グルコキナーゼ活性化因子として有用なアリールシクロプロピルアセトアミド誘導体
式（Ａ）の化合物：
および糖尿病の処置のための医薬組成物。
および糖尿病の処置のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
糖尿病は、長寿と生活の質との双方に悪影響を及ぼす進行性疾患である。既存の経口治療は、単独でも組み合わせであっても、糖尿病の患者において適切な、または持続性のグルコース低下効能を呈しない。この結果、糖尿病患者の治療の改善に対する未達成のニーズがある。
【背景技術】
【０００２】
グルコキナーゼ活性化因子（ＧＫＡ）は、膵臓β−細胞および肝臓における修飾作用を介して血糖を低下させるように主として作用する、グルコース低下剤の１つのクラスに相当する。糖尿病の処置のための合成ＧＫＡが数多く開示されており、例えば国際公開第０４／０６３１７９号パンフレットに開示されているものが挙げられる。糖尿病の患者のための治療薬として選択可能なＧＫＡに対するニーズが依然として存在している。
【０００３】
グルコキナーゼ（ＧＫ）は、ニューロンにおけるグルコースセンシングの媒介に重要であることが示されている。視床下部におけるＧＫの活性化は、インスリンで誘発される低血糖に対する対抗制御的応答を鈍化する。このため、ＧＫＡで脳内のＧＫが活性化すると、低グルコースレベルにてエピネフリン、ノルエピネフリンおよびグルカゴンの分泌レベルが低減することにより、低血糖の危険性が増大しうる。血液脳関門透過性が限られたＧＫＡ化合物では、激しい低血糖をもたらす潜在性が低いであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０４／０６３１７９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の化合物は、インビトロおよびインビボの双方でグルコキナーゼを活性化することが見出されている。本発明の化合物は、既存のＧＫＡよりも向上された効力を示すことが見出されている。本発明の化合物は、限られた血液脳関門透過性を示すことが見出されている。
【０００６】
本発明は、グルコキナーゼを活性化する化合物、有効成分としてそれらを含有する医薬組成物、グルコキナーゼ機能障害に関連する障害の処置の方法、および糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置のためのそれらの使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記式の化合物：
【化１】
または薬理学的に許容できるその塩を提供する。
【０００８】
本発明の化合物は、２つの立体中心（＊）を有しており、このため４つの立体異性体が可能である。各立体異性体、およびラセミ混合物またはジアステレオマー混合物で、純粋または部分的に純粋なものが、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【０００９】
本発明の化合物の好ましい立体異性体は、以下の構造式：
【化２】
を有する。
【００１０】
本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩、および薬理学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、治療用の、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を提供する。本発明はまた、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置用の、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩も提供する。本発明の他の態様で、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置のための医薬品の製造のための、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩の使用が提供される。
【００１２】
本発明は、有効な量の式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、糖尿病の処置の方法を提供する。本発明はまた、有効な量の式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、ＩＩ型糖尿病の処置の方法も提供する。
【００１３】
本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩を含む、治療用の医薬組成物を提供する。本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩を含む、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病用の医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本願明細書で使用する場合、用語「薬理学的に許容できる塩」は、生体に対して実質的に無毒である、本発明の化合物の塩類を指す。かかる塩類およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６，２−１９（１９７７）を参照のこと。薬理学的に許容できる好ましい塩は、塩酸塩である。
【００１５】
本発明の化合物は、様々な経路によって投与される医薬組成物として調合されることが好ましい。かかる組成物は、経口投与用であることが最も好ましい。かかる医薬組成物、およびそれらを調製するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ，Ｇｅｎｎａｒｏら編，第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９５）を参照のこと。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、本発明の化合物は、１以上の作用物質と組み合わせて投与される。かかる作用物質として、例えばメトホルミンが挙げられる。
【００１７】
組み合わせでの投与として、同時投与、逐次投与、または個別投与が挙げられる。
【００１８】
以下の実施例に対する化合物名は、ＡｕｔｏＮｏｍ ２０００を用いて作成している。
【実施例】
【００１９】
一般的手法：
水または空気に感受性の反応はすべて、不活性の雰囲気下で、乾燥溶媒中で行う。質量スペクトル（ＭＳ）は、エレクトロスプレーモードで行うＡｇｉｌｅｎｔ１１００ ＭＳＤ分光計にて得られる。旋光度は、クロロホルム中、ＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３７０デジタル旋光計でナトリウムＤラインを用い、２０℃にて得られる。
【００２０】
実施例１：（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸［５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イル］−アミド
【化３】
【００２１】
Ａ）（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−ジアゾ−酢酸エチルエステル
【化４】
【００２２】
