グルタチオン類縁体を含有する治療用組成物
【課題】医薬組成物およびその使用方法を提供すること。
【解決手段】グルタチオン類縁体の脂質製剤およびその製造方法。造血を刺激する；放射線または化学療法によって引き起こされた損傷から造血細胞を保護する；または造血先祖細胞によるコロニー形成における１種もしくは組合せのサイトカインの刺激作用を増強する；化学療法剤または放射線照射の破壊効果から患者を保護する；または化学療法剤の効果を増強するためのそれらの使用。
【解決手段】グルタチオン類縁体の脂質製剤およびその製造方法。造血を刺激する；放射線または化学療法によって引き起こされた損傷から造血細胞を保護する；または造血先祖細胞によるコロニー形成における１種もしくは組合せのサイトカインの刺激作用を増強する；化学療法剤または放射線照射の破壊効果から患者を保護する；または化学療法剤の効果を増強するためのそれらの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼと相互作用するグルタチオン類縁体の組成物、製剤および方法に関する。さらに本発明は、グルタチオン類縁体の脂質製剤およびその製造方法に関する。該脂質製剤は、経腸投与時における薬物不溶性という問題を克服し、その毒性作用を減少する。最後に、本発明は、骨髄または血液における造血の調節およびこのような組成物および製剤によって提供される他の有用な応答に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍および他の適応症の治療に用いられる化学療法剤の副作用は、よく知られている。これらの副作用には、好中球、血小板およびリンパ球などの種々の血液細胞の血中濃度の改変がある。これらの副作用の結果として、好中球減少症、血小板減少症および全身性免疫抑制が生じる。これらの副作用は、不愉快なだけでなく、ガン療法の効力を低下させ、患者を感染および制御不能な出血という重篤な危険に到らしめる。
現在、これらの作用に対する実際的改善は、少ししかない。代表的には、支持的介護、抗生物質の大量投与または成長因子の投与などがそのアプローチである。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）などの成長因子および巨核球成長および発育因子（ＭＧＤＦ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）といったようなさらに新しく発見された因子の投与は高価である。さらに、それらは、それ自体がよくない副作用をもっている。
化学療法の副作用を処理する現在のアプローチおよび別の方法での造血の抑制を処理することに関連する問題は、少なくとも部分的には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの種々のイソ酵素のインヒビターである単純なトリペプチド化合物の生物学的活性によって解決される。
【０００３】
多くの小さいペプチドベース化合物に関し、このような化合物の製剤は、それらの溶解性および効力において実質的な役割を演じる。脂質製剤[「薬物担体としてのリポソーム」、G.Gregoriadis編。JOHN Wiley and Sons、１９８８]および乳液または脂質マイクロスフィア[Cummings，J.らのExpert Opin.Ther.Pat.（１９８８）、８（２）、１５３；Takenaga，M.のAdv.Drug Delivery Rev.（１９９６）、２０（２，３）、２０９；Yamaguchi，T.のAdv.Drug Delivery Rev.（１９９６）、２０（２，３）、１１７；Mizushima，Y.のＥＰ０４３２６９７Ａ２；Kraft，M.のＷＯ９８・０５３０１]は、溶解性を増強し、薬物動態学的挙動を調節し、生体分布を変更し、酵素による崩壊から化合物を保護する適当な医薬的担体として用いることができる。化合物の親油性を増強することが、エマルジョンおよびリポソーム内に製剤化することを援助することがしばしばある。したがって、長い炭素鎖または他の親油性基を含むエステルを用いて、溶解性を最大化するための化合物を作成することができる。
【０００４】
リポソームは、閉じた水の区画を画定する完全に閉じた脂質二重層膜である。リポソームは、部分的にリン脂質から作られる微細なデリバリー小胞であり、水と混合したときに、閉じた液体充填球体を形成する。リポソームは、１つの脂質二重層膜からなる単ラメラまたは二重層以上の多重ラメラのいずれであってもよい。リポソームは、放出時間が延長されることによる投与薬物の制御放出を提供する能力および血流中の有効成分の遊離濃度を制限することによる薬物の副作用を減少する能力をもっている。またリポソームは、薬物の組織分配および取り込みを変更することができ、変更された組織分配は、該薬物の治療上の有効性を有意に増加する。
ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０２０５（１９９６年１２月１９日公開）、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０８５６３（１９９５年３月３０日公開）およびＰＣＴ／ＵＳ９４／１０７９７には、グルタチオンの類縁体であるトリペプチド化合物が開示されている。それらは、一般に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性のインヒビターであり、このグループに含まれる種々の化合物はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのイソ酵素に関して様々な特異性を示す。これらの特許に開示されたものは、１〜１０Ｃ単位の対称エステルであり、好ましい具体例としてジエチルエステルが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、造血の調節に有用であり、腫瘍の化学療法的治療に対する援助として有用な化合物を含む医薬組成物、該化合物それ自体を提供する。本発明は、式Ａ：
【化１２】
[式中、各エステルは１−２５Ｃ；
ＹＣＯはγ−ｇｌｕまたはβ−ａｓｐ；
Ｇ＊はフェニルグリシン；
ＺはＣＨ２、ＯまたはＳ；および
Ｘは６−８Ｃアルキル、ベンジルおよびナフチルからなるグループから選ばれる炭化水素ラジカル]
で示されるジエステル化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含む、先祖細胞からの造血の調節に使用するための脂質製剤およびそのような製剤の製造方法を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１３】
[式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、直線または分枝アルキル基（１−２５Ｃ）、シクロアルキル基（６−２５Ｃ）、置換アルキル基（２−２５Ｃ）、ヘテロシクロ（６−２０Ｃ）、エーテルまたはポリエーテル（３−２５Ｃ）から選ばれる、またはＲ１−Ｒ２が一緒になって（２−２０Ｃ）式Ｉで示されるマクロシクロを形成する；および
Ｘは６−８Ｃアルキル、ベンジルおよびナフチルからなるグループから選ばれる炭化水素ラジカル]
で示されるジエステル化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含む、先祖細胞からの造血の調節に使用するための脂質製剤およびそのような製剤の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の完成に先立って、Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが高級アルキル（少なくとも６Ｃ）基である高級アルキルエステルを製造することによって上記化合物のバイオアベイラビリティーを増加させる努力を行った。しかし、これは、より困難で高価なプロセスであることが判明した。続いて、本発明者らは、脂質製剤、特にリポソーム製剤を用いることによって、適当な標的化を介した化合物の取り込みを増強することができ、それによって、前述したような困難さや高級アルキルエステルの高価な製造にたよることなく、バイオアベイラビリティーを増加することができることを見出した。
【０００８】
本発明の脂質製剤または組成物は、リポソーム、脂質マイクロスフィアおよび脂質エマルジョンを含む。脂質マイクロスフィアは、本発明化合物を含有する脂質コアおよび／またはマトリックスからなる球状の粒子である。リポソームは、本発明化合物を含有する水性区画に境界をつけている脂質層からなるリン脂質小胞である。
式ＡまたはＩの化合物は、水溶液、特に高浸透性溶液において制限された溶解性をもつことがわかっている。脂質に配合されたこれらの化合物は、生物学的媒体に入れたときに、より高い溶解性をもつことが明らかである。これらの化合物はさらに、脂質マイクロスフィアに配合したときに、より大きいプロテアーゼ耐性をもち、血液中での半減期が長くなることがわかっている。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、医薬的に許容しうる油でコーティングされた式ＡまたはＩの化合物のコアを特徴とする小滴の脂質媒体の製造方法を提供する。したがって、本発明は、脂質ベース製剤の製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は、式ＡまたはＩの化合物がリポソームに会合しているのが見出されるリン脂質ベースリポソームの調製方法を提供する。
別の態様において、本発明は、式ＡまたはＩの化合物を含有するリン脂質ベースリポソームの製造方法に関する。
別の態様において、本発明は、患者に処置された化学療法剤および放射線療法の破壊作用からの回復が促進される作用モードといったような該破壊作用に対する保護に用いるための、保護効果を発揮するのに有効な量の式ＡまたはＩの化合物を含む脂質製剤およびそのような製剤の製造方法に関する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、好中球、血小板およびリンパ球の生成を促進し、損傷を受けた骨髄を回復させ、骨髄を細胞障害性療法から保護し、化学療法、感染または血液学的疾患によって引き起こされた好中球減少症、血小板減少症、リンパ球減少症および貧血症に対する保護効果を発揮し、および骨髄移植の間に細胞集団を増加するための式ＡまたはＩの化合物、式ＡまたはＩの化合物を含む製剤および脂質製剤に関する。このような化合物は、上記式ＡまたはＩの化合物またはその対応するアミド、エステル／アミド、塩または遊離ジ酸である。好ましい具体例は、脂質製剤中に低級アルキルエステルを包入したものである。さらに本発明は、治療効果を増強する腫瘍特異的な化学または放射線敏感剤および全身性化学保護剤としての本発明化合物の使用に関する。本発明の別の態様は、貧血症、感染などの治療のための一般的免疫刺激剤に関する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、以下の作法によって製造される式ＡまたはＩの化合物を含有する脂質製剤に関する：（ｉ）薬物および脂質をアルコール／水からなる共溶媒に溶解し；（ii）混合物を緩衝液で迅速に希釈してリポソームを形成し；（iii）リポソーム調製物を１つまたは２つ以上の積み重ねフィルターを通して押し出して所定のサイズの単ラメラ小胞を生成し；次いで（iv）凍結乾燥する。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
多くの式ＡおよびＩの化合物は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼイソ酵素の少なくとも１つのイソ酵素サブクラスの活性を阻害するのに有用である。またこれらの化合物の組成物は、通常、造血を維持するのに必要な細胞の大部分を破壊する作用剤の存在下でさえも、骨髄における造血を調節する。さらに、これらの組成物は、骨髄および血液細胞において他の有用な効果を示す。
【００１３】
式ＡおよびＩの本発明化合物は、遊離酸、塩、モノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミドまたはエステル／アミド混成体として存在する。エステルまたはアミド体は一般に、アルキル（１−２５Ｃ）；アルケニル（１−２５Ｃ）；およびアリールアルキル（１−２５Ｃ）アルコールならびにアミンである。特に、ジエステルはいずれも、１Ｃ原子を有する第１エステル基および１Ｃ，２Ｃ，３Ｃ，４Ｃ，５Ｃ，６Ｃ，７Ｃ，８Ｃ，９Ｃ，１０Ｃ，１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｃ，１６Ｃ，１７Ｃ，１８Ｃ，１９Ｃ，２０Ｃ，２１Ｃ，２２Ｃ，２３Ｃ，２４Ｃまたは２５Ｃ原子を有する第２エステル基をもつ。同様に、それらは、前記の第２エステル基のいずれかと１Ｃ，２Ｃ，３Ｃ，４Ｃ，５Ｃ，６Ｃ，７Ｃ，８Ｃ，９Ｃ，１０Ｃ，１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｃ，１６Ｃ，１７Ｃ，１８Ｃ，１９Ｃ，２０Ｃ，２１Ｃ，２２Ｃ，２３Ｃ，２４Ｃまたは２５Ｃ原子をもつ第１エステル基の組合せであってもよい。このような基は、直鎖であるか、または十分な数の炭素原子をもつ場合、１つまたは２つ以上の分枝を含んでもよい。特に、少なくとも１つのエステル基は、いずれか１つの１０〜２５Ｃ原子をもつ。本発明に有用な代表的なエステルとして、ジオレイル、パルミチル／エチル、ラウリル／エチル、ジラウリル、ステアリル／エチルなどが挙げられる。Ｘがベンジルである式ＡまたはＩの化合物のパルミチル／エチル体が特に好ましい。同様に、モノアミドまたはモノエステルについて、エステルまたはアミド基は、上記の数のＣ原子のいずれかをもつ。ジアミドまたはエステル／アミド混成体の場合、２つのアミド基それぞれまたはアミドおよびエステル基は、ジエステルにおいて記載したＣ原子の組合せと同じである。置換基が正の医薬的効果（少なくともいずれか１つの本明細書に記載した効果）を示すのを妨げない場合、このような基および式ＡまたはＩの残りのものが、１つまたは２つ以上の置換基をもってもよいことが理解されるであろう。このような置換基として、１つまたは２つ以上（２または３など）のハロゲンまたはヒドロキシが挙げられる。
