クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出用プローブおよびプライマー
【課題】クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプローブおよびプライマーの提供。
【解決手段】ＰＣＲ法の試料としてビール、発泡酒、ワインなどの酒類、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料、原料用に採取された水等の環境試料を対象として用い、特定の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用プローブまたはプライマーの利用。
【解決手段】ＰＣＲ法の試料としてビール、発泡酒、ワインなどの酒類、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料、原料用に採取された水等の環境試料を対象として用い、特定の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用プローブまたはプライマーの利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出用のＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は製品の品質を著しく損なう等深刻な問題をもたらす。酪酸は、通常はビール中の含量が少ないので問題になることはないが、酪酸含量が多くなるとチーズ様脂肪酸臭を生じ、ビールの品質を著しく損なう。酪酸がビール中に過剰に生成される原因としては、グラム陽性桿菌で、主に、ヒトや他の動物の腸管内および土壌中などに分布する偏性嫌気性、芽胞形成性のバシラセアエ(Bacillaceae) 科の細菌であるクロストリジウム属細菌（Clostridium）による原料や仕込工程の汚染が挙げられる（Hawthorne, D. B. et al. 1991, J. Am. Soc. Brew. Chem. 49, 4-8、Hawthorne, D. B. et al. 1986, J. Inst. Brew. 92, 181-184、Stenius, V. et al. 1991, Proceedings of EBC congress, 529-536）。従って、クロストリジウム属細菌を検出し、同定する技術はビール製造における品質管理に非常に重要である。
【０００３】
これまでクロストリジウム属細菌の検出に関しては、制限酵素切断ｒＤＮＡの電気泳動パターンによる同定法が報告されている（特許文献１）。しかし、クロストリジウム属細菌を検出対象とするＰＣＲ法プライマーペアとして、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列を用いたプライマーペアについては、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１１３８９９号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子において、種のレベルで保存され、かつクロストリジウム・ベイジェリンキに特異的な塩基配列を見出した。具体的には、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７）において、５８〜８６番目（配列番号１）、４３６〜４６３番目（配列番号２）、５７６〜６１６番目（配列番号３）、８００〜８２６番目（配列番号４）、９６５〜９９２番目（配列番号５）、１２１９〜１２５６番目（配列番号６）の塩基配列がそれぞれクロストリジウム・ベイジェリンキに特異的であることを見出した。本発明者はまた、この特異的な配列に基づいて設計したクロストリジウム・ベイジェリンキ検出用ＰＣＲ法プライマーセットによってクロストリジウム・ベイジェリンキを正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００６】
本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
（２）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（３）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（４）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーと、配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーとからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（７）配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプライマーセット。
（８）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプローブもしくはプライマー、または前記（５）〜（７）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【０００８】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に検出することができる。特に、本発明によるプライマーセットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【０００９】
クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１０】
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明では、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用のプライマーやプローブとして用いることができる（以下、「本発明によるプライマーまたはプローブ」ということがある）。
【００１１】
本発明では、また、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、本発明によるプライマーまたはプローブと組み合わせて、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用のプライマーとして使用することができる。
【００１２】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ここで「標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ」するとは、標的ポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１〜６のいずれか）の一部（例えば、少なくとも６塩基、好ましくは、少なくとも１０塩基、より好ましくは、少なくとも１２塩基、さらにより好ましくは、少なくとも１５塩基）または全部を少なくとも含んでなる配列にハイブリダイズすることを意味する。
【００１３】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００１４】
本明細書において、クロストリジウム・ベイジェリンキの「近縁種」とは、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または約１５００ヌクレオチドの領域を少なくとも含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部と、少なくとも９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターを設定して算出することができる。
【００１５】
クロストリジウム・ベイジェリンキの近縁種としては、例えば、クロストリジウム・ロゼウム（Clostridium roseum）、クロストリジウム・ファヴォソスポラム（Clostridium favososporum）、クロストリジウム・コリノホルム（Clostridium corinoforum）、クロストリジウム・パニセウム（Clostridium puniceum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカ（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム・クロモレダクタンス（Clostridium chromoreductans）、クロストリジウム・ジオリス（Clostridium diolis）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutyricum）が挙げられる。クロストリジウム・ベイジェリンキの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＲ＿０２９２３０．１）を各クロストリジウム属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＢＬＡＳＴにより比較したところ、以下の表の通り、約１５００ｂｐの範囲で９７％以上の同一性を示しており、少なくともクロストリジウム・ベイジェリンキの近縁種であることを確認している。
【表１】
【００１６】
本発明では、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）とすることができる。
【００１７】
本発明では、また、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドとすることができる。
【００１８】
本発明では、さらに、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表される対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表される対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとすることができる。
【００１９】
本発明において「配列番号１〜６のいずれかの塩基配列」は、好ましくは、配列番号１の塩基配列である。
【００２０】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２１】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２２】
本発明によるプライマーおよびプローブの具体例としては、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。なお、これらのポリヌクレオチドが、本発明によるプライマーと組み合わせて用いられるプライマーとして用いることができることはいうまでもない。
【００２３】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）とすることができる。
【００２４】
このようなプライマーとしては、例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）（１または数個の変異が導入されていてもよい）である。
【００２５】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、また、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドとすることができる。
【００２６】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、さらに、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとすることができる。
