コブラ毒因子様機能を有するヒト補体Ｃ３誘導体
ＣＶＦ機能を有する、実質的に低下した免疫原性を有するヒトＣ３タンパク質を生じる、ヒトＣ３タンパク質の部分の、コブラ毒因子タンパク質（ＣＶＦ）の対応する部分との置換を含む、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質（Ｃ３）を開示する。好都合には、Ｃ３タンパク質は、以下のＣＶＦ機能：Ｃ３コンバターゼの安定性の向上および因子Ｈおよび／またはＩの作用に対する耐性の向上の少なくとも１つを含有するように操作できる。Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分に置換を含有する置換を含有する多数のハイブリッドＣ３タンパク質を紹介して、上の機能について試験する。再潅流傷害、自己免疫疾患、および補体活性化向上の他の疾患などの疾患の処置方法はもちろんのこと、遺伝子治療および他の治療の有効性を向上させる方法も紹介する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本国際出願は、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される、２００４年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／５６７，０６９号、２００５年２月１４日に出願された６０／６５３，２４７、そして２００５年３月３０日に出願された６０／６６７，３５２に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、ヒトＣ３タンパク質の部分のコブラ毒因子（ＣＶＦ）タンパク質の対応部分による置換を有するヒト補体Ｃ３のキメラ誘導体に関する。好ましくは、Ｃ３のアルファ鎖の部分がＣＶＦの対応する部分によって置換される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
補体の第３の成分であるＣ３は、補体活性化の古典的経路および代替経路の両方において中枢の役割を果たし、生理的Ｃ３活性化生成物の多くは、免疫反応および宿主防御において重要な機能を有する。代替経路において、Ｃ３の活性化型、Ｃ３ｂは、Ｃ３コンバターゼの構造サブユニットである。この２分子酵素は、Ｃ３ｂおよび因子Ｂの活性化型であるＢｂより成る。この酵素は、因子Ｄによって続いて開裂されるＣ３ｂの因子Ｂへの結合によって形成され、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂ、Ｂｂの形成、および活性化ペプチドＢａの放出を生じる。Ｃ３コンバターゼは分子をＣ３ｂおよびアナフィラトキシン、Ｃ３ａに開裂することによってＣ３を活性化する。Ｃ３ｂ分子はＣ３コンバターゼのごく近くの細胞または粒子に結合するであろう。最終的に結合したＣ３ｂは、Ｃ５のＣ５ｂおよびアナフィラトキシン、Ｃ５ａへの活性化を可能にする。Ｃ５活性化は同じＣ３ｂ、Ｂｂ酵素によって起こり、Ｂｂ酵素は追加のＣ３ｂ分子に結合しているときにＣ５を開裂可能であり、（Ｃ３ｂ）２，Ｂｂより構成される３分子複合体を生成する。このＣ５開裂３分子酵素はＣ５コンバターゼと呼ばれる。Ｃ３およびＣ５の両方の活性化がＢｂサブユニットの同一の活性部位で発生するため、酵素はＣ３／Ｃ５コンバターゼとも呼ばれる；そして１個のＥＣメンバのみが割り当てられている（ＥＣ ３．４．２１．４７）。
【０００４】
コブラ毒は、コブラ毒因子（ＣＶＦ）と呼ばれるＣ３の構造的および機能的類似物質を含有する。この分子は、ヒトおよび哺乳類血清中の因子Ｂと結合して複合体ＣＶＦ，Ｂを形成することができ、これはまた因子Ｄによって２分子酵素ＣＶＦのＢｂおよびＢａに開裂される。２分子複合体ＣＶＦ，Ｂｂは、Ｃ３ｂによって形成されるＣ３／Ｃ５コンバターゼと同様にＣ３およびＣ５を活性化するＣ３／Ｃ５コンバターゼである。２つのＣ３／Ｃ５コンバターゼＣ３ｂ，ＢｂおよびＣＶＦ，Ｂｂは同じ分子構造、活性の部位保持Ｂｂサブユニット、および基質特異性を共有するが、２つの酵素は著しい機能の相違を示す。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素はＣ３ｂ，Ｂｂよりも物理化学的にはるかに安定であり、調節タンパク質因子ＨおよびＩによる不活性化に対して耐性であり、異なる動的特性を示し、Ｃ５開裂のために追加のＣ３ｂを必要としない。
【０００５】
ＣＶＦおよび哺乳類Ｃ３が免疫交叉反応、アミノ酸組成、円２色性スペクトル、２次構造、電子顕微鏡による超構造、およびアミノ酸配列を含む、複数の構造上の類似性を示すことが明らかにされている。それにもかかわらず、２つの分子間には著しい構造上の相違が存在する。Ｃ３が種に依存して、１７０〜１９０ｋＤａの見かけの分子量を持つ２鎖分子であるのに対して、ＣＶＦは、Ｃ３の生理的活性化生成物の１つであるＣ３ｃに似た、１４９ｋＤａの見かけの分子量を持つ３鎖分子である。Ｃ３とＣＶＦの間の別の著しい構造上の相違は、そのグリコシル化にある：ＣＶＦは、主として、非還元末端に珍しいα−ガラクトシル残基を持つＮ結合複合体型鎖で構成される、７．４％（ｗ／ｗ）の炭水化物含有率を有する。これに対して、ヒトおよびラットＣ３は、より低い程度のグリコシル化を示し、異なる構造のオリゴサッカライド鎖を持つ。
【０００６】
ＣＶＦ，ＢｂおよびＣ３ｂ，ＢｂはどちらもＣ３／Ｃ５コンバターゼであるが、それらは重要な相違を示す。ＣＶＦ含有酵素はＣ３含有酵素よりも、はるかに安定である。どちらのコンバターゼもその２つのそれぞれのサブユニットに自発的に崩壊するであろう。しかしながら、ＣＶＦ含有コンバターゼの固有半減期（安定性）は、３７℃にて約７時間であり、約１．５分間の固有半減期を持つＣ３含有酵素よりも数百倍長い。さらにＣＶＦ含有酵素は、遊離ＣＶＦと同様に、補体調節タンパク質因子ＨおよびＩによる調節を受けない。長い固有半減期とＣＶＦ含有酵素の調節に対する耐性の組合せによって、ＣＶＦはＣ３およびＣ５を継続的に（そして次に他の補体成分）を活性化して、最終的に血清補体活性の枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を引き起こす。
【０００７】
大流行している疾患を含め、多数の疾患への補体系の関与に基づいて、過去十年間には、これらの疾患状態における望ましくない補体活性化プロセスを妨害する複数の抗補体剤の開発が見られた。すべての補体向け薬物開発の試みは、補体の活性化を阻害することに基づいており、同時にＣＶＦは血清中の補体を枯渇させることにより作用する。補体活性化の疾患の処置にとって興味深いのは、Ｃ３の非免疫原性または低免疫原性をＣＶＦの補体枯渇機能と組合せるＣ３型分子である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
実施形態の以下のリストは、本発明の各種の態様の非制限的な説明である。他の態様および変形は、開示全体に照らして明らかになるであろう。
【０００９】
一部の実施形態は、ヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連する配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を有することができる、１つまたは複数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＶＦの置換部は、Ｃ３のアルファ鎖内でありうる。他の実施形態において、ＣＶＦの置換部分は、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分でありうる。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含む。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延在しない内部部分でありうる。さらなる実施形態において、修飾タンパク質は、実質的に同数のアミノ酸残基を未修飾ヒトＣ３タンパク質として有することができる。一部の実施形態において、置換はヒトＣ３タンパク質のアミノ酸位置７００−１６６３内の任意の位置を含むことができる。他の実施形態は、ヒト補体Ｃ３タンパク質であり、これはヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連しており、少なくとも２個の置換を有することができる配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を有することができる。一部の実施形態において、置換は選択された開始位置および選択された最終位置を有する；一部のそのような実施形態において、開始位置はたとえば７４９、８７４、９３６、９９４、１２６４、１３４８、１４９６、１５０４、１５５０などでありうる；最終位置はたとえば７８４、９２１、９７０ １３２４、１５５０、１６１７、１６６３でありうる。好ましい実施形態において、１つまたは複数の置換がアミノ酸：１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４９６−１６６３、１３４８−１６１７、１４９６−１６１７、１２６４−１３２４、７４９−７８４、８７４−９２１、９９４−１６６３、９９４−１５５０および９３６−９７０のいずれかを含むことができる。一部の実施形態において、ＣＶＦの置換部分はＣ３のベータ鎖内にありうる。
【００１０】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は因子Ｂへの親和性を有することができ、コンバターゼの形成を補助できる。一部の実施形態において、得られたコンバターゼはＣ３を開裂できるが、Ｃ５は開裂できない。さらなる実施形態において、コンバターゼは、約３７℃にて１．５分間〜約７時間の固有半減期を有することができる。一部の実施形態において、得られたコンバターゼは３７℃にて少なくとも約７時間の固有半減期を有することができる。
【００１１】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は単鎖タンパク質として発現できる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、Ｃ３に似た形態の少なくとも２本の鎖に開裂させることができる。さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を開裂させてそこからＣ３ａ部分を放出できる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、Ｃ３またはＣＶＦによってコードされないＮ末端において、追加の１〜約１９個のアミノ酸を有することができる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、非Ｃ３シグナルペプチド、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｂｉｐシグナル配列を含むことができる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、因子Ｂおよび／または因子Ｄに対して修飾親和性を有することができる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、因子Ｈおよび／または因子Ｉに対して部分または完全耐性を示すことができる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、実質的に非免疫原性でありうる。
【００１２】
他の実施形態は、補体の枯渇に有効な量の修飾Ｃ３タンパク質を患者に投与することによって、補体を枯渇させる方法も含むことができる。一部の実施形態において、投与は局所的でありうる。さらなる実施形態において、局所投与は臓器内、皮下的、空洞内、または組織内でありうる。他の実施形態において、局所投与は、修飾Ｃ３タンパク質を所望の場所に濃縮できるターゲティング機能を利用できる。さらなる実施形態において、ターゲティング機能は、修飾Ｃ３タンパク質に結合された抗体を使用することを含みうる。一部の実施形態において、投与は全身投与、たとえば静脈内または腹腔内投与でありうる。
【００１３】
さらなる実施形態は、補体を枯渇するのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を患者に送達するステップと；患者における再潅流を可能にするステップとによって、患者における再潅流傷害を回避または緩和するための方法でありうる。一部の実施形態において、送達ステップは、修飾Ｃ３タンパク質を動脈に注入することを含みうる。他の実施形態において、送達ステップは、修飾Ｃ３タンパク質の局所送達を含むことができる。他の実施形態において、送達ステップは修飾Ｃ３タンパク質の全身送達を含むことができる。一部の実施形態において、再潅流は閉塞動脈を開くことを含む。一部の実施形態において、再潅流は臓器移植と関連して起こることがある。
【００１４】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質を補体を枯渇させるのに十分な量で送達するステップと、遺伝子治療を供給するステップと；それからの向上した結果を観察するステップとによって、遺伝子治療の効率および／または有効性を上昇させる方法を含みうる。
【００１５】
一部の実施形態は、血流を増加させるのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を送達するステップと；治療剤または診断剤を供給するステップとによって、治療剤または診断剤の送達を増加させる方法を含みうる。一部の実施形態において、該方法は、送達ステップの前に、修飾Ｃ３タンパク質を特定の組織に対する親和性を備えた抗体に化学的に結合するステップを含みうる。一部の実施形態において、抗体を修飾Ｃ３に組換えＤＮＡ技術によって付着させることができる。一部の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体でありうる。
【００１６】
一部の実施形態は、補体を枯渇させるのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を投与するステップを含む、自己免疫疾患を処置する方法を含む。一部の実施形態において、投与は間欠的でもよく、少なくとも１つの疾患症状上昇の期間に一致する。一部の実施形態において、自己免疫疾患は、ぜんそく、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、関節リウマチ、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋虚血、再潅流、敗血症、超急性拒絶、移植片拒絶、心肺バイパス、心筋梗塞症、血管形成、腎炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、脊髄損傷およびパーキンソン病のいずれかでありうる。
【００１７】
一部の実施形態は、たとえばヒト補体Ｃ３タンパク質の部分をコブラ毒因子（ＣＶＦ）タンパク質の対応する部分によって置換するステップによって、ヒトタンパク質中のＣＶＦの特性を模倣する方法を含む。一部の実施形態において、部分はＣ３のアルファ鎖内でありうる。他の実施形態において、部分はＣ３のアルファ鎖のＣ末端分でありうる。一部の実施形態において、Ｃ末端部分はヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含みうる。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延在しない内部部分でありうる。
【００１８】
他の実施形態は、修飾タンパク質の機能プロフィールを形成するために修飾Ｃ３タンパク質の少なくとも１つの特性を特徴付けるステップと；機能プロフィールを処置される疾患または状態と結び付けるステップとによる、修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの特性は：コンバターゼ活性、コンバターゼ形成、コンバターゼ安定性、因子Ｈに対する感受性、因子Ｉに対する感受性、Ｃ３を開裂する能力、およびＣ５を開裂する能力から成る群より選択できる。一部の実施形態において、選択したＣ３タンパク質は、慢性状態の処置に適したコンバターゼの形成に関与する。一部の実施形態において、適応は、たとえば長い血漿半減期、高い安定性、因子Ｈに対する耐性、因子Ｉに対する耐性などのいずれかを含みうる。一部の実施形態において、コンバターゼは再潅流傷害の処置に適しうる。他の実施形態において、適応はたとえば高いコンバターゼ活性、因子Ｈに対する耐性、因子Ｉに対する耐性などのいずれかでありうる。
【００１９】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質をコードする核酸配列、および／または核酸を含むベクターおよび／またはベクターを含有する宿主細胞を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｉＦｉｖｅ細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかでありうる。
【００２０】
一部の実施形態は、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質ならびに医薬的に許容される担体および／または核酸を含みうる組成物を含む。
【００２１】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質を発現する発現系を含む。一部の実施形態において、発現系は：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｉＦｉｖｅ細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ細胞から成る群より選択される細胞を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ヒト補体Ｃ３配列の、ＣＶＦの特異的機能の主な構造要件を表すＣＶＦ配列による置換は、ＣＶＦ様機能を備えたＣ３誘導体の作製を可能にする。本発明の好ましい実施形態は、補体活性化が病因の一部である臨床状況で補体を枯渇させる新規な治療剤として使用するための安定なコンバターゼを形成することによって、補体を枯渇させるＣＶＦ特異的機能を示すヒトＣ３誘導体を提供することである。ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３分子は、免疫原性の著しい低下または非存在さえ示すであろう。
【００２３】
ＣＶＦ機能を備えた、しかし実質的に低下した免疫原性を備えたヒトＣ３タンパク質を生じる、ヒトＣ３タンパク質の部分の、コブラ毒因子タンパク質（ＣＶＦ）による対応する部分による置換を有する、多数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質（Ｃ３）が開示されている。Ｃ３タンパク質は、プロタンパク質（単鎖タンパク質）または４個のアルギニン残基の除去による開裂タンパク質でありうる。追加の２鎖形は、Ｃ３ａ部分の除去により形成できる。好都合には、Ｃ３タンパク質は、以下のＣＶＦ機能：Ｃ３コンバターゼを形成する能力の向上、Ｃ３コンバターゼの安定性向上、因子Ｈおよび／またはＩの作用に対する耐性の向上、Ｃ３およびＣ５を開裂させる活性の向上、および血漿半減期の延長の少なくとも１つを含有するように操作できる。１つの実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分は、ＣＶＦタンパク質の対応する部分によって置換される。多種多様の特異領域および特異キメラが本明細書で開示される。さらに修飾Ｃ３タンパク質が修飾タンパク質の機能プロフィールを形成する特性を特徴付けるステップと、処置される疾患または状態と結び付けるステップとを含む、修飾Ｃ３タンパク質を同定および／または選択する方法が開示される。機能プロフィールは、以下の機能：コンバターゼを形成する能力、Ｈおよび／またはＩに対する感受性、Ｃ３を開裂する能力、Ｃ５を開裂させる能力、コンバターゼの相対活性、コンバターゼの安定性、および血漿半減期の１つまたは複数を含みうる。キメラＣ３タンパク質、Ｃ３／ＣＶＦキメラ、またはＣ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質とも呼ばれる修飾Ｃ３タンパク質は、局所または全身補体活性化から生じる各種の疾患および／または状態を処置するのに使用できる。これらの疾患は、これに限定されるわけではないが：再潅流傷害、自己免疫疾患、たとえば関節リウマチおよび狼瘡、そして重症筋無力症ならびに人体のタンパク質または構造に対する免疫反応を識別および指示する抗体から生じた他の疾患を含む。
【００２４】
（補体系および疾患）
補体系は、脊椎動物免疫系の構成要素であり、宿主防御および免疫反応でのその役割を通じて健康の維持に関与している。しかしながら補体活性化も多数の疾患の病因に関与している。これらの疾患の例は、自己免疫溶血性貧血、関節リウマチおよび他の免疫複合疾患、ならびに血流が一時的に停止された後に組織損傷が発生する再潅流傷害を含む。再潅流傷害の例は、閉塞血管の再開後の組織損傷（たとえば心臓麻痺、卒中）および臓器移植後のレシピエントの血液による再潅流である。大流行している疾患を含め、多数の疾患への補体系の関与に基づいて、過去十年間には、これらの疾患状態における望ましくない補体活性化プロセスを妨害する複数の抗補体剤の開発が見られた。このような薬物の開発の試みはすべて、補体の活性化を阻害することに基づいている。
【００２５】
（補体タンパク質Ｃ３、コブラ毒因子ＣＶＦ、類似性および相違）
補体の第３の成分であるＣ３は、補体活性化の古典的経路および代替経路の両方において中枢の役割を果たし、生理的Ｃ３活性化生成物の多くは、免疫反応および宿主防御において重要な機能を有する（総説については、参考としてその全体が本明細書に援用されるＭｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｈ．Ｊ．（１９８８） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：３２１−３４７を参照）。ヒトＣ３は、分子量約１８５，０００の２鎖糖タンパク質である。それは単鎖プリプロＣ３として合成され、β鎖とα鎖との間のアルギニン残基４個の除去による次の処理を受ける。ヒトＣ３の１次配列は、分子クローニングから既知である。他の哺乳類種はもちろんのこと非哺乳類種からの完全または部分配列情報が入手できる。これらとしては、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、コブラ、アフリカツメガエル、およびヤツメウナギが挙げられる。ヒトＣ３遺伝子は、長さ４２ｋｂで、エキソン４１個を含み、５２〜２１３ｂｐの範囲の大きさである。
【００２６】
Ｃ３の主な活性化生成物はＣ３ｂである。Ｃ３ｂは、代替経路Ｃ３／Ｃ５コンバターゼの形成で中心的な役割を果たす。この酵素の形成は、Ｃ３ｂの因子Ｂへの初期結合を必要とする。弱い複合体Ｃ３ｂ，ＢはＭｇ２＋の存在下で因子Ｄによって次に開裂され、酵素活性Ｃ３／Ｃ５コンバターゼＣ３ｂ，Ｂｂを生じて、活性化ペプチドＢａの放出を引き起こす。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に不安定であり、２つのサブユニットＣ３ｂおよびＢｂへの自発的な崩壊解離を示し、固有半減期は３７℃にて１．５分間である。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素はプロパージンによって安定化される。Ｃ３／Ｃ５コンバターゼは、２つの基質における１個のペプチド結合を加水分解することによって、Ｃ３およびＣ５を開裂させる。酵素にＣ５を開裂させるために、コンバターゼに結合された別のＣ３ｂ分子にＣ５を結合させる必要がある。高速の自発的な崩壊解離に加えて、Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は厳密な制御を受ける。酵素は因子Ｈによって分解され、Ｃ３ｂは因子ＨおよびＩの複合作用によって不活性化される。因子Ｈの存在下で、因子Ｉは２個の開裂部位におけるＣ３ｂのα’鎖を開裂する。iＣ３ｂと呼ばれる得られたＣ３ｂ誘導体はもはや、因子Ｂを用いてコンバターゼを形成できない。因子Ｉは第３の部位にてα’鎖を開裂可能であり、これは２つのＣ３断片Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇの生成を引き起こす。因子Ｉによる第３の開裂では、Ｃ３ｂセレプタのＣＲ１が補因子として作用する。
【００２７】
Ｃ３の珍しい構造特性は、α鎖内の細胞内チオエステルの存在である。Ｃ３のＣ３ｂへの活性化時に、チオエステルは非常に反応性となり、Ｃ３ｂの細胞および他の特定の標的への共有付着に関与する。チオエステルの開裂と同時に起こる構造変化は、次の因子Ｂの結合およびその活性化を可能にする。
【００２８】
Ｃ３中のチオエステルは低速の自発的加水分解を受け、ｉＣ３またはＣ３（Ｈ２Ｏ）と呼ばれるＣ３の形態の形成を引き起こす。ｉＣ３はＣ３ｂ様機能を呈し、血清中の因子ＢおよびＤによって流体相コンバターゼを形成できる。得られたコンバターゼｉＣ３，ＢｂはＣ３ｂ，Ｂｂコンバターゼと同様に不安定であり、因子ＨおよびＩによる制御を受ける。しかしながらチオエステルの自発的な加水分解およびｉＣ３，ＢｂコンバターゼによるＣ３の次の低グレードの活性化は、標的細胞または粒子に対するＣ３ｂの初期沈着に関与して、いわゆるアクチベータ表面での代替経路の活性化を引き起こすと考えられる。
【００２９】
Ｃ３は、非常に珍しい多機能タンパク質である。その各種活性化生成物を含む該タンパク質は特に、約２０の異なる血漿タンパク質または細胞表面レセプタと相互作用する。このような他機能性は、分子の詳細な構造／機能解析に多大な興味をかき立てている。因子Ｈ、プロパージン、因子Ｂ、および補体レセプタＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、およびＣ３ａを含むＣ３の一部のリガンドでは、レセプタ結合部位は、Ｃ３ポリペプチドの多かれ少なかれ定義領域に提示または割当てされる。
【００３０】
