（ＡＵ）をプロットするグラフが、注入の約６０分後までは両方のペプチドが類似の腫瘍蓄積を示し、その後Ｐ３３７８Ｒペプチドは腫瘍から除去され、Ｐ３３７８ペプチドは保持されることを示す図である。
【図１８】Ｐ３３７８−ＤＬ６８０の蓄積が、過剰の非標識Ｐ３３７８によって遮断され得るが、Ｐ３３７８Ｒでは遮断されないことを示す図である。Ａは、注入の１５分後に測定したＰ３３７８−ＤＬ６８０の腫瘍特異的な蓄積が（２５ｎモル、左パネル）、過剰の非標識Ｐ３３７８との同時注入では遮断されるが（中間のパネル）、Ｐ３３７８Ｒペプチドとの同時注入では遮断されない（右パネル）ことを示す図である。Ｂでは、腫瘍部位におけるＰ３３７８−ＤＬ６８０の相対濃度の測定（白色矢印で示した）によって、この濃度値が、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０を単独で注入したマウス（左パネル）と比較して、過剰の非標識Ｐ３３７８の存在下では約３〜４分の１となり（中間のパネル）、過剰の非標識Ｐ３３７８Ｒのみがわずかな作用を有する（右パネル）ことが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【００１８】
クラステリンのｍＲＮＡは、ＢＲＩ−ＪＭ０１マウス乳腺細胞が形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βに曝露されると上方制御され、その結果クラステリンを分泌することが示されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。クラステリンはさらに、ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞のＴＧＦ−β誘発性ＥＭＴにおいて極めて重要な役割に関与するとされており（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋら、投稿済み）、そのＥＭＴ促進作用の原因となるクラステリン内のエピトープが同定されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。他の報告によれば、クラステリンは、腫瘍発生を促進するさらなる重要な機能、例えば抗アポトーシス活性を担うことが示されている（Ｌａｕら、２００６年；Ｍｏｕｒｒａら、２００７年；Ｚｈａｎｇら、２００６年；Ｗａｔａｒｉら、２００８年及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９７年）。
【００１９】
本発明は、クラステリン糖タンパク質に特異的に結合するペプチドを対象とする。具体的には、本発明は、
ａ）本明細書ではＰ３３７８と呼ばれる配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）、
ｂ）本明細書ではＰ３３７５と呼ばれる配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（配列番号２）、及び
ｃ）本明細書ではＰ３３７６と呼ばれる配列ＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（配列番号３）、
を含むペプチドを対象とする。
【００２０】
本発明はまた、ペプチドＰ３３７８、Ｐ３３７５及びＰ３３７６の配列に実質的に類似の配列を有するペプチドを包含する。実質的に同一のペプチドは、１つ又は複数の保存アミノ酸変異を含み得る。参照ペプチドに対する１つ又は複数の保存アミノ酸変異は、その参照ペプチドと比較して、生理的、化学的又は機能的特性の実質的な変化なしに変異ペプチドをもたらし得ることが当技術分野で公知であり、かかる場合、参照ペプチド及び変異ペプチドは「実質的に同一の」ポリペプチドとみなされ得る。保存アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むことができ、保存アミノ酸の置換とは、本明細書では、アミノ酸残基で、類似の化学特性（例えば、大きさ、電荷又は極性）を有するもう１つのアミノ酸残基を置換することと定義される。
【００２１】
非限定的な例では、保存変異はアミノ酸置換であり得る。かかる保存アミノ酸置換では、塩基性、中性、疎水性又は酸性アミノ酸で、同じグループの別のものを置換することができる。用語「塩基性アミノ酸」とは、ｐＫ値が７を超える側鎖を有する親水性アミノ酸を意味し、このアミノ酸は生理的ｐＨにおいて一般に正電荷である。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリシン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。用語「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」ともいう）は、生理的ｐＨでは無電荷であるが、２つの原子によって共有される電子対がそれらの原子の一方によってより密接して保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する、親水性のアミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」ともいう）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４年）の標準化された疎水性の統一基準によれば、ゼロを超える疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」とは、ｐＫ値が７未満の側鎖を有する親水性アミノ酸を指し、このアミノ酸は生理的ｐＨにおいて一般に負電荷である。酸性アミノ酸には、グルタミン酸塩（Ｇｌｕ又はＥ）及びアスパラギン酸塩（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。
【００２２】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用され、２つの配列が、残基位置と残基位置との間で最大限に一致するように整列している場合に同一となる残基の百分率を算出することによって決定される。任意の公知の方法を使用して、配列相同性を算出することができ、例えば、配列相同性の算出にはコンピューターソフトウェアが利用可能である。限定するものではないが、配列相同性は、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ若しくはＦＡＳＴＡ−Ｎなどのソフトウェア、又は当技術分野で公知の任意の他の適切なソフトウェアによって算出することができる。本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも７５％同一であってよい。別の例では、実質的に同一の配列は、本明細書に記載の配列と、アミノ酸レベルで少なくとも７５、８０、８５、９０、９５又は１００％同一であってよい。
【００２３】
本発明のＰ３３７８、Ｐ３３７５及びＰ３３７６ペプチドは、全長の組換えヒトクラステリンに対してファージディスプレイしたペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得た。核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの研究によって、ペプチドが特異的な方法でクラステリンと結合することを確認した。
【００２４】
本発明はまた、カーゴ分子に連結した本明細書に記載のクラステリン特異的ペプチドを包含する。カーゴ分子は、当技術分野で任意の適切な分子であってよく、クラステリンが上方制御されている癌腫又は他の病状の診断又は治療に有用となり得る。限定するものではないが、例えばカーゴ分子は、組織において対象となる細胞の同定及び限局化に有用な酵素、分子イメージングに使用されるイメージング部分、放射性同位体であってよく、又は疾患状態の組織の生存率若しくは腫瘍細胞の増殖能を低減するのに有用な薬物、抗原、アポトーシス誘発物質若しくは放射性同位体などの細胞傷害性薬剤であってよい。
【００２５】
一実施形態では、カーゴ分子はイメージング部分であってよい。分子イメージング部分は、任意の適切な分子であってよい。非限定的な例では、イメージング部分は、放射標識、フルオロフォア、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素又は磁気ナノ粒子であってよい。さらに非限定的な例では、イメージング部分は、アレクサ６８０、ディライト６８０若しくはディライト８００、Ｃｙ５．５色素、又は当技術分野で公知の任意の他のフルオロフォアであってよい。
【００２６】
カーゴ分子は、当技術分野で公知の任意の方法によってペプチドに連結することができる。限定するものではないが、例えばカーゴ分子は、共有結合又はイオン性相互作用によってペプチドに連結することができる。連結は、化学的架橋反応によって、又は細菌、酵母若しくは哺乳動物の細胞に基づく系などの任意のペプチド発現系と組み合わせた組換えＤＮＡ方法論を使用する融合によって達成され得る。カーゴ分子に本発明のペプチドを連結させる方法は、当業者に周知である。
【００２７】
上述のペプチドは、
本明細書に記載の光学イメージング；
１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａなどの一般的な同位体（臨床的には１８Ｆが最も利用される）でペプチドを標識化する陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；
特異的な適用に依存して９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌなどの放射性トレーサーを使用する単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）（限定するものではないが、例えば１３３Ｘｅガスは、肺機能評価のための吸入の診断研究に有用であることが示されている）；
ペプチドを、例えばそれに限定されるものではないが炭素で被覆した鉄−コバルトナノ粒子と結合させ、それにより腫瘍検出のためのＭＲＩの感受性を増大する磁気共鳴画像（ＭＲＩ）（この種類のナノ粒子は、近赤外光を吸収し発熱することもでき、これにより腫瘍のイメージングが可能になるだけでなく、腫瘍細胞を熱で死滅させることもできる。最適な注入用量及び投与方法（静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ））は、一般に実験によって決定される）
を含むいくつかの分子イメージング技術において使用することができる。
【００２８】
本明細書に記載のペプチドは、クラステリンが過剰発現する癌及び他の病状の診断、治療評価又は治療に使用することができる。クラステリンが癌腫のＥＭＴに関与する場合（図１）、本発明のクラステリン結合性ペプチドは、分子イメージング技術によって癌腫の進行を検出するために使用できる。実際、生存マウスに対するリアルタイムのイメージングによって、近赤外（ＮＩＲ）プローブで蛍光標識化した場合の、インビボで腫瘍にホーミングし、腫瘍をイメージングするＰ３３７８ペプチドの能力を実証した（図１２及び１３）。これにより、腫瘍をインビボで限局化、可視化及び定量化することができ、切除に最適な生検部位及び腫瘍境界に関する情報を提供することもできる。
【００２９】
本発明の新規のクラステリン結合性ペプチドは、クラステリンに特異的に結合し、固形腫瘍に選択的にホーミングすることが示されている。それらの結合特異性、結合親和性の低さ（モノクローナル抗体と比較して）、及び循環からのクリアランス速度の速さ（モノクローナル抗体と比較して）により、これらのペプチドは、それらがイメージング研究において良好なコントラストをもたらす限り、分子イメージングのための有用なツールとして作用することができる。
【実施例】
【００３０】
本発明を、以下の実施例でさらに例示する。しかしこれらの例は単に例示目的であり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するために使用されるべきでないことを理解されたい。
【００３１】
実施例１：ファージディスプレイによるクラステリン結合性ペプチドの同定
【００３２】
ヒトクラステリンに結合するペプチドを、ファージディスプレイ技術によって同定した。
【００３３】
ファージパニング、ＳＰＲ、ＮＭＲに使用する精製組換えヒトクラステリン（ｒｈ−クラステリン）調製物を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年に記載の一般的な発現系）において生成した。
【００３４】
無作為の１２アミノ酸ペプチドをディスプレイする市販のＰｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイライブラリーキットを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州べバリー）から購入した。マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）（商標）ウェル（デンマーク、Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ１００μＬ中ｒｈ−クラステリン１０μｇを用いて終夜４℃で被覆し、０．５％ＢＳＡで１時間ブロックした。
【００３５】
パニング手順を、他書に記載の通り（Ｓｕら、２００４年）本質的に室温で実施した。各パニングラウンドの後、２０のファージクローンを無作為に選択し、配列した。
【００３６】
精製したｒｈ−クラステリンに対してファージライブラリーを２ラウンド、パニングすることによって、Ｐ３３７８と指定されるアミノ酸配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）を有する独特のペプチドを含有する単一ファージクローンがかなり濃縮した（分析したプラークの最大３５％）。
【００３７】
３ラウンド目のパニングによって、ほぼ例外なくＰ３３７８をディスプレイするファージ粒子が回復した。したがって、ｒｈ−クラステリンに対して親和性を有するもう１つのペプチド配列ファミリーの同定は困難であった。ｒｈ−クラステリンと相互作用する他のペプチドリガンドを同定するために、１ラウンド目の選択後に得られたＰｈＤ−１２ファージのサブライブラリーを、競合するＰ３３７８の存在下（１ｍＭ）で、２回の連続パニングサイクルにかけた。これらのパニングラウンドによって、ｒｈ−クラステリンと結合する可能性があるより多くのペプチド配列が得られた。さらなる分析のために、発生頻度を基にして２つの追加の配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（Ｐ３３７５）（配列番号２）及びＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（Ｐ３３７６）（配列番号３）を選択した。Ｐ３３７５及びＰ３３７８の両方が配列ＹＷＳＱ（配列番号４）を含有することは、注目に値する。
【００３８】
実施例２：ペプチドＰ３３７５、３３７６及び３３７８の合成
【００３９】
実施例１で同定した３つのペプチド配列を、ＣＯＯＨ末端における伸長を伴う標準のＦｍｏｃ化学を使用して合成し、すなわちこれらのペプチド配列をＳＧＳＧＣ配列（配列番号５）によって伸長して、安定なチオエーテル結合を介してＳＰＲバイオセンサー表面又はＮＩＲ色素に結合するためのリンカーを提供した。
【００４０】
非標識の合成ペプチドを、標準のＦｍｏｃ化学を使用して合成した。ペプチドを、ＨＰＬＣを使用することによって、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した水−アセトニトリル直線勾配０〜６０％（１．０％／分、流速５．０ｍｌ／分）を使用して１０×２５０ｍｍのＶｙｄａｃ（商標）−Ｃ１８逆相カラムで精製した。最終生成物を凍結乾燥し、すべてのペプチドについて、分析ＨＰＬＣによって、０．１％ＴＦＡ中勾配０〜６０％（１％／分、流速１．０ｍｌ／分）のアセトニトリルを使用して４．６×２５０ｍｍのＶｙｄａｃ−Ｃ１８逆相カラムで純度≧９８％になったことを確認した。溶出プロファイルは、２７８ｎｍにおける吸光度によってモニターした。精製したすべてのペプチドの識別を、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって検証した。ペプチド濃度を、予測吸光係数を使用して分光光度的に決定した。
【００４１】
実施例３：ＳＴＤ−ＮＭＲを使用するペプチドとクラステリンとの相互作用の特徴付け