【００２７】
配列番号７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドを本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２８】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの具体例としては、配列番号９で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
本発明では、配列番号８または９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号８または９の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
プライマーでは、相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、最大で３０塩基、より好ましくは、最大で２５塩基とすることができる。相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、１２〜２５塩基または１２〜３０塩基、１５〜２５塩基または１５〜３０塩基、１８〜２５塩基または１８〜３０塩基、２０〜２５塩基または２０〜３０塩基とすることができる。
【００３２】
プライマーでは、相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３３】
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３４】
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号９の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３５】
プローブでは、相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、最大で３０塩基、より好ましくは、最大で２５塩基とすることができる。相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、１２〜２５塩基または１２〜３０塩基、１５〜２５塩基または１５〜３０塩基、１８〜２５塩基または１８〜３０塩基、２０〜２５塩基または２０〜３０塩基とすることができる。
【００３６】
プローブでは、相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３７】
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３８】
本発明においては、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号７の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号７の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。
【００３９】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６および配列番号７の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００４０】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６および配列番号７の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００４１】
本願明細書において、「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００４２】
本発明によるプローブまたはプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなり、かつ配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４３】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号９の塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットの好ましい態様としては、本発明による好ましい態様のプライマーと、本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの好ましい態様のプライマーとからなる、ＰＣＲ法プライマーセットが挙げられる。
【００４５】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４６】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４７】
本発明によるプライマーセットは、単独で使用しても、他のプライマーセットと適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種をより正確に区別して検出することが可能となる。
【００４８】
本発明によるプライマーセットは、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプライマーセットを含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出キットが提供される。
【００４９】
本発明によるプライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法等による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）、器具（例えば、反応用チューブ）、説明書等を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料（例えば、酒類）の品質低下の原因となるクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に識別することができる。クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００５１】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００５２】
クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットによりクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
【００５３】
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５４】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００５５】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００５６】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の存在を示す、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００５７】
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５８】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００５９】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【００６０】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００６１】
すなわち、本発明によれば、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の存在を示す、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００６２】
本発明によれば、また、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００６３】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【００６４】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【００６５】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の識別に用いることができる。
【００６６】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００６７】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００６８】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００６９】
これらをＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００７０】
本発明によるクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００７１】
まず、試料中に存在すると考えられるクロストリジウム・ベイジェリンキあるいはその近縁種を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＰＣＲ法を実施し、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７３】
実施例１：クロストリジウム・ベイジェリンキの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出した。１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２７μlを加えて混和することで中和した後、遠心分離した上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０７ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００７４】
（ｂ）ＰＣＲ用プライマーの合成
クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーを、ホスホアミダイド法で化学合成した（化学合成はシグマアルドリッチジャパン株式会社に委託）。
［プライマーセット１］
正規鎖側プライマー： GCGATGAAGC TCCTTCGGGA （配列番号８）
逆鎖側プライマー ： CCGTCAATTC CTTTGAGTTT （配列番号９）
【００７５】
（ｃ）ＰＣＲ反応溶液の調製およびＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ溶液１μlに、１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液４μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）、正規鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑ）０．２５μlを加え、水で５０μlとし、これをＰＣＲ反応溶液とした。
【００７６】
（ｄ）ＰＣＲ反応
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し反応させた。
【００７７】