【００１４】
式ＡまたはＩの特定のジエステル（式Ｉのジエステルなど）は、対応するジエチルエステルよりも親油性が大きい。このことは、化合物が、リポソーム組成物に配合される場合に特に遊離である。対応する遊離のジ酸体よりもヒト細胞におけるクロラムブチル細胞障害性の効力が強化されたジエステル[参考文献である米国特許第５９５５４３２号の実施例１に記載されている]または対応する遊離のジ酸体よりも無血清培地に懸濁するＨＴ−２９（ヒト結腸腺癌）などのヒトガン細胞による取り込みが強化されたジエステル[上記特許の実施例１に記載されている]を選択してもよい。対応する遊離のジ酸体よりもマウスまたはラットの骨髄の強化された分化を提供するジエステル[上記特許の実施例９に記載されている]を選択してもよい。
【００１５】
本発明のトリペプチドが、１つまたは２つ以上のキラル中心をもつことは明らかである。上記事項は、これらのキラル中心の存在から得られるジアステレオマーに関係している。本発明の好ましいアミノ酸は、Ｌ配置である。
本発明組成物は、化学療法の佐剤や他の指示薬として有用な幾つかの特性をもっている。第１の特性として、骨髄の崩壊は化学療法の通例の副作用であるが、本発明化合物は、骨髄における造血を調節する。第２の特性として、本発明化合物は、通常、腫瘍細胞において特に広く行き渡っているπサブクラスなどの少なくとも１つのクラスのＧＳＴイソ酵素を阻害する。最後の特性として、式ＡまたはＩの本発明化合物は、腫瘍細胞の破壊において化学療法剤の効果を直接強化する。この品質の組合せにより、本発明化合物は、直接的造血強化剤ならびに化学療法プロトコルの悪作用の改善剤および標的細胞への毒性作用の強化剤の両方として有用になる。インビボ用製剤または無傷の細胞と接触して用いる製剤とする場合、式ＡまたはＩの本発明化合物は、エステルとして供給されるのが好ましく、ジエステルがさらに好ましい。
【００１６】
Remington's Pharmaceutical Sciences（マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ）およびLiposome Technology、Vol.III、Targeted Drug Delivery and Biological Interaction（１９８４、ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド、ボカラトン、フロリダ） に記載されている標準的方法ならびに特定の製剤を用いて投与用製剤を調製する。特に有用な式ＡまたはＩの本発明化合物は、脂質組成物である。脂質組成物には、脂質エマルジョン（水性脂質エマルジョンなど）、リポソームおよび脂質マイクロスフィアがある。脂質組成物製剤は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、ホスファチジル酸、オレイン酸、カルジオリピン、スルファチド、ガングリオシド、脂肪酸、ペパーミント油、オリーブ油、大豆油、鉱物油、ピーナツ油、紅花油、トウモロコシ油、レシチンなどを含むことができる。脂質組成物製剤に配合できるその他の物質として、パルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、糖置換ＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジロイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、ジミリストイルレシチン（ＤＭＬ）、ジパルミトイルレシチン（ＤＰＬ）、ジステアロイルレシチン（ＤＳＬ）、ジラウロイルレシチン（ＤＬＬ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。
【００１７】
ひとつの好ましい組成物は、Ｒ１がパルミチル、Ｒ２がエチル、Ｘがベンジルである化合物Ｉの組成物であり、大豆油、卵黄レシチンおよびグリセロールの混合物に配合される。
本発明において、脂質は、５〜５０％（W/V）の大豆油などのグリセリドおよびグリセリド１００部当たり１〜５０部、好ましくは５〜３０部のホスホリピド（卵黄レシチンなど）からなるのが好ましい。１〜５０重量部、好ましくは１０〜４０重量部のグリセロールなどの等張剤を佐剤としてさらに含むことができる。脂質エマルジョンなどの脂質組成物中のグルタチオン類縁体の含量は、エマルジョンの形体および目的に応じて適当に調節し、通常、０．０２〜５ｍｇ／ｍｌのレベルである。
別の好ましい組成物は、Ｒ１およびＲ２がエチル、Ｘがベンジルである化合物Ｉの組成物であり、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）および卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の混合物に配合される。
【００１８】
脂質製剤は、脂質：式ＡまたはＩの化合物の比率が、３：１〜６：１である。卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の比率が３：１、２：２または１：３重量であり、式ＡまたはＩの化合物：スクロースの比率が１：７部である脂質製剤が好ましい。卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の比率が２：２重量であり、式ＡまたはＩの化合物：スクロースの比率が１：７部である脂質製剤が最も好ましい。さらに、ｐＨを調節するためにクエン酸緩衝液などの添加剤を加えてもよい。脂質製剤の正味電荷は、マイナスから中性である。脂質製剤の正味電荷がマイナスであるのが好ましい。脂質化合物／製剤の製造方法は、押し出し成形機を用い、次いで濾過して約５０〜２０００ｎｍの大きさの単ラメラ小胞を生成するのが好ましい。生成される単ラメラ小胞の大きさが約５０〜１０００ｎｍであるのがさらに好ましい。生成される単ラメラ小胞の大きさが約４００〜６００ｎｍであるのが最も好ましい。リポソームは凍結乾燥し、医薬的に許容しうる希釈剤で戻すことができる。
薬物のリポソーム内への包入の程度は、５０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましく、最終の凍結乾燥によって粘度および小胞の大きさが増加する（７５〜６００ｎｍ）。薬物のリポソーム内への包入の程度が約９５％であるのが最も好ましい。
【００１９】
（投与および使用）
「骨髄または末梢血液における造血を調節すること」は、コロニー形成または分化細胞の能力によって測定される血液細胞形成の速度を変えることを意味する。分化細胞として、好中球、血小板、赤血球、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、顆粒球−マクロファージなどが挙げられる。本明細書で用いる「骨髄または末梢血液における造血を調節すること」は、非処理の骨髄の能力とは異なるレベルでコロニー形成または分化細胞の生成を示すように本発明組成物で処理した骨髄または末梢血液の能力を意味する。同様に、適当な先祖細胞を含む骨髄または末梢血液のフラクションもこの効果を示す。本明細書で用いる「末梢血液」は、特に臍帯血を含むことに留意すべきである。
【００２０】
一般に、骨髄または血液の造血において代表的に破壊的作用をもつ作用剤を用いる場合、本発明組成物は、保護効果を発揮する。「保護効果」は、骨髄またｈ血液が得る損傷が、該組成物を投与しない場合よりも少ないことを意味する。
本発明組成物の保護効果が有用である状況は多い。これらには、放射線照射が行われた結果よくない効果がもたらされた、あるいは将来的にもたらされることが予測される場合、患者が何らかの理由で免疫システムがそこなわれている場合、患者が腎臓に損傷がある場合および患者が化学療法を処置された場合が含まれる。さらに、本発明組成物は、移植手術の設定に用いて、ドナーの骨髄細胞の数を増加することができる；代表的には、この場合、該組成物をインビボまたはエクスビボ投与する。この設定においても、本発明組成物は、先祖細胞がドナーの末梢血液内へ移動するのを促進し、このドナーにおける末梢白血球の回復を改善する；同様に、本発明組成物は、レシピエントにおける末梢白血球の回復を改善することができる。一般に、本発明組成物をインビボまたはエクスビボで処理した後、該組成物は増加を改善し、移植細胞の最終的植付けを促進する。本発明組成物は、回復を促進するためにレシピエントに直接使用することができる。
【００２１】
本発明組成物は、インビトロまたはエクスビトロのいずれかで用いることができる。たとえば、これらの組成物を同種または異種移植前に用いて、骨髄中の造血細胞を増加あるいは調節することができる。相対的に未分化の細胞の増加が実現されるエクスビボ技術を用いる患者の処置を用いてもよい。本発明組成物は、インビボ投与用に製剤することもできる。
エクスビボ投与を採用する場合、骨髄または末梢血液（臍帯血を含む）のいずれか、または両方を直接本発明組成物に接触させることができるが、あるいはこれら材料のフラクションを該フラクションが適当な標的先祖細胞を含むまで処理してもよい。
【００２２】
化合物は、注射用、経口投与用または経粘膜もしくは経皮投与などの別の投与法用に製剤することができる。注射は、経静脈、腹膜内、筋肉内またはいずれかの他の慣例の経路で行うことができる。
製剤中の有効成分化合物（または化合物の混合物）の割合は、約０．５％ｗ／ｗ〜約９５％ｗ／ｗといったような広範囲で変化させることができる。有効成分の好ましい割合は、本質的に製剤の性質に応じて変化する。したがって、本発明の“医薬組成物”は、たとえば、本発明化合物のみを含むか、または化合物と他の成分（非毒性が好ましい）を含むことができる。有効成分の好ましい割合は、本質的に製剤の性質に応じて変化する。さらに、本発明組成物は、免疫刺激剤または成長因子などの他の有益な作用剤と混合してもよいし、共に用いてもよい。
【００２３】
必要な用量は、患者の素質、身体状態の性質、投与方法および担当医または担当獣医の診断に応じて変化する。適当な用量範囲は、これらのパラメーターに従って決定する。一般に、患者当たりの代表的な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で１０〜４０日間、さらに好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で１４〜２８日間である。これらの範囲は、例示に過ぎず、正確な用量最適化は、慣例の方法により決定することができる。
本発明組成物を化学療法に関する保護剤として用いる場合、投与のタイミングも関連してくる。しかし、タイミングは、使用する化学療法の性質によって変わる。採用した特定の化学療法剤に対する適当なタイミングを決定するのは、明らかに慣例の技術の範囲内である。
好ましくは少なくとも１つのエステル基のＣ原子数が多く、加水分解速度が小さく、動物やヒトの血漿中での半減期が長いジエステルを選択する（たとえば、Ｃ１６／Ｃ２ ｖｓ 対応するＣ２／Ｃ２ジエステル）。同様に、少なくとも１つのエステル基のＣ原子数が多く（Ｃ１６／Ｃ２ジエステルなど）、少ない数のエステル基Ｃ原子（Ｃ２／Ｃ２ジエステルなど）をもつ、対応するジエステルと比較して動物またはヒトの細胞の造血の強化された調節を示すジエステルを選択する。
【００２４】
後記実施例は、本発明をさらに詳しく説明する。特定の化合物については、前記米国特許第５９５５４３２号においてさらなる実施例が提供されるが、本明細書に記載した他の化合物も同様の方法で用いることができる。実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明化合物をどのように製造し、使用するかを示すために提供するものである。後記実施例において温度はすべて℃であり、ＲＴは室温を示す。グルタチオン類縁体は、米国特許第５７８６３３６号に記載されているような当業界で公知の代表的な有機合成手順によって製造することができる。幾つかの場合において、保護基を導入するが、最終的には除去する。アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基のための適当な保護基は、“Protective Groups in Organic Synthesis”、第２版、ジョン・ウイリーアンド・サンズ、ニューヨーク（１９９１年）に記載されている。カルボン酸の活性化は、“Comprehensive Organic Transformations”、ＶＣＨパブリッシャーズ、ニューヨーク（１９８９年）に記載されている多数の異なる試薬を用いて達成することができる。
【００２５】
