グルコース結合蛋白質
【課題】グルコースに対する選択性が向上した改良型グルコース結合蛋白質を提供し、改良型グルコース結合蛋白質の配列情報に従い組換えＤＮＡ技術を用い該蛋白質の製造方法ならびにこれを用いる分析方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、グルコース結合蛋白質において、大腸菌由来グルコース結合蛋白質の第１４番目のアスパラギン酸残基または他の種における同等の残基において他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改良型グルコース結合蛋白質を提供する。本発明はまた、上述の改良型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改良型グルコース結合蛋白質を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
【解決手段】本発明は、グルコース結合蛋白質において、大腸菌由来グルコース結合蛋白質の第１４番目のアスパラギン酸残基または他の種における同等の残基において他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする改良型グルコース結合蛋白質を提供する。本発明はまた、上述の改良型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび該遺伝子を含む形質転換体、ならびに本発明の改良型グルコース結合蛋白質を含むグルコースアッセイキットおよびグルコースセンサーを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性に優れた改良されたグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）に関する。さらに、本発明は、グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子断片を組み込んでなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することによるＧＢＰの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しかし、酵素法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要や、酸化還元色素の添加ならびにそれを検出するための電気化学的デバイス、あるいは、Ｇ６ＰＤＨでは反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないなどの分子認識素子以外に複数の反応物質を検出系に加えなければならなかった。。
【０００３】
ところで、基質との結合により蛋白質のコンフォメーションが変化する結合蛋白質は、同分子のトリプトファン残基やチロシン残基に基づく自家蛍光あるいはアミノ酸置換によって導入されたチオール基を使って、導入された蛍光色素の蛍光変化を指標として、基質結合にもとづく結合蛋白質のコンフォメーション変化が蛍光波長あるいは強度の変化となって観察される。
【０００４】
したがって、これまでにグルコースやアミノ酸などに結合する結合蛋白質を蛍光標識することによって、グルコースあるいはアミノ酸の蛍光分析方法が提案されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、これまでにグルコースに結合する蛋白質としては、大腸菌由来のガラクトース・グルコース結合蛋白質（以下グルコース結合蛋白質）をはじめとして、数種知られているが、その中でグルコースに特異性の高いグルコース結合蛋白質は報告されていない。
【０００６】
特に前出の大腸菌由来グルコース結合蛋白質はグルコースと同等のレベルにてガラクトースと結合することから、血糖診断用の素子として応用することは困難であり、同蛋白質のグルコースに対する特異性を向上させることが望まれていた。
【０００７】
なお、本発明に関連する先行技術としては、以下のものがある。
【非特許文献１】Periplasmic bindind proteins:a versatile superfamily for protein engineering; M.A.Dwyer and H.W.Hellinga, Current Opinigon in Structural Biology, vol.14, 495-504, 2004, Elsevier
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、グルコースと結合する結合蛋白質、グルコース結合蛋白質の構造遺伝子に変異を導入したグルコースに特異的な結合蛋白質の構造ならびにその配列、およびこれを組換えＤＮＡ技術を用いて該蛋白質を製造する方法ならびにこれを用いる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ ）をコードする遺伝子を含むDNA断片に変異を導入することで部位特異的にアミノ酸置換を行い、この遺伝子を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、該培養物から改良型グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ） を採取し大量に調製できることを見出し、また改良型ＧＢＰの結合能力がグルコース特異的であることを見出し、さらに該蛋白質を用いて高感度にグルコースを計測できること、さらに該蛋白質を用いる分析キットが開発できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の事項に関する。すなわち、
１）天然のグルコース結合蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のグルコース結合蛋白質と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース結合蛋白質。
２）グルコース結合蛋白質において大腸菌由来グルコース結合蛋白質の成熟型蛋白質の１４番目のアスパラギン酸残基、もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース結合蛋白質。
３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１記載の改変型グルコース結合蛋白。
４）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグルタミン酸で置換されている、３）記載の改変型グルコース結合蛋白質。
５）１）−４）のいずれかに記載の改変型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子。
６）５）記載のグルコース結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
７）６）に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
８）７）記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース結合蛋白質を採取することを特徴とするグルコース結合蛋白質の製造方法。
９）８）記載の方法で製造されたグルコース結合蛋白質。
１０）９）に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの分光学的分析方法。
１１）９）に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの蛍光分光学的分析方法。
１２）９）に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とするグルコースの分光学的分析用アッセイキット。