１．５Ｌのエタノール中の（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−オキソ−酢酸エチルエステル（２５０ｇ、８０６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（１８７ｇ、９８４ｍｍｏｌ）の混合物を、淡黄色溶液が得られるまで室温で撹拌する。次いで濃塩酸（２０ｍＬ、２３３ｍｍｏｌ）を添加し、得られる混合物を３．５時間、還流加熱する。揮発物を除去して透明な淡黄色オイルを得、これを１．５Ｌの酢酸エチルに溶解させる。この溶液を次いで、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後１Ｌの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。水相を酢酸エチル（２×５００ｍｌ）で逆抽出して有機層を合わせ、硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過する。この粗製ヒドラゾン溶液（約２．１Ｌ、３６３ｇのヒドロゾン中間体を含有すると考えられる）を、トリエチルアミン（１００ｍＬ、８９０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加しながらよく撹拌する。得られる溶液を終夜放置し、この間にある程度の固体が沈降する。その混合物を３Ｌの容量まで酢酸エチルで希釈して溶液を得、これを１Ｌの水で洗浄して、その後、飽和塩化ナトリウム水溶液を配合した水の５００ｍＬ相当で必要に応じて２回洗浄し、エマルジョンをすべて離散させた。得られる有機相を次いで硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過し、濃縮して湿潤固体を得、これをメチルｔ−ブチルエーテルで粉にする。得られるスラリーを濾過して淡黄色固体を得、これを真空下で乾燥させて１５５ｇの標題の化合物を得る。その濾液を濃縮してオイルとし、これを自由流動性の（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）固体が得られるまで前記と同様に粉にする。この固体を濾過によって単離して乾燥させ、さらに１０ｇの標題の化合物を得る。ＬＣＭＳ（ｍ／ｅ）：２９５（Ｍ＋Ｈ）。
【００２３】
Ｂ）（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸
【化５】
【００２４】
不活性の雰囲気下に２５〜３０℃で維持した、１５０ｍＬの無水ジクロロメタン中のビニルシクロヘキサン（３００ｍＬ、２．７２ｍｏｌ）の溶液に、（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−ジアゾ−酢酸エチルエステル（１６９．４０ｇ、５７５．５ｍｍｏｌ）を一部ずつ加えながら、ビニルシクロヘキサン（４０ｍＬ）中のテトラキス［Ｎ−フタロイル−（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ロイシナト］ジロジウムビス（エチルアセテート）付加物（１２０ｍｇ、８４μｍｏｌ）の溶液を滴下する。添加速度は、内部温度を４０℃に維持するように調整する。およそ１．５時間後に添加を完了し、その反応混合物をさらに２時間、３０℃で撹拌する。その後、揮発物を真空下に除去し、粗製（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸エチルエステルを粘稠な褐色オイル（２１８ｇ、５７９ｍｍｏｌ）として得て、これを１．１Ｌのメタノールに溶解させて黄褐色溶液を得、これに５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５００ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。得られるスラリーを、次いで５０℃で１時間撹拌し、この間に溶液が生成される。メタノールを真空下に除去して、１Ｌの酢酸エチルを添加する。得られる混合物は、およそ５５０ｍＬの５％水性塩酸を添加することにより酸性化し、二層を分離させる。その水層は次いで、酢酸エチルの５００ｍＬ相当で２回抽出する。有機相を合わせて、５００ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過し、濃縮して湿性の浅黄色固体を得る。その後この物質を１Ｌのメタノールに溶解させる。次いでその攪拌用液に、１．５時間かけて水（１Ｌ）を添加する。得られるスラリーを３０分間室温にて撹拌し、その後濾過する。そのフィルターパッドを１：１のメタノール／水で洗浄して乾燥し、標題の化合物を浅黄色結晶（１６６ｇ）として得る。計算精密質量（ＭＳ ｅｘａｃｔ ｍａｓｓ）理論値：３４９．１４７３５；実測値：３４９．１４６７９（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＬＣ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーイオン化を使用）；
【数１】
【００２５】
０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するヘキサン中の１０％エタノールで、３５℃にて溶出されるＡＤ−Ｈカラム（１５０ｍｍ）でのキラルクロマトグラフィーにより分離した場合の、エナンチオマーに対応する２つのピークに対する積分の比較によって求めると、酸の鏡像体過剰率は９７．７％である。
【００２６】
Ｃ）５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イルアミン
【化６】
【００２７】
チイラン（５５０ｍＬ、９．２ｍｏｌ）を、不活性の雰囲気下、２．５Ｌの無水ジオキサン中のピロリジンの混合物（５４３ｍＬ、６．５７ｍｏｌ）に添加する。温度はゆっくりと上昇し、その反応混合物は内部温度が５４℃に達したら氷浴において冷却する。温度が４５℃まで下降すれば、冷却浴を除いて反応混合物を６０℃まで加熱する。３時間後に、混合物を室温にまで冷却して、真空下に濃縮する。その後、残渣を６ｍｍＨｇで蒸留して５０℃で沸騰する画分を集め、２−ピロリジン−１−イル−エタンチオールを無色オイル（６４３ｇ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１３２（Ｍ＋Ｈ）。
【００２８】
炭酸水素ナトリウム（１．２３２ｋｇ、１４．７ｍｏｌ）を、７．５Ｌのイソプロパノール中の５−ブロモ−チアゾール−２−イルアミン臭化水素酸塩（１．５３Ｋｇ、５．８７ｍｏｌ）の混合物にゆっくりと一部ずつ添加する。その後、２−ピロリジン−１−イル−エタンチオール（１．０６０Ｋｇ、８．０７ｍｏｌ）を１５分間かけて添加し、得られる混合物を６０℃にて９６時間撹拌する。温度を１時間、７０℃に上げ、次いでその混合物を室温に冷却する。イソプロパノールのほとんどは真空下に除去し、その残渣を４Ｌのイソプロパノール／クロロホルム溶液（１：９）中に取り出す。水性飽和炭酸水素ナトリウム（４Ｌ）を添加し、得られる混合物を３０分間撹拌する。層を分離させ、その水相をイソプロパノール／クロロホルム溶液（１：９）の４Ｌ相当で３回抽出する。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムにより乾燥させて濾過し、真空下に濃縮する。得られる残渣を３Ｌのジエチルエーテルで粉にして濾取し、標題の化合物の第１部分を浅黄色固体（４１０ｇ）として得る。濾液を橙色固体にまで濃縮し、これを２Ｌのジエチルエーテルで粉にして、濾過によりベージュ色の固体として単離する。この固体を次いで２Ｌのメタノールに溶解させ、その溶液を４５℃で３０分間加熱する。室温に冷却すると、固体が形成される。この物質を濾過によって単離し、前記と同様にジエチルエーテルで粉にして真空下に乾燥し、さらに３１０ｇの標題の化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３０［Ｍ＋Ｈ］