脂質エマルジョンおよびリポソームの製造は、当業界で公知の技術で成し遂げることができる。ここでは、グリセリドとして用いた大豆油を、高純度大豆油として精製する（トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドとして少なくとも９９．９％の純度）。通常の有機溶媒を用いる分離法によって製造される卵黄レシチンまたは大豆レシチンをリン脂質として精製する。一般に、予定量の大豆油、脂質、グルタチオン類縁体および前記の他の添加剤を混合し、加熱して溶液にし、通常のホモジナイザー（圧力ジェット型ホモジナイザーまたは超音波ホモジナイザー）を用いて２５〜９０℃の温度にて均質化処理し、油中水型分散液を得る。次いで、必要な量の水を加え、前記ホモジナイザーを用いて混合物を再度均質化し、水中油型エマルジョンにして本発明のエマルジョンを調製する。生成物に便利さを与えるために、エマルジョン形成後に、安定剤または等張化剤などの添加剤を加えることもできる。
【００２６】
当業界で公知であり、“Liposome Technology, Volume III, Targeted Drug Delivery and Biological Interaction”（１９８４、ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド、ボカラトン、フロリダ）に記載されている方法にしたがって、リポソームを調製する。脂質およびアルコール／水中のＡまたはＩの化合物を溶解し、混合物を適当な緩衝液で迅速に希釈し、少なくとも１つのフィルターを通して生成物を押し出し、次いで濾液を凍結乾燥することによって、リポソームを製造することもできる。
【実施例】
【００２７】
実施例１
グルタチオン類縁体の調製
【化１】
上記反応工程式には中間体（７）（Ｎ−ａ−ｔ−Ｂｏｃ−ａ−エチル−ｇ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システインスクシンイミドエステル）は示されていない。
【００２８】
ジ−ｔ−ブチルジカルボン酸を用いて、塩基性条件下、Ｌ−グルタミン酸（１）を保護する。次いで、化合物（２）を環化し、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸およびパラホルムアルデヒドの反応を介してオキサゾリジノン（３）を得る。オキサゾリジノンおよびＲ'ＯＮａの反応によって化合物（４）を製造する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとｇ遊離酸（４）とのＤＣＣカップリングによりスクシンイミドエステル（５）を製造し、次いで、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインを反応させて保護ジペプチド（６）を形成する。ＤＣＣカップリングによりスクシンイミドエステルを製造し、フェニルグリシンと反応させて、保護トリペプチド（８）を得る。脱保護およびエステル化して最終生成物（９）を得る。
【００２９】
実施例２
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（２）
５００ｇのＬ−グルタミン酸（６．８モル）２部を４Ｌの１０％ＴＨＦ水溶液にそれぞれ懸濁する。Ｎａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にすると透明な溶液が得られる。各溶液を４０℃まで加熱し（最初の１０時間Ｂｏｃ無水物を添加）、次いで、１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル（４．５８モル）を、Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨを９に維持しながら、３０分毎に各フラスコに５０ｇずつ固体で加える。反応物を室温で一夜攪拌する。翌日、さらに１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを上記のように加える。３日目の朝、各溶液を２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する（１当量のＢｏｃ無水物の添加後、ブタノールの形成が反応を止め、ＥｔＯＡｃ抽出物それを除去し、収量を有意に増加することがわかる）。水層を集め、１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを再度上記のように加える（４０℃加熱および５００ｇ／日、５０ｇずつ、各フラスコに２日間にわたって）。全反応時間は４日間であり、４ｋｇ（１８．３２モル）のジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを加える。長い反応時間および加熱によって良好な収量が得られる。次いで、反応混合物を各２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する。各水層を集め、氷浴で０℃に冷却し、濃ＨＣｌを３０分間にわたって滴下して（１滴／秒）ｐＨ３まで酸性化する（ＢｏｃＧｌｕはこの酸性化ステップに敏感であることがわかる。もしｐＨが低くなりすぎるか、またはＨＣｌを速く加えすぎるならば、いくらかの脱保護が起こり、大量のグルタミン酸が溶液から沈澱する）。酸性化が成功すると、オフホワイトのゲルが形成されるが、これはＮａＣｌを溶液の飽和点のわずかに手前まで多量に添加することによって強化される。得られる溶液を各２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する。水層からのＢｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕの除去をＴＬＣでモニターする。ＥｔＯＡｃ層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、３５℃にて回転蒸発器に節、透明な黄色がかった油状物を得る。これを一夜減圧乾燥して、１０９７．１ｇのＢｏｃＧｌｕ（４．４４モル）を得る；収率６５％。
【００３０】
（Ｓ）−ｔ−ブチルオキシカルボニル−５−オキソ−４−オキサゾリジンプロピオン酸（３）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（２）(１０７７ｇ、４．３６モル）をＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）に暖めながら溶解する。これを５Ｌの三つ首フラスコに入れる。この溶液にパラホルムアルデヒド(１９６ｇ、６．５４モル）およびｐ−トルエンスルホン酸(４０ｇ、０．２６モル）を加える。丸底フラスコに２つのディーン−スターク装置、−１０℃におけるデュアルコンデンサーおよびメカニカルスターラーを取り付け、反応混合物を７０℃にし、６時間還流する（反応完了時、ディーン−スターク装置から水(１００ｍｌ）が集められた）。反応混合物（透明な赤褐色の溶液）を室温まで冷却し、回転蒸発器にて赤褐色の油状物を得る。油状物を２Ｌのエーテルに再溶解し、１Ｌの水で３回抽出する。水層を合せ、２Ｌのエーテルで抽出して水中の生成物を移す。両方のエーテル層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、回転蒸発器にて透明な黄色油状物を得る。これを減圧乾燥して不純物の混在する化合物（３）(９５２ｇ、３．６７モル、収率８４．３％）を得る。
３０ｃｍの伸長部を備えた３Ｌの目の粗い焼結ガラスロートを用いて化合物（３）を精製する。４０μｍフラッシュクロマトグラフィー用ベイカーシリカゲル２ｋｇを４ＬのＣＨ２Ｃｌ２でスラリー化し、カラムに注ぎ入れる。樹脂床に達するまで溶媒を流す。さらに２ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、シリカゲルを落ち着かせるために樹脂床まで流す。この時点で、緩やかに加熱してＣＨ２Ｃｌ２(７５０ｍｌ）に溶解した化合物をカラムに入れ、溶媒を流す。溶媒が樹脂床に達した時点で、さらに１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、生成物のローディングが完了するまで流す。次いで、２０ＬのＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、４００ｍｌの画分を集める。蒸発して油状物にし、減圧乾燥して白っぽい黄色の泡状物を得る(７４５．７ｇ、２．８８モル、収率６６．２％）。
【００３１】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル（４）
トルエン(５００ｍｌ）を入れた容器にナトリウム棒(１５０ｇ、６．５モル）を入れ、表面の曇りをこすり落とし、薄い四角片を切り出す。四角片５０ｇを秤量して、トルエン１００ｍｌを入れた風袋控除した容器に入れ、トルエンを排出し、Ｎ２気流下、０℃にて３Ｌのエタノールにナトリウムを加える。泡立ちがおさまった後、さらに５０ｇの上記ナトリウムを加える。全部で２００ｇを加えるまでこれを繰り返す。次いで、Ｎ２気流下、室温にて該溶液を一夜攪拌すると粘稠な透明溶液が得られる。化合物（３）(７４５．７ｇ、２．８８モル）を３Ｌのエタノールに暖めながら加え、メカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコに入れる。Ｎ２気流下、この溶液に、平衡滴下ロートを用いてＮａＯＥｔを滴下する（１滴／秒）。反応物を一夜攪拌すると大量の白色沈澱を含む黄色がかった白色の溶液が得られる。氷浴にて反応混合物を０℃に冷却し、濃ＨＣｌを滴下（１滴／秒）してｐＨ９にする（反応後のｐＨは１３である）。６Ｌの水を加え、透明な溶液を得る。これをエーテル：石油エーテル（１：１）混合物各３Ｌで２回抽出する。水層を合わせ、氷浴にて０℃に冷却し、攪拌しながらＨＣｌを滴下して（１滴／秒）、ｐＨ３にする。酸性化した溶液を各３Ｌのエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、蒸発して透明な黄色油状物を得る。これを高減圧乾燥して、６０９ｇ（２．１１モル、収率７３．５％）を得る。
【００３２】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル・γ−スクシンイミドエステル（５）
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル（４）(６０９ｇ、２．１１モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(２８０．４ｇ、２．４３、モル）をメカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内で３ＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解する。ＣＨ２Ｃｌ２(５００ｍｌ）にＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(５４７．１ｇ、２．６５モル）を溶解し、Ｎ２気流下、攪拌しながら滴下する。さらに５０ｇ（０．２４モル）のＤＣＣをＣＨ２Ｃｌ２(１００ｍｌ）に溶解し、反応混合物に滴下し、一夜攪拌する。ＴＬＣにより、反応の完了がわかる。ＤＣＣ尿素を反応物から濾去し、濾液を回転蒸発器で処理して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る；粗化合物（５）(１０４２．７ｇ、２．８１モル）が得られる。
化合物（３）の精製に用いたオープンカラムを用いて化合物（５）を精製する。４０μｍフラッシュクロマトグラフィー用ベイカーシリカゲル２ｋｇを４ＬのＣＨ２Ｃｌ２でスラリー化し、カラムに注ぎ入れる。これを樹脂床に達するまで溶媒を流す。さらに２ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、シリカゲルをパックするために樹脂床まで流す。溶媒レベルが樹脂床の頂部に到達した時点で、緩やかに加熱してＣＨ２Ｃｌ２(７５０ｍｌ）に溶解した化合物をカラムに入れ、重力でローディングする。溶媒が樹脂床に達した時点で、１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、生成物のローディングが完了するように流す。生成物を２０ＬのＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、４００ｍｌのアリコートを集める。画分を蒸発して油状物にし、高減圧乾燥して泡状物を得る(８５３ｇ、２．２８モル、収率１０８．０％）（サプリメント＃５の純度を記載）。
【００３３】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）−Ｌ−システイン（６）