コブラ毒は、コブラ毒因子（ＣＶＦ）と呼ばれるＣ３の構造的および機能的類似物質を含有する。ＣＶＦはヒト血清および本質的にすべての脊椎動物の血清中の因子Ｂと結合でき、弱い複合体ＣＶＦ，Ｂを形成し、これが次にＭｇ２＋の存在下で因子Ｄによって２分子酵素ＣＶＦ，ＢｂおよびＢａに開裂されるという点で、ＣＶＦはＣ３ｂに機能的に似ている。２分子複合体ＣＶＦ，Ｂｂは、Ｃ３ｂによって形成されたＣ３／Ｃ５コンバターゼと同様にＣ３およびＣ５を活性化する、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼである。
【００３１】
ＣＶＦは、約１５０，０００Ｄａの分子量を持つ３鎖糖タンパク質である。ＣＶＦおよび哺乳類Ｃ３は、免疫交叉反応、アミノ酸組成、円２色性スペクトルおよび２次構造、ならびに電子顕微鏡超構造を含む複数の構造上の類似性を示すことが明らかにされている。初期のＮ末端アミノ酸配列比較は、Ｃ３との配列相同性を証明し、ＣＶＦがＣ３ｃと構造的に似ているという示唆をもたらした。ＣＶＦとＣ３との構造相同性および鎖の関係は、ＣＶＦの分子クローニングによって確認され、このことはタンパク質レベルにて哺乳類Ｃ３に対して約７０パーセントの、そしてコブラＣ３と比較したときに９０パーセント超の全体的な類似性を明らかにした。
【００３２】
ＣＶＦとＣ３との間のこれらの機能上および構造上の類似性にもかかわらず、２つの分子および得られたコンバターゼは、重要な機能上の相違を示す：
１．両方の酵素が、酵素活性を破壊する、各サブユニットへの自発的な崩壊解離を示す。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に短寿命であり、３７℃にて１．５分間の固有半減期で崩壊するのに対して、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素は何桁もより安定であり、約７時間の固有半減期で崩壊する。
【００３３】
２．Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は、因子ＨおよびＩによる調節を受ける。これに対してＣＶＦ，ＢｂおよびＣＶＦは、これらの２つのタンパク質の調節作用に対して完全に耐性である。
【００３４】
３．補体活性化中に産生されたＣ３ｂ，Ｂｂ酵素は表面に結合している。これに対してＣＶＦ，Ｂｂ酵素は流体相酵素である（ｉＣ３，Ｂｂと同様）。
【００３５】
４．Ｃ３ｂ，ＢｂとＣＶＦ，Ｂｂとの別の機能上の相違は、Ｃ５コンバターゼ活性にある。Ｃ５をＣ５コンバターゼによって開裂させるために、Ｃ３ｂまたはＣＶＦのどちらかに結合させる必要がある。しかしながらＣ３ｂ，Ｂｂ酵素によってＣ５開裂を発生させるために、Ｃ５をＣ３ｂ，Ｂｂ酵素の一部であるＣ３ｂ分子とは異なるＣ３ｂ分子に結合させる必要がある。これに対して、Ｃ５は、Ｂｂ触媒サブユニットを保持する同じＣＶＦ分子によって結合される。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素がＣ５を結合するこの特性はおそらく、流体相Ｃ５コンバターゼ活性を示すその能力の理由であり、これに対して、Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素のＣ５コンバターゼ活性は粒子の表面に制限される。
【００３６】
５．両方の活性が、Ｃ３加水分解のその動力学においてやや異なることが示されている。ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍大きい。
【００３７】
機能上の結果に関して、ＣＶＦ，ＢｂとＣ３ｂ，Ｂｂの間の２つの最も重大な相違は、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素の固有安定性および調節タンパク質因子ＨおよびＩに対するその耐性である。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素が形成されると、それは引き続きＣ３およびＣ５を活性化して、補体消費を引き起こす。ＣＶＦを実験動物に、その血漿補体を枯渇させるために安全に投与できることが３０年間に渡って証明されて以来、ＣＶＦは、免疫反応、宿主防御、および疾患の病因における補体の各種生体機能を、正常な（補体充足）動物をＣＶＦ処置（補体枯渇）動物と比較することによって、試験する重要な調査ツールとなってきた。
【００３８】
（Ｃ３／ＣＶＦ誘導体）
ＣＶＦは、次に枯渇につながる徹底的な活性化の機構を通じて作用する、補体インヒビタである。実際に、ＣＶＦは、他の薬物の抗補体活性を評価する標準として頻繁に使用される。ＣＶＦはこの強力な抗補体活性を示すが、その免疫原性のためにヒト用途には適していない。この理由で、ＣＶＦとＣ３との広範囲に渡る構造類似性を利用することによって実質的に非免疫原性ＣＶＦを調製することと、ＣＶＦ分子の機能的に重要な領域をヒトＣ３内へ組換え手段で置換することによってＣＶＦの所望の補体枯渇機能を備えたヒトＣ３誘導体を産生することが望ましい。このことは、本明細書で述べるように実施されている。
【００３９】
多数のヒトＣ３誘導体が生成および／または設計されており、Ｃ３配列の部分が相同性ＣＶＦ配列、主にＣＶＦベータ鎖内の配列によって置換された。ＣＶＦおよびＣ３は、真核発現系にて組換え手段によってうまく発現されている。Ｃ３のアルファ鎖領域、そして好ましくは、ＣＶＦ配列全体に集合的に及ぶ、ＣＶＦとコブラＣ３との間の５つのハイブリッドタンパク質が作製された（ヒトＣ３よりも、ＣＶＦに対する高い類似性のために）、以前の研究に基づいて、この鎖のＣ末端部分が選択された（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：１９９（２００３））。他の系列の研究は、ＣＶＦタンパク質の制限されたタンパク質分解を含んでいた（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，Ｓｕｐｐｌ．１，１１３（１９９３）Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１７４，３４４）。この以前の研究結果を使用して、アミノ酸残基１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、および１３４８−１６６３それぞれをＣＶＦからの相同配列で置換することによって、３つの好ましいヒトＣ３誘導体を作製した。Ｃ３誘導体は第１のアミノ酸残基によって指定され、最後のアミノ酸残基が示されない場合、それは１６６３であると理解される。ＣＶＦ挿入の終点がタンパク質のＣ末端より前である場合、それは位置によって指定される（たとえば：ＨＣ３−１５５０／１６１７）。アミノ酸残基１３４８−１６６３を置換することによって作製されたＣ３誘導体は、以前に１３２５−１６６３と呼ばれたが、置換マッピングが次に１３２５ではなく１３４８であったことを示していた。３つのヒトＣ３誘導体は、ＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１３４８と呼ばれる。３つのヒトＣ３誘導体は、所望のＣＶＦ活性を示すことが明らかにされた：３つのタンパク質はすべて、活性Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成することができる。これは、３つのタンパク質が因子Ｂの活性化を補助する能力によって、そして３つの得られたコンバターゼがＣ３を開裂する能力によって証明される。３つのタンパク質はすべて安定なコンバターゼを形成するが、固有安定性および少なくとも１つ（ＨＣ３−１５５０）は、ＣＶＦと比べてより低い固有安定性を示す。最初に試験した３つのタンパク質のうち２つ（ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８）が実際にモルモット血清から補体除去できたという観察は予想されていなかったが、この活性はＣＶＦの活性よりも明らかに低く、５つのタンパク質のうち４つがヒト血清中の補体を枯渇させることができ、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６は、ＣＶＦとほぼ同様に補体ヒト血清から補体を除去することができた。ＨＣ３−１５５０／１６１７は、ヒト血清中の補体を枯渇できなかった。補体を少なくとも部分的に枯渇する能力は、Ｃ３誘導体が安定なコンバターゼを形成するだけでなく、調節タンパク質因子Ｈおよび／またはＩに対して少なくとも部分的に耐性であることを示しており、それによりＣＶＦ様活性であることを示す。ヒトＣ３誘導体ＨＣ３−１５５０は、アミノ酸残基の４％未満がヒトＣ３とは異なり、その予測された免疫原性をＣＶＦと比較して大幅に低減または除去している。各種のＣ３ハイブリッドは、処置される疾患に応じて、その各種の特徴に基づいて好ましいことがある。たとえば慢性疾患の処置では、目的は、極めて低い免疫原性を有するか、免疫原性を持たず、高いコンバターゼ安定性を有するＣ３ハイブリッドを提供して、慢性疾患に罹患している患者の体内でその持続を促進することである。そのような状況では、他方の特徴、たとえばコンバターゼの活性は、比較的あまり重要でない。これに対して、補体関連再潅流傷害を回避するための処置では、高いコンバターゼ活性がコンバターゼ安定性よりも大きく重要である。それゆえそれぞれ特定の一連の特性を有する各種ハイブリッドの多様性により、補体活性化および／または補体枯渇によって処置できる所与の状態の処置のための好ましいハイブリッドの選択が可能となる。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、以下のＣＶＦまたはＣＶＦ，Ｂｂ品質：１．５分間より長い固有半減期で崩壊、因子Ｈおよび／またはＩの調節作用に対する耐性の上昇、流体相Ｃ３コンバターゼおよび流体相Ｃ５コンバターゼ活性の少なくとも１つを示す修飾補体Ｃ３タンパク質に関する。これらの要因に加え、触媒効率がＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍であるため、一部の実施形態において触媒効率をＣ３ｂ，Ｂｂと比べて低下させることができる。他の実施形態において、触媒効率はＣ３ｂ，Ｂｂと比較して上昇または下降されない。多くの好ましいＣ３ハイブリッドがほとんどまたは全く免疫原性を持たないが、それにもかかわらず多くの用途に適切である他の実施形態は、一部の場合では検出可能〜中程度の免疫原性を示すことがある。
【００４１】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質によって形成されたコンバターゼの固有半減期は、１．５分間超、好ましくは１０分間超である。さらなる実施形態において、固有半減期は一般に、これに限定されるわけではないが、約：２分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、９０分間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間および７時間またはそれ以上を含む、ＣＶＦ含有コンバターゼ（７時間以上）およびＣ３（１．５分間）の間に収まりうる。短いコンバターゼ固有半減期および／または短い血漿半減期を持つ修飾Ｃ３タンパク質は、一部の用途に有用であるが、長いコンバターゼ固有半減期および／または長い血漿半減期を持つＣ３タンパク質は別の用途に有用であろう。
【００４２】
さらなる実施形態において、Ｃ３ハイブリッドの因子Ｈおよび／またはＩに対する耐性は、未修飾Ｃ３の耐性よりも大きく、一部の実施形態においてＣＶＦの耐性と同等である。しかしながら一部の実施形態において、因子Ｈおよび／またはＩに対する耐性を達成するために、分子の他の部分でのさらなる修飾が必要となることがある。
【００４３】
本明細書で述べる多くの実施形態はＣ３の１つまたは複数の別個の領域の、ＣＶＦの対応する領域による特異的置換に関するが、他の実施形態は、ＣＶＦ配列に実質的に関連しているが、同一ではない配列を利用した置換を含む。すなわち置換のために選択したＣＶＦ領域内に、選択したＣＶＦ領域の所望の機構または機能を損失せずに１つまたは複数のアミノ酸に対する変化を生じさせることができる位置があり、一部の場合ではそのような変化は、機構または機能の向上を付与できる。そのような変化はすべて、本発明の実施形態と見なされる。
【００４４】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を含有するコンバターゼの触媒活性は、一部の実施形態においてＣＶＦを含有するコンバターゼの触媒活性の少なくとも５０％であり、未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの触媒活性よりも大きい。さらなる実施形態において、触媒活性は、ＣＶＦコンバターゼの触媒活性の６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。両方の酵素が、Ｃ３加水分解のその動力学で多少異なることが示されている。それゆえ多くの実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼは、２つの間に収まる、または未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの活性を超える触媒活性を有することができる。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼのそのような活性は、ＣＶＦを含有するコンバターゼの活性の、これに限定されるわけではないが２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１１０％、１３５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％およびそれ以上を含む、１０％〜１０００％またはそれ以上でありうる。
【００４５】
ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、Ｃ３を開裂させるときに、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍である。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの触媒効率は一部の実施形態においてＣＶＦを含有するコンバターゼの少なくとも５０％であり、未修飾Ｃ３ｂを含有するコンバターゼの触媒効率よりも大きいことがある。両方の酵素は、Ｃ３加水分解のその動力学でいくらか異なることが示されている。それゆえ多くの実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼは、２つの間に収まる、または未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの活性を超える触媒効率を有することができる。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼのそのような効率は、ＣＶＦを含有するコンバターゼの効率の、これに限定されるわけではないが２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１１０％、１３５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％およびそれ以上を含む、１０％〜１０００％またはそれ以上でありうる。
【００４６】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質のＣ５開裂活性は上昇する。Ｃ５開裂活性は、ＣＶＦまたはＣ３の活性の、これに限定されるわけではないが：１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、および３７５％を含む、約１０％〜４００％でありうる。
【００４７】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質の因子Ｂへの結合および／または因子Ｄによるその次の開裂を低下させることができる。しかしながら触媒活性および補体枯渇活性の少なくとも機能的量が残存している限り、修飾Ｃ３タンパク質は有用である。
【００４８】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を有するコンバターゼは、天然ＣＶＦを含有するコンバターゼの実質的に同じ補体活性化活性を示す。「天然ＣＶＦの実質的に同じ補体活性化活性を示すという用語は、本発明のＣ３誘導体が、Ｃｏｃｈｒａｎらの方法（参考としてその全体が本明細書に援用される、（１９７０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５（１）），５５−６９）によって測定されたように、天然ＣＶＦの補体活性化活性のレベルの０．１〜９７％、好ましくは５０〜９７％、好ましくは８０〜９７％を有することを意味する。
【００４９】
一部の実施形態において、修飾補体Ｃ３タンパク質は、Ｃ末端領域の一部または全部がＣＶＦの対応する領域によって置換されているＣ３分子である。一部の実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分のみがＣＶＦの対応する領域によって置換される。一部の実施形態において、これに限定されるわけではないが：３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１７５、１８０、１９０、２００、２５０、２７５、３００、３５０、３７５、４００、４５０、４７５、５００、５５０、５７５、６００、６５０、６７５、７００、７５０、７７５、８００、８５０、８７５、９００、９５０、９７５、１０００個の領域を含む、これに限定されるわけではないが２０〜約１０００個のアミノ酸の領域を含む、アミノ酸７００−１６６３の一部またはすべてが置換される。一部の実施形態において、Ｃ３のベータ鎖は無処置であり、すなわち天然Ｃ３と同じである。しかしながら一部の実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖における置換に加えて、上昇した安定性などの機能を提供するために他の置換を行うことができる（たとえば因子Ｈ結合および因子Ｉ開裂に関連する部位を変異または置換することができる）。特異的置換は、これに限定されるわけではないが、アミノ酸１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４７０−１６６３、１３４８−１６１７、１４７０−１６１７、１２６４−１３２４、１３４８−１３８６、７４９−７８４、８７４−９２１、１４９６−１６６３、１４９６−１６１７および９３６−９７０を含む。一部の実施形態において、これらの範囲でのなお小規模な置換は、所望のＣＶＦ機能または品質を持つＣ３を生じさせるより小規模な領域に一致できる。
【００５０】
好ましい実施形態の免疫原性は、Ｃ３の免疫原性と比較して、低いか、または非存在のままである。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は実質的に非免疫原性である。実質的に非免疫原性とは、タンパク質がヒト患者に注入されたときに補体活性化機能をなお示せることを意味する。さらに修飾Ｃ３タンパク質は、Ｃ３と同様に非免疫原性でありうるか、またはこれに限定されるわけではないが、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％を含む、約７５％非免疫原性〜約１００％非免疫原性でありうる。
【００５１】
（全身または局所処置の方法）
本明細書で開示した方法によって生成された修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質は、以下のように補体を局所的または全身的に枯渇させるために使用できる：
局所処置は、所望の効果に応じて、補体の枯渇または補体の活性化の結果を生じさせるために多数の方法で実施できる。１つの実施形態において、局所枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質を臓器、組織、空洞、または皮内に局所的に投与したときに作用する。これはその範囲の補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。局所枯渇または活性化も、選択した部位への修飾Ｃ３タンパク質の間欠流または定常流を生じさせるインスリン型ポンプを使用して作用しうる。あるいは補体の局所活性化は、修飾Ｃ３に化学的に付着したときに、特異的組織、疾患、または罹患細胞に局在化して、その部位の補体の連続活性化を引き起こすことができる、特異的モノクローナル抗体を利用する。他の実施形態において、抗体は組換えＤＮＡ技術によって修飾Ｃ３タンパク質に付着できる。
【００５２】
全身枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が全身的に、たとえば静脈内または腹腔内に投与されたときに作用する。これは全身的に補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。この方法は、再潅流傷害、冠状動脈心臓手術、移植または全身性疾患に、特に再発または間欠的活性の間に使用できる。これは本明細書に与える実施例でさらに議論する。
【００５３】
このような各場合および具体的な疾患状態において使用される修飾ヒトＣ３タンパク質の最も好都合な品質の多くは、かなり変化しうる。たとえば補体の即時であるが一時的な除去が望ましい場合、より短い血漿半減期および／または安定性を有するが、高い補体活性化活性（高いＣ３／Ｃ５コンバターゼ活性）を持つ修飾タンパク質が最も適している。慢性疾患を処置する場合、長い血漿半減期および／または安定性ならびに低いまたは停滞した活性が最も適している。
【００５４】
（コンバターゼ活性／機能）
本明細書で修飾Ｃ３タンパク質のための最善の用途を産生および解析する場合、これに限定されるわけではないが以下を含む、多数の機能および活性をそのような解析に使用できる：
因子Ｂに対する親和性−修飾Ｃ３タンパク質が因子Ｂの活性化（ＢａおよびＢｂへの開裂）を補助する効率の相違は、検出可能であり、利用できる。因子Ｂ活性化の補助を開始する、因子Ｂに対する単なる親和性を超えた複数の因子があるが、いったんコンバターゼが形成されると、一般に最も重要である次なる主な特性は、安定性、ＨおよびＩによる調節、そしてＣ３およびＣ５の開裂の活性である。
【００５５】
安定性−Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素およびＣＶＦ，Ｂｂ酵素のどちらも、酵素活性を破壊する各サブユニットへの自発的な崩壊解離を示す。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に短寿命であり、３７℃にて１．５分間の固有半減期で崩壊するのに対して、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素は何桁もより安定であり、約７時間の固有半減期で崩壊する。
【００５６】
因子Ｈおよび／またはＩによる調節−Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は、因子ＨおよびＩによる調節を受ける。これに対してＣＶＦ，ＢｂおよびＣＶＦは、これらの２つのタンパク質の調節作用に対して完全に耐性である。
【００５７】
開裂Ｃ３の活性−どちらの酵素も、Ｃ３加水分解のその動力学においてやや異なることが示されている。ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍大きい。
【００５８】
免疫原性−ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３はＣＶＦと比較して、著しく低下した免疫原性、または免疫原性の非存在すら示す。加えて、ヒトとは遠くかけ離れた種ではよくあるように、アルファ結合ガラクトースをＣＶＦオリゴサッカライド鎖の端部に移動するトランスフェラーゼ酵素が、コブラで生成される。ヒトはこのトランスフェラーゼを生成しないため、アルファ結合ガラクトース残基は、非自己として見られ、高い免疫原性である。それゆえ、ＣＶＦで生成された特異的ＣＨＯ部分を認識する抗アルファｇａｌ抗体が生成される。ヒトＣ３およびＣＶＦはその位置の５２％における同一性を欠いており、炭水化物の相違はなお顕著である。それゆえ好ましい修飾Ｃ３タンパク質は、１０％未満、そして一部の実施形態においては約４％の、ＣＶＦのアミノ酸によって置換されたＣ３アミノ酸を有し、コブラ由来炭水化物構造（グリカン上の特異的にアルファ結合されたガラクトース）も持たないため、本発明のＣ３ハイブリッドは、著しく低い免疫原性である。一部の実施形態において、好ましい実施形態のＣ３ハイブリッドは、ＣＶＦよりも著しく免疫原性が低い。他の実施形態において、好ましい実施形態のＣ３ハイブリッドは、ＣＶＦよりも少なくとも５０％低い免疫原性である。一部の実施形態において、組換えタンパク質は昆虫または哺乳類細胞系のどちらかで生成され、それは単純な（ｓｉｍｐｌｅ）炭水化物部分、またはヒトに見出されるのと非常に類似した炭水化物部分のどちらかを生じるであろう。
【実施例】
【００５９】
ＣＶＦ配列の大部分がコブラＣ３の相同性部分によって置換された、５つのＣＶＦ／コブラＣ３機能喪失ハイブリッドタンパク質を生成した。これらのハイブリッドタンパク質の予備キャラクタリゼーションは、ＣＶＦのα鎖（Ｃ３のβ鎖）内のコブラＣ３配列による置換が血清補体活性を枯渇させる機能特性を変化させるように見えないことを示したのに対して、β鎖およびγ鎖の部分の置換は大きな効果を有していた。ＣＶＦ残基９７８〜１６４２がコブラＣ３配列によって置換されたハイブリッドタンパク質Ｈ４およびＨ５は、血清補体を枯渇させる能力の低下に加えて、バイスタンダー溶解（Ｃ５開裂の尺度）活性の著しい低下を示した。このことは、Ｃ３のアルファ鎖（ＣＶＦのβ鎖およびガンマ鎖に相当する）がＣＶＦおよびＣ３の活性間の相違の主要な部位であることを示唆した。実験による裏付けの別の系統は、ＣＶＦβ鎖のＣ末端部分がＣＶＦ機能にとって重要であることを強く示唆し、キモトリプシンによるＣＶＦの制限されたタンパク質分解の実験から生じている（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｇｒｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，Ｓｕｐｐ．１，３０）。それゆえヒトＣ３タンパク質の部分の、コブラ毒因子タンパク質（ＣＶＦ）の対応する部分による置換を有する、多数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質（Ｃ３）が生成または同定されている。これらの置換は、ＣＶＦ型機能を備えているが、ＣＶＦよりも実質的に低い免疫原性を備えたヒトＣ３タンパク質を生じる。これらのタンパク質の生成および試験を以下の実施例１〜３で述べる。これらのタンパク質の使用およびアッセイを実施例４〜１０に与える。