反応溶液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色を行った。電気泳動は２％のアガロースゲルを使用し、ＴＡＥバッファーの中、１００ボルトで３０分間行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分間浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この時、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流して相対比較することにより、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００７８】
（ｅ）クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーの特異性評価
クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーとして開発したプライマーセット１について、各種標準株を用いてＰＣＲ法で特異性を評価した。その結果、プライマーセット１は、クロストリジウム・ベイジェリンキの菌株と反応させた場合にのみＤＮＡ増幅が観察された（表１）。
【表２】
なお、表中の＋は、約７００〜８３０塩基対に相当する大きさの増幅物（すなわち、配列番号７の６０〜８９２番目の塩基配列に相当）が観察されたことを示している。
【００７９】
以上により、クロストリジウム・ベイジェリンキに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とするクロストリジウム・ベイジェリンキを菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、クロストリジウム・ベイジェリンキを同定・検出することができる。
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出用のＰＣＲ法プライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は製品の品質を著しく損なう等深刻な問題をもたらす。酪酸は、通常はビール中の含量が少ないので問題になることはないが、酪酸含量が多くなるとチーズ様脂肪酸臭を生じ、ビールの品質を著しく損なう。酪酸がビール中に過剰に生成される原因としては、グラム陽性桿菌で、主に、ヒトや他の動物の腸管内および土壌中などに分布する偏性嫌気性、芽胞形成性のバシラセアエ(Bacillaceae) 科の細菌であるクロストリジウム属細菌（Clostridium）による原料や仕込工程の汚染が挙げられる（Hawthorne, D. B. et al. 1991, J. Am. Soc. Brew. Chem. 49, 4-8、Hawthorne, D. B. et al. 1986, J. Inst. Brew. 92, 181-184、Stenius, V. et al. 1991, Proceedings of EBC congress, 529-536）。従って、クロストリジウム属細菌を検出し、同定する技術はビール製造における品質管理に非常に重要である。
【０００３】
これまでクロストリジウム属細菌の検出に関しては、制限酵素切断ｒＤＮＡの電気泳動パターンによる同定法が報告されている（特許文献１）。しかし、クロストリジウム属細菌を検出対象とするＰＣＲ法プライマーペアとして、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列を用いたプライマーペアについては、これまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−１１３８９９号公報
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳリボソームＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子において、種のレベルで保存され、かつクロストリジウム・ベイジェリンキに特異的な塩基配列を見出した。具体的には、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７）において、５８〜８６番目（配列番号１）、４３６〜４６３番目（配列番号２）、５７６〜６１６番目（配列番号３）、８００〜８２６番目（配列番号４）、９６５〜９９２番目（配列番号５）、１２１９〜１２５６番目（配列番号６）の塩基配列がそれぞれクロストリジウム・ベイジェリンキに特異的であることを見出した。本発明者はまた、この特異的な配列に基づいて設計したクロストリジウム・ベイジェリンキ検出用ＰＣＲ法プライマーセットによってクロストリジウム・ベイジェリンキを正確に検出できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００６】
本発明は、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に検出できるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットを提供することを目的とする。本発明は、また、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
（２）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（３）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（４）配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、前記（１）に記載のプローブまたはプライマー。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプライマーと、配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーとからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
（７）配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、前記（６）に記載のプライマーセット。
（８）前記（１）〜（４）のいずれかに記載のプローブもしくはプライマー、または前記（５）〜（７）のいずれかに記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【０００８】
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に検出することができる。特に、本発明によるプライマーセットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【０００９】
クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【発明の具体的説明】
【００１０】
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明では、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用のプライマーやプローブとして用いることができる（以下、「本発明によるプライマーまたはプローブ」ということがある）。
【００１１】
本発明では、また、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチド、並びに配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基（好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは少なくとも１８塩基、特に好ましくは少なくとも２０塩基）のポリヌクレオチドを、本発明によるプライマーまたはプローブと組み合わせて、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用のプライマーとして使用することができる。
【００１２】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ここで「標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズ」するとは、標的ポリヌクレオチドの塩基配列（例えば、配列番号１〜６のいずれか）の一部（例えば、少なくとも６塩基、好ましくは、少なくとも１０塩基、より好ましくは、少なくとも１２塩基、さらにより好ましくは、少なくとも１５塩基）または全部を少なくとも含んでなる配列にハイブリダイズすることを意味する。
【００１３】
ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００１４】
本明細書において、クロストリジウム・ベイジェリンキの「近縁種」とは、クロストリジウム・ベイジェリンキの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子または約１５００ヌクレオチドの領域を少なくとも含む１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部と、少なくとも９７％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を示す１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターを設定して算出することができる。
【００１５】
クロストリジウム・ベイジェリンキの近縁種としては、例えば、クロストリジウム・ロゼウム（Clostridium roseum）、クロストリジウム・ファヴォソスポラム（Clostridium favososporum）、クロストリジウム・コリノホルム（Clostridium corinoforum）、クロストリジウム・パニセウム（Clostridium puniceum）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニカ（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）、クロストリジウム・クロモレダクタンス（Clostridium chromoreductans）、クロストリジウム・ジオリス（Clostridium diolis）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）、クロストリジウム・サッカロブチリカム（Clostridium saccharobutyricum）が挙げられる。クロストリジウム・ベイジェリンキの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号７；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＲ＿０２９２３０．１）を各クロストリジウム属細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とＢＬＡＳＴにより比較したところ、以下の表の通り、約１５００ｂｐの範囲で９７％以上の同一性を示しており、少なくともクロストリジウム・ベイジェリンキの近縁種であることを確認している。
【表１】
【００１６】
本発明では、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）とすることができる。
【００１７】
本発明では、また、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドとすることができる。
【００１８】