Ｓ（ベンジル）−Ｌ−システイン(４６５ｇ、２．２モル）を４Ｌの２０％ＴＨＦ水溶液でスラリー化する。磁気攪拌しながら溶液にＮａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にする。これは、部分的に溶解したスラリーになる。緩やかに加熱しながら化合物（５）(８５３ｇ、２．２８モル）を１．５ＬのＴＨＦに溶解する。これを、該攪拌溶液にＮａ２ＣＯ３にてｐＨ９を維持しながら滴下する（２滴／秒）。反応混合物を各２Ｌのエーテル：石油エーテル（１：１）で２回抽出する。大量のＴＨＦのために水相に生成物が残留していることを確かめるためにＴＬＣをチェックする。水相を分離し、氷浴で０℃に冷却する。溶液を磁気攪拌しながらｐＨが３になるまで濃ＨＣｌを滴下する。次いで、生成した油状沈澱を２Ｌ部のエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、Ｎａ２ＳＯ４に注ぎ、濾過し、蒸発して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る(８９５．８ｇ、１．９１モル、収率９０．４％）。
【００３４】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システインスクシンイミドエステル（７）
化合物（６）(８９５ｇ、１．９１モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(２４０．６ｇ、２．０９モル）をメカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内で３ＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解する。ＣＨ２Ｃｌ２(５００ｍｌ）にＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(４７２．５ｇ、２．２９モル）を溶解し、Ｎ２気流下、攪拌しながら滴下する（２滴／秒）。５時間後、ＴＬＣは出発物質の実質的量を示す。さらに５０ｇ（０．２４モル）のＤＣＣをＣＨ２Ｃｌ２(５０ｍｌ）に溶解し、反応混合物に滴下し、一夜攪拌する。ＴＬＣは反応の完了を示す。ＤＣＣ尿素を反応混合物から濾去し、濾液を蒸発して１Ｌにする。もやもやとしたものが生じるまでエーテルを加え、溶液を氷浴で０℃に冷却する。スクラッチすると結晶の形成が始まる。もやもやを維持するために少量のエーテル加え、生成物を押し出す。溶液を４℃にて一夜貯蔵する。濾過により結晶を集め、高減圧乾燥して、生成物を得る（９５３ｇ、１．６７モル、収率８７．４％）。
【００３５】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ−フェニルグリシン（８）
（Ｒ）−（−）−フェニルグリシン(２５３ｇ、１．６７モル）を４Ｌの２０％ＴＨＦ水溶液でスラリー化する。磁気攪拌しながら溶液にＮａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にすると、部分的に溶解したスラリーになる。緩やかに加熱しながら化合物（７）(９５３ｇ、１．６７モル）を１．５ＬのＴＨＦに溶解する。これを、該攪拌溶液にＮａ２ＣＯ３にてｐＨ９を維持しながら滴下する（２滴／秒）。反応物を６時間攪拌すると透明な黄色がかったオレンジ色溶液が得られる。反応混合物を各２Ｌのエーテル：石油エーテル（１：１）で２回抽出する。大量のＴＨＦのために水相に生成物が残留していることを確かめるためにＴＬＣをチェックする。水相を分離し、氷浴で０℃に冷却する。溶液を磁気攪拌しながらｐＨが３になるまで濃ＨＣｌを滴下する（１滴／秒）。次いで、生成物を各２Ｌのエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、Ｎａ２ＳＯ４に注ぎ、濾過し、蒸発して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る(８５３ｇ、１．４５モル、収率８６．８％）。
【００３６】
γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ−フェニルグリシンジエチルエステルヒドロクロリド（９）
化合物（８）(７６７．５ｇ、１．２６モル）を２つに分け、メカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内でそれぞれを２．４Ｌのエタノールに溶解する各溶液を氷浴上に置き、アルゴン下、攪拌しながら０℃に冷却する。温度を０℃に維持しながら、各溶液に（ＣＨ３）３ＳｉＣｌ（３８５ｍｌ、６．３２モル）を滴下する（１滴／秒）。（ＣＨ３）３ＳｉＣｌを加えた後（２．５時間後）、反応物から氷浴を取り外し、室温まで暖める。反応物を一夜攪拌する。１８時間後、反応混合物は、白色固体の塊になる。次いで固体を壊してスラリーにし、それぞれを３０℃の回転蒸発器にて体積２Ｌにする。メカニカルスターラーで激しく攪拌しながら、室温にて２．５時間にわたって各スラリーに無水エーテル（２Ｌ）を滴下する（１滴／秒）。不溶物質を濾過して集める。濾過ケーキを一夜高減圧乾燥して、合計３１２．８ｇの化合物（９）を得る。これ（３１２．８ｇ）を７Ｌの熱いＣＨ３ＣＮ（７９℃）に攪拌しながら溶解し、熱いまま濾過して不溶物を除去し、濾液を室温まで冷却する。溶液が冷えると、小さい白色針状結晶が形成され始め、室温になったとき、固化して固体塊になる。これを粉砕し、濾過して固体を集める。濾過ケーキをＮａＯＨペレット上で１６時間高減圧乾燥する。乾燥した物質は、２７７．０ｇ（０．４９モル）であり、３８．８％の収率が得られる。化合物（１０）、（１１）および（１３）が同様の方法で得られる。濃ＨＣｌで切断することによりｔ−Ｂｏｃを除去すると化合物（８）から化合物（１２）が得られる。
【００３７】
表１：化合物（９）−（１３）における置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の説明
【表１】
【００３８】
実施例３
脂質マイクロスフィアの製造
化合物（９）(３０ｍｇ）、精製大豆油(１０ｇ）および精製卵黄レシチン(１．８ｇ）を合せ、ホモジナイザーを用いて混合物を加熱して溶かす。次いで、グリセロール（２．２１ｇ）および体積を１００ｍｌにするのに十分な蒸留水（約９０ｍｌ）を加え、次いで、ホモジナイザーを用いて、大まかに乳化する。次いで、マントンゴウリン型ホモジナイザーを用いて生成物をさらに乳化する。次いで、溶液を１．２μｍのフィルターに通して、約２２０ｎｍの粒子の最終エマルジョンを３００μｇ／ｍｌで得る。同様の方法で、化合物（１０）〜（１２）を含む脂質マイクロスフィアを製造する。
【００３９】
表２：脂質マイクロスフィアの測定された特徴
【表２】
上記表２に記載したＫ１の減少は、本発明のグルタチオン類縁体の強化されたバイオアベイラビリティの指標である。もちろん、上記本発明への変更および修飾は可能である。したがって、本発明は上記詳細に記載した具体例に限定されるものでばない。
【００４０】
実施例４
リポソーム製造方法
他に特記しない限り、以下の一般的手順を用いて、脂質製剤を製造する：(ｉ)化合物（９）(１５７３ｍｇ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）および卵ホスファジチルグリセロール（ＥＰＧ）を無水エタノール(１４．３ｍｌ）およびＨ２Ｏ(２．２ｍｌ）に周囲温度で攪拌することによって溶解し；(ii)溶液を２０ゲージの針を用いて３０ｍｌ容の注射器に吸い上げ、攪拌している３７０ｍＭスクロース８０．９ｍｌに直ちに（１分以内）注入して多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）を形成し；(iii)１Ｍクエン酸塩（ｐＨ４．０）２．５ｍｌを攪拌緩衝液に加え；(iv)１００ｍｌ EXTRUDER（Lipex Biomembranes、バンクーバー、カナダ）を用い、２つの積み重ねた８０ｎｍポリカーボネートフィルターを通して溶液を１０回押し出して単ラメラ小胞を形成し；(v)０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌し；次いで(vi)凍結乾燥して水およびエタノールを除去する。凍結乾燥サイクルは、サンプル温度を−５０℃にする急速凍結、１次水を除去するために−３５℃のトレーに４２時間置く凍結乾燥、および２次水を除去するために２０℃で２時間置くことからなる。
Nicomp Particle Sizer（モデル２７０）を用いて、サンプルに準弾性光散乱分析（Quasi Elastic Light Scattering：ＱＥＬＳ）を行って、平均小胞径を決定する。小胞の薬物包含レベル（包入パーセント）を２つの別のアプローチを用いて決定する。第１のアプローチでは、製剤０．１ｍｌを水和セファデックスＧ−５０を入れた１．０ｍｌツベルクリン注射器に吸い込み；卓上遠心分離機にてサンプルを２０００rpmで５分間遠心分離し、次いで空の小胞を回収する（＞７０％）。包入されなかったかまたは沈澱した薬物をこの過程で除去し、残りをゲル濾過カラムに入れる。カラムクロマトグラフィー前後の薬物／脂質比から包入レベル（％）を計算する。第２のアプローチは、３００００ダルトンの分子量カットオフをもつMicron３０フィルター（Amicon）を通して遠心分離することによって包入されなかった薬物からリポソームを分離することに基いている。包入レベル（％）を１−（[遊離薬物]／[合計薬物]）＊１００から計算する。
【００４１】
実施例５
下記の表３に示す結果は、薬物／脂質比の関数としての幾つかの脂質製剤における化合物（９）の包入および脂質組成物をまとめたものである。スクロース緩衝液をエタノール溶液で希釈すると、相対的に大きく（平均直径７００ｎｍ）、異種成分からなるが、可視の脂質または薬物沈澱を含まないリポソーム（多重ラメラ小胞、ＭＬＶ）が自発的に形成される。EXTRUDER（Lipex Biomembranes、バンクーバー、カナダ）を用いて、積み重ねたポリカーボネートフィルター（孔径８０ｎｍ）にＭＬＶを通す（５〜１０回）。この過程で、沈澱した薬物（＜２％）が除去され、小胞サイズが平均径１４０ｎｍ（±２０ｎｍ）に減少する。
【００４２】
表３：エタノール希釈によるリポソームへの化合物（９）の包入
【表３】
ＮＤは、測定されずを意味する。
【００４３】
実施例６
凍結乾燥の影響と小胞サイズ
下記の表４に示す結果は、凍結乾燥条件と得られる小胞サイズ、および薬物包入レベルの関係をまとめたものである。他に特記しない限り、小胞は、実施例４の記載にしたがって製造し、滅菌濾過し、２．５ｍｌのアリコートをバイアルに入れた。続いて、サンプルの温度が−５０℃になり、サンプル温度が棚温度まで低下するのに十分な時間、バイアルを凍結する。次いで、減圧（５０〜２００ｍトル）下に、１次水を除去するのに十分な時間（２４〜４８時間）、サンプルを指示された棚温度にさらし、続いて、周囲温度に２〜６時間さらす。
【００４４】
表４：化合物（９）のリポソームにおける異なる凍結乾燥サイクルの影響
【表４】
【００４５】
実施例７
包入レベルにおける薬物／脂質比の影響
下記の表５に示す結果は、包入レベルにおける初期薬物／脂質比の影響をまとめたものである。化合物（９）は、０．３３までの薬物／脂質比（重量／重量）においてＥＰＣ／ＥＰＧリポソーム内に効率よく包入することができる。
【００４６】
表５：薬物／脂質比の関数としてのＥＰＣ／ＥＰＧリポソームにおける化合物（９）の包入
【表５】
【００４７】
実施例８
小胞サイズ安定性
下記の表６に示すように、試験したすべてのバッチについて、包入のレベルは、２〜８℃で４８時間の貯蔵によって影響されなかった。
【００４８】
表６：エタノール含量の関数としての押し出しに続く小胞サイズの安定性
【表６】
【００４９】
実施例９
包入における凍結乾燥時間の効果
下記の表７に示す結果は、化合物（９）ＥＰＣ／ＥＰＧ性材の包入効率、粘度およびサイズにおける凍結乾燥条件の影響をまとめたものである。
【００５０】
表７：化合物（９）ＥＰＣ／ＥＰＧ性材の包入、小胞サイズおよび粘度における初期凍結乾燥サイクルの影響
【表７】
【００５１】
実施例１０
化学療法誘発好中球減少症のラットモデル
実施例４の記載にしたがって製剤された化合物（９）は、ラットにおいて化学療法誘発好中球減少症からの回復を促進した。雄性ＣＤラット（２５０〜３００ｇ）に、抗新生物薬フルオロウラシル（１２５ｍｇ／ｋｇ）または等量のそのビヒクル（生理的食塩水）のいずれかを腹膜内注射した。フルオロウラシル注射後１日目から開始して、各フルオロウラシル処置ラットに化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝５）またはビヒクル（生理的食塩水、ｎ＝４）のいずれかを１日８回静脈注射した。初めからフルオロウラシルではなくて生理的食塩水を注射されたラットには、食塩水を静脈注射した（ｎ＝７）。フルオロウラシル処置前および処置後１４日間１〜２日毎に、好中球レベルを測定するために採血した。化合物（９）のリポソーム製剤によるフルオロウラシル誘発好中球減少症からの回復の促進を図１に示す。
【００５２】
実施例１１
正常ラットにおける化合物（９）の効果
実施例４に記載した化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、i.v.）は、正常ラットにおける循環好中球レベルも増加させた（図Ｂ）。雄性ＣＤラット（２５０〜３００ｇ）に、化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝４）またはビヒクル（生理的食塩水、ｎ＝１１）のいずれかを１日５回静脈注射した。毎日、好中球レベルを測定するために採血した。正常ラットにおける化合物（９）の脂質製剤による循環好中球レベルの上昇を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】化合物（９）のリポソーム製剤によるフルオロウラシル誘発好中球減少症からの回復の促進を示すグラフである。