【００６０】
（実施例１）
ヒト補体Ｃ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質の生成
ヒトＣ３配列の、ＣＶＦ特異的機能に関する重要な構造上の特徴を示すＣＶＦ配列による置換は、ＣＶＦ様機能を備えたＣ３誘導体の生成を可能にする。それゆえ本発明の実施形態は、補体活性化が病因の一部である臨床状況で補体を枯渇させる新規な治療剤として使用するための安定なコンバターゼを形成することによって、補体を枯渇させるＣＶＦ特異的機能を示すヒトＣ３誘導体の産生に関する。ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３分子が免疫原性の著しい低下または非存在さえ示せることが明らかである。
【００６１】
表１のヒトＣ３分子は、ＣＶＦ機能を備えたヒトＣ３誘導体を作製するために、特異的ＣＶＦ配列を含有するように組換えられている。本発明の一部の実施形態は、これらの範囲により小さい置換を供給して、比較的安定なコンバターゼを形成できる、そして免疫原性をほとんどまたは全く示さない修飾Ｃ３タンパク質を生じる小さな領域を定義する。
【００６２】
（表１：ヒトＣ３／ＣＶＦクローンの例）
【００６３】
【表１】
ある修飾Ｃ３タンパク質（ハイブリッドタンパク質またはキメラとも呼ばれる）は、以下で述べる部位特異的変異によって生成した。簡単には、ヒトＣ３配列の小規模な部分をＣＶＦと置換する部位特異的変異のために、Ｈｏらの手順を使用した（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）”Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｇｅｎｅ，７７：５１−５９）。この方法では、２つのＰＣＲ反応を実施し、１つは所望の突然変異の部位から上流のどこかのフォワードプライマーを用いた。２つ目は、リバースプライマーが突然変異を含有していた。このラウンドの第２のＰＣＲは、所望の突然変異を含有するフォワードプライマーを有し、リバースプライマーは突然変異部位からの下流である。好ましくは少なくとも１つの特有の制限部位がこのステップによるＰＣＲ生成物にそれぞれ存在し、修飾ＤＮＡを元のクローンに戻すことが可能である。大量のテンプレートＤＮＡと、ＰＣＲプロセスによって導入された突然変異を最小限にするために少ない回数のサイクルを使用して、増幅を実施した。さらに詳細には、ＰＣＲの第１のラウンドでは、５’生成物の反応がテンプレートとしてヒトＣ３プラスミドを使用するのに対して、他方のＰＣＲはＣＶＦプラスミドを使用した。この場合では、中間の「突然変異」プライマーは、部分的にＣ３配列より成り、そして部分的にＣＶＦ配列より成り、２つの配列間で「ブリッジ」を提供する。
【００６４】
増幅の後、２つの生成物をゲル電気泳動によって精製して、ＱｉａｇｅｎからのＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キットを使用してゲルから単離した。次に断片を合せて、２つの断片をテンプレートとして、外部プライマーを増幅プライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を実施した。高濃度のテンプレートＤＮＡを使用して再びＰＣＲ反応を実施して、ＰＣＲによって発生する突然変異を最小限にするために２、３回のサイクルのみ循環させた。得られたＰＣＲ生成物を２つの独自の制限酵素によって切断し、アガロースゲルでサイズ精製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを使用して興味のある断片を単離した。次に断片を適切な酵素によって切断して、同じ酵素で切断したｐＢＳ−ＨｕＣ３またはｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）のどちらかへクローニングした。
【００６５】
第１のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１５５０は、位置１５５０からタンパク質のＣ末端までの相同性Ｃ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有した。第２のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１５０４は、位置１５０４からタンパク質のＣ末端までのヒトＣ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有するハイブリッドタンパク質をコードする。第３のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１３４８は、位置１３４８からタンパク質のＣ末端までの相同性Ｃ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有した。第１のプラスミドを調製するために、２つの初期ＰＣＲ反応を実施した。どちらのハイブリッドも、以下のＲＳＰＷＰＧＶＰＴＳＰＶＷＷＮＳＡＤＡ（配列番号：５）の一部または全部を有する約１９アミノ酸ベクターコード配列を有していた。Ｃ３遺伝子のクローニングの方法のために、クローニングベクターによってコードされたこれらのアミノ酸は、ヒトＣ３のＮ末端に対してＮ末端側であった。これらの余分のアミノ酸は、タンパク質の活性に影響しなかったため、それらは悪影響なしに除去できた。第１のプラスミドは、ｐＢＳ−ＨＣ３−２をテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−１（ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＣ−配列番号：６）、およびＨＣ３Ｈ５−２（ＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣ−配列番号：７）をプライマーとして使用して調製した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣ３Ｈ５−３（ＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧ−配列番号：８）およびＨｕＣ３Ｈ５−４（ＴＡＴＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＡＧＧＧ−配列番号：９）をプライマーとして使用した。どちらの反応もＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモサイクラーで、以下のプログラムを使用して実施した：９５℃で５分、続いて９５℃で３０秒を５サイクル、５８℃で３０秒（５０〜６５℃の勾配）、７２℃で１分、続いて９５℃で３０秒を２０サイクル、５７．５℃で３０秒（５５〜６０℃の勾配）、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分。２つの断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製し、ＨＣ３Ｈ５−１およびＨＣ３Ｈ５−２をプライマーとして、２つの１次ＰＣＲ生成物をテンプレートとして、第２のＰＣＲ反応で合せた。この反応で使用したサイクル条件は：９５℃で５分、続いて；９５℃で３０秒、５１℃で３０秒（４６〜５６℃の勾配）、および７２℃で１．５分を５サイクル、続いて；９５℃で３０秒、５７℃で３０秒（５２〜６２℃の勾配）、および７２℃で１．５分を２０サイクルであった。これには７２℃で１０分間のインキュベーションが続いた。ＰＣＲ断片は上述のように精製して、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩで切断し、ゲル精製して、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ単離キットを使用して単離した。この断片を同じ酵素によって切断したｐＢＳ−ＨｕＣ３−２内にクローニングして、得られたクローンを、ＥｃｏＲＩを用いた消化による正しい断片の挿入についてスクリーニングした。正しいＥｃｏＲＩ消化パターンを持つクローンはすべて配列決定して、ＰＣＲ誘発突然変異が挿入されていないことを確認した。予想配列を用いた１つのクローン（ｐＨＣ３−１５５０）の大規模な調製を実施して、インサートをＨｉｎｄＩＩＩ（およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって修復された端部）およびＮｏｔＩによる消化によって切除した。断片をゲル電気泳動によって精製し、上述のようにゲルから単離して、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで切断したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクター、ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。この構築物からハイブリッドタンパク質の発現を得る試みは、タンパク質の非常に低い収率をもたらした。この理由で、新しい独自のＡｆｅＩ部位に挿入する間に、ｐＨＣ３−１５５０から除去されたヒトＣ３シグナル配列を有する構築物が作製された。これを行うために、ｐＨＣ３−１５５０を以下の２つのプライマー：ＨＣ３ＳｉｇＲｅｍＦ；ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣ（配列番号：１０、およびＨＣ３ＳｉｇＲｅｍＲ：ＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＣ（配列番号：１１）を用いて増幅した。増幅後、断片を上述のように精製して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで切断した。１５０ｂｐバンドをゲル単離して、同じ酵素で切断したｐＨＣ３−１５５０内にクローニングした。トランスフォーマントからのＤＮＡは、ＡｆｅＩを用いた切断によってスクリーンングして、すべての陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドをｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）と呼んだ。
【００６６】
インサートは、ＡｆｅＩ、ＤｒａＩ（プラスミドを断片化するため）、およびＮｏｔＩを用いた消化によってプラスミドから切除した。消化はゲル上で実施して、５ｋｂ断片を上述のように単離した。次にそれをＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩによって消化したｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内へ結合した。得られたプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０と読んだ。
【００６７】
第２のハイブリッドタンパク質を生成するためのプラスミド、ＨＣ３−１５０４を以下のように同様の方法で生成した。２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初にｐＢＳ−ＨｕＣ３−２をテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−３−Ｆ１（ＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧ−配列番号：１２）およびＨＣ３Ｈ５−３−Ｒ１（ＣＧＴＴＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣ−配列番号：１３）をプライマーとして使用した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣＣ３Ｈ５−３−Ｆ２（ＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−配列番号：１４）、およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２（ＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧ−配列番号：１５）をプライマーとして使用した。得られた２つのＰＣＲ生成物を、ＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用してＰＣＲ反応で合せた。第２のＰＣＲ反応の後、生成物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製し、次にＮｓｐＶを用いて切断して、同じ酵素で切断した、そしてコウシ小腸アルカリホスファターゼも用いて処理したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたクローンをＥｃｏＲＩで切断して、インサートの向きを決定し、ＰＣＲ誘発修飾が存在しないことを確認するために配列決定した。得られたプラスミドをｐＨＣ３−１５０４と呼んだ。次にこのプラスミドからのインサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５０４と呼んだ。
【００６８】
第３の構築物の生成のためのプラスミド、ＨＣ３−１３４８を、ＨＣ３−１５０４に使用したのと同様の方式で構築した。唯一の相違は、２つの突然変異プライマーがＨｕＣ３Ｈ５−５−１Ｒ（ＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣ−配列番号：１６）およびＨｕＣ３Ｈ５−５−２Ｆ（ＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＣＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣ−配列番号：１７）であったことである。１次ＰＣＲ反応では、使用したプライマーはＨｕＣ３Ｈ５−３−１ＦおよびＨｕＣ３Ｈ５−５−１Ｒであり、テンプレートはｐＢＳ−ＨｕＣ３−２であり、これに対して第２の１次ＰＣＲ反応に使用したプライマーはＨｕＣ３Ｈ５−５−２ＦおよびＨｕＣ３Ｈ５−３−２Ｒであり、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして使用した。１次ＰＣＲの後、２つの断片を精製して、ｐＨＣ３−１５０４の構築で述べたように２次ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。２次ＰＣＲ反応生成物を精製して、ＮｓｐＶで切断し、ｐＨＣ３−１５５０内にクローニングして、配列を確認し、インサートを上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ）内にクローニングした。
【００６９】
第４のハイブリッドタンパク質、ＨＣ３−１４９６の生成のためのプラスミドを、以下のような同様の方式で生成した。２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初にｐＢＳ−ＨｕＣ３−２をテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−３−Ｆ１（ＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧ−配列番号：１２）およびＨＣ３Ｈ５−４−Ｒ１ ＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ（配列番号：１８）をプライマーとして使用した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣＣ３Ｈ５−４−Ｆ２ ＣＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣ（配列番号：１９）、およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２（ＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧ−配列番号：２０）をプライマーとして使用した。得られた２つのＰＣＲ生成物を、ＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用してＰＣＲ反応で合せた。第２のＰＣＲ反応の後、生成物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製した。次にそれをＮｓｐＶで切断して、同じ酵素で切断してコウシ小腸アルカリホスファターゼ処理したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたプラスミドをｐＨＣ３−１４９６と呼んだ。次にこのプラスミドからのインサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１４９６と呼んだ。
【００７０】
ＨＣ３−１５５０のＣ末端４６アミノ酸残基がヒトＣ３配列によって置換された第５のハイブリッドタンパク質、ＨＣ３−１５５０／１６１７の生成のためのプラスミドを以下で説明する。再び２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初に以下の２つのプライマー；ＨｕＣ３Ｈ５−Ｆ１ ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＣ（配列番号：２１）、およびＨｕＣ３Ｈ５−２Ｒ１、ＣＣＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号：２２）を使用して、ｐＨＣ３−１５５０を増幅した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして、ＨｕＣ３Ｈ５−２Ｆ２（ＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＧ−配列番号：２３）およびＨｕＣ３Ｈ５−２−Ｒ２（ＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧ−配列番号：２４）をプライマーとして使用して実施した。第１のＰＣＲの後、ＨｕＣ３Ｈ５−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−２−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用して、断片を第２のＰＣＲ反応で合せた。このＰＣＲの後、増幅断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムを使用して生成し、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩで切断して、同じ酵素で切断したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたプラスミドを配列決定して正しい配列を確認した。それをｐＨＣ３−１５５０／１６１７と呼んだ。インサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内へクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０／１６１７と呼んだ。
【００７１】
一部の場合では、ヒトＣ３の部分を１を超える部位でＣＶＦ配列とさらに交換して、本明細書で示した目的の１つまたは複数で有用な修飾Ｃ３を産生した。それゆえＣＶＦ特異的配列が１を超える領域に挿入される、または既知の領域が各種の手段によって変異誘発される修飾Ｃ３タンパク質が産生される。たとえば因子Ｂを用いた物理的に安定なコンバターゼの形成に必要な１個または複数の部位に加えて、ヒトＣ３の因子Ｉ開裂部位を変化させることも望ましい。ヒトＣ３の因子Ｉ耐性ミュータントは以前に、Ｆｅｃｋｅらによって１９９８年にうまく説明されている（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｆｅｃｋｅ，Ｗ．，Ｆａｒｒｉｅｓ，Ｔ．Ｃ．，Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｌ．Ｇ．，Ｎａｐｐｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５：２９−３４）。たとえば特異的ＣＶＦ機能に必要な選択配列の置換により、ＣＶＦ機能の特異的なサブセットがそれぞれ存在または除去された新規なＣ３誘導体を組み換えることができる（たとえば安定なＣ３コンバターゼを形成するが、Ｃ５を開裂しないＣ３誘導体またはＣＶＦ誘導体）。Ｃ５を活性化しない修飾Ｃ３分子は、炎症誘発性Ｃ５ａアナフィラトキシンの産生を防止するため、療法のための特別の利点を有することがある。
【００７２】
（実施例２）
修飾ヒトＣ３タンパク質の発現
タンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞系において、タンパク質分泌のためのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｂｉｐシグナル配列を使用して生成した。簡単には、プラスミドｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０、ｐＭＢ／ＨＣ３−１５０４、ｐＭＢ／ＨＣ３−１４９６、ｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０／１６１７、およびｐＭＢ／ＨＣ３−１３４８をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞内に、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃｈｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９８７） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７（８），２７４５−２７５２）のリン酸カルシウム法を使用して形質移入した。Ｓ２細胞は、発現プラスミドとｐＣｏＢｌａｓｔの混合物を１９：１（ｗ：ｗ）の比で使用して形質移入した。形質移入後、ブラストサイジン（２５μｇ／ｍＬ）を使用して、両方のプラスミドを含有する細胞を選択した。発現では、形質移入細胞の培養物１リットルを無血清培地（Ｈｉ−ＦｉｖｅおよびＬ−グルタミン）で、ブラストサイジンの非存在下で培養した。細胞が５ｘ１０６細胞／ｍＬの密度に達したとき、最終濃度２５μＭまでのＣｕＳＯ４の添加によって、組換えタンパク質の生成を誘発した。培養物に４〜５日に渡って組換えタンパク質を発現させた。次にＡＮＸ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｈ−３００、およびＣＭ−ＦＦクロマトグラフィーの併用により、培地からハイブリッドタンパク質を精製した。
【００７３】
Ｃ３遺伝子のクローニングの方法のために、クローニングベクターによってコードされた、ヒトＣ３のＮ末端に対してＮ末端側である複数のアミノ酸（約１９）がある。これらの余分なアミノ酸は、タンパク質の活性に影響を及ぼさないため、悪影響なしに除去することができる。一部の場合では、最終構築物を発現ベクター内にクローニングするために必要な制限部位のアーチファクトである、少なくとも２つのアミノ酸があることが好ましい。各種の実施形態において、ヒトＣ３の未変性シグナル配列はもちろんのこと、新生ポリペプチドの小胞体への進入を指示するのに有効な他の任意のシグナル配列を含む、各種のシグナル配列を使用できる。
【００７４】
使用できる他の発現系は、これに限定されるわけではないが：Ｓｆ９またはＨｉＦｉｖｅ細胞のバキュロウィルス感染（他の昆虫発現系）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞（哺乳類発現系）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨａｎｓｅｌｕｌａ酵母発現系を含む各種の酵母発現系を含む。
【００７５】
（実施例３）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の活性測定の結果
精製した修飾ヒトＣ３タンパク質ハイブリッドに、以下のように多数の機能分析を受けさせた。
【００７６】
補体枯渇：
本アッセイは、タンパク質がヒト（または他の）血清中の補体を枯渇する能力を測定する。アッセイは２ステップで実施した。第１のステップでは、興味のあるタンパク質を通常は連続希釈によって、緩衝液中で所望の濃度まで希釈した（通例、ナノグラム／マイクロリットル未満から約３２０ｎｇ／マイクロリットルまたはアッセイで使用する１０マイクロリットル中３．２μｇ）。次に希釈したタンパク質の分割量１０μＬを未希釈血清と混合する。混合物を３７℃で３時間インキュベートして、Ｃ３コンバターゼを形成することによってタンパク質に補体を活性化させた。形成されたコンバターゼは次に血清のＣ３を活性化できた。次に、残っている補体活性の量を測定するために、血清を希釈して、血清中に存在するときに補体によって容易に溶解される抗体感作ヒツジ赤血球と混合した。この反応を３０分間進行させて、混合物を冷緩衝液中で希釈することによって停止させた。細胞を遠心分離にかけ、放出されたヘモグロビンを測定することによって、溶解細胞を定量した。結果を図４および図９に示す。