【００４２】
実施例１のペプチドとクラステリンとの直接結合を確認するために、実施例２の合成ペプチドとクラステリンとの相互作用を、核磁気共鳴飽和移動差（ＳＴＤ−ＮＭＲ；Ｍａｙｅｒ＆Ｍｅｙｅｒ、２００１年）を使用して試験した。
【００４３】
０．１５ｍＭペプチドを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解することによって、ＮＭＲサンプルを調製した。５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．０２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中ｒｈ−クラステリン（約１ｍｇ／ｍｌ）を、約１：３０の比のタンパク質：ペプチドに添加した。
【００４４】
すべてのＮＭＲ実験を、２９８Ｋにおいて、３つの軸勾配の５ｍｍの三重共鳴プローブを備えたブルカーアドバンス（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ）８００（商標）ＮＭＲ分光計で実施した。飽和移動差（ＳＴＤ）スペクトルを、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ版のＳＴＤパルスシーケンス（３５）を使用して、緩和遅延に適用した３秒の選択的飽和パルス及び２０ミリ秒のスピンロックパルスで、電界強度１２．２５ｋＨｚを用いて記録した。飽和パルスは、４９ミリ秒のガウス形選択的パルス及び１ミリ秒のインターパルス遅延のパルス列を使用して実施した。各ガウス形パルスは、１％切り捨てで１０００ポイントを有し、電界強度７５．９Ｈｚで印加された。ＳＴＤスペクトルは、スペクトル幅１６０２５．６４Ｈｚ及びデータ点３２Ｋで記録した。タイムドメインシグナルを、遊離サンプル及び複合サンプルについてそれぞれ１０２４及び４０９６のスキャンで積算した。ＮＭＲデータを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｗｉｎｎｍｒ ２．６を使用して処理した。フーリエ変換及び多項式ベースライン補正の前に、指数重み関数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）７Ｈｚを適用した。
【００４５】
ペプチドＰ３３７８及びｒｈ−クラステリンのＮＭＲシグナルが大幅に重複し、したがってペプチドの共鳴を妨げずに先の飽和パルスをｒｈ−クラステリン共鳴に排他的に適用することは不可能であった。Ｐ３３７８−ｒｈ−クラステリン複合体における結合相互作用を同定するために、メチル共鳴（０．９１２ｐｐｍ）におけるオン共鳴飽和パルス及び−７．７９９ｐｐｍ（参照したＨ２Ｏを４．７００ｐｐｍとする）におけるオフ共鳴照射を適用することによって、新しい実験スキームを実施した。このスキームでは、オン共鳴飽和パルスによってメチル共鳴周辺のＮＭＲシグナルがクエンチされたが、オフ共鳴照射は、任意の共鳴なしにスペクトル領域に適用されたので、全ＮＭＲスペクトルに対して作用しなかった。オフ共鳴照射されたスペクトルからオン共鳴照射されたスペクトルを減算することによって、ＳＴＤスペクトルを得た。差スペクトルの結果として、ペプチドとタンパク質の間に結合相互作用がなかったにもかかわらず、オン共鳴の周波数周辺の強い「残りの」ピークが、複合体のＳＴＤスペクトルにおいて観測された。メチル周波数におけるオン共鳴照射は、タンパク質シグナルだけでなく、オン共鳴に近いペプチドシグナルも飽和する。これは、ペプチド内の飽和移動作用に由来する追加のＳＴＤシグナルをもたらし得る。このペプチド内作用を評価するために、遊離ペプチドサンプルについても同じ実験準備を行った。結合の情報は、複合体のＳＴＤスペクトルを、遊離ペプチドのＳＴＤスペクトルと比較することによって抽出することができる。
【００４６】
図２（下のパネル）は、準化学量論的な量のクラステリンの存在下及びそれなしのＰ３３７８のＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルを示す（タンパク質：ペプチド約１：３０）。ｒｈ−クラステリンの存在下における芳香族側鎖領域の鋭いＮＭＲピークの出現（約７ｐｐｍ）は、タンパク質からペプチドへの飽和移動を示し、タンパク質とペプチドの間の直接的な相互作用を示すものであった。Ｐ３３７８と同様に、合成Ｐ３３７５及びＰ３３７６の結合をＳＴＤ−ＮＭＲによって確認した（図２、上及び中間のパネル）。ｒｈＣＬＵとのＰ３３７８の特異的な結合を実証するＰ３３７８−クラステリン複合体（実線の矢印）及びＰ３３７８単独（破線の矢印）のＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルを、やはり図３Ａ〜Ｃに示す。
【００４７】
実施例４−ＳＰＲバイオセンサー分析を使用するペプチドとクラステリンとの相互作用の特徴付け
【００４８】
実施例１のペプチドとクラステリンとの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してさらに研究した。
【００４９】
ペプチドを、マレイミドの結合方法によって研究用ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＣＭ５センサーチップ（研究用）及びＥＤＣは、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から購入した。このチオールの結合によって、センサーチップ表面上の反応性マレイミド基とペプチドのチオール基との安定なチオエーテル結合が得られる。ヘテロ二官能性試薬であるＳＭＣＣ−ヒドラジド（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１カルボキシルヒドラジド；純度９９．５％；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入した）を使用して、反応性マレイミド基をセンサー表面に導入した。流速５μＬ／分において２５℃で固定化を実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）−２０、ｐＨ７．４）の連続フローを、センサー表面上に維持した。センサー表面上のカルボキシル化デキストランマトリックスを、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．００中１．２ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１７２μＬ及び４０％ＤＭＦ中１７．８ｍＭのＳＭＣＣ−ヒドラジド２８μＬを含有する新しく混合した溶液５０μＬを注入することによって活性化した。ＳＭＣＣ：ＥＤＣの比は２．５：１であった。１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）にペプチド（３０〜１００μｇ／ｍｌ）を注入することによって、ペプチド結合表面を生成した。活性化表面上に固定化するペプチドの量を、ペプチド溶液との接触時間を変えることによって調節し、約４００〜５００ＲＵ又はペプチド４００〜５００ｐｇ／ｍｍ２とした。固定化手順は、１Ｍ塩化ナトリウム及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中５０ｍＭシステイン５０μＬを注入して、過剰の活性なマレイミド基をクエンチすることによって完了した。
【００５０】
タンパク質とペプチドとの相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器（スウェーデン、ウプサラ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を使用して追跡した。センサー表面全体にわたる流速２０μＬ／分のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン−２００）ｐＨ７．４の連続フローの下、２５℃ですべての結合実験を実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中異なる濃度のｒｈ−クラステリンを、ペプチド誘導体化センサーチップ上に注入した。注入後最大３００秒間、解離をモニターした。５ｍＭのＮａＯＨを含有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝溶液を１５秒間注入することによって、表面を完全に再生させた。各相互作用の動態は、流速（２０〜１００μＬ／分）を変えることによってごくわずかに影響を受けたが、このことは質量輸送の寄与が最小限であったことを示す（データは示さず）。各分析物の注入について、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０（スウェーデン、ウプサラ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用して、ペプチドを含有するフローセルから非修飾デキストラン表面を含有する対照フローセルからの参照応答を減算した。
【００５１】
得られたセンサーグラムを、単純１：１ラングミュア結合モデルに対する実験データのグローバルフィッティングによる運動速度の決定に使用した。センサーグラムの解離相と会合相の両方に関するフィットの統計的分析は、低いＸ２値（＜２）を示した。結合研究からの親和性データ（ＫＤ）を、定常状態におけるＲＵとしての応答（Ｒｅｑ）対クラステリンの濃度（Ｃ）をプロットし、これらの曲線を単一部位結合モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）、Ｒｅｑ＝Ｃ＊×Ｒｍａｘ／（Ｃ＋ＫＤ）（式中、Ｒｍａｘは飽和におけるＲＵの値であり、Ｒｅｑは、所与の各Ｃにおいて観測されたＲＵの光学的変化である）にフィットさせることによって得た。
【００５２】
図４は、ｒｈＣＬＵ（１１ｎＭ〜１４μＭ）と固定化無作為化配列Ｐ３３７８Ｒ（３３７８ＲＵ）との相互作用を評価した対照実験からの、ＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットである。この対照ペプチドは、Ｐ３３７８と同じアミノ酸含量を有するが、無作為化配列（ＰＹＬＨＱＳＰＨＷＫＰＳＳＧＳＧＣ−配列番号６）を有する。ｒｈＣＬＵとこの対照ペプチドとの結合の欠如は、スキャッチャードプロット（挿入図；ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットした平衡における応答）の線形性質によって明らかである。これは、無作為化ペプチドがｒｈＣＬＵに特異的に結合せず、結果的に親Ｐ３３７８ペプチドとクラステリンとの相互作用がペプチド配列依存性であることを実証するものである。
【００５３】
図５は、ｒｈＣＬＵ（５．５ｎＭ〜１．４μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７８（５００ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。データのグローバルフィット（実線）は、その結合が、ｋｏｎ＝（１．７２±０．０３）×１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝０．００５２±０．０００２ｓ−１及びＫｄ＝０．３０μＭの単純１対１ラングミュア結合モデルによって説明し得ることを示している。平衡における応答を、ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットし、実験データを、Ｋｄが０．３０±０．０６μＭの１対１結合モデルを用いてフィットさせた。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５４】
図６は、ｒｈＣＬＵ（２ｎＭ〜１．１μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７５（１２００ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。データのグローバルフィット（実線）は、その結合が、ｋｏｎ＝（１．１２±０．０３）×１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝０．００６±０．０００２ｓ−１及びＫｄ＝０．５４μＭの単純１対１ラングミュア結合モデルによって説明し得ることを示している。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５５】
図７は、ｒｈＣＬＵ（０ｎＭ〜１．４μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７６（１５０ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。平衡における応答を、ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットし、曲線は、Ｋｄが０．３４±０．１０μＭの１対１結合モデルに対するデータ点のフィットを表す。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５６】
つまり、図５、６及び７は、ファージディスプレイスクリーニングによって同定した３つすべてのクラステリン結合性ペプチドが、ｒｈ−クラステリンに対してマイクロモル以下の見掛けの親和性を示すことを実証している。
【００５７】
実施例５−ＳＰＲバイオセンサー分析及びクラステリンに無関係のタンパク質を使用するクラステリンとペプチドとの相互作用の特異性の研究の特徴付け
【００５８】
クラステリンとペプチドとの相互作用の特異性を、ＳＰＲバイオセンサー分析及びクラステリンに無関係のタンパク質を使用して研究した。センサーチップ上のペプチド及び他のタンパク質の固定化、並びにＳＰＲ実験を、実施例４に記載の通り実施した。
【００５９】
図８は、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメイン（３８ｎＭ〜４．５μＭ）と、固定化Ｐ３３７８（５００ＲＵ）（図８Ａ）又はＰ３３７５（１２００ＲＵ）（図８Ｂ）との相互作用を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムを表す。どちらの場合も著しいシグナルは観測されなかったが、このことはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体がこれらのペプチドと相互作用しないことを示す。
【００６０】
図９は、上皮増殖因子外部ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＤ）（７０ｎＭ〜５．６３μＭ）と、固定化Ｐ３３７５（１２００ＲＵ；図９Ａ）又はＰ３３７８（５００ＲＵ；図９Ｂ）との結合を示すオーバーレイプロットを示す。スキャッチャードプロットの線形性質（右パネル）は、これらのペプチドがＥＧＦＲ−ＥＤに特異的に結合しないことを示す。
【００６１】
つまり、図８及び９の結果は、Ｐ３３７８及びＰ３３７５が、クラステリンとは無関係なタンパク質とは特異的に相互作用しないことを示しており、このことは、ｒｈ−クラステリンとのそれらの結合が特異的であることを示す。
【００６２】
実施例６−クラステリンとペプチドとの相互作用の配列依存の特徴付け
【００６３】
クラステリンとペプチドとの相互作用の配列依存を、ＳＰＲバイオセンサー分析及びスクランブル配列を有するペプチドを使用して研究した。センサーチップ上のペプチドの固定化及びＳＰＲ実験を、実施例４に記載の通り実施した。
【００６４】
図１０は、ｒｈ−クラステリン（１１ｎＭ〜１．４μＭ）と、本発明のクラステリン結合性ペプチドの固定化無作為化型であるＰ３３７８Ｒ（ＰＹＬＨＱＳＰＨＷＫＰＳＳＧＳＧＣ−配列番号６）、Ｐ３３７５Ｒ（ＬＳＬＹＨＴＮＴＱＦＷＱＳＧＳＧＣ−配列番号７）及びＰ３３７６Ｒ（ＡＷＨＴＬＡＳＴＳＬＡＰＳＧＳＧＣ−配列番号８）との相互作用を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムを表す。曲線のスキャッチャードプロット（右パネル）によって明らかになる通り、クラステリンがＰ３３７５Ｒ（１３８５０ＲＵ）及びＰ３３７６Ｒ（３３００ＲＵ）と結合したことは（それぞれ図１０ｂ及びｃ）、Ｐ３３７５及びＰ３３７６とクラステリンとの結合が、ペプチド配列に特異的でないことを実証するものである。Ｐ３３７８Ｒ（３３７８ＲＵ）のスキャッチャードプロット（図１０ａ、右パネル）の線形性質によって、Ｐ３３７８とクラステリンとの相互作用の配列依存性の性質が確認される（図４も参照）。
