グリシンメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）動物モデル及びその使用
【課題】 本発明はグリシンメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）動物モデルとその使用に関連する。また、本発明はガン、特に肝臓ガンを予防するか治療することにおけるＧＮＭＴ製品の使用に関連する。
【解決手段】 本発明そしてゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えを行うことによって乱されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の表現型に相対しそのマウスの異常な肝臓機能からなる表現型が生じ、その乱される位置はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５である。本発明はさらにアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法をある患者に提供し、その患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与する。
【解決手段】 本発明そしてゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えを行うことによって乱されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）の表現型に相対しそのマウスの異常な肝臓機能からなる表現型が生じ、その乱される位置はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５である。本発明はさらにアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法をある患者に提供し、その患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリシンメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）動物モデルとその使用に関連する。また、本発明はガン、特に肝臓ガンを予防するか治療することにおけるＧＮＭＴ製品の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
細胞異常による人間のかかる病気の中で、最も一般的なタイプの一つはガンであり、現在、それは主な死亡原因でもある。ガンは根本的な間葉に侵入し破壊して、すなわち、局部侵入をする完全的に増殖する（悪性）腫瘍である。場合によっては、浸透したガン細胞はさらに腫瘍で新たに形成されたリンパ管や血管に辿り着き、局部のリンパ節や遠くの臓器に運ばれ、そこで新たなガン巣（転移）を作り出す可能性もある。少なくともいくつかの正常な増殖を制御するメカニズムに再び制御されない細胞――どんな組織でも起こる――はその異常な増殖が起こるということから、腫瘍は一般的に認識されている。ガンは別として、腫瘍は単に局部的に起こり悪性にならないこともある。つまり、良性腫瘍ということである。あるいは、腫瘍細胞はただガン細胞の形態学的外見を持っているだけで元の位置に残る可能性がある。つまり、非浸透ガンである。ところが、その場合は、腫瘍はその部位でガンになることもある。
【０００３】
腫瘍の悪性度を判断する絶対の方法はない。しかし、組織の顕微鏡検査は依然として現在慣用のいくつかの方法の中で、最も信頼できる方法である。病理学的研究において、腫瘍は組織学的で細胞学的基準に基づいた構造逆分化（退形成）の度合いのおよその判断によって、等級分けされることができる。しかし一方で、特定構造の特徴を失っても分化において生化的特徴をまだ保有している細胞があれば、構造的に分化される様に見えるが、正常な機能的特性は既に多くを失ってしまった細胞もあるとも考えられる。他方、腫瘍は均質でなく一つ以上の腫瘍等級のある領域を含む可能性もあるので、発展した腫瘍は、構造や、機能、成長可能性、薬またはＸ線に対する抵抗力、浸透性及び転移の能力が異なる細胞の混合集団から成るとも考えられる。その二つの制限は、腫瘍の組織学的検査の効果を減少させる。さらに、そのような標本抽出による検査は、大規模な調査にふさわしくない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既に長い時間、悪性の絶対標識（マーカー）を発見しようとする多くの試みがなされている。腫瘍特異性や腫瘍に関わるタンパク質を特定しようとする他の試みは、直接測定や、そうしたタンパク質に対する特定の抗体を開発することによって、今現在も実施されている。それらは診断だけではなく、ガン細胞の破壊方策を提供する面においても有望なアプローチであると思われる。さまざまな物質が生体内に存在し集中するのは、特定のガンを起こす可能性があるということが報告されている。その例として、腫瘍胎児抗原（例えば、アルファフェトプロテイン）や血清蛋白（例えば、フェリチン）、酵素、ポリアミン、異所性ホルモン、細胞のマーカー、レセプター、腫瘍に関わるウイルス抗原などが挙げられます。しかし、ガンの診断において最も一般的に用いられる方法は、上記の物質のものより、組織学に依存する。絶対標識（マーカー）が一つも発見されないことはガンの研究において大きな欠乏である。
【０００５】
最近の観測では、発ガン現象に密接的に関連する物質を捜すことに、いくつかの予測が提供される。ガンは腫瘍遺伝子の起動と腫瘍抑制遺伝子の不活化をもたらすいくつかの遺伝子異常に起因すると認識されている。さらに、そうした腫瘍形成に関わる重要な遺伝子の弁別的な発現は、細胞の中の伝令ＲＮＡ (ｍＲＮＡ)量で反映されることができる。大量のｍＲＮＡの中に効率のあるものを選出し変異要因のある ｍＲＮＡは、その差異を示すことのできる技術ＤＤ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）から小さな要因の部分を分離し、それにより、腫瘍細胞及び正常細胞に違った要因が表面上に現される。(Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２, ６９６６-６９６８, １９９２)
【０００６】
世界で最も一般的なガンの１つである人間の肝細胞癌(ＨＣＣ)は、通常、肝硬変を誘発するウイルス感染や化学発ガン物質に接触することで起こる慢性炎症性肝疾患から成るものである。(Ｙｕ,Ｍ.Ｗ. ｅｔ ａｌ., Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ. Ｏｎｃｏｌ. Ｈｅｍａｔｏｌ. １７, ７１-９１, １９９４; Ｓｃｈａｆｅｒ,Ｄ.Ｆ. ｅｔ ａｌ., Ｌａｎｃｅｔ ３５３, １２５３-１２５７, １９９９; Ｗｉｌｌｉａｍｓ,Ｊ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｎｕｔｒ. ８０, １１０６-１１２２, ２００４) いくつかの地域(中国やアフリカなど)では、肝細胞癌は主にウイルス感染（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）やアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に汚染された食べ物、そして他の形で摂取されたアフラトキシンに起因する。(Ｗｉｌｌｉａｍｓ,Ｊ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｎｕｔｒ. ８０, １１０６-１１２２, ２００４; Ｃｈｅｎ,Ｃ.Ｊ., Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １６, １１５０-１１５５, １９９２) アフラトキシンの代謝産物は、アスペルギラス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）とアスペルギラス・パラシティカス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ) 菌類は高温多湿な環境での二次産物である。そうした遍在している菌類は米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物に影響する。(ＭｃＬｅａｎ,Ｍ. ＆ Ｄｕｔｔｏｎ,Ｍ.Ｆ., Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｈｅｒ. ６５, １６３-１９２, １９９５)生物学的なシステムに直面する科学物質、または外来異物（ＡＦＢ１など）は代謝プロセスによって変えられることができる。解毒経路の第一相では、多環芳香族炭化水素と塩化炭化水素に誘発されるシトクロムＰ４５０アイソザイムは基質に一つの酸素原子を加え、生物活性はその偶発的な後遺症である。(Ｈｓｉｅｈ,Ｄ.Ｐ.Ｈ., Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ, １９８６; Ｈｓｉｅｈ,Ｄ.Ｐ.Ｈ., Ａｃａｄｅｍｉｃ, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, １９８７; Ａｏｙａｍａ,Ｔ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８７, ４７９０-４７９３, １９９０; Ｓｗｅｎｓｏｎ,Ｄ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ. ６０, １０３６-１０４３, １９７４)反応性中間体アフラトキシンＢ１ ８,９エポキシド（ＣＹＰアイソザイムから作られます、例えば、サイトクロームＰ４５０ＩＡ２とＰ４５０ＩＩＩＡ４）は多くの動物の種の中で発ガン性を持っている。その肝臓のＤＮＡとの共有結合は肝発ガンにおける重要なステップであることが示されている。(Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ,Ｌ.Ｍ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８７, ８３０６-８３１０, １９９０; Ｋｏｓｅｒ,Ｐ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ ２６３, １２５８４-１２５９５, １９８８) 最も重要な第二相酵素は、グルタチオンＳ転移酵素グループに属し、グルタチオンと潜在的に毒性を持っている求電子剤との化学結合を促進させ、それらの毒性を消失させる。(Ｄｅｇｅｎ,Ｇ.Ｈ. ＆ Ｎｅｕｍａｎｎ,Ｈ.Ｇ., Ｃｈｅｍ. Ｂｉｏｌ. Ｉｎｔｅｒａｃｔ. ２２, ２３９-２５５, １９７８; Ｈａｙｅｓ,Ｊ.Ｄ. ｅｔ ａｌ., Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｈｅｒ. ５０, ４４３-４７２, １９９１) その後、反応の良いアフラトキシンＢ１ ８,９エポキシドは遺伝子を攻撃し損害を与える。生体内で形成するＡＦＢ１−ＤＮＡ付加体は主にＡＦＢ１-Ｎ７−グアニンである。(Ｃｒｏｙ,Ｒ.Ｇ. ｅｔ. ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ７５, １７４５-１７４９, １９７８; Ｋｅｎｓｌｅｒ,Ｔ.Ｗ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４６, ３９２４-３９３１, １９８６) ＡＦＢ１はＤＮＡと共有結合をし、ｐ５３遺伝子のコドン２４９における第三ポジションでの塩基（それは ＡＦＢ１による突然変異誘発がよく起こっているものだと考えられる）で、Ｇ・Ｃ→Ｔ・Ａトランスバーションを誘発するということを指摘した報告は、少なくとも二つある (Ｂｒｅｓｓａｃ,Ｂ. ｅｔ. ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２９-４３１, １９９１; Ｈｓｕ,Ｉ.Ｃ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２７-４２８) 。
【０００７】
グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)は、グリシンからサルコシンを合成する作用を促進させる細胞内の酵素である。それによって、グリシンはＳ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）からメチル基を取得してサルコシンになり、その後、サルコシンデヒドロゲナーゼで水素を取り除かれてグリシンに戻すこともでる。後者の反応はエネルギーを生み出し、一つの炭素をＳＡＭｅから取り抜く。そのため、ＧＭＴはＳＡＭｅ対Ｓ-アデノシルホモシステイン(ＳＡＨ)の比率を調節することにおいて大切な役割を担うわけです。ネズミの肝臓のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＭＴ)における属性、例えば、飲食におけるメチオニンのレベルによって変動させられ関連させられているその活動状態と、メチオニンを多く摂取した食事による誘導性は、ＧＮＭＴはＳＡＭｅの組織集合やメチオニンの代謝を管理することでも重要な役を果たすものと考えられる (Ｏｇａｗａ, Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２５７:３４４７-３４５２, １９８２) 。しかし、ＧＮＭＴは単なる生体内で代謝した全部のメチオニンの２０％に関わることが発見された (Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｎｕｔｒ. １０６: １７２１-１７３６, １９７６) が、そのたんぱく質は発育十分なネズミやハツカネズミの肝臓に多くあり、ほとんどが肝臓であらゆる可溶性たんぱく質の１%〜３%を占める (Ｈｅａｄｙ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２４８:６９-７２, １９７３) 。そのため、ＧＮＭＴはほかの生理的な機能を発揮する可能性もあり、ネズミの肝サイトゾールから純化された葉酸結合蛋白と全く同じ様に働くものがあるということが発見された (Ｃｏｏｋ, Ｒ. Ｊ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８１:３６３１-３６３４, １９８４) 。近年、ＧＮＭＴはサイトクロームＰ４５０１Ａ１遺伝子(ＣＹＰ１Ａ１)における５'-フランキング領域と相互に作用する４Ｓ多環芳香族炭化水素結合蛋白であることは、ラハ（Ｒａｈａ）とほか(Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６９:５７５０-５７５６)によって証明されている。また、ＧＮＭＴは肝細胞で最も豊富で効率的なメチルトランスフェラーゼで、その活動はほかのメチルトランスフェラーゼに影響を与えることも可能である。例えば、ｔＲＮＡ-メチルトランスフェラーゼは活動がＧＮＭＴに妨害されることができる (Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２４７:４２４８-４２５２, １９７２) 。脂質動員合成物、例えば、ＳＡＭｅ及びその前駆物質であるメチオニンやコリン、ベタインはネズミやハツカネズミのモデルでさまざまな発ガン性物質に誘発される肝腫瘍の発展を予防できると、多くの実験室から研究結果が提出されている。ＧＮＭＴは肝細胞におけるＳＡＭｅのレベルと密接な関連をもっており、そしてその酵素の活動がＳＡＭｅによって活性化されるかもしれないという発見により、ＧＮＭＴは肝ガンに対する科学的予防経路の過程にかかわるとも考えられる (Ｐａｓｃａｌｅ ｅｔ ａｌ., Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., １３:１３４１-１３５６, １９９３) 。
【０００８】
ＧＮＭＴ発現のレベルはヒト肝細胞ガンの細胞株（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）と腫瘍組織のどちらでも減少させることできるということが発表されている (Ｌｉｕ, Ｈ. Ｈ. ｅｔ ａｌ, Ｊ. Ｂｉｏｍｅｄ. Ｓｃｉ.１０, ８７-９７, ２００３; Ｃｈｅｎ,Ｙ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ７５, ７８７-７９３, １９９８) 。人間のＧＮＭＴ遺伝子は６ｐ１２染色体領域に集中され、その多型を特徴づけられる。(Ｃｈｅｎ, Ｙ. Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６６, ４３-４７, ２０００)いくつかのヒトＧＮＭＴ遺伝子多型における遺伝子型分析は、肝細胞ガン組織のうちに３６−４７%の遺伝子マーカーが染色体欠失という現象があることを示し、(Ｔｓｅｎｇ,Ｔ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６３, ６４７-６５４, ２００３) そしてＧＮＭＴはベンゾピレン（ＢａＰ）デトックス経路にかかわり、ＧＮＭＴ発現細胞で形成するＢＰＤＥ-ＤＮＡ 付加体を減らすことが発表されている (Ｃｈｅｎ,Ｓ.Ｙ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６４, ３６１７-３６２３, ２００４) 。
【０００９】
前の研究結果は、ネズミの肝サイトゾールでマルチプロテイン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）はＡＦＢ１を化合させることができるということを指摘しています。(Ｔａｇｇａｒｔ,Ｐ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｓｏｃ. Ｅｘｐ. Ｂｉｏｌ. Ｍｅｄ. １８２, ６８-７２, １９８６) ＡＦＢ１結合にかかわる細胞質ゾルのたんぱく質は、輸送や代謝、発ガンせい性物質の作用において働く潜在力を持っている可能性がある ( Ｄｉｒｒ, Ｈ. Ｗ. ＆ Ｓｃｈａｂｏｒｔ,Ｊ.Ｃ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｉｎｔ. １４, ２９７-３０２, １９８７) 。
【発明の効果】
【００１０】
本発明はゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えを行うことによって乱されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ-ｔｙｐｅ）の表現型に相対しそのマウスの異常な肝臓機能からなる表現型が生じ、その乱される位置はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５である。
【００１１】
本発明は肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェント（ａｇｅｎｔ）をスクリーニングする方法をも提供し、それは
ａ.本発明のノックアウトマウスを提供し、
ｂ.ある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、
ｃ.そのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や非常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。
【００１２】
本発明は一組のプライマーを提供する。それは(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２ 、または (ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２である。
【００１３】
本発明はさらにＧＮＭＴノックアウトマウスにおける調節遺伝子群のデーターベースを提供する。
【００１４】
本発明は肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データーベースをも提供する。
【００１５】
本発明はさらにアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法をある患者に提供し、その患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与する。
【００１６】
本発明はアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）によって引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物を提供し、それはグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成する。
【００１７】
現在の発明において、正常細胞と腫瘍細胞におけるＧＮＭＴ遺伝子は有意差が見られることが明らかに分かる。本発明の目的は、ＧＮＭＴの遺伝子発現の相対的なレベルを測定することによって細胞の異常を見つける方法を提供することである。さらにもう一つの目的は、異常な細胞にＧＮＭＴを送ることによって細胞の異常を修正する方法を提供することである。精神活性の薬をスクリーニングするのに役立ついくつかの非人間のトランスジェニック動物モデルが提供される。そうした動物は、遺伝子組み換えＧＮＭＴ遺伝子を持っている。遺伝子における配列の改変は、削除または機能突然変異において他の喪失や、部位指定変異またはランダム変異によるヌクレオチド配列の持つ外来遺伝子の導入、ほかの種からの外来遺伝子の導入またはそれらの組合せなどが含まれます。遺伝子改変が行われたトランスジェニック動物はホモ接合性あるいはヘテロ接合性の可能性がある。
【００１８】
ＧＮＭＴは、ＡＦＢ１処理の後で核移動を経る。本発明のテスト結果によると、ＡＦＢ１はＳＡＭｅと同じ結合部位を争ってＧＮＭＴと結合することである。ＧＮＭＴはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らしＡＦＢ１処理を受けている細胞の生存率を促進することによってＡＦＢ１に誘発された細胞毒性を拮抗するという考えが実証された。最後に、ＧＮＭＴトランスジェニックマウスモデルより発見された結果は、ＧＮＭＴの過剰発現はＡＦＢ１に誘発された原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）に対して保護効果があるということが示されている。
【００１９】
本発明は、患者にアフラトキシンＢ１に起因する病気を治療するか予防する方法を提供する。それは効果的量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）やＧＮＭＴを含んでいるプラスミドを患者に投与することから成る。
【００２０】
好適な実施例において、その病気は原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）となっている。
【００２１】
現在の方法では、処置または予防は、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を妨害することによってなされる。
【００２２】
遺伝子治療において、プラスミドはプラスミドワクチンとして見なすことができ、遺伝子治療における現在の技術によって患者の体に直接施されることができる。
【００２３】
本発明は、ゲノムの混乱がｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓにおけるＳＥＱの５４７-４８７５でＮｏ.８を確認することから発見したマウスの異常な肝機能から成立し、野生のタイプ表現型と比較して、表現型を生じるためにＧｌｙｃｉｎｅ Ｎ-メチル基転移酵素（ＧＮＭＴ）遺伝子座位を組み換えによって崩壊するノックアウトｍｏｕｃｅを提供する。
【００２４】
本発明はゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えによって崩壊されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ-ｔｙｐｅ）の表現型に相対し例のマウスの肝臓機能の異常からなる表現型が生じ、その崩壊はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５で起こる。
【００２５】
特に、ヌクレオチドはＧＮＭＴエクソン１-４とエクソン５の一部分である。グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ活性の欠如の表現型は、野生型の表現型に相対して成熟したグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼの減少した量はその原因だと考えられる。
ノックアウトマウスの準備において、グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ遺伝子はヘテロローガスヌクレオチド配列（例えばネオマイシン）との組み換えによって崩壊される。
【００２６】
その中で「異常な肝機能」という用語は制限されないが、Ｓ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇を含む。
【００２７】
トランスジェニック動物
ここで使われている「導入遺伝子」という用語は、哺乳類の細胞（特に生きている動物の哺乳動物細胞株）のゲノムに遺伝物質を人工的に挿入されたか挿入されようとしていることを説明する。導入遺伝子は細胞を変えるのに用いられる。それは、外来ＤＮＡの編入に次いで細胞における遺伝子の永遠的なものであるか一時的な変化（望ましくは永遠的なものの遺伝子変化）が誘発されるということを意味している。永遠的なものの遺伝子変化は、通常、細胞のゲノムにＤＮＡの導入によって成し遂げられる。安定した統合を備えるベクターは、プラスミド、レトロウイルスと他の動物ウイルス、ＹＡＣｓなどを含みます。興味があるのはトランスジェニック哺乳類（例えば牛やブタ、ヤギ、馬など）、特に齧歯動物（例えばネズミ、マウスなど）である。
【００２８】