【００２９】
Ｄ）（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸［５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イル］−アミド
【００３０】
１０Ｌの無水ジクロロメタン中の（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸（２９５．００ｇ、０．８４７ｍｏｌ）の撹拌溶液に、塩化オキサリル（１４６．８９ｍＬ、１．６９ｍｏｌ）を不活性の雰囲気下、１５分間かけて添加する。その後ジメチルホルムアミド（６５４．６１μＬ、８．５ｍｍｏｌ）を一度に添加し、得られる溶液を終夜撹拌する。次いで揮発物を真空下に４０℃で除去してオイルを得、これを３Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させる。不活性の雰囲気を再構築し、その溶液を５℃未満に冷却する。トリエチルアミン（１７７ｍＬ、１．２７ｍｏｌ）をその後２０分間かけて滴下すると、暗色溶液が得られる。硫酸ナトリウム（１２０．２５ｇ、０．８４７ｍｏｌ）を添加し、その後５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イルアミン（２１３．６０ｇ、０．９３１ｍｏｌｅ）を添加する。内部温度が２０℃に上昇する。反応混合物を冷却下に１０分間撹拌し、次いで室温まで昇温させる。終夜撹拌後に、反応混合物を３Ｌの水に注加する。得られる混合物を数分間撹拌し、その後２層を分離させる。水層を１Ｌジクロロメタンで抽出し、そのジクロロメタン溶液を合わせてＭｇＳＯ４により乾燥させて濾過し、４０℃で真空下に濃縮する。得られるオイル（５５６ｇ）を、ジクロロメタン溶液としてシリカゲルプラグ（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｐｌｕｇ）に付す。メタノール中の２Ｍアンモニア／メチルｔ−ブチルエーテル／ヘプタン（１：１２：７）、次いで（メタノール中の）２Ｍアンモニア／酢酸エチル（１：１９）でプラグを溶出し、褐色泡状物（３５１ｇ）を得る。この物質３２０ｇをメチルｔ−ブチルエーテルおよびヘプタンから結晶化して、４５℃で２日間乾燥させた後、灰白色固体として標題の化合物（２７９．４ｇ）を得る。ＬＣＭＳ（ｍ／ｅ）：５６０（Ｍ＋Ｈ）；
【数２】
【００３１】
グルコキナーゼアッセイ
ヒト小島（ｉｓｌｅｔ）ＧＫアイソフォームを、大腸菌において（Ｈｉｓ）６―タグ化融合蛋白質として発現させ、金属キレート親和性クロマトグラフィーで精製する（例えば、Ｔｉｅｄｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３７，１７５−１９０，１９９７を参照のこと）。精製後、酵素は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭイミダゾール、１ｍＭジチオスレイトール、５０％グリセリン中、０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、一定分量にて−８０℃で保存する。アッセイは、平底９６穴プレートにおいて１００μＬの最終インキュベーション容量で実施する。インキュベーション混合物は、２５ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、４Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来）、５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＮＡＤ、および所定濃度のグルコースからなる。試験化合物をジメチルスルホキシドに溶解させ、その後反応混合物に添加して最終ジメチルスルホキシド濃度を１０％とする。反応は、２０μＬのＧＫの添加によって開始し、３７℃で２０分間実施する。生成されるＮＡＤＨの量を、マイクロプレートリーダーを用いて３４０ｎｍでの吸光度の増加量として測定する。吸光度値を、ＥＣ５０算出に使用する。
【００３２】
実施例１は、１０ｍＭグルコースで、ＥＣ５０＝４２±４２ｎＭ（ｎ＝５）にてＧＫを活性化した。実施例１ではまた、低グルコース濃度で濃度依存的に酵素活性の増加もなされた。
【００３３】
解糖アッセイ
ラット膵島細胞腺腫ＩＮＳ−１Ｅ細胞を、１１ｍＭグルコース、５％ウシ胎仔血清、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび抗生物質を追加した１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％にて維持する。アッセイの前に細胞をトリプシン処理し、遠心分離によってペレット化して３０，０００細胞／ウェルの密度で９６−穴組織培養アッセイプレートに播種する。細胞を接着させて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。アッセイ日に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を追加した２００μＬのアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）バッファーで細胞を洗浄およびインキュベートする。３０分間インキュベーションした後バッファーを除去して、０．１％ＢＳＡ、８ｍＭグルコースおよび前記化合物を含有する１００μＬ ＥＢＳＳバッファーを細胞に添加する。直後に、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを細胞に添加し、３７℃でさらに１時間、細胞をインキュベートする。インキュベーション終了時に、４９０ｎｍの吸光度を読み取る。吸光度値を、ＥＣ５０の算出に使用する。
【００３４】
実施例１は、ラット膵島細胞腺腫ＩＮＳ１−Ｅ細胞における糖代謝を刺激する（平均ＥＣ５０＝５７９±１３９ｎＭ、ｎ＝４）。
【００３５】
このように、本発明の化合物はインビトロでＧＫを活性化することが示される。
【００３６】
経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）