【００６５】
実施例７−ｍＡｂ１６Ｂ５との比較におけるＰ３３７８クラステリンのエピトープの特徴付け
【００６６】
ＥＭＴを遮断する抗クラステリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１６Ｂ５及びＰ３３７８が、クラステリン上に重複又は独立の結合部位を有するかどうかという問題を、ＳＰＲバイオセンサー分析を使用して研究した。クラステリンと相互作用するいくつかのｍＡｂが単離されており、１６Ｂ５を含むこれらのｍＡｂのうち５つが、クラステリンのＥＭＴ促進作用にとって重要なクラステリン上のエピトープと相互作用する。したがって、これらの抗クラステリンｍＡｂは、細胞培養におけるＥＭＴ及び動物モデルにおける腫瘍転移を阻害する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。クラステリン結合性ペプチドは、インビボでクラステリン発現腫瘍（原発腫瘍及び転移）を非侵襲的にイメージングするために使用できるので、抗クラステリンｍＡｂによる処理が、クラステリン標的とのペプチド結合を遮断し、したがって腫瘍をイメージングするペプチドの能力を損なうおそれがあるかどうかを決定することが重要である。センサーチップ上のペプチドの固定化及びＳＰＲ実験を、本質的に実施例４に記載の通り実施した。
【００６７】
図１１は、１６Ｂ５ｍＡｂなし、及び１６Ｂ５ｍＡｂの存在下でのｒｈ−クラステリンと固定化Ｐ３３７８ペプチドとの結合を示すセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。固定化Ｐ３３７８ペプチドよりも高い濃度のｒｈ−クラステリン（０〜１．２μＭ）の注入によって、０．５２μＭのＫＤが得られた（図１１ａ）。ｒｈ−クラステリンを、ｍＡｂ１６Ｂ５を用いてプレインキュベートし（比１：１．７）、次いで同じペプチド表面上にフローさせると、１．１μＭのＫＤが測定された（図１１ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ１６Ｂ５の存在が、固定化Ｐ３３７８とのｒｈ−クラステリンの結合親和性に著しく影響を及ぼさなかったことを示すが、このことはｍＡｂ１６Ｂ５及びＰ３３７８ペプチドが、ｒｈ−クラステリン上の非重複部位に結合することを示すものである。したがってＰ３３７８は、１６Ｂ５ｍＡｂによって処理した腫瘍との相互作用及びそのイメージングを遮断されないはずである。
【００６８】
実施例８−マウス４Ｔ１乳房腫瘍細胞におけるクラステリン分泌
【００６９】
動物モデルにおける腫瘍のイメージングを実証するためには、標的、この場合クラステリンを発現する腫瘍細胞株（動物に埋め込まれることになる）を選択することが必須である。したがって、マウス４Ｔ１乳房腫瘍細胞がクラステリンを分泌し、分泌されたクラステリンのレベルが間葉系の表現型と相関することを実証した。
【００７０】
マウス４Ｔ１腫瘍細胞は、クラステリンの分泌型を生成することが示されており、この分泌は、ＴＧＦ−βによる処理によって増大する（図１２）。マウス乳房４Ｔ１腫瘍細胞をＡＴＣＣから得、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞は、ＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖させると、未処理細胞（ＣＴＬ）と比較して非常にわずかな間葉系様の形態変化を受ける（図１２Ａ）。ＴＧＦ−βなし（ＣＴＬ）又はＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した細胞から得た馴化培地５０μＬのウエスタンブロット分析は、細胞によるクラステリン分泌がＴＧＦ−βによって増大することを示す（図１２Ｂ）。培地対照（Ｍｅｄ）におけるクラステリンの欠如は、未処理４Ｔ１細胞の馴化培地で検出されたクラステリンが、成長培地自体（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））に由来しないことを示す。これらの結果は、クラステリンが４Ｔ１細胞によって分泌され、分泌されたクラステリンの量がＴＧＦ−βによって増大すること、すなわちクラステリンの発現レベルがより間葉系の表現型と相関することを示すものである。４Ｔ１細胞の運動性は、創傷治癒アッセイにおいて示される通り、ＴＧＦ−βの存在によって増大するが（図１２Ｃ）、このことは、増大したクラステリンと間葉系の表現型との相関を確認するものである。Ｌｅｉｔｚ Ｌａｂｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡に搭載したＮｉｋｏｎ ＣｏｏｌＰｉｘ ９９５デジタルカメラで写真を撮った。
【００７１】
実施例９−標識化クラステリン結合性ペプチド（Ｐ３３７８）を使用する４Ｔ１腫瘍担持動物のイメージング
【００７２】
分子イメージングの準備では、ペプチドＰ３３７８（及びその無作為化対照ペプチド、Ｐ３３７８Ｒ）を様々なプローブで標識化した。アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）６８０のＣ２−マレイミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（オンタリオ州バーリントン）から購入した。アレクサフルオル６８０、ディライト６８０又はディライト８００によるＰ３３７８及びＰ３３７８Ｒペプチドの標識化を、製造者の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に従って実施した。３：１（色素：ペプチド）のモル比の７．０ｍＭのアレクサフルオル６８０のＣ２マレイミド（ＤＭＳＯに溶解）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．３ｍＭのペプチドを用いて４℃で２４時間にわたって暗室でインキュベートすることによって、アレクサフルオル６８０−ペプチドコンジュゲートを生成した。粗コンジュゲートを、分析的ＨＰＬＣを使用することによって、Ｖｙｄａｃ−Ｃ１８逆相カラム、４．６×２５０ｍｍで０．１％ＴＦＡ中勾配０〜６０％（１％／分、流速１．０ｍｌ／分）のアセトニトリルを使用して精製した。溶出プロファイルを２７８ｎｍにおける吸光度によってモニターした。精製したすべての標識化ペプチドの識別を、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって検証した。ピークを含有するペプチド−アレクサ６８０コンジュゲートを収集し、凍結乾燥させ、濃度２５０μＭ（予測吸光係数を使用して分光光度的に決定した）で滅菌生理食塩水に再溶解し、使用まで暗室において−８０℃で保存した。
【００７３】
モデル系として、４Ｔ１マウス乳癌細胞株の細胞を使用して、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腫瘍を発生させた。４Ｔ１細胞は、著しい量のクラステリンを発現及び分泌し（図１６及びＬｅｎｆｅｒｉｎｋ ２００９年）、雌性ＢＬＡＢ／ｃ動物に注入した場合に同系インビボモデル系を提供することが示されている。すべての動物における手順は、機関の指針と共に、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ（ケベック州モントリオール）によって承認のプロトコル０８−ＭＡＲ−Ｉ−１２に従って服薬遵守で実施した。６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから得た。乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルスを含まない高濃度フェノールレッドフリーマトリゲルを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）から購入した。無菌マトリゲルと生理食塩水の１：１溶液５０μｌ、又は４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞（５×１０６個の細胞）を含有する同じ溶液を、動物の右後大腿部に皮下注入した。Ｃｌｉｐｐｅｒｓ及びＮａｉｒを使用して、マトリゲル及び腫瘍細胞注入の前に、動物の注入部位並びに腰背部及び左大腿部から毛髪を除去した。腫瘍を測定して直径約０．５〜０．８ｃｍになったら（６〜８日）、腫瘍担持マウスをインビボでイメージングした。
【００７４】
免疫蛍光顕微鏡のために、ＯＣＴで包埋した４Ｔ１腫瘍を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９００クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、カナダ、オンタリオ州リッチモンドヒル）を使用して厚さ８μｍの切片にし、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州オタワ）上に置き、使用まで−８０℃で維持した。凍結切片を風乾させ、１０％緩衝ホルマリン中で５分間固定し、Ｕｌｔｒａ Ｖ Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）を用いて、室温で５分間にわたって非特異的にブロックした。次いでスライドを、クラステリン抗体Ｍ−１８（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルス）を用いて終夜４℃でインキュベートし、次いで二次アレクサフルオル５５５標識化ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州バーリントン）で室温において３０分間インキュベートした。核を、ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて室温で１分間対比染色した。水を使用した最後のステップを除き、すべての洗浄ステップでＰＢＳを使用した。最後に、プロロングゴールドアンチフェード（ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州バーリントン）を使用してスライドをマウントした。ＱＩｍａｇｉｎｇ（商標）Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒ ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、カナダ、ブリティッシュコロンビア州サリー）に接続したライツアリストプラン（Ｌｅｉｔｚ Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ）（商標）顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）を用いて蛍光を検出し、ＱＣａｐｔｕｒｅ（商標）ソフトウェア（Ｍｅｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国テキサス州ヒューストン）を使用して分析し、その後Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カナダ、オンタリオ州トロント）を用いて擬似色を付けた。
【００７５】
近赤外線の蛍光顕微鏡のために、インビボでの腫瘍標的化実験の完了後、動物にヘパリン処置した生理食塩水をかん流し、動物の脳を切開し、次いでドライアイスで凍結させた。マウスの脳組織を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（商標）凍結保存培地に包埋し、クリオスタット上で厚さ１０μｍの切片にし、次いでスーパーフロスト（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ）（商標）Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）上にマウントした。凍結した組織切片を、メタノール中、室温で１０分間固定した。スライドを０．２ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）ですすぎ、その後ＰＢＳ中５％ロバ血清を用いて０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）−Ｘ１００と共に室温で１時間インキュベートした。ブロッキング後、ヤギ抗マウスクラステリン一次抗体（１：１００）を用いてスライドを室温で１時間インキュベートし、その後アレクサ５６８標識化ロバ抗ヤギ二次抗体（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて室温で１時間インキュベートした。スライドを再度ＰＢＳで５回洗浄し、次いで過剰の液体を乾燥させ、Ｈｏｅｃｈｓｔを含有するＤＡＫＯ蛍光マウンティング培地（１：１０００）を使用してカバースリップをのせた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１倒立電動顕微鏡（Ｍａｒｋｈａｍ、カナダ、オンタリオ州）を使用して画像を取り込み、イメージプロ（ＩｍａｇｅＰｒｏ）（商標）６．２（Ｍａｒｋｈａｍ、カナダ、オンタリオ州）を使用して分析した。
【００７６】
動物を、以下の手順を使用してイメージングした。動物を、イソフルラン（Ｏ２中３％、２Ｌ／分）を使用して麻酔した。標識化ペプチドの注入の前に、動物を全身スキャンにかけて、バックグラウンド蛍光画像を得た。Ｐ３３７８−アレクサ６８０又はＰ３３７８Ｒ−アレクサ６８０を、２７ゲージの固定針を備えた０．５ｍｌインスリンシリンジを使用して、尾静脈を介して投与した（滅菌生理食塩水１００μＬ中２５ｎｍｏｌ）。直後に、動物をＡＲＴ ｅＸｐｌｏｒｅ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２イメージング系（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、モントリオール）の加熱した動物用プレート（３９℃）上に置いた。画素数当たりのレーザー出力及び計数時間を、それぞれ９．６μＷ及び０．５秒で最適化した。これらの値を、すべての実験中、一定に維持した。ラスタースキャン間隔を１．５ｍｍに設定し、各画像の取得中、一定に保持した。データを、時間的点広がり関数（ＴＰＳＦ）として記録し、蛍光強度及び蛍光寿命マップを作成した。すべての画像を、ＡＲＴオプティクスオプティビュー（Ｏｐｔｉｘ ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（商標）ソフトウェアを使用して分析した。体積データ及び３Ｄ画像を、ＡＲＴオプティビュー（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（商標）３Ｄ再構成ソフトウェアモジュールを使用して再構成した。すべての動物を、イメージング実験後に安楽死させた。
【００７７】
動物を、以下の３つの手法を使用してＡＲＴ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２小動物撮像装置でイメージングした。
ａ．マウスに、アレクサ６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド５ナノモル又はアレクサ６８０で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド５ナノモルのいずれかを、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。
ｂ．マウスに、アレクサ６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド２５ナノモル又はアレクサ６８０で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド２５ナノモルのいずれかを、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。
ｃ．マウスに、ディライト６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド２５ナノモル及びディライト８００色素で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド２５ナノモルの混合物を、ｉ．ｖ．（尾静脈）同時注入した。
【００７８】