【００７７】
予想された通り、非常に少量のＣＶＦがヒト血清中の補体を完全に枯渇することができた。タンパク質ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６のどちらかの８００ｎｇが、ヒト血清１０μＬを完全に枯渇することができた。他のハイブリッドタンパク質はより活性が低く、補体のヒト血清１０μＬを部分的に枯渇させるためにタンパク質約３〜４μｇを必要とした。１つのハイブリッドタンパク質ＨＣ３−１５５０／１６１７は明らかに、試験した濃度では補体を枯渇することができなかった。
【００７８】
タンパク質の２つ（ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８）が実際にモルモット血清中の補体を枯渇させることができなかったという観察は予想されなかったが、この活性はＣＶＦの活性よりも明らかに低かった。特に、好ましい実施形態ＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１５０４、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１３４８はすべて、ヒト血清中の補体を枯渇することができた。
【００７９】
因子Ｂ活性化アッセイ
これは、ハイブリッドタンパク質が因子Ｂを活性化して、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するアッセイであった。コンバターゼ形成は、因子ＢのＢｂおよびＢａへの開裂の機能として測定した。アッセイでは、精製したハイブリッドタンパク質は、３倍過剰の因子Ｂおよび因子Ｄ（すべて高度に精製）によって、３７℃にてマグネシウムの存在下でインキュベートした。各種の時間にて、反応物の分割量を取り出し、マグネシウムをキレートするＥＤＴＡを添加することによって反応を停止させた。反応生成物を非還元性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流して、タンパク質はクマシーブルーで染色された。変換された因子Ｂの量は、ゲルを専用コンピュータプログラム内にスキャンして、因子ＢおよびＢｂバンド内のタンパク質の量を測定することによって定量した。
【００８０】
図５および１０の結果は、因子Ｂが２つの理由で、ヒトＣ３の存在下で非常に迅速に活性化されたことを示す。ヒトＣ３は、因子Ｂを非常に迅速に結合することができ、これにより因子Ｄによる開裂が可能になる。しかしながら得られたコンバターゼは非常に不安定であり、迅速に分解して、さらに因子Ｂを結合するためにＣ３ｂを利用できるようにする。ＣＶＦの存在下での反応ははるかに低速であり、これは因子Ｂに対するＣＶＦのより低い親和性、およびＣＶＦ含有コンバターゼのより高い安定性の結果であった。ＨＣ３−１５０４またはＨＣ３−１４９６の存在下での因子Ｂの変換は、ＣＶＦときわめて似ている。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３ １５５０／１６１７は、因子ＢをＣＶＦよりもはるかに迅速に、しかしＣ３ｂよりも低速に変換することができた。これはおそらく、コンバターゼがＣＶＦ含有酵素よりも安定でないが、Ｃ３ｂ含有コンバターゼよりも安定であることの結果である。加えてＨＣ３−１５５０による因子Ｂの初期結合は、ＣＶＦによる結合よりもはるかに迅速であると思われる。最後に、ＨＣ３−１３４８は、因子Ｂの開裂を、議論した他のタンパク質よりも巧みに補助しない。これはおそらく、得られたコンバターゼＣ３ｂ含有酵素よりも安定であることと、因子Ｂの初期結合がより迅速でないことの組合せである。
【００８１】
Ｃ３コンバターゼ活性アッセイ
本アッセイは、Ｃ３ａペプチドを開裂させることによって、ハイブリッドタンパク質を含有するＣ３／Ｃ５コンバターゼがヒトＣ３を活性化する活性を測定する。このアッセイを実施するために、コンバターゼを上述のように形成して、反応をＥＤＴＡの添加によって停止させた。次にコンバターゼをヒトＣ３と混合して、反応物を３７℃にてインキュベートした。指示した時間に分割量を取り出して、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含有するゲル装填緩衝液と混合して反応を停止させた。ＳＤＳはタンパク質を変性させて、β−メルカプトエタノールは、タンパク質中のシステイン間のジスルフィド結合を還元する。還元条件下での電気泳動の後、ゲルをクマシーブルー染料で染色して、Ｃ３α鎖およびＣ３α’鎖の相対量を上述のように定量した。各反応で同量のコンバターゼを使用するように注意した。
【００８２】
図６および図１１は、このアッセイでＣＶＦおよびＨＣ３−１５５０の両者がヒトＣ３をほぼ同じ速度で変換できることを示している。ＨＣ３−１５０４は、ＣＶＦよりも著しく低速であるが、１時間以内に存在するＣ３の量を完全に変換できる。ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６は、ＣＶＦよりも高速でＣ３を変換するように見えたが、ＨＣ３−１５５０／１６１７は、Ｃ３を最初は高速で変換して、約１０分後には低速になるように見えた。この現象をさらに調査するために、ＨＣ３−１５０４を除くすべてのタンパク質を使用して、Ｃ３変換アッセイを反復した。反応速度を低下させるために、存在するコンバターゼの量を５分の１に減少させた。これらの結果を図７および図１１のはめ込み図に示す。本アッセイでは、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６がＣＶＦよりも著しく効率的であるコンバターゼを形成することが明らかであった。ＨＣ３−１５５０／１６１７は、最初に活性であるが、約１０分後にはほとんど不活性になるように見えるコンバターゼを形成した。
【００８３】
Ｃ５変換アッセイ
Ｃ５変換活性のアッセイは本質的に、参考としてその全体が本明細書に援用されるＰｅｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０４（１−２），１５９−１７２によって述べられているように実施した。本アッセイでは、Ｃ５コンバターゼは合計３μｇのタンパク質を使用して上述のように形成した。コンバターゼ形成の後、最終濃度５ｍＭまでのＥＤＴＡの添加によって反応を停止させた。次にこの反応物５μＬを、ＰＢＳ中にＣ５７μｇを含有する反応物２５μＬに添加した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉゲル装填緩衝液７μＬの添加と、それに続く５分間の煮沸によって反応を停止させた。反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元することによって分離し、ゲルをクマシーブルー染料で染色して、Ｃ５α鎖およびＣ５α’鎖の相対量を上述のように定量した。現在のタンパク質のいずれも、活性Ｃ５コンバターゼを形成できなかった。
【００８４】
因子ＨおよびＩによるタンパク質の分解のアッセイを本質的に、ＯｒａｎおよびＩｓｅｎｍａｎ（参考としてその全体が本明細書に援用される、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（８），５１２０−５１３０）の方法に従って実施した。本方法では、各タンパク質１２μｇを因子Ｈ４．３μｇおよび因子Ｉ ０．３μｇによって、３７℃にて全量６０μＬでインキュベートした。指示した時間に、分割量１０μＬを取り出して、５μＬ ５ｘＬａｅｍｌｉゲル装填緩衝液の添加により反応を停止させた。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、還元条件下の４〜２０％勾配ゲルで分離した。これらのデータは、すべてのタンパク質が、因子Ｈの存在下で、因子Ｉによる消化に対して部分的に耐性であることを示している。同様のアッセイでは、Ｃ３ｂは０時点にてほぼ完全に消化された。
【００８５】
（実施例４）
補体を局所的または全身的に枯渇させる方法
本明細書で開示した方法によって生成した修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質を使用して、以下のように補体を局所的または全身的に枯渇させる：
局所枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が臓器、組織、空洞に、または経皮的に局所投与されるときに作用する。これはその範囲の補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。あるいは局所枯渇は、修飾Ｃ３に化学的に付着したときにそれを特定の組織、疾患部位、または感染細胞に局在化させて、その範囲の補体の連続的枯渇を引き起こす、特異的モノクローナル抗体を使用できる。
【００８６】
全身枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が全身的に、たとえば静脈内または腹腔内に投与されたときに作用する。これは全身的に補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。この方法は、再潅流傷害、冠状動脈心臓手術、移植および／または全身性疾患に、特に症状の再発または間欠的活性の間に使用できる。
【００８７】
このような各場合および具体的な疾患状態において使用される修飾ヒトＣ３タンパク質の最も好都合な品質の一部は、かなり変化しうる。たとえばたとえば補体の即時であるが一時的な除去が望ましい場合、より短い血漿半減期および／または安定性を有するが、高い補体活性化活性が好ましい。慢性疾患を処置する場合、低いまたは停滞した活性を伴っても、長い血漿半減期および／または高い安定性が好ましい。さらにＣ５を活性化しない修飾Ｃ３分子は、炎症誘発性Ｃ５ａアナフィラトキシンの産生を防止するため、ある治療にとって特に好都合でありうる。
【００８８】
（実施例５）
再潅流傷害の処置方法
再潅流傷害の例は、閉塞血管の再開後（たとえば心臓麻痺または虚血性卒中の後）の組織損傷、および移植臓器のレシピエントの血液による再潅流である。詰まった冠状動脈または臓器移植後の再潅流では、移植体に再潅流させる前に、または閉塞血管の開通前に多くの場合で補体を枯渇させることが望ましい。補体活性化を活性化する能力は、それが引き起こす組織損傷を回避できるため、組織損傷の唯一残存している主な源は、酸素欠乏である。通例、再潅流の間の補体活性化による組織損傷は、酸素欠乏による組織損傷の２倍大きい−すなわち組織損傷のほぼ２／３が補体活性化に起因するのに対して、１／３は酸素欠乏に起因する。それゆえ再潅流傷害は、本発明の実施形態で可能であるように、再潅流の前に補体を所望させることによって大幅に減少させることができる。この場合、最高活性コンバターゼを使用することと、高い用量を使用することが好ましい。コンバターゼの安定性は、慢性疾患に対するほど重要ではない。
【００８９】
一般論として、本発明のこれらの実施形態の方法は、修飾Ｃ３タンパク質の有効量を全身的に投与するステップと、補体の枯渇に十分な時間に渡って放置するステップと、次に手術を実施するステップとを含む。
【００９０】
（実施例６）
遺伝子治療の有効性および／または効率を上昇させる方法
本方法は、体内での有用なウィルスの生存の延長を補助するために、補体の枯渇に依存している。補体は遺伝子治療で使用したあるウィルスベクターの本体からの除去を補助することが見出されているため、遺伝子治療ベクターの投与前に循環する補体の量を減少させることが望ましい。このことは、使用されている遺伝子治療の種類に応じて局所的にまたは全身的に実施できる。
【００９１】
方法は、修飾Ｃ３タンパク質の有効量を全身的に、または遺伝子治療が投与されている局所範囲に投与するステップと、補体の枯渇のための時間に渡って放置するステップと、次に遺伝子治療を投与するステップとを含む。
【００９２】
（実施例７）
治療剤（たとえば化学治療剤）または診断剤の送達を向上させる方法
治療薬が投与される範囲への血流を増加させるために、修飾Ｃ３タンパク質は、選択した組織への親和性を持つモノクローナル抗体に化学的に結合される。本実施例では、修飾Ｃ３は、高い活性のＣ３／Ｃ５コンバターゼを形成するＣ３である。修飾Ｃ３／抗体は、組織へ標的化されて、領域に局所補体活性化を生じさせて、補体活性化のために血管透過性を引き起こす。新しい非活性化補体が標的に到着する血液によって連続的に供給されるため、血管透過性は、活性コンバターゼ／抗体複合体が標的に結合されている限り継続する。
【００９３】
肺癌の処置の間の本方法の使用では、肺特異的抗原を認識するモノクローナル抗体を使用して、修飾Ｃ３タンパク質−モノクローナル抗体ハイブリッドが肺癌患者に投与される。抗体は、肺組織に結合して、補体を局所的に活性化する。これは肺における血管透過性を向上させて、化学治療剤をより効率的および効果的に肺癌に作用させる。上述のように、本方法は補体の連続局所活性化を可能にして、それは血管透過性の持続的な局所上昇を可能にする。
【００９４】
（実施例８）
関節リウマチ、狼瘡、および他の自己免疫または免疫複合疾患を処置する方法
本方法は、関節リウマチの例を局所範囲における補体活性化から疼痛および炎症が発生する複数の状態の１つとして使用する。処置のために、修飾Ｃ３タンパク質が全身的または局所的に投与されて、補体を枯渇させることによって、補体反応／活性化を低下させる。これは疾患の症状および疾患の進行を低減させることができる。特に疾患症状の悪化の発現があるときには、補体系の活性の長期低下と組合せて間欠的枯渇を有することも有益でありうる。さらに本方法は、循環免疫複合体を伴う他の疾患、たとえば狼瘡および他の自己免疫疾患によって使用できる。
【００９５】
たとえば補体活性化自己抗体が生成され、体内の自分のタンパク質に対して向けられたとき、疾患効果は主に、補体活性化および組織損傷を引き起こす抗体の標的への結合はもちろんのこと、正常機能への他の干渉によるものである。重症筋無力症は、この種の疾患の例である。自己抗体は、神経が筋肉に接触する神経筋終板に結合する。補体は活性化されて、神経伝達物質を遮断して、麻痺を生じる。本発明の本実施形態の方法を利用すると、補体の全身枯渇は、連続的に、または疾患の悪化の間のどちらかで、症状およびその進行を著しく低減することができる。
【００９６】
（実施例９）
修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法
各種の修飾Ｃ３タンパク質は、各種の疾患、および処置方法に有用である。それゆえ本発明の実施形態の修飾Ｃ３タンパク質の機能品質を解析して、それに従ってそれらを使用することが有用である。以下の方法を、実施例２で生成された精製修飾Ｃ３タンパク質の機能を分析するために使用する。本明細書で述べる方法は、当業者に既知の他の方法と同様に使用できる。
【００９７】
コンバターゼ活性を決定するアッセイ。以下で触れる特異性アッセイに加えて、血清補体活性の枯渇およびバイスタンダー溶解の誘発に関する２つの溶血アッセイをスクリーニングに利用できる。
【００９８】
補体枯渇アッセイ。修飾Ｃ３タンパク質の抗補体（補体消費）活性を測定するために、少量のヒト血清をＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質によって、３時間またはそれより短い期間に渡り３７℃にて、タンパク質濃度５μｇ／ｍＬでインキュベートして、タンパク質に補体を枯渇させる。次に残存する補体溶血活性を感作ヒツジ赤血球を使用して、Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １１７：６３０−４）の方法を含む当業者に既知の方法を使用し、測定する。
【００９９】
バイスタンダー溶解アッセイ。バイスタンダー溶解アッセイは、３７℃の正常モルモット血清２０μＬを濃度５μｇ／ｍＬのＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質２０μＬおよびモルモット赤血球２０μＬ（５ｘ１０８／ｍＬ）と共にインキュベートすることによって実施する。ＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質は、赤血球の溶解を引き起こすＣ５の流体相活性化に関与する。それゆえ上澄み中のヘモグロビンの存在はＣ５活性化を示す。反応を３７℃で３０分間インキュベートして、冷緩衝液１ｍＬの添加によって停止させる。遠心分離の後、放出されたヘモグロビンを分光光度法で測定する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ，Ｃ．Ｗ．，ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｈ．Ｊ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７３（１），２０３−２２０）。
【０１００】
Ｃ３コンバターゼ形成／因子Ｂ活性化。因子ＢのＢａおよびＢｂへの開裂を検出するために、ハイブリッドタンパク質（１μＭにて）は、最長２４時間まで３倍モル過剰の因子Ｂおよび因子Ｄ０．５μＭの存在下で、ＭｇＣｌ２の存在下で３７℃にてインキュベートする。因子Ｂの消失および開裂生成物ＢａおよびＢｂの出現を監視するために、反応混合物を非還元条件下にて７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析する。必要な場合、次のウェスタンブロットを実施してＢａおよびＢｂ開裂断片を検出できる。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、コブラＣ３、ｉＣ３、ヒトＣ３、ｉＣ３、Ｃ３ｂ、およびＥＤＴＡを含みうる（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８２９２−９）。
【０１０１】
Ｃ３開裂活性。Ｃ３開裂活性を検査するために、Ｃ３コンバターゼは、「Ｃ３コンバターゼ形成／因子Ｂ活性化」を参照して、ハイブリッドタンパク質ならびにヒト因子Ｂおよび因子Ｄを使用して、本発明で述べたように予備形成する。コンバターゼ形成をＥＤＴＡの添加によって停止して、精製ヒトＣ３を添加する。反応混合物は、３７℃で１時間または他の任意の適切な期間に渡ってインキュベートする。分割量を取り、ただちに氷水浴に移して、さらなるＣ３活性化を停止させる。還元条件下で７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに反応生成物を流すことによって、Ｃ３α鎖の消失およびＣ３α’鎖の出現によってＣ３開裂を監視する。必要な場合、抗Ｃ３抗血清を用いた次のウェスタンブロットを実施する。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、ならびにヒトおよびコブラｉＣ３またはＣ３ｂを含む（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８２９２−９）。
【０１０２】
Ｃ５開裂アッセイ。Ｃ５開裂アッセイは、精製ヒトＣ５を基質として使用して、Ｃ３開裂アッセイについて上述したように実施する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｐｅｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４７４２−４７５１）。たとえば図１２を参照。
【０１０３】
コンバターゼ安定性のアッセイ。上述のようにハイブリッドタンパク質および精製ヒト因子Ｂおよび因子Ｄを使用して、２分子コンバターゼを予備形成する。ＥＤＴＡの添加後、混合物を３７℃でインキュベートして、分割量を２４時間または適切ならばより短い期間に渡って取り出して、各分割量をただちに氷水浴に入れる。次にＣ３コンバターゼ活性を上述のＣ３開裂アッセイによって決定する。時間に対するＣ３開裂活性の低下から、各種のコンバターゼの自発的な崩壊解離の半減期を計算する。本アッセイのために不十分な量のハイブリッドタンパク質しか入手できない場合、酵素活性を蛍光発生トリペプチドｔ−ブチルオキシ−カルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニル−アミノメチルクマリンを使用して決定する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｇａｂａｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｅｌｌ，Ｗ．，ａｎｄ Ｇｏｔｚｅ，Ｏ．１９８１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（５），１９６３−１９６５）。
【０１０４】
因子Ｈ結合のアッセイ。ハイブリッドタンパク質への因子Ｈ結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。ハイブリッドタンパク質はマイクロタイタープレートに吸収される。オボアルブミンおよびＢＳＡを用いた遮断の後、精製ヒト因子Ｈを１０μｇ／ｍＬにて添加して、室温にて３０分間インキュベートする。洗浄後、結合した因子Ｈを抗因子Ｈ抗体によって、続いて適切なホスファターゼ結合２次抗体によって検出する。因子Ｈがタンパク質に結合できる場合、適切な色変化が観察される。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、コブラおよびヒトＣ３はもちろんのこと、コブラおよびヒトｉＣ３も含みうる（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ａｌｓｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６３−７６）。
【０１０５】
因子Ｉ開裂のアッセイ。ハイブリッドタンパク質は、精製ヒト因子Ｈおよび因子Ｉを用いて３７℃で数時間インキュベートする。反応物を次の４〜２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって還元条件下で分析する。因子Ｉ活性は、１０５ｋＤａα’鎖バンドの強度の低下、および分子量３７および４０ｋＤａのバンドの出現によって決定する。必要ならば、次のウェスタンブロットは、抗ＣＶＦおよび／または抗Ｃ３抗体を使用して実施する。あるいはハイブリッドタンパク質は、ヨードジェン法（Ｆｒａｋｅｒ ａｎｄ Ｓｐｅｃｋ，１９７８）を使用して１２５Ｉによって標識する。開裂生成物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、オートラジオグラフィーによって検出する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｌａｍｂｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４８２１−３２）。たとえば図１２を参照。
【０１０６】
免疫原性のアッセイ。これに限定されるわけではないが、皮膚試験、そのようなトランスジェニック動物で産生された血清を使用するＲＩＡ試験を含む、試験管内法でヒト免疫系を有するように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物における修飾Ｃ３タンパク質の試験、放射性免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気化学発光、および表面プラスモン共鳴を含む、各種の方法を使用して、免疫原性を分析することができる。加えて一部のタンパク質のマウス、ラットまたはモルモット類似物質を、マウス、ラットまたはモルモットＣ３およびＣＶＦ配列のどれかを使用して構築する。これらを適切な動物に注入して、血清を収集し、ハイブリッドタンパク質に対する抗体の生成について分析する。
【０１０７】
（実施例１０）
血漿半減期を測定する方法
これに限定されるわけではないが、免疫系によって生成される特異的抗体、血清内で循環するプロテアーゼ、非特異的免疫反応、および因子ＨおよびＩなど特異的調節因子を含む、修飾Ｃ３タンパク質の血漿半減期に影響を及ぼす多くの因子がある。修飾Ｃ３タンパク質を活性化させて、次に補体を枯渇できるようにするために、好ましいＣ３タンパク質は、ヒト血漿内で少なくとも最小限の量の時間に渡って持続するであろう。それゆえ修飾Ｃ３タンパク質の血漿半減期を確認して、それらがある疾患の処置にどのように有用であるかを判定することは興味深い。
【０１０８】
本方法は、３つの方法で血漿中の修飾Ｃ３タンパク質の安定性を測定する。しかしながら方法の１つまたはすべてはもちろんのこと、当業者に既知の他の任意の方法も使用できることが理解されるはずである。
【０１０９】
第１の方法は、試験管内での血清の安定性を測定する。ヒト血清は患者の全血から単離および分離する。各種の濃度の修飾Ｃ３タンパク質の分割量を血清に添加し、インキュベートする。血清の分割量を各種の時間間隔で取り出して、持続する修飾Ｃ３の量をＣ３に対して特異的であるモノクローナル抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイで確認する。
【０１１０】
第２の方法は、ヒト化動物における血清の安定性の確認を可能にする。修飾Ｃ３タンパク質を動物に投与して、血液サンプルを時間と共に取り出す。修飾Ｃ３タンパク質の量は、ＥＬＩＳＡアッセイでタンパク質に対する特異的抗体を使用して同定する。
【０１１１】
第３の方法は、ヒト患者での安定性の確認を可能にする。修飾Ｃ３を患者に投与して、血液サンプルを時間と共に取り出す。修飾Ｃ３タンパク質の量はＥＬＩＳＡアッセイを使用して同定する。これは修飾Ｃ３タンパク質が患者の血漿中を循環する期間の明確な表示を与えるであろう。
【０１１２】
一部の実施形態において、使用した抗体は、修飾Ｃ３に対して特異的である必要はない。たとえば正常なＣ３を認識する抗体は、ＥＬＩＳＡ手順で修飾Ｃ３を同定するために試験および使用できる。
【０１１３】
（実施例１１）
表面プラスモン共鳴を使用して測定されるような修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質のＣ３コンバターゼ形成