【図２】正常ラットにおける化合物（９）の脂質製剤による循環好中球レベルの上昇を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼと相互作用するグルタチオン類縁体の組成物、製剤および方法に関する。さらに本発明は、グルタチオン類縁体の脂質製剤およびその製造方法に関する。該脂質製剤は、経腸投与時における薬物不溶性という問題を克服し、その毒性作用を減少する。最後に、本発明は、骨髄または血液における造血の調節およびこのような組成物および製剤によって提供される他の有用な応答に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍および他の適応症の治療に用いられる化学療法剤の副作用は、よく知られている。これらの副作用には、好中球、血小板およびリンパ球などの種々の血液細胞の血中濃度の改変がある。これらの副作用の結果として、好中球減少症、血小板減少症および全身性免疫抑制が生じる。これらの副作用は、不愉快なだけでなく、ガン療法の効力を低下させ、患者を感染および制御不能な出血という重篤な危険に到らしめる。
現在、これらの作用に対する実際的改善は、少ししかない。代表的には、支持的介護、抗生物質の大量投与または成長因子の投与などがそのアプローチである。顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）などの成長因子および巨核球成長および発育因子（ＭＧＤＦ）トロンボポエチン（ＴＰＯ）といったようなさらに新しく発見された因子の投与は高価である。さらに、それらは、それ自体がよくない副作用をもっている。
化学療法の副作用を処理する現在のアプローチおよび別の方法での造血の抑制を処理することに関連する問題は、少なくとも部分的には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの種々のイソ酵素のインヒビターである単純なトリペプチド化合物の生物学的活性によって解決される。
【０００３】
多くの小さいペプチドベース化合物に関し、このような化合物の製剤は、それらの溶解性および効力において実質的な役割を演じる。脂質製剤[「薬物担体としてのリポソーム」、G.Gregoriadis編。JOHN Wiley and Sons、１９８８]および乳液または脂質マイクロスフィア[Cummings，J.らのExpert Opin.Ther.Pat.（１９８８）、８（２）、１５３；Takenaga，M.のAdv.Drug Delivery Rev.（１９９６）、２０（２，３）、２０９；Yamaguchi，T.のAdv.Drug Delivery Rev.（１９９６）、２０（２，３）、１１７；Mizushima，Y.のＥＰ０４３２６９７Ａ２；Kraft，M.のＷＯ９８・０５３０１]は、溶解性を増強し、薬物動態学的挙動を調節し、生体分布を変更し、酵素による崩壊から化合物を保護する適当な医薬的担体として用いることができる。化合物の親油性を増強することが、エマルジョンおよびリポソーム内に製剤化することを援助することがしばしばある。したがって、長い炭素鎖または他の親油性基を含むエステルを用いて、溶解性を最大化するための化合物を作成することができる。
【０００４】
リポソームは、閉じた水の区画を画定する完全に閉じた脂質二重層膜である。リポソームは、部分的にリン脂質から作られる微細なデリバリー小胞であり、水と混合したときに、閉じた液体充填球体を形成する。リポソームは、１つの脂質二重層膜からなる単ラメラまたは二重層以上の多重ラメラのいずれであってもよい。リポソームは、放出時間が延長されることによる投与薬物の制御放出を提供する能力および血流中の有効成分の遊離濃度を制限することによる薬物の副作用を減少する能力をもっている。またリポソームは、薬物の組織分配および取り込みを変更することができ、変更された組織分配は、該薬物の治療上の有効性を有意に増加する。
ＰＣＴ出願ＷＯ９６／４０２０５（１９９６年１２月１９日公開）、ＰＣＴ出願ＷＯ９５／０８５６３（１９９５年３月３０日公開）およびＰＣＴ／ＵＳ９４／１０７９７には、グルタチオンの類縁体であるトリペプチド化合物が開示されている。それらは、一般に、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性のインヒビターであり、このグループに含まれる種々の化合物はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼのイソ酵素に関して様々な特異性を示す。これらの特許に開示されたものは、１〜１０Ｃ単位の対称エステルであり、好ましい具体例としてジエチルエステルが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、造血の調節に有用であり、腫瘍の化学療法的治療に対する援助として有用な化合物を含む医薬組成物、該化合物それ自体を提供する。本発明は、式Ａ：
【化１２】
[式中、各エステルは１−２５Ｃ；
ＹＣＯはγ−ｇｌｕまたはβ−ａｓｐ；
Ｇ＊はフェニルグリシン；
ＺはＣＨ２、ＯまたはＳ；および
Ｘは６−８Ｃアルキル、ベンジルおよびナフチルからなるグループから選ばれる炭化水素ラジカル]
で示されるジエステル化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含む、先祖細胞からの造血の調節に使用するための脂質製剤およびそのような製剤の製造方法を提供する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、式Ｉ：
【化１３】
[式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、直線または分枝アルキル基（１−２５Ｃ）、シクロアルキル基（６−２５Ｃ）、置換アルキル基（２−２５Ｃ）、ヘテロシクロ（６−２０Ｃ）、エーテルまたはポリエーテル（３−２５Ｃ）から選ばれる、またはＲ１−Ｒ２が一緒になって（２−２０Ｃ）式Ｉで示されるマクロシクロを形成する；および
Ｘは６−８Ｃアルキル、ベンジルおよびナフチルからなるグループから選ばれる炭化水素ラジカル]
で示されるジエステル化合物またはその医薬的に許容しうる塩を含む、先祖細胞からの造血の調節に使用するための脂質製剤およびそのような製剤の製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の完成に先立って、Ｒ１またはＲ２の少なくとも１つが高級アルキル（少なくとも６Ｃ）基である高級アルキルエステルを製造することによって上記化合物のバイオアベイラビリティーを増加させる努力を行った。しかし、これは、より困難で高価なプロセスであることが判明した。続いて、本発明者らは、脂質製剤、特にリポソーム製剤を用いることによって、適当な標的化を介した化合物の取り込みを増強することができ、それによって、前述したような困難さや高級アルキルエステルの高価な製造にたよることなく、バイオアベイラビリティーを増加することができることを見出した。
【０００８】
本発明の脂質製剤または組成物は、リポソーム、脂質マイクロスフィアおよび脂質エマルジョンを含む。脂質マイクロスフィアは、本発明化合物を含有する脂質コアおよび／またはマトリックスからなる球状の粒子である。リポソームは、本発明化合物を含有する水性区画に境界をつけている脂質層からなるリン脂質小胞である。
式ＡまたはＩの化合物は、水溶液、特に高浸透性溶液において制限された溶解性をもつことがわかっている。脂質に配合されたこれらの化合物は、生物学的媒体に入れたときに、より高い溶解性をもつことが明らかである。これらの化合物はさらに、脂質マイクロスフィアに配合したときに、より大きいプロテアーゼ耐性をもち、血液中での半減期が長くなることがわかっている。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、医薬的に許容しうる油でコーティングされた式ＡまたはＩの化合物のコアを特徴とする小滴の脂質媒体の製造方法を提供する。したがって、本発明は、脂質ベース製剤の製造方法を提供する。
別の態様において、本発明は、式ＡまたはＩの化合物がリポソームに会合しているのが見出されるリン脂質ベースリポソームの調製方法を提供する。
別の態様において、本発明は、式ＡまたはＩの化合物を含有するリン脂質ベースリポソームの製造方法に関する。
別の態様において、本発明は、患者に処置された化学療法剤および放射線療法の破壊作用からの回復が促進される作用モードといったような該破壊作用に対する保護に用いるための、保護効果を発揮するのに有効な量の式ＡまたはＩの化合物を含む脂質製剤およびそのような製剤の製造方法に関する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、好中球、血小板およびリンパ球の生成を促進し、損傷を受けた骨髄を回復させ、骨髄を細胞障害性療法から保護し、化学療法、感染または血液学的疾患によって引き起こされた好中球減少症、血小板減少症、リンパ球減少症および貧血症に対する保護効果を発揮し、および骨髄移植の間に細胞集団を増加するための式ＡまたはＩの化合物、式ＡまたはＩの化合物を含む製剤および脂質製剤に関する。このような化合物は、上記式ＡまたはＩの化合物またはその対応するアミド、エステル／アミド、塩または遊離ジ酸である。好ましい具体例は、脂質製剤中に低級アルキルエステルを包入したものである。さらに本発明は、治療効果を増強する腫瘍特異的な化学または放射線敏感剤および全身性化学保護剤としての本発明化合物の使用に関する。本発明の別の態様は、貧血症、感染などの治療のための一般的免疫刺激剤に関する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、以下の作法によって製造される式ＡまたはＩの化合物を含有する脂質製剤に関する：（ｉ）薬物および脂質をアルコール／水からなる共溶媒に溶解し；（ii）混合物を緩衝液で迅速に希釈してリポソームを形成し；（iii）リポソーム調製物を１つまたは２つ以上の積み重ねフィルターを通して押し出して所定のサイズの単ラメラ小胞を生成し；次いで（iv）凍結乾燥する。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
多くの式ＡおよびＩの化合物は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼイソ酵素の少なくとも１つのイソ酵素サブクラスの活性を阻害するのに有用である。またこれらの化合物の組成物は、通常、造血を維持するのに必要な細胞の大部分を破壊する作用剤の存在下でさえも、骨髄における造血を調節する。さらに、これらの組成物は、骨髄および血液細胞において他の有用な効果を示す。
【００１３】
式ＡおよびＩの本発明化合物は、遊離酸、塩、モノエステル、ジエステル、モノアミド、ジアミドまたはエステル／アミド混成体として存在する。エステルまたはアミド体は一般に、アルキル（１−２５Ｃ）；アルケニル（１−２５Ｃ）；およびアリールアルキル（１−２５Ｃ）アルコールならびにアミンである。特に、ジエステルはいずれも、１Ｃ原子を有する第１エステル基および１Ｃ，２Ｃ，３Ｃ，４Ｃ，５Ｃ，６Ｃ，７Ｃ，８Ｃ，９Ｃ，１０Ｃ，１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｃ，１６Ｃ，１７Ｃ，１８Ｃ，１９Ｃ，２０Ｃ，２１Ｃ，２２Ｃ，２３Ｃ，２４Ｃまたは２５Ｃ原子を有する第２エステル基をもつ。同様に、それらは、前記の第２エステル基のいずれかと１Ｃ，２Ｃ，３Ｃ，４Ｃ，５Ｃ，６Ｃ，７Ｃ，８Ｃ，９Ｃ，１０Ｃ，１１Ｃ，１２Ｃ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｃ，１６Ｃ，１７Ｃ，１８Ｃ，１９Ｃ，２０Ｃ，２１Ｃ，２２Ｃ，２３Ｃ，２４Ｃまたは２５Ｃ原子をもつ第１エステル基の組合せであってもよい。このような基は、直鎖であるか、または十分な数の炭素原子をもつ場合、１つまたは２つ以上の分枝を含んでもよい。特に、少なくとも１つのエステル基は、いずれか１つの１０〜２５Ｃ原子をもつ。本発明に有用な代表的なエステルとして、ジオレイル、パルミチル／エチル、ラウリル／エチル、ジラウリル、ステアリル／エチルなどが挙げられる。Ｘがベンジルである式ＡまたはＩの化合物のパルミチル／エチル体が特に好ましい。同様に、モノアミドまたはモノエステルについて、エステルまたはアミド基は、上記の数のＣ原子のいずれかをもつ。ジアミドまたはエステル／アミド混成体の場合、２つのアミド基それぞれまたはアミドおよびエステル基は、ジエステルにおいて記載したＣ原子の組合せと同じである。置換基が正の医薬的効果（少なくともいずれか１つの本明細書に記載した効果）を示すのを妨げない場合、このような基および式ＡまたはＩの残りのものが、１つまたは２つ以上の置換基をもってもよいことが理解されるであろう。このような置換基として、１つまたは２つ以上（２または３など）のハロゲンまたはヒドロキシが挙げられる。
【００１４】
式ＡまたはＩの特定のジエステル（式Ｉのジエステルなど）は、対応するジエチルエステルよりも親油性が大きい。このことは、化合物が、リポソーム組成物に配合される場合に特に遊離である。対応する遊離のジ酸体よりもヒト細胞におけるクロラムブチル細胞障害性の効力が強化されたジエステル[参考文献である米国特許第５９５５４３２号の実施例１に記載されている]または対応する遊離のジ酸体よりも無血清培地に懸濁するＨＴ−２９（ヒト結腸腺癌）などのヒトガン細胞による取り込みが強化されたジエステル[上記特許の実施例１に記載されている]を選択してもよい。対応する遊離のジ酸体よりもマウスまたはラットの骨髄の強化された分化を提供するジエステル[上記特許の実施例９に記載されている]を選択してもよい。