トランスジェニック動物は染色体外遺伝因子として呈すか、その細胞、特に生殖細胞の全部または一部に安定的に結合される外来の核酸配列を包含します。明記しない限り、トランスジェニック動物は生殖系細胞系の細胞群が安定した変化を包含することが仮定される。その動物が最初に構成されている間、細胞のサブセットだけは変えられたゲノムを持っている「キメラ」または「キメラ動物」は生み出される。キメラは主に繁殖目的で使われます。それによって望ましいトランスジェニック動物が生み出される。ヘテロ接合性の変異がある動物はキメラの繁殖によって生み出される。雄と雌のヘテロ接合体は一般的にホモ接合性の動物を生み出すように繁殖される。トランスジェニック動物は２つのグループに分類され、口語で「ノックアウト」と「ノックイン」と呼ばれる。本発明では、ノックアウトは内在性ＧＮＭＴ遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が部分的であるか完全な機能損失を持っている。ノックインは内在性遺伝子から変えられた遺伝子配列と機能を得た導入遺伝子が導入されている。その二つは結合されるかもしれないが、その場合、天然に存在する遺伝子の能力が奪われ、そして変化した遺伝子型が導入される。
【００２９】
ノックアウトにおいて、目標遺伝子発現は検知されることができないか、重要ではないことが望ましい。ＧＮＭＴ遺伝子のノックアウトとは、ＧＮＭＴ遺伝子のその機能がかなり減少されたということである。それによって、発現は検知されることができないか重要ではないレベルだけを呈している。それは様々な手段によって成し遂げられる可能性もあるが、崩壊したコーディング配列の導入、例えば一つまたは一つ以上の停止コドンの挿入やＤＮＡ断片の挿入などや、コーディング配列の削除、コーディング配列に代えて停止コドンの置換などはその例である。時には、外来の導入遺伝子配列は最終的にゲノムから削除され、変異を行う前の配列に真の変化を残す。異なるアプローチは、「ノックアウト」を達成するのに用いられると考えられる。天然の遺伝子は全部または一部の染色体削除が誘発されるかもしれないが、非コード領域（特にプロモーター領域）や、３’制御配列、エンハンサーの削除、またはＧＮＭＴ遺伝子の発見を促進する遺伝子の削除などが含まれる。機能的なノックアウトは、天然の遺伝子の発現を妨害するアンチセンス構成物の導入によっても成し遂げられる可能性がある。
【００３０】
「ノックアウト」は条件つきのノックアウトをも含む。例えば、目標遺伝子の変異は以下の状況で起こる：その動物が目標遺伝子変異を促進する物質にさらされること、目標遺伝子の位置で組み換えを促進する酵素の導入（例えばＣｒｅ-ｌｏｘシステムにおけるＣｒｅ）、または出生後に目標遺伝子変異を誘導する他の方法である。
【００３１】
目標遺伝子の「ノックイン」は、宿主細胞ゲノムに変異を与え、天然のＧＮＭＴ変えられた遺伝子の発現または機能に終わることを意味する。増加する（異所性を含む）か減少する発見は、目標遺伝子の追加したコピーの導入、または強化された内在性目標遺伝子のコピーの発見を提供する制御配列を有効に挿入するすることによって達成するとも考えられる。そうした変異は構造性的な条件つきなものと思われる。すなわち活性剤または抑制物質の存在に依存している。
【００３２】
外来遺伝子は通常ホスト動物より異なる種から得たか、さもなければそのコーディングまたは非コーディング配列が変えられる。導入された遺伝子は野生型の遺伝子や、天然に存在する多型または遺伝的に操作られた配列である可能性も考えられる。例えばコーディングまたは非コーディング領域への削除や置換、または挿入が行われるということである。導入された配列は、ＧＮＭＴポリペプチドをエンコードするとも考えられる。導入された遺伝子がコーディング配列である場合、それは通常、プロモーター（それは構成性的または誘導可能であるとも考えられる）やホスト動物の発現において必要である他の制御配列に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。“作動可能に連結(ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ)”されると言うことは適切な分子（例えば転写活性化タンパク質）が制御配列に結合される時、ＤＮＡ配列と制御配列が遺伝子発現を可能にする方式で連結されたということである。
【００３３】
興味があるがそれに制限していない特定の構築物は、アンチセンスＧＮＭＴ遺伝子を含んでいる。アンチセンスＧＮＭＴ遺伝子は天然のＧＮＭＴ発現と優性阻害ＧＮＭＴ突然変異の発見、ＧＮＭＴ遺伝子の過剰発現を妨げるものです。検知されることができるマーカー、例えばｌａｃ Ｚはその遺伝子座（そこで発見の増加 (ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)は簡単に検知された表現型の変化に終わる）に導入する可能性がある。
【００３４】
ＧＮＭＴ遺伝子で一連の小さな削除と／または置換がされると考えられる。それによって、ＤＮＡ結合で異なるエクソンの役割や転写調節などを決定する。細胞におけるＧＮＭＴタンパク質の発見を提供する（さもなければ、その細胞は正常に生み出されない）ことによって、細胞の行為の変化が誘発されることができる。
【００３５】
相同的組換え用のＤＮＡ構築物は、少なくとも一部の望ましい遺伝子改変があるＧＮＭＴ遺伝子を含んで、そして目標遺伝子座にホモロジーのある領域をも含んでいる。ランダムな統合用のＤＮＡ構築物は、組み換えを伝達するのにホモロジーのある領域を含む必要はない。便利なのは、正と負の選択用のマーカーは含まれる。目標とされている遺伝子改変のある細胞を相同的組換えを通して生み出す方法は技術（ａｒｔ）において知られている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を得るために、ＥＳ細胞系は使用されるか、あるいは、胚細胞は新たにホスト（例えばマウス、ネズミ、モルモットなど）から得られるとも考えられる。
【００３６】
そのような細胞は適当な線維芽細胞層で発育するか、適当な成長因子（例えば白血病抑制因子（ＬＩＦ））が存在している時に発育する。ＥＳ細胞は性質転換されたとき、トランスジェニック動物を産むのに用いられる可能性もある。性質転換の後、そうした細胞は適切な培地でフィーダー細胞層の上にメッキをされる。その構築物を含んでいる細胞は、選択的な培地を使用することによって検知されるとも考えられる。コロニーは発育に十分な時間を経た後、選ばれて相同的組換えや構築物の統合の発生について分析されます。そうしたコロニーは陽性である場合、それから胚操作と胚盤胞注入において使われる可能性も考えられる。胚盤胞は生後４〜６週間目の過剰排卵する雌から得られるものである。ＥＳ細胞はトリプシン処理され、そして、その改変された細胞は胚盤胞の割腔に注入される。注入の後、胚盤胞はそれぞれ偽妊娠の雌の子宮角に戻される。雌はその後、妊娠期間に入り、産まれた一腹の子が構築物を持っている変異細胞がスクリーンされる。胚盤胞とＥＳ細胞の異なる表現型に備えることによって、キメラの後代検定は、すぐに探知されることができる。
【００３７】
したがって、本発明は本発明のノックマウスから備えられた細胞または細胞株を提供する。好適な実施例において、細胞または細胞株は幹細胞、ＥＳ細胞卵母細胞と胚細胞を含めているグループから選ばれる未分化細胞である。
【００３８】
キメラ動物は改変された遺伝子の有無についてスクリーニングされ、そして改変されている雌および雄が交尾することによってホモ接合性の妊娠が生じます。もしその遺伝子変異は開発においてある程度で致死性を引き起こすならば、組織または臓器は同種異系間やコンジェニック系統における移植や移植片として、または試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養において維持されてもよいと考えられる。
【００３９】
関心のゲノム配列は、リストアップされた配列の間で定められ、開始コドンと停止コドンの間で存在している核酸から成り、そして通常天然の染色体で存在する全てのイントロンを含みます。それは更に成熟したｍＲＮＡで見つけた３'と ５'ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）を含む可能性も考えられる。それは、特定の転写制御配列や翻訳制御配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど）、そして転写領域の５'または３'端のどちらにおいて１ｋｂ（より多い可能性がある）のフランキングゲノムＤＮＡを更に含むものとも考えられる。そのゲノムＤＮＡは１００ｋｂｐやより小さい断片として隔離され、非常なフランキング染色体配列を持っていないと考えられる。
【００４０】
薬物をスクリーニングする分析評価
本発明はさらに肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェントをスクリーニングする方法をも提供し、それは
ａ.本発明のノックアウトマウスを提供し、
ｂ.ある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、
ｃ.そのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や異常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。
【００４１】
そこから派生された被験者のトランスジェニック動物または細胞を用いることにより、ＧＮＭＴポリペプチドと結合するか、それを調整するか、拮抗するか、苦しませるリガンドまたはサブストレートを識別することができる。そうしたポリペプチドに対して効果の思わしくない薬をスクリーニングすることにも関心がある。ヒト細胞に低い毒性を持つ薬品のスクリーニング評価について、特に興味があるものと思われる。
【００４２】
多種多様な分析評価はその目的のために使われる可能性もあるが、生体内の行動研究や、投与後に薬剤の局在の識別、標識された試験管内のタンパク質-タンパク質結合の分析評価、タンパク質-ＤＮＡ結合の分析評価、ゲルシフト法、タンパク質結合の免疫測定法などを含んでいる。特定の分析評価に従い、全動物、あるいはそこから派生された細胞が使われるかもしれません。細胞はある動物から新たに隔離されるかもしれないか、培養基において不死化にされるかもしれません。特に関心の細胞は、神経および脳組織を含む。
【００４３】
ここで用いられる用語「エージェント（ａｇｅｎｔ）」というのは、ＧＮＭＴポリペプチドの生物学的作用に影響を及ぼす能力を持つ分子（例えばタンパク質または医薬）のことである。
【００４４】
通常、複数の分析評価混合物は同時に異なるエージェント濃度でされることにより、そうした濃度に異なる反応を得る。一般的に、こうした濃度のうちに、１つがネガコン（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の仕組みをしており、すなわちゼロ濃度や検知のレベル以下である。
【００４５】
好適な実施例において、そのエージェントは原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）や、糖原病、肝臓形成異常または脂肪肝を予防するか、治療することに使われる。
【００４６】
候補エージェントは、一般的に有機分子（望ましくは５０以上、およそ２,５００未満のダルトンの分子量を有する小さな有機化合物）であるが、多数の化学的な種類（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓｅｓ）がある。候補エージェントはタンパク質（特に水素結合）と構造的な相互作用に必要な官能基から成り、一般的に少なくともアミン、またはカルボニル、水酸基、カルボキシル基それぞれ一つ持っており、望ましくはそうした化学の官能基のうちに、少なくとも２つを持つ。候補エージェントはしばしば周期的な炭素または複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含み、上記の官能基の一つまたは一つ以上の代用をする。候補エージェントは、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、派生物、構造類似物またはその組合せといった生体分子の間で発見されるが、それに制限してはいない。
【００４７】
候補エージェントは、合成であるか天然合成物のライブラリを含む多種多様な源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物と生体分子におけるランダムで誘導された合成（ランダム化されたオリゴヌクレオチドとオリゴペプチドの発現を含む）に使えるいくつかの手段が考えられる。あるいは、細菌や菌類、植物、そして動物性抽出物の形として天然合成物のライブラリは、入手するか、すぐに生産される。その上、自然であるか総合的に生産されたライブラリと合成物は、従来の化学的や、物理的で、生化学的手段を通してすぐに改変されて、そして組合せライブラリを作成するのに用いられる可能性も考えられる。既知の薬理学的エージェントは構造類似物を生じるが、誘導された、又はランダムな化学改変、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎなどを受けるものとも考えられる。
【００４８】
スクリーニングは既知の薬理活性化合物とその化学類似物に向けられると考えられる。既知の肝ガンに対する制ガン剤または肝病気に対する薬の中で、非常に抑制作用（ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）のある薬物に特に興味がる。
【００４９】
ノックアウトマウスを準備するために、本発明は一対のプライマーをも提供する。それは(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２または(ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ３と４である。
【００５０】
本発明は、上流にある調整遺伝子（ｕｐ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）と下流にある調節遺伝子（ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）を研究するために、ＧＮＭＴノックアウトマウスにおける調節遺伝子のデータベースを更なる提供する。
【００５１】
更なる本発明は、肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベースを提供し、それは
(a) 生存と増殖：ＰＴＥＮ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ １、ＧＳＫ３βまたはβ-カテニン
(b) ガン遺伝子：サイクリンＤ１、Ｃ-ｍｙｃまたはＣ-ジュン;そして、
(c) 腫瘍抑制遺伝子：Ｒｂまたはｐ５３。
からなる。
【００５２】
本発明はアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物をも提供し、それはグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成する。好適な実施例において、ＧＮＭＴは二量体形成であるか四量体形成である。
【００５３】
本発明の組み合わせは、主食作物（例えば米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなど）の補助的な添加物として適用されることができる。
【００５４】
本発明は特定の方法論や、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物、記述された試薬に限られていないことは理解すべきである。そうしたものは、もちろん、変化させる可能性がある。もう一つ理解すべきことは、ここで使用される用語が特定の実施例を説明するという目的だけで使われ、本発明の範囲を制限しようとするのはその目的ではないということである。本発明は、添付した特許請求の範囲だけによって制限されるのである。
【００５５】
本記載にあるものと添付した特許請求の範囲において使われているように、単数形と、「と」、「その」といった言葉は複数の指示物を含み、又は、その文脈が明確に指摘するので、その点にも注意しなければならない。
【００５６】
特に定義しない限り、ここで使用されるすべての専門的で科学的な用語は、本発明の属する技術（ａｒｔ）範囲における関連的技能を身につける人が理解しているのと同じ意味を持っている。ここに記述されている方法や装置、材料と類似したまたは同等したものは、すべて本発明の実施（ｐｒａｃｔｉｃｅ）またはテスト（ｔｅｓｔ）において使われることができるが、現在説明するのは、望ましい方法や装置、材料である。
【００５７】
ここに言及したすべての出版物は、細胞株や構築物、本発明に適用されるかもしれないそうした出版物で記述される方法といった例を、記述し明らかにする目的で言及した。上記に言及された、そして全篇のテキストを貫くそうした出版物は、本発明の出願年月日の前に発表されることだけで言及する。先行発明によって発明者がそのような発表に先だつ権利を許可されないものと解釈されるものではない。
【００５８】
以下の実施例は関連する技術を身につけた者たちに本発明の製作および応用について全面的な説明を提供するために挙げられる。本発明の範囲を制限することを目的とはしない。使われる数（例えば総計や温度、濃度など）に関して正確さを確保しようという努力はされたが、若干の実験誤差と逸脱は許容できる。特に指摘しない限り、パーセント(百分比)は重量百分比のことで、分子量は平均分子量、温度は摂氏の温度で、そして圧力は気圧を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
目標ベクターを構築するために、ラムダ（λ）ファージクローン３-２と５-３に代謝されるＤＮＡ断片は、プラスミド-ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ＩＩ ＫＳに挿入されました。左アーム（ｌｅｆｔ ａｒｍ）はＰｓｔ Ｉを用いてファージクローン５-３から代謝され、ｐＮｅｏベクターに挿入された。右アーム（ｒｉｇｈｔ ａｒｍ）はＨｉｎｃ ＩＩを用いてファージクローン３-２から代謝され、ＴＫベクターに挿入された。右アームとＴＫ遺伝子を含んでいる断片がＮｏｔ Ｉを用いて代謝され、左アームを含んでいるｐＮｅｏベクターに挿入されるこのによって目標ベクターを生み出す（図１）。
【００６０】
（マウスＧＮＭＴ遺伝子のエクソン １-４およびエクソン５の一部分を入れ替える）ネオマイシン遺伝子は、目標ベクターで２つのＤＮＡ断片（３.１ｋｂと３.７ｋｂ）に挟まれる。チミジンキナーゼ遺伝子が負の選択マーカーとして使われた。（図２Ａ）４０μｇ目標ベクターは、ＡｓｃＩを用いて線形化され、エレクトロポーレーションによってＥＳ細胞（１２９/Ｓｖ-派生系）に導入された。サザンブロット分析を使って２７８個のクローンをスクリーニングした後（図２Ｂ）、組み換えクローンが隔離されマイクロインジェクション法によって胚盤細胞に注入された。そのため４匹の雄キメラマウスは生み出され、雌Ｃ５７ＢＬ/６マウスを育てるのに用いられた。アグーチ（Ａｇｏｕｔｉ）のＦ１世代は崩壊された対立遺伝子における生殖細胞系の伝送（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が検知されるために、ＰＣＲが用いられた。ヘテロ接合性のＦ１雄マウスが雌の野生型Ｃ５７Ｂ/６マウスと戻り交配されて、Ｃ５７ＢＬ/６ゲノム遺伝的背景を持つマウス（Ｃ５７ＢＬ/６ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｍｉｃｅ）を生み出します。ＰＣＲは、野生型（+/+）とＧＮＭＴヘテロ接合性（+/-）、ＧＮＭＴ-/-マウスを区別するために用いられ、下記のプライマーが使用された：
ＧＮＭＴにおいて
ＧＮＭＴ-Ｆ（５'-ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ）とＧＮＭＴ-Ｒ（５'-ＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡＧＣ）;
ネオマイシンにおいて
ネオマイシンＦ（５'-ＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴ）とネオマイシンＲ（５'-ＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣ）。
正常のＧＮＭＴ対立遺伝子はそうしたＧＮＭＴプライマーにより７７２ｂｐ断片を生じ、そして崩壊された対立遺伝子はそうしたネオマイシンプライマーにより４０９ｂｐ断片を生じた。（図２Ｃ）肝臓におけるＧＮＭＴタンパク質の発現は、サザンブロット分析で分析された; その結果が示したように、野生型と比較したら、ＧＮＭＴ+/-マウスは肝臓におけるＧＮＭＴ発現がおよそ５０%が減って、ＧＮＭＴ-/-マウスはその肝臓でＧＮＭＴが検知されることができなかった。（図２Ｄ）
【００６１】
生後１１週間で、雄と雌の野生型とＧＮＭＴ+/-、ＧＮＭＴ-/-マウス（組ごとに６匹やそれ以上のマウス）は表現型分析のために犠牲になった。ＳＡＭｅとＳＡＨ濃度は、ＨＰＬＣを用いて検知された。同性の野生型マウスに比べると、ＧＮＭＴ-/-マウスは雄とも雌ともＳＡＭｅの肝臓濃度がかなり増えた(ｐ＜０.０５)。対照的に、ＧＮＭＴ+/-マウスにおけるＳＡＭｅの肝臓濃度は野生型マウスより２.８倍低くて（表１）、そして雄と雌のＧＮＭＴ-/-マウスにおけるＳＡＨの肝臓濃度は野生型マウスと類似している。したがって、ＳＡＭｅ/ＳＡＨの比率は雄と雌のＧＮＭＴ-/-マウスにおいてそれぞれ４２と６７倍増えた（表１）。ホモシステインレベルは、そうした異なるマウスグループで不変のままだった。メチオニンレベルは、ＧＮＭＴ-/-マウスにおいて野生型マウスよりその量が１.９〜２.４倍多かった（表１）。
【００６２】
表１ 野生型とＧＮＭＴ欠損マウスにおける、肝臓でのＳＡＭｅとＳＡＨ濃度および血清ホモシステインとメチオニン濃度である。
野生型肝腫瘍形成ＧＮＭＴ-/-マウスの研究で、表現型ＧＮＭＴ-/-マウスは１２週目まで隔週ごとに磁気共鳴画像とソノグラムを使って追跡した。その結果は７匹の雌ＧＮＭＴ-/-マウスのうち７匹の腫瘍が０.５ｍｍ以上成長したＨＣＣ、これは１６.１ヶ月目のものと意味する。対照的に、我々が２１ヶ月６匹の雄ＧＮＭＴ-/-マウスの研究を追跡している中、一匹はＨＣＣがあり、二匹は１３ヶ月で早まって犠牲になり、他は不明確である。したがって、１４ヶ月から１５ヶ月の雌のＧＮＭＴ-/-マウスは、５０％（二分の一）がＨＣＣを持っていた。２１ヶ月から２２ヶ月で、雌のＧＮＭＴ-/-マウスの６匹のうち６匹（１００％）はＨＣＣが発達した。雄の１８ヶ月から２１ヶ月のＧＮＭＴ-/-マウスは７５％（四分の三）が肝小結節に発達があった。野生型肝腫瘍形成の雌ＧＮＭＴ-/-マウスが指し示すものは、雄のＧＮＭＴ-/-マウスよりも深刻である。一方、３７.５％（八分の三）の雌ＧＮＭＴ-/-マウスは血管腫が発達した。全ての雌ＧＮＭＴ-/-マウスが脂肪変性に変化した中、雄ＧＮＭＴ-/-マウスは三分の一だけだった。
【００６３】
表２ ＧＮＭＴ-/-マウスは生後１３-２１ヵ月目での肝腫瘍形成である。
ａ.マウスが犠牲になった年齢。
ｂ.１８ヶ月で二匹の雄の肝小結節が０.６ｃｍ以下で、一匹の雄には肝小結節がなかった。
ｃ.二匹のマウスは軟弱過ぎたため、肝小結節を持たなかった。
ｄ.このマウスは麻酔処置によって犠牲になった。
ｅ.２１ヶ月で、肝臓にある小結節が超音波によって検出された。
ｆ.１８ヶ月で小結節は検出されなかった。
ｇ.１８ヶ月で０.５ｃｍの小結節が検出された。
ｈ.該当なし。
【００６４】
マイクロアレイ分析は、ＧＮＭＴノックアウトマウスと野生型マウスと代謝の違いを観察するのに適用された。野生型と比較したら、ｍＲＮＡレベルにおいて雌のＧＮＭＴ欠損マウスは１８９６個の遺伝子がかなり増加し、雄のＧＮＭＴ 欠損マウスは２４２９個の遺伝子がかなり増加した。そうした遺伝子のうち、それぞれ二倍以上変化した５４３個と８４３個の遺伝子は、更なる機能分析のために選ばれた。我々は、ＣｒｏｓｓＰａｔｈプログラム（ｈｔｔｐ://ｉｂｓ.ｓｉｎｉｃａ.ｅｄｕ.ｔｗ/ｃｒｏｓｓｐａｔｈ/）を使い、ＫＥＧＧ経路データベースに基づいてそれらの遺伝子を機能によって分類した。表３と表４は、発現量の異なる遺伝子は発現量が二倍または二倍以上増加しているのが所定の経路で分類された機能的な経路を示した。それによって、雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおいて主な経路増加はＰＰＡＲシグナル伝達経路および細胞周期で起こるものである。そのうえ、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）-サイトカイン受容体へのインタラクション及びＭＡＰＫシグナル経路は、雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおいて減少した。表５は、リアルタイム定量ＰＣＲ法によってＧＮＭＴ-/-マウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルｖｓ.同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのｍＲＮＡ発現レベルの比率が測られることを示している。その結果は、ＧＮＭＴ-/-マウスにおいていくつかの生存と増殖に関わる遺伝子はかなり減少し、そして三つのガン遺伝子は増加したことを示している。
【００６５】
表３-１ ＫＥＧＧ経路データベースによる生後１１週間での雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおける調節遺伝子の機能的分類である。
* ＧＮＭＴ欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６６】
表３-２. 生後１４-１８ヵ月目でＫＥＧＧ経路データベースによって機能的な分類をした雌と雄ＧＮＭＴ-/-マウスにおける腫瘍と腫瘍に隣接した組織の調節遺伝子個数である。
* ＧＮＭＴ-/-マウスにおいて腫瘍と腫瘍に隣接した組織と発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６７】
表４ ＫＥＧＧ経路データベースによる雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおける下流にある調節遺伝子（ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ）の機能的分類である。
* ＧＮＭＴ欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６８】
表５ リアルタイム定量ＰＣＲ法によってＧＮＭＴ-/-マウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルｖｓ.同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのｍＲＮＡ発現レベルの比率が測られることを示している。
ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎｈｏｍｏｌｏｇ）はガン抑制遺伝子ＰＴＥＮで、ＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３-ｋｉｎａｓｅ）はホスファチジルイノシトール３-キナーゼで、ＧＳＫ３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）はグリコーゲンシンターゼキナーゼで、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）は網膜芽腫で、Ｔは腫瘍状組織で、ＴＡは腫瘍に隣接した組織で、ＫＯはＧＮＭＴ-/-マウスで、ＷＴは野生型のマウスである。
ａ.生後１１週間でＧＮＭＴ-/-マウス対野生型のマウスの遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ｂ.腫瘍に隣接した組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ｃ.腫瘍状組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ＧＮＭＴ-/-マウスモデルがより発ガン物質に影響されやすいことを証明するために、マウスらに対してアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）を用いてテストした。ＡＦＢ１は、以下の剤量で腹膜内に二回投与された：生後七日目で体重一グラム当たり１０ｕｇで、生後九週間で体重一グラム当たり４０ｕｇである。ＡＦＢ１で処置されたすべて（５/５）の雌および５７.１%（４/７）の雄ＧＮＭＴ -/-マウスには肝臓結節が検知されたが、ＡＦＢ１で処置された野生型のマウスも溶媒（トリカプリリン、ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）で処置された他のグループも生後１３-１４ヵ月目でまだ肝腫瘍が起こることはないと、その結果は示している(表６)。
【００６９】
表６ 生後１３ヵ月目でそれぞれ溶媒またはＡＦＢ１で処置された２匹の遺伝子型マウス（ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｍｉｃｅ）の肝腫瘍形成である。
ＨＥ染色でマウス肝臓部の組織薄片を見たら、ＡＦＢ１で処置された野生型のマウスは異常が現れなかったが、ＡＦＢ１で処置された雄のＧＮＭＴ-/-マウスにはデイスプラジア結節や早期ＨＣＣ、脂肪結節が検知され（図９ＡとＢ）、そして雌のＧＮＭＴ-/-マウスには硬化性ＨＣＣ（Ｓｃｌｅｎｏｓｉｎｇ ＨＣＣ）や限局性脂肪沈着におけるデイスプラジア結節が検知された（図９ＣとＤ）。
【００７０】
材料と方法：細胞培養および処置
肝臓ガン細胞株［ＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ］はＷａｘｍａｎ,Ｄ.Ｊ. ＆ Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ,Ｃ. Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｘ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０, ２６１３ (２００６)によって作製されたもので、ヒト肝芽腫細胞株-ＨｅｐＧ２から取り出された安定発現クローンは、Ｍｏｄｅ,Ａ. ＆ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ,Ｊ.Ａ. Ｓｅｘ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ−Ａ Ｊｏｕｒｎｅｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｆｉｖｅ Ｄｅｃａｄｅｓ. Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８, １９７-２０７ (２００６)に基づいて作製されたものである。Ｃｈｅｎ, Ｓ.Ｙ. ｅｔ ａｌ. Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｎｚｏ(ａ)ｐｙｒｅｎｅ-ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６４, ３６１７-３６２３ (２００４)といった論文で述べた［ＳＣＧ２］は、この実施例でも使われています。本発明で使われる細胞は、１０%のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、特殊血清）を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）(ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ, Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, ＮＹ)で維持された。ＡＦＢ１はＤＭＳＯで溶解され、処置が培養基において行われた。
【００７１】
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡
培養されたＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ細胞はカバースリップの上に置かれて２０ mＭ のＡＦＢ１または０.１% のＤＭＳＯで三時間処置された後、４%のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ, ｐＨ ７.４）（溶液Ｉ）によって室温で２０分固定された。そうした細胞は透過溶液（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（定着液Ｉに０.５%のトリトンＸ-１００を加えたもの）の中で室温で５分培養された後、そのカバースリップはブロッキング液(５%ＢＳＡ 加 ＰＢＳ)とともに室温で一時間インキュベート（保温）され、そしてウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清（１:２００）とともにもう一時間インキュベートされた。ＦＩＴＣ（蛍光色素）を共役しているヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が第二の抗体として使われた。核はヘキスト３３２５８（シグマアルドリッチ）で対比染色された。共焦点顕微鏡は、オリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗアルゴンとクリプトンスキャニングレーザーシステムと、Ｆｌｕｏｖｉｅｗイメージ分析ソフトウェア(Ｏｌｙｍｐｕｓ, Ｍｅｌｖｉｌｌｅ, ＮＹ)といった装備を整えているオリンパスＩＸ７０倒置蛍光顕微鏡を用いて実行された。
【００７２】
ＬＧＡドッキング
ＬＧＡがＡＦＢ１といろいろな形のＧＮＭＴとのインタラクションサイトを解明するのに用いられた。ソフトウェアのＡｕｔｏｄｏｃｋ ３.０が最も良いリガンド結合インタラクションを確認するのに使われた。前述のとおり、ネズミＧＮＭＴからのＸ線結晶学データがドッキングという目的に使われたのは、ネズミＧＮＭＴおよび人間のＧＮＭＴはアミノ酸配列で９１%のホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有しているからである。(Ｐａｋｈｏｍｏｖａ,Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５７, ３３１-３３７, ２００４) パラメータは、１０ ｒｕｎと５０の集団サイズ、２７,０００世代または２.５×１０５のエネルギー評価に達する停止基準を含んでいる（先に出るのはどちらでも可能）。二乗平均平方根偏差の群集構造（Ａ ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）の許容偏差値０.５ Aはリガンドの結晶座標から計算されたものである。手続きの詳細は前のレポートを参照。(Ｍｏｒｒｉｓ ＧＭ ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ １９, １６３９-１６６２, １９９８)
【００７３】
細胞毒性評価
ＭＴＴ分析評価は、ＡＦＢ１の細胞毒性効果を決めるのに用いられた。省略して表現すると、細胞は９６穴プレートに播かれて培養されている。評価の時点において、培養液は１０ mＬのＭＴＴ貯蔵液（５ｍｇ/ｍＬ）を含んでいる１００mＬの新鮮液に穴ずつ替えられた。ＭＴＴで４時間細胞にラベルをつけたら、その新鮮液は穴ずつ１００ mＬのＤＭＳＯに３７°Ｃで１０分替えられた。そのような試料を混合し５４０ｎＭで吸光度を測定した。半數致死濃度（ＬＣ５０）の測定に、７０００個のＨｕＨ-７細胞は９６穴プレートに播き１８時間培養した。細胞はそれぞれ異なる濃度のＡＦＢ１で処置され、そしてＭＴＴ分析評価は一連の時点において一組ごとに三回実行された。生存率は、実験群におけるＯＤ値割る溶媒対照群におけるＯＤ値によって計算される。そういった細胞毒性評価を行うために、５０００個のＨｕＨ-７細胞は異なる量のアデノウイルスまたはＧＮＭＴ ｃＤＮＡを有するレンチウイルスに８時間感染してから、その培養液を替えまた１０時間培養される。７２時間のＡＦＢ１処置の後、ＭＴＴ分析評価は生存率を測定するのに実行された。
【００７４】
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体は競合 ＥＬＩＳＡ 法で測量
ＧＮＭＴの保護効果を評価するために、安定ＳＣＧ２-１-１細胞クローンまたはＧＮＭＴ組み換えアデノウイルス(Ａｄ-ＧＮＭＴ)に感染したＨｅｐＧ２細胞は一晩中１０ｃｍのペトリ皿で培養され、ＡＦＢ１または０.１%のＤＭＳＯで１６時間処理されて、それからＤＮＡ抽出が行われた。すべての試料は、すべての開環型付加体（ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ ｒｉｎｇ-ｏｐｅｎｅｄ ｆｏｒｍ）の中和を確実にするために、１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３と３０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ ９.６）で３７°Ｃで二時間処置された。Ｈｓｉｅｈ,Ｌ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１-ＤＮＡ ａｄｄｕｃｔｓ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４８, ６３２８-６３３１ (１９８８)という論文で述べてられているように、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体レベルは６Ａ１０抗体を使っている競合ＥＬＩＳＡ法で測定された。各々のＥＬＩＳＡ分析は三回実行された。吸光度なら４９０ｎＭで測定した。
【００７５】
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴトランスジェニックの構築
我々は肝臓と腎臓に特異的なトランスジェニックベクターであるｐＰＥＰＣＫｅｘを使用しました。それはマウスホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(ＰＥＰＣＫ; Ｖａｌｅｒａ,Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ９１, ９１５１-９１５４, １９９４) プロモーターと、０.３ｋｂの合成イントロン（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｔｒｏｎ）、０.６ｋｂのヒト成長ホルモンポリＡシグナル（Ｐｏｌｙ Ａ Ｓｉｇｎａｌ）を含む。ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴトランスジェニックプラスミドは、１.２ｋｂのヒトＧＮＭＴ ｃＤＮＡ (９-１-２ プラスミドより; Ｃｈｅｎ,Ｙ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ７５, ７８７-７９３, １９９８) をｐＰＥＰＣＫｅｘベクターにおける制限酵素サイトであるＮｏｔＩとＸｈｏＩに挿入することによって構築された。ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドをＡｓｃＩで制限酵素消化後の線形４.３ｋｂの断片はマイクロインジェクション法において使われた。
【００７６】
ＧＮＭＴ ＴＧマウスの生成
ＧＮＭＴ ＴＧマウスはＦＶＢ受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出され、特定病原フリー（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）の施設で育てられた。それらの尾は生後３週間での離乳期で切られた。ゲノムＤＮＡは、プロテイナーゼＫ(ＰＫ)とドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を組み合わせた前処理法（Ｐｒｏｍａｇａ）、そしてフェノール/クロロホルム抽出法によって単離された。そして、そうしたＴＧマウスの遺伝子型はＰＣＲで測定された。ＧＮＭＴ-ＴＧを見つけるために、６６８-ｂｐのヒトＧＮＭＴ特異的なＤＮＡ断片はＰＣＲプローブによって９４℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（１分）といったサイクル条件でプライマーのＧＮＭＴ-Ｆ ５’- ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ-３’およびＧＮＭＴ-Ｒ ５’- ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ-３’を用いて３０サイクルで増幅された。
【００７７】
大量のＡＦＢ１ の投与
本発明で使われるＡＦＢ１(Ｓｉｇｍａ Ｃｏ, Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ) は濃度０.２ｍｇ/ｍＬのトリカプリリン（Ｓｉｇｍａ）に溶かされたものである。生後７日目に各グループの６匹以上のマウスは腹膜内にアフラトキシンＢ１を注射し（ＡＦＢ１ １０ｍｇ/ｋｇ体重）、そして２ヵ月後同じ投与量を追加した。そのプロトコルは前にＧｈｅｂｒａｎｉｏｕｓとＳｅｌｌによって修正された(Ｇｈｅｂｒａｎｉｏｕｓ,Ｎ. ＆ Ｓｅｌｌ,Ｓ. Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７, ３８３-３９１,１９９８)。注射後９ヵ月で、そうしたマウスは病理検査のために犠牲になった。病理組織検査のために、器官（肝臓と肺、腎臓を含む）の５分の２は１０%のホルマリンで固定され；残りの器官はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションやＤＮＡとＲＮＡ、タンパク質分析のため、-８０℃で保存された。
【００７８】
ＲＮＡ分析
メーカーの指示に従い、全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ)によって凍った組織から抽出された。全ＲＮＡ試料のための量は分光光度計で定量化された。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは前述の通りに実行された。ｃＤＮＡプローブはプラスミド９-１-２におけるヒトＧＮＭＴ遺伝子によって作製され、相補的ＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ-Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて肝臓ＲＮＡ（２mｇ）から作り出された。ＧＮＭＴのためのプライマー配列はＦ１: ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣとＲ１: ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣで、β-アクチンのためのプライマー配列はＦ２: ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡとＲ２: ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣである。ＰＣＲ条件は下記の通りである：９４°Ｃで５分間のプレ変性（ｐｒｅ-ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、９４℃（３０秒）と６０℃（３０秒）、７２℃（１分）で３０サイクルの増幅に次いで７２°Ｃで１０分の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行った。
【００７９】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を実行するために、１０μｇの全部の肝臓タンパク質抽出物は１０%のＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離され、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜(ＰＶＤＦ; Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ, Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ, ＮＪ)に転写された。その手順はＷａｘｍａｎ,Ｄ.Ｊ. ＆ Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ,Ｃ. Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｘ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０, ２６１３ (２００６) に記述してある。その分析において、マウス抗ＧＮＭＴ単クローン性抗体（ｍＡＢ）１４-１はＧＮＭＴ２０を検出するのに用いられた。
【００８０】
ＧＮＭＴ酵素活性分析
この分析はＣｏｏｋ,Ｒ.Ｊ. ＆ Ｗａｇｎｅｒ,Ｃ. Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ａ ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌ. Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８１, ３６３１-３６３４ (１９８４)という論文で述べてある手順によって修正されたものである。それはＧＮＭＴ-ＴＧマウスから採った肝臓組織のＧＮＭＴ酵素活性を測るのに用いられた。一部分の肝臓は０.２５Ｍの蔗糖と１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのアジ化ナトリウム、そして０.１ｍＭのｐｈｅｎｙｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｏｕｒｉｄｅを含んでいる３倍容量の氷冷リン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ ７.０）によって均質化された。３０分間２０,０００Ｘ ｇで遠心分離された後、産物として生じた上清液は取り除かれ、２-メルカプトエタノールは最終濃度１０ｍＭに加えられる。タンパク質の濃度を測ったら、２５０ｕｇのタンパク質は１００ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ ７.４）と５０ｍＭのグリシン、０.２３ｍＭのＳＡＭｅ、そして２.１６ｕＭの Ｓ-アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］−メチオニン（Ｓ-ａｄｅｎｏｓｙｌ-Ｌ-[ｍｅｔｈｙｌ-３Ｈ]-ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）（７６.４Ｃｉ/ｍｍｏｌ）を有する１００ｕｌの反応混合物に加えられた。３７°Ｃで３０分培養した後、反応は１０％トリクロロ酢酸と５%の活性炭との混合物５０ｕｌを添加することによって終了した。各反応は三回実行される。
【００８１】
免疫組織化学的染色方法
ＧＮＭＴタンパク質に対する免疫組織化学による発現解析はモノクローナル抗体（ｍＡＢ）１４-１を１:２００希釈で使用することによって実施された。パラフィンに包埋した肝臓の部分（４ｕｍ）はＧＮＭＴ抗体とともに培養され、メーカーの指示に従いＤＡＢキット（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で検出した。
【００８２】
ＡＦＢ１によって誘発されるＧＮＭＴ核転座である
ＧＮＭＴ ｃＤＮＡはＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ細胞にＡＦＢ１またはＤＭＳＯ（溶媒対照）を１６時間トランスフェクトした。（図１０ＡとＢ）図１０で示すように、ＧＮＭＴ分布は最初に細胞質に制限された（図１０Ａ）が、ＡＦＢ１処置（図１０Ｂ）の後で、細胞核に部分的に転位した。そうした結果は、ＡＦＢ１（およびＢａＰ）がＧＮＭＴ核転座を誘発することを示した。
【００８３】
また、それはＡＦＢ１で処置した細胞中でＧＮＭＴに核転座が生じたことを証明し、ＧＮＭＴはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を減らす、そしてＡＦＢ１で処置した細胞の生存率を上昇させることができることを示した（図１０）。ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加物形成は肝臓発ガンに関係する(Ｂｒｅｓｓａｃ,Ｂ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２９-４３１, １９９１; Ｈｓｕ,Ｉ.Ｃ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２７-４２８, １９９１)。そして、肝細胞におけるＧＮＭＴの減少がその発ガン物質に対する肝臓の敏感性を増やすことも証明された。したがって、ＧＮＭＴはそうした環境発ガン物質に対する細胞の防衛機構に関係する。
【００８４】
ＧＮＭＴ-ＡＦＢ１インタラクションのモデリング
Ｌａｒｍａｒｃｋｉａｎ 遺伝アルゴリズム(ＬＧＡ) とＸ線結晶学データの組合せはＧＮＭＴとＡＦＢ１間の物理的インタラクションを予測するのに用いられた。ネズミＧＮＭＴタンパク質はアミノ酸配列においてヒトＧＮＭＴタンパク質と９１%のホモロジーを持っているので、我々はネズミＧＮＭＴタンパク質に対するＸ線結晶学データによりＡＦＢ１ドッキング実験が行われた。表７で示すデータによると、ＡＦＢ１はＧＮＭＴの二量体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋコード１Ｄ２Ｃ）と四量体（１Ｄ２Ｇ）形成と低い結合エネルギーレベルで（それぞれ-９.４１と-１０.０６ ｋｃａｌ/モル）結合した。
【００８５】
表７ Ｌａｒｍａｒｃｋｉａｎ 遺伝アルゴリズムを用いて行ったＧＮＭＴタンパク質とＡＦＢ１ 分子ａ間のドッキングの探索
ＡＦＢ１とＳＡＭｅ（-９.８５ｋｃａｌ/モル）に結合しないＧＮＭＴ二量体（１ＸＶＡ）間の結合エネルギーを、ＡＦＢ１とすでにＳＡＭｅ（５３.２５ｋｃａｌ/モル）に結合しているＧＮＭＴ二量体間の結合エネルギーと比較したら、その結果はＡＦＢ１はＳＡＭｅと同じ結合部位を争ってＧＮＭＴと結合することを指摘する。ＡＦＢ１分子（およびＢａＰ）はＧＮＭＴ二量体と四量体において分子配向性（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が少し違うが、分子バスケット（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｋｅｔ）内部に同じ位置にある（図１１Ａ）。ＧＮＭＴアミノ酸残基がＡＦＢ１（Ａｌａ６４とＶａｌ６９、Ｌｅｕ１３６、Ｇｌｙ１３７、Ｓｅｒ１３９）の極近くにあることは図１１Ｂに示される。
【００８６】
その実施例は(ａ) ＧＮＭＴの基質ＳＡＭｅ結合部位にＡＦＢ１結合性領域があること、そして（ｂ）ＡＦＢ１はＧＮＭＴの二量体と四量体形成の両方とも結合することを指摘する。ＧＮＭＴ四量体（１Ｄ２Ｇ）のＲ１７５Ｋ変異体形成（ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ）は、結合部位のすぐ近く（~５ A）にあるＲ/Ｋ残基がＧＮＭＴ-ＡＦＢ１集団構造（ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にほとんど効果を及ぼさないことを証明するのに用いられた（表７）。その結果は、ＧＮＭＴが分子バスケットであるという議論と一致する。この独特の構造は、ＧＮＭＴはＳＡＭｅだけでなくベンゾピレン（ＢａＰ）のような多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）分子と結合することができるという事実と一致していと考えられる。ＧＮＭＴの結晶構造により、ＧＮＭＴの活性部位の内面にある多くのチロシン残基（３３、４４、１７７、１９４、２２０、２４２、２８３）が他の残基とともに発ガン物質に相互作用している環境を提供する可能性もある。ＧＮＭＴがＡＦＢ１とも結合することができることとも思われる。
【００８７】
ＡＦＢ１によって誘発された細胞毒性はＧＮＭＴによって拮抗される
ＭＴＴ分析は細胞の生存率を判定するのに用いられた。細胞毒性分析の条件を最適化するために、ＨｕＨ-７細胞は一連の時点で異なる濃度のＡＦＢ１で処置された。図１１Ａで示すように、ＡＦＢ１の半（數）致死濃度（ＬＣ５０）は処置の持続時間によるものである。１６ mＭ に達するＡＦＢ１処置は細胞毒性効果が２４時間以内で不分明である。しかし、処置の４８時間後にＨｕＨ-７細胞は４ mＭのＡＦＢ１で処置されたグループさえ、生存率がかなり下がった。７２時間でＡＦＢ１のＬＣ５０はおよそ１２ mＭである。ＡＦＢ１処置を受けた細胞にＧＮＭＴの影響を判明するために、我々はＧＮＭＴ ｃＤＮＡを運んでいるアデノウイルスを感染させることによってＨｕＨ-７細胞内でＧＮＭＴたんぱく質を発見した。Ａｄ-ＧＦＰコントロールウイルスに感染しているＨｕＨ-７細胞と比較したら、ＡＦＢ１で処置されたＨｕＨ-７細胞の生存率は少し増加したが、Ａｄ-ＧＮＭＴを投与すればかなり増加する（図１１Ｂ）。類似した結果は、ＧＮＭＴ遺伝子がレンチウイルスベクターによって導入された別個のシステムで観察された（図１１Ｃ）。そうした結果は、ＧＮＭＴがＡＦＢ１処置によって誘導される細胞毒性効果に拮抗することができることを証明した。
