ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物
【課題】本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物に関するものである。
【解決手段】本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝機能指標である、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていることが分かる。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れている。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優れている。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優れていることが分かる。
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用できる。
【解決手段】本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝機能指標である、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていることが分かる。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れている。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優れている。
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優れていることが分かる。
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
代表的な成人病のひとつの肝疾患は、ストレス性慢性疲労及び大部分の外因性物質によって、肝が損傷されることにより発病される疾患である。現在、韓国での肝疾患の発生率は、外国に比べて相当に高い方で、最近の肝臓癌による死亡率は世界１位で、慢性肝疾患の場合もその死亡率が３番目であるという調査結果である。最近の統計庁報告によると、韓国の４０代の場合、肝疾患が一番高い死亡原因であると発表された。国内の肝疾患の中で一番高い死亡率を示すのがウイルス性肝炎であるが、西欧ではウイルス性肝炎よりは肝硬変による死亡が５〜１０倍程度高く報告されている。
【０００３】
肝臓は、人間の身体臓器の中で生体内代謝が最も活発に起きる臓器であり、脂肪成分が含まれた食べ物またはアルコールの過多摂取、ウイルスの感染、各種薬品のような有害物質、栄養不足等、多様な原因によって急性または慢性の障害が起き、脂肪肝、肝炎、黄疸、肝硬変、肝臓癌等が惹起され得る。特に、食べ物を通じた過多な脂肪摂取または過度なアルコール摂取は、肝組織に脂質が蓄積する脂肪肝を誘発し、この時血清の中のＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、γ−ＧＴＰ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）等が増加するようになる。肝臓は、緩衝能力が大きい器官であり疾患の初期段階ではあまり症状を示さず、かなり悪くなった後になってはじめて疾患の症状を示すようになる。
【０００４】
また、肝臓は、人体で血液の貯蔵及び循環、血流量調節と防御解毒作用をして精神的活動と密接に関連していると知られている。産業化による公害物質、有毒物質に対して私たちの体はいつも露出していて、私たちの肝臓は絶え間なく解毒作用の負担を負っている。さらに、深刻なことは精神的なストレスによる肝損傷である。精神的休息を取れば、損傷した肝細胞は復旧されるが、切迫した現代社会では精神的休息の余裕を持つことができないため精神的ストレス、飲み過ぎ、喫煙によって肝損傷を加重させ、人体が防御解毒作用をできずに免疫体系に異常を来たして他の疾病の原因になったりする。
【０００５】
肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）は、肝組織が繊維化して起きる。結合組織の生成と分解過程恒常性が喪失した状態で、肝組織内に結合組織が過度に蓄積して壊死や炎症が伴う。特に筋繊維芽細胞形態に転移した肝放射状細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ：ＨＳＣｓ）が増殖、移動して過度な結合組織を生成することにより、このような、肝の繊維化過程を進行させると知られている（非特許文献１）。肝硬変は、各種肝疾患が慢性的に進行する場合に共通的に至る最後の段階で、肝血流量低下、肝内血流の短縮、代謝酵素の機能低下、血中タンパク質の質的・量的変化及び胆汁流量の変化等、全般的な肝機能が低下する。
【０００６】
肝毒性を起こす誘発物質としては、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＣＣｌ４）、Ｄ−ガラクトースアミン、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）、ブロモベンゼン等があるが、四塩化炭素は、肝細胞の過酸化脂質反応を起こして肝毒性を示すと知られている（非特許文献２〜４）。肝毒性を起こす四塩化炭素は、肝毒性保護作用を検定するために肝細胞培養、肝組織培養及びマウスやラットに直接投与して人為的に肝毒性を起こさせる物質である。四塩化炭素は、複合的な機能をするチトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０のような代謝酵素によって、小胞体内で非常に反応性が強いフリーラジカルであるＣＣｌ３・の分子構造に転換しながら強い肝毒性効果を示す。フリーラジカルであるＣＣｌ３・は、アルコールによって蓄積された肝中性脂肪や膜リン脂質にある脂肪酸の酸化を誘発させて脂質の酸敗が始まって酸素と結合した後、過酸化脂質反応を通じて有機過酸化物を形成する。過酸化脂質反応を通じて肝に脂肪が蓄積してタンパク質合成能力が減少し、グリコーゲンが分解されて血管内の細胞質酵素が破壊されて肝組織の壊死が起きるようになる（非特許文献５）。このようなフリーラジカルは、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に損傷を与えて細胞からタンパク質放出に悪影響を与えることにより、肝だけでなく腎臓にも損傷を与えることが知られている。
【０００７】
また、脂質過酸化を抑制または防止することができる機能である抗酸化効果は、肝保護効果及び抗炎症作用があると報告されていて、抗酸化物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、反応性酸素中間生成物（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）による攻撃に対抗し、肝と肝細胞保護の目的に使用されている。
【０００８】
天然物から抽出されたフラボノイド、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）またはビタミンＥのような抗酸化剤は、脂質過酸化と肝繊維化に効果がある物質として報告されていて、Ｎ−アセチルシステイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ；ＮＡＣ）は、抗酸化活性を通じて肝繊維化の初期段階で肝繊維化と酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）を阻害すると知られている。また、胡黄連（ｋｕｔｋｉｎ）は、脂質過酸化とフリーラジカルによる損傷を減少させて肝保護、抗繊維化効果だけでなく、肝保護効果を助ける抗酸化効果がある天然物として報告されている。
【０００９】
現在一般的に利用されている肝疾患の治療方法は、大きく分けて食餌療法と薬剤療法に分けられ、大部分の場合にこの二つの方法を併用している。肝疾患に対する薬剤療法としては、肝疾患の発病原因及び種類によって多様な作用機序を有する薬剤を利用されることができる。例えば、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；非特許文献６）、ＤＤＢ（ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；非特許文献７）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、グリシリジン（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ）等のような肝細胞再生促進剤及び肝機能補助剤、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）のような抗ウイルス剤、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ、６−ＭＰ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）等のような免疫抑制剤等の薬剤が一般的に使われている。しかし、肝疾患は一つの原因によってだけ発生するのではなく、多くの要因の複合的な作用によって発病するので、一つの作用機序を持つ薬剤だけでは総の肝疾患に対して十分に満足できる高い治療効果を期待することはできない。また、現在使用されている公知の肝疾患治療薬は、急激な作用が発生したり、大量または長期間投与時には副作用が現われたりする短所がある。
【００１０】
一方、腎臓は、体内の水（体液）の量とイオン濃度を適切に調節して、老廃物（要素、尿酸、クレアチニン等）を小便として排出して、毒性物質や薬物、そして代謝産物は毒を無くした後、排泄する作用をする。組織で脂質過酸化の分解産物であるマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｅｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＭＤＡ）と４−ヒドロキシノネナール（４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ；ＨＮＥ）は、細胞損傷の指標として知られていて、脂質過酸化物を触媒するスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）は、細胞損傷を回復させるのに関与すると報告されている（非特許文献８〜１０）。アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）と血液尿素窒素（ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＢＵＮ）は、腎臓機能代謝の診断指標として臨床で使用されている。特に、ＢＵＮ数値の増加は高窒素血症（ａｚｏｔｅｍｉａ）による糸球体ろ過率（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ；ＧＦＲ）の減少として現われる。参考に、腎前性（ｐｒｅｒｅｎａｌ）高窒素血症は、鬱血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、ショック、血液量減少（ｈｙｐｏｖｏｌｅｍｉａ）及び出血等、腎臓に低潅流状態によって腎臓の損傷なしに機能低下が招来されることであり、腎後性（ｐｏｓｔｒｅｎａｌ）高窒素血症は、腎臓下部で小便の流れが詰まった場合に起きるが、その原因がなくなれば回復が可能である。高窒素血症がさまざまな臨床症状、症侯及び生化学的異常を伴えば尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）と言う。したがって尿毒症は、単純な生化学的異常ではない臨床症侯群で腎臓の排泄機能の異常のみならず代謝性、内分泌機能障害、胃腸管系、神経筋肉系及び心脈管系にも障害が招来される。腎臓機能の異常により発病する疾病は、急性腎盂腎炎（Ａｃｕｔｅ ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、慢性腎盂腎炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎臓結核（Ｒｅｎａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、尿路結石（Ｕｒｉｎａｒｙ ｓｔｏｎｅ）、腎臓癌（Ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）等がある。
【００１１】
一方、ケンボナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ ｄｕｌｃｉｓ Ｔｈｕｎｂ．）はクロウメモドキ科の落葉闊葉喬木で漢方では「地球木」と言う。本草綱目ではケンボナシは、味が甘くて淡白で毒性がなく、五臓を柔らかくして潤滑にして、胸の煩熱をなくして喉の渇きを癒してくれ、酒毒を解いて、嘔吐症を除去して、虫毒を無くして五種類の痔疾を治癒するとなっている。また、肝保護効果があることが知られていて、口臭除去、アルコール性肝炎、脂肪肝、肝硬変、特に抗癌効果、血圧調節、血糖降下、肝解毒、便秘にも卓越した効果があることが明らかにされた。
【００１２】
ダンコウバイ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｏｂｓｔｉｌｏｂａ）は、くすのき科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）に属する落葉闊葉喬木で、韓国を含む日本、中国、満洲等に分布する。ダンコウバイの花、葉脈が独特の香りを発する特徴があり、その幹は薬用に使用され、抗菌効果が知られている。また新芽は、お茶の原料に使用されている。
【００１３】