【００１５】
本発明のトリペプチドが、１つまたは２つ以上のキラル中心をもつことは明らかである。上記事項は、これらのキラル中心の存在から得られるジアステレオマーに関係している。本発明の好ましいアミノ酸は、Ｌ配置である。
本発明組成物は、化学療法の佐剤や他の指示薬として有用な幾つかの特性をもっている。第１の特性として、骨髄の崩壊は化学療法の通例の副作用であるが、本発明化合物は、骨髄における造血を調節する。第２の特性として、本発明化合物は、通常、腫瘍細胞において特に広く行き渡っているπサブクラスなどの少なくとも１つのクラスのＧＳＴイソ酵素を阻害する。最後の特性として、式ＡまたはＩの本発明化合物は、腫瘍細胞の破壊において化学療法剤の効果を直接強化する。この品質の組合せにより、本発明化合物は、直接的造血強化剤ならびに化学療法プロトコルの悪作用の改善剤および標的細胞への毒性作用の強化剤の両方として有用になる。インビボ用製剤または無傷の細胞と接触して用いる製剤とする場合、式ＡまたはＩの本発明化合物は、エステルとして供給されるのが好ましく、ジエステルがさらに好ましい。
【００１６】
Remington's Pharmaceutical Sciences（マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ＰＡ）およびLiposome Technology、Vol.III、Targeted Drug Delivery and Biological Interaction（１９８４、ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド、ボカラトン、フロリダ） に記載されている標準的方法ならびに特定の製剤を用いて投与用製剤を調製する。特に有用な式ＡまたはＩの本発明化合物は、脂質組成物である。脂質組成物には、脂質エマルジョン（水性脂質エマルジョンなど）、リポソームおよび脂質マイクロスフィアがある。脂質組成物製剤は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、コレステロール、ホスファチジル酸、オレイン酸、カルジオリピン、スルファチド、ガングリオシド、脂肪酸、ペパーミント油、オリーブ油、大豆油、鉱物油、ピーナツ油、紅花油、トウモロコシ油、レシチンなどを含むことができる。脂質組成物製剤に配合できるその他の物質として、パルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、糖置換ＰＥ、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジロイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、スフィンゴミエリン、ジミリストイルレシチン（ＤＭＬ）、ジパルミトイルレシチン（ＤＰＬ）、ジステアロイルレシチン（ＤＳＬ）、ジラウロイルレシチン（ＤＬＬ）およびジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。
【００１７】
ひとつの好ましい組成物は、Ｒ１がパルミチル、Ｒ２がエチル、Ｘがベンジルである化合物Ｉの組成物であり、大豆油、卵黄レシチンおよびグリセロールの混合物に配合される。
本発明において、脂質は、５〜５０％（W/V）の大豆油などのグリセリドおよびグリセリド１００部当たり１〜５０部、好ましくは５〜３０部のホスホリピド（卵黄レシチンなど）からなるのが好ましい。１〜５０重量部、好ましくは１０〜４０重量部のグリセロールなどの等張剤を佐剤としてさらに含むことができる。脂質エマルジョンなどの脂質組成物中のグルタチオン類縁体の含量は、エマルジョンの形体および目的に応じて適当に調節し、通常、０．０２〜５ｍｇ／ｍｌのレベルである。
別の好ましい組成物は、Ｒ１およびＲ２がエチル、Ｘがベンジルである化合物Ｉの組成物であり、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）および卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の混合物に配合される。
【００１８】
脂質製剤は、脂質：式ＡまたはＩの化合物の比率が、３：１〜６：１である。卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の比率が３：１、２：２または１：３重量であり、式ＡまたはＩの化合物：スクロースの比率が１：７部である脂質製剤が好ましい。卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）：卵黄レシチンおよび卵ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）の比率が２：２重量であり、式ＡまたはＩの化合物：スクロースの比率が１：７部である脂質製剤が最も好ましい。さらに、ｐＨを調節するためにクエン酸緩衝液などの添加剤を加えてもよい。脂質製剤の正味電荷は、マイナスから中性である。脂質製剤の正味電荷がマイナスであるのが好ましい。脂質化合物／製剤の製造方法は、押し出し成形機を用い、次いで濾過して約５０〜２０００ｎｍの大きさの単ラメラ小胞を生成するのが好ましい。生成される単ラメラ小胞の大きさが約５０〜１０００ｎｍであるのがさらに好ましい。生成される単ラメラ小胞の大きさが約４００〜６００ｎｍであるのが最も好ましい。リポソームは凍結乾燥し、医薬的に許容しうる希釈剤で戻すことができる。
薬物のリポソーム内への包入の程度は、５０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましく、最終の凍結乾燥によって粘度および小胞の大きさが増加する（７５〜６００ｎｍ）。薬物のリポソーム内への包入の程度が約９５％であるのが最も好ましい。
【００１９】
（投与および使用）
「骨髄または末梢血液における造血を調節すること」は、コロニー形成または分化細胞の能力によって測定される血液細胞形成の速度を変えることを意味する。分化細胞として、好中球、血小板、赤血球、リンパ球、マクロファージ、顆粒球、顆粒球−マクロファージなどが挙げられる。本明細書で用いる「骨髄または末梢血液における造血を調節すること」は、非処理の骨髄の能力とは異なるレベルでコロニー形成または分化細胞の生成を示すように本発明組成物で処理した骨髄または末梢血液の能力を意味する。同様に、適当な先祖細胞を含む骨髄または末梢血液のフラクションもこの効果を示す。本明細書で用いる「末梢血液」は、特に臍帯血を含むことに留意すべきである。
【００２０】
一般に、骨髄または血液の造血において代表的に破壊的作用をもつ作用剤を用いる場合、本発明組成物は、保護効果を発揮する。「保護効果」は、骨髄またｈ血液が得る損傷が、該組成物を投与しない場合よりも少ないことを意味する。
本発明組成物の保護効果が有用である状況は多い。これらには、放射線照射が行われた結果よくない効果がもたらされた、あるいは将来的にもたらされることが予測される場合、患者が何らかの理由で免疫システムがそこなわれている場合、患者が腎臓に損傷がある場合および患者が化学療法を処置された場合が含まれる。さらに、本発明組成物は、移植手術の設定に用いて、ドナーの骨髄細胞の数を増加することができる；代表的には、この場合、該組成物をインビボまたはエクスビボ投与する。この設定においても、本発明組成物は、先祖細胞がドナーの末梢血液内へ移動するのを促進し、このドナーにおける末梢白血球の回復を改善する；同様に、本発明組成物は、レシピエントにおける末梢白血球の回復を改善することができる。一般に、本発明組成物をインビボまたはエクスビボで処理した後、該組成物は増加を改善し、移植細胞の最終的植付けを促進する。本発明組成物は、回復を促進するためにレシピエントに直接使用することができる。
【００２１】
本発明組成物は、インビトロまたはエクスビトロのいずれかで用いることができる。たとえば、これらの組成物を同種または異種移植前に用いて、骨髄中の造血細胞を増加あるいは調節することができる。相対的に未分化の細胞の増加が実現されるエクスビボ技術を用いる患者の処置を用いてもよい。本発明組成物は、インビボ投与用に製剤することもできる。
エクスビボ投与を採用する場合、骨髄または末梢血液（臍帯血を含む）のいずれか、または両方を直接本発明組成物に接触させることができるが、あるいはこれら材料のフラクションを該フラクションが適当な標的先祖細胞を含むまで処理してもよい。
【００２２】
化合物は、注射用、経口投与用または経粘膜もしくは経皮投与などの別の投与法用に製剤することができる。注射は、経静脈、腹膜内、筋肉内またはいずれかの他の慣例の経路で行うことができる。
製剤中の有効成分化合物（または化合物の混合物）の割合は、約０．５％ｗ／ｗ〜約９５％ｗ／ｗといったような広範囲で変化させることができる。有効成分の好ましい割合は、本質的に製剤の性質に応じて変化する。したがって、本発明の“医薬組成物”は、たとえば、本発明化合物のみを含むか、または化合物と他の成分（非毒性が好ましい）を含むことができる。有効成分の好ましい割合は、本質的に製剤の性質に応じて変化する。さらに、本発明組成物は、免疫刺激剤または成長因子などの他の有益な作用剤と混合してもよいし、共に用いてもよい。
【００２３】
必要な用量は、患者の素質、身体状態の性質、投与方法および担当医または担当獣医の診断に応じて変化する。適当な用量範囲は、これらのパラメーターに従って決定する。一般に、患者当たりの代表的な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で１０〜４０日間、さらに好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で１４〜２８日間である。これらの範囲は、例示に過ぎず、正確な用量最適化は、慣例の方法により決定することができる。
本発明組成物を化学療法に関する保護剤として用いる場合、投与のタイミングも関連してくる。しかし、タイミングは、使用する化学療法の性質によって変わる。採用した特定の化学療法剤に対する適当なタイミングを決定するのは、明らかに慣例の技術の範囲内である。
好ましくは少なくとも１つのエステル基のＣ原子数が多く、加水分解速度が小さく、動物やヒトの血漿中での半減期が長いジエステルを選択する（たとえば、Ｃ１６／Ｃ２ ｖｓ 対応するＣ２／Ｃ２ジエステル）。同様に、少なくとも１つのエステル基のＣ原子数が多く（Ｃ１６／Ｃ２ジエステルなど）、少ない数のエステル基Ｃ原子（Ｃ２／Ｃ２ジエステルなど）をもつ、対応するジエステルと比較して動物またはヒトの細胞の造血の強化された調節を示すジエステルを選択する。
【００２４】
後記実施例は、本発明をさらに詳しく説明する。特定の化合物については、前記米国特許第５９５５４３２号においてさらなる実施例が提供されるが、本明細書に記載した他の化合物も同様の方法で用いることができる。実施例は、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明化合物をどのように製造し、使用するかを示すために提供するものである。後記実施例において温度はすべて℃であり、ＲＴは室温を示す。グルタチオン類縁体は、米国特許第５７８６３３６号に記載されているような当業界で公知の代表的な有機合成手順によって製造することができる。幾つかの場合において、保護基を導入するが、最終的には除去する。アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基のための適当な保護基は、“Protective Groups in Organic Synthesis”、第２版、ジョン・ウイリーアンド・サンズ、ニューヨーク（１９９１年）に記載されている。カルボン酸の活性化は、“Comprehensive Organic Transformations”、ＶＣＨパブリッシャーズ、ニューヨーク（１９８９年）に記載されている多数の異なる試薬を用いて達成することができる。
【００２５】
脂質エマルジョンおよびリポソームの製造は、当業界で公知の技術で成し遂げることができる。ここでは、グリセリドとして用いた大豆油を、高純度大豆油として精製する（トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドとして少なくとも９９．９％の純度）。通常の有機溶媒を用いる分離法によって製造される卵黄レシチンまたは大豆レシチンをリン脂質として精製する。一般に、予定量の大豆油、脂質、グルタチオン類縁体および前記の他の添加剤を混合し、加熱して溶液にし、通常のホモジナイザー（圧力ジェット型ホモジナイザーまたは超音波ホモジナイザー）を用いて２５〜９０℃の温度にて均質化処理し、油中水型分散液を得る。次いで、必要な量の水を加え、前記ホモジナイザーを用いて混合物を再度均質化し、水中油型エマルジョンにして本発明のエマルジョンを調製する。生成物に便利さを与えるために、エマルジョン形成後に、安定剤または等張化剤などの添加剤を加えることもできる。
【００２６】