【００８８】
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの抑制影響
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの影響を判明するために、我々は抗体６Ａ１０で競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を行うことによってＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を測り、ＨｅｐＧ２細胞株-ＳＣＧ２-１-１とＳＣＧ２-ｎｅｇから得る一対の安定クローンおよびＧＮＭＴ組み換えアデノウイルスに感染されたＨｅｐＧ２細胞を利用する。
【００８９】
細胞は、ＤＮＡ抽出の前にＤＭＳＯと異なる濃度のＡＦＢ１で１６時間処置されました。その間、明らかな細胞毒性効果がなかった。ＳＣＧ２-１-１細胞中のＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の量は、ＳＣＧ２-ｎｅｇ細胞中のその量のおよそ５０%になった（図１１Ｄ）。さらに、ＧＮＭＴ組み換えアデノウイルス（ａｄ-ＧＮＭＴ）の感染によるＧＮＭＴ過剰発見も、投与する方法によってＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らした（図１１Ｅ）。Ａｄ-ＧＦＰに感染された細胞と比較して、５ＭＯＩ のＡｄ-ＧＮＭＴに感染されたＨｅｐＧ２細胞は両方のＡＦＢ１濃度でも４０%を超えるＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成の減少という結果となる。５０ＭＯＩのＡｄ-ＧＮＭＴに感染されたＨｅｐＧ２細胞はＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成がおよそ７０%の減少が見られた。実験の結果は、抑制率に基づくＡＦＢ１-ＤＮＡ形成量によって計算された。それは、実験のデータにより、コントロール細胞（Ａｄ-ＧＦＰに感染されたＳＣＧ２-ｎｅｇ細胞とＨｅｐＧ２細胞）と比較して、ＧＮＭＴを発現している細胞で形成したＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の数がかなり減少したことを指摘した。それは、ＧＮＭＴにはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らすことによってＡＦＢ１処置を受けた細胞に対する保護役割があることを証明した。
【００９０】
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスの作製
生体内でＡＦＢ１によって誘発された発ガンに対するＧＮＭＴの影響を判明するために、ヒトＧＮＭＴトランスジェニックマウス（ＴＧ）モデルは作製された。ＧＮＭＴ-ＴＧマウスを生み出すのに用いられるプラスミドは図１４ａに示されたようにｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドである。それはマウスＰＥＰＣＫプロモーター（Ｖａｌｅｒａ,Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ９１, ９１５１-９１５４, １９９４）でヒトＧＮＭＴ発現を駆動することができる。ＧＮＭＴ-ＴＧマウスはＦＶＢ受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出された。ノーザンブロット解析法は、ヒトＧＮＭＴが予想の通り、特にマウスの肝臓と腎臓で発見することを証明した（図１４Ｂ）。
【００９１】
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスのＧＮＭＴの発見プロフィールは、ＲＴ-ＰＣＲ法およびウエスタンブロット分析で測定されました。図１２Ａで示すように、野生型マウスは年齢増加とともにＧＮＭＴのｍＲＮＡ表現レベルが増加し、生後７週間でプラトーに達した。特に一週目と３週目の時点で、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスは野生型マウスよりＧＮＭＴ ｍＲＮＡの遺伝子発現レベルが高かった。そのうえ、ウエスタンブロット分析は示したが、生後一週間~三週間で雄の野生型マウスはＧＮＭＴのタンパク質レベルが検知することが不可能だが、生後一週間で雌の野生型マウスはＧＮＭＴのタンパク質が低い発現レベルで検知されることができる。対照的に、雄と雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは両方とも生後一週間でタンパクの量がより高かった（図１２Ａ）。そうした結果は、生後１-３週間で野生型のマウスよりＧＮＭＴ-ＴＧマウスのほうはＧＮＭＴ発現が高いことを示した。さらに、我々はＧＮＭＴ-ＴＧマウスでＧＮＭＴ酵素活性を、野生型マウスで肝臓ライセートを検知した。生後九週と１１週間でＧＮＭＴ-ＴＧマウスにおけるＧＮＭＴ酵素活性は野生型マウスよりかなり高かった（ｐ＜０.０５）が、生後九週間での雄は唯一の例外である（図１２Ｂ）。
【００９２】
その実験において、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスには特異的なダイエットが提供されなかった。特に生後一週目と３週目でＧＮＭＴ-ＴＧマウスは野生型マウスより肝臓におけるＧＮＭＴ遺伝子発見レベルが高く（図１２Ａ）、そして生後七週目でプラトーに達した。
【００９３】
ＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成はＧＮＭＴ-ＴＧマウス体内で遮断
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスは腹膜内にＡＦＢ１が投与され、生後１１ヵ月目で犠牲になった。その雄と雌のマウスのかかる肝腫瘍の全体的な発病率は表八で見られた。
【００９４】
表８ ＡＦＢ１溶媒で処置された２つの遺伝子型のマウスにおける肝腫瘍形成。
ＡＦＢ１で処置された雄と雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは両方とも肝腫瘍が形成しなかったが、
ＡＦＢ１で処置された６匹の雄の野生型マウスのうちで４匹（６７%）は肝腫瘍が形成された。また、溶媒（ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）で処置されたマウスは腫瘍が検知されなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度は、生後１１ヵ月目でＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスの肝機能をモニターするために測定された。ＡＦＢ１処置群において、雄の野生型マウスは雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスより平均血清ＡＬＴ値が高かったが、雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウス間で差がなかった。病理検査は、ＡＦＢ１処置を受けた雄の野生型マウスには異形成とＨＣＣがある（図１３Ａ）ものの、ＡＦＢ１処置を受けた雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは正常のパターンが観察される（図１３Ｂ）ことを明らかにした。免疫組織化学的染色は、ＧＮＭＴは正常の肝細胞の場合にはサイトゾールでその発現が豊かであった（図１３Ｄ）ものの腫瘍細胞の場合にはそれが減少した（図１３Ｃ）ことを証明しました。その現象は、ウエスタンプロット分析によって確認される（図１３Ｅ）し、ヒトＨＣＣでも観察される。
【００９５】
ＡＦＢ１処置の実験では、マウスらはＧＮＭＴ-ＴＧマウスにおけるＧＮＭＴの発現が野生型マウスより高かった時、ＡＦＢ１を注射した。その結果は、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスは雄とも雌とも肝腫瘍形成が出ないが、ＡＦＢ１で処置された６匹の雄の野生型マウスのうちで４匹（６７%）は肝腫瘍が形成した（表８）ことを示しました。その実施例において、雄の野生型マウスにおける肝腫瘍形成率は１０%から６７%まで増加した。同じ処置手順で、雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは肝腫瘍形成が出なかった。さらに、ＧＮＭＴタンパク質は低い濃度でもウエスタンプロット分析によって生後一週間という早い時期に雌マウスの肝臓で検知されることができる。そうしたＧＮＭＴタンパク質は保護効果を及ぼし雌の野生型マウス体内でＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成を防いだ（ＡＦＢ１で処置された雌マウスは一匹も肝腫瘍が形成しなかった）。その実験は、ＧＮＭＴは雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスをＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成から守ることができることも証明した。
【００９６】
さらに、病理検査は、ＡＦＢ１で処置された野生型マウスで形成した肝腫瘍はＨＣＣであることを確認した（図１３Ａ）。免疫組織化学的染色およびウエスタンプロット分析から得た結果は、腫瘍組織におけるＧＮＭＴ発現レベルが低下することを示した（図１３ＣとＥ）。その結果は我々の前のヒトＨＣＣに対する調査結果と首尾一貫しており、それに、発ガンに対するＧＮＭＴ制御性においてマウスと人間は非常に類似していることを示唆した。したがって、ＧＮＭＴは発ガンの予防において役に立つことが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】目標ベクターを構築する策略が表されている。
【図２】ＧＮＭＴ遺伝子座に対して予測される修正が表されている。(Ａ)目標ベクターはＧＮＭＴエクソン１−４と一部分のエクソン５でネオマイシン耐性遺伝子に入れ替わるという設定がされている。ネオマイシン正の選択マーカーは二つの相同の部分がついており、そして目標ベクターの３’ 端でＴＫ（チミジンキナーゼ）負の選択マーカーが付け加えられる。(Ｂ) 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）クローンについてのサザンブロット分析。ＢａｍＨＩ（Ｂ）-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片サイズは、７.９ｋｂ（野生型対立遺伝子）から５.３ｋｂ（組み換え型対立遺伝子）に減少した。(Ｃ) ＰＣＲ(遺伝子増幅)法によるＧＮＭＴノックアウトマウスの遺伝子型。正常なＧＮＭＴ対立遺伝子は７７２ ｂｐ断片を生じ、分離された対立遺伝子は４０９ｂｐ断片を生じた。野生型+/+と、ＧＮＭＴヘテロ+/-、-/- ＧＮＭＴ -/-マウス。 (Ｄ)ＧＮＭＴタンパク質の発見はウエスタンプロット分析により確認されました。個々のレーンは１０ mｇの肝臓ライセートを含んでいる。ＧＮＭＴ分子量：３２ ｋＤａ。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素）：内部標準。
【図３】遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルにおけるリアルタイム定量ＰＣＲ法は炭素一炭素代謝経路に参与することが表されている。ＷＴＭ (野生型の雄)とＫＯＭ (ＧＮＭＴ -/- 雄)、ＫＯＦ (ＧＮＭＴ -/-雌)の肝臓組織でのｍＲＮＡ発見プロフィールはＷＴＦ (野生型の雌)マウスに正常化された。*, ｐ＜０.０５. Ａｈｃｙ（Ｓ-アデノシルホモシステイン加水分解酵素）；Ｍｓ（メチオニンシンターゼ）；Ｃｂｓ（シスタチオニン-β-シンターゼ）；Ｍｔｈｆｒ（５-１０メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素）；Ｍｔｈｆｄ１（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ）（ＮＡＤＰ+ 依存性）；メテニルテトラヒドロホール酸シクロヒドロラーゼ（ｍｅｔｈｅｎｙ ｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）；ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ；Ａｌｄｈ１ｌ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１家族、メンバーＬ１）；Ａｔｉｃ（５-アミノイミダゾール-４-カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ/ＩＭＰシクロヒドロラーゼ）；Ｓｈｍｔ２（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ２）；Ｍｔｈｆｓ（５,１０-メテニルテトラヒドロホール酸シンテターゼ）；Ｆｔｃｄ（ホルムイミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ）。
【図４】ＧＮＭＴ -/-マウスは肝腫大を起こし、血清ＡＬＴ値レベルが著しく高いことが描かれている。(Ａ)肝臓の重量対体の重量の比率。(Ｂ)野生型やＧＮＭＴ +/-、ＧＮＭＴ -/-マウスの血清ＡＬＴ値レベルの比較。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１．どちらも野生型のマウスと比較されている。
【図５】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスの肝臓病理検査を表している。肝臓の肉眼検査は雄の野生型(Ａ)と、雄ＧＮＭＴ +/-(Ｂ)、雄ＧＮＭＴ -/- (Ｃ)、そして雌ＧＮＭＴ -/-マウス(Ｄ)である。そうしたマウスは犠牲になる前に八時間も断食した。肝臓組織のＨＥ染色が行われるのは生後１１週間の雄の野生型（ＥとＩ）をはじめ、雄ＧＮＭＴ +/-（ＦとＪ）と雄ＧＮＭＴ -/-（ＧとＫ）、雌ＧＮＭＴ -/-（ＨとＬ）、生後九週間の雄ＧＮＭＴ（Ｑ）、そして生後九週間の雌ＧＮＭＴ -/-マウス（Ｓ）である。肝臓組織のＰＡＳ染色が行われるのは生後１１週間の雄の野生型（Ｍ）をはじめ、雌の野生型（Ｎ）と雄ＧＮＭＴ -/-（Ｏ）、雌ＧＮＭＴナル（Ｐ）、生後九週間の雄ＧＮＭＴ -/-（Ｒ）、そして生後九週間の雌ＧＮＭＴ -/-マウス（Ｔ）である。拡大：Ｅ-Ｈ には１００Ｘ, Ｉ-Ｔには ４００Ｘ。
【図６】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスの血液生化学的パラメータによる血液学と分析を表している。(Ａ) 野生型のマウス（ソリッドサークル）とＧＮＭＴ -/-マウス（オープンサークル）において白血球や好中球、リンパ球、単球、好酸球、そして好塩基球も視野に入れている。水平のバーは平均値を示します。(Ｂ) 野生型（ソリッドサークル）とＧＮＭＴ -/-マウス（オープンサークル）における血清グルコースやコレステロール、トリグリセリドのレベルである。水平のバーは平均血清濃度を示す。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１。どちらも野生型マウスと比較している。
【図７】遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルにおけるリアルタイム定量ＰＣＲ分析はいろいろな種類の糖原病（ＧＳＤ）に繋がっていることが示されている。ｍＲＮＡの発現プロフィールは野生型のマウスには正常化された。(Ａ)そのマウスの生後１１週間目；(Ｂ)そのマウスの生後九ヶ月目。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１。Ｇｙｓ２（グリコーゲンシンターゼ２）；Ｇ６Ｐａｓｅ（ぶどう糖 ６-ホスファターゼ）；Ｇ６ＰＴ（グルコース-６-リン酸輸送体）；Ｇａａ（アルファ-グルコシダーゼ）；Ａｇｌ（アミロ-１,６-グルコシダーゼ）；Ｇｂｅ１（ブランチングエンザイム１）；Ｐｙｇｌ（グリコーゲンホスホリラーゼ）；Ｐｈｋａ２（ホスホリラーゼキナーゼアルファ２）；Ｆｂｐ１（フルクトース１,６-ビスホスファターゼ）；そしてＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）。
【図８】雄と雌ＧＮＭＴ -/-マウスには超音波や磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、肉眼検査、ＨＥ染色、そしてレチクリン染色が行われた結果である。雄ＧＮＭＴ -/-(Ａ)と雌ＧＮＭＴ -/-(Ｇ)は肝臓に超音波が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (ＢとＣ)と雌ＧＮＭＴ -/-マウス (ＨとＩ)は肝臓にＭＲＩとＭＲＩ再構成が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (Ｄ)と雌ＧＮＭＴ -/-マウス(Ｊ)は肝臓に肉眼検査が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (Ｅ)と雌ＧＮＭＴ -/- (Ｋ)は肝臓にＨＥ染色が行われ；そして雄ＧＮＭＴ -/- (Ｆ)と雌ＧＮＭＴ -/- (ｌ)は肝臓組織にレチクリン染色が行われた。
【図９】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスはいくつかの早期の原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）マーカーに対するリアルタイム定量ＰＣＲ分析（グリピカン-３やＬＹＶＥ１、サバイビン、そしてα‐フェトプロテイン）が示されている。
【図１０】アフラトキシンＢ１による処理に次いでグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)における(Ａ-Ｂ)核移動が示されている。カバースリップに載せられているＨＡ２２Ｔ細胞は５mｇ ＧＮＭＴ-フラッグでトランスフェクトされ、そしてＲ４ (ウサギアンチＧＮＭＴ) 抗血清で治療するか反応する前に溶媒のＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド) (Ａ)または４０ mＭ ＡＦＢ１ (Ｂ)によって処理されました。免疫蛍光染色には、われわれはＦＩＴＣ（蛍光色素）を共役しているヤギ抗ウサギ抗体を用いた。核はヘキスト３３２５８で染色された。バー：２０ mＭ。(Ｃ-Ｅ)ベンゾピレン（ＢａＰ）のモデルと、ラマルキアン式の遺伝的アルゴリズムによって四量体形のＧＮＭＴと分子結合したアフラトキシンＢ１(ＡＦＢ１)である。(Ｃ) Ｓ-アデノシルホモシステインに結び付いた四量体形のネズミＧＮＭＴ（シアン）(ＰＤＢコード１Ｄ２Ｈ) と分子結合されたＢａＰ（緑）とＡＦＢ１（赤い）分子である。(Ｂ) ＢａＰ（緑）とＡＦＢ１（赤い）分子の分子結合モデルを示すモノマーである。ＧＮＭＴ構造(ＰＤＢコード１Ｄ２Ｈ)とＧＮＭＴ-ＡＦＢ１錯体の分子結合モデルによりいくつかのＡＦＢ１炭素原子のすぐ近くにあるＧＮＭＴアミノ酸残基（Ａｌａ６４, Ｖａｌ６９, Ｌｅｕ１３６, Ｇｌｙ１３７ ａｎｄ Ｓｅｒ１３９）が示されている。(Ｅ) ＡＦＢ１ (左)およびＢａＰ (右)の構造。
【図１１】ＧＮＭＴはＡＦＢ１の細胞毒性効果を拮抗することが示されている。(Ａ-Ｃ) ＡＦＢ１の誘発した細胞毒性は、ＧＮＭＴ過剰発現によって減少される。ＭＴＴ分析評価は、ＡＦＢ１で扱われるＨｕＨ-７細胞の生存率を決めるのに用いられた。Ａ、いくつかの時間に異なった量のＡＦＢ１で処理するＨｕＨ-７細胞の生存曲線である。５０パーセントの発育阻止濃度はその処理の持続期間によるものである。ＨｕＨ-７細胞にＡＦＢ１で７２時間処理したＩＣ５０は１２ｕＭ程である。Ｂ、ＨｕＨ-７細胞はＧＮＭＴ遺伝子またはＧＦＰ支配遺伝子を運ばれるアデノウイルスに１６時間感染された。ＡＦＢ１で７２時間処理された後、細胞はＭＴＴ分析評価を受けた。ＨｕＨ-７細胞の生存率は、Ａｄ-ＧＮＭＴの投薬によって多少増加した。８ｕＭの ＡＦＢ１で処理されたＨｕＨ-７細胞のグループで、ＨｕＨ-７細胞の生存率は、Ａｄ-ＧＮＭＴの投薬によってかなり増加した。Ｃ、類似した結果は他のシステムでも観察されたが、ＨｕＨ-７細胞はレンチウイルスベクターによってＧＮＭＴ遺伝子を導入された。* ｐ＜０.０５、 ** ｐ＜０.０１。(Ｄ-Ｅ) ＧＮＭＴ過剰発現は、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を減少した。Ｄ、ＳＣＧ２-ｎｅｇとＳＣＧ２-１-１細胞は、ＤＮＡ抽出の結果を得る前にＤＭＳＯや示された濃度の ＡＦＢ１で処理された。ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体は、競合 ＥＬＩＳＡ 法で測定された。白いバーと灰色のバーはそれぞれＳＣＧ２-ｎｅｇとＳＣＧ２-１-１を示す。データは、ｍｅａｎ±ＳＤを代表する。*, ｐ＜０.０１; **, ｔ-検定によるｐ＜０.００１。Ｅ、Ａｄ-ＧＦＰとＡｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞は、この分析評価を実行するのに用いられました。白いバーは、Ａｄ-ＧＦＰを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示し;灰色のバーは、５ ＭＯＩ Ａｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示し;黒色のバーは、５０ ＭＯＩ Ａｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示す。*一元配置(一要因の)分散分析による。
【図１２】ＧＮＭＴ-ＴＧと野生型のマウスにあるＧＮＭＴの発現プロフィールと酵素活動が説明されている。Ａ、１、野生型の雄（開いているダイヤモンド）；２、トランスジェニック雄（閉じたダイヤモンド）; ３、野生型の雌（開いている正方形）；そして４、トランスジェニック雌（閉じた正方形）におけるＧＮＭＴタンパク質濃度は、ウエスタンブロット分析（上部のパネル）と量的データ（下部のパネル）によって測定された。その結果により、生後５週間の間でトランスジェニック動物は野生型より多くのＧＮＭＴタンパク質を持つことが判明された。Ｂ、１、野生型の雄;２、トランスジェニック雄;３、野生型の雌；そして４、トランスジェニック雌はＧＮＭＴの酵素活動が比較された。
【図１３】４つのグループの雄マウスの肝臓に、Ｈ＆ＥとＩＨＣ染色が行われたことである。発ガン性物質処理を受けているマウスの肝臓のＨ＆Ｅ染色による顕微鏡写真である。(Ａ) ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理された野生型のマウス（Ｂ）ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス。パラフィン固定組織におけるＧＮＭＴ発現の免疫組織化学分析である。(Ｃ) ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理された野生型。（Ｄ）ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理されたＧＮＭＴトランスジェニック。(Ｅ)非腫瘍組織（Ｎ）と腫瘍組織（Ｔ）からの細胞抽出物に対するウエスタンブロット分析。その結果として、３つのマウスグループで腫瘍組織のＧＮＭＴ発現レベルは非腫瘍組織より低いことが判明された。
【図１４】ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築が示されている。ｐＰＥＰＣＫｅｘ（ベクター）とｐＳＫ-ｆｌＧＮＭＴ（挿入）はＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉで消化し結合することによって、ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴが生じた。Ｂ.トランスジェニックまたは野生型のマウスのいろいろな臓器におけるマウス内在性とヒトＧＮＭＴ ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット解析法で測定されました。１）ＧＮＭＴトランスジェニックマウスの腎臓ＲＮＡ。２）ＧＮＭＴトランスジェニックマウスの肝臓ＲＮＡ。３）野生型のマウスの脳ＲＮＡ。４）野生型のマウスの腎臓ＲＮＡ。５）野生型のマウスの肝臓ＲＮＡ。その結果は、ＧＮＭＴトランスジェニックマウスは肝臓と腎臓でヒトＧＮＭＴ遺伝子（導入遺伝子）が表現されることを示されている。
【符号の説明】
【００９８】
１０ ＴＫベクター
１１ ファージクローン ３−２
２０ ｐＮｅｏベクター
５０ 右アームのＴＫベクター
６０ 左アームのｐＮｅｏベクター
７０ 目標ベクター
８０ 目標ベクターの直線型
９０ 原内対立遺伝子
１００ 目標対立遺伝子
【技術分野】
【０００１】
本発明はグリシンメチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）動物モデルとその使用に関連する。また、本発明はガン、特に肝臓ガンを予防するか治療することにおけるＧＮＭＴ製品の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
細胞異常による人間のかかる病気の中で、最も一般的なタイプの一つはガンであり、現在、それは主な死亡原因でもある。ガンは根本的な間葉に侵入し破壊して、すなわち、局部侵入をする完全的に増殖する（悪性）腫瘍である。場合によっては、浸透したガン細胞はさらに腫瘍で新たに形成されたリンパ管や血管に辿り着き、局部のリンパ節や遠くの臓器に運ばれ、そこで新たなガン巣（転移）を作り出す可能性もある。少なくともいくつかの正常な増殖を制御するメカニズムに再び制御されない細胞――どんな組織でも起こる――はその異常な増殖が起こるということから、腫瘍は一般的に認識されている。ガンは別として、腫瘍は単に局部的に起こり悪性にならないこともある。つまり、良性腫瘍ということである。あるいは、腫瘍細胞はただガン細胞の形態学的外見を持っているだけで元の位置に残る可能性がある。つまり、非浸透ガンである。ところが、その場合は、腫瘍はその部位でガンになることもある。
【０００３】