表２は、補体タンパク質のＣ３、ＣＶＦ、および組換えヒトＣ３／ＣＶＦタンパク質への相対結合を示す。すべての場合で、数字が大きいほどタンパク質相互作用が強いことを示す。タンパク質（Ｃ３ｂなど）をＢＩＡＣＯＲＥＣＨＩＰＴＭに結合させて、次に補体因子と接触させる。チップに結合された（それゆえ修飾Ｃ３タンパク質に結合された）補体因子それぞれの量は、表面プラスモン共鳴によって決定した。結果は：１）Ｃ５を開裂できるコンバターゼを形成できないことと一致して、Ｃ５に結合した組換えタンパク質のどちらも示さず、２）両方のタンパク質は因子Ｈに結合したが、ＣＶＦは結合せず、因子Ｈは、Ｃ３ｂ，Ｂｂコンバターゼ複合体を解離させて、開裂によってＣ３ｂを不活性化するために第２の補体タンパク質、因子Ｉを向けることができる調節タンパク質の１つであることと、３）因子Ｄおよびマグネシウムの存在下での因子Ｂへのタンパク質の親和性は、タンパク質がＣ３コンバターゼを形成する速度（因子Ｂ開裂を仲介するその能力によって測定された−図１０を参照）にほぼ比例したことを示した。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８の両方を開裂させたが、Ｃ３ｂよりも低速であった。ＣＶＦはＨまたはＩ部位を持たないため、ＣＶＦはＨまたはＩによって全く開裂されない。組換えＣＶＦの２鎖分子は２または３個のＩ部位を有するが、因子Ｉによってなお開裂されないことは、興味深い。
【０１１４】
表２：補体タンパク質のＣ３、ＣＶＦ、および組換えヒトＣ３／ＣＶＦタンパク質への相対結合
【０１１５】
【表２】
表３は、表面プラスモン共鳴によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で２５℃にて測定した、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質によって形成されたＣ３コンバターゼの安定性を示す。結果は、両方のタンパク質が実質的にＣ３ｂ含有コンバターゼよりも安定であるＣ３コンバターゼを形成できることを示した。表は、ＨＣ３−１３４８含有コンバターゼが実際にＣＶＦ含有酵素よりも安定であることも示している。これらの結果は、ＣＶＦが３７℃にて７時間の半減期を有し、Ｃ３ｂが３７℃にて１．５分間の半減期を有することを示した、より高温での半減期の他の測定と一致している。
【０１１６】
【表３】
（実施例１２）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の因子Ｂ開裂
図１０の因子Ｂ開裂のグラフは、修飾ヒト補体Ｃ３ｂタンパク質がマグネシウムイオンおよび因子Ｄの存在下で因子Ｂの開裂を仲介する能力の時間経過を示す。これはタンパク質がＣ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するのに使用できる。本アッセイでは、それが因子Ｄおよびマグネシウムの存在下で因子Ｂを非常に効率的に結合する（実施例１１のデータを参照）ことと、得られた複合体が非常に安定であることの両方のために、Ｃ３ｂがコンバターゼを非常に効率的に形成することは注目に値した。ＣＶＦ、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１５０４はすべてコンバターゼをほぼ同じ速度で形成したが、ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１５５０／１６１７は、そのコンバターゼを形成する能力がＣ３ｂとＣＶＦとの中間である。ＨＣ３−１３４８は非常に低速で因子Ｂを結合する。これはいったん形成されたコンバターゼより長い半減期と、因子Ｂへのハイブリッドタンパク質のより低い親和性との組合せによって最も確からしく説明される。
【０１１７】
（実施例１３）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質のＣ３開裂
図１１は、コンバターゼがＣ３を開裂する能力を示し、開裂反応の時間経過を示す。はめ込み図は、主グラフで使用したコンバターゼの２０％で実施した時間経過である。結果は、ＣＶＦおよびＨＣ３−１５５０がＣ３開裂にてほぼ等しく効率的であるコンバターゼを形成したが、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６はどちらもＣ３の開裂でＣＶＦよりも約５倍効率的であるコンバターゼを形成したことを示している。ＨＣ３−１５５０／１６１７含有コンバターゼは非常に不安定であるように見えたが、約１０分後にはＣ３開裂を補助しなかったことは興味深い。
【０１１８】
（実施例１４）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の補体枯渇
図９の補体枯渇チャートのデータは、ＨＣ３−１５５０／１６１７を除くすべてのタンパク質が、非常に異なる効率であるが補体を枯渇できたことを示している。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１５０４はどちらも補体の枯渇ではきわめて非効率的であったが、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１３４８は、天然または組換えＣＶＦと全く同様というわけではないが、補体をきわめて効率的に枯渇することができた。以前にＨＣ３−１３４８を、前出願ではＨＣ３−１３２５と呼んだが、置換マッピングは次に、置換が１３２５ではなくて１３４８であることを示している。
【０１１９】
結論として、ＨＣ３−１４９６は、それのみがＨＣ３−１５０４よりも長いインサート８アミノ酸を有しているが、補体枯渇およびＣ３開裂に関しては非常にＨＣ３−１３４８と似たように、因子Ｂ開裂に関してはＨＣ３−１５０４と似たように作用するため、興味深いタンパク質である。ＨＣ３−１４９６はＨＣ３−１５０４またはＣＶＦと同様にコンバターゼを形成するが、得られたコンバターゼはＣ３の開裂でより活性が高い。
【０１２０】
ＨＣ３１５５０／１６１７は、１５５０からＣ３端までの領域をＣＶＦ領域と置換して、次に最後の４６アミノ酸を除去して、それらをＣ３と置換することによって作製した。このキメラ分子は補体枯渇を示さず、ＨＣ３−１５５０と同様にＣ３コンバターゼを形成して、形成されたＣ３コンバターゼはＨＣ３−５５０とほぼ同じくらい活性であったが、明らかにより短い半減期を有していた。
【０１２１】
（実施例１５）
修飾Ｃ３タンパク質の変異形を生成する方法
好都合な品質を有する修飾Ｃ３タンパク質の変異形が生成される。好都合なとは、変異形がこれに限定されるわけではないが：Ｃ３コンバターゼ活性、血清補体除去、因子Ｂ結合、Ｃ３の開裂、Ｂｂの結合およびＣ３の結合を含む、タンパク質の１つまたは複数の活性を向上させることを意味する。変異形は各領域に１つまたは複数の突然変異体を含むことが可能であり、１つまたは複数のアミノ酸を含むことができる。一部の特異的変異形を以下に述べる：
Ｃ末端がＣ３コンバターゼの安定化に関与しているため、突然変異は任意の修飾Ｃ３タンパク質のＣ末端（ａａ１６１７の後）に生成される。突然変異は挿入、欠失、および置換でありうる。しかしながら突然変異は好ましくは置換である。突然変異はＣ３コンバターゼを安定化する。Ｃ末端における突然変異の例は、これに限定されるわけではないが：位置１６３３、１６５４、および１６５８における突然変異を含む。非保存的変異は保存的変異と同様に、形態に影響するアミノ酸変化に加えて、実施形態に含まれる。しかしながら好ましくは、突然変異は、非保存的アミノ酸変化を生じる。
【０１２２】
コンバターゼの活性の大きな変化の原因と思われる１４９６〜１５０４（８アミノ酸残基）のスパンにおいて、ＣＶＦとヒトＣ３との間には３つの変化がある。それゆえ修飾Ｃ３タンパク質のいずれかの位置１４９６と１５０４との間には、Ｃ３開裂および／または血清の補体枯渇におけるコンバターゼの活性上昇を引き起こす突然片を含む突然変異が含まれている。突然変異は、その領域内の１つまたは複数のアミノ酸に変化できる。好ましくは、突然変異はその領域での１つまたは複数のアミノ酸の置換、特に非保存的アミノ酸変化を生じる突然変異である。
【０１２３】
タンパク質が因子Ｂを結合する能力（特にＣ３ｂおよび因子Ｂが結合する能力）を修飾する、任意の修飾Ｃ３タンパク質における位置１３４８と１４９６との間の突然変異が生成され、好ましくは修飾が因子Ｂに結合する能力を向上させる。ＣＶＦからの領域全体がＣ３に交換され、またはその反対も同様である。含まれるさらなる突然変異がアミノ酸置換を生じさせる。さらに詳細には、ＣＶＦおよびＣ３については１３６７−１３７９の領域が交換され、この領域内の特異的アミノ酸は置換される。
【０１２４】
配列は、Ｂｂの結合または標的Ｃ３分子の結合のどちらかから、Ｃ３開裂のＣ３コンバターゼ活性に関与する、ＣＶＦにおける１５５０付近の領域およびＣ３の１５７０−１５８４の領域の配列において変化する。ＣＶＦ／コブラＣ３置換を使用すると、はるかに低いＣ３開裂の活性を持つタンパク質を生じる一連の４アミノ酸残基が同定された（ＣＶＦ配列ナンバリングに従ってナンバリングされたＱ１５５０Ｇ、Ｅ１５５４Ｒ、Ｐ１５５６ＡおよびＲ１５５７Ｑ位置）。したがって変異形は、修飾Ｃ３タンパク質のＣ３開裂でのＣ３コンバターゼの活性向上を生じる位置１５７０−１５８４のアミノ酸にて生成される。変異形は好ましくは、その領域の１つまたは複数のアミノ酸のアミノ酸置換である。
【０１２５】
上述した各種の方法および技法は、本発明を実施する多数の方法を提供する。もちろん、説明された必ずしもすべての目的および利点が本明細書で述べた任意の詳細な実施形態に従って実現されないことが理解されるはずである。それゆえたとえば、当業者は、本明細書で教示または示唆できる他の目的または利点を必ずしも達成することなく、方法が本明細書で教示した１つの利点または利点の群を達成または最適化する方法で実施できることを認識するであろう。
【０１２６】
さらに当業者は、異なる実施形態から各種の特徴の互換性を認識するであろう。同様に上述した各種の特徴およびステップは、そのような特徴およびステップそれぞれの他の既知の同等物と同様に、本明細書に述べた原理に従って方法を実施するために当業者が組合せおよび／または交換することができる。本明細書で引用した各特許、文献引用などは、参考としてその全体が本明細書に援用される。
【０１２７】
本発明は一部の実施形態および実施例の状況で開示されているが、当業者によって、本発明が特に開示された実施形態を超えて、他の代わりの実施形態および／または用途ならびにその明らかな改良および同等物に及ぶことが理解されるはずである。したがって本発明は、本明細書の好ましい実施形態の具体的な開示によって制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】斜線部分が成熟タンパク質中に存在する、Ｃ３およびＣＶＦの鎖構造を示す。
【図２】元のＣＶＦ／コブラＣ３ハイブリッドタンパク質のマップを示し、５つのハイブリッドタンパク質それぞれにおいてコブラＣ３配列と置換されたＣＶＦの領域を示す。
【図３Ａ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｂ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｃ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｄ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｅ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｆ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｇ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図４】ＣＶＦと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）のヒト血清における補体枯渇アッセイの結果を示す。
【図５】ＣＶＦおよびＣ３ｂと比較して修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）が因子Ｂを活性化して、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するアッセイの結果を示す。
【図６】ＣＶＦと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）に関する、Ｃ３を活性化するためにＣ３／Ｃ５コンバターゼの活性を測定するアッセイの結果を示す。
【図７】ＣＶＦと比較した、修飾ヒトＣ３タンパク質ＨＣ３−１３４８のＣ３開裂（図６の実験で使用したコンバターゼの量の２０％を使用して）を測定するアッセイの結果を示す。
【図８】ＣＶＦおよびヒトＣ３ｂと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質：ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０の活性測定の結果のまとめを示す。
【図９】天然ＣＶＦおよび各種のヒトＣ３タンパク質の補体枯渇の結果を示すグラフである。
【図１０】Ｃ３ｂ、組換えＣＶＦおよび各種の修飾ヒトＣ３タンパク質による因子Ｂの開裂の結果を示すグラフである。
【図１１】天然ＣＶＦおよび各種の修飾ヒトＣ３タンパク質のＣ３開裂の結果を示すグラフである。はめ込みグラフは、主グラフのコンバターゼの２０％を使用して実施した同じ反応である。
【図１２】因子ＨおよびＩによる、選択したハイブリッドタンパク質の開裂の結果を示すグラフである。
【図１３】ヒトＣ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質によるＣ５変換の結果を示すゲルの写真である。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本国際出願は、それぞれその全体が参照により本明細書に援用される、２００４年４月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／５６７，０６９号、２００５年２月１４日に出願された６０／６５３，２４７、そして２００５年３月３０日に出願された６０／６６７，３５２に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、ヒトＣ３タンパク質の部分のコブラ毒因子（ＣＶＦ）タンパク質の対応部分による置換を有するヒト補体Ｃ３のキメラ誘導体に関する。好ましくは、Ｃ３のアルファ鎖の部分がＣＶＦの対応する部分によって置換される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
補体の第３の成分であるＣ３は、補体活性化の古典的経路および代替経路の両方において中枢の役割を果たし、生理的Ｃ３活性化生成物の多くは、免疫反応および宿主防御において重要な機能を有する。代替経路において、Ｃ３の活性化型、Ｃ３ｂは、Ｃ３コンバターゼの構造サブユニットである。この２分子酵素は、Ｃ３ｂおよび因子Ｂの活性化型であるＢｂより成る。この酵素は、因子Ｄによって続いて開裂されるＣ３ｂの因子Ｂへの結合によって形成され、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ３ｂ、Ｂｂの形成、および活性化ペプチドＢａの放出を生じる。Ｃ３コンバターゼは分子をＣ３ｂおよびアナフィラトキシン、Ｃ３ａに開裂することによってＣ３を活性化する。Ｃ３ｂ分子はＣ３コンバターゼのごく近くの細胞または粒子に結合するであろう。最終的に結合したＣ３ｂは、Ｃ５のＣ５ｂおよびアナフィラトキシン、Ｃ５ａへの活性化を可能にする。Ｃ５活性化は同じＣ３ｂ、Ｂｂ酵素によって起こり、Ｂｂ酵素は追加のＣ３ｂ分子に結合しているときにＣ５を開裂可能であり、（Ｃ３ｂ）２，Ｂｂより構成される３分子複合体を生成する。このＣ５開裂３分子酵素はＣ５コンバターゼと呼ばれる。Ｃ３およびＣ５の両方の活性化がＢｂサブユニットの同一の活性部位で発生するため、酵素はＣ３／Ｃ５コンバターゼとも呼ばれる；そして１個のＥＣメンバのみが割り当てられている（ＥＣ ３．４．２１．４７）。
【０００４】
コブラ毒は、コブラ毒因子（ＣＶＦ）と呼ばれるＣ３の構造的および機能的類似物質を含有する。この分子は、ヒトおよび哺乳類血清中の因子Ｂと結合して複合体ＣＶＦ，Ｂを形成することができ、これはまた因子Ｄによって２分子酵素ＣＶＦのＢｂおよびＢａに開裂される。２分子複合体ＣＶＦ，Ｂｂは、Ｃ３ｂによって形成されるＣ３／Ｃ５コンバターゼと同様にＣ３およびＣ５を活性化するＣ３／Ｃ５コンバターゼである。２つのＣ３／Ｃ５コンバターゼＣ３ｂ，ＢｂおよびＣＶＦ，Ｂｂは同じ分子構造、活性の部位保持Ｂｂサブユニット、および基質特異性を共有するが、２つの酵素は著しい機能の相違を示す。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素はＣ３ｂ，Ｂｂよりも物理化学的にはるかに安定であり、調節タンパク質因子ＨおよびＩによる不活性化に対して耐性であり、異なる動的特性を示し、Ｃ５開裂のために追加のＣ３ｂを必要としない。
【０００５】
ＣＶＦおよび哺乳類Ｃ３が免疫交叉反応、アミノ酸組成、円２色性スペクトル、２次構造、電子顕微鏡による超構造、およびアミノ酸配列を含む、複数の構造上の類似性を示すことが明らかにされている。それにもかかわらず、２つの分子間には著しい構造上の相違が存在する。Ｃ３が種に依存して、１７０〜１９０ｋＤａの見かけの分子量を持つ２鎖分子であるのに対して、ＣＶＦは、Ｃ３の生理的活性化生成物の１つであるＣ３ｃに似た、１４９ｋＤａの見かけの分子量を持つ３鎖分子である。Ｃ３とＣＶＦの間の別の著しい構造上の相違は、そのグリコシル化にある：ＣＶＦは、主として、非還元末端に珍しいα−ガラクトシル残基を持つＮ結合複合体型鎖で構成される、７．４％（ｗ／ｗ）の炭水化物含有率を有する。これに対して、ヒトおよびラットＣ３は、より低い程度のグリコシル化を示し、異なる構造のオリゴサッカライド鎖を持つ。
【０００６】
ＣＶＦ，ＢｂおよびＣ３ｂ，ＢｂはどちらもＣ３／Ｃ５コンバターゼであるが、それらは重要な相違を示す。ＣＶＦ含有酵素はＣ３含有酵素よりも、はるかに安定である。どちらのコンバターゼもその２つのそれぞれのサブユニットに自発的に崩壊するであろう。しかしながら、ＣＶＦ含有コンバターゼの固有半減期（安定性）は、３７℃にて約７時間であり、約１．５分間の固有半減期を持つＣ３含有酵素よりも数百倍長い。さらにＣＶＦ含有酵素は、遊離ＣＶＦと同様に、補体調節タンパク質因子ＨおよびＩによる調節を受けない。長い固有半減期とＣＶＦ含有酵素の調節に対する耐性の組合せによって、ＣＶＦはＣ３およびＣ５を継続的に（そして次に他の補体成分）を活性化して、最終的に血清補体活性の枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を引き起こす。
【０００７】
大流行している疾患を含め、多数の疾患への補体系の関与に基づいて、過去十年間には、これらの疾患状態における望ましくない補体活性化プロセスを妨害する複数の抗補体剤の開発が見られた。すべての補体向け薬物開発の試みは、補体の活性化を阻害することに基づいており、同時にＣＶＦは血清中の補体を枯渇させることにより作用する。補体活性化の疾患の処置にとって興味深いのは、Ｃ３の非免疫原性または低免疫原性をＣＶＦの補体枯渇機能と組合せるＣ３型分子である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要約）
実施形態の以下のリストは、本発明の各種の態様の非制限的な説明である。他の態様および変形は、開示全体に照らして明らかになるであろう。
【０００９】
一部の実施形態は、ヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連する配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を有することができる、１つまたは複数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質を含む。一部の実施形態において、ＣＶＦの置換部は、Ｃ３のアルファ鎖内でありうる。他の実施形態において、ＣＶＦの置換部分は、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分でありうる。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含む。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延在しない内部部分でありうる。さらなる実施形態において、修飾タンパク質は、実質的に同数のアミノ酸残基を未修飾ヒトＣ３タンパク質として有することができる。一部の実施形態において、置換はヒトＣ３タンパク質のアミノ酸位置７００−１６６３内の任意の位置を含むことができる。他の実施形態は、ヒト補体Ｃ３タンパク質であり、これはヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連しており、少なくとも２個の置換を有することができる配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を有することができる。一部の実施形態において、置換は選択された開始位置および選択された最終位置を有する；一部のそのような実施形態において、開始位置はたとえば７４９、８７４、９３６、９９４、１２６４、１３４８、１４９６、１５０４、１５５０などでありうる；最終位置はたとえば７８４、９２１、９７０ １３２４、１５５０、１６１７、１６６３でありうる。好ましい実施形態において、１つまたは複数の置換がアミノ酸：１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４９６−１６６３、１３４８−１６１７、１４９６−１６１７、１２６４−１３２４、７４９−７８４、８７４−９２１、９９４−１６６３、９９４−１５５０および９３６−９７０のいずれかを含むことができる。一部の実施形態において、ＣＶＦの置換部分はＣ３のベータ鎖内にありうる。
【００１０】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は因子Ｂへの親和性を有することができ、コンバターゼの形成を補助できる。一部の実施形態において、得られたコンバターゼはＣ３を開裂できるが、Ｃ５は開裂できない。さらなる実施形態において、コンバターゼは、約３７℃にて１．５分間〜約７時間の固有半減期を有することができる。一部の実施形態において、得られたコンバターゼは３７℃にて少なくとも約７時間の固有半減期を有することができる。
【００１１】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は単鎖タンパク質として発現できる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、Ｃ３に似た形態の少なくとも２本の鎖に開裂させることができる。さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を開裂させてそこからＣ３ａ部分を放出できる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、Ｃ３またはＣＶＦによってコードされないＮ末端において、追加の１〜約１９個のアミノ酸を有することができる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、非Ｃ３シグナルペプチド、たとえばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｂｉｐシグナル配列を含むことができる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、因子Ｂおよび／または因子Ｄに対して修飾親和性を有することができる。一部の実施形態において、修飾タンパク質は、因子Ｈおよび／または因子Ｉに対して部分または完全耐性を示すことができる。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は、実質的に非免疫原性でありうる。
【００１２】
他の実施形態は、補体の枯渇に有効な量の修飾Ｃ３タンパク質を患者に投与することによって、補体を枯渇させる方法も含むことができる。一部の実施形態において、投与は局所的でありうる。さらなる実施形態において、局所投与は臓器内、皮下的、空洞内、または組織内でありうる。他の実施形態において、局所投与は、修飾Ｃ３タンパク質を所望の場所に濃縮できるターゲティング機能を利用できる。さらなる実施形態において、ターゲティング機能は、修飾Ｃ３タンパク質に結合された抗体を使用することを含みうる。一部の実施形態において、投与は全身投与、たとえば静脈内または腹腔内投与でありうる。
【００１３】
さらなる実施形態は、補体を枯渇するのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を患者に送達するステップと；患者における再潅流を可能にするステップとによって、患者における再潅流傷害を回避または緩和するための方法でありうる。一部の実施形態において、送達ステップは、修飾Ｃ３タンパク質を動脈に注入することを含みうる。他の実施形態において、送達ステップは、修飾Ｃ３タンパク質の局所送達を含むことができる。他の実施形態において、送達ステップは修飾Ｃ３タンパク質の全身送達を含むことができる。一部の実施形態において、再潅流は閉塞動脈を開くことを含む。一部の実施形態において、再潅流は臓器移植と関連して起こることがある。
【００１４】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質を補体を枯渇させるのに十分な量で送達するステップと、遺伝子治療を供給するステップと；それからの向上した結果を観察するステップとによって、遺伝子治療の効率および／または有効性を上昇させる方法を含みうる。
【００１５】
一部の実施形態は、血流を増加させるのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を送達するステップと；治療剤または診断剤を供給するステップとによって、治療剤または診断剤の送達を増加させる方法を含みうる。一部の実施形態において、該方法は、送達ステップの前に、修飾Ｃ３タンパク質を特定の組織に対する親和性を備えた抗体に化学的に結合するステップを含みうる。一部の実施形態において、抗体を修飾Ｃ３に組換えＤＮＡ技術によって付着させることができる。一部の実施形態において、抗体はモノクローナル抗体でありうる。