１３）９）に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とする、グルコースの蛍光分析用アッセイキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明よれば、グルコースと特異的に結合する新規なグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）を提供することができる。また本発明によれば、上記ＧＢＰを組み換えDNA技術により大量生産することができ、その組み換えＧＢＰを用いて、グルコースを蛍光分光法により簡易かつ高感度に計測することができる。さらに、本発明によれば、ＧＢＰにCys残基をアミノ酸置換により導入し、そこへ環境応答性蛍光色素を修飾することで、グルコースの計測にきわめて好適に使用できる環境応答型蛍光色素標識ＧＢＰを大量に生産することができ、また上記修飾分子を用いて、グルコースの蛍光分析をさらに簡易かつ高感度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の改良型グルコース結合蛋白質（以下、ＧＢＰ）は、ガラクトースに比べ、グルコースと特異的に結合し、そのコンフォメーション変化に基づき、蛍光特性を変化させることができることを特徴とするものである。したがって、本発明の蛋白質、その構造遺伝子、アミノ酸配列は新規であり、その組み換えDNA技術を用いた蛋白質の製造方法ならびに該蛋白質を用いる分析方法ならびに該蛋白質を含む分析キットは、新規な方法である。
【００１４】
遺伝子の調製方法
天然型のＧＢＰをコードする遺伝子を含むDNA断片は、ＧＢＰ生産菌から得ることができる。該ＧＢＰ生産菌としては具体的にはEscherichia coli（大腸菌）が適している。
【００１５】
該ＧＢＰをコードする遺伝子はこれらの菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧＢＰ遺伝子を含むDNA断片を得ることができる。
【００１６】
上記ＧＢＰをコードする遺伝子としては、例えば（a）配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＢＰ活性を有するタンパク質であるＧＢＰをコードする遺伝子が挙げられる。なお、本発明においては、アミノ酸をアルファベット１文字で表記することとした。
【００１７】
本発明において、ＧＢＰをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてDNAを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両DNAを平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと蛋白質の発現を指標としてスクリーニングして、ＧＢＰをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００１８】
改変型ＧＢＰの製造方法
大腸菌由来の天然のＧＢＰをコードする遺伝子の配列は配列番号２で規定される。この配列には同蛋白質が細胞内でｍＲＮＡから翻訳されるときの蛋白質の配列をコードしているものであり、細胞内膜を通るときに切除されるＮ末端領域のシグナル配列（MNKKVLTLSA VMASMLFGAA AHA（配列番号９））をコードする領域を含む。本発明の改変型ＧＢＰをコードする遺伝子は、天然のＧＢＰをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory Manual”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００１９】
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
【００２０】
本発明の改変型ＧＢＰにおいては、所望のグルコース結合能力を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。
【００２１】
さらに、当業者は、他の細菌に由来するＧＢＰについても、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該蛋白質の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、大腸菌由来のＧＢＰの第１４番目のアスパラギン酸残基と同等の残基を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコース選択性の向上した改変型ＧＢＰを得ることができる。これらの改変型ＧＢＰも本発明の範囲内である。
【００２２】
改良型ＧＢＰの構築
改良型ＧＢＰは、定法に構築することができ、変異箇所に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて単離されているＧＢＰ構造遺伝子、あるいはpＧＥにクローニングされた該構造遺伝子、あるいはpETベクターなどの発現ベクターに挿入された該構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入することができる。改良型ＧＢＰとして天然型ＧＢＰの第１４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１４）をアスパラギン（Ａｓｐ１４Ａｓｎ）あるいはグルタミン酸（Ａｓｐ１４Ｇｌｕ）に置換する。
【００２３】
本発明のグルコース結合蛋白質は、そのアミノ酸配列中にCys残基を含まない。したがって、任意の位置をCysに置換することにより、Cys残基に存在するチオール基を用いて、部位特異的にチオール標識能力のある蛍光色素でラベルすることもできる。
【００２４】
上述のようにして得られた、改変型ＧＢＰを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム蛋白質を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、ＧＢＰを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＢＰを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＧＢＰを調製する。
【００２５】
改良型ＧＢＰの蛍光特性
このように構築された改良型ＧＢＰのうち、Ａｓｐ１４ＡｓｎおよびＡｓｎ１４Ｇｌｕの二種の改良型ＧＢＰを精製し、グルコースおよびガラクトース結合に基づく自家蛍光の変化を測定した。これらの改良型ＧＢＰは、野生型ＧＢＰと同様の方法で精製できる。蛍光スペクトル変化を観察したところ、天然型ＧＢＰはグルコースとガラクトース両方に対してほぼ同等の結合を示した。いずれの糖に対しても濃度依存的に蛍光強度が変化することからＧＢＰを用いてグルコースの計測が行えることが明らかであったが、しかし、その選択性は低いものであった。これに対して、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースとの結合により天然型ＧＢＰと同様に蛍光強度の増加がみられた。しかし、おどろくべきことに、ガラクトース存在下ではAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰは蛍光強度の変化が観察されず、ガラクトースとはほとんど結合しないことがわかった。
【００２６】
本発明においては、これらの改良型ＧＢＰを用いて、該蛋白質の自家蛍光を指標としてもグルコースの計測が行うことができる。さらに、これらの改良型ＧＢＰにＣｙｓ残基を導入し、これを環境応答性蛍光色素を用いて蛍光ラベルすることもできる。このように、改良型ＧＢＰを環境応答型の蛍光色素でラベルすることにより、グルコースの結合によるＧＢＰのコンフォメーション変化をラベルした蛍光色素の蛍光強度変化により明瞭に観察することができる。
【００２７】
また、蛍光色素の蛍光強度を計測することができるので、蛍光分光法により蛍光修飾された改良型ＧＢＰを用いることでグルコースの新規な分析方法が開発できる。
【００２８】
本発明の改良型ＧＢＰ修飾する蛍光色素としては、環境応答型の蛍光色素であれば特に制限されるものではないが、たとえば６−アクリロイル２ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、バダン：６−ブロモアセチル−２―ジメチルアミノナフタール、Ｎ−（１−ピレン）マレイミド、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセタミド、ＰＭＩＡアミド：（Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセタミド、パナシルブロミド、 TFPAM-SS1 、
PyMPOマレイミド、ダンシルアジリデン、ダポキシル（登録商標）、 IAANS :2-(4'-(ヨードアセトアミド)アニリノ)ナフタレン−６− サルフォニック酸ナトリウム塩などがあげられる。