以上のことに鑑みて本発明者らは、さまざまな作用機序を有していて毒性が少ない薬物を天然物のなかで捜していた中で、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物が抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善作用があることを確認して本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｇｒｅｓｓｎｅｒ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８８年， １５１〜２２２頁
【非特許文献２】Ｒｅｃｋｎａｇｅｌ等， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． １９６７年，第１９巻，１４５−２０８頁
【非特許文献３】Ａｌｐｅｒｓ等， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９６８年，第４巻，５６６−５７３頁
【非特許文献４】Ｓｌａｔｅｒ Ｔ． Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９６８年，第２２２巻， １〜１５頁
【非特許文献５】Ｃｈａｎｇ Ｉ． Ｍ．等， Ｄｒｕｇ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， １９８３年， 第６巻， ４４３−４５３頁
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １９９３年 第４巻， ２６３−２７０頁
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９８１年 第１０３巻， １１３１−１１３７頁
【非特許文献８】Ｓｌａｔｅｒ ＴＦ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １９９４年，第２２２巻，１−１５頁
【非特許文献９】Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ， Ｓｃｈａｕｅｒ ＲＪ， Ｚｏｌｌｎｅｒ Ｈ．， １９９４年
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９２年，第１１巻， ８１−１２８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明の組成物は、抗酸化用組成物、抗繊維化用組成物、肝機能改善用組成物、及び腎臓機能改善用組成物を含む。
【００１７】
以下、本発明に対して詳しく説明する。
本発明によるケンボナシ、ダンコウバイ、またはその混合生薬抽出物の抽出方法を下記に示す。
【００１８】
ケンボナシまたはダンコウバイを水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥させる。乾燥したケンボナシまたはダンコウバイを還流抽出器に入れて、そこに蒸留水を入れて１００℃で９０分間加熱して熱水抽出する。前記熱水抽出液を熱い間にろ過紙で減圧ろ過した後、前記ろ過液を真空蒸発器を利用して濃縮する。長期間保存時には、凍結乾燥器を利用して乾燥する。本発明ではケンボナシ及びダンコウバイの幹、花、葉、種子等を全て使うことができる。
【００１９】
本発明の組成物で生薬成分の組成比率は、それぞれの乾燥重量を基準にして、ケンボナシとダンコウバイの比率を３：２〜１：１で配合して使用し、好ましくはケンボナシとダンコウバイの比率を２：１〜１：１で配合して使用する。このような組成比は、それぞれの生薬成分が持つ有効用量と副作用等を考慮して捜し出したものであり、その比率の範囲を脱する場合には、効果が急激に落ちたりする副作用の憂慮がある。
【００２０】
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物投与群は、肝機能の指標であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用できるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優秀であることが分かる。
【００２１】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優秀である。特に、混合生薬抽出物の場合、ケンボナシ抽出物及びダンコウバイ抽出物よりヒドロキシプロリンの量が肝組織ではさらに低く現われて腎臓組織ではさらに高く現われる。
【００２２】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優秀である。
【００２３】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優秀であることが分かる。
【００２４】
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけでなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物に、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００２６】
前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。すなわち、本発明の混合生薬抽出物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができる。製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤及び界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤する。
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤及びカプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチン等を混ぜて調剤する。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアリン酸タルクのような潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、油剤及びシロップ剤等が該当し、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にもさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、香料及び保存剤等を含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤及び座薬が含まれる。非水性溶剤と懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基剤には、ハードファット、マクロゴ−ル、トゥイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチン等が使用できる。
【００２７】
投薬単位は、例えば個別投薬量の１、２、３または４倍を含んだりまたは１／２、１／３または １／４倍を含むことができる。個別投薬量は、有効薬物が１回で投与される量を含むことが好ましく、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３ または１／４倍に該当する。ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物の有効用量は、それぞれ２００ないし６００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、３００ないし４００ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜６回投与することができる。
【００２８】
本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能及び腎臓機能改善のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用できる。
【００２９】
本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能及び腎臓機能改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を食品添加物に使用する場合、前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物をそのまま添加したり他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に相応して決めることができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的としたりまたは健康調節を目的にする長期間の摂取の場合には、前記の量は前記範囲以下があり得、安全性面で何らの問題がないので有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００３０】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等があり、通常の意味での健康食品を全て含む。
【００３１】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味料または天然炭水化物等を追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料等を使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００３２】
前記の他に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤等を含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率は、それほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより易しく理解するために提供するものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
実施例１：ケンボナシ抽出物の製造
ケンボナシを水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥させた。乾燥したケンボナシ２０ｇを還流抽出器に入れて、１．５ｌの蒸留水を入れて１００℃で９０分間加熱して熱水抽出した。前記熱水抽出液を熱い間にろ過紙で減圧ろ過した。前記ろ過液を真空蒸発器を利用して濃縮した。長期間保存時には、凍結乾燥器を利用して乾燥した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用した。
【実施例２】
【００３５】
実施例２：ダンコウバイ抽出物の製造
ダンコウバイを使用し、前記実施例１と同一の方法で製造して使用した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用した。
【実施例３】
【００３６】
実施例３：混合生薬抽出物の製造
乾燥したケンボナシ２０ｇとダンコウバイの幹１０ｇを使用して、前記実施例１と同一の方法で製造して使用した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用し、ＭＴＴ、ＮＲ ａｓｓａｙ（５０μｌ／ウェル）には４倍に濃縮して使用した。
【００３７】
実験例１：ラットで四塩化炭素の臓器投与に誘発された肝損傷及び腎臓損傷に対する抗酸化、抗繊維化、肝機能改善及び腎臓保護、腎臓機能改善効果
【００３８】
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物の肝損傷及び腎臓損傷に対する抗酸化、抗繊維化、肝機能改善及び腎臓保護、腎臓機能改善効果を調べるために下記のような実験を遂行した。
【００３９】
１．実験動物
実験動物は、体重が約１８０〜２１０ｇの１２週齢スプラグダウリ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ダムルサイオンス、オサン、韓国）を使用し、飼育環境は温度２３±２℃、相対湿度６０±１０％を維持した。飼料（ピュリナ飼料）と飲み水は自由に供給し、夜と昼に区分して供給した。
【００４０】
２週間実験室環境に適応させた実験動物を（１）正常群、（２）ＣＣｌ４投与群、（３）ＣＣｌ４＋混合生薬抽出物投与群、（４）ＣＣｌ４＋ケンボナシ抽出物投与群、（５）ＣＣｌ４＋ダンコウバイ抽出物投与群の５群に分け、各群当たり１０匹ずつ割り当てた。
【００４１】
２．肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷誘導
正常群を除いた残りの実験群のラットに、オリーブオイルとＣＣｌ４の混合液１ｍｌ／ラット／日を一週間に３回ずつ４週間投与して肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷を誘導した。
【００４２】
ＣＣｌ４投与群には蒸留水を、ＣＣｌ４＋混合生薬抽出物投与群には前記実施例３で製造した混合生薬抽出物を、ＣＣｌ４＋ケンボナシ抽出物投与群には前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物を、ＣＣｌ４＋ダンコウバイ抽出物投与群には実施例２で製造したダンコウバイ抽出物をそれぞれ２ｍｌ／ラット／日を経口投与した。
【００４３】