【００１６】
一部の実施形態は、補体を枯渇させるのに十分な修飾Ｃ３タンパク質を投与するステップを含む、自己免疫疾患を処置する方法を含む。一部の実施形態において、投与は間欠的でもよく、少なくとも１つの疾患症状上昇の期間に一致する。一部の実施形態において、自己免疫疾患は、ぜんそく、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、関節リウマチ、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋虚血、再潅流、敗血症、超急性拒絶、移植片拒絶、心肺バイパス、心筋梗塞症、血管形成、腎炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、脊髄損傷およびパーキンソン病のいずれかでありうる。
【００１７】
一部の実施形態は、たとえばヒト補体Ｃ３タンパク質の部分をコブラ毒因子（ＣＶＦ）タンパク質の対応する部分によって置換するステップによって、ヒトタンパク質中のＣＶＦの特性を模倣する方法を含む。一部の実施形態において、部分はＣ３のアルファ鎖内でありうる。他の実施形態において、部分はＣ３のアルファ鎖のＣ末端分でありうる。一部の実施形態において、Ｃ末端部分はヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含みうる。一部の実施形態において、置換Ｃ末端部分は、ヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延在しない内部部分でありうる。
【００１８】
他の実施形態は、修飾タンパク質の機能プロフィールを形成するために修飾Ｃ３タンパク質の少なくとも１つの特性を特徴付けるステップと；機能プロフィールを処置される疾患または状態と結び付けるステップとによる、修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法を含む。一部の実施形態において、少なくとも１つの特性は：コンバターゼ活性、コンバターゼ形成、コンバターゼ安定性、因子Ｈに対する感受性、因子Ｉに対する感受性、Ｃ３を開裂する能力、およびＣ５を開裂する能力から成る群より選択できる。一部の実施形態において、選択したＣ３タンパク質は、慢性状態の処置に適したコンバターゼの形成に関与する。一部の実施形態において、適応は、たとえば長い血漿半減期、高い安定性、因子Ｈに対する耐性、因子Ｉに対する耐性などのいずれかを含みうる。一部の実施形態において、コンバターゼは再潅流傷害の処置に適しうる。他の実施形態において、適応はたとえば高いコンバターゼ活性、因子Ｈに対する耐性、因子Ｉに対する耐性などのいずれかでありうる。
【００１９】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質をコードする核酸配列、および／または核酸を含むベクターおよび／またはベクターを含有する宿主細胞を含む。一部の実施形態において、宿主細胞は：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｉＦｉｖｅ細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ細胞のいずれかでありうる。
【００２０】
一部の実施形態は、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質ならびに医薬的に許容される担体および／または核酸を含みうる組成物を含む。
【００２１】
一部の実施形態は、修飾Ｃ３タンパク質を発現する発現系を含む。一部の実施形態において、発現系は：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞、Ｓｆ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨｉＦｉｖｅ細胞、酵母細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＥ．ｃｏｌｉ細胞から成る群より選択される細胞を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ヒト補体Ｃ３配列の、ＣＶＦの特異的機能の主な構造要件を表すＣＶＦ配列による置換は、ＣＶＦ様機能を備えたＣ３誘導体の作製を可能にする。本発明の好ましい実施形態は、補体活性化が病因の一部である臨床状況で補体を枯渇させる新規な治療剤として使用するための安定なコンバターゼを形成することによって、補体を枯渇させるＣＶＦ特異的機能を示すヒトＣ３誘導体を提供することである。ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３分子は、免疫原性の著しい低下または非存在さえ示すであろう。
【００２３】
ＣＶＦ機能を備えた、しかし実質的に低下した免疫原性を備えたヒトＣ３タンパク質を生じる、ヒトＣ３タンパク質の部分の、コブラ毒因子タンパク質（ＣＶＦ）による対応する部分による置換を有する、多数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質（Ｃ３）が開示されている。Ｃ３タンパク質は、プロタンパク質（単鎖タンパク質）または４個のアルギニン残基の除去による開裂タンパク質でありうる。追加の２鎖形は、Ｃ３ａ部分の除去により形成できる。好都合には、Ｃ３タンパク質は、以下のＣＶＦ機能：Ｃ３コンバターゼを形成する能力の向上、Ｃ３コンバターゼの安定性向上、因子Ｈおよび／またはＩの作用に対する耐性の向上、Ｃ３およびＣ５を開裂させる活性の向上、および血漿半減期の延長の少なくとも１つを含有するように操作できる。１つの実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分は、ＣＶＦタンパク質の対応する部分によって置換される。多種多様の特異領域および特異キメラが本明細書で開示される。さらに修飾Ｃ３タンパク質が修飾タンパク質の機能プロフィールを形成する特性を特徴付けるステップと、処置される疾患または状態と結び付けるステップとを含む、修飾Ｃ３タンパク質を同定および／または選択する方法が開示される。機能プロフィールは、以下の機能：コンバターゼを形成する能力、Ｈおよび／またはＩに対する感受性、Ｃ３を開裂する能力、Ｃ５を開裂させる能力、コンバターゼの相対活性、コンバターゼの安定性、および血漿半減期の１つまたは複数を含みうる。キメラＣ３タンパク質、Ｃ３／ＣＶＦキメラ、またはＣ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質とも呼ばれる修飾Ｃ３タンパク質は、局所または全身補体活性化から生じる各種の疾患および／または状態を処置するのに使用できる。これらの疾患は、これに限定されるわけではないが：再潅流傷害、自己免疫疾患、たとえば関節リウマチおよび狼瘡、そして重症筋無力症ならびに人体のタンパク質または構造に対する免疫反応を識別および指示する抗体から生じた他の疾患を含む。
【００２４】
（補体系および疾患）
補体系は、脊椎動物免疫系の構成要素であり、宿主防御および免疫反応でのその役割を通じて健康の維持に関与している。しかしながら補体活性化も多数の疾患の病因に関与している。これらの疾患の例は、自己免疫溶血性貧血、関節リウマチおよび他の免疫複合疾患、ならびに血流が一時的に停止された後に組織損傷が発生する再潅流傷害を含む。再潅流傷害の例は、閉塞血管の再開後の組織損傷（たとえば心臓麻痺、卒中）および臓器移植後のレシピエントの血液による再潅流である。大流行している疾患を含め、多数の疾患への補体系の関与に基づいて、過去十年間には、これらの疾患状態における望ましくない補体活性化プロセスを妨害する複数の抗補体剤の開発が見られた。このような薬物の開発の試みはすべて、補体の活性化を阻害することに基づいている。
【００２５】
（補体タンパク質Ｃ３、コブラ毒因子ＣＶＦ、類似性および相違）
補体の第３の成分であるＣ３は、補体活性化の古典的経路および代替経路の両方において中枢の役割を果たし、生理的Ｃ３活性化生成物の多くは、免疫反応および宿主防御において重要な機能を有する（総説については、参考としてその全体が本明細書に援用されるＭｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｈ．Ｊ．（１９８８） ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７：３２１−３４７を参照）。ヒトＣ３は、分子量約１８５，０００の２鎖糖タンパク質である。それは単鎖プリプロＣ３として合成され、β鎖とα鎖との間のアルギニン残基４個の除去による次の処理を受ける。ヒトＣ３の１次配列は、分子クローニングから既知である。他の哺乳類種はもちろんのこと非哺乳類種からの完全または部分配列情報が入手できる。これらとしては、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、コブラ、アフリカツメガエル、およびヤツメウナギが挙げられる。ヒトＣ３遺伝子は、長さ４２ｋｂで、エキソン４１個を含み、５２〜２１３ｂｐの範囲の大きさである。
【００２６】
Ｃ３の主な活性化生成物はＣ３ｂである。Ｃ３ｂは、代替経路Ｃ３／Ｃ５コンバターゼの形成で中心的な役割を果たす。この酵素の形成は、Ｃ３ｂの因子Ｂへの初期結合を必要とする。弱い複合体Ｃ３ｂ，ＢはＭｇ２＋の存在下で因子Ｄによって次に開裂され、酵素活性Ｃ３／Ｃ５コンバターゼＣ３ｂ，Ｂｂを生じて、活性化ペプチドＢａの放出を引き起こす。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に不安定であり、２つのサブユニットＣ３ｂおよびＢｂへの自発的な崩壊解離を示し、固有半減期は３７℃にて１．５分間である。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素はプロパージンによって安定化される。Ｃ３／Ｃ５コンバターゼは、２つの基質における１個のペプチド結合を加水分解することによって、Ｃ３およびＣ５を開裂させる。酵素にＣ５を開裂させるために、コンバターゼに結合された別のＣ３ｂ分子にＣ５を結合させる必要がある。高速の自発的な崩壊解離に加えて、Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は厳密な制御を受ける。酵素は因子Ｈによって分解され、Ｃ３ｂは因子ＨおよびＩの複合作用によって不活性化される。因子Ｈの存在下で、因子Ｉは２個の開裂部位におけるＣ３ｂのα’鎖を開裂する。iＣ３ｂと呼ばれる得られたＣ３ｂ誘導体はもはや、因子Ｂを用いてコンバターゼを形成できない。因子Ｉは第３の部位にてα’鎖を開裂可能であり、これは２つのＣ３断片Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇの生成を引き起こす。因子Ｉによる第３の開裂では、Ｃ３ｂセレプタのＣＲ１が補因子として作用する。
【００２７】
Ｃ３の珍しい構造特性は、α鎖内の細胞内チオエステルの存在である。Ｃ３のＣ３ｂへの活性化時に、チオエステルは非常に反応性となり、Ｃ３ｂの細胞および他の特定の標的への共有付着に関与する。チオエステルの開裂と同時に起こる構造変化は、次の因子Ｂの結合およびその活性化を可能にする。
【００２８】
Ｃ３中のチオエステルは低速の自発的加水分解を受け、ｉＣ３またはＣ３（Ｈ２Ｏ）と呼ばれるＣ３の形態の形成を引き起こす。ｉＣ３はＣ３ｂ様機能を呈し、血清中の因子ＢおよびＤによって流体相コンバターゼを形成できる。得られたコンバターゼｉＣ３，ＢｂはＣ３ｂ，Ｂｂコンバターゼと同様に不安定であり、因子ＨおよびＩによる制御を受ける。しかしながらチオエステルの自発的な加水分解およびｉＣ３，ＢｂコンバターゼによるＣ３の次の低グレードの活性化は、標的細胞または粒子に対するＣ３ｂの初期沈着に関与して、いわゆるアクチベータ表面での代替経路の活性化を引き起こすと考えられる。
【００２９】
Ｃ３は、非常に珍しい多機能タンパク質である。その各種活性化生成物を含む該タンパク質は特に、約２０の異なる血漿タンパク質または細胞表面レセプタと相互作用する。このような他機能性は、分子の詳細な構造／機能解析に多大な興味をかき立てている。因子Ｈ、プロパージン、因子Ｂ、および補体レセプタＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、およびＣ３ａを含むＣ３の一部のリガンドでは、レセプタ結合部位は、Ｃ３ポリペプチドの多かれ少なかれ定義領域に提示または割当てされる。
【００３０】
コブラ毒は、コブラ毒因子（ＣＶＦ）と呼ばれるＣ３の構造的および機能的類似物質を含有する。ＣＶＦはヒト血清および本質的にすべての脊椎動物の血清中の因子Ｂと結合でき、弱い複合体ＣＶＦ，Ｂを形成し、これが次にＭｇ２＋の存在下で因子Ｄによって２分子酵素ＣＶＦ，ＢｂおよびＢａに開裂されるという点で、ＣＶＦはＣ３ｂに機能的に似ている。２分子複合体ＣＶＦ，Ｂｂは、Ｃ３ｂによって形成されたＣ３／Ｃ５コンバターゼと同様にＣ３およびＣ５を活性化する、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼである。
【００３１】
ＣＶＦは、約１５０，０００Ｄａの分子量を持つ３鎖糖タンパク質である。ＣＶＦおよび哺乳類Ｃ３は、免疫交叉反応、アミノ酸組成、円２色性スペクトルおよび２次構造、ならびに電子顕微鏡超構造を含む複数の構造上の類似性を示すことが明らかにされている。初期のＮ末端アミノ酸配列比較は、Ｃ３との配列相同性を証明し、ＣＶＦがＣ３ｃと構造的に似ているという示唆をもたらした。ＣＶＦとＣ３との構造相同性および鎖の関係は、ＣＶＦの分子クローニングによって確認され、このことはタンパク質レベルにて哺乳類Ｃ３に対して約７０パーセントの、そしてコブラＣ３と比較したときに９０パーセント超の全体的な類似性を明らかにした。
【００３２】
ＣＶＦとＣ３との間のこれらの機能上および構造上の類似性にもかかわらず、２つの分子および得られたコンバターゼは、重要な機能上の相違を示す：
１．両方の酵素が、酵素活性を破壊する、各サブユニットへの自発的な崩壊解離を示す。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に短寿命であり、３７℃にて１．５分間の固有半減期で崩壊するのに対して、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素は何桁もより安定であり、約７時間の固有半減期で崩壊する。
【００３３】
２．Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は、因子ＨおよびＩによる調節を受ける。これに対してＣＶＦ，ＢｂおよびＣＶＦは、これらの２つのタンパク質の調節作用に対して完全に耐性である。
【００３４】
３．補体活性化中に産生されたＣ３ｂ，Ｂｂ酵素は表面に結合している。これに対してＣＶＦ，Ｂｂ酵素は流体相酵素である（ｉＣ３，Ｂｂと同様）。
【００３５】
４．Ｃ３ｂ，ＢｂとＣＶＦ，Ｂｂとの別の機能上の相違は、Ｃ５コンバターゼ活性にある。Ｃ５をＣ５コンバターゼによって開裂させるために、Ｃ３ｂまたはＣＶＦのどちらかに結合させる必要がある。しかしながらＣ３ｂ，Ｂｂ酵素によってＣ５開裂を発生させるために、Ｃ５をＣ３ｂ，Ｂｂ酵素の一部であるＣ３ｂ分子とは異なるＣ３ｂ分子に結合させる必要がある。これに対して、Ｃ５は、Ｂｂ触媒サブユニットを保持する同じＣＶＦ分子によって結合される。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素がＣ５を結合するこの特性はおそらく、流体相Ｃ５コンバターゼ活性を示すその能力の理由であり、これに対して、Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素のＣ５コンバターゼ活性は粒子の表面に制限される。
【００３６】
５．両方の活性が、Ｃ３加水分解のその動力学においてやや異なることが示されている。ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍大きい。
【００３７】
機能上の結果に関して、ＣＶＦ，ＢｂとＣ３ｂ，Ｂｂの間の２つの最も重大な相違は、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素の固有安定性および調節タンパク質因子ＨおよびＩに対するその耐性である。ＣＶＦ，Ｂｂ酵素が形成されると、それは引き続きＣ３およびＣ５を活性化して、補体消費を引き起こす。ＣＶＦを実験動物に、その血漿補体を枯渇させるために安全に投与できることが３０年間に渡って証明されて以来、ＣＶＦは、免疫反応、宿主防御、および疾患の病因における補体の各種生体機能を、正常な（補体充足）動物をＣＶＦ処置（補体枯渇）動物と比較することによって、試験する重要な調査ツールとなってきた。
【００３８】
（Ｃ３／ＣＶＦ誘導体）
ＣＶＦは、次に枯渇につながる徹底的な活性化の機構を通じて作用する、補体インヒビタである。実際に、ＣＶＦは、他の薬物の抗補体活性を評価する標準として頻繁に使用される。ＣＶＦはこの強力な抗補体活性を示すが、その免疫原性のためにヒト用途には適していない。この理由で、ＣＶＦとＣ３との広範囲に渡る構造類似性を利用することによって実質的に非免疫原性ＣＶＦを調製することと、ＣＶＦ分子の機能的に重要な領域をヒトＣ３内へ組換え手段で置換することによってＣＶＦの所望の補体枯渇機能を備えたヒトＣ３誘導体を産生することが望ましい。このことは、本明細書で述べるように実施されている。
【００３９】
多数のヒトＣ３誘導体が生成および／または設計されており、Ｃ３配列の部分が相同性ＣＶＦ配列、主にＣＶＦベータ鎖内の配列によって置換された。ＣＶＦおよびＣ３は、真核発現系にて組換え手段によってうまく発現されている。Ｃ３のアルファ鎖領域、そして好ましくは、ＣＶＦ配列全体に集合的に及ぶ、ＣＶＦとコブラＣ３との間の５つのハイブリッドタンパク質が作製された（ヒトＣ３よりも、ＣＶＦに対する高い類似性のために）、以前の研究に基づいて、この鎖のＣ末端部分が選択された（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：１９９（２００３））。他の系列の研究は、ＣＶＦタンパク質の制限されたタンパク質分解を含んでいた（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，Ｓｕｐｐｌ．１，１１３（１９９３）Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，１７４，３４４）。この以前の研究結果を使用して、アミノ酸残基１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、および１３４８−１６６３それぞれをＣＶＦからの相同配列で置換することによって、３つの好ましいヒトＣ３誘導体を作製した。Ｃ３誘導体は第１のアミノ酸残基によって指定され、最後のアミノ酸残基が示されない場合、それは１６６３であると理解される。ＣＶＦ挿入の終点がタンパク質のＣ末端より前である場合、それは位置によって指定される（たとえば：ＨＣ３−１５５０／１６１７）。アミノ酸残基１３４８−１６６３を置換することによって作製されたＣ３誘導体は、以前に１３２５−１６６３と呼ばれたが、置換マッピングが次に１３２５ではなく１３４８であったことを示していた。３つのヒトＣ３誘導体は、ＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１３４８と呼ばれる。３つのヒトＣ３誘導体は、所望のＣＶＦ活性を示すことが明らかにされた：３つのタンパク質はすべて、活性Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成することができる。これは、３つのタンパク質が因子Ｂの活性化を補助する能力によって、そして３つの得られたコンバターゼがＣ３を開裂する能力によって証明される。３つのタンパク質はすべて安定なコンバターゼを形成するが、固有安定性および少なくとも１つ（ＨＣ３−１５５０）は、ＣＶＦと比べてより低い固有安定性を示す。最初に試験した３つのタンパク質のうち２つ（ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８）が実際にモルモット血清から補体除去できたという観察は予想されていなかったが、この活性はＣＶＦの活性よりも明らかに低く、５つのタンパク質のうち４つがヒト血清中の補体を枯渇させることができ、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６は、ＣＶＦとほぼ同様に補体ヒト血清から補体を除去することができた。ＨＣ３−１５５０／１６１７は、ヒト血清中の補体を枯渇できなかった。補体を少なくとも部分的に枯渇する能力は、Ｃ３誘導体が安定なコンバターゼを形成するだけでなく、調節タンパク質因子Ｈおよび／またはＩに対して少なくとも部分的に耐性であることを示しており、それによりＣＶＦ様活性であることを示す。ヒトＣ３誘導体ＨＣ３−１５５０は、アミノ酸残基の４％未満がヒトＣ３とは異なり、その予測された免疫原性をＣＶＦと比較して大幅に低減または除去している。各種のＣ３ハイブリッドは、処置される疾患に応じて、その各種の特徴に基づいて好ましいことがある。たとえば慢性疾患の処置では、目的は、極めて低い免疫原性を有するか、免疫原性を持たず、高いコンバターゼ安定性を有するＣ３ハイブリッドを提供して、慢性疾患に罹患している患者の体内でその持続を促進することである。そのような状況では、他方の特徴、たとえばコンバターゼの活性は、比較的あまり重要でない。これに対して、補体関連再潅流傷害を回避するための処置では、高いコンバターゼ活性がコンバターゼ安定性よりも大きく重要である。それゆえそれぞれ特定の一連の特性を有する各種ハイブリッドの多様性により、補体活性化および／または補体枯渇によって処置できる所与の状態の処置のための好ましいハイブリッドの選択が可能となる。
【００４０】
１つの実施形態において、本発明は、以下のＣＶＦまたはＣＶＦ，Ｂｂ品質：１．５分間より長い固有半減期で崩壊、因子Ｈおよび／またはＩの調節作用に対する耐性の上昇、流体相Ｃ３コンバターゼおよび流体相Ｃ５コンバターゼ活性の少なくとも１つを示す修飾補体Ｃ３タンパク質に関する。これらの要因に加え、触媒効率がＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍であるため、一部の実施形態において触媒効率をＣ３ｂ，Ｂｂと比べて低下させることができる。他の実施形態において、触媒効率はＣ３ｂ，Ｂｂと比較して上昇または下降されない。多くの好ましいＣ３ハイブリッドがほとんどまたは全く免疫原性を持たないが、それにもかかわらず多くの用途に適切である他の実施形態は、一部の場合では検出可能〜中程度の免疫原性を示すことがある。
【００４１】
一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質によって形成されたコンバターゼの固有半減期は、１．５分間超、好ましくは１０分間超である。さらなる実施形態において、固有半減期は一般に、これに限定されるわけではないが、約：２分間、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、９０分間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、６．５時間および７時間またはそれ以上を含む、ＣＶＦ含有コンバターゼ（７時間以上）およびＣ３（１．５分間）の間に収まりうる。短いコンバターゼ固有半減期および／または短い血漿半減期を持つ修飾Ｃ３タンパク質は、一部の用途に有用であるが、長いコンバターゼ固有半減期および／または長い血漿半減期を持つＣ３タンパク質は別の用途に有用であろう。
【００４２】
さらなる実施形態において、Ｃ３ハイブリッドの因子Ｈおよび／またはＩに対する耐性は、未修飾Ｃ３の耐性よりも大きく、一部の実施形態においてＣＶＦの耐性と同等である。しかしながら一部の実施形態において、因子Ｈおよび／またはＩに対する耐性を達成するために、分子の他の部分でのさらなる修飾が必要となることがある。
【００４３】
本明細書で述べる多くの実施形態はＣ３の１つまたは複数の別個の領域の、ＣＶＦの対応する領域による特異的置換に関するが、他の実施形態は、ＣＶＦ配列に実質的に関連しているが、同一ではない配列を利用した置換を含む。すなわち置換のために選択したＣＶＦ領域内に、選択したＣＶＦ領域の所望の機構または機能を損失せずに１つまたは複数のアミノ酸に対する変化を生じさせることができる位置があり、一部の場合ではそのような変化は、機構または機能の向上を付与できる。そのような変化はすべて、本発明の実施形態と見なされる。
【００４４】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を含有するコンバターゼの触媒活性は、一部の実施形態においてＣＶＦを含有するコンバターゼの触媒活性の少なくとも５０％であり、未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの触媒活性よりも大きい。さらなる実施形態において、触媒活性は、ＣＶＦコンバターゼの触媒活性の６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。両方の酵素が、Ｃ３加水分解のその動力学で多少異なることが示されている。それゆえ多くの実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼは、２つの間に収まる、または未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの活性を超える触媒活性を有することができる。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼのそのような活性は、ＣＶＦを含有するコンバターゼの活性の、これに限定されるわけではないが２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１１０％、１３５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％およびそれ以上を含む、１０％〜１０００％またはそれ以上でありうる。