腫瘍の悪性度を判断する絶対の方法はない。しかし、組織の顕微鏡検査は依然として現在慣用のいくつかの方法の中で、最も信頼できる方法である。病理学的研究において、腫瘍は組織学的で細胞学的基準に基づいた構造逆分化（退形成）の度合いのおよその判断によって、等級分けされることができる。しかし一方で、特定構造の特徴を失っても分化において生化的特徴をまだ保有している細胞があれば、構造的に分化される様に見えるが、正常な機能的特性は既に多くを失ってしまった細胞もあるとも考えられる。他方、腫瘍は均質でなく一つ以上の腫瘍等級のある領域を含む可能性もあるので、発展した腫瘍は、構造や、機能、成長可能性、薬またはＸ線に対する抵抗力、浸透性及び転移の能力が異なる細胞の混合集団から成るとも考えられる。その二つの制限は、腫瘍の組織学的検査の効果を減少させる。さらに、そのような標本抽出による検査は、大規模な調査にふさわしくない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
既に長い時間、悪性の絶対標識（マーカー）を発見しようとする多くの試みがなされている。腫瘍特異性や腫瘍に関わるタンパク質を特定しようとする他の試みは、直接測定や、そうしたタンパク質に対する特定の抗体を開発することによって、今現在も実施されている。それらは診断だけではなく、ガン細胞の破壊方策を提供する面においても有望なアプローチであると思われる。さまざまな物質が生体内に存在し集中するのは、特定のガンを起こす可能性があるということが報告されている。その例として、腫瘍胎児抗原（例えば、アルファフェトプロテイン）や血清蛋白（例えば、フェリチン）、酵素、ポリアミン、異所性ホルモン、細胞のマーカー、レセプター、腫瘍に関わるウイルス抗原などが挙げられます。しかし、ガンの診断において最も一般的に用いられる方法は、上記の物質のものより、組織学に依存する。絶対標識（マーカー）が一つも発見されないことはガンの研究において大きな欠乏である。
【０００５】
最近の観測では、発ガン現象に密接的に関連する物質を捜すことに、いくつかの予測が提供される。ガンは腫瘍遺伝子の起動と腫瘍抑制遺伝子の不活化をもたらすいくつかの遺伝子異常に起因すると認識されている。さらに、そうした腫瘍形成に関わる重要な遺伝子の弁別的な発現は、細胞の中の伝令ＲＮＡ (ｍＲＮＡ)量で反映されることができる。大量のｍＲＮＡの中に効率のあるものを選出し変異要因のある ｍＲＮＡは、その差異を示すことのできる技術ＤＤ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ）から小さな要因の部分を分離し、それにより、腫瘍細胞及び正常細胞に違った要因が表面上に現される。(Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２, ６９６６-６９６８, １９９２)
【０００６】
世界で最も一般的なガンの１つである人間の肝細胞癌(ＨＣＣ)は、通常、肝硬変を誘発するウイルス感染や化学発ガン物質に接触することで起こる慢性炎症性肝疾患から成るものである。(Ｙｕ,Ｍ.Ｗ. ｅｔ ａｌ., Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ. Ｏｎｃｏｌ. Ｈｅｍａｔｏｌ. １７, ７１-９１, １９９４; Ｓｃｈａｆｅｒ,Ｄ.Ｆ. ｅｔ ａｌ., Ｌａｎｃｅｔ ３５３, １２５３-１２５７, １９９９; Ｗｉｌｌｉａｍｓ,Ｊ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｎｕｔｒ. ８０, １１０６-１１２２, ２００４) いくつかの地域(中国やアフリカなど)では、肝細胞癌は主にウイルス感染（Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）やアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に汚染された食べ物、そして他の形で摂取されたアフラトキシンに起因する。(Ｗｉｌｌｉａｍｓ,Ｊ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ａｍ. Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｎｕｔｒ. ８０, １１０６-１１２２, ２００４; Ｃｈｅｎ,Ｃ.Ｊ., Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １６, １１５０-１１５５, １９９２) アフラトキシンの代謝産物は、アスペルギラス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）とアスペルギラス・パラシティカス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ) 菌類は高温多湿な環境での二次産物である。そうした遍在している菌類は米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物に影響する。(ＭｃＬｅａｎ,Ｍ. ＆ Ｄｕｔｔｏｎ,Ｍ.Ｆ., Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｈｅｒ. ６５, １６３-１９２, １９９５)生物学的なシステムに直面する科学物質、または外来異物（ＡＦＢ１など）は代謝プロセスによって変えられることができる。解毒経路の第一相では、多環芳香族炭化水素と塩化炭化水素に誘発されるシトクロムＰ４５０アイソザイムは基質に一つの酸素原子を加え、生物活性はその偶発的な後遺症である。(Ｈｓｉｅｈ,Ｄ.Ｐ.Ｈ., Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ, Ａｍｓｔｅｒｄａｍ, １９８６; Ｈｓｉｅｈ,Ｄ.Ｐ.Ｈ., Ａｃａｄｅｍｉｃ, Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ, １９８７; Ａｏｙａｍａ,Ｔ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８７, ４７９０-４７９３, １９９０; Ｓｗｅｎｓｏｎ,Ｄ.Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｂｉｏｐｈｙｓ. Ｒｅｓ. Ｃｏｍｍｕｎ. ６０, １０３６-１０４３, １９７４)反応性中間体アフラトキシンＢ１ ８,９エポキシド（ＣＹＰアイソザイムから作られます、例えば、サイトクロームＰ４５０ＩＡ２とＰ４５０ＩＩＩＡ４）は多くの動物の種の中で発ガン性を持っている。その肝臓のＤＮＡとの共有結合は肝発ガンにおける重要なステップであることが示されている。(Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ,Ｌ.Ｍ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８７, ８３０６-８３１０, １９９０; Ｋｏｓｅｒ,Ｐ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ ２６３, １２５８４-１２５９５, １９８８) 最も重要な第二相酵素は、グルタチオンＳ転移酵素グループに属し、グルタチオンと潜在的に毒性を持っている求電子剤との化学結合を促進させ、それらの毒性を消失させる。(Ｄｅｇｅｎ,Ｇ.Ｈ. ＆ Ｎｅｕｍａｎｎ,Ｈ.Ｇ., Ｃｈｅｍ. Ｂｉｏｌ. Ｉｎｔｅｒａｃｔ. ２２, ２３９-２５５, １９７８; Ｈａｙｅｓ,Ｊ.Ｄ. ｅｔ ａｌ., Ｐｈａｒｍａｃｏｌ. Ｔｈｅｒ. ５０, ４４３-４７２, １９９１) その後、反応の良いアフラトキシンＢ１ ８,９エポキシドは遺伝子を攻撃し損害を与える。生体内で形成するＡＦＢ１−ＤＮＡ付加体は主にＡＦＢ１-Ｎ７−グアニンである。(Ｃｒｏｙ,Ｒ.Ｇ. ｅｔ. ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ７５, １７４５-１７４９, １９７８; Ｋｅｎｓｌｅｒ,Ｔ.Ｗ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４６, ３９２４-３９３１, １９８６) ＡＦＢ１はＤＮＡと共有結合をし、ｐ５３遺伝子のコドン２４９における第三ポジションでの塩基（それは ＡＦＢ１による突然変異誘発がよく起こっているものだと考えられる）で、Ｇ・Ｃ→Ｔ・Ａトランスバーションを誘発するということを指摘した報告は、少なくとも二つある (Ｂｒｅｓｓａｃ,Ｂ. ｅｔ. ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２９-４３１, １９９１; Ｈｓｕ,Ｉ.Ｃ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２７-４２８) 。
【０００７】
グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)は、グリシンからサルコシンを合成する作用を促進させる細胞内の酵素である。それによって、グリシンはＳ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）からメチル基を取得してサルコシンになり、その後、サルコシンデヒドロゲナーゼで水素を取り除かれてグリシンに戻すこともでる。後者の反応はエネルギーを生み出し、一つの炭素をＳＡＭｅから取り抜く。そのため、ＧＭＴはＳＡＭｅ対Ｓ-アデノシルホモシステイン(ＳＡＨ)の比率を調節することにおいて大切な役割を担うわけです。ネズミの肝臓のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＭＴ)における属性、例えば、飲食におけるメチオニンのレベルによって変動させられ関連させられているその活動状態と、メチオニンを多く摂取した食事による誘導性は、ＧＮＭＴはＳＡＭｅの組織集合やメチオニンの代謝を管理することでも重要な役を果たすものと考えられる (Ｏｇａｗａ, Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２５７:３４４７-３４５２, １９８２) 。しかし、ＧＮＭＴは単なる生体内で代謝した全部のメチオニンの２０％に関わることが発見された (Ｃａｓｅ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｎｕｔｒ. １０６: １７２１-１７３６, １９７６) が、そのたんぱく質は発育十分なネズミやハツカネズミの肝臓に多くあり、ほとんどが肝臓であらゆる可溶性たんぱく質の１%〜３%を占める (Ｈｅａｄｙ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２４８:６９-７２, １９７３) 。そのため、ＧＮＭＴはほかの生理的な機能を発揮する可能性もあり、ネズミの肝サイトゾールから純化された葉酸結合蛋白と全く同じ様に働くものがあるということが発見された (Ｃｏｏｋ, Ｒ. Ｊ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８１:３６３１-３６３４, １９８４) 。近年、ＧＮＭＴはサイトクロームＰ４５０１Ａ１遺伝子(ＣＹＰ１Ａ１)における５'-フランキング領域と相互に作用する４Ｓ多環芳香族炭化水素結合蛋白であることは、ラハ（Ｒａｈａ）とほか(Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２６９:５７５０-５７５６)によって証明されている。また、ＧＮＭＴは肝細胞で最も豊富で効率的なメチルトランスフェラーゼで、その活動はほかのメチルトランスフェラーゼに影響を与えることも可能である。例えば、ｔＲＮＡ-メチルトランスフェラーゼは活動がＧＮＭＴに妨害されることができる (Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ. Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ., ２４７:４２４８-４２５２, １９７２) 。脂質動員合成物、例えば、ＳＡＭｅ及びその前駆物質であるメチオニンやコリン、ベタインはネズミやハツカネズミのモデルでさまざまな発ガン性物質に誘発される肝腫瘍の発展を予防できると、多くの実験室から研究結果が提出されている。ＧＮＭＴは肝細胞におけるＳＡＭｅのレベルと密接な関連をもっており、そしてその酵素の活動がＳＡＭｅによって活性化されるかもしれないという発見により、ＧＮＭＴは肝ガンに対する科学的予防経路の過程にかかわるとも考えられる (Ｐａｓｃａｌｅ ｅｔ ａｌ., Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ., １３:１３４１-１３５６, １９９３) 。
【０００８】
ＧＮＭＴ発現のレベルはヒト肝細胞ガンの細胞株（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ）と腫瘍組織のどちらでも減少させることできるということが発表されている (Ｌｉｕ, Ｈ. Ｈ. ｅｔ ａｌ, Ｊ. Ｂｉｏｍｅｄ. Ｓｃｉ.１０, ８７-９７, ２００３; Ｃｈｅｎ,Ｙ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ７５, ７８７-７９３, １９９８) 。人間のＧＮＭＴ遺伝子は６ｐ１２染色体領域に集中され、その多型を特徴づけられる。(Ｃｈｅｎ, Ｙ. Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６６, ４３-４７, ２０００)いくつかのヒトＧＮＭＴ遺伝子多型における遺伝子型分析は、肝細胞ガン組織のうちに３６−４７%の遺伝子マーカーが染色体欠失という現象があることを示し、(Ｔｓｅｎｇ,Ｔ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６３, ６４７-６５４, ２００３) そしてＧＮＭＴはベンゾピレン（ＢａＰ）デトックス経路にかかわり、ＧＮＭＴ発現細胞で形成するＢＰＤＥ-ＤＮＡ 付加体を減らすことが発表されている (Ｃｈｅｎ,Ｓ.Ｙ. ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６４, ３６１７-３６２３, ２００４) 。
【０００９】
前の研究結果は、ネズミの肝サイトゾールでマルチプロテイン（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）はＡＦＢ１を化合させることができるということを指摘しています。(Ｔａｇｇａｒｔ,Ｐ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｓｏｃ. Ｅｘｐ. Ｂｉｏｌ. Ｍｅｄ. １８２, ６８-７２, １９８６) ＡＦＢ１結合にかかわる細胞質ゾルのたんぱく質は、輸送や代謝、発ガンせい性物質の作用において働く潜在力を持っている可能性がある ( Ｄｉｒｒ, Ｈ. Ｗ. ＆ Ｓｃｈａｂｏｒｔ,Ｊ.Ｃ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｉｎｔ. １４, ２９７-３０２, １９８７) 。
【発明の効果】
【００１０】
本発明はゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えを行うことによって乱されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ-ｔｙｐｅ）の表現型に相対しそのマウスの異常な肝臓機能からなる表現型が生じ、その乱される位置はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５である。
【００１１】
本発明は肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェント（ａｇｅｎｔ）をスクリーニングする方法をも提供し、それは
ａ.本発明のノックアウトマウスを提供し、
ｂ.ある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、
ｃ.そのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や非常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。
【００１２】
本発明は一組のプライマーを提供する。それは(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２ 、または (ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２である。
【００１３】
本発明はさらにＧＮＭＴノックアウトマウスにおける調節遺伝子群のデーターベースを提供する。
【００１４】
本発明は肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データーベースをも提供する。
【００１５】
本発明はさらにアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法をある患者に提供し、その患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与する。
【００１６】
本発明はアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）によって引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物を提供し、それはグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成する。
【００１７】
現在の発明において、正常細胞と腫瘍細胞におけるＧＮＭＴ遺伝子は有意差が見られることが明らかに分かる。本発明の目的は、ＧＮＭＴの遺伝子発現の相対的なレベルを測定することによって細胞の異常を見つける方法を提供することである。さらにもう一つの目的は、異常な細胞にＧＮＭＴを送ることによって細胞の異常を修正する方法を提供することである。精神活性の薬をスクリーニングするのに役立ついくつかの非人間のトランスジェニック動物モデルが提供される。そうした動物は、遺伝子組み換えＧＮＭＴ遺伝子を持っている。遺伝子における配列の改変は、削除または機能突然変異において他の喪失や、部位指定変異またはランダム変異によるヌクレオチド配列の持つ外来遺伝子の導入、ほかの種からの外来遺伝子の導入またはそれらの組合せなどが含まれます。遺伝子改変が行われたトランスジェニック動物はホモ接合性あるいはヘテロ接合性の可能性がある。
【００１８】
ＧＮＭＴは、ＡＦＢ１処理の後で核移動を経る。本発明のテスト結果によると、ＡＦＢ１はＳＡＭｅと同じ結合部位を争ってＧＮＭＴと結合することである。ＧＮＭＴはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らしＡＦＢ１処理を受けている細胞の生存率を促進することによってＡＦＢ１に誘発された細胞毒性を拮抗するという考えが実証された。最後に、ＧＮＭＴトランスジェニックマウスモデルより発見された結果は、ＧＮＭＴの過剰発現はＡＦＢ１に誘発された原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）に対して保護効果があるということが示されている。
【００１９】
本発明は、患者にアフラトキシンＢ１に起因する病気を治療するか予防する方法を提供する。それは効果的量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）やＧＮＭＴを含んでいるプラスミドを患者に投与することから成る。
【００２０】
好適な実施例において、その病気は原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）となっている。
【００２１】
現在の方法では、処置または予防は、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を妨害することによってなされる。
【００２２】
遺伝子治療において、プラスミドはプラスミドワクチンとして見なすことができ、遺伝子治療における現在の技術によって患者の体に直接施されることができる。
【００２３】
本発明は、ゲノムの混乱がｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓにおけるＳＥＱの５４７-４８７５でＮｏ.８を確認することから発見したマウスの異常な肝機能から成立し、野生のタイプ表現型と比較して、表現型を生じるためにＧｌｙｃｉｎｅ Ｎ-メチル基転移酵素（ＧＮＭＴ）遺伝子座位を組み換えによって崩壊するノックアウトｍｏｕｃｅを提供する。
【００２４】
本発明はゲノムがグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)遺伝子座における組み換えによって崩壊されたノックアウトマウスを提供し、それによって、野生型（ｗｉｌｄ-ｔｙｐｅ）の表現型に相対し例のマウスの肝臓機能の異常からなる表現型が生じ、その崩壊はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ. ８におけるヌクレオチド５４７-４８７５で起こる。
【００２５】
特に、ヌクレオチドはＧＮＭＴエクソン１-４とエクソン５の一部分である。グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ活性の欠如の表現型は、野生型の表現型に相対して成熟したグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼの減少した量はその原因だと考えられる。
ノックアウトマウスの準備において、グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ遺伝子はヘテロローガスヌクレオチド配列（例えばネオマイシン）との組み換えによって崩壊される。
【００２６】
その中で「異常な肝機能」という用語は制限されないが、Ｓ-アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇を含む。
【００２７】
トランスジェニック動物
ここで使われている「導入遺伝子」という用語は、哺乳類の細胞（特に生きている動物の哺乳動物細胞株）のゲノムに遺伝物質を人工的に挿入されたか挿入されようとしていることを説明する。導入遺伝子は細胞を変えるのに用いられる。それは、外来ＤＮＡの編入に次いで細胞における遺伝子の永遠的なものであるか一時的な変化（望ましくは永遠的なものの遺伝子変化）が誘発されるということを意味している。永遠的なものの遺伝子変化は、通常、細胞のゲノムにＤＮＡの導入によって成し遂げられる。安定した統合を備えるベクターは、プラスミド、レトロウイルスと他の動物ウイルス、ＹＡＣｓなどを含みます。興味があるのはトランスジェニック哺乳類（例えば牛やブタ、ヤギ、馬など）、特に齧歯動物（例えばネズミ、マウスなど）である。
【００２８】
トランスジェニック動物は染色体外遺伝因子として呈すか、その細胞、特に生殖細胞の全部または一部に安定的に結合される外来の核酸配列を包含します。明記しない限り、トランスジェニック動物は生殖系細胞系の細胞群が安定した変化を包含することが仮定される。その動物が最初に構成されている間、細胞のサブセットだけは変えられたゲノムを持っている「キメラ」または「キメラ動物」は生み出される。キメラは主に繁殖目的で使われます。それによって望ましいトランスジェニック動物が生み出される。ヘテロ接合性の変異がある動物はキメラの繁殖によって生み出される。雄と雌のヘテロ接合体は一般的にホモ接合性の動物を生み出すように繁殖される。トランスジェニック動物は２つのグループに分類され、口語で「ノックアウト」と「ノックイン」と呼ばれる。本発明では、ノックアウトは内在性ＧＮＭＴ遺伝子の一方または両方の対立遺伝子が部分的であるか完全な機能損失を持っている。ノックインは内在性遺伝子から変えられた遺伝子配列と機能を得た導入遺伝子が導入されている。その二つは結合されるかもしれないが、その場合、天然に存在する遺伝子の能力が奪われ、そして変化した遺伝子型が導入される。
【００２９】
ノックアウトにおいて、目標遺伝子発現は検知されることができないか、重要ではないことが望ましい。ＧＮＭＴ遺伝子のノックアウトとは、ＧＮＭＴ遺伝子のその機能がかなり減少されたということである。それによって、発現は検知されることができないか重要ではないレベルだけを呈している。それは様々な手段によって成し遂げられる可能性もあるが、崩壊したコーディング配列の導入、例えば一つまたは一つ以上の停止コドンの挿入やＤＮＡ断片の挿入などや、コーディング配列の削除、コーディング配列に代えて停止コドンの置換などはその例である。時には、外来の導入遺伝子配列は最終的にゲノムから削除され、変異を行う前の配列に真の変化を残す。異なるアプローチは、「ノックアウト」を達成するのに用いられると考えられる。天然の遺伝子は全部または一部の染色体削除が誘発されるかもしれないが、非コード領域（特にプロモーター領域）や、３’制御配列、エンハンサーの削除、またはＧＮＭＴ遺伝子の発見を促進する遺伝子の削除などが含まれる。機能的なノックアウトは、天然の遺伝子の発現を妨害するアンチセンス構成物の導入によっても成し遂げられる可能性がある。
【００３０】
「ノックアウト」は条件つきのノックアウトをも含む。例えば、目標遺伝子の変異は以下の状況で起こる：その動物が目標遺伝子変異を促進する物質にさらされること、目標遺伝子の位置で組み換えを促進する酵素の導入（例えばＣｒｅ-ｌｏｘシステムにおけるＣｒｅ）、または出生後に目標遺伝子変異を誘導する他の方法である。
【００３１】
目標遺伝子の「ノックイン」は、宿主細胞ゲノムに変異を与え、天然のＧＮＭＴ変えられた遺伝子の発現または機能に終わることを意味する。増加する（異所性を含む）か減少する発見は、目標遺伝子の追加したコピーの導入、または強化された内在性目標遺伝子のコピーの発見を提供する制御配列を有効に挿入するすることによって達成するとも考えられる。そうした変異は構造性的な条件つきなものと思われる。すなわち活性剤または抑制物質の存在に依存している。
【００３２】
外来遺伝子は通常ホスト動物より異なる種から得たか、さもなければそのコーディングまたは非コーディング配列が変えられる。導入された遺伝子は野生型の遺伝子や、天然に存在する多型または遺伝的に操作られた配列である可能性も考えられる。例えばコーディングまたは非コーディング領域への削除や置換、または挿入が行われるということである。導入された配列は、ＧＮＭＴポリペプチドをエンコードするとも考えられる。導入された遺伝子がコーディング配列である場合、それは通常、プロモーター（それは構成性的または誘導可能であるとも考えられる）やホスト動物の発現において必要である他の制御配列に“作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）”される。“作動可能に連結(ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ)”されると言うことは適切な分子（例えば転写活性化タンパク質）が制御配列に結合される時、ＤＮＡ配列と制御配列が遺伝子発現を可能にする方式で連結されたということである。