本発明では、さらに、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表される対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号１〜６のいずれかの塩基配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表される対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとすることができる。
【００１９】
本発明において「配列番号１〜６のいずれかの塩基配列」は、好ましくは、配列番号１の塩基配列である。
【００２０】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２１】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１２〜３０塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２２】
本発明によるプライマーおよびプローブの具体例としては、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。なお、これらのポリヌクレオチドが、本発明によるプライマーと組み合わせて用いられるプライマーとして用いることができることはいうまでもない。
【００２３】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）とすることができる。
【００２４】
このようなプライマーとしては、例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）、および配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列の連続する少なくとも１０個（例えば、１０〜２５個および１０〜３０個）、好ましくは、少なくとも１５個（例えば、１５〜２５個および１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）（１または数個の変異が導入されていてもよい）である。
【００２５】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、また、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドとすることができる。
【００２６】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーでは、さらに、配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドとすることができる。
【００２７】
配列番号７の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドを本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で３０塩基、より好ましくは最大で２５塩基、特に好ましくは最大で２０塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、１５〜２５塩基、１５〜３０塩基、１８〜２５塩基、１８〜３０塩基、２０〜２５塩基、または２０〜３０塩基とすることができる。
【００２８】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの具体例としては、配列番号９で表されるポリヌクレオチド、更にはこれらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
本発明では、配列番号８または９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号８または９の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
【００３０】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００３１】
プライマーでは、相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、最大で３０塩基、より好ましくは、最大で２５塩基とすることができる。相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、１２〜２５塩基または１２〜３０塩基、１５〜２５塩基または１５〜３０塩基、１８〜２５塩基または１８〜３０塩基、２０〜２５塩基または２０〜３０塩基とすることができる。
【００３２】
プライマーでは、相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３３】
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３４】
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号９の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３５】
プローブでは、相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１２塩基、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも１８塩基、特に好ましくは、少なくとも２０塩基とすることができ、また、最大で３０塩基、より好ましくは、最大で２５塩基とすることができる。相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、１２〜２５塩基または１２〜３０塩基、１５〜２５塩基または１５〜３０塩基、１８〜２５塩基または１８〜３０塩基、２０〜２５塩基または２０〜３０塩基とすることができる。
【００３６】
プローブでは、相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１７個、特に好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００３７】
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号８の連続する少なくとも１５個（１５〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で２５塩基、好ましくは最大で３０塩基とすることができる）であり、好ましくは、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００３８】
本発明においては、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号７の塩基配列（例えば、配列番号７の８７３〜９０６番目の塩基配列）の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号１〜６のいずれかの塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号７の塩基配列の相補配列以外の配列（配列番号７の配列の外側の領域）に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。
【００３９】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６および配列番号７の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００４０】
相同ポリヌクレオチド、並びに配列番号１〜６および配列番号７の塩基配列やその相補配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００４１】
本願明細書において、「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【００４２】
本発明によるプローブまたはプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号８の塩基配列からなり、かつ配列番号１の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４３】
本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの好ましい態様としては、１または数個の変異が導入されていてもよい配列番号９の塩基配列からなり、かつ配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはこのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４４】
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットの好ましい態様としては、本発明による好ましい態様のプライマーと、本発明によるプライマーと組み合わせて使用するプライマーの好ましい態様のプライマーとからなる、ＰＣＲ法プライマーセットが挙げられる。
【００４５】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【００４６】
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【００４７】
本発明によるプライマーセットは、単独で使用しても、他のプライマーセットと適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種をより正確に区別して検出することが可能となる。
【００４８】
本発明によるプライマーセットは、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、本発明によるプライマーセットを含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出キットが提供される。
【００４９】
本発明によるプライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法等による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）、器具（例えば、反応用チューブ）、説明書等を含んでいてもよい。
【００５０】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料（例えば、酒類）の品質低下の原因となるクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種を正確に識別することができる。クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【００５１】
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００５２】
クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種は各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出のみならず、各種飲料（例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン）の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットによりクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
【００５３】