【００４５】
ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、Ｃ３を開裂させるときに、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍である。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの触媒効率は一部の実施形態においてＣＶＦを含有するコンバターゼの少なくとも５０％であり、未修飾Ｃ３ｂを含有するコンバターゼの触媒効率よりも大きいことがある。両方の酵素は、Ｃ３加水分解のその動力学でいくらか異なることが示されている。それゆえ多くの実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼは、２つの間に収まる、または未修飾Ｃ３を含有するコンバターゼの活性を超える触媒効率を有することができる。それゆえ一部の実施形態において、修飾Ｃ３を含有するコンバターゼのそのような効率は、ＣＶＦを含有するコンバターゼの効率の、これに限定されるわけではないが２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１１０％、１３５％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、７５０％、１０００％およびそれ以上を含む、１０％〜１０００％またはそれ以上でありうる。
【００４６】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質のＣ５開裂活性は上昇する。Ｃ５開裂活性は、ＣＶＦまたはＣ３の活性の、これに限定されるわけではないが：１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、および３７５％を含む、約１０％〜４００％でありうる。
【００４７】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質の因子Ｂへの結合および／または因子Ｄによるその次の開裂を低下させることができる。しかしながら触媒活性および補体枯渇活性の少なくとも機能的量が残存している限り、修飾Ｃ３タンパク質は有用である。
【００４８】
さらなる実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質を有するコンバターゼは、天然ＣＶＦを含有するコンバターゼの実質的に同じ補体活性化活性を示す。「天然ＣＶＦの実質的に同じ補体活性化活性を示すという用語は、本発明のＣ３誘導体が、Ｃｏｃｈｒａｎらの方法（参考としてその全体が本明細書に援用される、（１９７０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０５（１）），５５−６９）によって測定されたように、天然ＣＶＦの補体活性化活性のレベルの０．１〜９７％、好ましくは５０〜９７％、好ましくは８０〜９７％を有することを意味する。
【００４９】
一部の実施形態において、修飾補体Ｃ３タンパク質は、Ｃ末端領域の一部または全部がＣＶＦの対応する領域によって置換されているＣ３分子である。一部の実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖のＣ末端部分のみがＣＶＦの対応する領域によって置換される。一部の実施形態において、これに限定されるわけではないが：３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０、１７５、１８０、１９０、２００、２５０、２７５、３００、３５０、３７５、４００、４５０、４７５、５００、５５０、５７５、６００、６５０、６７５、７００、７５０、７７５、８００、８５０、８７５、９００、９５０、９７５、１０００個の領域を含む、これに限定されるわけではないが２０〜約１０００個のアミノ酸の領域を含む、アミノ酸７００−１６６３の一部またはすべてが置換される。一部の実施形態において、Ｃ３のベータ鎖は無処置であり、すなわち天然Ｃ３と同じである。しかしながら一部の実施形態において、Ｃ３のアルファ鎖における置換に加えて、上昇した安定性などの機能を提供するために他の置換を行うことができる（たとえば因子Ｈ結合および因子Ｉ開裂に関連する部位を変異または置換することができる）。特異的置換は、これに限定されるわけではないが、アミノ酸１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４７０−１６６３、１３４８−１６１７、１４７０−１６１７、１２６４−１３２４、１３４８−１３８６、７４９−７８４、８７４−９２１、１４９６−１６６３、１４９６−１６１７および９３６−９７０を含む。一部の実施形態において、これらの範囲でのなお小規模な置換は、所望のＣＶＦ機能または品質を持つＣ３を生じさせるより小規模な領域に一致できる。
【００５０】
好ましい実施形態の免疫原性は、Ｃ３の免疫原性と比較して、低いか、または非存在のままである。一部の実施形態において、修飾Ｃ３タンパク質は実質的に非免疫原性である。実質的に非免疫原性とは、タンパク質がヒト患者に注入されたときに補体活性化機能をなお示せることを意味する。さらに修飾Ｃ３タンパク質は、Ｃ３と同様に非免疫原性でありうるか、またはこれに限定されるわけではないが、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％を含む、約７５％非免疫原性〜約１００％非免疫原性でありうる。
【００５１】
（全身または局所処置の方法）
本明細書で開示した方法によって生成された修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質は、以下のように補体を局所的または全身的に枯渇させるために使用できる：
局所処置は、所望の効果に応じて、補体の枯渇または補体の活性化の結果を生じさせるために多数の方法で実施できる。１つの実施形態において、局所枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質を臓器、組織、空洞、または皮内に局所的に投与したときに作用する。これはその範囲の補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。局所枯渇または活性化も、選択した部位への修飾Ｃ３タンパク質の間欠流または定常流を生じさせるインスリン型ポンプを使用して作用しうる。あるいは補体の局所活性化は、修飾Ｃ３に化学的に付着したときに、特異的組織、疾患、または罹患細胞に局在化して、その部位の補体の連続活性化を引き起こすことができる、特異的モノクローナル抗体を利用する。他の実施形態において、抗体は組換えＤＮＡ技術によって修飾Ｃ３タンパク質に付着できる。
【００５２】
全身枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が全身的に、たとえば静脈内または腹腔内に投与されたときに作用する。これは全身的に補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。この方法は、再潅流傷害、冠状動脈心臓手術、移植または全身性疾患に、特に再発または間欠的活性の間に使用できる。これは本明細書に与える実施例でさらに議論する。
【００５３】
このような各場合および具体的な疾患状態において使用される修飾ヒトＣ３タンパク質の最も好都合な品質の多くは、かなり変化しうる。たとえば補体の即時であるが一時的な除去が望ましい場合、より短い血漿半減期および／または安定性を有するが、高い補体活性化活性（高いＣ３／Ｃ５コンバターゼ活性）を持つ修飾タンパク質が最も適している。慢性疾患を処置する場合、長い血漿半減期および／または安定性ならびに低いまたは停滞した活性が最も適している。
【００５４】
（コンバターゼ活性／機能）
本明細書で修飾Ｃ３タンパク質のための最善の用途を産生および解析する場合、これに限定されるわけではないが以下を含む、多数の機能および活性をそのような解析に使用できる：
因子Ｂに対する親和性−修飾Ｃ３タンパク質が因子Ｂの活性化（ＢａおよびＢｂへの開裂）を補助する効率の相違は、検出可能であり、利用できる。因子Ｂ活性化の補助を開始する、因子Ｂに対する単なる親和性を超えた複数の因子があるが、いったんコンバターゼが形成されると、一般に最も重要である次なる主な特性は、安定性、ＨおよびＩによる調節、そしてＣ３およびＣ５の開裂の活性である。
【００５５】
安定性−Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素およびＣＶＦ，Ｂｂ酵素のどちらも、酵素活性を破壊する各サブユニットへの自発的な崩壊解離を示す。Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は非常に短寿命であり、３７℃にて１．５分間の固有半減期で崩壊するのに対して、ＣＶＦ，Ｂｂ酵素は何桁もより安定であり、約７時間の固有半減期で崩壊する。
【００５６】
因子Ｈおよび／またはＩによる調節−Ｃ３ｂ，Ｂｂ酵素は、因子ＨおよびＩによる調節を受ける。これに対してＣＶＦ，ＢｂおよびＣＶＦは、これらの２つのタンパク質の調節作用に対して完全に耐性である。
【００５７】
開裂Ｃ３の活性−どちらの酵素も、Ｃ３加水分解のその動力学においてやや異なることが示されている。ｋｃａｔ／Ｋｍに基づいて、触媒効率は、ＣＶＦ，Ｂｂと比較してＣ３ｂ，Ｂｂでは約８倍大きい。
【００５８】
免疫原性−ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３はＣＶＦと比較して、著しく低下した免疫原性、または免疫原性の非存在すら示す。加えて、ヒトとは遠くかけ離れた種ではよくあるように、アルファ結合ガラクトースをＣＶＦオリゴサッカライド鎖の端部に移動するトランスフェラーゼ酵素が、コブラで生成される。ヒトはこのトランスフェラーゼを生成しないため、アルファ結合ガラクトース残基は、非自己として見られ、高い免疫原性である。それゆえ、ＣＶＦで生成された特異的ＣＨＯ部分を認識する抗アルファｇａｌ抗体が生成される。ヒトＣ３およびＣＶＦはその位置の５２％における同一性を欠いており、炭水化物の相違はなお顕著である。それゆえ好ましい修飾Ｃ３タンパク質は、１０％未満、そして一部の実施形態においては約４％の、ＣＶＦのアミノ酸によって置換されたＣ３アミノ酸を有し、コブラ由来炭水化物構造（グリカン上の特異的にアルファ結合されたガラクトース）も持たないため、本発明のＣ３ハイブリッドは、著しく低い免疫原性である。一部の実施形態において、好ましい実施形態のＣ３ハイブリッドは、ＣＶＦよりも著しく免疫原性が低い。他の実施形態において、好ましい実施形態のＣ３ハイブリッドは、ＣＶＦよりも少なくとも５０％低い免疫原性である。一部の実施形態において、組換えタンパク質は昆虫または哺乳類細胞系のどちらかで生成され、それは単純な（ｓｉｍｐｌｅ）炭水化物部分、またはヒトに見出されるのと非常に類似した炭水化物部分のどちらかを生じるであろう。
【実施例】
【００５９】
ＣＶＦ配列の大部分がコブラＣ３の相同性部分によって置換された、５つのＣＶＦ／コブラＣ３機能喪失ハイブリッドタンパク質を生成した。これらのハイブリッドタンパク質の予備キャラクタリゼーションは、ＣＶＦのα鎖（Ｃ３のβ鎖）内のコブラＣ３配列による置換が血清補体活性を枯渇させる機能特性を変化させるように見えないことを示したのに対して、β鎖およびγ鎖の部分の置換は大きな効果を有していた。ＣＶＦ残基９７８〜１６４２がコブラＣ３配列によって置換されたハイブリッドタンパク質Ｈ４およびＨ５は、血清補体を枯渇させる能力の低下に加えて、バイスタンダー溶解（Ｃ５開裂の尺度）活性の著しい低下を示した。このことは、Ｃ３のアルファ鎖（ＣＶＦのβ鎖およびガンマ鎖に相当する）がＣＶＦおよびＣ３の活性間の相違の主要な部位であることを示唆した。実験による裏付けの別の系統は、ＣＶＦβ鎖のＣ末端部分がＣＶＦ機能にとって重要であることを強く示唆し、キモトリプシンによるＣＶＦの制限されたタンパク質分解の実験から生じている（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｇｒｕｎｗａｌｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０，Ｓｕｐｐ．１，３０）。それゆえヒトＣ３タンパク質の部分の、コブラ毒因子タンパク質（ＣＶＦ）の対応する部分による置換を有する、多数の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質（Ｃ３）が生成または同定されている。これらの置換は、ＣＶＦ型機能を備えているが、ＣＶＦよりも実質的に低い免疫原性を備えたヒトＣ３タンパク質を生じる。これらのタンパク質の生成および試験を以下の実施例１〜３で述べる。これらのタンパク質の使用およびアッセイを実施例４〜１０に与える。
【００６０】
（実施例１）
ヒト補体Ｃ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質の生成
ヒトＣ３配列の、ＣＶＦ特異的機能に関する重要な構造上の特徴を示すＣＶＦ配列による置換は、ＣＶＦ様機能を備えたＣ３誘導体の生成を可能にする。それゆえ本発明の実施形態は、補体活性化が病因の一部である臨床状況で補体を枯渇させる新規な治療剤として使用するための安定なコンバターゼを形成することによって、補体を枯渇させるＣＶＦ特異的機能を示すヒトＣ３誘導体の産生に関する。ＣＶＦ特異的配列によって引き起こされたヒトＣ３の構造変化は最小限であるため、修飾Ｃ３分子が免疫原性の著しい低下または非存在さえ示せることが明らかである。
【００６１】
表１のヒトＣ３分子は、ＣＶＦ機能を備えたヒトＣ３誘導体を作製するために、特異的ＣＶＦ配列を含有するように組換えられている。本発明の一部の実施形態は、これらの範囲により小さい置換を供給して、比較的安定なコンバターゼを形成できる、そして免疫原性をほとんどまたは全く示さない修飾Ｃ３タンパク質を生じる小さな領域を定義する。
【００６２】
（表１：ヒトＣ３／ＣＶＦクローンの例）
【００６３】
【表１】
ある修飾Ｃ３タンパク質（ハイブリッドタンパク質またはキメラとも呼ばれる）は、以下で述べる部位特異的変異によって生成した。簡単には、ヒトＣ３配列の小規模な部分をＣＶＦと置換する部位特異的変異のために、Ｈｏらの手順を使用した（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．ａｎｄ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）”Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｇｅｎｅ，７７：５１−５９）。この方法では、２つのＰＣＲ反応を実施し、１つは所望の突然変異の部位から上流のどこかのフォワードプライマーを用いた。２つ目は、リバースプライマーが突然変異を含有していた。このラウンドの第２のＰＣＲは、所望の突然変異を含有するフォワードプライマーを有し、リバースプライマーは突然変異部位からの下流である。好ましくは少なくとも１つの特有の制限部位がこのステップによるＰＣＲ生成物にそれぞれ存在し、修飾ＤＮＡを元のクローンに戻すことが可能である。大量のテンプレートＤＮＡと、ＰＣＲプロセスによって導入された突然変異を最小限にするために少ない回数のサイクルを使用して、増幅を実施した。さらに詳細には、ＰＣＲの第１のラウンドでは、５’生成物の反応がテンプレートとしてヒトＣ３プラスミドを使用するのに対して、他方のＰＣＲはＣＶＦプラスミドを使用した。この場合では、中間の「突然変異」プライマーは、部分的にＣ３配列より成り、そして部分的にＣＶＦ配列より成り、２つの配列間で「ブリッジ」を提供する。
【００６４】
増幅の後、２つの生成物をゲル電気泳動によって精製して、ＱｉａｇｅｎからのＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キットを使用してゲルから単離した。次に断片を合せて、２つの断片をテンプレートとして、外部プライマーを増幅プライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を実施した。高濃度のテンプレートＤＮＡを使用して再びＰＣＲ反応を実施して、ＰＣＲによって発生する突然変異を最小限にするために２、３回のサイクルのみ循環させた。得られたＰＣＲ生成物を２つの独自の制限酵素によって切断し、アガロースゲルでサイズ精製し、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムを使用して興味のある断片を単離した。次に断片を適切な酵素によって切断して、同じ酵素で切断したｐＢＳ−ＨｕＣ３またはｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）のどちらかへクローニングした。
【００６５】
第１のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１５５０は、位置１５５０からタンパク質のＣ末端までの相同性Ｃ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有した。第２のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１５０４は、位置１５０４からタンパク質のＣ末端までのヒトＣ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有するハイブリッドタンパク質をコードする。第３のハイブリッドプラスミド、ｐＨＣ３−１３４８は、位置１３４８からタンパク質のＣ末端までの相同性Ｃ３配列を置換するＣＶＦ配列を含有した。第１のプラスミドを調製するために、２つの初期ＰＣＲ反応を実施した。どちらのハイブリッドも、以下のＲＳＰＷＰＧＶＰＴＳＰＶＷＷＮＳＡＤＡ（配列番号：５）の一部または全部を有する約１９アミノ酸ベクターコード配列を有していた。Ｃ３遺伝子のクローニングの方法のために、クローニングベクターによってコードされたこれらのアミノ酸は、ヒトＣ３のＮ末端に対してＮ末端側であった。これらの余分のアミノ酸は、タンパク質の活性に影響しなかったため、それらは悪影響なしに除去できた。第１のプラスミドは、ｐＢＳ−ＨＣ３−２をテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−１（ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＣ−配列番号：６）、およびＨＣ３Ｈ５−２（ＴＣＴＴＣＴＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＧＴＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣ−配列番号：７）をプライマーとして使用して調製した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣ３Ｈ５−３（ＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＣＧＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧ−配列番号：８）およびＨｕＣ３Ｈ５−４（ＴＡＴＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＴＡＡＧＧＧ−配列番号：９）をプライマーとして使用した。どちらの反応もＥｐｐｅｎｄｏｒｆサーモサイクラーで、以下のプログラムを使用して実施した：９５℃で５分、続いて９５℃で３０秒を５サイクル、５８℃で３０秒（５０〜６５℃の勾配）、７２℃で１分、続いて９５℃で３０秒を２０サイクル、５７．５℃で３０秒（５５〜６０℃の勾配）、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分。２つの断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製し、ＨＣ３Ｈ５−１およびＨＣ３Ｈ５−２をプライマーとして、２つの１次ＰＣＲ生成物をテンプレートとして、第２のＰＣＲ反応で合せた。この反応で使用したサイクル条件は：９５℃で５分、続いて；９５℃で３０秒、５１℃で３０秒（４６〜５６℃の勾配）、および７２℃で１．５分を５サイクル、続いて；９５℃で３０秒、５７℃で３０秒（５２〜６２℃の勾配）、および７２℃で１．５分を２０サイクルであった。これには７２℃で１０分間のインキュベーションが続いた。ＰＣＲ断片は上述のように精製して、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩで切断し、ゲル精製して、Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ単離キットを使用して単離した。この断片を同じ酵素によって切断したｐＢＳ−ＨｕＣ３−２内にクローニングして、得られたクローンを、ＥｃｏＲＩを用いた消化による正しい断片の挿入についてスクリーニングした。正しいＥｃｏＲＩ消化パターンを持つクローンはすべて配列決定して、ＰＣＲ誘発突然変異が挿入されていないことを確認した。予想配列を用いた１つのクローン（ｐＨＣ３−１５５０）の大規模な調製を実施して、インサートをＨｉｎｄＩＩＩ（およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによって修復された端部）およびＮｏｔＩによる消化によって切除した。断片をゲル電気泳動によって精製し、上述のようにゲルから単離して、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで切断したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクター、ｐＭＴ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。この構築物からハイブリッドタンパク質の発現を得る試みは、タンパク質の非常に低い収率をもたらした。この理由で、新しい独自のＡｆｅＩ部位に挿入する間に、ｐＨＣ３−１５５０から除去されたヒトＣ３シグナル配列を有する構築物が作製された。これを行うために、ｐＨＣ３−１５５０を以下の２つのプライマー：ＨＣ３ＳｉｇＲｅｍＦ；ＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣ（配列番号：１０、およびＨＣ３ＳｉｇＲｅｍＲ：ＧＣＧＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＣＡＧＣＣ（配列番号：１１）を用いて増幅した。増幅後、断片を上述のように精製して、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで切断した。１５０ｂｐバンドをゲル単離して、同じ酵素で切断したｐＨＣ３−１５５０内にクローニングした。トランスフォーマントからのＤＮＡは、ＡｆｅＩを用いた切断によってスクリーンングして、すべての陽性クローンをＤＮＡ配列決定によって確認した。このプラスミドをｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）と呼んだ。
【００６６】
インサートは、ＡｆｅＩ、ＤｒａＩ（プラスミドを断片化するため）、およびＮｏｔＩを用いた消化によってプラスミドから切除した。消化はゲル上で実施して、５ｋｂ断片を上述のように単離した。次にそれをＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩによって消化したｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内へ結合した。得られたプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０と読んだ。
【００６７】
第２のハイブリッドタンパク質を生成するためのプラスミド、ＨＣ３−１５０４を以下のように同様の方法で生成した。２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初にｐＢＳ−ＨｕＣ３−２をテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−３−Ｆ１（ＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧ−配列番号：１２）およびＨＣ３Ｈ５−３−Ｒ１（ＣＧＴＴＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＴＣＣ−配列番号：１３）をプライマーとして使用した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣＣ３Ｈ５−３−Ｆ２（ＧＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−配列番号：１４）、およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２（ＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧ−配列番号：１５）をプライマーとして使用した。得られた２つのＰＣＲ生成物を、ＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用してＰＣＲ反応で合せた。第２のＰＣＲ反応の後、生成物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製し、次にＮｓｐＶを用いて切断して、同じ酵素で切断した、そしてコウシ小腸アルカリホスファターゼも用いて処理したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたクローンをＥｃｏＲＩで切断して、インサートの向きを決定し、ＰＣＲ誘発修飾が存在しないことを確認するために配列決定した。得られたプラスミドをｐＨＣ３−１５０４と呼んだ。次にこのプラスミドからのインサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５０４と呼んだ。
【００６８】