正常群を含む各群のラットの体重を測定後、エーテルで麻酔して、心臓穿刺（ｈｅａｒｔ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって心臓で採血して２時間以上室温に放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を得て−２０℃で保管した。保管した血清は、血清生化学的検査であるトランスアミナーゼ（ＧＯＴ及びＧＰＴ）とアルカリホスファターゼ、ＢＵＮ及び総ビリルビン値を測定するのに使用した。
【００４４】
また、肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷が誘導されたラットの肝と腎臓を摘出してリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、重さを測定した。肝と腎臓組織の一部は、−７５℃で保管してヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、マロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＭＤＡ）測定に使用した。
【００４５】
体重変化は、毎週測定し、耳、尾、足で黄疸の有無を確認して屠殺時、肝の重さ変化を観察した。
【００４６】
実験成績は、平均値±標準偏差で示し、対照群と実験群との平均の差を検定する時には スチューデントｔテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で検定してＰ値が０．００５未満の時、統計的に有意な差があると判定した。
結果は、表１に示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
＊：ｐ＜０．００５
【００４９】
表１に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物投与群の体重と肝の重さの比率変化は、対照群に比べて低く現われ、体重と腎臓重さの比率変化も対照群に比べて低く現われた。
【００５０】
３．血清生化学的検査
１） ＧＯＴ（ＡＳＴ）測定（ＥＭＢＩＥＬキット使用）
２個のファルコン試験管（ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）にＡＳＴ基質液５００μｌを入れて、３７℃で３〜５分間加温した。一方の試験管には標準液を加えて希釈し、もう一方の試験管には血清試料１００μｌを加えた後、３７℃で６０分間反応させた。各試験管に蒸留水１００μｌと発色液（２，３−ジ−ニトロフェニルヒドラジン）５００μｌを加えて、室温で２０分間放置した。各試験管に０．４Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌを加えて室温で１０分間再び反応させた後、５０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５１】
２） ＧＰＴ（ＡＬＴ）測定（ＥＭＢＩＥＬキット使用）
２個のファルコン試験管にＡＬＴ基質液１５０μｌを入れて、３７℃で４分間加温した。一方の試験管には標準液を加えて希釈し、もう一方の試験管には血清試料１００μｌを加えて３７℃で３０分間反応させた。各試験管に蒸留水１００μｌと発色液（２，３−ジ−ニトロフェニルヒドラジン）５００μｌを加えて、室温で２０分間放置した。各試験管に０．４Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌを加えて室温で１０分間再び反応させた後、５０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
３） ＡＬＰ（Ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）測定
３個の試験管にＡＬＰ基質緩衝液（フェニルリン酸−２−ナトリウム）２．０ｍｌを入れて３７℃で３〜５分間加温した。各試験管に血清試料５０μｌ、蒸留水５０μｌ、標準液５０μｌをそれぞれ加えて混合して３７℃で１５分間加温した。各試験管に呈色試薬２．０ｍｌを入れて室温で１０分間放置した後、６０分以内に５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５３】
４） ＢＵＮ（Ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）測定
３個の試験管に血清試料２０μｌ、蒸留水２０μｌ、標準液２０μｌをそれぞれ加えて、酵素溶液２．０ｍｌをそれぞれ入れた後、混合して３７℃で５分間反応させた。各試験管に呈色試薬 ２．０ｍｌを加えて混合して３７℃で１０分間加温後、６０分以内に５８０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５４】
５） 総ビリルビン量測定
３個の試験管に血清試料１００μｌ、蒸留水１００μｌ、標準液１００μｌをそれぞれ加えて、総ビリルビン呈色試薬６００μｌをそれぞれ加えた。各試験管にジアゾ混合液６００μｌを入れて混合した後、室温で１０分間放置した。各試験管にフェリン試薬６００μｌを加えて反応させた後、２時間以内に６００ｎｍで吸光度を測定した。
結果は、表２に示した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
＊：ｐ＜０．０５， ＊＊：ｐ＜０．００５
【００５７】
表２に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物投与群では、肝機能指標であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が対照群より有意性をもって低く現われ、特に混合生薬抽出物投与群の場合、ケンボナシ抽出物及びダンコウバイ抽出物投与群よりもさらに低く現われた。
【００５８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物は、肝機能改善効果が優れていることが分かる。
【００５９】
また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていること分かる。
【００６０】
４．ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ：ｈｙｐ）量測定
１） 試薬の調剤
（１）酢酸クエン酸緩衝液（Ａｃｅｔａｔｅ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）
酢酸ナトリウム三水和物（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ）５０ｇ、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）３７．５ｇ、クエン酸一水和物（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）５．５ｇ、イソプロパノール３９５ｍｌに蒸留水を加えて、全体で１ｌになるようにした後、ｐＨを６．０にして４℃で保管して使用した。
【００６１】
（２）クロラミン−Ｔ（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ）溶液
クロラミン−Ｔ ８４ｍｇを酢酸クエン酸緩衝液１０ｍｌに溶解させて使用した。
【００６２】
（３） エリリッチ試薬（Ｅｈｒｉｌｉｃｈ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔｓ）
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）１０ｇと６０％過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）１１ｍｌを混合して貯蔵溶液を作った。貯蔵溶液３ｍｌを取った後、イソプロパノール８．０ｍｌと混合して使用した。エリリッチ試薬は、使用直前に調剤して使用し、貯蔵溶液は遮光して４℃で保管した。
【００６３】
２） ヒドロキシプロリン量測定
フリーズドライ（−５０℃、７２時間）または冷凍した肝組織（または腎臓組織）０．２ｇを１０ｍｌガラス瓶に坪量した後、６Ｎ ＨＣｌ ４ｍｌを入れて均質器（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化させて１１０℃で１０〜２４時間乾燥オーブンで加水分解させた後、ワットマンろ過紙を使用してろ過した。ここで、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｕｇ／５０μｌのトランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ） ６Ｎ ＨＣｌで希釈した標準溶液を試料のように１１０℃から １２〜１４時間加水分解させた。各試料と標準溶液を５０μｌガラス瓶に取って完全に乾燥させて塩酸を除去した。その後に、５０％イソプロパノール１．２ｍｌを入れて沈殿物を溶解させ、クロラミン−Ｔ溶液２００μｌを加えて１０分間室温で反応させた後、１．２ｍｌのエリリッチ反応試薬を入れた。５０℃で９０分間発色させて常温で冷却した後、５５８ｎｍで分光光度計を使用して吸光度を測定した。
【００６４】
肝組織（または腎臓組織）中のヒドロキシプロリンの濃度は、下記の式によって計算した。
Ｃ［の肝組織（または腎臓組織）０．２ｇのヒドロキシプロリンの濃度］＝［ＨＡ（試料の吸光度）／ＳＡ（１．０ｕｇ／５０μｌのトランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ） ６Ｎ ＨＣｌで希釈した標準溶液の吸光度）］×８０
Ｃ×５＝ヒドロキシプロリン量／ｇの肝組織（または腎臓組織）
結果は、表３に示した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
＊：ｐ＜０．００５
【００６７】
表３に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物投与群でヒドロキシプロリンの量は、肝組織では対照群より低く現われ、腎臓組織では対照群より高く現われた。特に、混合生薬抽出物投与群の場合ヒドロキシプロリンの量は、肝組織では対照群より５０．８％有意性をもって低く現われ、腎臓組織では対照群より５．５％、ケンボナシ単独投与群より３．０％、ダンコウバイ単独投与群より１．２％高く現われた。
【００６８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００６９】
５．ＭＤＡ（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）測定
均質化させた組織試料［１．１５％ ＫＣｌ １．８ｍｌ中に０．２ｇ肝組織（または腎臓組織）］と希釈した標準物質（０、４、８、１６、３２ｎｍｏｌ／２００μｌ テトラメトキシプロパン）２００μｌをファルコン試験管に加えた。試料と希釈した標準溶液２００μｌに０．２％ＳＤＳ １００μｌを入れて混合し、室温で１０分間反応させた。そして２０％アセト酸７５０μｌと０．８％チオバルビツレート（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ）７５０μｌを加えて混合した。その後に９５℃で３０分間反応させて氷に入れて冷却した。完全に冷却したことを確認した後、ｎ−ブタノール２ｍｌを加えて遠心分離して上層液の吸光度を５３２ｎｍで分光光度計を使用して測定した。
【００７０】
血清と組織中ＭＤＡ濃度は、次のように計算した。
Ｃ［の肝組織（または腎臓組織）０．２ｇ（または血清２００μｌ）のマロンジアルデヒドの濃度］＝［ＨＡ（試料の吸光度）／ＳＡ（標準溶液の吸光度（８μｍｏｌ／１．１５％ ＫＣｌ ２００μｌ））×８０
Ｃ×５＝マロンジアルデヒド量（μｍｏｌ／ｍｌ）
結果は、表４に示した。
【００７１】
【表４】
【００７２】
＊：ｐ＜０．０５
【００７３】
表４に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物投与群で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量は、肝組織及び腎臓組織で対照群より低く現われ、特に混合生薬抽出物投与群の場合の肝組織では対照群より３１．０％有意性をもって低く現われ、腎臓組織では対照群より１３．０％低く現われた。
【００７４】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、抗酸化及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００７５】
実験例２：毒性実験
本実験に使用した細胞株は、ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ １４６９（肝細胞株）とｖｅｒｏ（腎臓細胞株）で、韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）から購入した。
【００７６】
ＭＴＴ貯蔵溶液は、リン酸緩衝溶液１ｍｌにＭＴＴ粉末５ｍｇを溶解させた後、よく振った後、０．４μｍ フィルターでろ過して準備した。
【００７７】
ＮＲ貯蔵溶液は、３次蒸留水１ｍｌにＮＲ粉末４ｍｇを溶解させた後、よく振った後、０．４μｍフィルターでろ過して準備した。
【００７８】
トリプシン−ＥＤＴＡは、０．５％トリプシン、５．３ｍＭ ＥＤＴＡを含んだものが販売されていて、それをＰＢＳで１０倍に希釈して使用した。
【００７９】
１） ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］分析