【００２９】
改良型ＧＢＰの蛍光ラベルは、例えば、以下のようにして行うことができる。所定濃度の緩衝溶液に精製した改良型ＧＢＰを所定濃度の緩衝溶液に溶解させ、さらに蛍光色素を混合、遮光下で所定時間反応させた後、ろ過、遠心分離を行い未反応の蛍光色素を除去し、蛍光修飾ＧＢＰを得る。
【００３０】
さらに、本発明の改良型ＧＢＰ、蛍光修飾された改良型ＧＢＰは、グルコースの計測用キットの他、センサーの構成物として利用も可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明につき、実施例を用いて説明するが、本発明は、なんらこれに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
＜天然型グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）のクローニング＞
大腸菌、Escherichia coli DH5α株をＬ完全培地で培養後、GenomicPrep Cell and Tissue DNA Isolation kit (Amercham)を用いて同株のゲノム抽出を行った。これに対して大腸菌の天然型ＧＢＰ構造遺伝子をコードするｍｇｌｂ遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
すなわち、下記に示すPCRプライマー１及び２（配列番号３、４）を用いて、大腸菌ゲノムDNAをテンプレートとしPCRによって目的遺伝子の増幅を行い、精製後、TAクローニングを行った。反応条件を以下の通りに設定して、ＰＣＲ増幅を行った。なお、このプライマーによって増幅されるＧＢＰの配列は最終的に蛋白質として調製される成熟型の蛋白質に加え、Ｎ末端領域にペルプラズムに分泌するためのシグナルペプチド配列（MNKKVLTLSA VMASMLFGAA AHA）が付与された状態にて増幅される。
94℃ １分、60℃ 30秒、72℃ 30秒（以上を１サイクル）、
98℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 7分、72℃ 8分（以上を２５サイクル）。
プライマーの配列
配列番号３ （プライマー１）
forward; 5'- gagatcatatgaataagaaggtgttaaccc - 3'
配列番号４ （プライマー２）
reverse; 5'- cccaaaagcttttttttcttgctgaattc -3'
【００３４】
Taqポリメラーゼは、TaKaRa LA TaqTMを用いた。このようにして得られたPCR産物をGENE CLEAN2Kit付属のマニュアルに従いグラスミルク精製後、pGEM-T Vector System付属のマニュアルに従いサブクローニングし、カラーセレクションにより、インサートを有するベクターを保持する形質転換体を得た。得られた形質転換体をLB培地で培養(37℃、1.8ml、試験管)し、集菌、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをM13プライマーフォワード、M13プライマーリバース(タカラバイオ(株))を用い、インサートの塩基配列解析を行った。サンプルの調整方法、解析法などはABIプリズム310ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社製）付属のマニュアルにしたがった。
【００３５】
配列解析の結果、pGEMへのｍｇｌＢ配列の挿入（pGEM-ＧＢＰ）が確認された。また配列中にアミノ酸変化を伴う変異はなかった。
【００３６】
（実施例２）
＜天然型ＧＢＰの調製＞
ＧＢＰのC末端にHis Tagを付加した発現用ベクターpET-ＧＢＰの構築を行った。
【００３７】
pGEM/ＧＢＰをNdeI-HindIII消化し、グラスミルク精製を行なった後、同制限酵素にて消化したpET30(c)とライゲーションし、His-tag融合発現ベクターpET30(c)/ ＧＢＰを構築した。シークエンス解析により配列が確認されたpET30(c)/ＧＢＰで形質転換した大腸菌BL21(DE3)/ pET30(c)/ＧＢＰをLB培地（Amp 50μg/ml）にて150 mlスケールで培養した。OD600が0.6となったところでIPTGを終濃度0.4 mMとなるように添加し、添加後5.5 時間で培養を停止した。集菌・洗浄後、20％ sucrose/30 mM Tris−HCl buffer (pH8.0)に懸濁・攪拌・遠心分離後、得られたペレットに5 mM MgCl2を加え攪拌後、遠心分離を行い、ペリプラズム画分を調整し、10 mM imidazol を含む300 mM NaCl / 50 mM Na-phosphate buffer (pH8.0)(buffer A)にて一晩透析し、Ni-NTA agarose (QIAGEN) 5 mlを充填したOpen columnを用いて組換えＧＢＰの精製を行った(平衡化buffer: A + 10 mM imidazol, 洗浄buffer:A + 20 mM imidazol, 溶出buffer: A + 250 mM imidazol)。天然型ＧＢＰを終濃度1μMに調製し、グルコース、ガラクトースを添加したときの342 nmにおける蛍光強度の変化を測定した（励起波長; 295 nm）。
【００３８】
（実施例３）
＜天然型ＧＢＰのグルコース結合能力の検討＞
実施例２で得られた精製ＧＢＰを用いて、蛍光分光光度計による自家蛍光特性検討を行った。1μM ＧＢＰにグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、蛍光波長及びＧＢＰ配列中に有するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した（λex=295 nm）。
【００３９】
図３に示される蛍光スペクトル変化からも明らかなように、グルコースおよびガラクトースとの結合により蛍光強度の増加が見られた。
【００４０】
＜グルコース類の蛍光分析＞
実施例２で得られた天然型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計によるグルコースの蛍光測定を行った。ＧＢＰを含む溶液にグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、３３５nmにおける最大蛍光強度の変化を測定した(λex=295 nm)。
【００４１】
図４で示される蛍光強度変化のグルコース及びガラクトースの濃度依存性からも明らかなように、グルコースおよびガラクトースの濃度とともに蛍光強度の増加が観測され、蛍光強度を指標としてグルコースおよびガラクトースが蛍光分光法により計測できることがわかった。しかし、天然型ＧＢＰはグルコースとガラクトースの両単糖類に対して同等に結合し、選択性が低いことが明らかである。
【００４２】
（実施例４）
＜改良型ＧＢＰの構築＞
グルコース結合蛋白質の１４番目ＡｓｐをＡｓｎあるいはＧｌｕ残基に置換した改良型ＧＢＰを構築した。
【００４３】
改良型ＧＢＰは定法に従い、ＧＢＰ構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入する。本実施例では、pGEM/ＧＢＰをテンプレートとし、Asp14Asn, Asp14Gluとなるようにデザインしたプライマーを用いて、クイックチェンジ（登録商標）を用いて作成した。
【００４４】
すなわち、pGEM/ＧＢＰを対象として、以下に示す変異導入用のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて１４番目ＡｓｐをＡｓｎあるいはＧｌｕ残基に相当するコドンに置換した。
Asp14Asn gat→aac
プライマーの配列
配列番号５ （プライマー３）
forward; 5'- caatctataagtacgac aac aactttatgtctgtag -3'
配列番号６ （プライマー４）
reverse; 5'- ctacagacataaagtt gtt gtcgtacttatagattg -3'
Asp14Glu gat→gaa
プライマー配列
配列番号７ （プライマー５）
forward; 5'- caatctataagtacgac gaa aactttatgtctgtag -3'
プライマー配列
配列番号８ （プライマー６）