【００３３】
興味があるがそれに制限していない特定の構築物は、アンチセンスＧＮＭＴ遺伝子を含んでいる。アンチセンスＧＮＭＴ遺伝子は天然のＧＮＭＴ発現と優性阻害ＧＮＭＴ突然変異の発見、ＧＮＭＴ遺伝子の過剰発現を妨げるものです。検知されることができるマーカー、例えばｌａｃ Ｚはその遺伝子座（そこで発見の増加 (ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ)は簡単に検知された表現型の変化に終わる）に導入する可能性がある。
【００３４】
ＧＮＭＴ遺伝子で一連の小さな削除と／または置換がされると考えられる。それによって、ＤＮＡ結合で異なるエクソンの役割や転写調節などを決定する。細胞におけるＧＮＭＴタンパク質の発見を提供する（さもなければ、その細胞は正常に生み出されない）ことによって、細胞の行為の変化が誘発されることができる。
【００３５】
相同的組換え用のＤＮＡ構築物は、少なくとも一部の望ましい遺伝子改変があるＧＮＭＴ遺伝子を含んで、そして目標遺伝子座にホモロジーのある領域をも含んでいる。ランダムな統合用のＤＮＡ構築物は、組み換えを伝達するのにホモロジーのある領域を含む必要はない。便利なのは、正と負の選択用のマーカーは含まれる。目標とされている遺伝子改変のある細胞を相同的組換えを通して生み出す方法は技術（ａｒｔ）において知られている。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を得るために、ＥＳ細胞系は使用されるか、あるいは、胚細胞は新たにホスト（例えばマウス、ネズミ、モルモットなど）から得られるとも考えられる。
【００３６】
そのような細胞は適当な線維芽細胞層で発育するか、適当な成長因子（例えば白血病抑制因子（ＬＩＦ））が存在している時に発育する。ＥＳ細胞は性質転換されたとき、トランスジェニック動物を産むのに用いられる可能性もある。性質転換の後、そうした細胞は適切な培地でフィーダー細胞層の上にメッキをされる。その構築物を含んでいる細胞は、選択的な培地を使用することによって検知されるとも考えられる。コロニーは発育に十分な時間を経た後、選ばれて相同的組換えや構築物の統合の発生について分析されます。そうしたコロニーは陽性である場合、それから胚操作と胚盤胞注入において使われる可能性も考えられる。胚盤胞は生後４〜６週間目の過剰排卵する雌から得られるものである。ＥＳ細胞はトリプシン処理され、そして、その改変された細胞は胚盤胞の割腔に注入される。注入の後、胚盤胞はそれぞれ偽妊娠の雌の子宮角に戻される。雌はその後、妊娠期間に入り、産まれた一腹の子が構築物を持っている変異細胞がスクリーンされる。胚盤胞とＥＳ細胞の異なる表現型に備えることによって、キメラの後代検定は、すぐに探知されることができる。
【００３７】
したがって、本発明は本発明のノックマウスから備えられた細胞または細胞株を提供する。好適な実施例において、細胞または細胞株は幹細胞、ＥＳ細胞卵母細胞と胚細胞を含めているグループから選ばれる未分化細胞である。
【００３８】
キメラ動物は改変された遺伝子の有無についてスクリーニングされ、そして改変されている雌および雄が交尾することによってホモ接合性の妊娠が生じます。もしその遺伝子変異は開発においてある程度で致死性を引き起こすならば、組織または臓器は同種異系間やコンジェニック系統における移植や移植片として、または試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）培養において維持されてもよいと考えられる。
【００３９】
関心のゲノム配列は、リストアップされた配列の間で定められ、開始コドンと停止コドンの間で存在している核酸から成り、そして通常天然の染色体で存在する全てのイントロンを含みます。それは更に成熟したｍＲＮＡで見つけた３'と ５'ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ）を含む可能性も考えられる。それは、特定の転写制御配列や翻訳制御配列（例えばプロモーター、エンハンサーなど）、そして転写領域の５'または３'端のどちらにおいて１ｋｂ（より多い可能性がある）のフランキングゲノムＤＮＡを更に含むものとも考えられる。そのゲノムＤＮＡは１００ｋｂｐやより小さい断片として隔離され、非常なフランキング染色体配列を持っていないと考えられる。
【００４０】
薬物をスクリーニングする分析評価
本発明はさらに肝臓疾患や異常の予防または治療に対する候補エージェントをスクリーニングする方法をも提供し、それは
ａ.本発明のノックアウトマウスを提供し、
ｂ.ある候補エージェントをそのノックアウトマウスに投与し、
ｃ.そのノックアウトマウスの肝臓機能を候補エージェントを投与しないノックアウトマウスの肝臓機能と比較し、そして肝臓機能を好転させるエージェントは例の肝臓疾患や異常に効果があるエージェントとして選ばれるといったことから成る。
【００４１】
そこから派生された被験者のトランスジェニック動物または細胞を用いることにより、ＧＮＭＴポリペプチドと結合するか、それを調整するか、拮抗するか、苦しませるリガンドまたはサブストレートを識別することができる。そうしたポリペプチドに対して効果の思わしくない薬をスクリーニングすることにも関心がある。ヒト細胞に低い毒性を持つ薬品のスクリーニング評価について、特に興味があるものと思われる。
【００４２】
多種多様な分析評価はその目的のために使われる可能性もあるが、生体内の行動研究や、投与後に薬剤の局在の識別、標識された試験管内のタンパク質-タンパク質結合の分析評価、タンパク質-ＤＮＡ結合の分析評価、ゲルシフト法、タンパク質結合の免疫測定法などを含んでいる。特定の分析評価に従い、全動物、あるいはそこから派生された細胞が使われるかもしれません。細胞はある動物から新たに隔離されるかもしれないか、培養基において不死化にされるかもしれません。特に関心の細胞は、神経および脳組織を含む。
【００４３】
ここで用いられる用語「エージェント（ａｇｅｎｔ）」というのは、ＧＮＭＴポリペプチドの生物学的作用に影響を及ぼす能力を持つ分子（例えばタンパク質または医薬）のことである。
【００４４】
通常、複数の分析評価混合物は同時に異なるエージェント濃度でされることにより、そうした濃度に異なる反応を得る。一般的に、こうした濃度のうちに、１つがネガコン（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）の仕組みをしており、すなわちゼロ濃度や検知のレベル以下である。
【００４５】
好適な実施例において、そのエージェントは原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）や、糖原病、肝臓形成異常または脂肪肝を予防するか、治療することに使われる。
【００４６】
候補エージェントは、一般的に有機分子（望ましくは５０以上、およそ２,５００未満のダルトンの分子量を有する小さな有機化合物）であるが、多数の化学的な種類（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｌａｓｓｅｓ）がある。候補エージェントはタンパク質（特に水素結合）と構造的な相互作用に必要な官能基から成り、一般的に少なくともアミン、またはカルボニル、水酸基、カルボキシル基それぞれ一つ持っており、望ましくはそうした化学の官能基のうちに、少なくとも２つを持つ。候補エージェントはしばしば周期的な炭素または複素環構造および／または芳香族構造または多環芳香族構造を含み、上記の官能基の一つまたは一つ以上の代用をする。候補エージェントは、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、派生物、構造類似物またはその組合せといった生体分子の間で発見されるが、それに制限してはいない。
【００４７】
候補エージェントは、合成であるか天然合成物のライブラリを含む多種多様な源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物と生体分子におけるランダムで誘導された合成（ランダム化されたオリゴヌクレオチドとオリゴペプチドの発現を含む）に使えるいくつかの手段が考えられる。あるいは、細菌や菌類、植物、そして動物性抽出物の形として天然合成物のライブラリは、入手するか、すぐに生産される。その上、自然であるか総合的に生産されたライブラリと合成物は、従来の化学的や、物理的で、生化学的手段を通してすぐに改変されて、そして組合せライブラリを作成するのに用いられる可能性も考えられる。既知の薬理学的エージェントは構造類似物を生じるが、誘導された、又はランダムな化学改変、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎなどを受けるものとも考えられる。
【００４８】
スクリーニングは既知の薬理活性化合物とその化学類似物に向けられると考えられる。既知の肝ガンに対する制ガン剤または肝病気に対する薬の中で、非常に抑制作用（ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）のある薬物に特に興味がる。
【００４９】
ノックアウトマウスを準備するために、本発明は一対のプライマーをも提供する。それは(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２または(ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ３と４である。
【００５０】
本発明は、上流にある調整遺伝子（ｕｐ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）と下流にある調節遺伝子（ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）を研究するために、ＧＮＭＴノックアウトマウスにおける調節遺伝子のデータベースを更なる提供する。
【００５１】
更なる本発明は、肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベースを提供し、それは
(a) 生存と増殖：ＰＴＥＮ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ １、ＧＳＫ３βまたはβ-カテニン
(b) ガン遺伝子：サイクリンＤ１、Ｃ-ｍｙｃまたはＣ-ジュン;そして、
(c) 腫瘍抑制遺伝子：Ｒｂまたはｐ５３。
からなる。
【００５２】
本発明はアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできる合成物をも提供し、それはグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成する。好適な実施例において、ＧＮＭＴは二量体形成であるか四量体形成である。
【００５３】
本発明の組み合わせは、主食作物（例えば米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなど）の補助的な添加物として適用されることができる。
【００５４】
本発明は特定の方法論や、プロトコル、細胞株、動物の種または属、構築物、記述された試薬に限られていないことは理解すべきである。そうしたものは、もちろん、変化させる可能性がある。もう一つ理解すべきことは、ここで使用される用語が特定の実施例を説明するという目的だけで使われ、本発明の範囲を制限しようとするのはその目的ではないということである。本発明は、添付した特許請求の範囲だけによって制限されるのである。
【００５５】
本記載にあるものと添付した特許請求の範囲において使われているように、単数形と、「と」、「その」といった言葉は複数の指示物を含み、又は、その文脈が明確に指摘するので、その点にも注意しなければならない。
【００５６】
特に定義しない限り、ここで使用されるすべての専門的で科学的な用語は、本発明の属する技術（ａｒｔ）範囲における関連的技能を身につける人が理解しているのと同じ意味を持っている。ここに記述されている方法や装置、材料と類似したまたは同等したものは、すべて本発明の実施（ｐｒａｃｔｉｃｅ）またはテスト（ｔｅｓｔ）において使われることができるが、現在説明するのは、望ましい方法や装置、材料である。
【００５７】
ここに言及したすべての出版物は、細胞株や構築物、本発明に適用されるかもしれないそうした出版物で記述される方法といった例を、記述し明らかにする目的で言及した。上記に言及された、そして全篇のテキストを貫くそうした出版物は、本発明の出願年月日の前に発表されることだけで言及する。先行発明によって発明者がそのような発表に先だつ権利を許可されないものと解釈されるものではない。
【００５８】
以下の実施例は関連する技術を身につけた者たちに本発明の製作および応用について全面的な説明を提供するために挙げられる。本発明の範囲を制限することを目的とはしない。使われる数（例えば総計や温度、濃度など）に関して正確さを確保しようという努力はされたが、若干の実験誤差と逸脱は許容できる。特に指摘しない限り、パーセント(百分比)は重量百分比のことで、分子量は平均分子量、温度は摂氏の温度で、そして圧力は気圧を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
目標ベクターを構築するために、ラムダ（λ）ファージクローン３-２と５-３に代謝されるＤＮＡ断片は、プラスミド-ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ ＩＩ ＫＳに挿入されました。左アーム（ｌｅｆｔ ａｒｍ）はＰｓｔ Ｉを用いてファージクローン５-３から代謝され、ｐＮｅｏベクターに挿入された。右アーム（ｒｉｇｈｔ ａｒｍ）はＨｉｎｃ ＩＩを用いてファージクローン３-２から代謝され、ＴＫベクターに挿入された。右アームとＴＫ遺伝子を含んでいる断片がＮｏｔ Ｉを用いて代謝され、左アームを含んでいるｐＮｅｏベクターに挿入されるこのによって目標ベクターを生み出す（図１）。
【００６０】
（マウスＧＮＭＴ遺伝子のエクソン １-４およびエクソン５の一部分を入れ替える）ネオマイシン遺伝子は、目標ベクターで２つのＤＮＡ断片（３.１ｋｂと３.７ｋｂ）に挟まれる。チミジンキナーゼ遺伝子が負の選択マーカーとして使われた。（図２Ａ）４０μｇ目標ベクターは、ＡｓｃＩを用いて線形化され、エレクトロポーレーションによってＥＳ細胞（１２９/Ｓｖ-派生系）に導入された。サザンブロット分析を使って２７８個のクローンをスクリーニングした後（図２Ｂ）、組み換えクローンが隔離されマイクロインジェクション法によって胚盤細胞に注入された。そのため４匹の雄キメラマウスは生み出され、雌Ｃ５７ＢＬ/６マウスを育てるのに用いられた。アグーチ（Ａｇｏｕｔｉ）のＦ１世代は崩壊された対立遺伝子における生殖細胞系の伝送（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が検知されるために、ＰＣＲが用いられた。ヘテロ接合性のＦ１雄マウスが雌の野生型Ｃ５７Ｂ/６マウスと戻り交配されて、Ｃ５７ＢＬ/６ゲノム遺伝的背景を持つマウス（Ｃ５７ＢＬ/６ ｇｅｎｏｍｅ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｍｉｃｅ）を生み出します。ＰＣＲは、野生型（+/+）とＧＮＭＴヘテロ接合性（+/-）、ＧＮＭＴ-/-マウスを区別するために用いられ、下記のプライマーが使用された：
ＧＮＭＴにおいて
ＧＮＭＴ-Ｆ（５'-ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ）とＧＮＭＴ-Ｒ（５'-ＴＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＧＴＧＡＧＣ）;
ネオマイシンにおいて
ネオマイシンＦ（５'-ＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴ）とネオマイシンＲ（５'-ＣＧＧＣＣＡＣＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣ）。
正常のＧＮＭＴ対立遺伝子はそうしたＧＮＭＴプライマーにより７７２ｂｐ断片を生じ、そして崩壊された対立遺伝子はそうしたネオマイシンプライマーにより４０９ｂｐ断片を生じた。（図２Ｃ）肝臓におけるＧＮＭＴタンパク質の発現は、サザンブロット分析で分析された; その結果が示したように、野生型と比較したら、ＧＮＭＴ+/-マウスは肝臓におけるＧＮＭＴ発現がおよそ５０%が減って、ＧＮＭＴ-/-マウスはその肝臓でＧＮＭＴが検知されることができなかった。（図２Ｄ）
【００６１】
生後１１週間で、雄と雌の野生型とＧＮＭＴ+/-、ＧＮＭＴ-/-マウス（組ごとに６匹やそれ以上のマウス）は表現型分析のために犠牲になった。ＳＡＭｅとＳＡＨ濃度は、ＨＰＬＣを用いて検知された。同性の野生型マウスに比べると、ＧＮＭＴ-/-マウスは雄とも雌ともＳＡＭｅの肝臓濃度がかなり増えた(ｐ＜０.０５)。対照的に、ＧＮＭＴ+/-マウスにおけるＳＡＭｅの肝臓濃度は野生型マウスより２.８倍低くて（表１）、そして雄と雌のＧＮＭＴ-/-マウスにおけるＳＡＨの肝臓濃度は野生型マウスと類似している。したがって、ＳＡＭｅ/ＳＡＨの比率は雄と雌のＧＮＭＴ-/-マウスにおいてそれぞれ４２と６７倍増えた（表１）。ホモシステインレベルは、そうした異なるマウスグループで不変のままだった。メチオニンレベルは、ＧＮＭＴ-/-マウスにおいて野生型マウスよりその量が１.９〜２.４倍多かった（表１）。
【００６２】
表１ 野生型とＧＮＭＴ欠損マウスにおける、肝臓でのＳＡＭｅとＳＡＨ濃度および血清ホモシステインとメチオニン濃度である。
野生型肝腫瘍形成ＧＮＭＴ-/-マウスの研究で、表現型ＧＮＭＴ-/-マウスは１２週目まで隔週ごとに磁気共鳴画像とソノグラムを使って追跡した。その結果は７匹の雌ＧＮＭＴ-/-マウスのうち７匹の腫瘍が０.５ｍｍ以上成長したＨＣＣ、これは１６.１ヶ月目のものと意味する。対照的に、我々が２１ヶ月６匹の雄ＧＮＭＴ-/-マウスの研究を追跡している中、一匹はＨＣＣがあり、二匹は１３ヶ月で早まって犠牲になり、他は不明確である。したがって、１４ヶ月から１５ヶ月の雌のＧＮＭＴ-/-マウスは、５０％（二分の一）がＨＣＣを持っていた。２１ヶ月から２２ヶ月で、雌のＧＮＭＴ-/-マウスの６匹のうち６匹（１００％）はＨＣＣが発達した。雄の１８ヶ月から２１ヶ月のＧＮＭＴ-/-マウスは７５％（四分の三）が肝小結節に発達があった。野生型肝腫瘍形成の雌ＧＮＭＴ-/-マウスが指し示すものは、雄のＧＮＭＴ-/-マウスよりも深刻である。一方、３７.５％（八分の三）の雌ＧＮＭＴ-/-マウスは血管腫が発達した。全ての雌ＧＮＭＴ-/-マウスが脂肪変性に変化した中、雄ＧＮＭＴ-/-マウスは三分の一だけだった。
【００６３】
表２ ＧＮＭＴ-/-マウスは生後１３-２１ヵ月目での肝腫瘍形成である。
ａ.マウスが犠牲になった年齢。
ｂ.１８ヶ月で二匹の雄の肝小結節が０.６ｃｍ以下で、一匹の雄には肝小結節がなかった。
ｃ.二匹のマウスは軟弱過ぎたため、肝小結節を持たなかった。
ｄ.このマウスは麻酔処置によって犠牲になった。
ｅ.２１ヶ月で、肝臓にある小結節が超音波によって検出された。
ｆ.１８ヶ月で小結節は検出されなかった。
ｇ.１８ヶ月で０.５ｃｍの小結節が検出された。
ｈ.該当なし。
【００６４】
マイクロアレイ分析は、ＧＮＭＴノックアウトマウスと野生型マウスと代謝の違いを観察するのに適用された。野生型と比較したら、ｍＲＮＡレベルにおいて雌のＧＮＭＴ欠損マウスは１８９６個の遺伝子がかなり増加し、雄のＧＮＭＴ 欠損マウスは２４２９個の遺伝子がかなり増加した。そうした遺伝子のうち、それぞれ二倍以上変化した５４３個と８４３個の遺伝子は、更なる機能分析のために選ばれた。我々は、ＣｒｏｓｓＰａｔｈプログラム（ｈｔｔｐ://ｉｂｓ.ｓｉｎｉｃａ.ｅｄｕ.ｔｗ/ｃｒｏｓｓｐａｔｈ/）を使い、ＫＥＧＧ経路データベースに基づいてそれらの遺伝子を機能によって分類した。表３と表４は、発現量の異なる遺伝子は発現量が二倍または二倍以上増加しているのが所定の経路で分類された機能的な経路を示した。それによって、雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおいて主な経路増加はＰＰＡＲシグナル伝達経路および細胞周期で起こるものである。そのうえ、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）-サイトカイン受容体へのインタラクション及びＭＡＰＫシグナル経路は、雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおいて減少した。表５は、リアルタイム定量ＰＣＲ法によってＧＮＭＴ-/-マウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルｖｓ.同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのｍＲＮＡ発現レベルの比率が測られることを示している。その結果は、ＧＮＭＴ-/-マウスにおいていくつかの生存と増殖に関わる遺伝子はかなり減少し、そして三つのガン遺伝子は増加したことを示している。
【００６５】
表３-１ ＫＥＧＧ経路データベースによる生後１１週間での雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおける調節遺伝子の機能的分類である。
* ＧＮＭＴ欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６６】
表３-２. 生後１４-１８ヵ月目でＫＥＧＧ経路データベースによって機能的な分類をした雌と雄ＧＮＭＴ-/-マウスにおける腫瘍と腫瘍に隣接した組織の調節遺伝子個数である。
* ＧＮＭＴ-/-マウスにおいて腫瘍と腫瘍に隣接した組織と発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６７】
表４ ＫＥＧＧ経路データベースによる雌と雄ＧＮＭＴ欠損マウスにおける下流にある調節遺伝子（ｄｏｗｎ-ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ）の機能的分類である。
* ＧＮＭＴ欠損マウスと野生型マウスにおいて発現は少なくとも二倍の違いを示した遺伝子の個数。
【００６８】
表５ リアルタイム定量ＰＣＲ法によってＧＮＭＴ-/-マウスにおいていろいろな組織における異なる経路に属している遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルｖｓ.同齢の野生型マウスにおいて肝臓組織におけるそのｍＲＮＡ発現レベルの比率が測られることを示している。
ＰＴＥＮ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄ ｔｅｎｓｉｎｈｏｍｏｌｏｇ）はガン抑制遺伝子ＰＴＥＮで、ＰＩ３Ｋ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３-ｋｉｎａｓｅ）はホスファチジルイノシトール３-キナーゼで、ＧＳＫ３β（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）はグリコーゲンシンターゼキナーゼで、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）は網膜芽腫で、Ｔは腫瘍状組織で、ＴＡは腫瘍に隣接した組織で、ＫＯはＧＮＭＴ-/-マウスで、ＷＴは野生型のマウスである。
ａ.生後１１週間でＧＮＭＴ-/-マウス対野生型のマウスの遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ｂ.腫瘍に隣接した組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。その生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ｃ.腫瘍状組織対野生型のマウスにおける肝臓組織の遺伝子発現プロフィールの比率である。生データは内部統制のＧＡＰＤによって標準的にされた。
ＧＮＭＴ-/-マウスモデルがより発ガン物質に影響されやすいことを証明するために、マウスらに対してアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）を用いてテストした。ＡＦＢ１は、以下の剤量で腹膜内に二回投与された：生後七日目で体重一グラム当たり１０ｕｇで、生後九週間で体重一グラム当たり４０ｕｇである。ＡＦＢ１で処置されたすべて（５/５）の雌および５７.１%（４/７）の雄ＧＮＭＴ -/-マウスには肝臓結節が検知されたが、ＡＦＢ１で処置された野生型のマウスも溶媒（トリカプリリン、ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）で処置された他のグループも生後１３-１４ヵ月目でまだ肝腫瘍が起こることはないと、その結果は示している(表６)。
【００６９】
表６ 生後１３ヵ月目でそれぞれ溶媒またはＡＦＢ１で処置された２匹の遺伝子型マウス（ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｍｉｃｅ）の肝腫瘍形成である。
ＨＥ染色でマウス肝臓部の組織薄片を見たら、ＡＦＢ１で処置された野生型のマウスは異常が現れなかったが、ＡＦＢ１で処置された雄のＧＮＭＴ-/-マウスにはデイスプラジア結節や早期ＨＣＣ、脂肪結節が検知され（図９ＡとＢ）、そして雌のＧＮＭＴ-/-マウスには硬化性ＨＣＣ（Ｓｃｌｅｎｏｓｉｎｇ ＨＣＣ）や限局性脂肪沈着におけるデイスプラジア結節が検知された（図９ＣとＤ）。
【００７０】
材料と方法：細胞培養および処置