最初の２つの手法（ａ、ｂ）では、クラステリン結合性ペプチド及び対照ペプチドを同じフルオロフォアで標識化したので、各ペプチドのホーミング能力を個々に、すなわち異なる時間及び／又は異なる動物においてモニターしなければならなかった。第３の手法（ｃ）におけるクラステリン結合性ペプチド及び対照ペプチドの差動的な標識化によって、同時注入が可能になり、同じマウスにおける同じ４Ｔ１腫瘍にホーミングするこれら２つのペプチドの能力をほぼ同時にモニターすることができた。最初の２つの手法で使用したアレクサ標識から、第３の手法で使用したディライト（商標）標識への切替えは、２つの異なるフルオロフォアを使用できるようにするために行われ、また、多くの適用においてディライト（商標）色素がアレクサフルオロフォアよりも高い蛍光強度及び光安定性を提示することが示されていることから行われた。
【００７９】
最初の実験（ａ、ｂ）では、ある日動物１匹にＰ３３７８−アレクサ６８０を注入した後、イメージングデータを注入の３時間後に収集した。ペプチド注入の２４時間後、この動物を再スキャンして（前日と同じパラメータを使用する）、Ｐ３３７８−アレクサ６８０がマウスから除去されたことを確認した。次いで、Ｐ３３７８Ｒ−アレクサ６８０スクランブルペプチドを注入し、前日と同じ測定を実施した。この設定を使用して、２つのペプチドの挙動を、異なる日の同じ動物における同じ腫瘍で比較した。
【００８０】
生理食塩水１００μＬ中標識化ペプチド５ナノモル又は２５ナノモルのいずれかを注入した。これは、それぞれ約３μＭ及び約１５μＭの最初の循環ペプチド濃度に相当するものであった。クラステリンは、血中に中程度豊富に存在する循環タンパク質である（１００μｇ／ｍｌ＝約１μＭ）。ペプチド５ナノモル又は２５ナノモルのいずれかを注入した場合、注入したペプチドの最初の濃度は循環クラステリンの濃度よりも高かったので、遊離循環ペプチド（クラステリン結合していない）は、どちらの場合も腫瘍にホーミングするのに利用可能なはずである。ＡＲＴ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２小動物撮像装置を使用して、両方のペプチド濃度における腫瘍内（並びに腎臓及び膀胱内）のＰ３３７８−アレクサ６８０及びＰ３３７８Ｒ−アレクサ６８０の両方の蓄積を観測した。
【００８１】
重要なことに、Ｐ３３７８−アレクサ６８０ペプチドは、Ｐ３３７８Ｒ−アレクサ６８０ペプチドよりも腫瘍部位からゆっくり除去されたが、このことは、Ｐ３３７８ペプチドがクラステリン結合に起因して、腫瘍部位に選択的に保持されたことを示している（図１３Ａ）。この作用は、「腫瘍抗原シンク（ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｉｎｋ）」作用を反映し得る腎臓におけるＰ３３７８Ｒスクランブルペプチドのより早い蓄積と相関し、すなわち腫瘍に保持されるＰ３３７８Ｒスクランブルペプチドが少ないので、多くのペプチドが循環に保持され、腎臓におけるクリアランスに利用可能となる（図１３Ｂ）。これらの結果は、Ｐ３３７８が４Ｔ１腫瘍細胞によって分泌されたクラステリンに対して特異性を有することを示している。
【００８２】
Ｐ３３７８ペプチドの腫瘍標的化能力の特異性に関するさらなる最終的なデータを得るために、第３の手法（ｃ）を使用して、Ｐ３３７８ペプチドをディライト６８０で標識化し、Ｐ３３７８Ｒペプチドをディライト８００フルオロフォアで標識化した。次いで、両方のペプチドの１：１混合物（各２５ナノモル）を、４Ｔ１腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．注入した（前述の通り）。さらに、これらの同じ動物に対して、４Ｔ１細胞を注入したビヒクル（マトリゲル／生理食塩水５０μＬ、１：１（ｖ／ｖ））も、左大腿部（ｓ．ｃ．）に注入した。これによって、同じマウスの腫瘍部位（右大腿部）及びビヒクル対照部位（左大腿部）において、両方のペプチドのホーミング挙動の実質的に同じ時間におけるモニターが可能となった。
【００８３】
６匹の動物を使用したこれらの実験結果から、先の実験（先のａ及びｂ）において得られた結果を確認した。図１４は、Ｐ３３７８ペプチドが、Ｐ３３７８Ｒペプチドと比較して腫瘍部位にかなり長く存在することを示すものであり、それによって腫瘍標的化に対するＰ３３７８ペプチドの特異性を確認する。この観測を、両方のペプチドについて経時的な腫瘍シグナル対バックグラウンド比を決定することによってさらに確認した（図１７）。そのために、同じ動物の腫瘍（ＡＵＴ）及び非腫瘍を含有する反対側（ＡＵＮ）の周りに描いた関心領域（ＲＯＩ）について平均蛍光強度（ＡＵ）を決定した。時間関数としてＡＵＴ／ＡＵＮ比をプロットすることによって、両方のペプチドが、最初は注入の約６０分後まで腫瘍部位において同じ速度で蓄積し、その後Ｐ３３７８Ｒペプチドは腫瘍から除去され、Ｐ３３７８ペプチドは腫瘍部位に保持されることが示される。
【００８４】
これらの実験過程中、Ｐ３３７８／Ｐ３３７８Ｒペプチド混合物を注入した３匹の動物の腫瘍は、経時的に増殖速度の低減を示す傾向があったが（図１５）、このことは、これらのペプチドが抗腫瘍作用を有し得ることを示すものであることにも気付いた。腫瘍細胞の注入の７日後まで、腫瘍の大きさを２次元で測定したことに留意されたい（長さ及び幅、実験を通して同じ式を使用できるように高さは１ｍｍに設定した）。
【００８５】
Ｐ３３７８−ＤＬ６８０プローブのインビボ標的化能力の特異性をさらに評価するために、過剰の非標識Ｐ３３７８ペプチドを使用してブロッキング実験を実施した。マウスに、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を単独で（ｎ＝１）、又は滅菌生理食塩水１００μＬ中、非標識Ｐ３３７８若しくはＰ３３７８Ｒペプチド５μモル（共にｎ＝２）と組み合せて投与した。対照群の動物には、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を、５μモルの非標識スクランブルＰ３３７８Ｒペプチドと共に、又はそれなしに投与し、実験動物には、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を、５μモルの非標識Ｐ３３７８ペプチドと組み合わせて注入した。図１８Ａ（注入の１５分後）に示す通り、非標識Ｐ３３７８ペプチドは、腫瘍へのＰ３３７８−ＤＬ６８０の取込みの遮断に成功したが、非標識スクランブルＰ３３７８Ｒは遮断しなかった。さらに、ゲート（ｇａｔｅｄ）ＮＩＲＦ寿命及びオプティビュー３Ｄ再構成モジュールを使用して、各マウスにおいて最高濃度のＰ３３７８−ＤＬ６８０を含有するＺ軸に沿った切片を選択し、その相対濃度を決定した。図１８Ｂは、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０プローブの相対濃度（図１８Ｂ、中間のパネル）が、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０を注入した動物（図１８Ｂ、左パネル）と比較して、過剰の非標識Ｐ３３７８ペプチドの存在下では約３〜４分の１となり、この濃度値が、過剰のスクランブルＰ３３７８Ｒペプチドの存在のみによってわずかに影響を受ける（図１８Ｂ、右パネル）ことを示す。
【００８６】
共焦点顕微鏡を使用して、注入の１５分間後に収集した４Ｔ１腫瘍及び様々な器官（肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、心臓、肺）におけるＰ３３７８−ＤＬ６８０プローブの分布を評価した。Ｐ３３７８−ＤＬ６８０（２５ｎモル）の注入の１５分後に動物から収集した４Ｔ１腫瘍及び器官の凍結切片（厚さ１０μｍ）は、４Ｔ１腫瘍における蛍光プローブの特異的な取込み及び蓄積を示すものであり、蛍光プローブはその標的ＣＬＵと共に局在している。Ｐ３３７８ペプチドは、ｓＣＬＵが存在したにもかかわらず他の器官では検出できなかったが、これによってＰ３３７８−ＤＬ６８０ペプチドが腫瘍によって選択的に取り込まれることが、顕微鏡的なレベルで確認される。核のＤＡＰＩ染色を使用して、組織形態を可視化した。
【００８７】
本明細書に記載の実施形態及び実施例は例示的なものであり、特許請求される本発明の範囲を制限することを企図しない。本発明者らは、代替、改変及び等価物を含む先の実施形態の変形形態が特許請求の範囲に包含されることを企図する。さらに、論じた組合せの特徴が本発明の解決に必要ないこともあり得る。
【００８８】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている２００９年４月１７日出願の米国特許仮出願第６１／２０２，９１０号の利益を主張するものである。
【００８９】
参考文献
本明細書に記載のすべての特許、特許出願及び出版物は、参照によって本明細書に組み込まれている。
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
基礎研究における分子イメージングは、新しい技術ではないが、その使用は、分子生物学の技術の出現及び様々なゲノムシークエンシングプロジェクトの成果と共に重要な成長を示している。この技術は、神経学的疾患、心血管疾患及び癌などの疾患の診断における適用に潜在可能性を有することから、将来的に臨床ケアに対して著しく影響を及ぼし得るものである。
【０００３】
生物における標的を特異的に探し出すプローブ又は分子イメージング剤の開発は、この研究分野において非常に重要な基礎の１つである。ゲノム及びプロテオミクスの研究は、多くの新しい潜在的な標的を既に明らかにしてきた。これらの新しい標的に対するイメージング剤は、疾患の進行におけるそれらの役割の理解の一助となるだけでなく、新しい治療を生み出し、評価する一助にもなろう。プローブは一般に、プローブを標的分子上にホーミングすることができる標的化部分、及びプローブの検出を可能にするイメージング部分を含む。
【０００４】
理想的には、分子イメージング剤は、インビボで検出可能にするための十分な濃度及び保持時間にわたってその標的上にホーミングできるように、適切な親和性、特異性及び代謝安定性を有するべきである。また理想的には、分子イメージング剤は、循環において相対的に短い半減期を有し、非常に低い非特異的結合を示すべきである。多くの種類のイメージング部分、例えば放射標識、フルオロフォア及び近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素が、分子イメージングに使用されている。標的化部分には、モノクローナル抗体、リポタンパク質及びポリペプチドが含まれる。これら及び他の種類の標的化部分は、光プローブを生成するために利用されており、この光プローブは、様々な種類の腫瘍の光学イメージングのために多くの研究者によって使用されているものである（Ｗａｇｎｉｅｒｅｓら、１９９８年；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、２００７年；ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、２００７年；Ｐｅｎｇら、２００８年）。ＮＩＲプローブの１つの利点は、高浸透、組織による吸収の低さ、及び散乱といったそれらの特性に起因する、より深い組織を画像化するそれらの能力である。
【０００５】
ゲノムバイオテクノロジー及び創薬研究後、より多目的な標的化部分の新しい世代として、新しい標的にホーミングするペプチド系分子の開発に高い関心が寄せられている。ペプチド系標的化部分は、一般に、それらの標的に対してモノクローナル抗体よりも低い親和性を示す。しかし、抗体は拡散しにくく、標的への到達性が低いことに関連する制限を有するが、ペプチドは、寸法の小ささ（良好な組織浸透を意味する）、合成の容易さ、及び循環からのクリアランス速度の速さ（良好なコントラストをもたらすことができる）などの利点を有する。現在まで、有効なペプチド系標的化部分の同定は、主に血管標的と相互作用するペプチドに焦点が当てられていた。
【０００６】
分子イメージング分野の中でも特に興味深いのは、癌の診断及び治療への応答の評価のためのツールとしてのその潜在可能性である。癌腫は、最も一般的なヒトの悪性腫瘍であり、上皮細胞から生じる。上皮癌の進行は、細胞と細胞の接触の崩壊、並びに遊走性（間葉系様の）表現型の獲得によって開始する。この現象は上皮間葉移行（ＥＭＴ）と呼ばれ、後期の腫瘍進行及び転移における重大な事象とみなされる（Ｇｕｐｔａ及びＭａｓｓａｇｕｅ、２００６年；Ｂｅｒｘら、２００７年）。ＥＭＴにおける非常に重要な役割の担い手の１つが分泌タンパク質ＴＧＦ−βであり、これは上皮起源の腫瘍細胞に対するその増殖抑制作用が主因となり、最初は腫瘍増殖を抑制するが、次いで後期では腫瘍細胞の進行及び転移を促進する（Ｍａｓｓａｇｕｅ、２００８年）。ＴＧＦ−βが腫瘍の進行を促進し得る１つの機構は、ＥＭＴの誘発によるものである。
【０００７】
腫瘍の形成及び進行に関連する分子機構を標的とする改善されたイメージングプローブの開発は、癌の診断及び進行の評価に有益となり、場合によっては治療の開発及び評価に有益となり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【０００９】
本発明は、
ａ）配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）、
ｂ）配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（配列番号２）、及び
ｃ）配列ＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（配列番号３）、
又はそれと実質的に同一の配列を含むペプチドを対象とする。
【００１０】
本発明はまた、カーゴ分子と連結している上述のペプチドを提供する。
【００１１】
上述のペプチドは、分子イメージングに使用することができ、又はクラステリンが上方制御されている癌などの病状の診断若しくは治療において使用することができる。
【００１２】
本発明の新規のクラステリン結合性ペプチドは、クラステリンと特異的に相互作用し、固形腫瘍に選択的にホーミングすることが示されている。これらのペプチドは、それらの有利な結合特異性、親和性及び循環からのクリアランス速度により、分子イメージングのためのツールとして使用することができる。したがってこの種のペプチド系分子は、より多目的な標的化薬剤の次の世代となり得る。
【００１３】
一態様では、本発明はまた、イメージング部分を含むカーゴ分子に上述のペプチドを連結させるステップと、カーゴ分子に連結したペプチドを対象に投与するステップと、対象におけるイメージング部分を検出するステップとを含む、腫瘍のイメージング方法を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の説明から明らかとなろう。詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、本発明の範囲に含まれる様々な変更及び改変が本発明の教示に照らして当業者に明らかとなる通り、単に例示的なものである。
【００１５】
本発明のこれら及び他の特徴を以下に、添付の図を参照することによって実施例により記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＴＧＦ−β及び組換えヒトクラステリン（ｒｈＣＬＵ）が上皮間葉移行（ＥＭＴ）を誘発することを示す図である。ＥＭＴは、細胞の伸長を特徴とする（他の特徴の中でも特に）。
【図２】同定されたペプチドとクラステリンとの結合を示す核磁気共鳴飽和移動差（ＮＭＲ−ＳＴＤ）スペクトルを示す図である。上のパネルはＰ３３７６／クラステリン複合体であり、中間のパネルはＰ３３７５／クラステリン複合体であり、下のパネルはＰ３３７８／クラステリン複合体及びＰ３３７８単独のオーバーレイである。クラステリンなし（実線の矢印）のＳＴＤスペクトルと、クラステリンの存在下（破線の矢印）のＳＴＤスペクトルとの差異は、結合を示す。
【図３】Ａ−Ｃは、ペプチド（Ｐ３３７８）とｒｈＣＬＵとの結合を示す、Ｐ３３７８−クラステリン複合体（実線の矢印）及びＰ３３７８単独（破線の矢印）のＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルを示す図である。図３Ａ及び３Ｂは、図２（下のパネル）及び図３Ｃに示したＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルの拡大図である。