培地を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍｌを入れて１０〜２０分間放置して細胞を容器から分離して１５ｍｌファルコンチューブに入れた。培養フラスコに残っている細胞を全て回収するために培地１ｍｌを入れて振り、残留細胞を回収して前記ファルコンチューブに入れた。細胞浮遊液１０μｌを血球計（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に入れて細胞数を数えた（細胞２．５×１０４個／ｍｌ）。細胞を９６ウェルプレートに５０μｌずつ（細胞１〜２×１０５個）入れた後、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質）１５０μｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間放置して細胞を付着させた。
【００８０】
２４時間経過後、９６ウェルプレートに付着させた細胞から培地を注意深く除去した（この時、底に付着した細胞が付いて出て来ないように、汚染に気を付ける）。培地１５０μｌに前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物、実施例２で製造したダンコウバイ抽出物、または実施例３で製造した混合生薬抽出物５０μｌをそれぞれ入れて、総体積が２００μｌになるようにして、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養させた。ここで、薬剤から入れると細胞の損傷が大きいので培地を先に入れた後で薬剤を処理した。培養した後、９６ウェルプレートを取り出して培地を除去した。ここにＭＴＴ染料５０μｌ／ｍｌ（貯蔵液５０μｌ＋培地９５０μｌ）を入れて希釈して、各ウェルに５０μｌずつ入れて、ＣＯ２培養器に入れて４時間培養した。上澄み液を除去した後、ＤＭＳＯ １００μｌを加えた後、１０分間よく振った後、エライザリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で５４０ｎｍでＯＤ（吸光度）を測定した。
【００８１】
対照群には、培地だけを入れたものを使用して生存率を計算した。
【００８２】
２） ＮＲ（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ：３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジン）分析
培地を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍｌを入れて１０〜２０分間放置して細胞を容器から分離して１５ｍｌファルコンチューブに入れた。培養フラスコに残っている細胞を全て回収するために培地１ｍｌを入れて振って残留する細胞を回収して前記ファルコンチューブに入れた。細胞浮遊液１０μｌを血球計に入れて細胞数を数えた（細胞２．５×１０４個／ｍｌ）。細胞を９６ウェルプレートに５０μｌずつ（細胞１〜２×１０５個）入れた後、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質）１５０μｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間放置して細胞を付着させた。
【００８３】
２４時間経過後、９６ウェルプレートに付着した細胞から培地を注意深く除去した（ここで、底に付着した細胞が付いて出て来ないように、汚染に気を付ける）。培地１５０μｌに前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物、実施例２で製造したダンコウバイ抽出物、または実施例３で製造した混合生薬抽出物５０μｌをそれぞれ入れて総体積が２００μｌになるようにして、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養させた。この時、薬剤から入れると細胞の損傷が大きいので培地を先に入れた後、薬剤を処理した。
【００８４】
培養した後、９６ウェルプレートを取り出して培地を除去した。そこにＮＲ染料１０μｌ／ｍｌ（貯蔵液１０μｌ＋培地９９０μｌ）を入れて希釈して各ウェルに２００μｌずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器に入れて３時間培養した。また、培地を除去した後、１％ＣａＣｌ２、０．５％ホルムアルデヒド１００μｌを入れて洗浄した。上澄み液を除去した後、１％アセト酸、５０％エチルアルコールを２００μｌ加えた後、１０分間振った後、エライザリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で５４０ｎｍでＯＤ（吸光度）を測定した。
【００８５】
対照群には、培地だけを入れたものを使用して生存率を計算した。
結果は、表５に示した。
【００８６】
【表５】
【００８７】
表５に示したように、本発明のダンコウバイ抽出物及び混合生薬抽出物は、肝細胞株で細胞生存率が高く現われ、特に混合生薬抽出物はケンボナシ抽出物より肝細胞株で細胞生存率が高く現われた。また、腎臓細胞株では、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及び混合生薬抽出物の全てが、生存には危害を与えないことが分かった。
【００８８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、肝保護及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００８９】
本発明の組成物のための製剤例を例示する。
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物含む薬学的製剤を下記のように製造した。
【００９０】
製剤例１：薬学的製剤の製造
１．散剤の製造
ケンボナシ抽出物 ２ｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【００９１】
２．錠剤の製造
ケンボナシ抽出物 １００ｍｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００９２】
３．カプセル剤の製造
ケンボナシ抽出物 １００ｍｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００９３】
製剤例２：食品の製造
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物を含む食品を下記のように製造した。
【００９４】
１．料理用味付けタレの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）２０〜９５重量％で健康増進用料理用味付けタレを製造した。
【００９５】
２．トマトケチャップ及びソースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．２〜１．０重量％をトマトケチャップまたはソースに添加して、健康増進用トマトケチャップまたはソースを製造した。
【００９６】
３．小麦粉食品の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．５〜５．０重量％を小麦粉に添加して、その混合物を利用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
【００９７】
４．スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．１〜５．０重量％をスープ及び肉汁に添加して健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【００９８】
５．牛挽肉（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）１０重量％を牛挽肉に添加して、健康増進用牛挽肉を製造した。
【００９９】
６．乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）５〜１０重量％を牛乳に添加して、前記牛乳を利用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１００】
７．禅食の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０１】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたことを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０２】
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を真空濃縮機で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１０３】
前記で製造した穀物類、種実類及びケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）の乾燥粉末を次の比率で配合して製造した。
【０１０４】
穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、麦２０重量％）、種実類（えごま７重量％、黒豆８重量％、黒ごま７重量％）、ケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）の乾燥粉末（３重量％）、霊芝（０．５重量％）、地黄（０．５重量％）
【０１０５】
製剤例３：飲料の製造
１．炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ０．１〜１％の添加物を混合して、そこに７９〜９４％の蒸留水を混ぜてシロップを作り、前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して冷却水と１：４の比率で混合した後、炭酸ガスを０．５〜０．８２％注入して本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を含む炭酸飲料を製造した。
【０１０６】
２．健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような部材料とケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、ペットボトル等の小容器に包装して健康飲料を製造した。
【０１０７】
３．野菜ジュースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。
【０１０８】
４．果物ジュースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）１ｇをリンゴまたはブドウジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。
【０１０９】
産業上の利用可能性
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝機能指標である、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていることが分かる。
【０１１０】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れている。
【０１１１】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優れている。
【０１１２】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優れていることが分かる。
【０１１３】
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
代表的な成人病のひとつの肝疾患は、ストレス性慢性疲労及び大部分の外因性物質によって、肝が損傷されることにより発病される疾患である。現在、韓国での肝疾患の発生率は、外国に比べて相当に高い方で、最近の肝臓癌による死亡率は世界１位で、慢性肝疾患の場合もその死亡率が３番目であるという調査結果である。最近の統計庁報告によると、韓国の４０代の場合、肝疾患が一番高い死亡原因であると発表された。国内の肝疾患の中で一番高い死亡率を示すのがウイルス性肝炎であるが、西欧ではウイルス性肝炎よりは肝硬変による死亡が５〜１０倍程度高く報告されている。
【０００３】
肝臓は、人間の身体臓器の中で生体内代謝が最も活発に起きる臓器であり、脂肪成分が含まれた食べ物またはアルコールの過多摂取、ウイルスの感染、各種薬品のような有害物質、栄養不足等、多様な原因によって急性または慢性の障害が起き、脂肪肝、肝炎、黄疸、肝硬変、肝臓癌等が惹起され得る。特に、食べ物を通じた過多な脂肪摂取または過度なアルコール摂取は、肝組織に脂質が蓄積する脂肪肝を誘発し、この時血清の中のＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍａｔｅ−ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、γ−ＧＴＰ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ）等が増加するようになる。肝臓は、緩衝能力が大きい器官であり疾患の初期段階ではあまり症状を示さず、かなり悪くなった後になってはじめて疾患の症状を示すようになる。
【０００４】
また、肝臓は、人体で血液の貯蔵及び循環、血流量調節と防御解毒作用をして精神的活動と密接に関連していると知られている。産業化による公害物質、有毒物質に対して私たちの体はいつも露出していて、私たちの肝臓は絶え間なく解毒作用の負担を負っている。さらに、深刻なことは精神的なストレスによる肝損傷である。精神的休息を取れば、損傷した肝細胞は復旧されるが、切迫した現代社会では精神的休息の余裕を持つことができないため精神的ストレス、飲み過ぎ、喫煙によって肝損傷を加重させ、人体が防御解毒作用をできずに免疫体系に異常を来たして他の疾病の原因になったりする。
【０００５】