肝臓ガン細胞株［ＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ］はＷａｘｍａｎ,Ｄ.Ｊ. ＆ Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ,Ｃ. Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｘ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０, ２６１３ (２００６)によって作製されたもので、ヒト肝芽腫細胞株-ＨｅｐＧ２から取り出された安定発現クローンは、Ｍｏｄｅ,Ａ. ＆ Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ,Ｊ.Ａ. Ｓｅｘ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ−Ａ Ｊｏｕｒｎｅｙ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｆｉｖｅ Ｄｅｃａｄｅｓ. Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３８, １９７-２０７ (２００６)に基づいて作製されたものである。Ｃｈｅｎ, Ｓ.Ｙ. ｅｔ ａｌ. Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｂｅｎｚｏ(ａ)ｐｙｒｅｎｅ-ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ６４, ３６１７-３６２３ (２００４)といった論文で述べた［ＳＣＧ２］は、この実施例でも使われています。本発明で使われる細胞は、１０%のウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ、特殊血清）を含んでいるダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）(ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ, Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ, ＮＹ)で維持された。ＡＦＢ１はＤＭＳＯで溶解され、処置が培養基において行われた。
【００７１】
免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡
培養されたＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ細胞はカバースリップの上に置かれて２０ mＭ のＡＦＢ１または０.１% のＤＭＳＯで三時間処置された後、４%のパラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ, ｐＨ ７.４）（溶液Ｉ）によって室温で２０分固定された。そうした細胞は透過溶液（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（定着液Ｉに０.５%のトリトンＸ-１００を加えたもの）の中で室温で５分培養された後、そのカバースリップはブロッキング液(５%ＢＳＡ 加 ＰＢＳ)とともに室温で一時間インキュベート（保温）され、そしてウサギ抗ＧＮＭＴ抗血清（１:２００）とともにもう一時間インキュベートされた。ＦＩＴＣ（蛍光色素）を共役しているヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が第二の抗体として使われた。核はヘキスト３３２５８（シグマアルドリッチ）で対比染色された。共焦点顕微鏡は、オリンパスＦｌｕｏｖｉｅｗアルゴンとクリプトンスキャニングレーザーシステムと、Ｆｌｕｏｖｉｅｗイメージ分析ソフトウェア(Ｏｌｙｍｐｕｓ, Ｍｅｌｖｉｌｌｅ, ＮＹ)といった装備を整えているオリンパスＩＸ７０倒置蛍光顕微鏡を用いて実行された。
【００７２】
ＬＧＡドッキング
ＬＧＡがＡＦＢ１といろいろな形のＧＮＭＴとのインタラクションサイトを解明するのに用いられた。ソフトウェアのＡｕｔｏｄｏｃｋ ３.０が最も良いリガンド結合インタラクションを確認するのに使われた。前述のとおり、ネズミＧＮＭＴからのＸ線結晶学データがドッキングという目的に使われたのは、ネズミＧＮＭＴおよび人間のＧＮＭＴはアミノ酸配列で９１%のホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有しているからである。(Ｐａｋｈｏｍｏｖａ,Ｓ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５７, ３３１-３３７, ２００４) パラメータは、１０ ｒｕｎと５０の集団サイズ、２７,０００世代または２.５×１０５のエネルギー評価に達する停止基準を含んでいる（先に出るのはどちらでも可能）。二乗平均平方根偏差の群集構造（Ａ ｒｏｏｔ ｍｅａｎ ｓｑｕａｒｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）の許容偏差値０.５ Aはリガンドの結晶座標から計算されたものである。手続きの詳細は前のレポートを参照。(Ｍｏｒｒｉｓ ＧＭ ｅｔ ａｌ. Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ １９, １６３９-１６６２, １９９８)
【００７３】
細胞毒性評価
ＭＴＴ分析評価は、ＡＦＢ１の細胞毒性効果を決めるのに用いられた。省略して表現すると、細胞は９６穴プレートに播かれて培養されている。評価の時点において、培養液は１０ mＬのＭＴＴ貯蔵液（５ｍｇ/ｍＬ）を含んでいる１００mＬの新鮮液に穴ずつ替えられた。ＭＴＴで４時間細胞にラベルをつけたら、その新鮮液は穴ずつ１００ mＬのＤＭＳＯに３７°Ｃで１０分替えられた。そのような試料を混合し５４０ｎＭで吸光度を測定した。半數致死濃度（ＬＣ５０）の測定に、７０００個のＨｕＨ-７細胞は９６穴プレートに播き１８時間培養した。細胞はそれぞれ異なる濃度のＡＦＢ１で処置され、そしてＭＴＴ分析評価は一連の時点において一組ごとに三回実行された。生存率は、実験群におけるＯＤ値割る溶媒対照群におけるＯＤ値によって計算される。そういった細胞毒性評価を行うために、５０００個のＨｕＨ-７細胞は異なる量のアデノウイルスまたはＧＮＭＴ ｃＤＮＡを有するレンチウイルスに８時間感染してから、その培養液を替えまた１０時間培養される。７２時間のＡＦＢ１処置の後、ＭＴＴ分析評価は生存率を測定するのに実行された。
【００７４】
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体は競合 ＥＬＩＳＡ 法で測量
ＧＮＭＴの保護効果を評価するために、安定ＳＣＧ２-１-１細胞クローンまたはＧＮＭＴ組み換えアデノウイルス(Ａｄ-ＧＮＭＴ)に感染したＨｅｐＧ２細胞は一晩中１０ｃｍのペトリ皿で培養され、ＡＦＢ１または０.１%のＤＭＳＯで１６時間処理されて、それからＤＮＡ抽出が行われた。すべての試料は、すべての開環型付加体（ａｄｄｕｃｔｓ ｉｎ ｒｉｎｇ-ｏｐｅｎｅｄ ｆｏｒｍ）の中和を確実にするために、１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３と３０ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ ９.６）で３７°Ｃで二時間処置された。Ｈｓｉｅｈ,Ｌ.Ｌ. ｅｔ ａｌ., Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｆｌａｔｏｘｉｎ Ｂ１-ＤＮＡ ａｄｄｕｃｔｓ ｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ. Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ. ４８, ６３２８-６３３１ (１９８８)という論文で述べてられているように、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体レベルは６Ａ１０抗体を使っている競合ＥＬＩＳＡ法で測定された。各々のＥＬＩＳＡ分析は三回実行された。吸光度なら４９０ｎＭで測定した。
【００７５】
ｐＰＥＰＣＫｅｘ−ｆｌＧＮＭＴトランスジェニックの構築
我々は肝臓と腎臓に特異的なトランスジェニックベクターであるｐＰＥＰＣＫｅｘを使用しました。それはマウスホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(ＰＥＰＣＫ; Ｖａｌｅｒａ,Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ９１, ９１５１-９１５４, １９９４) プロモーターと、０.３ｋｂの合成イントロン（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｎｔｒｏｎ）、０.６ｋｂのヒト成長ホルモンポリＡシグナル（Ｐｏｌｙ Ａ Ｓｉｇｎａｌ）を含む。ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴトランスジェニックプラスミドは、１.２ｋｂのヒトＧＮＭＴ ｃＤＮＡ (９-１-２ プラスミドより; Ｃｈｅｎ,Ｙ.Ｍ. ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ ７５, ７８７-７９３, １９９８) をｐＰＥＰＣＫｅｘベクターにおける制限酵素サイトであるＮｏｔＩとＸｈｏＩに挿入することによって構築された。ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドをＡｓｃＩで制限酵素消化後の線形４.３ｋｂの断片はマイクロインジェクション法において使われた。
【００７６】
ＧＮＭＴ ＴＧマウスの生成
ＧＮＭＴ ＴＧマウスはＦＶＢ受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出され、特定病原フリー（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｆｒｅｅ）の施設で育てられた。それらの尾は生後３週間での離乳期で切られた。ゲノムＤＮＡは、プロテイナーゼＫ(ＰＫ)とドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を組み合わせた前処理法（Ｐｒｏｍａｇａ）、そしてフェノール/クロロホルム抽出法によって単離された。そして、そうしたＴＧマウスの遺伝子型はＰＣＲで測定された。ＧＮＭＴ-ＴＧを見つけるために、６６８-ｂｐのヒトＧＮＭＴ特異的なＤＮＡ断片はＰＣＲプローブによって９４℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（１分）といったサイクル条件でプライマーのＧＮＭＴ-Ｆ ５’- ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣ-３’およびＧＮＭＴ-Ｒ ５’- ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣ-３’を用いて３０サイクルで増幅された。
【００７７】
大量のＡＦＢ１ の投与
本発明で使われるＡＦＢ１(Ｓｉｇｍａ Ｃｏ, Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ, ＭＯ) は濃度０.２ｍｇ/ｍＬのトリカプリリン（Ｓｉｇｍａ）に溶かされたものである。生後７日目に各グループの６匹以上のマウスは腹膜内にアフラトキシンＢ１を注射し（ＡＦＢ１ １０ｍｇ/ｋｇ体重）、そして２ヵ月後同じ投与量を追加した。そのプロトコルは前にＧｈｅｂｒａｎｉｏｕｓとＳｅｌｌによって修正された(Ｇｈｅｂｒａｎｉｏｕｓ,Ｎ. ＆ Ｓｅｌｌ,Ｓ. Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７, ３８３-３９１,１９９８)。注射後９ヵ月で、そうしたマウスは病理検査のために犠牲になった。病理組織検査のために、器官（肝臓と肺、腎臓を含む）の５分の２は１０%のホルマリンで固定され；残りの器官はｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションやＤＮＡとＲＮＡ、タンパク質分析のため、-８０℃で保存された。
【００７８】
ＲＮＡ分析
メーカーの指示に従い、全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ, Ｃａｒｌｓｂａｄ, ＣＡ)によって凍った組織から抽出された。全ＲＮＡ試料のための量は分光光度計で定量化された。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは前述の通りに実行された。ｃＤＮＡプローブはプラスミド９-１-２におけるヒトＧＮＭＴ遺伝子によって作製され、相補的ＤＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ-Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いて肝臓ＲＮＡ（２mｇ）から作り出された。ＧＮＭＴのためのプライマー配列はＦ１: ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＣとＲ１: ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣで、β-アクチンのためのプライマー配列はＦ２: ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡとＲ２: ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣである。ＰＣＲ条件は下記の通りである：９４°Ｃで５分間のプレ変性（ｐｒｅ-ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、９４℃（３０秒）と６０℃（３０秒）、７２℃（１分）で３０サイクルの増幅に次いで７２°Ｃで１０分の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行った。
【００７９】
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析を実行するために、１０μｇの全部の肝臓タンパク質抽出物は１０%のＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分離され、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜(ＰＶＤＦ; Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ, Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ, ＮＪ)に転写された。その手順はＷａｘｍａｎ,Ｄ.Ｊ. ＆ Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ,Ｃ. Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｘ-Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｌｉｖｅｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０, ２６１３ (２００６) に記述してある。その分析において、マウス抗ＧＮＭＴ単クローン性抗体（ｍＡＢ）１４-１はＧＮＭＴ２０を検出するのに用いられた。
【００８０】
ＧＮＭＴ酵素活性分析
この分析はＣｏｏｋ,Ｒ.Ｊ. ＆ Ｗａｇｎｅｒ,Ｃ. Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｎ-ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｓ ａ ｆｏｌａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｃｙｔｏｓｏｌ. Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ８１, ３６３１-３６３４ (１９８４)という論文で述べてある手順によって修正されたものである。それはＧＮＭＴ-ＴＧマウスから採った肝臓組織のＧＮＭＴ酵素活性を測るのに用いられた。一部分の肝臓は０.２５Ｍの蔗糖と１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのアジ化ナトリウム、そして０.１ｍＭのｐｈｅｎｙｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｏｕｒｉｄｅを含んでいる３倍容量の氷冷リン酸バッファー（１０ｍＭ、ｐＨ ７.０）によって均質化された。３０分間２０,０００Ｘ ｇで遠心分離された後、産物として生じた上清液は取り除かれ、２-メルカプトエタノールは最終濃度１０ｍＭに加えられる。タンパク質の濃度を測ったら、２５０ｕｇのタンパク質は１００ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ ７.４）と５０ｍＭのグリシン、０.２３ｍＭのＳＡＭｅ、そして２.１６ｕＭの Ｓ-アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］−メチオニン（Ｓ-ａｄｅｎｏｓｙｌ-Ｌ-[ｍｅｔｈｙｌ-３Ｈ]-ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）（７６.４Ｃｉ/ｍｍｏｌ）を有する１００ｕｌの反応混合物に加えられた。３７°Ｃで３０分培養した後、反応は１０％トリクロロ酢酸と５%の活性炭との混合物５０ｕｌを添加することによって終了した。各反応は三回実行される。
【００８１】
免疫組織化学的染色方法
ＧＮＭＴタンパク質に対する免疫組織化学による発現解析はモノクローナル抗体（ｍＡＢ）１４-１を１:２００希釈で使用することによって実施された。パラフィンに包埋した肝臓の部分（４ｕｍ）はＧＮＭＴ抗体とともに培養され、メーカーの指示に従いＤＡＢキット（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）で検出した。
【００８２】
ＡＦＢ１によって誘発されるＧＮＭＴ核転座である
ＧＮＭＴ ｃＤＮＡはＨＡ２２Ｔ/ＶＧＨ細胞にＡＦＢ１またはＤＭＳＯ（溶媒対照）を１６時間トランスフェクトした。（図１０ＡとＢ）図１０で示すように、ＧＮＭＴ分布は最初に細胞質に制限された（図１０Ａ）が、ＡＦＢ１処置（図１０Ｂ）の後で、細胞核に部分的に転位した。そうした結果は、ＡＦＢ１（およびＢａＰ）がＧＮＭＴ核転座を誘発することを示した。
【００８３】
また、それはＡＦＢ１で処置した細胞中でＧＮＭＴに核転座が生じたことを証明し、ＧＮＭＴはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を減らす、そしてＡＦＢ１で処置した細胞の生存率を上昇させることができることを示した（図１０）。ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加物形成は肝臓発ガンに関係する(Ｂｒｅｓｓａｃ,Ｂ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２９-４３１, １９９１; Ｈｓｕ,Ｉ.Ｃ. ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ３５０, ４２７-４２８, １９９１)。そして、肝細胞におけるＧＮＭＴの減少がその発ガン物質に対する肝臓の敏感性を増やすことも証明された。したがって、ＧＮＭＴはそうした環境発ガン物質に対する細胞の防衛機構に関係する。
【００８４】
ＧＮＭＴ-ＡＦＢ１インタラクションのモデリング
Ｌａｒｍａｒｃｋｉａｎ 遺伝アルゴリズム(ＬＧＡ) とＸ線結晶学データの組合せはＧＮＭＴとＡＦＢ１間の物理的インタラクションを予測するのに用いられた。ネズミＧＮＭＴタンパク質はアミノ酸配列においてヒトＧＮＭＴタンパク質と９１%のホモロジーを持っているので、我々はネズミＧＮＭＴタンパク質に対するＸ線結晶学データによりＡＦＢ１ドッキング実験が行われた。表７で示すデータによると、ＡＦＢ１はＧＮＭＴの二量体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋコード１Ｄ２Ｃ）と四量体（１Ｄ２Ｇ）形成と低い結合エネルギーレベルで（それぞれ-９.４１と-１０.０６ ｋｃａｌ/モル）結合した。
【００８５】
表７ Ｌａｒｍａｒｃｋｉａｎ 遺伝アルゴリズムを用いて行ったＧＮＭＴタンパク質とＡＦＢ１ 分子ａ間のドッキングの探索
ＡＦＢ１とＳＡＭｅ（-９.８５ｋｃａｌ/モル）に結合しないＧＮＭＴ二量体（１ＸＶＡ）間の結合エネルギーを、ＡＦＢ１とすでにＳＡＭｅ（５３.２５ｋｃａｌ/モル）に結合しているＧＮＭＴ二量体間の結合エネルギーと比較したら、その結果はＡＦＢ１はＳＡＭｅと同じ結合部位を争ってＧＮＭＴと結合することを指摘する。ＡＦＢ１分子（およびＢａＰ）はＧＮＭＴ二量体と四量体において分子配向性（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が少し違うが、分子バスケット（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｋｅｔ）内部に同じ位置にある（図１１Ａ）。ＧＮＭＴアミノ酸残基がＡＦＢ１（Ａｌａ６４とＶａｌ６９、Ｌｅｕ１３６、Ｇｌｙ１３７、Ｓｅｒ１３９）の極近くにあることは図１１Ｂに示される。
【００８６】
その実施例は(ａ) ＧＮＭＴの基質ＳＡＭｅ結合部位にＡＦＢ１結合性領域があること、そして（ｂ）ＡＦＢ１はＧＮＭＴの二量体と四量体形成の両方とも結合することを指摘する。ＧＮＭＴ四量体（１Ｄ２Ｇ）のＲ１７５Ｋ変異体形成（ｍｕｔａｎｔ ｆｏｒｍ）は、結合部位のすぐ近く（~５ A）にあるＲ/Ｋ残基がＧＮＭＴ-ＡＦＢ１集団構造（ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にほとんど効果を及ぼさないことを証明するのに用いられた（表７）。その結果は、ＧＮＭＴが分子バスケットであるという議論と一致する。この独特の構造は、ＧＮＭＴはＳＡＭｅだけでなくベンゾピレン（ＢａＰ）のような多環式芳香族炭化水素（ＰＡＨ）分子と結合することができるという事実と一致していと考えられる。ＧＮＭＴの結晶構造により、ＧＮＭＴの活性部位の内面にある多くのチロシン残基（３３、４４、１７７、１９４、２２０、２４２、２８３）が他の残基とともに発ガン物質に相互作用している環境を提供する可能性もある。ＧＮＭＴがＡＦＢ１とも結合することができることとも思われる。
【００８７】
ＡＦＢ１によって誘発された細胞毒性はＧＮＭＴによって拮抗される
ＭＴＴ分析は細胞の生存率を判定するのに用いられた。細胞毒性分析の条件を最適化するために、ＨｕＨ-７細胞は一連の時点で異なる濃度のＡＦＢ１で処置された。図１１Ａで示すように、ＡＦＢ１の半（數）致死濃度（ＬＣ５０）は処置の持続時間によるものである。１６ mＭ に達するＡＦＢ１処置は細胞毒性効果が２４時間以内で不分明である。しかし、処置の４８時間後にＨｕＨ-７細胞は４ mＭのＡＦＢ１で処置されたグループさえ、生存率がかなり下がった。７２時間でＡＦＢ１のＬＣ５０はおよそ１２ mＭである。ＡＦＢ１処置を受けた細胞にＧＮＭＴの影響を判明するために、我々はＧＮＭＴ ｃＤＮＡを運んでいるアデノウイルスを感染させることによってＨｕＨ-７細胞内でＧＮＭＴたんぱく質を発見した。Ａｄ-ＧＦＰコントロールウイルスに感染しているＨｕＨ-７細胞と比較したら、ＡＦＢ１で処置されたＨｕＨ-７細胞の生存率は少し増加したが、Ａｄ-ＧＮＭＴを投与すればかなり増加する（図１１Ｂ）。類似した結果は、ＧＮＭＴ遺伝子がレンチウイルスベクターによって導入された別個のシステムで観察された（図１１Ｃ）。そうした結果は、ＧＮＭＴがＡＦＢ１処置によって誘導される細胞毒性効果に拮抗することができることを証明した。
【００８８】
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの抑制影響
ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成に対するＧＮＭＴの影響を判明するために、我々は抗体６Ａ１０で競合酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を行うことによってＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を測り、ＨｅｐＧ２細胞株-ＳＣＧ２-１-１とＳＣＧ２-ｎｅｇから得る一対の安定クローンおよびＧＮＭＴ組み換えアデノウイルスに感染されたＨｅｐＧ２細胞を利用する。
【００８９】
細胞は、ＤＮＡ抽出の前にＤＭＳＯと異なる濃度のＡＦＢ１で１６時間処置されました。その間、明らかな細胞毒性効果がなかった。ＳＣＧ２-１-１細胞中のＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の量は、ＳＣＧ２-ｎｅｇ細胞中のその量のおよそ５０%になった（図１１Ｄ）。さらに、ＧＮＭＴ組み換えアデノウイルス（ａｄ-ＧＮＭＴ）の感染によるＧＮＭＴ過剰発見も、投与する方法によってＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らした（図１１Ｅ）。Ａｄ-ＧＦＰに感染された細胞と比較して、５ＭＯＩ のＡｄ-ＧＮＭＴに感染されたＨｅｐＧ２細胞は両方のＡＦＢ１濃度でも４０%を超えるＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成の減少という結果となる。５０ＭＯＩのＡｄ-ＧＮＭＴに感染されたＨｅｐＧ２細胞はＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成がおよそ７０%の減少が見られた。実験の結果は、抑制率に基づくＡＦＢ１-ＤＮＡ形成量によって計算された。それは、実験のデータにより、コントロール細胞（Ａｄ-ＧＦＰに感染されたＳＣＧ２-ｎｅｇ細胞とＨｅｐＧ２細胞）と比較して、ＧＮＭＴを発現している細胞で形成したＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の数がかなり減少したことを指摘した。それは、ＧＮＭＴにはＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体形成を減らすことによってＡＦＢ１処置を受けた細胞に対する保護役割があることを証明した。
【００９０】
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスの作製
生体内でＡＦＢ１によって誘発された発ガンに対するＧＮＭＴの影響を判明するために、ヒトＧＮＭＴトランスジェニックマウス（ＴＧ）モデルは作製された。ＧＮＭＴ-ＴＧマウスを生み出すのに用いられるプラスミドは図１４ａに示されたようにｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドである。それはマウスＰＥＰＣＫプロモーター（Ｖａｌｅｒａ,Ａ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕ. Ｓ. Ａ ９１, ９１５１-９１５４, １９９４）でヒトＧＮＭＴ発現を駆動することができる。ＧＮＭＴ-ＴＧマウスはＦＶＢ受精卵の前核へのマイクロインジェクションによって生み出された。ノーザンブロット解析法は、ヒトＧＮＭＴが予想の通り、特にマウスの肝臓と腎臓で発見することを証明した（図１４Ｂ）。