reverse; 5'- ctacagacataaagtt ttc gtcgtacttatagattg -3'
【００４５】
その結果、Ａｓｐ１４ＡｓｎおよびＡｓｐ１４Ｇｌｕの改良型ＧＢＰをコードする遺伝子が構築できた。
【００４６】
実施例５
＜改良型ＧＢＰの調製＞
改良型ＧＢＰはすでにC末端にHis Tagを付加した発現用ベクターpETに挿入されていることから天然型ＧＢＰと同様に精製を行った。
【００４７】
pET30(c)/１Ａｓｐ１４ＡｓｎあるいはpET30(c)/１Ａｓｐ１４Ｇｌｕで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB培地（Amp 50μg/ml）にて150 mlスケールで培養した。OD600が0.6となったところでIPTGを終濃度0.4 mMとなるように添加し、添加後5.5 時間で培養を停止した。集菌・洗浄後、20％ sucrose/30 mM Tris−HCl buffer (pH8.0)に懸濁・攪拌・遠心分離後、得られたペレットに5 mM MgCl2を加え攪拌後、遠心分離を行い、ペリプラズム画分を調整し、10 mM imidazol を含む300 mM NaCl / 50 mM Na-phosphate buffer (pH8.0)(buffer A)にて一晩透析し、Ni-NTA agarose (QIAGEN) 5 mlを充填したOpen columnを用いて改良型ＧＢＰの精製を行った(平衡化buffer: A + 10 mM imidazol, 洗浄buffer:A + 20 mM imidazol, 溶出buffer: A + 250 mM imidazol)。
【００４８】
（実施例６）
＜改良型ＧＢＰのグルコース結合能力の検討＞
実施例５で得られた改良型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計による自家蛍光特性検討を行った。1μM 改良型ＧＢＰにグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、蛍光波長及びＧＢＰ配列中に有するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した（λex=295 nm）。
【００４９】
蛍光スペクトル変化を観察したところ、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースとの結合により天然型ＧＢＰと同様に蛍光強度の増加がみられた。しかし、おどろくべきことに、ガラクトースの存在下ではAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰは蛍光強度の変化が観察されず、ガラクトースとはほとんど結合しないことがわかった。
【００５０】
（実施例７）
＜改良型ＧＢＰを用いるグルコース類の蛍光分析＞
実施例５で得られたAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計によるグルコースの蛍光測定を行った。Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰＧＢＰを含む溶液にグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、３３５nmにおける最大蛍光強度の変化を測定した(λex=295 nm)。
【００５１】
図５及び図６に示される蛍光強度変化のグルコース及びガラクトースの濃度依存性からも明らかなように、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰを用いた蛍光分析においてはグルコースの濃度とともに蛍光強度の増加が観測され、蛍光強度を指標としてグルコースが蛍光分光法により計測できることがわかった。しかし、天然型ＧＢＰとは全く異なり、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはガラクトースの濃度増加に対して蛍光強度の増加は観測されず、きわめて選択性の高い分析方法が構築できた。
【００５２】
このように蛍光強度の変化量からグルコースの濃度が高まるとともに、蛍光修飾ＧＢＰの蛍光強度が増加したことから、蛍光強度を指標として選択的にグルコースの定量が可能であった。
【００５３】
以下の表に本発明にて構築された改良型ＧＢＰのグルコースに対する結合定数を記す。このように、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースに対してそれぞれ０．３９μＭおよび０．３４μＭときわめて高い親和性を有し、かつ、天然型ＧＢＰのようにガラクトースを認識しないことがわかった。このように本発明の両改良型ＧＢＰは血糖値をはじめとするグルコース計測においてすぐれた特性を示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の新規なグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）及びこれを用いたグルコースの蛍光分光学的分析方法は、糖尿病の診断や臨床検体の分析等の臨床試験に大きく貢献することができるものであり、医療分野の技術革新に寄与することができる。すなわち本発明は、糖尿病に代表される生活習慣病等の医療技術の進歩に寄与することができる革新的な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】グルコース結合蛋白質のアミノ酸配列を示した配列番号１を示す。
【図２】グルコース結合蛋白質の遺伝子配列を示した配列番号２を示す。
【図３】天然型グルコース結合蛋白質の自家蛍光特性を示す。
【図４】天然型グルコース結合蛋白質の自家蛍光に基づくグルコースおよびガラクトースの蛍光測定を示す。
【図５】改良型グルコース結合蛋白質、Ａｓｐ１４Ａｓｎの自家蛍光に基づくグルコースの蛍光測定を示す。
【図６】改良型グルコース結合蛋白質、Ａｓｐ１４Ｇｌｕの自家蛍光に基づくグルコースの蛍光測定を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質特異性に優れた改良されたグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）に関する。さらに、本発明は、グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子断片を組み込んでなる組み換えベクター、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養することによるＧＢＰの製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度は、糖尿病の重要なマーカーである。また、微生物を用いる発酵生産においては、プロセスをモニタリングするためにグルコース濃度を定量する。従来、グルコースはグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ピロロキノリンキノンを補酵素とするグルコース脱水素酵素、グルコース６リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を用いる酵素法により定量されていた。しかし、酵素法ではグルコース酸化反応にともない発生する過酸化水素を定量するためカタラーゼあるいはパーオキシダーゼをアッセイ系に添加する必要や、酸化還元色素の添加ならびにそれを検出するための電気化学的デバイス、あるいは、Ｇ６ＰＤＨでは反応系に補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）を添加しなければならないなどの分子認識素子以外に複数の反応物質を検出系に加えなければならなかった。。
【０００３】
ところで、基質との結合により蛋白質のコンフォメーションが変化する結合蛋白質は、同分子のトリプトファン残基やチロシン残基に基づく自家蛍光あるいはアミノ酸置換によって導入されたチオール基を使って、導入された蛍光色素の蛍光変化を指標として、基質結合にもとづく結合蛋白質のコンフォメーション変化が蛍光波長あるいは強度の変化となって観察される。
【０００４】
したがって、これまでにグルコースやアミノ酸などに結合する結合蛋白質を蛍光標識することによって、グルコースあるいはアミノ酸の蛍光分析方法が提案されている（非特許文献１）。
【０００５】