肝硬変（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）は、肝組織が繊維化して起きる。結合組織の生成と分解過程恒常性が喪失した状態で、肝組織内に結合組織が過度に蓄積して壊死や炎症が伴う。特に筋繊維芽細胞形態に転移した肝放射状細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ：ＨＳＣｓ）が増殖、移動して過度な結合組織を生成することにより、このような、肝の繊維化過程を進行させると知られている（非特許文献１）。肝硬変は、各種肝疾患が慢性的に進行する場合に共通的に至る最後の段階で、肝血流量低下、肝内血流の短縮、代謝酵素の機能低下、血中タンパク質の質的・量的変化及び胆汁流量の変化等、全般的な肝機能が低下する。
【０００６】
肝毒性を起こす誘発物質としては、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＣＣｌ４）、Ｄ−ガラクトースアミン、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）、ブロモベンゼン等があるが、四塩化炭素は、肝細胞の過酸化脂質反応を起こして肝毒性を示すと知られている（非特許文献２〜４）。肝毒性を起こす四塩化炭素は、肝毒性保護作用を検定するために肝細胞培養、肝組織培養及びマウスやラットに直接投与して人為的に肝毒性を起こさせる物質である。四塩化炭素は、複合的な機能をするチトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０のような代謝酵素によって、小胞体内で非常に反応性が強いフリーラジカルであるＣＣｌ３・の分子構造に転換しながら強い肝毒性効果を示す。フリーラジカルであるＣＣｌ３・は、アルコールによって蓄積された肝中性脂肪や膜リン脂質にある脂肪酸の酸化を誘発させて脂質の酸敗が始まって酸素と結合した後、過酸化脂質反応を通じて有機過酸化物を形成する。過酸化脂質反応を通じて肝に脂肪が蓄積してタンパク質合成能力が減少し、グリコーゲンが分解されて血管内の細胞質酵素が破壊されて肝組織の壊死が起きるようになる（非特許文献５）。このようなフリーラジカルは、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に損傷を与えて細胞からタンパク質放出に悪影響を与えることにより、肝だけでなく腎臓にも損傷を与えることが知られている。
【０００７】
また、脂質過酸化を抑制または防止することができる機能である抗酸化効果は、肝保護効果及び抗炎症作用があると報告されていて、抗酸化物質（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、反応性酸素中間生成物（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）による攻撃に対抗し、肝と肝細胞保護の目的に使用されている。
【０００８】
天然物から抽出されたフラボノイド、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）またはビタミンＥのような抗酸化剤は、脂質過酸化と肝繊維化に効果がある物質として報告されていて、Ｎ−アセチルシステイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ；ＮＡＣ）は、抗酸化活性を通じて肝繊維化の初期段階で肝繊維化と酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）を阻害すると知られている。また、胡黄連（ｋｕｔｋｉｎ）は、脂質過酸化とフリーラジカルによる損傷を減少させて肝保護、抗繊維化効果だけでなく、肝保護効果を助ける抗酸化効果がある天然物として報告されている。
【０００９】
現在一般的に利用されている肝疾患の治療方法は、大きく分けて食餌療法と薬剤療法に分けられ、大部分の場合にこの二つの方法を併用している。肝疾患に対する薬剤療法としては、肝疾患の発病原因及び種類によって多様な作用機序を有する薬剤を利用されることができる。例えば、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ；非特許文献６）、ＤＤＢ（ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；非特許文献７）、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、グリシリジン（ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ）等のような肝細胞再生促進剤及び肝機能補助剤、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）のような抗ウイルス剤、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ、６−ＭＰ）、アザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）等のような免疫抑制剤等の薬剤が一般的に使われている。しかし、肝疾患は一つの原因によってだけ発生するのではなく、多くの要因の複合的な作用によって発病するので、一つの作用機序を持つ薬剤だけでは総の肝疾患に対して十分に満足できる高い治療効果を期待することはできない。また、現在使用されている公知の肝疾患治療薬は、急激な作用が発生したり、大量または長期間投与時には副作用が現われたりする短所がある。
【００１０】
一方、腎臓は、体内の水（体液）の量とイオン濃度を適切に調節して、老廃物（要素、尿酸、クレアチニン等）を小便として排出して、毒性物質や薬物、そして代謝産物は毒を無くした後、排泄する作用をする。組織で脂質過酸化の分解産物であるマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｅｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＭＤＡ）と４−ヒドロキシノネナール（４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ；ＨＮＥ）は、細胞損傷の指標として知られていて、脂質過酸化物を触媒するスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）は、細胞損傷を回復させるのに関与すると報告されている（非特許文献８〜１０）。アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）と血液尿素窒素（ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ；ＢＵＮ）は、腎臓機能代謝の診断指標として臨床で使用されている。特に、ＢＵＮ数値の増加は高窒素血症（ａｚｏｔｅｍｉａ）による糸球体ろ過率（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ；ＧＦＲ）の減少として現われる。参考に、腎前性（ｐｒｅｒｅｎａｌ）高窒素血症は、鬱血性心不全（ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ ｈｅａｒｔ ｆａｉｌｕｒｅ）、ショック、血液量減少（ｈｙｐｏｖｏｌｅｍｉａ）及び出血等、腎臓に低潅流状態によって腎臓の損傷なしに機能低下が招来されることであり、腎後性（ｐｏｓｔｒｅｎａｌ）高窒素血症は、腎臓下部で小便の流れが詰まった場合に起きるが、その原因がなくなれば回復が可能である。高窒素血症がさまざまな臨床症状、症侯及び生化学的異常を伴えば尿毒症（ｕｒｅｍｉａ）と言う。したがって尿毒症は、単純な生化学的異常ではない臨床症侯群で腎臓の排泄機能の異常のみならず代謝性、内分泌機能障害、胃腸管系、神経筋肉系及び心脈管系にも障害が招来される。腎臓機能の異常により発病する疾病は、急性腎盂腎炎（Ａｃｕｔｅ ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、慢性腎盂腎炎（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｙｅｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、腎臓結核（Ｒｅｎａｌ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、尿路感染症（ＵＴＩ）、尿路結石（Ｕｒｉｎａｒｙ ｓｔｏｎｅ）、腎臓癌（Ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）等がある。
【００１１】
一方、ケンボナシ（Ｈｏｖｅｎｉａ ｄｕｌｃｉｓ Ｔｈｕｎｂ．）はクロウメモドキ科の落葉闊葉喬木で漢方では「地球木」と言う。本草綱目ではケンボナシは、味が甘くて淡白で毒性がなく、五臓を柔らかくして潤滑にして、胸の煩熱をなくして喉の渇きを癒してくれ、酒毒を解いて、嘔吐症を除去して、虫毒を無くして五種類の痔疾を治癒するとなっている。また、肝保護効果があることが知られていて、口臭除去、アルコール性肝炎、脂肪肝、肝硬変、特に抗癌効果、血圧調節、血糖降下、肝解毒、便秘にも卓越した効果があることが明らかにされた。
【００１２】
ダンコウバイ（Ｌｉｎｄｅｒａ ｏｂｓｔｉｌｏｂａ）は、くすのき科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）に属する落葉闊葉喬木で、韓国を含む日本、中国、満洲等に分布する。ダンコウバイの花、葉脈が独特の香りを発する特徴があり、その幹は薬用に使用され、抗菌効果が知られている。また新芽は、お茶の原料に使用されている。
【００１３】
以上のことに鑑みて本発明者らは、さまざまな作用機序を有していて毒性が少ない薬物を天然物のなかで捜していた中で、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物が抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善作用があることを確認して本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｇｒｅｓｓｎｅｒ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １９８８年， １５１〜２２２頁
【非特許文献２】Ｒｅｃｋｎａｇｅｌ等， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． １９６７年，第１９巻，１４５−２０８頁
【非特許文献３】Ａｌｐｅｒｓ等， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９６８年，第４巻，５６６−５７３頁
【非特許文献４】Ｓｌａｔｅｒ Ｔ． Ｆ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １９６８年，第２２２巻， １〜１５頁
【非特許文献５】Ｃｈａｎｇ Ｉ． Ｍ．等， Ｄｒｕｇ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ， １９８３年， 第６巻， ４４３−４５３頁
【非特許文献６】Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， １９９３年 第４巻， ２６３−２７０頁
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １９８１年 第１０３巻， １１３１−１１３７頁
【非特許文献８】Ｓｌａｔｅｒ ＴＦ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １９９４年，第２２２巻，１−１５頁
【非特許文献９】Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ Ｈ， Ｓｃｈａｕｅｒ ＲＪ， Ｚｏｌｌｎｅｒ Ｈ．， １９９４年
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９２年，第１１巻， ８１−１２８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明の組成物は、抗酸化用組成物、抗繊維化用組成物、肝機能改善用組成物、及び腎臓機能改善用組成物を含む。
【００１７】
以下、本発明に対して詳しく説明する。
本発明によるケンボナシ、ダンコウバイ、またはその混合生薬抽出物の抽出方法を下記に示す。
【００１８】
ケンボナシまたはダンコウバイを水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥させる。乾燥したケンボナシまたはダンコウバイを還流抽出器に入れて、そこに蒸留水を入れて１００℃で９０分間加熱して熱水抽出する。前記熱水抽出液を熱い間にろ過紙で減圧ろ過した後、前記ろ過液を真空蒸発器を利用して濃縮する。長期間保存時には、凍結乾燥器を利用して乾燥する。本発明ではケンボナシ及びダンコウバイの幹、花、葉、種子等を全て使うことができる。
【００１９】
本発明の組成物で生薬成分の組成比率は、それぞれの乾燥重量を基準にして、ケンボナシとダンコウバイの比率を３：２〜１：１で配合して使用し、好ましくはケンボナシとダンコウバイの比率を２：１〜１：１で配合して使用する。このような組成比は、それぞれの生薬成分が持つ有効用量と副作用等を考慮して捜し出したものであり、その比率の範囲を脱する場合には、効果が急激に落ちたりする副作用の憂慮がある。
【００２０】
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物投与群は、肝機能の指標であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用できるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優秀であることが分かる。