２２５〜２５０ｇの体重の雄性ウィスターラットを、標準食餌、ならびに正常の光サイクルおよび条件で飼育する。実験用にラットの正確な体重を測定する前に終夜絶食し、同様の体重の群に無作為化する（１群当たりｎ＝４）。前記化合物を、超音波浴の中でソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）／エタノールの１：１混合物中に懸濁させる（総容量の１０％）。得られた懸濁液は次いで、９倍容量の１０％ソルトール水溶液で希釈し、前記化合物を経口的に１、３、６、１０、２０、および３０ｍｇ／ｋｇで経口服用させる。化合物投与後２時間に、２ｇ／ｋｇの経口グルコースボーラスをラットに与える。グルコース投与後０、１５、３０、６０、９０および１２０分間で、尾採血によって血液を採取する。採取した血液は、１試料当たり４００μＬの容量にてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブに入れ、前記試料を氷上に置いておく。血漿を単離し、試料をグルコースおよび化合物への曝露について分析するまで、−２０℃で保管する。血漿グルコース曲線下の面積（グルコースＡＵＣ）を、各群につき算出し、対照群に対するグルコースＡＵＣの低下パーセントを、化合物による、血漿グルコースを低減する効能の尺度として使用する。
【００３７】
実施例１は、絶食および食後グルコースレベルの双方で、用量依存的に血漿グルコースを低下させる。未処置対照群に対するグルコースＡＵＣの最大の低下は、高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）で観察され、４２％の低減が示される。データの補間によって、２０％のグルコースＡＵＣ低減は、血漿中９９ｎｇ／ｍｌ（１７９ｎＭ）の化合物平均濃度で起こり、これは６．９ｍｇ／ｋｇの化合用量に相当していることが示された。
【００３８】
よって、本発明の化合物は、インビボでＧＫを活性化することが示される。
【００３９】
血液脳関門透過性
ストック化合物溶液を、ジメチルスルホキシド中１０ｍＭに調製する。次いで９００μＬのプロピレングリコールで１００μＬのストックを希釈することにより、投与溶液を１ｍＭに調製する。この用量の投与は、２．１７μｍｏｌｅ／ｋｇの標的用量となるよう、静脈内（ＩＶ）ボーラス（２．２ｍＬ／ｋｇ）として、６匹の雄性ＣＦ−１マウス（およそ２３ｇ）に尾静脈を介して行う。マウスをＣＯ２および頸椎脱臼の双方を用いて安楽死させる。３匹のマウスを投与後５分に、そして投与後６０分に３匹を犠牲にする。各々の動物から心臓刺によって血液を採取し、ナトリウムＥＤＴＡを用いて血漿を調製し、ポリプロピレンサンプル管に移して直ちにドライアイスを用いて凍結する。各々の動物から全脳を採取して、正中で二等分し、その半分を各々ポリプロピレンサンプル管の中に移して直ちにドライアイスを使用して凍結する。一分量の血漿に二分量の抽出溶媒（ｓｏｖｅｎｔ）（アセトニトリル中の１０％テトラヒドロフラン）を用いてタンパク質を沈殿させ、ボルテックスミキサーで混合することにより、分析用に血漿試料を調製する。脳組織については、１ｍｇの脳組織をおよそ１μＬ容量と考え、一分量の組織に二分量の抽出溶媒を添加する。試料は直ちに超音波細胞粉砕機（ｄｉｓｍｅｍｂｅｒａｔｏｒ）を用いてホモジナイズする。較正標準は既知濃度の化合物を盲検マウス血漿にスパイクすることよって調製し、その後血漿試料として処置する。すべての試料を６０００ＲＣＦで５分間、遠心分離する。各試料からの上清の一定分量をポリプロピレン９６穴プレートに移して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析用に封止する。
【００４０】
ＭＳ／ＭＳは、ターボイオンスプレーソースを取り付けたＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００三連四重極質量分析計を用いて実施する。高性能液体クロマトグラフィーは、５０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｈｙｒｄｒｏ ＲＰ分析用カラム（１００×２．０ｍｍ、４μ）を用いて実施し、０．６ｍＬ／分の一定流量で操作する。６０：４０の５ｍＭ水性ギ酸アンモニウム：メタノール中５ｍＭギ酸アンモニウムの初発移動相、１分間の保持時間、その後１０：９０の５ｍＭ水性ギ酸アンモニウム：メタノール中５ｍＭギ酸アンモニウムへの２分間の直線勾配、そして１分間の最終保持時間からなる、移動相勾配を利用する。カラム溶出液は、廃液に０〜２．８分間逸流させ、次いで質量分析計に２．８〜４．０分間導き、監視されるＭＳ／ＭＳ転移は５６０／８４である。試験試料中の化合物の定量は、ピーク面積値を、較正標準の基準濃度から算出される二次方程式加重（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔｅｄ）１／ｘ２、およびそれらのそれぞれのピーク面積と比較することにより成し遂げる。定量の上限および下限は、理論値の＋／−２０％を超える較正標準の逆回帰（ｂａｃｋ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ）によって求める。１６μＬの血漿／グラムのマウス脳の、文献上の換算係数を用いて、脳組織濃度を血漿の寄与に対して補正する。
【００４１】
実施例１の、インビボの血液脳関門透過性の結果、投与後５分で０．１７の平均脳／血漿比と、同じ時間で０．５３９ｎｍｏｌ／ｇの平均総脳レベルが導かれる。
【００４２】
本発明の化合物は、血液脳関門透過性が限られており、そのため激しい低血糖をもたらす潜在性が限られていることが示されている。
【技術分野】
【０００１】
糖尿病は、長寿と生活の質との双方に悪影響を及ぼす進行性疾患である。既存の経口治療は、単独でも組み合わせであっても、糖尿病の患者において適切な、または持続性のグルコース低下効能を呈しない。この結果、糖尿病患者の治療の改善に対する未達成のニーズがある。
【背景技術】
【０００２】
グルコキナーゼ活性化因子（ＧＫＡ）は、膵臓β−細胞および肝臓における修飾作用を介して血糖を低下させるように主として作用する、グルコース低下剤の１つのクラスに相当する。糖尿病の処置のための合成ＧＫＡが数多く開示されており、例えば国際公開第０４／０６３１７９号パンフレットに開示されているものが挙げられる。糖尿病の患者のための治療薬として選択可能なＧＫＡに対するニーズが依然として存在している。
【０００３】
グルコキナーゼ（ＧＫ）は、ニューロンにおけるグルコースセンシングの媒介に重要であることが示されている。視床下部におけるＧＫの活性化は、インスリンで誘発される低血糖に対する対抗制御的応答を鈍化する。このため、ＧＫＡで脳内のＧＫが活性化すると、低グルコースレベルにてエピネフリン、ノルエピネフリンおよびグルカゴンの分泌レベルが低減することにより、低血糖の危険性が増大しうる。血液脳関門透過性が限られたＧＫＡ化合物では、激しい低血糖をもたらす潜在性が低いであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０４／０６３１７９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の化合物は、インビトロおよびインビボの双方でグルコキナーゼを活性化することが見出されている。本発明の化合物は、既存のＧＫＡよりも向上された効力を示すことが見出されている。本発明の化合物は、限られた血液脳関門透過性を示すことが見出されている。
【０００６】
本発明は、グルコキナーゼを活性化する化合物、有効成分としてそれらを含有する医薬組成物、グルコキナーゼ機能障害に関連する障害の処置の方法、および糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置のためのそれらの使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、下記式の化合物：