【図４】対照ペプチド（Ｐ３３７８Ｒ）がｒｈＣＬＵに結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図５】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７８との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図６】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７５との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図７】ｒｈＣＬＵと固定化ペプチドＰ３３７６との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。スキャッチャードプロットを挿入図で示す。
【図８】応答（ＲＵ）の欠如によって明らかになる通り、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体が固定化Ｐ３３７８（図８Ａ）又はＰ３３７５（図８Ｂ）に結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図９】線形スキャッチャードプロット（右パネル）によって明らかになる通り、上皮増殖因子受容体が固定化Ｐ３３７５（図９Ａ）又はＰ３３７８（図９Ｂ）に結合しないことを示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図１０】クラステリンを、Ｐ３３７８の無作為化型（Ｐ３３７８Ｒ；図１０Ａ）、Ｐ３３７５の無作為化型（Ｐ３３７５Ｒ；図１０Ｂ）及びＰ３３７６の無作為化型（Ｐ３３７６Ｒ；図１０Ｃ）配列を有する固定化ペプチド上にフローさせて得たＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットの図である。
【図１１】Ｐ３３７８及びモノクローナル抗体１６Ｂ５についてクラステリン上の結合部位を比較するオーバーレイプロットの図である。図１１Ａはクラステリンと固定化Ｐ３３７８との結合を示し、図１１Ｂはクラステリン：１６Ｂ５の混合物と固定化Ｐ３３７８との結合を示す。
【図１２】Ａは、４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞が、ＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した場合に、未処理細胞（ＣＴＬ）と比較して非常にわずかな間葉系様の形態変化を受けることを示す図である。Ｂは、ＴＧＦ−βなし（ＣＴＬ）又はＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した細胞から得られた順化培地中のクラステリンの量についてのウエスタンブロット分析を示す図である。培地対照を「Ｍｅｄ」と表示する。Ｃは、創傷治癒アッセイで示される通り、４Ｔ１細胞の内因性運動がＴＧＦ−βの存在下で増大することを示す図である。上のパネルは、低拡大率における細胞の単層を示し、下のパネルは高拡大率における細胞の単層を示し、線は創傷の元の幅を示す。
【図１３】ペプチド注入の１４〜１３０分後の、共にアレクサ（Ａｌｅｘａ）６８０フルオロフォアで標識化したクラステリン結合性ペプチドＰ３３７８（図１３Ａ）及びスクランブル対照ペプチドＰ３３７８Ｒ（図１３Ｂ）の４Ｔ１腫瘍担持マウスにおける分布に従う時間依存性の蛍光強度マップの代表的な画像である。点線の輪は、腫瘍部位におけるＰ３３７８−アレクサ６８０ペプチドを示し、実線の輪は、腎臓におけるＰ３３７８Ｒペプチドを示す。
【図１４】ペプチド注入の１１〜１１０分後（Ｐ３３７８−ＤＬ６８０）又は２０〜１２０分後（Ｐ３３７８Ｒ−ＤＬ８００）の、ディライト（ＤｙＬｉｇｈｔ）６８０（Ｐ３３７８Ｒ−ＤＬ６８０）フルオロフォアで標識化したクラステリン結合性ペプチドＰ３３７８（図１４Ａ）又はディライト（商標）８００（Ｐ３３７８ＲＤＬ８００）フルオロフォアで標識化したスクランブル対照ペプチドＰ３３７８Ｒ（図１４Ｂ）の４Ｔ１腫瘍担持マウスにおける分布に従う時間依存性の蛍光強度マップの代表的な画像である。
【図１５】Ｐ３３７８及びＰ３３７８Ｒペプチドに曝露した４Ｔ１腫瘍担持マウスにおいて得られた腫瘍測定値から算出した腫瘍体積（ｐｉ／６（長さ×幅×高さ））の増大を示すグラフである。
【図１６】マウス乳房４Ｔ１腫瘍細胞がクラステリンを発現し、分泌する図である。Ａは、２Ｄで培養した場合の４Ｔ１細胞の形態（ｍｏｒｐｈｏｌｇｙ）の図である（拡大率：４０×）。Ｂは、ホールセル溶菌液（ＷＣＬ）及び順化培地（ＣＭ）のウエスタンブロットが、ＷＣＬ中未処理の（ｐＣＬＵ）クラステリン及び処理され分泌された（ｓＣＬＵ）クラステリンの存在を示す図であり、処理され分泌されたｓＣＬＵのみを、ＣＭに見出すことができる。Ｃは、免疫蛍光顕微鏡が、ＤＡＰＩ染色核と比較して、単離した４Ｔ１腫瘍において分泌されたＣＬＵの存在を示す図である（拡大率１０×）。
【図１７】腫瘍（ＡＵＴ）及び非腫瘍を含有する反対側（ＡＵＮ）の関心領域（ＲＯＩ）に対する平均蛍光強度（ＡＵ）をプロットするグラフが、注入の約６０分後までは両方のペプチドが類似の腫瘍蓄積を示し、その後Ｐ３３７８Ｒペプチドは腫瘍から除去され、Ｐ３３７８ペプチドは保持されることを示す図である。
【図１８】Ｐ３３７８−ＤＬ６８０の蓄積が、過剰の非標識Ｐ３３７８によって遮断され得るが、Ｐ３３７８Ｒでは遮断されないことを示す図である。Ａは、注入の１５分後に測定したＰ３３７８−ＤＬ６８０の腫瘍特異的な蓄積が（２５ｎモル、左パネル）、過剰の非標識Ｐ３３７８との同時注入では遮断されるが（中間のパネル）、Ｐ３３７８Ｒペプチドとの同時注入では遮断されない（右パネル）ことを示す図である。Ｂでは、腫瘍部位におけるＰ３３７８−ＤＬ６８０の相対濃度の測定（白色矢印で示した）によって、この濃度値が、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０を単独で注入したマウス（左パネル）と比較して、過剰の非標識Ｐ３３７８の存在下では約３〜４分の１となり（中間のパネル）、過剰の非標識Ｐ３３７８Ｒのみがわずかな作用を有する（右パネル）ことが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、クラステリンに特異的なペプチドリガンド及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、クラステリン結合性ペプチド及び分子イメージングにおけるそれらの使用に関する。
【００１８】
クラステリンのｍＲＮＡは、ＢＲＩ−ＪＭ０１マウス乳腺細胞が形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βに曝露されると上方制御され、その結果クラステリンを分泌することが示されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。クラステリンはさらに、ＢＲＩ−ＪＭ０１細胞のＴＧＦ−β誘発性ＥＭＴにおいて極めて重要な役割に関与するとされており（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋら、投稿済み）、そのＥＭＴ促進作用の原因となるクラステリン内のエピトープが同定されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。他の報告によれば、クラステリンは、腫瘍発生を促進するさらなる重要な機能、例えば抗アポトーシス活性を担うことが示されている（Ｌａｕら、２００６年；Ｍｏｕｒｒａら、２００７年；Ｚｈａｎｇら、２００６年；Ｗａｔａｒｉら、２００８年及びＳｔｅｉｎｂｅｒｇら、１９９７年）。
【００１９】
本発明は、クラステリン糖タンパク質に特異的に結合するペプチドを対象とする。具体的には、本発明は、
ａ）本明細書ではＰ３３７８と呼ばれる配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）、
ｂ）本明細書ではＰ３３７５と呼ばれる配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（配列番号２）、及び
ｃ）本明細書ではＰ３３７６と呼ばれる配列ＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（配列番号３）、
を含むペプチドを対象とする。
【００２０】
本発明はまた、ペプチドＰ３３７８、Ｐ３３７５及びＰ３３７６の配列に実質的に類似の配列を有するペプチドを包含する。実質的に同一のペプチドは、１つ又は複数の保存アミノ酸変異を含み得る。参照ペプチドに対する１つ又は複数の保存アミノ酸変異は、その参照ペプチドと比較して、生理的、化学的又は機能的特性の実質的な変化なしに変異ペプチドをもたらし得ることが当技術分野で公知であり、かかる場合、参照ペプチド及び変異ペプチドは「実質的に同一の」ポリペプチドとみなされ得る。保存アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失又は置換を含むことができ、保存アミノ酸の置換とは、本明細書では、アミノ酸残基で、類似の化学特性（例えば、大きさ、電荷又は極性）を有するもう１つのアミノ酸残基を置換することと定義される。
【００２１】
非限定的な例では、保存変異はアミノ酸置換であり得る。かかる保存アミノ酸置換では、塩基性、中性、疎水性又は酸性アミノ酸で、同じグループの別のものを置換することができる。用語「塩基性アミノ酸」とは、ｐＫ値が７を超える側鎖を有する親水性アミノ酸を意味し、このアミノ酸は生理的ｐＨにおいて一般に正電荷である。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリシン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。用語「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」ともいう）は、生理的ｐＨでは無電荷であるが、２つの原子によって共有される電子対がそれらの原子の一方によってより密接して保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する、親水性のアミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」ともいう）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４年）の標準化された疎水性の統一基準によれば、ゼロを超える疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」とは、ｐＫ値が７未満の側鎖を有する親水性アミノ酸を指し、このアミノ酸は生理的ｐＨにおいて一般に負電荷である。酸性アミノ酸には、グルタミン酸塩（Ｇｌｕ又はＥ）及びアスパラギン酸塩（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。
【００２２】
配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用され、２つの配列が、残基位置と残基位置との間で最大限に一致するように整列している場合に同一となる残基の百分率を算出することによって決定される。任意の公知の方法を使用して、配列相同性を算出することができ、例えば、配列相同性の算出にはコンピューターソフトウェアが利用可能である。限定するものではないが、配列相同性は、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ若しくはＦＡＳＴＡ−Ｎなどのソフトウェア、又は当技術分野で公知の任意の他の適切なソフトウェアによって算出することができる。本発明の実質的に同一の配列は、少なくとも７５％同一であってよい。別の例では、実質的に同一の配列は、本明細書に記載の配列と、アミノ酸レベルで少なくとも７５、８０、８５、９０、９５又は１００％同一であってよい。
【００２３】
本発明のＰ３３７８、Ｐ３３７５及びＰ３３７６ペプチドは、全長の組換えヒトクラステリンに対してファージディスプレイしたペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得た。核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーの研究によって、ペプチドが特異的な方法でクラステリンと結合することを確認した。
【００２４】
本発明はまた、カーゴ分子に連結した本明細書に記載のクラステリン特異的ペプチドを包含する。カーゴ分子は、当技術分野で任意の適切な分子であってよく、クラステリンが上方制御されている癌腫又は他の病状の診断又は治療に有用となり得る。限定するものではないが、例えばカーゴ分子は、組織において対象となる細胞の同定及び限局化に有用な酵素、分子イメージングに使用されるイメージング部分、放射性同位体であってよく、又は疾患状態の組織の生存率若しくは腫瘍細胞の増殖能を低減するのに有用な薬物、抗原、アポトーシス誘発物質若しくは放射性同位体などの細胞傷害性薬剤であってよい。
【００２５】
一実施形態では、カーゴ分子はイメージング部分であってよい。分子イメージング部分は、任意の適切な分子であってよい。非限定的な例では、イメージング部分は、放射標識、フルオロフォア、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素又は磁気ナノ粒子であってよい。さらに非限定的な例では、イメージング部分は、アレクサ６８０、ディライト６８０若しくはディライト８００、Ｃｙ５．５色素、又は当技術分野で公知の任意の他のフルオロフォアであってよい。
【００２６】
カーゴ分子は、当技術分野で公知の任意の方法によってペプチドに連結することができる。限定するものではないが、例えばカーゴ分子は、共有結合又はイオン性相互作用によってペプチドに連結することができる。連結は、化学的架橋反応によって、又は細菌、酵母若しくは哺乳動物の細胞に基づく系などの任意のペプチド発現系と組み合わせた組換えＤＮＡ方法論を使用する融合によって達成され得る。カーゴ分子に本発明のペプチドを連結させる方法は、当業者に周知である。
【００２７】
上述のペプチドは、
本明細書に記載の光学イメージング；
１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａなどの一般的な同位体（臨床的には１８Ｆが最も利用される）でペプチドを標識化する陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）；
特異的な適用に依存して９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌなどの放射性トレーサーを使用する単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）（限定するものではないが、例えば１３３Ｘｅガスは、肺機能評価のための吸入の診断研究に有用であることが示されている）；
ペプチドを、例えばそれに限定されるものではないが炭素で被覆した鉄−コバルトナノ粒子と結合させ、それにより腫瘍検出のためのＭＲＩの感受性を増大する磁気共鳴画像（ＭＲＩ）（この種類のナノ粒子は、近赤外光を吸収し発熱することもでき、これにより腫瘍のイメージングが可能になるだけでなく、腫瘍細胞を熱で死滅させることもできる。最適な注入用量及び投与方法（静脈内（ｉ．ｖ．）又は腹腔内（ｉ．ｐ））は、一般に実験によって決定される）
を含むいくつかの分子イメージング技術において使用することができる。
【００２８】
本明細書に記載のペプチドは、クラステリンが過剰発現する癌及び他の病状の診断、治療評価又は治療に使用することができる。クラステリンが癌腫のＥＭＴに関与する場合（図１）、本発明のクラステリン結合性ペプチドは、分子イメージング技術によって癌腫の進行を検出するために使用できる。実際、生存マウスに対するリアルタイムのイメージングによって、近赤外（ＮＩＲ）プローブで蛍光標識化した場合の、インビボで腫瘍にホーミングし、腫瘍をイメージングするＰ３３７８ペプチドの能力を実証した（図１２及び１３）。これにより、腫瘍をインビボで限局化、可視化及び定量化することができ、切除に最適な生検部位及び腫瘍境界に関する情報を提供することもできる。
【００２９】
本発明の新規のクラステリン結合性ペプチドは、クラステリンに特異的に結合し、固形腫瘍に選択的にホーミングすることが示されている。それらの結合特異性、結合親和性の低さ（モノクローナル抗体と比較して）、及び循環からのクリアランス速度の速さ（モノクローナル抗体と比較して）により、これらのペプチドは、それらがイメージング研究において良好なコントラストをもたらす限り、分子イメージングのための有用なツールとして作用することができる。