しかし、これまでにグルコースに結合する蛋白質としては、大腸菌由来のガラクトース・グルコース結合蛋白質（以下グルコース結合蛋白質）をはじめとして、数種知られているが、その中でグルコースに特異性の高いグルコース結合蛋白質は報告されていない。
【０００６】
特に前出の大腸菌由来グルコース結合蛋白質はグルコースと同等のレベルにてガラクトースと結合することから、血糖診断用の素子として応用することは困難であり、同蛋白質のグルコースに対する特異性を向上させることが望まれていた。
【０００７】
なお、本発明に関連する先行技術としては、以下のものがある。
【非特許文献１】Periplasmic bindind proteins:a versatile superfamily for protein engineering; M.A.Dwyer and H.W.Hellinga, Current Opinigon in Structural Biology, vol.14, 495-504, 2004, Elsevier
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、グルコースと結合する結合蛋白質、グルコース結合蛋白質の構造遺伝子に変異を導入したグルコースに特異的な結合蛋白質の構造ならびにその配列、およびこれを組換えＤＮＡ技術を用いて該蛋白質を製造する方法ならびにこれを用いる分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ ）をコードする遺伝子を含むDNA断片に変異を導入することで部位特異的にアミノ酸置換を行い、この遺伝子を組み込んでなる組み換えベクターにより微生物を形質転換することによって得られた形質転換体を培養し、該培養物から改良型グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ） を採取し大量に調製できることを見出し、また改良型ＧＢＰの結合能力がグルコース特異的であることを見出し、さらに該蛋白質を用いて高感度にグルコースを計測できること、さらに該蛋白質を用いる分析キットが開発できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下の事項に関する。すなわち、
１）天然のグルコース結合蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のグルコース結合蛋白質と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース結合蛋白質。
２）グルコース結合蛋白質において大腸菌由来グルコース結合蛋白質の成熟型蛋白質の１４番目のアスパラギン酸残基、もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース結合蛋白質。
３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１記載の改変型グルコース結合蛋白。
４）配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグルタミン酸で置換されている、３）記載の改変型グルコース結合蛋白質。
５）１）−４）のいずれかに記載の改変型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子。
６）５）記載のグルコース結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
７）６）に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
８）７）記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース結合蛋白質を採取することを特徴とするグルコース結合蛋白質の製造方法。
９）８）記載の方法で製造されたグルコース結合蛋白質。
１０）９）に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの分光学的分析方法。
１１）９）に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの蛍光分光学的分析方法。
１２）９）に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とするグルコースの分光学的分析用アッセイキット。
１３）９）に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とする、グルコースの蛍光分析用アッセイキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明よれば、グルコースと特異的に結合する新規なグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）を提供することができる。また本発明によれば、上記ＧＢＰを組み換えDNA技術により大量生産することができ、その組み換えＧＢＰを用いて、グルコースを蛍光分光法により簡易かつ高感度に計測することができる。さらに、本発明によれば、ＧＢＰにCys残基をアミノ酸置換により導入し、そこへ環境応答性蛍光色素を修飾することで、グルコースの計測にきわめて好適に使用できる環境応答型蛍光色素標識ＧＢＰを大量に生産することができ、また上記修飾分子を用いて、グルコースの蛍光分析をさらに簡易かつ高感度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の改良型グルコース結合蛋白質（以下、ＧＢＰ）は、ガラクトースに比べ、グルコースと特異的に結合し、そのコンフォメーション変化に基づき、蛍光特性を変化させることができることを特徴とするものである。したがって、本発明の蛋白質、その構造遺伝子、アミノ酸配列は新規であり、その組み換えDNA技術を用いた蛋白質の製造方法ならびに該蛋白質を用いる分析方法ならびに該蛋白質を含む分析キットは、新規な方法である。
【００１４】
遺伝子の調製方法
天然型のＧＢＰをコードする遺伝子を含むDNA断片は、ＧＢＰ生産菌から得ることができる。該ＧＢＰ生産菌としては具体的にはEscherichia coli（大腸菌）が適している。
【００１５】
該ＧＢＰをコードする遺伝子はこれらの菌株から抽出してもよく、また化学的に合成することもできる。さらにＰＣＲ法の利用によりＧＢＰ遺伝子を含むDNA断片を得ることができる。
【００１６】
上記ＧＢＰをコードする遺伝子としては、例えば（a）配列番号1に記載されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする遺伝子、または(b)アミノ酸配列(a)において1もしくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＧＢＰ活性を有するタンパク質であるＧＢＰをコードする遺伝子が挙げられる。なお、本発明においては、アミノ酸をアルファベット１文字で表記することとした。
【００１７】
本発明において、ＧＢＰをコードする遺伝子を得る方法としては、次のような方法が挙げられる。例えば染色体を分離、精製した後、超音波処理、制限酵素処理等を用いてDNAを切断したものと、リニアーな発現ベクターと両DNAを平滑末端または付着末端においてDNAリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。該組換えベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと蛋白質の発現を指標としてスクリーニングして、ＧＢＰをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。
【００１８】
改変型ＧＢＰの製造方法
大腸菌由来の天然のＧＢＰをコードする遺伝子の配列は配列番号２で規定される。この配列には同蛋白質が細胞内でｍＲＮＡから翻訳されるときの蛋白質の配列をコードしているものであり、細胞内膜を通るときに切除されるＮ末端領域のシグナル配列（MNKKVLTLSA VMASMLFGAA AHA（配列番号９））をコードする領域を含む。本発明の改変型ＧＢＰをコードする遺伝子は、天然のＧＢＰをコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸残基をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基配列に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が、当該技術分野において知られており、例えば、Sambrookら,”Molecular Cloning; A Laboratory Manual”,第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。