【化１】
または薬理学的に許容できるその塩を提供する。
【０００８】
本発明の化合物は、２つの立体中心（＊）を有しており、このため４つの立体異性体が可能である。各立体異性体、およびラセミ混合物またはジアステレオマー混合物で、純粋または部分的に純粋なものが、本発明の範囲に含まれることが意図される。
【０００９】
本発明の化合物の好ましい立体異性体は、以下の構造式：
【化２】
を有する。
【００１０】
本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩、および薬理学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、治療用の、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を提供する。本発明はまた、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置用の、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩も提供する。本発明の他の態様で、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病の処置のための医薬品の製造のための、式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩の使用が提供される。
【００１２】
本発明は、有効な量の式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、糖尿病の処置の方法を提供する。本発明はまた、有効な量の式Ｉの化合物、または薬理学的に許容できるその塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、ＩＩ型糖尿病の処置の方法も提供する。
【００１３】
本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩を含む、治療用の医薬組成物を提供する。本発明は、本発明の化合物、または薬理学的に許容できるその塩を含む、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病用の医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本願明細書で使用する場合、用語「薬理学的に許容できる塩」は、生体に対して実質的に無毒である、本発明の化合物の塩類を指す。かかる塩類およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；およびＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６，２−１９（１９７７）を参照のこと。薬理学的に許容できる好ましい塩は、塩酸塩である。
【００１５】
本発明の化合物は、様々な経路によって投与される医薬組成物として調合されることが好ましい。かかる組成物は、経口投与用であることが最も好ましい。かかる医薬組成物、およびそれらを調製するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ａ，Ｇｅｎｎａｒｏら編，第１９版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９５）を参照のこと。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、本発明の化合物は、１以上の作用物質と組み合わせて投与される。かかる作用物質として、例えばメトホルミンが挙げられる。
【００１７】
組み合わせでの投与として、同時投与、逐次投与、または個別投与が挙げられる。
【００１８】
以下の実施例に対する化合物名は、ＡｕｔｏＮｏｍ ２０００を用いて作成している。
【実施例】
【００１９】
一般的手法：
水または空気に感受性の反応はすべて、不活性の雰囲気下で、乾燥溶媒中で行う。質量スペクトル（ＭＳ）は、エレクトロスプレーモードで行うＡｇｉｌｅｎｔ１１００ ＭＳＤ分光計にて得られる。旋光度は、クロロホルム中、ＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３７０デジタル旋光計でナトリウムＤラインを用い、２０℃にて得られる。
【００２０】
実施例１：（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸［５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イル］−アミド
【化３】
【００２１】
Ａ）（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−ジアゾ−酢酸エチルエステル
【化４】
【００２２】
１．５Ｌのエタノール中の（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−オキソ−酢酸エチルエステル（２５０ｇ、８０６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（１８７ｇ、９８４ｍｍｏｌ）の混合物を、淡黄色溶液が得られるまで室温で撹拌する。次いで濃塩酸（２０ｍＬ、２３３ｍｍｏｌ）を添加し、得られる混合物を３．５時間、還流加熱する。揮発物を除去して透明な淡黄色オイルを得、これを１．５Ｌの酢酸エチルに溶解させる。この溶液を次いで、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後１Ｌの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄する。水相を酢酸エチル（２×５００ｍｌ）で逆抽出して有機層を合わせ、硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過する。この粗製ヒドラゾン溶液（約２．１Ｌ、３６３ｇのヒドロゾン中間体を含有すると考えられる）を、トリエチルアミン（１００ｍＬ、８９０ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加しながらよく撹拌する。得られる溶液を終夜放置し、この間にある程度の固体が沈降する。その混合物を３Ｌの容量まで酢酸エチルで希釈して溶液を得、これを１Ｌの水で洗浄して、その後、飽和塩化ナトリウム水溶液を配合した水の５００ｍＬ相当で必要に応じて２回洗浄し、エマルジョンをすべて離散させた。得られる有機相を次いで硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過し、濃縮して湿潤固体を得、これをメチルｔ−ブチルエーテルで粉にする。得られるスラリーを濾過して淡黄色固体を得、これを真空下で乾燥させて１５５ｇの標題の化合物を得る。その濾液を濃縮してオイルとし、これを自由流動性の（ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）固体が得られるまで前記と同様に粉にする。この固体を濾過によって単離して乾燥させ、さらに１０ｇの標題の化合物を得る。ＬＣＭＳ（ｍ／ｅ）：２９５（Ｍ＋Ｈ）。
【００２３】
Ｂ）（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸
【化５】
【００２４】
不活性の雰囲気下に２５〜３０℃で維持した、１５０ｍＬの無水ジクロロメタン中のビニルシクロヘキサン（３００ｍＬ、２．７２ｍｏｌ）の溶液に、（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−ジアゾ−酢酸エチルエステル（１６９．４０ｇ、５７５．５ｍｍｏｌ）を一部ずつ加えながら、ビニルシクロヘキサン（４０ｍＬ）中のテトラキス［Ｎ−フタロイル−（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ロイシナト］ジロジウムビス（エチルアセテート）付加物（１２０ｍｇ、８４μｍｏｌ）の溶液を滴下する。添加速度は、内部温度を４０℃に維持するように調整する。およそ１．５時間後に添加を完了し、その反応混合物をさらに２時間、３０℃で撹拌する。その後、揮発物を真空下に除去し、粗製（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸エチルエステルを粘稠な褐色オイル（２１８ｇ、５７９ｍｍｏｌ）として得て、これを１．１Ｌのメタノールに溶解させて黄褐色溶液を得、これに５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（５００ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加する。得られるスラリーを、次いで５０℃で１時間撹拌し、この間に溶液が生成される。メタノールを真空下に除去して、１Ｌの酢酸エチルを添加する。得られる混合物は、およそ５５０ｍＬの５％水性塩酸を添加することにより酸性化し、二層を分離させる。その水層は次いで、酢酸エチルの５００ｍＬ相当で２回抽出する。有機相を合わせて、５００ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムにより乾燥させて濾過し、濃縮して湿性の浅黄色固体を得る。その後この物質を１Ｌのメタノールに溶解させる。次いでその攪拌用液に、１．５時間かけて水（１Ｌ）を添加する。得られるスラリーを３０分間室温にて撹拌し、その後濾過する。そのフィルターパッドを１：１のメタノール／水で洗浄して乾燥し、標題の化合物を浅黄色結晶（１６６ｇ）として得る。計算精密質量（ＭＳ ｅｘａｃｔ ｍａｓｓ）理論値：３４９．１４７３５；実測値：３４９．１４６７９（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＬＣ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーイオン化を使用）；
【数１】
【００２５】
０．０５％トリフルオロ酢酸を含有するヘキサン中の１０％エタノールで、３５℃にて溶出されるＡＤ−Ｈカラム（１５０ｍｍ）でのキラルクロマトグラフィーにより分離した場合の、エナンチオマーに対応する２つのピークに対する積分の比較によって求めると、酸の鏡像体過剰率は９７．７％である。
【００２６】
Ｃ）５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イルアミン
【化６】
【００２７】
チイラン（５５０ｍＬ、９．２ｍｏｌ）を、不活性の雰囲気下、２．５Ｌの無水ジオキサン中のピロリジンの混合物（５４３ｍＬ、６．５７ｍｏｌ）に添加する。温度はゆっくりと上昇し、その反応混合物は内部温度が５４℃に達したら氷浴において冷却する。温度が４５℃まで下降すれば、冷却浴を除いて反応混合物を６０℃まで加熱する。３時間後に、混合物を室温にまで冷却して、真空下に濃縮する。その後、残渣を６ｍｍＨｇで蒸留して５０℃で沸騰する画分を集め、２−ピロリジン−１−イル−エタンチオールを無色オイル（６４３ｇ）として得る。ＭＳ（ｍ／ｅ）：１３２（Ｍ＋Ｈ）。
【００２８】
炭酸水素ナトリウム（１．２３２ｋｇ、１４．７ｍｏｌ）を、７．５Ｌのイソプロパノール中の５−ブロモ−チアゾール−２−イルアミン臭化水素酸塩（１．５３Ｋｇ、５．８７ｍｏｌ）の混合物にゆっくりと一部ずつ添加する。その後、２−ピロリジン−１−イル−エタンチオール（１．０６０Ｋｇ、８．０７ｍｏｌ）を１５分間かけて添加し、得られる混合物を６０℃にて９６時間撹拌する。温度を１時間、７０℃に上げ、次いでその混合物を室温に冷却する。イソプロパノールのほとんどは真空下に除去し、その残渣を４Ｌのイソプロパノール／クロロホルム溶液（１：９）中に取り出す。水性飽和炭酸水素ナトリウム（４Ｌ）を添加し、得られる混合物を３０分間撹拌する。層を分離させ、その水相をイソプロパノール／クロロホルム溶液（１：９）の４Ｌ相当で３回抽出する。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムにより乾燥させて濾過し、真空下に濃縮する。得られる残渣を３Ｌのジエチルエーテルで粉にして濾取し、標題の化合物の第１部分を浅黄色固体（４１０ｇ）として得る。濾液を橙色固体にまで濃縮し、これを２Ｌのジエチルエーテルで粉にして、濾過によりベージュ色の固体として単離する。この固体を次いで２Ｌのメタノールに溶解させ、その溶液を４５℃で３０分間加熱する。室温に冷却すると、固体が形成される。この物質を濾過によって単離し、前記と同様にジエチルエーテルで粉にして真空下に乾燥し、さらに３１０ｇの標題の化合物を得る。ＭＳ（ｍ／ｅ）：２３０［Ｍ＋Ｈ］
【００２９】
Ｄ）（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸［５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イル］−アミド
【００３０】
１０Ｌの無水ジクロロメタン中の（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−シクロプロパンスルホニル−フェニル）−シクロプロパンカルボン酸（２９５．００ｇ、０．８４７ｍｏｌ）の撹拌溶液に、塩化オキサリル（１４６．８９ｍＬ、１．６９ｍｏｌ）を不活性の雰囲気下、１５分間かけて添加する。その後ジメチルホルムアミド（６５４．６１μＬ、８．５ｍｍｏｌ）を一度に添加し、得られる溶液を終夜撹拌する。次いで揮発物を真空下に４０℃で除去してオイルを得、これを３Ｌの無水ジクロロメタンに溶解させる。不活性の雰囲気を再構築し、その溶液を５℃未満に冷却する。トリエチルアミン（１７７ｍＬ、１．２７ｍｏｌ）をその後２０分間かけて滴下すると、暗色溶液が得られる。硫酸ナトリウム（１２０．２５ｇ、０．８４７ｍｏｌ）を添加し、その後５−（２−ピロリジン−１−イル−エチルスルファニル）−チアゾール−２−イルアミン（２１３．６０ｇ、０．９３１ｍｏｌｅ）を添加する。内部温度が２０℃に上昇する。反応混合物を冷却下に１０分間撹拌し、次いで室温まで昇温させる。終夜撹拌後に、反応混合物を３Ｌの水に注加する。得られる混合物を数分間撹拌し、その後２層を分離させる。水層を１Ｌジクロロメタンで抽出し、そのジクロロメタン溶液を合わせてＭｇＳＯ４により乾燥させて濾過し、４０℃で真空下に濃縮する。得られるオイル（５５６ｇ）を、ジクロロメタン溶液としてシリカゲルプラグ（ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｐｌｕｇ）に付す。メタノール中の２Ｍアンモニア／メチルｔ−ブチルエーテル／ヘプタン（１：１２：７）、次いで（メタノール中の）２Ｍアンモニア／酢酸エチル（１：１９）でプラグを溶出し、褐色泡状物（３５１ｇ）を得る。この物質３２０ｇをメチルｔ−ブチルエーテルおよびヘプタンから結晶化して、４５℃で２日間乾燥させた後、灰白色固体として標題の化合物（２７９．４ｇ）を得る。ＬＣＭＳ（ｍ／ｅ）：５６０（Ｍ＋Ｈ）；