【実施例】
【００３０】
本発明を、以下の実施例でさらに例示する。しかしこれらの例は単に例示目的であり、いかなる方法でも本発明の範囲を制限するために使用されるべきでないことを理解されたい。
【００３１】
実施例１：ファージディスプレイによるクラステリン結合性ペプチドの同定
【００３２】
ヒトクラステリンに結合するペプチドを、ファージディスプレイ技術によって同定した。
【００３３】
ファージパニング、ＳＰＲ、ＮＭＲに使用する精製組換えヒトクラステリン（ｒｈ−クラステリン）調製物を、ＨＥＫ−２９３細胞（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年に記載の一般的な発現系）において生成した。
【００３４】
無作為の１２アミノ酸ペプチドをディスプレイする市販のＰｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイライブラリーキットを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州べバリー）から購入した。マキシソープ（ＭａｘｉＳｏｒｐ）（商標）ウェル（デンマーク、Ｎｕｎｃ Ｂｒａｎｄ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ１００μＬ中ｒｈ−クラステリン１０μｇを用いて終夜４℃で被覆し、０．５％ＢＳＡで１時間ブロックした。
【００３５】
パニング手順を、他書に記載の通り（Ｓｕら、２００４年）本質的に室温で実施した。各パニングラウンドの後、２０のファージクローンを無作為に選択し、配列した。
【００３６】
精製したｒｈ−クラステリンに対してファージライブラリーを２ラウンド、パニングすることによって、Ｐ３３７８と指定されるアミノ酸配列ＨＰＬＳＫＨＰＹＷＳＱＰ（配列番号１）を有する独特のペプチドを含有する単一ファージクローンがかなり濃縮した（分析したプラークの最大３５％）。
【００３７】
３ラウンド目のパニングによって、ほぼ例外なくＰ３３７８をディスプレイするファージ粒子が回復した。したがって、ｒｈ−クラステリンに対して親和性を有するもう１つのペプチド配列ファミリーの同定は困難であった。ｒｈ−クラステリンと相互作用する他のペプチドリガンドを同定するために、１ラウンド目の選択後に得られたＰｈＤ−１２ファージのサブライブラリーを、競合するＰ３３７８の存在下（１ｍＭ）で、２回の連続パニングサイクルにかけた。これらのパニングラウンドによって、ｒｈ−クラステリンと結合する可能性があるより多くのペプチド配列が得られた。さらなる分析のために、発生頻度を基にして２つの追加の配列ＮＴＹＷＳＱＬＬＨＦＱＴ（Ｐ３３７５）（配列番号２）及びＳＨＡＬＰＬＴＷＳＴＡＡ（Ｐ３３７６）（配列番号３）を選択した。Ｐ３３７５及びＰ３３７８の両方が配列ＹＷＳＱ（配列番号４）を含有することは、注目に値する。
【００３８】
実施例２：ペプチドＰ３３７５、３３７６及び３３７８の合成
【００３９】
実施例１で同定した３つのペプチド配列を、ＣＯＯＨ末端における伸長を伴う標準のＦｍｏｃ化学を使用して合成し、すなわちこれらのペプチド配列をＳＧＳＧＣ配列（配列番号５）によって伸長して、安定なチオエーテル結合を介してＳＰＲバイオセンサー表面又はＮＩＲ色素に結合するためのリンカーを提供した。
【００４０】
非標識の合成ペプチドを、標準のＦｍｏｃ化学を使用して合成した。ペプチドを、ＨＰＬＣを使用することによって、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した水−アセトニトリル直線勾配０〜６０％（１．０％／分、流速５．０ｍｌ／分）を使用して１０×２５０ｍｍのＶｙｄａｃ（商標）−Ｃ１８逆相カラムで精製した。最終生成物を凍結乾燥し、すべてのペプチドについて、分析ＨＰＬＣによって、０．１％ＴＦＡ中勾配０〜６０％（１％／分、流速１．０ｍｌ／分）のアセトニトリルを使用して４．６×２５０ｍｍのＶｙｄａｃ−Ｃ１８逆相カラムで純度≧９８％になったことを確認した。溶出プロファイルは、２７８ｎｍにおける吸光度によってモニターした。精製したすべてのペプチドの識別を、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって検証した。ペプチド濃度を、予測吸光係数を使用して分光光度的に決定した。
【００４１】
実施例３：ＳＴＤ−ＮＭＲを使用するペプチドとクラステリンとの相互作用の特徴付け
【００４２】
実施例１のペプチドとクラステリンとの直接結合を確認するために、実施例２の合成ペプチドとクラステリンとの相互作用を、核磁気共鳴飽和移動差（ＳＴＤ−ＮＭＲ；Ｍａｙｅｒ＆Ｍｅｙｅｒ、２００１年）を使用して試験した。
【００４３】
０．１５ｍＭペプチドを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５に溶解することによって、ＮＭＲサンプルを調製した。５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．０２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４中ｒｈ−クラステリン（約１ｍｇ／ｍｌ）を、約１：３０の比のタンパク質：ペプチドに添加した。
【００４４】
すべてのＮＭＲ実験を、２９８Ｋにおいて、３つの軸勾配の５ｍｍの三重共鳴プローブを備えたブルカーアドバンス（Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ）８００（商標）ＮＭＲ分光計で実施した。飽和移動差（ＳＴＤ）スペクトルを、ＷＡＴＥＲＧＡＴＥ版のＳＴＤパルスシーケンス（３５）を使用して、緩和遅延に適用した３秒の選択的飽和パルス及び２０ミリ秒のスピンロックパルスで、電界強度１２．２５ｋＨｚを用いて記録した。飽和パルスは、４９ミリ秒のガウス形選択的パルス及び１ミリ秒のインターパルス遅延のパルス列を使用して実施した。各ガウス形パルスは、１％切り捨てで１０００ポイントを有し、電界強度７５．９Ｈｚで印加された。ＳＴＤスペクトルは、スペクトル幅１６０２５．６４Ｈｚ及びデータ点３２Ｋで記録した。タイムドメインシグナルを、遊離サンプル及び複合サンプルについてそれぞれ１０２４及び４０９６のスキャンで積算した。ＮＭＲデータを、Ｂｒｕｋｅｒ Ｘｗｉｎｎｍｒ ２．６を使用して処理した。フーリエ変換及び多項式ベースライン補正の前に、指数重み関数（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）７Ｈｚを適用した。
【００４５】
ペプチドＰ３３７８及びｒｈ−クラステリンのＮＭＲシグナルが大幅に重複し、したがってペプチドの共鳴を妨げずに先の飽和パルスをｒｈ−クラステリン共鳴に排他的に適用することは不可能であった。Ｐ３３７８−ｒｈ−クラステリン複合体における結合相互作用を同定するために、メチル共鳴（０．９１２ｐｐｍ）におけるオン共鳴飽和パルス及び−７．７９９ｐｐｍ（参照したＨ２Ｏを４．７００ｐｐｍとする）におけるオフ共鳴照射を適用することによって、新しい実験スキームを実施した。このスキームでは、オン共鳴飽和パルスによってメチル共鳴周辺のＮＭＲシグナルがクエンチされたが、オフ共鳴照射は、任意の共鳴なしにスペクトル領域に適用されたので、全ＮＭＲスペクトルに対して作用しなかった。オフ共鳴照射されたスペクトルからオン共鳴照射されたスペクトルを減算することによって、ＳＴＤスペクトルを得た。差スペクトルの結果として、ペプチドとタンパク質の間に結合相互作用がなかったにもかかわらず、オン共鳴の周波数周辺の強い「残りの」ピークが、複合体のＳＴＤスペクトルにおいて観測された。メチル周波数におけるオン共鳴照射は、タンパク質シグナルだけでなく、オン共鳴に近いペプチドシグナルも飽和する。これは、ペプチド内の飽和移動作用に由来する追加のＳＴＤシグナルをもたらし得る。このペプチド内作用を評価するために、遊離ペプチドサンプルについても同じ実験準備を行った。結合の情報は、複合体のＳＴＤスペクトルを、遊離ペプチドのＳＴＤスペクトルと比較することによって抽出することができる。
【００４６】
図２（下のパネル）は、準化学量論的な量のクラステリンの存在下及びそれなしのＰ３３７８のＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルを示す（タンパク質：ペプチド約１：３０）。ｒｈ−クラステリンの存在下における芳香族側鎖領域の鋭いＮＭＲピークの出現（約７ｐｐｍ）は、タンパク質からペプチドへの飽和移動を示し、タンパク質とペプチドの間の直接的な相互作用を示すものであった。Ｐ３３７８と同様に、合成Ｐ３３７５及びＰ３３７６の結合をＳＴＤ−ＮＭＲによって確認した（図２、上及び中間のパネル）。ｒｈＣＬＵとのＰ３３７８の特異的な結合を実証するＰ３３７８−クラステリン複合体（実線の矢印）及びＰ３３７８単独（破線の矢印）のＮＭＲ−ＳＴＤスペクトルを、やはり図３Ａ〜Ｃに示す。
【００４７】
実施例４−ＳＰＲバイオセンサー分析を使用するペプチドとクラステリンとの相互作用の特徴付け
【００４８】
実施例１のペプチドとクラステリンとの結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してさらに研究した。
【００４９】
ペプチドを、マレイミドの結合方法によって研究用ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。ＣＭ５センサーチップ（研究用）及びＥＤＣは、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から購入した。このチオールの結合によって、センサーチップ表面上の反応性マレイミド基とペプチドのチオール基との安定なチオエーテル結合が得られる。ヘテロ二官能性試薬であるＳＭＣＣ−ヒドラジド（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１カルボキシルヒドラジド；純度９９．５％；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から購入した）を使用して、反応性マレイミド基をセンサー表面に導入した。流速５μＬ／分において２５℃で固定化を実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）（商標）−２０、ｐＨ７．４）の連続フローを、センサー表面上に維持した。センサー表面上のカルボキシル化デキストランマトリックスを、１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．００中１．２ｍＭのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）１７２μＬ及び４０％ＤＭＦ中１７．８ｍＭのＳＭＣＣ−ヒドラジド２８μＬを含有する新しく混合した溶液５０μＬを注入することによって活性化した。ＳＭＣＣ：ＥＤＣの比は２．５：１であった。１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）にペプチド（３０〜１００μｇ／ｍｌ）を注入することによって、ペプチド結合表面を生成した。活性化表面上に固定化するペプチドの量を、ペプチド溶液との接触時間を変えることによって調節し、約４００〜５００ＲＵ又はペプチド４００〜５００ｐｇ／ｍｍ２とした。固定化手順は、１Ｍ塩化ナトリウム及び０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）中５０ｍＭシステイン５０μＬを注入して、過剰の活性なマレイミド基をクエンチすることによって完了した。
【００５０】
タンパク質とペプチドとの相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器（スウェーデン、ウプサラ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ）を使用して追跡した。センサー表面全体にわたる流速２０μＬ／分のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％ツイーン−２００）ｐＨ７．４の連続フローの下、２５℃ですべての結合実験を実施した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中異なる濃度のｒｈ−クラステリンを、ペプチド誘導体化センサーチップ上に注入した。注入後最大３００秒間、解離をモニターした。５ｍＭのＮａＯＨを含有するＨＢＳ−ＥＰ緩衝溶液を１５秒間注入することによって、表面を完全に再生させた。各相互作用の動態は、流速（２０〜１００μＬ／分）を変えることによってごくわずかに影響を受けたが、このことは質量輸送の寄与が最小限であったことを示す（データは示さず）。各分析物の注入について、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．０（スウェーデン、ウプサラ、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用して、ペプチドを含有するフローセルから非修飾デキストラン表面を含有する対照フローセルからの参照応答を減算した。
【００５１】
得られたセンサーグラムを、単純１：１ラングミュア結合モデルに対する実験データのグローバルフィッティングによる運動速度の決定に使用した。センサーグラムの解離相と会合相の両方に関するフィットの統計的分析は、低いＸ２値（＜２）を示した。結合研究からの親和性データ（ＫＤ）を、定常状態におけるＲＵとしての応答（Ｒｅｑ）対クラステリンの濃度（Ｃ）をプロットし、これらの曲線を単一部位結合モデル（ｏｎｅ−ｓｉｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）、Ｒｅｑ＝Ｃ＊×Ｒｍａｘ／（Ｃ＋ＫＤ）（式中、Ｒｍａｘは飽和におけるＲＵの値であり、Ｒｅｑは、所与の各Ｃにおいて観測されたＲＵの光学的変化である）にフィットさせることによって得た。
【００５２】
図４は、ｒｈＣＬＵ（１１ｎＭ〜１４μＭ）と固定化無作為化配列Ｐ３３７８Ｒ（３３７８ＲＵ）との相互作用を評価した対照実験からの、ＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットである。この対照ペプチドは、Ｐ３３７８と同じアミノ酸含量を有するが、無作為化配列（ＰＹＬＨＱＳＰＨＷＫＰＳＳＧＳＧＣ−配列番号６）を有する。ｒｈＣＬＵとこの対照ペプチドとの結合の欠如は、スキャッチャードプロット（挿入図；ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットした平衡における応答）の線形性質によって明らかである。これは、無作為化ペプチドがｒｈＣＬＵに特異的に結合せず、結果的に親Ｐ３３７８ペプチドとクラステリンとの相互作用がペプチド配列依存性であることを実証するものである。
【００５３】
図５は、ｒｈＣＬＵ（５．５ｎＭ〜１．４μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７８（５００ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。データのグローバルフィット（実線）は、その結合が、ｋｏｎ＝（１．７２±０．０３）×１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝０．００５２±０．０００２ｓ−１及びＫｄ＝０．３０μＭの単純１対１ラングミュア結合モデルによって説明し得ることを示している。平衡における応答を、ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットし、実験データを、Ｋｄが０．３０±０．０６μＭの１対１結合モデルを用いてフィットさせた。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５４】
図６は、ｒｈＣＬＵ（２ｎＭ〜１．１μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７５（１２００ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。データのグローバルフィット（実線）は、その結合が、ｋｏｎ＝（１．１２±０．０３）×１０４Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝０．００６±０．０００２ｓ−１及びＫｄ＝０．５４μＭの単純１対１ラングミュア結合モデルによって説明し得ることを示している。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５５】