【００２１】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優秀である。特に、混合生薬抽出物の場合、ケンボナシ抽出物及びダンコウバイ抽出物よりヒドロキシプロリンの量が肝組織ではさらに低く現われて腎臓組織ではさらに高く現われる。
【００２２】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優秀である。
【００２３】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優秀であることが分かる。
【００２４】
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけでなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物に、追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
【００２６】
前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。すなわち、本発明の混合生薬抽出物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができる。製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤及び界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して調剤する。
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤及びカプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチン等を混ぜて調剤する。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアリン酸タルクのような潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、油剤及びシロップ剤等が該当し、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にもさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、香料及び保存剤等を含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤及び座薬が含まれる。非水性溶剤と懸濁剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基剤には、ハードファット、マクロゴ−ル、トゥイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチン等が使用できる。
【００２７】
投薬単位は、例えば個別投薬量の１、２、３または４倍を含んだりまたは１／２、１／３または １／４倍を含むことができる。個別投薬量は、有効薬物が１回で投与される量を含むことが好ましく、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３ または１／４倍に該当する。ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物の有効用量は、それぞれ２００ないし６００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは、３００ないし４００ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜６回投与することができる。
【００２８】
本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能及び腎臓機能改善のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用できる。
【００２９】
本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能及び腎臓機能改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を食品添加物に使用する場合、前記ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物をそのまま添加したり他の食品または食品成分と共に使用することができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、使用目的（予防、健康または治療的処置）に相応して決めることができる。一般的に、食品または飲料の製造時には、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物を原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加する。しかし、健康及び衛生を目的としたりまたは健康調節を目的にする長期間の摂取の場合には、前記の量は前記範囲以下があり得、安全性面で何らの問題がないので有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができる。
【００３０】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤等があり、通常の意味での健康食品を全て含む。
【００３１】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味料または天然炭水化物等を追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料等を使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００３２】
前記の他に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤等を含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率は、それほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択することが一般的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより易しく理解するために提供するものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
実施例１：ケンボナシ抽出物の製造
ケンボナシを水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥させた。乾燥したケンボナシ２０ｇを還流抽出器に入れて、１．５ｌの蒸留水を入れて１００℃で９０分間加熱して熱水抽出した。前記熱水抽出液を熱い間にろ過紙で減圧ろ過した。前記ろ過液を真空蒸発器を利用して濃縮した。長期間保存時には、凍結乾燥器を利用して乾燥した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用した。
【実施例２】
【００３５】
実施例２：ダンコウバイ抽出物の製造
ダンコウバイを使用し、前記実施例１と同一の方法で製造して使用した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用した。
【実施例３】
【００３６】
実施例３：混合生薬抽出物の製造
乾燥したケンボナシ２０ｇとダンコウバイの幹１０ｇを使用して、前記実施例１と同一の方法で製造して使用した。
前記濃縮液は、動物実験（２ｍｌ／ラット／日）に使用し、ＭＴＴ、ＮＲ ａｓｓａｙ（５０μｌ／ウェル）には４倍に濃縮して使用した。
【００３７】
実験例１：ラットで四塩化炭素の臓器投与に誘発された肝損傷及び腎臓損傷に対する抗酸化、抗繊維化、肝機能改善及び腎臓保護、腎臓機能改善効果
【００３８】
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物の肝損傷及び腎臓損傷に対する抗酸化、抗繊維化、肝機能改善及び腎臓保護、腎臓機能改善効果を調べるために下記のような実験を遂行した。
【００３９】
１．実験動物
実験動物は、体重が約１８０〜２１０ｇの１２週齢スプラグダウリ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ダムルサイオンス、オサン、韓国）を使用し、飼育環境は温度２３±２℃、相対湿度６０±１０％を維持した。飼料（ピュリナ飼料）と飲み水は自由に供給し、夜と昼に区分して供給した。
【００４０】
２週間実験室環境に適応させた実験動物を（１）正常群、（２）ＣＣｌ４投与群、（３）ＣＣｌ４＋混合生薬抽出物投与群、（４）ＣＣｌ４＋ケンボナシ抽出物投与群、（５）ＣＣｌ４＋ダンコウバイ抽出物投与群の５群に分け、各群当たり１０匹ずつ割り当てた。
【００４１】
２．肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷誘導
正常群を除いた残りの実験群のラットに、オリーブオイルとＣＣｌ４の混合液１ｍｌ／ラット／日を一週間に３回ずつ４週間投与して肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷を誘導した。
【００４２】
ＣＣｌ４投与群には蒸留水を、ＣＣｌ４＋混合生薬抽出物投与群には前記実施例３で製造した混合生薬抽出物を、ＣＣｌ４＋ケンボナシ抽出物投与群には前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物を、ＣＣｌ４＋ダンコウバイ抽出物投与群には実施例２で製造したダンコウバイ抽出物をそれぞれ２ｍｌ／ラット／日を経口投与した。
【００４３】
正常群を含む各群のラットの体重を測定後、エーテルで麻酔して、心臓穿刺（ｈｅａｒｔ ｐｕｎｃｔｕｒｅ）によって心臓で採血して２時間以上室温に放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を得て−２０℃で保管した。保管した血清は、血清生化学的検査であるトランスアミナーゼ（ＧＯＴ及びＧＰＴ）とアルカリホスファターゼ、ＢＵＮ及び総ビリルビン値を測定するのに使用した。
【００４４】
また、肝繊維化（硬化）及び腎臓損傷が誘導されたラットの肝と腎臓を摘出してリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、重さを測定した。肝と腎臓組織の一部は、−７５℃で保管してヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）、マロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；ＭＤＡ）測定に使用した。
【００４５】
体重変化は、毎週測定し、耳、尾、足で黄疸の有無を確認して屠殺時、肝の重さ変化を観察した。
【００４６】
実験成績は、平均値±標準偏差で示し、対照群と実験群との平均の差を検定する時には スチューデントｔテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で検定してＰ値が０．００５未満の時、統計的に有意な差があると判定した。
結果は、表１に示した。
【００４７】
【表１】
【００４８】
＊：ｐ＜０．００５
【００４９】
表１に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物投与群の体重と肝の重さの比率変化は、対照群に比べて低く現われ、体重と腎臓重さの比率変化も対照群に比べて低く現われた。
【００５０】
３．血清生化学的検査
１） ＧＯＴ（ＡＳＴ）測定（ＥＭＢＩＥＬキット使用）
２個のファルコン試験管（ｆａｌｃｏｎ ｔｕｂｅ）にＡＳＴ基質液５００μｌを入れて、３７℃で３〜５分間加温した。一方の試験管には標準液を加えて希釈し、もう一方の試験管には血清試料１００μｌを加えた後、３７℃で６０分間反応させた。各試験管に蒸留水１００μｌと発色液（２，３−ジ−ニトロフェニルヒドラジン）５００μｌを加えて、室温で２０分間放置した。各試験管に０．４Ｎ ＮａＯＨ ５ｍｌを加えて室温で１０分間再び反応させた後、５０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５１】
２） ＧＰＴ（ＡＬＴ）測定（ＥＭＢＩＥＬキット使用）
２個のファルコン試験管にＡＬＴ基質液１５０μｌを入れて、３７℃で４分間加温した。一方の試験管には標準液を加えて希釈し、もう一方の試験管には血清試料１００μｌを加えて３７℃で３０分間反応させた。各試験管に蒸留水１００μｌと発色液（２，３−ジ−ニトロフェニルヒドラジン）５００μｌを加えて、室温で２０分間放置した。各試験管に０．４Ｎ ＮａＯＨ １．５ｍｌを加えて室温で１０分間再び反応させた後、５０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５２】
３） ＡＬＰ（Ａｌｋａｋｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）測定
３個の試験管にＡＬＰ基質緩衝液（フェニルリン酸−２−ナトリウム）２．０ｍｌを入れて３７℃で３〜５分間加温した。各試験管に血清試料５０μｌ、蒸留水５０μｌ、標準液５０μｌをそれぞれ加えて混合して３７℃で１５分間加温した。各試験管に呈色試薬２．０ｍｌを入れて室温で１０分間放置した後、６０分以内に５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５３】