【数２】
【００３１】
グルコキナーゼアッセイ
ヒト小島（ｉｓｌｅｔ）ＧＫアイソフォームを、大腸菌において（Ｈｉｓ）６―タグ化融合蛋白質として発現させ、金属キレート親和性クロマトグラフィーで精製する（例えば、Ｔｉｅｄｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３７，１７５−１９０，１９９７を参照のこと）。精製後、酵素は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭイミダゾール、１ｍＭジチオスレイトール、５０％グリセリン中、０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で、一定分量にて−８０℃で保存する。アッセイは、平底９６穴プレートにおいて１００μＬの最終インキュベーション容量で実施する。インキュベーション混合物は、２５ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ塩化カリウム、２．５ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭジチオスレイトール、４Ｕ／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来）、５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＮＡＤ、および所定濃度のグルコースからなる。試験化合物をジメチルスルホキシドに溶解させ、その後反応混合物に添加して最終ジメチルスルホキシド濃度を１０％とする。反応は、２０μＬのＧＫの添加によって開始し、３７℃で２０分間実施する。生成されるＮＡＤＨの量を、マイクロプレートリーダーを用いて３４０ｎｍでの吸光度の増加量として測定する。吸光度値を、ＥＣ５０算出に使用する。
【００３２】
実施例１は、１０ｍＭグルコースで、ＥＣ５０＝４２±４２ｎＭ（ｎ＝５）にてＧＫを活性化した。実施例１ではまた、低グルコース濃度で濃度依存的に酵素活性の増加もなされた。
【００３３】
解糖アッセイ
ラット膵島細胞腺腫ＩＮＳ−１Ｅ細胞を、１１ｍＭグルコース、５％ウシ胎仔血清、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸塩、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび抗生物質を追加した１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％にて維持する。アッセイの前に細胞をトリプシン処理し、遠心分離によってペレット化して３０，０００細胞／ウェルの密度で９６−穴組織培養アッセイプレートに播種する。細胞を接着させて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートする。アッセイ日に、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を追加した２００μＬのアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）バッファーで細胞を洗浄およびインキュベートする。３０分間インキュベーションした後バッファーを除去して、０．１％ＢＳＡ、８ｍＭグルコースおよび前記化合物を含有する１００μＬ ＥＢＳＳバッファーを細胞に添加する。直後に、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを細胞に添加し、３７℃でさらに１時間、細胞をインキュベートする。インキュベーション終了時に、４９０ｎｍの吸光度を読み取る。吸光度値を、ＥＣ５０の算出に使用する。
【００３４】
実施例１は、ラット膵島細胞腺腫ＩＮＳ１−Ｅ細胞における糖代謝を刺激する（平均ＥＣ５０＝５７９±１３９ｎＭ、ｎ＝４）。
【００３５】
このように、本発明の化合物はインビトロでＧＫを活性化することが示される。
【００３６】
経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）
２２５〜２５０ｇの体重の雄性ウィスターラットを、標準食餌、ならびに正常の光サイクルおよび条件で飼育する。実験用にラットの正確な体重を測定する前に終夜絶食し、同様の体重の群に無作為化する（１群当たりｎ＝４）。前記化合物を、超音波浴の中でソルトール（ｓｏｌｕｔｏｌ）／エタノールの１：１混合物中に懸濁させる（総容量の１０％）。得られた懸濁液は次いで、９倍容量の１０％ソルトール水溶液で希釈し、前記化合物を経口的に１、３、６、１０、２０、および３０ｍｇ／ｋｇで経口服用させる。化合物投与後２時間に、２ｇ／ｋｇの経口グルコースボーラスをラットに与える。グルコース投与後０、１５、３０、６０、９０および１２０分間で、尾採血によって血液を採取する。採取した血液は、１試料当たり４００μＬの容量にてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブに入れ、前記試料を氷上に置いておく。血漿を単離し、試料をグルコースおよび化合物への曝露について分析するまで、−２０℃で保管する。血漿グルコース曲線下の面積（グルコースＡＵＣ）を、各群につき算出し、対照群に対するグルコースＡＵＣの低下パーセントを、化合物による、血漿グルコースを低減する効能の尺度として使用する。
【００３７】
実施例１は、絶食および食後グルコースレベルの双方で、用量依存的に血漿グルコースを低下させる。未処置対照群に対するグルコースＡＵＣの最大の低下は、高用量（３０ｍｇ／ｋｇ）で観察され、４２％の低減が示される。データの補間によって、２０％のグルコースＡＵＣ低減は、血漿中９９ｎｇ／ｍｌ（１７９ｎＭ）の化合物平均濃度で起こり、これは６．９ｍｇ／ｋｇの化合用量に相当していることが示された。
【００３８】
よって、本発明の化合物は、インビボでＧＫを活性化することが示される。
【００３９】
血液脳関門透過性
ストック化合物溶液を、ジメチルスルホキシド中１０ｍＭに調製する。次いで９００μＬのプロピレングリコールで１００μＬのストックを希釈することにより、投与溶液を１ｍＭに調製する。この用量の投与は、２．１７μｍｏｌｅ／ｋｇの標的用量となるよう、静脈内（ＩＶ）ボーラス（２．２ｍＬ／ｋｇ）として、６匹の雄性ＣＦ−１マウス（およそ２３ｇ）に尾静脈を介して行う。マウスをＣＯ２および頸椎脱臼の双方を用いて安楽死させる。３匹のマウスを投与後５分に、そして投与後６０分に３匹を犠牲にする。各々の動物から心臓刺によって血液を採取し、ナトリウムＥＤＴＡを用いて血漿を調製し、ポリプロピレンサンプル管に移して直ちにドライアイスを用いて凍結する。各々の動物から全脳を採取して、正中で二等分し、その半分を各々ポリプロピレンサンプル管の中に移して直ちにドライアイスを使用して凍結する。一分量の血漿に二分量の抽出溶媒（ｓｏｖｅｎｔ）（アセトニトリル中の１０％テトラヒドロフラン）を用いてタンパク質を沈殿させ、ボルテックスミキサーで混合することにより、分析用に血漿試料を調製する。脳組織については、１ｍｇの脳組織をおよそ１μＬ容量と考え、一分量の組織に二分量の抽出溶媒を添加する。試料は直ちに超音波細胞粉砕機（ｄｉｓｍｅｍｂｅｒａｔｏｒ）を用いてホモジナイズする。較正標準は既知濃度の化合物を盲検マウス血漿にスパイクすることよって調製し、その後血漿試料として処置する。すべての試料を６０００ＲＣＦで５分間、遠心分離する。各試料からの上清の一定分量をポリプロピレン９６穴プレートに移して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析用に封止する。