【００９１】
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスのＧＮＭＴの発見プロフィールは、ＲＴ-ＰＣＲ法およびウエスタンブロット分析で測定されました。図１２Ａで示すように、野生型マウスは年齢増加とともにＧＮＭＴのｍＲＮＡ表現レベルが増加し、生後７週間でプラトーに達した。特に一週目と３週目の時点で、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスは野生型マウスよりＧＮＭＴ ｍＲＮＡの遺伝子発現レベルが高かった。そのうえ、ウエスタンブロット分析は示したが、生後一週間~三週間で雄の野生型マウスはＧＮＭＴのタンパク質レベルが検知することが不可能だが、生後一週間で雌の野生型マウスはＧＮＭＴのタンパク質が低い発現レベルで検知されることができる。対照的に、雄と雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは両方とも生後一週間でタンパクの量がより高かった（図１２Ａ）。そうした結果は、生後１-３週間で野生型のマウスよりＧＮＭＴ-ＴＧマウスのほうはＧＮＭＴ発現が高いことを示した。さらに、我々はＧＮＭＴ-ＴＧマウスでＧＮＭＴ酵素活性を、野生型マウスで肝臓ライセートを検知した。生後九週と１１週間でＧＮＭＴ-ＴＧマウスにおけるＧＮＭＴ酵素活性は野生型マウスよりかなり高かった（ｐ＜０.０５）が、生後九週間での雄は唯一の例外である（図１２Ｂ）。
【００９２】
その実験において、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスには特異的なダイエットが提供されなかった。特に生後一週目と３週目でＧＮＭＴ-ＴＧマウスは野生型マウスより肝臓におけるＧＮＭＴ遺伝子発見レベルが高く（図１２Ａ）、そして生後七週目でプラトーに達した。
【００９３】
ＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成はＧＮＭＴ-ＴＧマウス体内で遮断
ＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスは腹膜内にＡＦＢ１が投与され、生後１１ヵ月目で犠牲になった。その雄と雌のマウスのかかる肝腫瘍の全体的な発病率は表八で見られた。
【００９４】
表８ ＡＦＢ１溶媒で処置された２つの遺伝子型のマウスにおける肝腫瘍形成。
ＡＦＢ１で処置された雄と雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは両方とも肝腫瘍が形成しなかったが、
ＡＦＢ１で処置された６匹の雄の野生型マウスのうちで４匹（６７%）は肝腫瘍が形成された。また、溶媒（ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）で処置されたマウスは腫瘍が検知されなかった。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度は、生後１１ヵ月目でＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウスの肝機能をモニターするために測定された。ＡＦＢ１処置群において、雄の野生型マウスは雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスより平均血清ＡＬＴ値が高かったが、雌のＧＮＭＴ-ＴＧマウスと野生型マウス間で差がなかった。病理検査は、ＡＦＢ１処置を受けた雄の野生型マウスには異形成とＨＣＣがある（図１３Ａ）ものの、ＡＦＢ１処置を受けた雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは正常のパターンが観察される（図１３Ｂ）ことを明らかにした。免疫組織化学的染色は、ＧＮＭＴは正常の肝細胞の場合にはサイトゾールでその発現が豊かであった（図１３Ｄ）ものの腫瘍細胞の場合にはそれが減少した（図１３Ｃ）ことを証明しました。その現象は、ウエスタンプロット分析によって確認される（図１３Ｅ）し、ヒトＨＣＣでも観察される。
【００９５】
ＡＦＢ１処置の実験では、マウスらはＧＮＭＴ-ＴＧマウスにおけるＧＮＭＴの発現が野生型マウスより高かった時、ＡＦＢ１を注射した。その結果は、ＧＮＭＴ-ＴＧマウスは雄とも雌とも肝腫瘍形成が出ないが、ＡＦＢ１で処置された６匹の雄の野生型マウスのうちで４匹（６７%）は肝腫瘍が形成した（表８）ことを示しました。その実施例において、雄の野生型マウスにおける肝腫瘍形成率は１０%から６７%まで増加した。同じ処置手順で、雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスは肝腫瘍形成が出なかった。さらに、ＧＮＭＴタンパク質は低い濃度でもウエスタンプロット分析によって生後一週間という早い時期に雌マウスの肝臓で検知されることができる。そうしたＧＮＭＴタンパク質は保護効果を及ぼし雌の野生型マウス体内でＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成を防いだ（ＡＦＢ１で処置された雌マウスは一匹も肝腫瘍が形成しなかった）。その実験は、ＧＮＭＴは雄のＧＮＭＴ-ＴＧマウスをＡＦＢ１によって誘発された肝腫瘍形成から守ることができることも証明した。
【００９６】
さらに、病理検査は、ＡＦＢ１で処置された野生型マウスで形成した肝腫瘍はＨＣＣであることを確認した（図１３Ａ）。免疫組織化学的染色およびウエスタンプロット分析から得た結果は、腫瘍組織におけるＧＮＭＴ発現レベルが低下することを示した（図１３ＣとＥ）。その結果は我々の前のヒトＨＣＣに対する調査結果と首尾一貫しており、それに、発ガンに対するＧＮＭＴ制御性においてマウスと人間は非常に類似していることを示唆した。したがって、ＧＮＭＴは発ガンの予防において役に立つことが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】目標ベクターを構築する策略が表されている。
【図２】ＧＮＭＴ遺伝子座に対して予測される修正が表されている。(Ａ)目標ベクターはＧＮＭＴエクソン１−４と一部分のエクソン５でネオマイシン耐性遺伝子に入れ替わるという設定がされている。ネオマイシン正の選択マーカーは二つの相同の部分がついており、そして目標ベクターの３’ 端でＴＫ（チミジンキナーゼ）負の選択マーカーが付け加えられる。(Ｂ) 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）クローンについてのサザンブロット分析。ＢａｍＨＩ（Ｂ）-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片サイズは、７.９ｋｂ（野生型対立遺伝子）から５.３ｋｂ（組み換え型対立遺伝子）に減少した。(Ｃ) ＰＣＲ(遺伝子増幅)法によるＧＮＭＴノックアウトマウスの遺伝子型。正常なＧＮＭＴ対立遺伝子は７７２ ｂｐ断片を生じ、分離された対立遺伝子は４０９ｂｐ断片を生じた。野生型+/+と、ＧＮＭＴヘテロ+/-、-/- ＧＮＭＴ -/-マウス。 (Ｄ)ＧＮＭＴタンパク質の発見はウエスタンプロット分析により確認されました。個々のレーンは１０ mｇの肝臓ライセートを含んでいる。ＧＮＭＴ分子量：３２ ｋＤａ。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素）：内部標準。
【図３】遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルにおけるリアルタイム定量ＰＣＲ法は炭素一炭素代謝経路に参与することが表されている。ＷＴＭ (野生型の雄)とＫＯＭ (ＧＮＭＴ -/- 雄)、ＫＯＦ (ＧＮＭＴ -/-雌)の肝臓組織でのｍＲＮＡ発見プロフィールはＷＴＦ (野生型の雌)マウスに正常化された。*, ｐ＜０.０５. Ａｈｃｙ（Ｓ-アデノシルホモシステイン加水分解酵素）；Ｍｓ（メチオニンシンターゼ）；Ｃｂｓ（シスタチオニン-β-シンターゼ）；Ｍｔｈｆｒ（５-１０メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素）；Ｍｔｈｆｄ１（メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ）（ＮＡＤＰ+ 依存性）；メテニルテトラヒドロホール酸シクロヒドロラーゼ（ｍｅｔｈｅｎｙ ｌｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）；ホルミルテトラヒドロ葉酸シンターゼ；Ａｌｄｈ１ｌ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１家族、メンバーＬ１）；Ａｔｉｃ（５-アミノイミダゾール-４-カルボキサミドリボヌクレオチドホルミルトランスフェラーゼ/ＩＭＰシクロヒドロラーゼ）；Ｓｈｍｔ２（セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ２）；Ｍｔｈｆｓ（５,１０-メテニルテトラヒドロホール酸シンテターゼ）；Ｆｔｃｄ（ホルムイミノトランスフェラーゼシクロデアミナーゼ）。
【図４】ＧＮＭＴ -/-マウスは肝腫大を起こし、血清ＡＬＴ値レベルが著しく高いことが描かれている。(Ａ)肝臓の重量対体の重量の比率。(Ｂ)野生型やＧＮＭＴ +/-、ＧＮＭＴ -/-マウスの血清ＡＬＴ値レベルの比較。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１．どちらも野生型のマウスと比較されている。
【図５】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスの肝臓病理検査を表している。肝臓の肉眼検査は雄の野生型(Ａ)と、雄ＧＮＭＴ +/-(Ｂ)、雄ＧＮＭＴ -/- (Ｃ)、そして雌ＧＮＭＴ -/-マウス(Ｄ)である。そうしたマウスは犠牲になる前に八時間も断食した。肝臓組織のＨＥ染色が行われるのは生後１１週間の雄の野生型（ＥとＩ）をはじめ、雄ＧＮＭＴ +/-（ＦとＪ）と雄ＧＮＭＴ -/-（ＧとＫ）、雌ＧＮＭＴ -/-（ＨとＬ）、生後九週間の雄ＧＮＭＴ（Ｑ）、そして生後九週間の雌ＧＮＭＴ -/-マウス（Ｓ）である。肝臓組織のＰＡＳ染色が行われるのは生後１１週間の雄の野生型（Ｍ）をはじめ、雌の野生型（Ｎ）と雄ＧＮＭＴ -/-（Ｏ）、雌ＧＮＭＴナル（Ｐ）、生後九週間の雄ＧＮＭＴ -/-（Ｒ）、そして生後九週間の雌ＧＮＭＴ -/-マウス（Ｔ）である。拡大：Ｅ-Ｈ には１００Ｘ, Ｉ-Ｔには ４００Ｘ。
【図６】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスの血液生化学的パラメータによる血液学と分析を表している。(Ａ) 野生型のマウス（ソリッドサークル）とＧＮＭＴ -/-マウス（オープンサークル）において白血球や好中球、リンパ球、単球、好酸球、そして好塩基球も視野に入れている。水平のバーは平均値を示します。(Ｂ) 野生型（ソリッドサークル）とＧＮＭＴ -/-マウス（オープンサークル）における血清グルコースやコレステロール、トリグリセリドのレベルである。水平のバーは平均血清濃度を示す。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１。どちらも野生型マウスと比較している。
【図７】遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルにおけるリアルタイム定量ＰＣＲ分析はいろいろな種類の糖原病（ＧＳＤ）に繋がっていることが示されている。ｍＲＮＡの発現プロフィールは野生型のマウスには正常化された。(Ａ)そのマウスの生後１１週間目；(Ｂ)そのマウスの生後九ヶ月目。*, ｐ＜０.０５; **, ｐ＜０.０１。Ｇｙｓ２（グリコーゲンシンターゼ２）；Ｇ６Ｐａｓｅ（ぶどう糖 ６-ホスファターゼ）；Ｇ６ＰＴ（グルコース-６-リン酸輸送体）；Ｇａａ（アルファ-グルコシダーゼ）；Ａｇｌ（アミロ-１,６-グルコシダーゼ）；Ｇｂｅ１（ブランチングエンザイム１）；Ｐｙｇｌ（グリコーゲンホスホリラーゼ）；Ｐｈｋａ２（ホスホリラーゼキナーゼアルファ２）；Ｆｂｐ１（フルクトース１,６-ビスホスファターゼ）；そしてＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ）。
【図８】雄と雌ＧＮＭＴ -/-マウスには超音波や磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、肉眼検査、ＨＥ染色、そしてレチクリン染色が行われた結果である。雄ＧＮＭＴ -/-(Ａ)と雌ＧＮＭＴ -/-(Ｇ)は肝臓に超音波が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (ＢとＣ)と雌ＧＮＭＴ -/-マウス (ＨとＩ)は肝臓にＭＲＩとＭＲＩ再構成が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (Ｄ)と雌ＧＮＭＴ -/-マウス(Ｊ)は肝臓に肉眼検査が行われ；雄ＧＮＭＴ -/- (Ｅ)と雌ＧＮＭＴ -/- (Ｋ)は肝臓にＨＥ染色が行われ；そして雄ＧＮＭＴ -/- (Ｆ)と雌ＧＮＭＴ -/- (ｌ)は肝臓組織にレチクリン染色が行われた。
【図９】野生型とＧＮＭＴ -/-マウスはいくつかの早期の原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）マーカーに対するリアルタイム定量ＰＣＲ分析（グリピカン-３やＬＹＶＥ１、サバイビン、そしてα‐フェトプロテイン）が示されている。
【図１０】アフラトキシンＢ１による処理に次いでグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)における(Ａ-Ｂ)核移動が示されている。カバースリップに載せられているＨＡ２２Ｔ細胞は５mｇ ＧＮＭＴ-フラッグでトランスフェクトされ、そしてＲ４ (ウサギアンチＧＮＭＴ) 抗血清で治療するか反応する前に溶媒のＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド) (Ａ)または４０ mＭ ＡＦＢ１ (Ｂ)によって処理されました。免疫蛍光染色には、われわれはＦＩＴＣ（蛍光色素）を共役しているヤギ抗ウサギ抗体を用いた。核はヘキスト３３２５８で染色された。バー：２０ mＭ。(Ｃ-Ｅ)ベンゾピレン（ＢａＰ）のモデルと、ラマルキアン式の遺伝的アルゴリズムによって四量体形のＧＮＭＴと分子結合したアフラトキシンＢ１(ＡＦＢ１)である。(Ｃ) Ｓ-アデノシルホモシステインに結び付いた四量体形のネズミＧＮＭＴ（シアン）(ＰＤＢコード１Ｄ２Ｈ) と分子結合されたＢａＰ（緑）とＡＦＢ１（赤い）分子である。(Ｂ) ＢａＰ（緑）とＡＦＢ１（赤い）分子の分子結合モデルを示すモノマーである。ＧＮＭＴ構造(ＰＤＢコード１Ｄ２Ｈ)とＧＮＭＴ-ＡＦＢ１錯体の分子結合モデルによりいくつかのＡＦＢ１炭素原子のすぐ近くにあるＧＮＭＴアミノ酸残基（Ａｌａ６４, Ｖａｌ６９, Ｌｅｕ１３６, Ｇｌｙ１３７ ａｎｄ Ｓｅｒ１３９）が示されている。(Ｅ) ＡＦＢ１ (左)およびＢａＰ (右)の構造。
【図１１】ＧＮＭＴはＡＦＢ１の細胞毒性効果を拮抗することが示されている。(Ａ-Ｃ) ＡＦＢ１の誘発した細胞毒性は、ＧＮＭＴ過剰発現によって減少される。ＭＴＴ分析評価は、ＡＦＢ１で扱われるＨｕＨ-７細胞の生存率を決めるのに用いられた。Ａ、いくつかの時間に異なった量のＡＦＢ１で処理するＨｕＨ-７細胞の生存曲線である。５０パーセントの発育阻止濃度はその処理の持続期間によるものである。ＨｕＨ-７細胞にＡＦＢ１で７２時間処理したＩＣ５０は１２ｕＭ程である。Ｂ、ＨｕＨ-７細胞はＧＮＭＴ遺伝子またはＧＦＰ支配遺伝子を運ばれるアデノウイルスに１６時間感染された。ＡＦＢ１で７２時間処理された後、細胞はＭＴＴ分析評価を受けた。ＨｕＨ-７細胞の生存率は、Ａｄ-ＧＮＭＴの投薬によって多少増加した。８ｕＭの ＡＦＢ１で処理されたＨｕＨ-７細胞のグループで、ＨｕＨ-７細胞の生存率は、Ａｄ-ＧＮＭＴの投薬によってかなり増加した。Ｃ、類似した結果は他のシステムでも観察されたが、ＨｕＨ-７細胞はレンチウイルスベクターによってＧＮＭＴ遺伝子を導入された。* ｐ＜０.０５、 ** ｐ＜０.０１。(Ｄ-Ｅ) ＧＮＭＴ過剰発現は、ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体の形成を減少した。Ｄ、ＳＣＧ２-ｎｅｇとＳＣＧ２-１-１細胞は、ＤＮＡ抽出の結果を得る前にＤＭＳＯや示された濃度の ＡＦＢ１で処理された。ＡＦＢ１-ＤＮＡ付加体は、競合 ＥＬＩＳＡ 法で測定された。白いバーと灰色のバーはそれぞれＳＣＧ２-ｎｅｇとＳＣＧ２-１-１を示す。データは、ｍｅａｎ±ＳＤを代表する。*, ｐ＜０.０１; **, ｔ-検定によるｐ＜０.００１。Ｅ、Ａｄ-ＧＦＰとＡｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞は、この分析評価を実行するのに用いられました。白いバーは、Ａｄ-ＧＦＰを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示し;灰色のバーは、５ ＭＯＩ Ａｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示し;黒色のバーは、５０ ＭＯＩ Ａｄ-ＧＮＭＴを感染しているＨｅｐＧ２細胞を示す。*一元配置(一要因の)分散分析による。
【図１２】ＧＮＭＴ-ＴＧと野生型のマウスにあるＧＮＭＴの発現プロフィールと酵素活動が説明されている。Ａ、１、野生型の雄（開いているダイヤモンド）；２、トランスジェニック雄（閉じたダイヤモンド）; ３、野生型の雌（開いている正方形）；そして４、トランスジェニック雌（閉じた正方形）におけるＧＮＭＴタンパク質濃度は、ウエスタンブロット分析（上部のパネル）と量的データ（下部のパネル）によって測定された。その結果により、生後５週間の間でトランスジェニック動物は野生型より多くのＧＮＭＴタンパク質を持つことが判明された。Ｂ、１、野生型の雄;２、トランスジェニック雄;３、野生型の雌；そして４、トランスジェニック雌はＧＮＭＴの酵素活動が比較された。
【図１３】４つのグループの雄マウスの肝臓に、Ｈ＆ＥとＩＨＣ染色が行われたことである。発ガン性物質処理を受けているマウスの肝臓のＨ＆Ｅ染色による顕微鏡写真である。(Ａ) ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理された野生型のマウス（Ｂ）ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理されたＧＮＭＴトランスジェニックマウス。パラフィン固定組織におけるＧＮＭＴ発現の免疫組織化学分析である。(Ｃ) ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理された野生型。（Ｄ）ＡＦＢ１. Ｘ ２００で処理されたＧＮＭＴトランスジェニック。(Ｅ)非腫瘍組織（Ｎ）と腫瘍組織（Ｔ）からの細胞抽出物に対するウエスタンブロット分析。その結果として、３つのマウスグループで腫瘍組織のＧＮＭＴ発現レベルは非腫瘍組織より低いことが判明された。
【図１４】ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴプラスミドの構築が示されている。ｐＰＥＰＣＫｅｘ（ベクター）とｐＳＫ-ｆｌＧＮＭＴ（挿入）はＮｏｔ ＩとＸｈｏ Ｉで消化し結合することによって、ｐＰＥＰＣＫｅｘ-ｆｌＧＮＭＴが生じた。Ｂ.トランスジェニックまたは野生型のマウスのいろいろな臓器におけるマウス内在性とヒトＧＮＭＴ ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット解析法で測定されました。１）ＧＮＭＴトランスジェニックマウスの腎臓ＲＮＡ。２）ＧＮＭＴトランスジェニックマウスの肝臓ＲＮＡ。３）野生型のマウスの脳ＲＮＡ。４）野生型のマウスの腎臓ＲＮＡ。５）野生型のマウスの肝臓ＲＮＡ。その結果は、ＧＮＭＴトランスジェニックマウスは肝臓と腎臓でヒトＧＮＭＴ遺伝子（導入遺伝子）が表現されることを示されている。
【符号の説明】
【００９８】
１０ ＴＫベクター
１１ ファージクローン ３−２
２０ ｐＮｅｏベクター
５０ 右アームのＴＫベクター
６０ 左アームのｐＮｅｏベクター
７０ 目標ベクター
８０ 目標ベクターの直線型
９０ 原内対立遺伝子
１００ 目標対立遺伝子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２または
(ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ３と４であることを特徴とする一対のプライマー。
【請求項２】
表３−１と３−２にリストされる上流にある調節遺伝子および表３−１と３−２、そして表４とにリストされる下流にある調節遺伝子からなることを特徴とするＧＮＭＴノックアウトマウスの調節遺伝子データベース。
【請求項３】
（ａ）生存と増殖：ＰＴＥＮ、Ｐ１３Ｋ、Ａｋｔ１、ＧＳＫ３βまたはβ-カテニン；
（ｂ）ガン遺伝子：サイクリンＤ１、Ｃ−ｍｙｃまたはＣ−ジュン;そして、
（ｃ）腫瘍抑制遺伝子：Ｒｂまたはｐ５３。
からなることを特徴とする肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベース。
【請求項４】
患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与することを特徴とするアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法。
【請求項５】
前記疾患は原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
処置または予防はＡＦＢ１−ＤＮＡ付加体形成を妨害することによってなされることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プラスミドは患者の体に直接施されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成するアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできることを特徴とする合成物。
【請求項９】
ＧＮＭＴが二量体形または四量体形であることを特徴とする請求項８に記載の合成物。
【請求項１０】
主食作物の補助的な添加物であることを特徴とする請求項８に記載の合成物。
【請求項１１】
米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物であることを特徴とする請求項１０に記載の合成物。
【請求項１】
(ｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ １と２または
(ｉｉ) ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏｓ ３と４であることを特徴とする一対のプライマー。
【請求項２】
表３−１と３−２にリストされる上流にある調節遺伝子および表３−１と３−２、そして表４とにリストされる下流にある調節遺伝子からなることを特徴とするＧＮＭＴノックアウトマウスの調節遺伝子データベース。
【請求項３】
（ａ）生存と増殖：ＰＴＥＮ、Ｐ１３Ｋ、Ａｋｔ１、ＧＳＫ３βまたはβ-カテニン；
（ｂ）ガン遺伝子：サイクリンＤ１、Ｃ−ｍｙｃまたはＣ−ジュン;そして、
（ｃ）腫瘍抑制遺伝子：Ｒｂまたはｐ５３。
からなることを特徴とする肝細胞ガンのシグナル伝達経路遺伝子データベース。
【請求項４】
患者に効果的な量のグリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ(ＧＮＭＴ)やＧＮＭＴを含むプラスミドを投与することを特徴とするアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防の方法。
【請求項５】
前記疾患は原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
処置または予防はＡＦＢ１−ＤＮＡ付加体形成を妨害することによってなされることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
プラスミドは患者の体に直接施されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
グリシン-Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）と医学的に、あるいは食物許容できるキャリアー（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｏｒ ｆｏｏｄ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）で構成するアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）に引き起こされる疾患に対する治療または予防のできることを特徴とする合成物。
【請求項９】
ＧＮＭＴが二量体形または四量体形であることを特徴とする請求項８に記載の合成物。
【請求項１０】
主食作物の補助的な添加物であることを特徴とする請求項８に記載の合成物。
【請求項１１】
米やとうもろこし、キャッサバ、堅果類、ピーナッツ、チリ、スパイスなどの主食作物であることを特徴とする請求項１０に記載の合成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１６０８０５（Ｐ２０１１−１６０８０５Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５８０１７（Ｐ２０１１−５８０１７）
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００８−６９８５２（Ｐ２００８−６９８５２）の分割
【原出願日】平成２０年３月１８日（２００８．３．１８）
【出願人】（５０７３８８０７４）国立陽明大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月１６日（２０１１．３．１６）
【分割の表示】特願２００８−６９８５２（Ｐ２００８−６９８５２）の分割
【原出願日】平成２０年３月１８日（２００８．３．１８）
【出願人】（５０７３８８０７４）国立陽明大学 (6)
【Ｆターム（参考）】
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