４） ＢＵＮ（Ｂｌｏｏｄ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）測定
３個の試験管に血清試料２０μｌ、蒸留水２０μｌ、標準液２０μｌをそれぞれ加えて、酵素溶液２．０ｍｌをそれぞれ入れた後、混合して３７℃で５分間反応させた。各試験管に呈色試薬 ２．０ｍｌを加えて混合して３７℃で１０分間加温後、６０分以内に５８０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５４】
５） 総ビリルビン量測定
３個の試験管に血清試料１００μｌ、蒸留水１００μｌ、標準液１００μｌをそれぞれ加えて、総ビリルビン呈色試薬６００μｌをそれぞれ加えた。各試験管にジアゾ混合液６００μｌを入れて混合した後、室温で１０分間放置した。各試験管にフェリン試薬６００μｌを加えて反応させた後、２時間以内に６００ｎｍで吸光度を測定した。
結果は、表２に示した。
【００５５】
【表２】
【００５６】
＊：ｐ＜０．０５， ＊＊：ｐ＜０．００５
【００５７】
表２に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物投与群では、肝機能指標であるＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が対照群より有意性をもって低く現われ、特に混合生薬抽出物投与群の場合、ケンボナシ抽出物及びダンコウバイ抽出物投与群よりもさらに低く現われた。
【００５８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物は、肝機能改善効果が優れていることが分かる。
【００５９】
また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、及びその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていること分かる。
【００６０】
４．ヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ：ｈｙｐ）量測定
１） 試薬の調剤
（１）酢酸クエン酸緩衝液（Ａｃｅｔａｔｅ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）
酢酸ナトリウム三水和物（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ）５０ｇ、クエン酸三ナトリウム（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）３７．５ｇ、クエン酸一水和物（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）５．５ｇ、イソプロパノール３９５ｍｌに蒸留水を加えて、全体で１ｌになるようにした後、ｐＨを６．０にして４℃で保管して使用した。
【００６１】
（２）クロラミン−Ｔ（Ｃｈｌｏｒａｍｉｎｅ−Ｔ）溶液
クロラミン−Ｔ ８４ｍｇを酢酸クエン酸緩衝液１０ｍｌに溶解させて使用した。
【００６２】
（３） エリリッチ試薬（Ｅｈｒｉｌｉｃｈ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔｓ）
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）１０ｇと６０％過塩素酸（ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ）１１ｍｌを混合して貯蔵溶液を作った。貯蔵溶液３ｍｌを取った後、イソプロパノール８．０ｍｌと混合して使用した。エリリッチ試薬は、使用直前に調剤して使用し、貯蔵溶液は遮光して４℃で保管した。
【００６３】
２） ヒドロキシプロリン量測定
フリーズドライ（−５０℃、７２時間）または冷凍した肝組織（または腎臓組織）０．２ｇを１０ｍｌガラス瓶に坪量した後、６Ｎ ＨＣｌ ４ｍｌを入れて均質器（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化させて１１０℃で１０〜２４時間乾燥オーブンで加水分解させた後、ワットマンろ過紙を使用してろ過した。ここで、０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ｕｇ／５０μｌのトランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ） ６Ｎ ＨＣｌで希釈した標準溶液を試料のように１１０℃から １２〜１４時間加水分解させた。各試料と標準溶液を５０μｌガラス瓶に取って完全に乾燥させて塩酸を除去した。その後に、５０％イソプロパノール１．２ｍｌを入れて沈殿物を溶解させ、クロラミン−Ｔ溶液２００μｌを加えて１０分間室温で反応させた後、１．２ｍｌのエリリッチ反応試薬を入れた。５０℃で９０分間発色させて常温で冷却した後、５５８ｎｍで分光光度計を使用して吸光度を測定した。
【００６４】
肝組織（または腎臓組織）中のヒドロキシプロリンの濃度は、下記の式によって計算した。
Ｃ［の肝組織（または腎臓組織）０．２ｇのヒドロキシプロリンの濃度］＝［ＨＡ（試料の吸光度）／ＳＡ（１．０ｕｇ／５０μｌのトランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ） ６Ｎ ＨＣｌで希釈した標準溶液の吸光度）］×８０
Ｃ×５＝ヒドロキシプロリン量／ｇの肝組織（または腎臓組織）
結果は、表３に示した。
【００６５】
【表３】
【００６６】
＊：ｐ＜０．００５
【００６７】
表３に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物投与群でヒドロキシプロリンの量は、肝組織では対照群より低く現われ、腎臓組織では対照群より高く現われた。特に、混合生薬抽出物投与群の場合ヒドロキシプロリンの量は、肝組織では対照群より５０．８％有意性をもって低く現われ、腎臓組織では対照群より５．５％、ケンボナシ単独投与群より３．０％、ダンコウバイ単独投与群より１．２％高く現われた。
【００６８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００６９】
５．ＭＤＡ（Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）測定
均質化させた組織試料［１．１５％ ＫＣｌ １．８ｍｌ中に０．２ｇ肝組織（または腎臓組織）］と希釈した標準物質（０、４、８、１６、３２ｎｍｏｌ／２００μｌ テトラメトキシプロパン）２００μｌをファルコン試験管に加えた。試料と希釈した標準溶液２００μｌに０．２％ＳＤＳ １００μｌを入れて混合し、室温で１０分間反応させた。そして２０％アセト酸７５０μｌと０．８％チオバルビツレート（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ）７５０μｌを加えて混合した。その後に９５℃で３０分間反応させて氷に入れて冷却した。完全に冷却したことを確認した後、ｎ−ブタノール２ｍｌを加えて遠心分離して上層液の吸光度を５３２ｎｍで分光光度計を使用して測定した。
【００７０】
血清と組織中ＭＤＡ濃度は、次のように計算した。
Ｃ［の肝組織（または腎臓組織）０．２ｇ（または血清２００μｌ）のマロンジアルデヒドの濃度］＝［ＨＡ（試料の吸光度）／ＳＡ（標準溶液の吸光度（８μｍｏｌ／１．１５％ ＫＣｌ ２００μｌ））×８０
Ｃ×５＝マロンジアルデヒド量（μｍｏｌ／ｍｌ）
結果は、表４に示した。
【００７１】
【表４】
【００７２】
＊：ｐ＜０．０５
【００７３】
表４に示したように、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物投与群で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量は、肝組織及び腎臓組織で対照群より低く現われ、特に混合生薬抽出物投与群の場合の肝組織では対照群より３１．０％有意性をもって低く現われ、腎臓組織では対照群より１３．０％低く現われた。
【００７４】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、抗酸化及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００７５】
実験例２：毒性実験
本実験に使用した細胞株は、ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ １４６９（肝細胞株）とｖｅｒｏ（腎臓細胞株）で、韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ）から購入した。
【００７６】
ＭＴＴ貯蔵溶液は、リン酸緩衝溶液１ｍｌにＭＴＴ粉末５ｍｇを溶解させた後、よく振った後、０．４μｍ フィルターでろ過して準備した。
【００７７】
ＮＲ貯蔵溶液は、３次蒸留水１ｍｌにＮＲ粉末４ｍｇを溶解させた後、よく振った後、０．４μｍフィルターでろ過して準備した。
【００７８】
トリプシン−ＥＤＴＡは、０．５％トリプシン、５．３ｍＭ ＥＤＴＡを含んだものが販売されていて、それをＰＢＳで１０倍に希釈して使用した。
【００７９】
１） ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］分析
培地を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍｌを入れて１０〜２０分間放置して細胞を容器から分離して１５ｍｌファルコンチューブに入れた。培養フラスコに残っている細胞を全て回収するために培地１ｍｌを入れて振り、残留細胞を回収して前記ファルコンチューブに入れた。細胞浮遊液１０μｌを血球計（ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）に入れて細胞数を数えた（細胞２．５×１０４個／ｍｌ）。細胞を９６ウェルプレートに５０μｌずつ（細胞１〜２×１０５個）入れた後、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質）１５０μｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間放置して細胞を付着させた。
【００８０】
２４時間経過後、９６ウェルプレートに付着させた細胞から培地を注意深く除去した（この時、底に付着した細胞が付いて出て来ないように、汚染に気を付ける）。培地１５０μｌに前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物、実施例２で製造したダンコウバイ抽出物、または実施例３で製造した混合生薬抽出物５０μｌをそれぞれ入れて、総体積が２００μｌになるようにして、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養させた。ここで、薬剤から入れると細胞の損傷が大きいので培地を先に入れた後で薬剤を処理した。培養した後、９６ウェルプレートを取り出して培地を除去した。ここにＭＴＴ染料５０μｌ／ｍｌ（貯蔵液５０μｌ＋培地９５０μｌ）を入れて希釈して、各ウェルに５０μｌずつ入れて、ＣＯ２培養器に入れて４時間培養した。上澄み液を除去した後、ＤＭＳＯ １００μｌを加えた後、１０分間よく振った後、エライザリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で５４０ｎｍでＯＤ（吸光度）を測定した。
【００８１】
対照群には、培地だけを入れたものを使用して生存率を計算した。
【００８２】
２） ＮＲ（Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ：３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジン）分析
培地を除去した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液１ｍｌを入れて１０〜２０分間放置して細胞を容器から分離して１５ｍｌファルコンチューブに入れた。培養フラスコに残っている細胞を全て回収するために培地１ｍｌを入れて振って残留する細胞を回収して前記ファルコンチューブに入れた。細胞浮遊液１０μｌを血球計に入れて細胞数を数えた（細胞２．５×１０４個／ｍｌ）。細胞を９６ウェルプレートに５０μｌずつ（細胞１〜２×１０５個）入れた後、培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質）１５０μｌを入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間放置して細胞を付着させた。
【００８３】
２４時間経過後、９６ウェルプレートに付着した細胞から培地を注意深く除去した（ここで、底に付着した細胞が付いて出て来ないように、汚染に気を付ける）。培地１５０μｌに前記実施例１で製造したケンボナシ抽出物、実施例２で製造したダンコウバイ抽出物、または実施例３で製造した混合生薬抽出物５０μｌをそれぞれ入れて総体積が２００μｌになるようにして、３７℃、５％ＣＯ２培養器で２４時間培養させた。この時、薬剤から入れると細胞の損傷が大きいので培地を先に入れた後、薬剤を処理した。
【００８４】
培養した後、９６ウェルプレートを取り出して培地を除去した。そこにＮＲ染料１０μｌ／ｍｌ（貯蔵液１０μｌ＋培地９９０μｌ）を入れて希釈して各ウェルに２００μｌずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ２培養器に入れて３時間培養した。また、培地を除去した後、１％ＣａＣｌ２、０．５％ホルムアルデヒド１００μｌを入れて洗浄した。上澄み液を除去した後、１％アセト酸、５０％エチルアルコールを２００μｌ加えた後、１０分間振った後、エライザリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で５４０ｎｍでＯＤ（吸光度）を測定した。