【００１９】
このようにして得た変異遺伝子を遺伝子発現用のベクター（例えばプラスミド）に挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られており、宿主としては例えば、細菌、酵母、培養細胞などの種々のものを用いることができる。
【００２０】
本発明の改変型ＧＢＰにおいては、所望のグルコース結合能力を有する限り、さらに他のアミノ酸残基の一部が欠失または置換されていてもよく、また他のアミノ酸残基が付加されていてもよい。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法が当該技術分野においてよく知られている。
【００２１】
さらに、当業者は、他の細菌に由来するＧＢＰについても、蛋白質の一次構造を並列して比較すること、あるいは当該蛋白質の一次構造をもとに予測された二次構造を比較することにより、大腸菌由来のＧＢＰの第１４番目のアスパラギン酸残基と同等の残基を容易に認識することができ、本発明にしたがって、この領域中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換することにより、グルコース選択性の向上した改変型ＧＢＰを得ることができる。これらの改変型ＧＢＰも本発明の範囲内である。
【００２２】
改良型ＧＢＰの構築
改良型ＧＢＰは、定法に構築することができ、変異箇所に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いて単離されているＧＢＰ構造遺伝子、あるいはpＧＥにクローニングされた該構造遺伝子、あるいはpETベクターなどの発現ベクターに挿入された該構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入することができる。改良型ＧＢＰとして天然型ＧＢＰの第１４番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１４）をアスパラギン（Ａｓｐ１４Ａｓｎ）あるいはグルタミン酸（Ａｓｐ１４Ｇｌｕ）に置換する。
【００２３】
本発明のグルコース結合蛋白質は、そのアミノ酸配列中にCys残基を含まない。したがって、任意の位置をCysに置換することにより、Cys残基に存在するチオール基を用いて、部位特異的にチオール標識能力のある蛍光色素でラベルすることもできる。
【００２４】
上述のようにして得られた、改変型ＧＢＰを発現する形質転換体を培養し、培養液から遠心分離などで菌体を回収した後、菌体をフレンチプレスなどで破砕するか、またはオスモティックショックによりペリプラズム蛋白質を培地中に放出させる。これを超遠心分離し、ＧＢＰを含む水溶性画分を得ることができる。あるいは、適当な宿主ベクター系を用いることにより、発現したＧＢＰを培養液中に分泌させることもできる。得られた水溶性画分を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどにより精製することにより、本発明の改変型ＧＢＰを調製する。
【００２５】
改良型ＧＢＰの蛍光特性
このように構築された改良型ＧＢＰのうち、Ａｓｐ１４ＡｓｎおよびＡｓｎ１４Ｇｌｕの二種の改良型ＧＢＰを精製し、グルコースおよびガラクトース結合に基づく自家蛍光の変化を測定した。これらの改良型ＧＢＰは、野生型ＧＢＰと同様の方法で精製できる。蛍光スペクトル変化を観察したところ、天然型ＧＢＰはグルコースとガラクトース両方に対してほぼ同等の結合を示した。いずれの糖に対しても濃度依存的に蛍光強度が変化することからＧＢＰを用いてグルコースの計測が行えることが明らかであったが、しかし、その選択性は低いものであった。これに対して、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースとの結合により天然型ＧＢＰと同様に蛍光強度の増加がみられた。しかし、おどろくべきことに、ガラクトース存在下ではAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰは蛍光強度の変化が観察されず、ガラクトースとはほとんど結合しないことがわかった。
【００２６】
本発明においては、これらの改良型ＧＢＰを用いて、該蛋白質の自家蛍光を指標としてもグルコースの計測が行うことができる。さらに、これらの改良型ＧＢＰにＣｙｓ残基を導入し、これを環境応答性蛍光色素を用いて蛍光ラベルすることもできる。このように、改良型ＧＢＰを環境応答型の蛍光色素でラベルすることにより、グルコースの結合によるＧＢＰのコンフォメーション変化をラベルした蛍光色素の蛍光強度変化により明瞭に観察することができる。
【００２７】
また、蛍光色素の蛍光強度を計測することができるので、蛍光分光法により蛍光修飾された改良型ＧＢＰを用いることでグルコースの新規な分析方法が開発できる。
【００２８】
本発明の改良型ＧＢＰ修飾する蛍光色素としては、環境応答型の蛍光色素であれば特に制限されるものではないが、たとえば６−アクリロイル２ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、バダン：６−ブロモアセチル−２―ジメチルアミノナフタール、Ｎ−（１−ピレン）マレイミド、Ｎ−（１−ピレン）ヨードアセタミド、ＰＭＩＡアミド：（Ｎ−（１−ピレンメチル）ヨードアセタミド、パナシルブロミド、 TFPAM-SS1 、
PyMPOマレイミド、ダンシルアジリデン、ダポキシル（登録商標）、 IAANS :2-(4'-(ヨードアセトアミド)アニリノ)ナフタレン−６− サルフォニック酸ナトリウム塩などがあげられる。
【００２９】
改良型ＧＢＰの蛍光ラベルは、例えば、以下のようにして行うことができる。所定濃度の緩衝溶液に精製した改良型ＧＢＰを所定濃度の緩衝溶液に溶解させ、さらに蛍光色素を混合、遮光下で所定時間反応させた後、ろ過、遠心分離を行い未反応の蛍光色素を除去し、蛍光修飾ＧＢＰを得る。
【００３０】
さらに、本発明の改良型ＧＢＰ、蛍光修飾された改良型ＧＢＰは、グルコースの計測用キットの他、センサーの構成物として利用も可能である。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明につき、実施例を用いて説明するが、本発明は、なんらこれに限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
＜天然型グルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）のクローニング＞
大腸菌、Escherichia coli DH5α株をＬ完全培地で培養後、GenomicPrep Cell and Tissue DNA Isolation kit (Amercham)を用いて同株のゲノム抽出を行った。これに対して大腸菌の天然型ＧＢＰ構造遺伝子をコードするｍｇｌｂ遺伝子のクローニングを行った。
【００３３】
すなわち、下記に示すPCRプライマー１及び２（配列番号３、４）を用いて、大腸菌ゲノムDNAをテンプレートとしPCRによって目的遺伝子の増幅を行い、精製後、TAクローニングを行った。反応条件を以下の通りに設定して、ＰＣＲ増幅を行った。なお、このプライマーによって増幅されるＧＢＰの配列は最終的に蛋白質として調製される成熟型の蛋白質に加え、Ｎ末端領域にペルプラズムに分泌するためのシグナルペプチド配列（MNKKVLTLSA VMASMLFGAA AHA）が付与された状態にて増幅される。
94℃ １分、60℃ 30秒、72℃ 30秒（以上を１サイクル）、
98℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 7分、72℃ 8分（以上を２５サイクル）。
プライマーの配列
配列番号３ （プライマー１）
forward; 5'- gagatcatatgaataagaaggtgttaaccc - 3'
配列番号４ （プライマー２）
reverse; 5'- cccaaaagcttttttttcttgctgaattc -3'
【００３４】