【００４０】
ＭＳ／ＭＳは、ターボイオンスプレーソースを取り付けたＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００三連四重極質量分析計を用いて実施する。高性能液体クロマトグラフィーは、５０℃に加熱したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｈｙｒｄｒｏ ＲＰ分析用カラム（１００×２．０ｍｍ、４μ）を用いて実施し、０．６ｍＬ／分の一定流量で操作する。６０：４０の５ｍＭ水性ギ酸アンモニウム：メタノール中５ｍＭギ酸アンモニウムの初発移動相、１分間の保持時間、その後１０：９０の５ｍＭ水性ギ酸アンモニウム：メタノール中５ｍＭギ酸アンモニウムへの２分間の直線勾配、そして１分間の最終保持時間からなる、移動相勾配を利用する。カラム溶出液は、廃液に０〜２．８分間逸流させ、次いで質量分析計に２．８〜４．０分間導き、監視されるＭＳ／ＭＳ転移は５６０／８４である。試験試料中の化合物の定量は、ピーク面積値を、較正標準の基準濃度から算出される二次方程式加重（ｑｕａｄｒａｔｉｃ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｗｅｉｇｈｔｅｄ）１／ｘ２、およびそれらのそれぞれのピーク面積と比較することにより成し遂げる。定量の上限および下限は、理論値の＋／−２０％を超える較正標準の逆回帰（ｂａｃｋ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ）によって求める。１６μＬの血漿／グラムのマウス脳の、文献上の換算係数を用いて、脳組織濃度を血漿の寄与に対して補正する。
【００４１】
実施例１の、インビボの血液脳関門透過性の結果、投与後５分で０．１７の平均脳／血漿比と、同じ時間で０．５３９ｎｍｏｌ／ｇの平均総脳レベルが導かれる。
【００４２】
本発明の化合物は、血液脳関門透過性が限られており、そのため激しい低血糖をもたらす潜在性が限られていることが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物：
【化１】
またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項２】
下記式の、請求項１記載の化合物：
【化２】
またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項３】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
治療用の、請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項５】
糖尿病の処置用の、請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項６】
ＩＩ型糖尿病の処置用の、請求項５記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項７】
有効な量の請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、糖尿病の処置の方法。
【請求項８】
ＩＩ型糖尿病の処置のための、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を含む、治療用の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を含む、糖尿病の処置用の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩＩ型糖尿病の処置用の、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１】
下記式の化合物：
【化１】
またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項２】
下記式の、請求項１記載の化合物：
【化２】
またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項３】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩、および薬理学的に許容できる希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
治療用の、請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項５】
糖尿病の処置用の、請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項６】
ＩＩ型糖尿病の処置用の、請求項５記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩。
【請求項７】
有効な量の請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を、それを必要とするヒトまたは動物に投与することを含む、糖尿病の処置の方法。
【請求項８】
ＩＩ型糖尿病の処置のための、請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を含む、治療用の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１もしくは２記載の化合物、またはその薬理学的に許容できる塩を含む、糖尿病の処置用の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩＩ型糖尿病の処置用の、請求項１０記載の医薬組成物。
【公表番号】特表２０１２−５１２８７４（Ｐ２０１２−５１２８７４Ａ）
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２２７６（Ｐ２０１１−５４２２７６）
【出願日】平成２１年１２月１１日（２００９．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７６０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０３３３
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１１日（２００９．１２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６７６０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８０３３３
【国際公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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