【００８５】
対照群には、培地だけを入れたものを使用して生存率を計算した。
結果は、表５に示した。
【００８６】
【表５】
【００８７】
表５に示したように、本発明のダンコウバイ抽出物及び混合生薬抽出物は、肝細胞株で細胞生存率が高く現われ、特に混合生薬抽出物はケンボナシ抽出物より肝細胞株で細胞生存率が高く現われた。また、腎臓細胞株では、ケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及び混合生薬抽出物の全てが、生存には危害を与えないことが分かった。
【００８８】
したがって、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物及びその混合生薬抽出物は、肝保護及び腎臓保護効果が優れていること分かる。
【００８９】
本発明の組成物のための製剤例を例示する。
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物含む薬学的製剤を下記のように製造した。
【００９０】
製剤例１：薬学的製剤の製造
１．散剤の製造
ケンボナシ抽出物 ２ｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
乳糖 １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【００９１】
２．錠剤の製造
ケンボナシ抽出物 １００ｍｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００９２】
３．カプセル剤の製造
ケンボナシ抽出物 １００ｍｇ
（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）
とうもろこし澱粉 １００ｍｇ
乳糖 １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００９３】
製剤例２：食品の製造
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物を含む食品を下記のように製造した。
【００９４】
１．料理用味付けタレの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）２０〜９５重量％で健康増進用料理用味付けタレを製造した。
【００９５】
２．トマトケチャップ及びソースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．２〜１．０重量％をトマトケチャップまたはソースに添加して、健康増進用トマトケチャップまたはソースを製造した。
【００９６】
３．小麦粉食品の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．５〜５．０重量％を小麦粉に添加して、その混合物を利用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
【００９７】
４．スープ及び肉汁（ｇｒａｖｉｅｓ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）０．１〜５．０重量％をスープ及び肉汁に添加して健康増進用肉加工製品、麺類のスープ及び肉汁を製造した。
【００９８】
５．牛挽肉（ｇｒｏｕｎｄ ｂｅｅｆ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）１０重量％を牛挽肉に添加して、健康増進用牛挽肉を製造した。
【００９９】
６．乳製品（ｄａｉｒｙ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）５〜１０重量％を牛乳に添加して、前記牛乳を利用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【０１００】
７．禅食の製造
玄米、麦、もち米、鳩麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０１】
黒豆、黒ごま、えごまも公知の方法で蒸して乾燥させたことを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【０１０２】
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を真空濃縮機で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【０１０３】
前記で製造した穀物類、種実類及びケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）の乾燥粉末を次の比率で配合して製造した。
【０１０４】
穀物類（玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、麦２０重量％）、種実類（えごま７重量％、黒豆８重量％、黒ごま７重量％）、ケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）の乾燥粉末（３重量％）、霊芝（０．５重量％）、地黄（０．５重量％）
【０１０５】
製剤例３：飲料の製造
１．炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ０．１〜１％の添加物を混合して、そこに７９〜９４％の蒸留水を混ぜてシロップを作り、前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して冷却水と１：４の比率で混合した後、炭酸ガスを０．５〜０．８２％注入して本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を含む炭酸飲料を製造した。
【０１０６】
２．健康飲料の製造
液状果糖（０．５％）、オリゴ糖（２％）、砂糖（２％）、食塩（０．５％）、水（７５％）のような部材料とケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、ペットボトル等の小容器に包装して健康飲料を製造した。
【０１０７】
３．野菜ジュースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用野菜ジュースを製造した。
【０１０８】
４．果物ジュースの製造
本発明のケンボナシ抽出物（またはダンコウバイ抽出物またはその混合生薬抽出物）１ｇをリンゴまたはブドウジュース１，０００ｍｌに加えて、健康増進用果物ジュースを製造した。
【０１０９】
産業上の利用可能性
本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝機能指標である、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、ＢＵＮ、総ビリルビン量が低く現われるので、肝機能改善効果が優秀である。また、ＡＬＰ、ＢＵＮ数値は、肝機能のみならず腎臓機能診断指標にも利用されるので、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、腎臓機能改善効果も優れていることが分かる。
【０１１０】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、ヒドロキシプロリンの量が肝組織では低く現われて腎臓組織では高く現われるので、抗繊維化効果及び腎臓保護効果が優れている。
【０１１１】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝組織及び腎臓組織で脂質過酸化の指標であるマロンジアルデヒドの量が低く現われるので、抗酸化効果が優れている。
【０１１２】
また、本発明のケンボナシ抽出物、ダンコウバイ抽出物、またはその混合生薬抽出物は、肝細胞株及び腎臓細胞株で細胞生存率が高く現われるので、肝細胞保護及び腎臓細胞保護効果が優れていることが分かる。
【０１１３】
したがって、本発明の組成物は、抗酸化、抗繊維化、肝機能改善だけではなく、腎臓保護及び腎臓機能改善にも有用に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項２】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項３】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項４】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項３記載の抗酸化用組成物。
【請求項５】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項６】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項７】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項８】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項７記載の抗酸化用組成物。
【請求項９】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１０】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１１】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１２】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項１１記載の肝機能改善用組成物。
【請求項１３】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１４】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１５】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１６】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項１１記載の腎臓機能改善用組成物。
【請求項１】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項２】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項３】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項４】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項３記載の抗酸化用組成物。
【請求項５】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項６】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項７】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む抗酸化用組成物。
【請求項８】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項７記載の抗酸化用組成物。
【請求項９】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１０】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１１】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む肝機能改善用組成物。
【請求項１２】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項１１記載の肝機能改善用組成物。
【請求項１３】
ケンボナシ抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１４】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１５】
ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物の混合生薬抽出物を有効成分として含む腎臓機能改善用組成物。
【請求項１６】
前記ケンボナシ抽出物とダンコウバイ抽出物を２：１〜１：１で配合して得る請求項１１記載の腎臓機能改善用組成物。
【公表番号】特表２００７−５１９７１５（Ｐ２００７−５１９７１５Ａ）
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５５０９５３（Ｐ２００６−５５０９５３）
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００２８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２７５８
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２６０６７４）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月３１日（２００５．１．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／０００２８３
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０７２７５８
【国際公開日】平成１７年８月１１日（２００５．８．１１）
【出願人】（５０６２６０６７４）
【Ｆターム（参考）】
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