Taqポリメラーゼは、TaKaRa LA TaqTMを用いた。このようにして得られたPCR産物をGENE CLEAN2Kit付属のマニュアルに従いグラスミルク精製後、pGEM-T Vector System付属のマニュアルに従いサブクローニングし、カラーセレクションにより、インサートを有するベクターを保持する形質転換体を得た。得られた形質転換体をLB培地で培養(37℃、1.8ml、試験管)し、集菌、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをM13プライマーフォワード、M13プライマーリバース(タカラバイオ(株))を用い、インサートの塩基配列解析を行った。サンプルの調整方法、解析法などはABIプリズム310ジェネティックアナライザー（パーキンエルマーアプライドバイオシステム社製）付属のマニュアルにしたがった。
【００３５】
配列解析の結果、pGEMへのｍｇｌＢ配列の挿入（pGEM-ＧＢＰ）が確認された。また配列中にアミノ酸変化を伴う変異はなかった。
【００３６】
（実施例２）
＜天然型ＧＢＰの調製＞
ＧＢＰのC末端にHis Tagを付加した発現用ベクターpET-ＧＢＰの構築を行った。
【００３７】
pGEM/ＧＢＰをNdeI-HindIII消化し、グラスミルク精製を行なった後、同制限酵素にて消化したpET30(c)とライゲーションし、His-tag融合発現ベクターpET30(c)/ ＧＢＰを構築した。シークエンス解析により配列が確認されたpET30(c)/ＧＢＰで形質転換した大腸菌BL21(DE3)/ pET30(c)/ＧＢＰをLB培地（Amp 50μg/ml）にて150 mlスケールで培養した。OD600が0.6となったところでIPTGを終濃度0.4 mMとなるように添加し、添加後5.5 時間で培養を停止した。集菌・洗浄後、20％ sucrose/30 mM Tris−HCl buffer (pH8.0)に懸濁・攪拌・遠心分離後、得られたペレットに5 mM MgCl2を加え攪拌後、遠心分離を行い、ペリプラズム画分を調整し、10 mM imidazol を含む300 mM NaCl / 50 mM Na-phosphate buffer (pH8.0)(buffer A)にて一晩透析し、Ni-NTA agarose (QIAGEN) 5 mlを充填したOpen columnを用いて組換えＧＢＰの精製を行った(平衡化buffer: A + 10 mM imidazol, 洗浄buffer:A + 20 mM imidazol, 溶出buffer: A + 250 mM imidazol)。天然型ＧＢＰを終濃度1μMに調製し、グルコース、ガラクトースを添加したときの342 nmにおける蛍光強度の変化を測定した（励起波長; 295 nm）。
【００３８】
（実施例３）
＜天然型ＧＢＰのグルコース結合能力の検討＞
実施例２で得られた精製ＧＢＰを用いて、蛍光分光光度計による自家蛍光特性検討を行った。1μM ＧＢＰにグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、蛍光波長及びＧＢＰ配列中に有するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した（λex=295 nm）。
【００３９】
図３に示される蛍光スペクトル変化からも明らかなように、グルコースおよびガラクトースとの結合により蛍光強度の増加が見られた。
【００４０】
＜グルコース類の蛍光分析＞
実施例２で得られた天然型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計によるグルコースの蛍光測定を行った。ＧＢＰを含む溶液にグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、３３５nmにおける最大蛍光強度の変化を測定した(λex=295 nm)。
【００４１】
図４で示される蛍光強度変化のグルコース及びガラクトースの濃度依存性からも明らかなように、グルコースおよびガラクトースの濃度とともに蛍光強度の増加が観測され、蛍光強度を指標としてグルコースおよびガラクトースが蛍光分光法により計測できることがわかった。しかし、天然型ＧＢＰはグルコースとガラクトースの両単糖類に対して同等に結合し、選択性が低いことが明らかである。
【００４２】
（実施例４）
＜改良型ＧＢＰの構築＞
グルコース結合蛋白質の１４番目ＡｓｐをＡｓｎあるいはＧｌｕ残基に置換した改良型ＧＢＰを構築した。
【００４３】
改良型ＧＢＰは定法に従い、ＧＢＰ構造遺伝子に対して部位特異的に変異を導入する。本実施例では、pGEM/ＧＢＰをテンプレートとし、Asp14Asn, Asp14Gluとなるようにデザインしたプライマーを用いて、クイックチェンジ（登録商標）を用いて作成した。
【００４４】
すなわち、pGEM/ＧＢＰを対象として、以下に示す変異導入用のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて１４番目ＡｓｐをＡｓｎあるいはＧｌｕ残基に相当するコドンに置換した。
Asp14Asn gat→aac
プライマーの配列
配列番号５ （プライマー３）
forward; 5'- caatctataagtacgac aac aactttatgtctgtag -3'
配列番号６ （プライマー４）
reverse; 5'- ctacagacataaagtt gtt gtcgtacttatagattg -3'
Asp14Glu gat→gaa
プライマー配列
配列番号７ （プライマー５）
forward; 5'- caatctataagtacgac gaa aactttatgtctgtag -3'
プライマー配列
配列番号８ （プライマー６）
reverse; 5'- ctacagacataaagtt ttc gtcgtacttatagattg -3'
【００４５】
その結果、Ａｓｐ１４ＡｓｎおよびＡｓｐ１４Ｇｌｕの改良型ＧＢＰをコードする遺伝子が構築できた。
【００４６】
実施例５
＜改良型ＧＢＰの調製＞
改良型ＧＢＰはすでにC末端にHis Tagを付加した発現用ベクターpETに挿入されていることから天然型ＧＢＰと同様に精製を行った。
【００４７】
pET30(c)/１Ａｓｐ１４ＡｓｎあるいはpET30(c)/１Ａｓｐ１４Ｇｌｕで形質転換した大腸菌BL21(DE3)をLB培地（Amp 50μg/ml）にて150 mlスケールで培養した。OD600が0.6となったところでIPTGを終濃度0.4 mMとなるように添加し、添加後5.5 時間で培養を停止した。集菌・洗浄後、20％ sucrose/30 mM Tris−HCl buffer (pH8.0)に懸濁・攪拌・遠心分離後、得られたペレットに5 mM MgCl2を加え攪拌後、遠心分離を行い、ペリプラズム画分を調整し、10 mM imidazol を含む300 mM NaCl / 50 mM Na-phosphate buffer (pH8.0)(buffer A)にて一晩透析し、Ni-NTA agarose (QIAGEN) 5 mlを充填したOpen columnを用いて改良型ＧＢＰの精製を行った(平衡化buffer: A + 10 mM imidazol, 洗浄buffer:A + 20 mM imidazol, 溶出buffer: A + 250 mM imidazol)。
【００４８】
（実施例６）
＜改良型ＧＢＰのグルコース結合能力の検討＞
実施例５で得られた改良型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計による自家蛍光特性検討を行った。1μM 改良型ＧＢＰにグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、蛍光波長及びＧＢＰ配列中に有するトリプトファン残基の自家蛍光に由来する最大蛍光強度の変化を測定した（λex=295 nm）。
【００４９】
蛍光スペクトル変化を観察したところ、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースとの結合により天然型ＧＢＰと同様に蛍光強度の増加がみられた。しかし、おどろくべきことに、ガラクトースの存在下ではAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰは蛍光強度の変化が観察されず、ガラクトースとはほとんど結合しないことがわかった。
【００５０】
（実施例７）
＜改良型ＧＢＰを用いるグルコース類の蛍光分析＞