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５４】
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、ＰＣＲ法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
【００５５】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００５６】
すなわち、本発明によれば、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の存在を示す、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００５７】
本発明によれば、また、
（ａ）本発明によるＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００５８】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【００５９】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【００６０】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【００６１】
すなわち、本発明によれば、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の存在を示す、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
【００６２】
本発明によれば、また、
（ａ’）本発明のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｂ’）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
【００６３】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【００６４】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
【００６５】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の識別に用いることができる。
【００６６】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【００６７】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【００６８】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【００６９】
これらをＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白 核酸 酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【００７０】
本発明によるクロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【００７１】
まず、試料中に存在すると考えられるクロストリジウム・ベイジェリンキあるいはその近縁種を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＰＣＲ法を実施し、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７３】
実施例１：クロストリジウム・ベイジェリンキの検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に懸濁し、沸騰水中で１０分間加熱することによりＤＮＡを抽出した。１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）２７μlを加えて混和することで中和した後、遠心分離した上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。なお、この懸濁液中の菌濃度は１０７ｃｆｕ／ｍｌ程度であった。
【００７４】
（ｂ）ＰＣＲ用プライマーの合成
クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーを、ホスホアミダイド法で化学合成した（化学合成はシグマアルドリッチジャパン株式会社に委託）。
［プライマーセット１］
正規鎖側プライマー： GCGATGAAGC TCCTTCGGGA （配列番号８）
逆鎖側プライマー ： CCGTCAATTC CTTTGAGTTT （配列番号９）
【００７５】
（ｃ）ＰＣＲ反応溶液の調製およびＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡ溶液１μlに、１０倍に濃縮されている反応用バッファー５μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のＢｕｆｆｅｒ）、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）混合液４μl（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑに付属のｄＮＴＰ混合液）、正規鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、逆鎖側プライマー２０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製、ＴａＫａＲａ ｅｘＴａｑ）０．２５μlを加え、水で５０μlとし、これをＰＣＲ反応溶液とした。
【００７６】
（ｄ）ＰＣＲ反応
熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、重合反応（７２℃、１分）からなる過程を１サイクルとし、これを２５サイクル繰り返し反応させた。
【００７７】
反応溶液中にヌクレオチド配列が増幅されたか否かを見るために、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによる染色を行った。電気泳動は２％のアガロースゲルを使用し、ＴＡＥバッファーの中、１００ボルトで３０分間行った。次いでゲルを取り出し、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム水溶液中に３０分間浸漬して染色後、トランスイルミネーターで発色させ、ポラロイドカメラで撮影した。この時、電気泳動時に塩基対数が既知のＤＮＡ断片を一緒に流して相対比較することにより、検出されたヌクレオチド配列断片の長さを算出した。
【００７８】
（ｅ）クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーの特異性評価
クロストリジウム・ベイジェリンキ用プライマーとして開発したプライマーセット１について、各種標準株を用いてＰＣＲ法で特異性を評価した。その結果、プライマーセット１は、クロストリジウム・ベイジェリンキの菌株と反応させた場合にのみＤＮＡ増幅が観察された（表１）。
【表２】
なお、表中の＋は、約７００〜８３０塩基対に相当する大きさの増幅物（すなわち、配列番号７の６０〜８９２番目の塩基配列に相当）が観察されたことを示している。
【００７９】
以上により、クロストリジウム・ベイジェリンキに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とするクロストリジウム・ベイジェリンキを菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、クロストリジウム・ベイジェリンキを同定・検出することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項４】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、
請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーと、配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーとからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項７】
配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、または請求項５〜７のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【請求項１】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項３】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであり、
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、または配列番号８の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項４】
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）であり、
配列番号１〜６のいずれかの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）である、
請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーを少なくとも１種含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプライマーと、配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなるプライマーとからなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項７】
配列番号７の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、配列番号７の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド、または配列番号７の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項６に記載のプライマーセット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブもしくはプライマー、または請求項５〜７のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、クロストリジウム・ベイジェリンキおよびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
【公開番号】特開２０１１−１５２０８１（Ｐ２０１１−１５２０８１Ａ）
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５８７９（Ｐ２０１０−１５８７９）
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（３１１００２４４７）キリングループオフィス株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ポラロイド
【出願人】（３１１００２４４７）キリングループオフィス株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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