図７は、ｒｈＣＬＵ（０ｎＭ〜１．４μＭ）と固定化ペプチドＰ３３７６（１５０ＲＵ）との結合を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。平衡における応答を、ｒｈＣＬＵの濃度に対してプロットし、曲線は、Ｋｄが０．３４±０．１０μＭの１対１結合モデルに対するデータ点のフィットを表す。結合は、スキャッチャードプロット（挿入図）の曲線の性質によって明らかである。
【００５６】
つまり、図５、６及び７は、ファージディスプレイスクリーニングによって同定した３つすべてのクラステリン結合性ペプチドが、ｒｈ−クラステリンに対してマイクロモル以下の見掛けの親和性を示すことを実証している。
【００５７】
実施例５−ＳＰＲバイオセンサー分析及びクラステリンに無関係のタンパク質を使用するクラステリンとペプチドとの相互作用の特異性の研究の特徴付け
【００５８】
クラステリンとペプチドとの相互作用の特異性を、ＳＰＲバイオセンサー分析及びクラステリンに無関係のタンパク質を使用して研究した。センサーチップ上のペプチド及び他のタンパク質の固定化、並びにＳＰＲ実験を、実施例４に記載の通り実施した。
【００５９】
図８は、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメイン（３８ｎＭ〜４．５μＭ）と、固定化Ｐ３３７８（５００ＲＵ）（図８Ａ）又はＰ３３７５（１２００ＲＵ）（図８Ｂ）との相互作用を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムを表す。どちらの場合も著しいシグナルは観測されなかったが、このことはＩＩ型ＴＧＦ−β受容体がこれらのペプチドと相互作用しないことを示す。
【００６０】
図９は、上皮増殖因子外部ドメイン（ＥＧＦＲ−ＥＤ）（７０ｎＭ〜５．６３μＭ）と、固定化Ｐ３３７５（１２００ＲＵ；図９Ａ）又はＰ３３７８（５００ＲＵ；図９Ｂ）との結合を示すオーバーレイプロットを示す。スキャッチャードプロットの線形性質（右パネル）は、これらのペプチドがＥＧＦＲ−ＥＤに特異的に結合しないことを示す。
【００６１】
つまり、図８及び９の結果は、Ｐ３３７８及びＰ３３７５が、クラステリンとは無関係なタンパク質とは特異的に相互作用しないことを示しており、このことは、ｒｈ−クラステリンとのそれらの結合が特異的であることを示す。
【００６２】
実施例６−クラステリンとペプチドとの相互作用の配列依存の特徴付け
【００６３】
クラステリンとペプチドとの相互作用の配列依存を、ＳＰＲバイオセンサー分析及びスクランブル配列を有するペプチドを使用して研究した。センサーチップ上のペプチドの固定化及びＳＰＲ実験を、実施例４に記載の通り実施した。
【００６４】
図１０は、ｒｈ−クラステリン（１１ｎＭ〜１．４μＭ）と、本発明のクラステリン結合性ペプチドの固定化無作為化型であるＰ３３７８Ｒ（ＰＹＬＨＱＳＰＨＷＫＰＳＳＧＳＧＣ−配列番号６）、Ｐ３３７５Ｒ（ＬＳＬＹＨＴＮＴＱＦＷＱＳＧＳＧＣ−配列番号７）及びＰ３３７６Ｒ（ＡＷＨＴＬＡＳＴＳＬＡＰＳＧＳＧＣ−配列番号８）との相互作用を示すＳＰＲバイオセンサーのセンサーグラムを表す。曲線のスキャッチャードプロット（右パネル）によって明らかになる通り、クラステリンがＰ３３７５Ｒ（１３８５０ＲＵ）及びＰ３３７６Ｒ（３３００ＲＵ）と結合したことは（それぞれ図１０ｂ及びｃ）、Ｐ３３７５及びＰ３３７６とクラステリンとの結合が、ペプチド配列に特異的でないことを実証するものである。Ｐ３３７８Ｒ（３３７８ＲＵ）のスキャッチャードプロット（図１０ａ、右パネル）の線形性質によって、Ｐ３３７８とクラステリンとの相互作用の配列依存性の性質が確認される（図４も参照）。
【００６５】
実施例７−ｍＡｂ１６Ｂ５との比較におけるＰ３３７８クラステリンのエピトープの特徴付け
【００６６】
ＥＭＴを遮断する抗クラステリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１６Ｂ５及びＰ３３７８が、クラステリン上に重複又は独立の結合部位を有するかどうかという問題を、ＳＰＲバイオセンサー分析を使用して研究した。クラステリンと相互作用するいくつかのｍＡｂが単離されており、１６Ｂ５を含むこれらのｍＡｂのうち５つが、クラステリンのＥＭＴ促進作用にとって重要なクラステリン上のエピトープと相互作用する。したがって、これらの抗クラステリンｍＡｂは、細胞培養におけるＥＭＴ及び動物モデルにおける腫瘍転移を阻害する（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔら、国際公開第２００７／０３０９３０号パンフレット）。クラステリン結合性ペプチドは、インビボでクラステリン発現腫瘍（原発腫瘍及び転移）を非侵襲的にイメージングするために使用できるので、抗クラステリンｍＡｂによる処理が、クラステリン標的とのペプチド結合を遮断し、したがって腫瘍をイメージングするペプチドの能力を損なうおそれがあるかどうかを決定することが重要である。センサーチップ上のペプチドの固定化及びＳＰＲ実験を、本質的に実施例４に記載の通り実施した。
【００６７】
図１１は、１６Ｂ５ｍＡｂなし、及び１６Ｂ５ｍＡｂの存在下でのｒｈ−クラステリンと固定化Ｐ３３７８ペプチドとの結合を示すセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す。固定化Ｐ３３７８ペプチドよりも高い濃度のｒｈ−クラステリン（０〜１．２μＭ）の注入によって、０．５２μＭのＫＤが得られた（図１１ａ）。ｒｈ−クラステリンを、ｍＡｂ１６Ｂ５を用いてプレインキュベートし（比１：１．７）、次いで同じペプチド表面上にフローさせると、１．１μＭのＫＤが測定された（図１１ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ１６Ｂ５の存在が、固定化Ｐ３３７８とのｒｈ−クラステリンの結合親和性に著しく影響を及ぼさなかったことを示すが、このことはｍＡｂ１６Ｂ５及びＰ３３７８ペプチドが、ｒｈ−クラステリン上の非重複部位に結合することを示すものである。したがってＰ３３７８は、１６Ｂ５ｍＡｂによって処理した腫瘍との相互作用及びそのイメージングを遮断されないはずである。
【００６８】
実施例８−マウス４Ｔ１乳房腫瘍細胞におけるクラステリン分泌
【００６９】
動物モデルにおける腫瘍のイメージングを実証するためには、標的、この場合クラステリンを発現する腫瘍細胞株（動物に埋め込まれることになる）を選択することが必須である。したがって、マウス４Ｔ１乳房腫瘍細胞がクラステリンを分泌し、分泌されたクラステリンのレベルが間葉系の表現型と相関することを実証した。
【００７０】
マウス４Ｔ１腫瘍細胞は、クラステリンの分泌型を生成することが示されており、この分泌は、ＴＧＦ−βによる処理によって増大する（図１２）。マウス乳房４Ｔ１腫瘍細胞をＡＴＣＣから得、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞は、ＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖させると、未処理細胞（ＣＴＬ）と比較して非常にわずかな間葉系様の形態変化を受ける（図１２Ａ）。ＴＧＦ−βなし（ＣＴＬ）又はＴＧＦ−βの存在下で２４時間増殖した細胞から得た馴化培地５０μＬのウエスタンブロット分析は、細胞によるクラステリン分泌がＴＧＦ−βによって増大することを示す（図１２Ｂ）。培地対照（Ｍｅｄ）におけるクラステリンの欠如は、未処理４Ｔ１細胞の馴化培地で検出されたクラステリンが、成長培地自体（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））に由来しないことを示す。これらの結果は、クラステリンが４Ｔ１細胞によって分泌され、分泌されたクラステリンの量がＴＧＦ−βによって増大すること、すなわちクラステリンの発現レベルがより間葉系の表現型と相関することを示すものである。４Ｔ１細胞の運動性は、創傷治癒アッセイにおいて示される通り、ＴＧＦ−βの存在によって増大するが（図１２Ｃ）、このことは、増大したクラステリンと間葉系の表現型との相関を確認するものである。Ｌｅｉｔｚ Ｌａｂｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡に搭載したＮｉｋｏｎ ＣｏｏｌＰｉｘ ９９５デジタルカメラで写真を撮った。
【００７１】
実施例９−標識化クラステリン結合性ペプチド（Ｐ３３７８）を使用する４Ｔ１腫瘍担持動物のイメージング
【００７２】
分子イメージングの準備では、ペプチドＰ３３７８（及びその無作為化対照ペプチド、Ｐ３３７８Ｒ）を様々なプローブで標識化した。アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）６８０のＣ２−マレイミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（オンタリオ州バーリントン）から購入した。アレクサフルオル６８０、ディライト６８０又はディライト８００によるＰ３３７８及びＰ３３７８Ｒペプチドの標識化を、製造者の指示（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に従って実施した。３：１（色素：ペプチド）のモル比の７．０ｍＭのアレクサフルオル６８０のＣ２マレイミド（ＤＭＳＯに溶解）を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．３ｍＭのペプチドを用いて４℃で２４時間にわたって暗室でインキュベートすることによって、アレクサフルオル６８０−ペプチドコンジュゲートを生成した。粗コンジュゲートを、分析的ＨＰＬＣを使用することによって、Ｖｙｄａｃ−Ｃ１８逆相カラム、４．６×２５０ｍｍで０．１％ＴＦＡ中勾配０〜６０％（１％／分、流速１．０ｍｌ／分）のアセトニトリルを使用して精製した。溶出プロファイルを２７８ｎｍにおける吸光度によってモニターした。精製したすべての標識化ペプチドの識別を、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって検証した。ピークを含有するペプチド−アレクサ６８０コンジュゲートを収集し、凍結乾燥させ、濃度２５０μＭ（予測吸光係数を使用して分光光度的に決定した）で滅菌生理食塩水に再溶解し、使用まで暗室において−８０℃で保存した。
【００７３】
モデル系として、４Ｔ１マウス乳癌細胞株の細胞を使用して、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腫瘍を発生させた。４Ｔ１細胞は、著しい量のクラステリンを発現及び分泌し（図１６及びＬｅｎｆｅｒｉｎｋ ２００９年）、雌性ＢＬＡＢ／ｃ動物に注入した場合に同系インビボモデル系を提供することが示されている。すべての動物における手順は、機関の指針と共に、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ（ケベック州モントリオール）によって承認のプロトコル０８−ＭＡＲ−Ｉ−１２に従って服薬遵守で実施した。６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから得た。乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルスを含まない高濃度フェノールレッドフリーマトリゲルを、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ニュージャージー州フランクリンレイクス）から購入した。無菌マトリゲルと生理食塩水の１：１溶液５０μｌ、又は４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞（５×１０６個の細胞）を含有する同じ溶液を、動物の右後大腿部に皮下注入した。Ｃｌｉｐｐｅｒｓ及びＮａｉｒを使用して、マトリゲル及び腫瘍細胞注入の前に、動物の注入部位並びに腰背部及び左大腿部から毛髪を除去した。腫瘍を測定して直径約０．５〜０．８ｃｍになったら（６〜８日）、腫瘍担持マウスをインビボでイメージングした。
【００７４】
免疫蛍光顕微鏡のために、ＯＣＴで包埋した４Ｔ１腫瘍を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９００クリオスタット（Ｌｅｉｃａ、カナダ、オンタリオ州リッチモンドヒル）を使用して厚さ８μｍの切片にし、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州オタワ）上に置き、使用まで−８０℃で維持した。凍結切片を風乾させ、１０％緩衝ホルマリン中で５分間固定し、Ｕｌｔｒａ Ｖ Ｂｌｏｃｋ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）を用いて、室温で５分間にわたって非特異的にブロックした。次いでスライドを、クラステリン抗体Ｍ−１８（１：１００；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国カリフォルニア州サンタクルス）を用いて終夜４℃でインキュベートし、次いで二次アレクサフルオル５５５標識化ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：２００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州バーリントン）で室温において３０分間インキュベートした。核を、ＰＢＳ中０．１μｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて室温で１分間対比染色した。水を使用した最後のステップを除き、すべての洗浄ステップでＰＢＳを使用した。最後に、プロロングゴールドアンチフェード（ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ）（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州バーリントン）を使用してスライドをマウントした。ＱＩｍａｇｉｎｇ（商標）Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒ ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ、カナダ、ブリティッシュコロンビア州サリー）に接続したライツアリストプラン（Ｌｅｉｔｚ Ａｒｉｓｔｏｐｌａｎ）（商標）顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）を用いて蛍光を検出し、ＱＣａｐｔｕｒｅ（商標）ソフトウェア（Ｍｅｙｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国テキサス州ヒューストン）を使用して分析し、その後Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カナダ、オンタリオ州トロント）を用いて擬似色を付けた。
【００７５】
近赤外線の蛍光顕微鏡のために、インビボでの腫瘍標的化実験の完了後、動物にヘパリン処置した生理食塩水をかん流し、動物の脳を切開し、次いでドライアイスで凍結させた。マウスの脳組織を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（商標）凍結保存培地に包埋し、クリオスタット上で厚さ１０μｍの切片にし、次いでスーパーフロスト（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ）（商標）Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カナダ、オンタリオ州Ｎｅｐｅａｎ）上にマウントした。凍結した組織切片を、メタノール中、室温で１０分間固定した。スライドを０．２ＭのＰＢＳ（ｐＨ７．３）ですすぎ、その後ＰＢＳ中５％ロバ血清を用いて０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標）−Ｘ１００と共に室温で１時間インキュベートした。ブロッキング後、ヤギ抗マウスクラステリン一次抗体（１：１００）を用いてスライドを室温で１時間インキュベートし、その後アレクサ５６８標識化ロバ抗ヤギ二次抗体（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて室温で１時間インキュベートした。スライドを再度ＰＢＳで５回洗浄し、次いで過剰の液体を乾燥させ、Ｈｏｅｃｈｓｔを含有するＤＡＫＯ蛍光マウンティング培地（１：１０００）を使用してカバースリップをのせた。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１倒立電動顕微鏡（Ｍａｒｋｈａｍ、カナダ、オンタリオ州）を使用して画像を取り込み、イメージプロ（ＩｍａｇｅＰｒｏ）（商標）６．２（Ｍａｒｋｈａｍ、カナダ、オンタリオ州）を使用して分析した。