当業界で公知であり、“Liposome Technology, Volume III, Targeted Drug Delivery and Biological Interaction”（１９８４、ＣＲＣプレス・インコーポレイテッド、ボカラトン、フロリダ）に記載されている方法にしたがって、リポソームを調製する。脂質およびアルコール／水中のＡまたはＩの化合物を溶解し、混合物を適当な緩衝液で迅速に希釈し、少なくとも１つのフィルターを通して生成物を押し出し、次いで濾液を凍結乾燥することによって、リポソームを製造することもできる。
【実施例】
【００２７】
実施例１
グルタチオン類縁体の調製
【化１】
上記反応工程式には中間体（７）（Ｎ−ａ−ｔ−Ｂｏｃ−ａ−エチル−ｇ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）システインスクシンイミドエステル）は示されていない。
【００２８】
ジ−ｔ−ブチルジカルボン酸を用いて、塩基性条件下、Ｌ−グルタミン酸（１）を保護する。次いで、化合物（２）を環化し、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸およびパラホルムアルデヒドの反応を介してオキサゾリジノン（３）を得る。オキサゾリジノンおよびＲ'ＯＮａの反応によって化合物（４）を製造する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとｇ遊離酸（４）とのＤＣＣカップリングによりスクシンイミドエステル（５）を製造し、次いで、Ｓ−ベンジル−Ｌ−システインを反応させて保護ジペプチド（６）を形成する。ＤＣＣカップリングによりスクシンイミドエステルを製造し、フェニルグリシンと反応させて、保護トリペプチド（８）を得る。脱保護およびエステル化して最終生成物（９）を得る。
【００２９】
実施例２
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸（２）
５００ｇのＬ−グルタミン酸（６．８モル）２部を４Ｌの１０％ＴＨＦ水溶液にそれぞれ懸濁する。Ｎａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にすると透明な溶液が得られる。各溶液を４０℃まで加熱し（最初の１０時間Ｂｏｃ無水物を添加）、次いで、１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチル（４．５８モル）を、Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨを９に維持しながら、３０分毎に各フラスコに５０ｇずつ固体で加える。反応物を室温で一夜攪拌する。翌日、さらに１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを上記のように加える。３日目の朝、各溶液を２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する（１当量のＢｏｃ無水物の添加後、ブタノールの形成が反応を止め、ＥｔＯＡｃ抽出物それを除去し、収量を有意に増加することがわかる）。水層を集め、１ｋｇのジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを再度上記のように加える（４０℃加熱および５００ｇ／日、５０ｇずつ、各フラスコに２日間にわたって）。全反応時間は４日間であり、４ｋｇ（１８．３２モル）のジカルボン酸ジ−ｔ−ブチルを加える。長い反応時間および加熱によって良好な収量が得られる。次いで、反応混合物を各２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する。各水層を集め、氷浴で０℃に冷却し、濃ＨＣｌを３０分間にわたって滴下して（１滴／秒）ｐＨ３まで酸性化する（ＢｏｃＧｌｕはこの酸性化ステップに敏感であることがわかる。もしｐＨが低くなりすぎるか、またはＨＣｌを速く加えすぎるならば、いくらかの脱保護が起こり、大量のグルタミン酸が溶液から沈澱する）。酸性化が成功すると、オフホワイトのゲルが形成されるが、これはＮａＣｌを溶液の飽和点のわずかに手前まで多量に添加することによって強化される。得られる溶液を各２ＬのＥｔＯＡｃで２回抽出する。水層からのＢｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕの除去をＴＬＣでモニターする。ＥｔＯＡｃ層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、３５℃にて回転蒸発器に節、透明な黄色がかった油状物を得る。これを一夜減圧乾燥して、１０９７．１ｇのＢｏｃＧｌｕ（４．４４モル）を得る；収率６５％。
【００３０】
（Ｓ）−ｔ−ブチルオキシカルボニル−５−オキソ−４−オキサゾリジンプロピオン酸（３）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（２）(１０７７ｇ、４．３６モル）をＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）に暖めながら溶解する。これを５Ｌの三つ首フラスコに入れる。この溶液にパラホルムアルデヒド(１９６ｇ、６．５４モル）およびｐ−トルエンスルホン酸(４０ｇ、０．２６モル）を加える。丸底フラスコに２つのディーン−スターク装置、−１０℃におけるデュアルコンデンサーおよびメカニカルスターラーを取り付け、反応混合物を７０℃にし、６時間還流する（反応完了時、ディーン−スターク装置から水(１００ｍｌ）が集められた）。反応混合物（透明な赤褐色の溶液）を室温まで冷却し、回転蒸発器にて赤褐色の油状物を得る。油状物を２Ｌのエーテルに再溶解し、１Ｌの水で３回抽出する。水層を合せ、２Ｌのエーテルで抽出して水中の生成物を移す。両方のエーテル層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、回転蒸発器にて透明な黄色油状物を得る。これを減圧乾燥して不純物の混在する化合物（３）(９５２ｇ、３．６７モル、収率８４．３％）を得る。
３０ｃｍの伸長部を備えた３Ｌの目の粗い焼結ガラスロートを用いて化合物（３）を精製する。４０μｍフラッシュクロマトグラフィー用ベイカーシリカゲル２ｋｇを４ＬのＣＨ２Ｃｌ２でスラリー化し、カラムに注ぎ入れる。樹脂床に達するまで溶媒を流す。さらに２ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、シリカゲルを落ち着かせるために樹脂床まで流す。この時点で、緩やかに加熱してＣＨ２Ｃｌ２(７５０ｍｌ）に溶解した化合物をカラムに入れ、溶媒を流す。溶媒が樹脂床に達した時点で、さらに１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、生成物のローディングが完了するまで流す。次いで、２０ＬのＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、４００ｍｌの画分を集める。蒸発して油状物にし、減圧乾燥して白っぽい黄色の泡状物を得る(７４５．７ｇ、２．８８モル、収率６６．２％）。
【００３１】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル（４）
トルエン(５００ｍｌ）を入れた容器にナトリウム棒(１５０ｇ、６．５モル）を入れ、表面の曇りをこすり落とし、薄い四角片を切り出す。四角片５０ｇを秤量して、トルエン１００ｍｌを入れた風袋控除した容器に入れ、トルエンを排出し、Ｎ２気流下、０℃にて３Ｌのエタノールにナトリウムを加える。泡立ちがおさまった後、さらに５０ｇの上記ナトリウムを加える。全部で２００ｇを加えるまでこれを繰り返す。次いで、Ｎ２気流下、室温にて該溶液を一夜攪拌すると粘稠な透明溶液が得られる。化合物（３）(７４５．７ｇ、２．８８モル）を３Ｌのエタノールに暖めながら加え、メカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコに入れる。Ｎ２気流下、この溶液に、平衡滴下ロートを用いてＮａＯＥｔを滴下する（１滴／秒）。反応物を一夜攪拌すると大量の白色沈澱を含む黄色がかった白色の溶液が得られる。氷浴にて反応混合物を０℃に冷却し、濃ＨＣｌを滴下（１滴／秒）してｐＨ９にする（反応後のｐＨは１３である）。６Ｌの水を加え、透明な溶液を得る。これをエーテル：石油エーテル（１：１）混合物各３Ｌで２回抽出する。水層を合わせ、氷浴にて０℃に冷却し、攪拌しながらＨＣｌを滴下して（１滴／秒）、ｐＨ３にする。酸性化した溶液を各３Ｌのエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、乾燥(Ｎａ２ＳＯ４）し、濾過し、蒸発して透明な黄色油状物を得る。これを高減圧乾燥して、６０９ｇ（２．１１モル、収率７３．５％）を得る。
【００３２】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル・γ−スクシンイミドエステル（５）
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸α−エチルエステル（４）(６０９ｇ、２．１１モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(２８０．４ｇ、２．４３、モル）をメカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内で３ＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解する。ＣＨ２Ｃｌ２(５００ｍｌ）にＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(５４７．１ｇ、２．６５モル）を溶解し、Ｎ２気流下、攪拌しながら滴下する。さらに５０ｇ（０．２４モル）のＤＣＣをＣＨ２Ｃｌ２(１００ｍｌ）に溶解し、反応混合物に滴下し、一夜攪拌する。ＴＬＣにより、反応の完了がわかる。ＤＣＣ尿素を反応物から濾去し、濾液を回転蒸発器で処理して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る；粗化合物（５）(１０４２．７ｇ、２．８１モル）が得られる。
化合物（３）の精製に用いたオープンカラムを用いて化合物（５）を精製する。４０μｍフラッシュクロマトグラフィー用ベイカーシリカゲル２ｋｇを４ＬのＣＨ２Ｃｌ２でスラリー化し、カラムに注ぎ入れる。これを樹脂床に達するまで溶媒を流す。さらに２ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、シリカゲルをパックするために樹脂床まで流す。溶媒レベルが樹脂床の頂部に到達した時点で、緩やかに加熱してＣＨ２Ｃｌ２(７５０ｍｌ）に溶解した化合物をカラムに入れ、重力でローディングする。溶媒が樹脂床に達した時点で、１ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加え、生成物のローディングが完了するように流す。生成物を２０ＬのＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、４００ｍｌのアリコートを集める。画分を蒸発して油状物にし、高減圧乾燥して泡状物を得る(８５３ｇ、２．２８モル、収率１０８．０％）（サプリメント＃５の純度を記載）。
【００３３】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−γ−グルタミル−Ｓ（ベンジル）−Ｌ−システイン（６）
Ｓ（ベンジル）−Ｌ−システイン(４６５ｇ、２．２モル）を４Ｌの２０％ＴＨＦ水溶液でスラリー化する。磁気攪拌しながら溶液にＮａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にする。これは、部分的に溶解したスラリーになる。緩やかに加熱しながら化合物（５）(８５３ｇ、２．２８モル）を１．５ＬのＴＨＦに溶解する。これを、該攪拌溶液にＮａ２ＣＯ３にてｐＨ９を維持しながら滴下する（２滴／秒）。反応混合物を各２Ｌのエーテル：石油エーテル（１：１）で２回抽出する。大量のＴＨＦのために水相に生成物が残留していることを確かめるためにＴＬＣをチェックする。水相を分離し、氷浴で０℃に冷却する。溶液を磁気攪拌しながらｐＨが３になるまで濃ＨＣｌを滴下する。次いで、生成した油状沈澱を２Ｌ部のエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、Ｎａ２ＳＯ４に注ぎ、濾過し、蒸発して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る(８９５．８ｇ、１．９１モル、収率９０．４％）。
【００３４】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システインスクシンイミドエステル（７）