実施例５で得られたAsp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰ用いて、蛍光分光光度計によるグルコースの蛍光測定を行った。Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰＧＢＰを含む溶液にグルコースあるいはガラクトースを加え25℃で2.5分間インキュベート後、３３５nmにおける最大蛍光強度の変化を測定した(λex=295 nm)。
【００５１】
図５及び図６に示される蛍光強度変化のグルコース及びガラクトースの濃度依存性からも明らかなように、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰを用いた蛍光分析においてはグルコースの濃度とともに蛍光強度の増加が観測され、蛍光強度を指標としてグルコースが蛍光分光法により計測できることがわかった。しかし、天然型ＧＢＰとは全く異なり、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはガラクトースの濃度増加に対して蛍光強度の増加は観測されず、きわめて選択性の高い分析方法が構築できた。
【００５２】
このように蛍光強度の変化量からグルコースの濃度が高まるとともに、蛍光修飾ＧＢＰの蛍光強度が増加したことから、蛍光強度を指標として選択的にグルコースの定量が可能であった。
【００５３】
以下の表に本発明にて構築された改良型ＧＢＰのグルコースに対する結合定数を記す。このように、Asp14AsnおよびAsp14Gluの両改良型ＧＢＰはグルコースに対してそれぞれ０．３９μＭおよび０．３４μＭときわめて高い親和性を有し、かつ、天然型ＧＢＰのようにガラクトースを認識しないことがわかった。このように本発明の両改良型ＧＢＰは血糖値をはじめとするグルコース計測においてすぐれた特性を示す。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の新規なグルコース結合蛋白質（ＧＢＰ）及びこれを用いたグルコースの蛍光分光学的分析方法は、糖尿病の診断や臨床検体の分析等の臨床試験に大きく貢献することができるものであり、医療分野の技術革新に寄与することができる。すなわち本発明は、糖尿病に代表される生活習慣病等の医療技術の進歩に寄与することができる革新的な技術である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】グルコース結合蛋白質のアミノ酸配列を示した配列番号１を示す。
【図２】グルコース結合蛋白質の遺伝子配列を示した配列番号２を示す。
【図３】天然型グルコース結合蛋白質の自家蛍光特性を示す。
【図４】天然型グルコース結合蛋白質の自家蛍光に基づくグルコースおよびガラクトースの蛍光測定を示す。
【図５】改良型グルコース結合蛋白質、Ａｓｐ１４Ａｓｎの自家蛍光に基づくグルコースの蛍光測定を示す。
【図６】改良型グルコース結合蛋白質、Ａｓｐ１４Ｇｌｕの自家蛍光に基づくグルコースの蛍光測定を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のグルコース結合蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のグルコース結合蛋白質と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項２】
グルコース結合蛋白質において大腸菌由来グルコース結合蛋白質の成熟型蛋白質の１４番目のアスパラギン酸残基、もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１記載の改変型グルコース結合蛋白。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグルタミン酸で置換されている、請求項３記載の改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかに記載の改変型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載のグルコース結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース結合蛋白質を採取することを特徴とするグルコース結合蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法で製造されたグルコース結合蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの分光学的分析方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの蛍光分光学的分析方法。
【請求項１２】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とするグルコースの分光学的分析用アッセイキット。
【請求項１３】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とする、グルコースの蛍光分析用アッセイキット。
【請求項１】
天然のグルコース結合蛋白質の１またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されており、かつ前記天然のグルコース結合蛋白質と比較してグルコースに対する高い選択性を有する改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項２】
グルコース結合蛋白質において大腸菌由来グルコース結合蛋白質の成熟型蛋白質の１４番目のアスパラギン酸残基、もしくは他の種における同等の位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されている改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項３】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸残基で置換されている、請求項１記載の改変型グルコース結合蛋白。
【請求項４】
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１４番目のアスパラギン酸がアスパラギンまたはグルタミン酸で置換されている、請求項３記載の改変型グルコース結合蛋白質。
【請求項５】
請求項１−４のいずれかに記載の改変型グルコース結合蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項５記載のグルコース結合蛋白質をコードする遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体または形質導入体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養して、該培養物からグルコース結合蛋白質を採取することを特徴とするグルコース結合蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法で製造されたグルコース結合蛋白質。
【請求項１０】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの分光学的分析方法。
【請求項１１】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を用いることを特徴とするグルコースの蛍光分光学的分析方法。
【請求項１２】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とするグルコースの分光学的分析用アッセイキット。
【請求項１３】
請求項９に記載のグルコース結合蛋白質を含むことを特徴とする、グルコースの蛍光分析用アッセイキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１５９５２４（Ｐ２００７−１５９５２４Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６３０８３（Ｐ２００５−３６３０８３）
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【Ｆターム（参考）】
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