【００７６】
動物を、以下の手順を使用してイメージングした。動物を、イソフルラン（Ｏ２中３％、２Ｌ／分）を使用して麻酔した。標識化ペプチドの注入の前に、動物を全身スキャンにかけて、バックグラウンド蛍光画像を得た。Ｐ３３７８−アレクサ６８０又はＰ３３７８Ｒ−アレクサ６８０を、２７ゲージの固定針を備えた０．５ｍｌインスリンシリンジを使用して、尾静脈を介して投与した（滅菌生理食塩水１００μＬ中２５ｎｍｏｌ）。直後に、動物をＡＲＴ ｅＸｐｌｏｒｅ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２イメージング系（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、モントリオール）の加熱した動物用プレート（３９℃）上に置いた。画素数当たりのレーザー出力及び計数時間を、それぞれ９．６μＷ及び０．５秒で最適化した。これらの値を、すべての実験中、一定に維持した。ラスタースキャン間隔を１．５ｍｍに設定し、各画像の取得中、一定に保持した。データを、時間的点広がり関数（ＴＰＳＦ）として記録し、蛍光強度及び蛍光寿命マップを作成した。すべての画像を、ＡＲＴオプティクスオプティビュー（Ｏｐｔｉｘ ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（商標）ソフトウェアを使用して分析した。体積データ及び３Ｄ画像を、ＡＲＴオプティビュー（ＯｐｔｉＶｉｅｗ）（商標）３Ｄ再構成ソフトウェアモジュールを使用して再構成した。すべての動物を、イメージング実験後に安楽死させた。
【００７７】
動物を、以下の３つの手法を使用してＡＲＴ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２小動物撮像装置でイメージングした。
ａ．マウスに、アレクサ６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド５ナノモル又はアレクサ６８０で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド５ナノモルのいずれかを、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。
ｂ．マウスに、アレクサ６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド２５ナノモル又はアレクサ６８０で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド２５ナノモルのいずれかを、尾静脈を介して静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。
ｃ．マウスに、ディライト６８０で標識化したＰ３３７８ペプチド２５ナノモル及びディライト８００色素で標識化したＰ３３７８Ｒペプチド２５ナノモルの混合物を、ｉ．ｖ．（尾静脈）同時注入した。
【００７８】
最初の２つの手法（ａ、ｂ）では、クラステリン結合性ペプチド及び対照ペプチドを同じフルオロフォアで標識化したので、各ペプチドのホーミング能力を個々に、すなわち異なる時間及び／又は異なる動物においてモニターしなければならなかった。第３の手法（ｃ）におけるクラステリン結合性ペプチド及び対照ペプチドの差動的な標識化によって、同時注入が可能になり、同じマウスにおける同じ４Ｔ１腫瘍にホーミングするこれら２つのペプチドの能力をほぼ同時にモニターすることができた。最初の２つの手法で使用したアレクサ標識から、第３の手法で使用したディライト（商標）標識への切替えは、２つの異なるフルオロフォアを使用できるようにするために行われ、また、多くの適用においてディライト（商標）色素がアレクサフルオロフォアよりも高い蛍光強度及び光安定性を提示することが示されていることから行われた。
【００７９】
最初の実験（ａ、ｂ）では、ある日動物１匹にＰ３３７８−アレクサ６８０を注入した後、イメージングデータを注入の３時間後に収集した。ペプチド注入の２４時間後、この動物を再スキャンして（前日と同じパラメータを使用する）、Ｐ３３７８−アレクサ６８０がマウスから除去されたことを確認した。次いで、Ｐ３３７８Ｒ−アレクサ６８０スクランブルペプチドを注入し、前日と同じ測定を実施した。この設定を使用して、２つのペプチドの挙動を、異なる日の同じ動物における同じ腫瘍で比較した。
【００８０】
生理食塩水１００μＬ中標識化ペプチド５ナノモル又は２５ナノモルのいずれかを注入した。これは、それぞれ約３μＭ及び約１５μＭの最初の循環ペプチド濃度に相当するものであった。クラステリンは、血中に中程度豊富に存在する循環タンパク質である（１００μｇ／ｍｌ＝約１μＭ）。ペプチド５ナノモル又は２５ナノモルのいずれかを注入した場合、注入したペプチドの最初の濃度は循環クラステリンの濃度よりも高かったので、遊離循環ペプチド（クラステリン結合していない）は、どちらの場合も腫瘍にホーミングするのに利用可能なはずである。ＡＲＴ Ｏｐｔｉｘ ＭＸ２小動物撮像装置を使用して、両方のペプチド濃度における腫瘍内（並びに腎臓及び膀胱内）のＰ３３７８−アレクサ６８０及びＰ３３７８Ｒ−アレクサ６８０の両方の蓄積を観測した。
【００８１】
重要なことに、Ｐ３３７８−アレクサ６８０ペプチドは、Ｐ３３７８Ｒ−アレクサ６８０ペプチドよりも腫瘍部位からゆっくり除去されたが、このことは、Ｐ３３７８ペプチドがクラステリン結合に起因して、腫瘍部位に選択的に保持されたことを示している（図１３Ａ）。この作用は、「腫瘍抗原シンク（ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｉｎｋ）」作用を反映し得る腎臓におけるＰ３３７８Ｒスクランブルペプチドのより早い蓄積と相関し、すなわち腫瘍に保持されるＰ３３７８Ｒスクランブルペプチドが少ないので、多くのペプチドが循環に保持され、腎臓におけるクリアランスに利用可能となる（図１３Ｂ）。これらの結果は、Ｐ３３７８が４Ｔ１腫瘍細胞によって分泌されたクラステリンに対して特異性を有することを示している。
【００８２】
Ｐ３３７８ペプチドの腫瘍標的化能力の特異性に関するさらなる最終的なデータを得るために、第３の手法（ｃ）を使用して、Ｐ３３７８ペプチドをディライト６８０で標識化し、Ｐ３３７８Ｒペプチドをディライト８００フルオロフォアで標識化した。次いで、両方のペプチドの１：１混合物（各２５ナノモル）を、４Ｔ１腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．注入した（前述の通り）。さらに、これらの同じ動物に対して、４Ｔ１細胞を注入したビヒクル（マトリゲル／生理食塩水５０μＬ、１：１（ｖ／ｖ））も、左大腿部（ｓ．ｃ．）に注入した。これによって、同じマウスの腫瘍部位（右大腿部）及びビヒクル対照部位（左大腿部）において、両方のペプチドのホーミング挙動の実質的に同じ時間におけるモニターが可能となった。
【００８３】
６匹の動物を使用したこれらの実験結果から、先の実験（先のａ及びｂ）において得られた結果を確認した。図１４は、Ｐ３３７８ペプチドが、Ｐ３３７８Ｒペプチドと比較して腫瘍部位にかなり長く存在することを示すものであり、それによって腫瘍標的化に対するＰ３３７８ペプチドの特異性を確認する。この観測を、両方のペプチドについて経時的な腫瘍シグナル対バックグラウンド比を決定することによってさらに確認した（図１７）。そのために、同じ動物の腫瘍（ＡＵＴ）及び非腫瘍を含有する反対側（ＡＵＮ）の周りに描いた関心領域（ＲＯＩ）について平均蛍光強度（ＡＵ）を決定した。時間関数としてＡＵＴ／ＡＵＮ比をプロットすることによって、両方のペプチドが、最初は注入の約６０分後まで腫瘍部位において同じ速度で蓄積し、その後Ｐ３３７８Ｒペプチドは腫瘍から除去され、Ｐ３３７８ペプチドは腫瘍部位に保持されることが示される。
【００８４】
これらの実験過程中、Ｐ３３７８／Ｐ３３７８Ｒペプチド混合物を注入した３匹の動物の腫瘍は、経時的に増殖速度の低減を示す傾向があったが（図１５）、このことは、これらのペプチドが抗腫瘍作用を有し得ることを示すものであることにも気付いた。腫瘍細胞の注入の７日後まで、腫瘍の大きさを２次元で測定したことに留意されたい（長さ及び幅、実験を通して同じ式を使用できるように高さは１ｍｍに設定した）。
【００８５】
Ｐ３３７８−ＤＬ６８０プローブのインビボ標的化能力の特異性をさらに評価するために、過剰の非標識Ｐ３３７８ペプチドを使用してブロッキング実験を実施した。マウスに、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を単独で（ｎ＝１）、又は滅菌生理食塩水１００μＬ中、非標識Ｐ３３７８若しくはＰ３３７８Ｒペプチド５μモル（共にｎ＝２）と組み合せて投与した。対照群の動物には、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を、５μモルの非標識スクランブルＰ３３７８Ｒペプチドと共に、又はそれなしに投与し、実験動物には、２５ｎモルのＰ３３７８−ＤＬ６８０を、５μモルの非標識Ｐ３３７８ペプチドと組み合わせて注入した。図１８Ａ（注入の１５分後）に示す通り、非標識Ｐ３３７８ペプチドは、腫瘍へのＰ３３７８−ＤＬ６８０の取込みの遮断に成功したが、非標識スクランブルＰ３３７８Ｒは遮断しなかった。さらに、ゲート（ｇａｔｅｄ）ＮＩＲＦ寿命及びオプティビュー３Ｄ再構成モジュールを使用して、各マウスにおいて最高濃度のＰ３３７８−ＤＬ６８０を含有するＺ軸に沿った切片を選択し、その相対濃度を決定した。図１８Ｂは、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０プローブの相対濃度（図１８Ｂ、中間のパネル）が、Ｐ３３７８−ＤＬ６８０を注入した動物（図１８Ｂ、左パネル）と比較して、過剰の非標識Ｐ３３７８ペプチドの存在下では約３〜４分の１となり、この濃度値が、過剰のスクランブルＰ３３７８Ｒペプチドの存在のみによってわずかに影響を受ける（図１８Ｂ、右パネル）ことを示す。
【００８６】
共焦点顕微鏡を使用して、注入の１５分間後に収集した４Ｔ１腫瘍及び様々な器官（肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、心臓、肺）におけるＰ３３７８−ＤＬ６８０プローブの分布を評価した。Ｐ３３７８−ＤＬ６８０（２５ｎモル）の注入の１５分後に動物から収集した４Ｔ１腫瘍及び器官の凍結切片（厚さ１０μｍ）は、４Ｔ１腫瘍における蛍光プローブの特異的な取込み及び蓄積を示すものであり、蛍光プローブはその標的ＣＬＵと共に局在している。Ｐ３３７８ペプチドは、ｓＣＬＵが存在したにもかかわらず他の器官では検出できなかったが、これによってＰ３３７８−ＤＬ６８０ペプチドが腫瘍によって選択的に取り込まれることが、顕微鏡的なレベルで確認される。核のＤＡＰＩ染色を使用して、組織形態を可視化した。
【００８７】
本明細書に記載の実施形態及び実施例は例示的なものであり、特許請求される本発明の範囲を制限することを企図しない。本発明者らは、代替、改変及び等価物を含む先の実施形態の変形形態が特許請求の範囲に包含されることを企図する。さらに、論じた組合せの特徴が本発明の解決に必要ないこともあり得る。
【００８８】
関連出願の相互参照
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている２００９年４月１７日出願の米国特許仮出願第６１／２０２，９１０号の利益を主張するものである。
【００８９】
参考文献
本明細書に記載のすべての特許、特許出願及び出版物は、参照によって本明細書に組み込まれている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で示したアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
カーゴ分子に連結している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
カーゴ分子が、酵素、イメージング部分、放射性同位体又は細胞傷害性薬剤を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
カーゴ分子がイメージング部分を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
イメージング部分が、放射標識、フルオロフォア、近赤外蛍光色素又は磁気ナノ粒子を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
分子イメージング、クラステリンが上方制御されている病状の診断、又はクラステリンが上方制御されている病状の治療のための、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
腫瘍の分子イメージングのための、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
分子イメージングが、光学イメージング、陽電子放出断層撮影、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、又は磁気共鳴画像である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
病状が癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項１】
配列番号１、配列番号２若しくは配列番号３で示したアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２】
カーゴ分子に連結している、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
カーゴ分子が、酵素、イメージング部分、放射性同位体又は細胞傷害性薬剤を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
カーゴ分子がイメージング部分を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
イメージング部分が、放射標識、フルオロフォア、近赤外蛍光色素又は磁気ナノ粒子を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
分子イメージング、クラステリンが上方制御されている病状の診断、又はクラステリンが上方制御されている病状の治療のための、請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項７】
腫瘍の分子イメージングのための、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
分子イメージングが、光学イメージング、陽電子放出断層撮影、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、又は磁気共鳴画像である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
病状が癌である、請求項６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２４０２９（Ｐ２０１２−５２４０２９Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０５００８（Ｐ２０１２−５０５００８）
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８５２１
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００５６６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１８５２１
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
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