化合物（６）(８９５ｇ、１．９１モル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド(２４０．６ｇ、２．０９モル）をメカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内で３ＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解する。ＣＨ２Ｃｌ２(５００ｍｌ）にＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド(４７２．５ｇ、２．２９モル）を溶解し、Ｎ２気流下、攪拌しながら滴下する（２滴／秒）。５時間後、ＴＬＣは出発物質の実質的量を示す。さらに５０ｇ（０．２４モル）のＤＣＣをＣＨ２Ｃｌ２(５０ｍｌ）に溶解し、反応混合物に滴下し、一夜攪拌する。ＴＬＣは反応の完了を示す。ＤＣＣ尿素を反応混合物から濾去し、濾液を蒸発して１Ｌにする。もやもやとしたものが生じるまでエーテルを加え、溶液を氷浴で０℃に冷却する。スクラッチすると結晶の形成が始まる。もやもやを維持するために少量のエーテル加え、生成物を押し出す。溶液を４℃にて一夜貯蔵する。濾過により結晶を集め、高減圧乾燥して、生成物を得る（９５３ｇ、１．６７モル、収率８７．４％）。
【００３５】
Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−α−エチル−Ｌ−γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ−フェニルグリシン（８）
（Ｒ）−（−）−フェニルグリシン(２５３ｇ、１．６７モル）を４Ｌの２０％ＴＨＦ水溶液でスラリー化する。磁気攪拌しながら溶液にＮａ２ＣＯ３粉末を加えてｐＨ９にすると、部分的に溶解したスラリーになる。緩やかに加熱しながら化合物（７）(９５３ｇ、１．６７モル）を１．５ＬのＴＨＦに溶解する。これを、該攪拌溶液にＮａ２ＣＯ３にてｐＨ９を維持しながら滴下する（２滴／秒）。反応物を６時間攪拌すると透明な黄色がかったオレンジ色溶液が得られる。反応混合物を各２Ｌのエーテル：石油エーテル（１：１）で２回抽出する。大量のＴＨＦのために水相に生成物が残留していることを確かめるためにＴＬＣをチェックする。水相を分離し、氷浴で０℃に冷却する。溶液を磁気攪拌しながらｐＨが３になるまで濃ＨＣｌを滴下する（１滴／秒）。次いで、生成物を各２Ｌのエーテルで２回抽出する。エーテル層を合せ、Ｎａ２ＳＯ４に注ぎ、濾過し、蒸発して油状物を得、高減圧乾燥して、泡状物を得る(８５３ｇ、１．４５モル、収率８６．８％）。
【００３６】
γ−グルタミル−Ｌ−Ｓ（ベンジル）システイニル−Ｒ−フェニルグリシンジエチルエステルヒドロクロリド（９）
化合物（８）(７６７．５ｇ、１．２６モル）を２つに分け、メカニカルスターラーを備えた５Ｌの三つ首丸底フラスコ内でそれぞれを２．４Ｌのエタノールに溶解する各溶液を氷浴上に置き、アルゴン下、攪拌しながら０℃に冷却する。温度を０℃に維持しながら、各溶液に（ＣＨ３）３ＳｉＣｌ（３８５ｍｌ、６．３２モル）を滴下する（１滴／秒）。（ＣＨ３）３ＳｉＣｌを加えた後（２．５時間後）、反応物から氷浴を取り外し、室温まで暖める。反応物を一夜攪拌する。１８時間後、反応混合物は、白色固体の塊になる。次いで固体を壊してスラリーにし、それぞれを３０℃の回転蒸発器にて体積２Ｌにする。メカニカルスターラーで激しく攪拌しながら、室温にて２．５時間にわたって各スラリーに無水エーテル（２Ｌ）を滴下する（１滴／秒）。不溶物質を濾過して集める。濾過ケーキを一夜高減圧乾燥して、合計３１２．８ｇの化合物（９）を得る。これ（３１２．８ｇ）を７Ｌの熱いＣＨ３ＣＮ（７９℃）に攪拌しながら溶解し、熱いまま濾過して不溶物を除去し、濾液を室温まで冷却する。溶液が冷えると、小さい白色針状結晶が形成され始め、室温になったとき、固化して固体塊になる。これを粉砕し、濾過して固体を集める。濾過ケーキをＮａＯＨペレット上で１６時間高減圧乾燥する。乾燥した物質は、２７７．０ｇ（０．４９モル）であり、３８．８％の収率が得られる。化合物（１０）、（１１）および（１３）が同様の方法で得られる。濃ＨＣｌで切断することによりｔ−Ｂｏｃを除去すると化合物（８）から化合物（１２）が得られる。
【００３７】
表１：化合物（９）−（１３）における置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の説明
【表１】
【００３８】
実施例３
脂質マイクロスフィアの製造
化合物（９）(３０ｍｇ）、精製大豆油(１０ｇ）および精製卵黄レシチン(１．８ｇ）を合せ、ホモジナイザーを用いて混合物を加熱して溶かす。次いで、グリセロール（２．２１ｇ）および体積を１００ｍｌにするのに十分な蒸留水（約９０ｍｌ）を加え、次いで、ホモジナイザーを用いて、大まかに乳化する。次いで、マントンゴウリン型ホモジナイザーを用いて生成物をさらに乳化する。次いで、溶液を１．２μｍのフィルターに通して、約２２０ｎｍの粒子の最終エマルジョンを３００μｇ／ｍｌで得る。同様の方法で、化合物（１０）〜（１２）を含む脂質マイクロスフィアを製造する。
【００３９】
表２：脂質マイクロスフィアの測定された特徴
【表２】
上記表２に記載したＫ１の減少は、本発明のグルタチオン類縁体の強化されたバイオアベイラビリティの指標である。もちろん、上記本発明への変更および修飾は可能である。したがって、本発明は上記詳細に記載した具体例に限定されるものでばない。
【００４０】
実施例４
リポソーム製造方法
他に特記しない限り、以下の一般的手順を用いて、脂質製剤を製造する：(ｉ)化合物（９）(１５７３ｍｇ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）および卵ホスファジチルグリセロール（ＥＰＧ）を無水エタノール(１４．３ｍｌ）およびＨ２Ｏ(２．２ｍｌ）に周囲温度で攪拌することによって溶解し；(ii)溶液を２０ゲージの針を用いて３０ｍｌ容の注射器に吸い上げ、攪拌している３７０ｍＭスクロース８０．９ｍｌに直ちに（１分以内）注入して多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）を形成し；(iii)１Ｍクエン酸塩（ｐＨ４．０）２．５ｍｌを攪拌緩衝液に加え；(iv)１００ｍｌ EXTRUDER（Lipex Biomembranes、バンクーバー、カナダ）を用い、２つの積み重ねた８０ｎｍポリカーボネートフィルターを通して溶液を１０回押し出して単ラメラ小胞を形成し；(v)０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌し；次いで(vi)凍結乾燥して水およびエタノールを除去する。凍結乾燥サイクルは、サンプル温度を−５０℃にする急速凍結、１次水を除去するために−３５℃のトレーに４２時間置く凍結乾燥、および２次水を除去するために２０℃で２時間置くことからなる。
Nicomp Particle Sizer（モデル２７０）を用いて、サンプルに準弾性光散乱分析（Quasi Elastic Light Scattering：ＱＥＬＳ）を行って、平均小胞径を決定する。小胞の薬物包含レベル（包入パーセント）を２つの別のアプローチを用いて決定する。第１のアプローチでは、製剤０．１ｍｌを水和セファデックスＧ−５０を入れた１．０ｍｌツベルクリン注射器に吸い込み；卓上遠心分離機にてサンプルを２０００rpmで５分間遠心分離し、次いで空の小胞を回収する（＞７０％）。包入されなかったかまたは沈澱した薬物をこの過程で除去し、残りをゲル濾過カラムに入れる。カラムクロマトグラフィー前後の薬物／脂質比から包入レベル（％）を計算する。第２のアプローチは、３００００ダルトンの分子量カットオフをもつMicron３０フィルター（Amicon）を通して遠心分離することによって包入されなかった薬物からリポソームを分離することに基いている。包入レベル（％）を１−（[遊離薬物]／[合計薬物]）＊１００から計算する。
【００４１】
実施例５
下記の表３に示す結果は、薬物／脂質比の関数としての幾つかの脂質製剤における化合物（９）の包入および脂質組成物をまとめたものである。スクロース緩衝液をエタノール溶液で希釈すると、相対的に大きく（平均直径７００ｎｍ）、異種成分からなるが、可視の脂質または薬物沈澱を含まないリポソーム（多重ラメラ小胞、ＭＬＶ）が自発的に形成される。EXTRUDER（Lipex Biomembranes、バンクーバー、カナダ）を用いて、積み重ねたポリカーボネートフィルター（孔径８０ｎｍ）にＭＬＶを通す（５〜１０回）。この過程で、沈澱した薬物（＜２％）が除去され、小胞サイズが平均径１４０ｎｍ（±２０ｎｍ）に減少する。
【００４２】
表３：エタノール希釈によるリポソームへの化合物（９）の包入
【表３】
ＮＤは、測定されずを意味する。
【００４３】
実施例６
凍結乾燥の影響と小胞サイズ
下記の表４に示す結果は、凍結乾燥条件と得られる小胞サイズ、および薬物包入レベルの関係をまとめたものである。他に特記しない限り、小胞は、実施例４の記載にしたがって製造し、滅菌濾過し、２．５ｍｌのアリコートをバイアルに入れた。続いて、サンプルの温度が−５０℃になり、サンプル温度が棚温度まで低下するのに十分な時間、バイアルを凍結する。次いで、減圧（５０〜２００ｍトル）下に、１次水を除去するのに十分な時間（２４〜４８時間）、サンプルを指示された棚温度にさらし、続いて、周囲温度に２〜６時間さらす。
【００４４】
表４：化合物（９）のリポソームにおける異なる凍結乾燥サイクルの影響
【表４】
【００４５】
実施例７
包入レベルにおける薬物／脂質比の影響
下記の表５に示す結果は、包入レベルにおける初期薬物／脂質比の影響をまとめたものである。化合物（９）は、０．３３までの薬物／脂質比（重量／重量）においてＥＰＣ／ＥＰＧリポソーム内に効率よく包入することができる。
【００４６】
表５：薬物／脂質比の関数としてのＥＰＣ／ＥＰＧリポソームにおける化合物（９）の包入
【表５】
【００４７】
実施例８
小胞サイズ安定性
下記の表６に示すように、試験したすべてのバッチについて、包入のレベルは、２〜８℃で４８時間の貯蔵によって影響されなかった。
【００４８】
表６：エタノール含量の関数としての押し出しに続く小胞サイズの安定性
【表６】
【００４９】
実施例９
包入における凍結乾燥時間の効果
下記の表７に示す結果は、化合物（９）ＥＰＣ／ＥＰＧ性材の包入効率、粘度およびサイズにおける凍結乾燥条件の影響をまとめたものである。
【００５０】
表７：化合物（９）ＥＰＣ／ＥＰＧ性材の包入、小胞サイズおよび粘度における初期凍結乾燥サイクルの影響
【表７】
【００５１】
実施例１０
化学療法誘発好中球減少症のラットモデル
実施例４の記載にしたがって製剤された化合物（９）は、ラットにおいて化学療法誘発好中球減少症からの回復を促進した。雄性ＣＤラット（２５０〜３００ｇ）に、抗新生物薬フルオロウラシル（１２５ｍｇ／ｋｇ）または等量のそのビヒクル（生理的食塩水）のいずれかを腹膜内注射した。フルオロウラシル注射後１日目から開始して、各フルオロウラシル処置ラットに化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝５）またはビヒクル（生理的食塩水、ｎ＝４）のいずれかを１日８回静脈注射した。初めからフルオロウラシルではなくて生理的食塩水を注射されたラットには、食塩水を静脈注射した（ｎ＝７）。フルオロウラシル処置前および処置後１４日間１〜２日毎に、好中球レベルを測定するために採血した。化合物（９）のリポソーム製剤によるフルオロウラシル誘発好中球減少症からの回復の促進を図１に示す。
【００５２】
実施例１１
正常ラットにおける化合物（９）の効果
実施例４に記載した化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、i.v.）は、正常ラットにおける循環好中球レベルも増加させた（図Ｂ）。雄性ＣＤラット（２５０〜３００ｇ）に、化合物（９）（３５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝９）、Ｇ−ＣＳＦ（１０μｇ／ｋｇ、ｎ＝４）またはビヒクル（生理的食塩水、ｎ＝１１）のいずれかを１日５回静脈注射した。毎日、好中球レベルを測定するために採血した。正常ラットにおける化合物（９）の脂質製剤による循環好中球レベルの上昇を図２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】化合物（９）のリポソーム製剤によるフルオロウラシル誘発好中球減少症からの回復の促進を示すグラフである。
【図２】正常ラットにおける化合物（９）の脂質製剤による循環好中球レベルの上昇を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されたいずれかの発明。
【請求項１】
本願明細書に記載されたいずれかの発明。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−３２６８７７（Ｐ２００７−３２６８７７Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２９７９８（Ｐ２００７−２２９７９８）
【出願日】平成１９年９月５日（２００７．９．５）
【分割の表示】特願２０００−５９５６７０（Ｐ２０００−５９５６７０）の分割
【原出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（５９３１８２９５６）テリック，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月５日（２００７．９．５）
【分割の表示】特願２０００−５９５６７０（Ｐ２０００−５９５６７０）の分割
【原出願日】平成１２年１月２７日（２０００．１．２７）
【出願人】（５９３１８２９５６）テリック，インコーポレイテッド (18)
【Ｆターム（参考）】
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