第３の構築物の生成のためのプラスミド、ＨＣ３−１３４８を、ＨＣ３−１５０４に使用したのと同様の方式で構築した。唯一の相違は、２つの突然変異プライマーがＨｕＣ３Ｈ５−５−１Ｒ（ＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＡＴＴＧＴＣＡＣＣＡＣＣＧＡＣ−配列番号：１６）およびＨｕＣ３Ｈ５−５−２Ｆ（ＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＣＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣ−配列番号：１７）であったことである。１次ＰＣＲ反応では、使用したプライマーはＨｕＣ３Ｈ５−３−１ＦおよびＨｕＣ３Ｈ５−５−１Ｒであり、テンプレートはｐＢＳ−ＨｕＣ３−２であり、これに対して第２の１次ＰＣＲ反応に使用したプライマーはＨｕＣ３Ｈ５−５−２ＦおよびＨｕＣ３Ｈ５−３−２Ｒであり、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして使用した。１次ＰＣＲの後、２つの断片を精製して、ｐＨＣ３−１５０４の構築で述べたように２次ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。２次ＰＣＲ反応生成物を精製して、ＮｓｐＶで切断し、ｐＨＣ３−１５５０内にクローニングして、配列を確認し、インサートを上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ）内にクローニングした。
【００６９】
第４のハイブリッドタンパク質、ＨＣ３−１４９６の生成のためのプラスミドを、以下のような同様の方式で生成した。２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初にｐＢＳ−ＨｕＣ３−２をテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨＣ３Ｈ５−３−Ｆ１（ＴＣＴＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＴＣＧＡＧＧ−配列番号：１２）およびＨＣ３Ｈ５−４−Ｒ１ ＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ（配列番号：１８）をプライマーとして使用した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δテンプレートとして、以下のオリゴヌクレオチド：ＨｕＣＣ３Ｈ５−４−Ｆ２ ＣＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣ（配列番号：１９）、およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２（ＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣＣＡＴＣＴＴＧ−配列番号：２０）をプライマーとして使用した。得られた２つのＰＣＲ生成物を、ＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−３−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用してＰＣＲ反応で合せた。第２のＰＣＲ反応の後、生成物をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを使用して精製した。次にそれをＮｓｐＶで切断して、同じ酵素で切断してコウシ小腸アルカリホスファターゼ処理したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたプラスミドをｐＨＣ３−１４９６と呼んだ。次にこのプラスミドからのインサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内にクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１４９６と呼んだ。
【００７０】
ＨＣ３−１５５０のＣ末端４６アミノ酸残基がヒトＣ３配列によって置換された第５のハイブリッドタンパク質、ＨＣ３−１５５０／１６１７の生成のためのプラスミドを以下で説明する。再び２つのＰＣＲ反応を実施して、コード配列のヒトＣ３およびＣＶＦ部分を得た。最初に以下の２つのプライマー；ＨｕＣ３Ｈ５−Ｆ１ ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＡＴＡＴＣＣ（配列番号：２１）、およびＨｕＣ３Ｈ５−２Ｒ１、ＣＣＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＴＣＴＴＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号：２２）を使用して、ｐＨＣ３−１５５０を増幅した。第２のＰＣＲは、ｐＣＶＦ−ＦＬ３Δをテンプレートとして、ＨｕＣ３Ｈ５−２Ｆ２（ＣＣＣＡＣＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＧ−配列番号：２３）およびＨｕＣ３Ｈ５−２−Ｒ２（ＡＡＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧ−配列番号：２４）をプライマーとして使用して実施した。第１のＰＣＲの後、ＨｕＣ３Ｈ５−Ｆ１およびＨｕＣ３Ｈ５−２−Ｒ２をプライマーとして、２つのＰＣＲ断片をテンプレートとして使用して、断片を第２のＰＣＲ反応で合せた。このＰＣＲの後、増幅断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムを使用して生成し、ＢｓｒＧＩおよびＮｏｔＩで切断して、同じ酵素で切断したｐＨＣ３−１５５０（−ｓｉｇ）内へクローニングした。得られたプラスミドを配列決定して正しい配列を確認した。それをｐＨＣ３−１５５０／１６１７と呼んだ。インサートを上述のように単離して、上述のようにｐＭＴ−Ｂｉｐ／Ｖ５−ＨｉｓＡ内へクローニングした。このプラスミドをｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０／１６１７と呼んだ。
【００７１】
一部の場合では、ヒトＣ３の部分を１を超える部位でＣＶＦ配列とさらに交換して、本明細書で示した目的の１つまたは複数で有用な修飾Ｃ３を産生した。それゆえＣＶＦ特異的配列が１を超える領域に挿入される、または既知の領域が各種の手段によって変異誘発される修飾Ｃ３タンパク質が産生される。たとえば因子Ｂを用いた物理的に安定なコンバターゼの形成に必要な１個または複数の部位に加えて、ヒトＣ３の因子Ｉ開裂部位を変化させることも望ましい。ヒトＣ３の因子Ｉ耐性ミュータントは以前に、Ｆｅｃｋｅらによって１９９８年にうまく説明されている（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｆｅｃｋｅ，Ｗ．，Ｆａｒｒｉｅｓ，Ｔ．Ｃ．，Ｄ’Ｃｒｕｚ，Ｌ．Ｇ．，Ｎａｐｐｅｒ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｒ．Ａ．（１９９８）Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５：２９−３４）。たとえば特異的ＣＶＦ機能に必要な選択配列の置換により、ＣＶＦ機能の特異的なサブセットがそれぞれ存在または除去された新規なＣ３誘導体を組み換えることができる（たとえば安定なＣ３コンバターゼを形成するが、Ｃ５を開裂しないＣ３誘導体またはＣＶＦ誘導体）。Ｃ５を活性化しない修飾Ｃ３分子は、炎症誘発性Ｃ５ａアナフィラトキシンの産生を防止するため、療法のための特別の利点を有することがある。
【００７２】
（実施例２）
修飾ヒトＣ３タンパク質の発現
タンパク質は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞系において、タンパク質分泌のためのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｂｉｐシグナル配列を使用して生成した。簡単には、プラスミドｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０、ｐＭＢ／ＨＣ３−１５０４、ｐＭＢ／ＨＣ３−１４９６、ｐＭＢ／ＨＣ３−１５５０／１６１７、およびｐＭＢ／ＨＣ３−１３４８をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞内に、ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃｈｅｎ，Ｃ．，ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．（１９８７） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７（８），２７４５−２７５２）のリン酸カルシウム法を使用して形質移入した。Ｓ２細胞は、発現プラスミドとｐＣｏＢｌａｓｔの混合物を１９：１（ｗ：ｗ）の比で使用して形質移入した。形質移入後、ブラストサイジン（２５μｇ／ｍＬ）を使用して、両方のプラスミドを含有する細胞を選択した。発現では、形質移入細胞の培養物１リットルを無血清培地（Ｈｉ−ＦｉｖｅおよびＬ−グルタミン）で、ブラストサイジンの非存在下で培養した。細胞が５ｘ１０６細胞／ｍＬの密度に達したとき、最終濃度２５μＭまでのＣｕＳＯ４の添加によって、組換えタンパク質の生成を誘発した。培養物に４〜５日に渡って組換えタンパク質を発現させた。次にＡＮＸ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｈ−３００、およびＣＭ−ＦＦクロマトグラフィーの併用により、培地からハイブリッドタンパク質を精製した。
【００７３】
Ｃ３遺伝子のクローニングの方法のために、クローニングベクターによってコードされた、ヒトＣ３のＮ末端に対してＮ末端側である複数のアミノ酸（約１９）がある。これらの余分なアミノ酸は、タンパク質の活性に影響を及ぼさないため、悪影響なしに除去することができる。一部の場合では、最終構築物を発現ベクター内にクローニングするために必要な制限部位のアーチファクトである、少なくとも２つのアミノ酸があることが好ましい。各種の実施形態において、ヒトＣ３の未変性シグナル配列はもちろんのこと、新生ポリペプチドの小胞体への進入を指示するのに有効な他の任意のシグナル配列を含む、各種のシグナル配列を使用できる。
【００７４】
使用できる他の発現系は、これに限定されるわけではないが：Ｓｆ９またはＨｉＦｉｖｅ細胞のバキュロウィルス感染（他の昆虫発現系）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞（哺乳類発現系）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、およびＨａｎｓｅｌｕｌａ酵母発現系を含む各種の酵母発現系を含む。
【００７５】
（実施例３）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の活性測定の結果
精製した修飾ヒトＣ３タンパク質ハイブリッドに、以下のように多数の機能分析を受けさせた。
【００７６】
補体枯渇：
本アッセイは、タンパク質がヒト（または他の）血清中の補体を枯渇する能力を測定する。アッセイは２ステップで実施した。第１のステップでは、興味のあるタンパク質を通常は連続希釈によって、緩衝液中で所望の濃度まで希釈した（通例、ナノグラム／マイクロリットル未満から約３２０ｎｇ／マイクロリットルまたはアッセイで使用する１０マイクロリットル中３．２μｇ）。次に希釈したタンパク質の分割量１０μＬを未希釈血清と混合する。混合物を３７℃で３時間インキュベートして、Ｃ３コンバターゼを形成することによってタンパク質に補体を活性化させた。形成されたコンバターゼは次に血清のＣ３を活性化できた。次に、残っている補体活性の量を測定するために、血清を希釈して、血清中に存在するときに補体によって容易に溶解される抗体感作ヒツジ赤血球と混合した。この反応を３０分間進行させて、混合物を冷緩衝液中で希釈することによって停止させた。細胞を遠心分離にかけ、放出されたヘモグロビンを測定することによって、溶解細胞を定量した。結果を図４および図９に示す。
【００７７】
予想された通り、非常に少量のＣＶＦがヒト血清中の補体を完全に枯渇することができた。タンパク質ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６のどちらかの８００ｎｇが、ヒト血清１０μＬを完全に枯渇することができた。他のハイブリッドタンパク質はより活性が低く、補体のヒト血清１０μＬを部分的に枯渇させるためにタンパク質約３〜４μｇを必要とした。１つのハイブリッドタンパク質ＨＣ３−１５５０／１６１７は明らかに、試験した濃度では補体を枯渇することができなかった。
【００７８】
タンパク質の２つ（ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８）が実際にモルモット血清中の補体を枯渇させることができなかったという観察は予想されなかったが、この活性はＣＶＦの活性よりも明らかに低かった。特に、好ましい実施形態ＨＣ３−１５５０、ＨＣ３−１５０４、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１３４８はすべて、ヒト血清中の補体を枯渇することができた。
【００７９】
因子Ｂ活性化アッセイ
これは、ハイブリッドタンパク質が因子Ｂを活性化して、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するアッセイであった。コンバターゼ形成は、因子ＢのＢｂおよびＢａへの開裂の機能として測定した。アッセイでは、精製したハイブリッドタンパク質は、３倍過剰の因子Ｂおよび因子Ｄ（すべて高度に精製）によって、３７℃にてマグネシウムの存在下でインキュベートした。各種の時間にて、反応物の分割量を取り出し、マグネシウムをキレートするＥＤＴＡを添加することによって反応を停止させた。反応生成物を非還元性ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流して、タンパク質はクマシーブルーで染色された。変換された因子Ｂの量は、ゲルを専用コンピュータプログラム内にスキャンして、因子ＢおよびＢｂバンド内のタンパク質の量を測定することによって定量した。
【００８０】
図５および１０の結果は、因子Ｂが２つの理由で、ヒトＣ３の存在下で非常に迅速に活性化されたことを示す。ヒトＣ３は、因子Ｂを非常に迅速に結合することができ、これにより因子Ｄによる開裂が可能になる。しかしながら得られたコンバターゼは非常に不安定であり、迅速に分解して、さらに因子Ｂを結合するためにＣ３ｂを利用できるようにする。ＣＶＦの存在下での反応ははるかに低速であり、これは因子Ｂに対するＣＶＦのより低い親和性、およびＣＶＦ含有コンバターゼのより高い安定性の結果であった。ＨＣ３−１５０４またはＨＣ３−１４９６の存在下での因子Ｂの変換は、ＣＶＦときわめて似ている。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３ １５５０／１６１７は、因子ＢをＣＶＦよりもはるかに迅速に、しかしＣ３ｂよりも低速に変換することができた。これはおそらく、コンバターゼがＣＶＦ含有酵素よりも安定でないが、Ｃ３ｂ含有コンバターゼよりも安定であることの結果である。加えてＨＣ３−１５５０による因子Ｂの初期結合は、ＣＶＦによる結合よりもはるかに迅速であると思われる。最後に、ＨＣ３−１３４８は、因子Ｂの開裂を、議論した他のタンパク質よりも巧みに補助しない。これはおそらく、得られたコンバターゼＣ３ｂ含有酵素よりも安定であることと、因子Ｂの初期結合がより迅速でないことの組合せである。
【００８１】
Ｃ３コンバターゼ活性アッセイ
本アッセイは、Ｃ３ａペプチドを開裂させることによって、ハイブリッドタンパク質を含有するＣ３／Ｃ５コンバターゼがヒトＣ３を活性化する活性を測定する。このアッセイを実施するために、コンバターゼを上述のように形成して、反応をＥＤＴＡの添加によって停止させた。次にコンバターゼをヒトＣ３と混合して、反応物を３７℃にてインキュベートした。指示した時間に分割量を取り出して、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含有するゲル装填緩衝液と混合して反応を停止させた。ＳＤＳはタンパク質を変性させて、β−メルカプトエタノールは、タンパク質中のシステイン間のジスルフィド結合を還元する。還元条件下での電気泳動の後、ゲルをクマシーブルー染料で染色して、Ｃ３α鎖およびＣ３α’鎖の相対量を上述のように定量した。各反応で同量のコンバターゼを使用するように注意した。
【００８２】
図６および図１１は、このアッセイでＣＶＦおよびＨＣ３−１５５０の両者がヒトＣ３をほぼ同じ速度で変換できることを示している。ＨＣ３−１５０４は、ＣＶＦよりも著しく低速であるが、１時間以内に存在するＣ３の量を完全に変換できる。ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６は、ＣＶＦよりも高速でＣ３を変換するように見えたが、ＨＣ３−１５５０／１６１７は、Ｃ３を最初は高速で変換して、約１０分後には低速になるように見えた。この現象をさらに調査するために、ＨＣ３−１５０４を除くすべてのタンパク質を使用して、Ｃ３変換アッセイを反復した。反応速度を低下させるために、存在するコンバターゼの量を５分の１に減少させた。これらの結果を図７および図１１のはめ込み図に示す。本アッセイでは、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６がＣＶＦよりも著しく効率的であるコンバターゼを形成することが明らかであった。ＨＣ３−１５５０／１６１７は、最初に活性であるが、約１０分後にはほとんど不活性になるように見えるコンバターゼを形成した。
【００８３】
Ｃ５変換アッセイ
Ｃ５変換活性のアッセイは本質的に、参考としてその全体が本明細書に援用されるＰｅｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０４（１−２），１５９−１７２によって述べられているように実施した。本アッセイでは、Ｃ５コンバターゼは合計３μｇのタンパク質を使用して上述のように形成した。コンバターゼ形成の後、最終濃度５ｍＭまでのＥＤＴＡの添加によって反応を停止させた。次にこの反応物５μＬを、ＰＢＳ中にＣ５７μｇを含有する反応物２５μＬに添加した。反応物を３７℃で２４時間インキュベートし、Ｌａｅｍｍｌｉゲル装填緩衝液７μＬの添加と、それに続く５分間の煮沸によって反応を停止させた。反応生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを還元することによって分離し、ゲルをクマシーブルー染料で染色して、Ｃ５α鎖およびＣ５α’鎖の相対量を上述のように定量した。現在のタンパク質のいずれも、活性Ｃ５コンバターゼを形成できなかった。
【００８４】
因子ＨおよびＩによるタンパク質の分解のアッセイを本質的に、ＯｒａｎおよびＩｓｅｎｍａｎ（参考としてその全体が本明細書に援用される、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（８），５１２０−５１３０）の方法に従って実施した。本方法では、各タンパク質１２μｇを因子Ｈ４．３μｇおよび因子Ｉ ０．３μｇによって、３７℃にて全量６０μＬでインキュベートした。指示した時間に、分割量１０μＬを取り出して、５μＬ ５ｘＬａｅｍｌｉゲル装填緩衝液の添加により反応を停止させた。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、還元条件下の４〜２０％勾配ゲルで分離した。これらのデータは、すべてのタンパク質が、因子Ｈの存在下で、因子Ｉによる消化に対して部分的に耐性であることを示している。同様のアッセイでは、Ｃ３ｂは０時点にてほぼ完全に消化された。
【００８５】
（実施例４）
補体を局所的または全身的に枯渇させる方法
本明細書で開示した方法によって生成した修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質を使用して、以下のように補体を局所的または全身的に枯渇させる：
局所枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が臓器、組織、空洞に、または経皮的に局所投与されるときに作用する。これはその範囲の補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。あるいは局所枯渇は、修飾Ｃ３に化学的に付着したときにそれを特定の組織、疾患部位、または感染細胞に局在化させて、その範囲の補体の連続的枯渇を引き起こす、特異的モノクローナル抗体を使用できる。
【００８６】
全身枯渇は、修飾Ｃ３タンパク質が全身的に、たとえば静脈内または腹腔内に投与されたときに作用する。これは全身的に補体の一時的および完全な枯渇を引き起こす。この方法は、再潅流傷害、冠状動脈心臓手術、移植および／または全身性疾患に、特に症状の再発または間欠的活性の間に使用できる。
【００８７】
このような各場合および具体的な疾患状態において使用される修飾ヒトＣ３タンパク質の最も好都合な品質の一部は、かなり変化しうる。たとえばたとえば補体の即時であるが一時的な除去が望ましい場合、より短い血漿半減期および／または安定性を有するが、高い補体活性化活性が好ましい。慢性疾患を処置する場合、低いまたは停滞した活性を伴っても、長い血漿半減期および／または高い安定性が好ましい。さらにＣ５を活性化しない修飾Ｃ３分子は、炎症誘発性Ｃ５ａアナフィラトキシンの産生を防止するため、ある治療にとって特に好都合でありうる。
【００８８】
（実施例５）
再潅流傷害の処置方法
再潅流傷害の例は、閉塞血管の再開後（たとえば心臓麻痺または虚血性卒中の後）の組織損傷、および移植臓器のレシピエントの血液による再潅流である。詰まった冠状動脈または臓器移植後の再潅流では、移植体に再潅流させる前に、または閉塞血管の開通前に多くの場合で補体を枯渇させることが望ましい。補体活性化を活性化する能力は、それが引き起こす組織損傷を回避できるため、組織損傷の唯一残存している主な源は、酸素欠乏である。通例、再潅流の間の補体活性化による組織損傷は、酸素欠乏による組織損傷の２倍大きい−すなわち組織損傷のほぼ２／３が補体活性化に起因するのに対して、１／３は酸素欠乏に起因する。それゆえ再潅流傷害は、本発明の実施形態で可能であるように、再潅流の前に補体を所望させることによって大幅に減少させることができる。この場合、最高活性コンバターゼを使用することと、高い用量を使用することが好ましい。コンバターゼの安定性は、慢性疾患に対するほど重要ではない。
【００８９】
一般論として、本発明のこれらの実施形態の方法は、修飾Ｃ３タンパク質の有効量を全身的に投与するステップと、補体の枯渇に十分な時間に渡って放置するステップと、次に手術を実施するステップとを含む。
【００９０】
（実施例６）
遺伝子治療の有効性および／または効率を上昇させる方法
本方法は、体内での有用なウィルスの生存の延長を補助するために、補体の枯渇に依存している。補体は遺伝子治療で使用したあるウィルスベクターの本体からの除去を補助することが見出されているため、遺伝子治療ベクターの投与前に循環する補体の量を減少させることが望ましい。このことは、使用されている遺伝子治療の種類に応じて局所的にまたは全身的に実施できる。
【００９１】
方法は、修飾Ｃ３タンパク質の有効量を全身的に、または遺伝子治療が投与されている局所範囲に投与するステップと、補体の枯渇のための時間に渡って放置するステップと、次に遺伝子治療を投与するステップとを含む。
【００９２】
（実施例７）
治療剤（たとえば化学治療剤）または診断剤の送達を向上させる方法
治療薬が投与される範囲への血流を増加させるために、修飾Ｃ３タンパク質は、選択した組織への親和性を持つモノクローナル抗体に化学的に結合される。本実施例では、修飾Ｃ３は、高い活性のＣ３／Ｃ５コンバターゼを形成するＣ３である。修飾Ｃ３／抗体は、組織へ標的化されて、領域に局所補体活性化を生じさせて、補体活性化のために血管透過性を引き起こす。新しい非活性化補体が標的に到着する血液によって連続的に供給されるため、血管透過性は、活性コンバターゼ／抗体複合体が標的に結合されている限り継続する。
【００９３】
肺癌の処置の間の本方法の使用では、肺特異的抗原を認識するモノクローナル抗体を使用して、修飾Ｃ３タンパク質−モノクローナル抗体ハイブリッドが肺癌患者に投与される。抗体は、肺組織に結合して、補体を局所的に活性化する。これは肺における血管透過性を向上させて、化学治療剤をより効率的および効果的に肺癌に作用させる。上述のように、本方法は補体の連続局所活性化を可能にして、それは血管透過性の持続的な局所上昇を可能にする。
【００９４】
（実施例８）
関節リウマチ、狼瘡、および他の自己免疫または免疫複合疾患を処置する方法
本方法は、関節リウマチの例を局所範囲における補体活性化から疼痛および炎症が発生する複数の状態の１つとして使用する。処置のために、修飾Ｃ３タンパク質が全身的または局所的に投与されて、補体を枯渇させることによって、補体反応／活性化を低下させる。これは疾患の症状および疾患の進行を低減させることができる。特に疾患症状の悪化の発現があるときには、補体系の活性の長期低下と組合せて間欠的枯渇を有することも有益でありうる。さらに本方法は、循環免疫複合体を伴う他の疾患、たとえば狼瘡および他の自己免疫疾患によって使用できる。
【００９５】
たとえば補体活性化自己抗体が生成され、体内の自分のタンパク質に対して向けられたとき、疾患効果は主に、補体活性化および組織損傷を引き起こす抗体の標的への結合はもちろんのこと、正常機能への他の干渉によるものである。重症筋無力症は、この種の疾患の例である。自己抗体は、神経が筋肉に接触する神経筋終板に結合する。補体は活性化されて、神経伝達物質を遮断して、麻痺を生じる。本発明の本実施形態の方法を利用すると、補体の全身枯渇は、連続的に、または疾患の悪化の間のどちらかで、症状およびその進行を著しく低減することができる。
【００９６】
（実施例９）
修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法
各種の修飾Ｃ３タンパク質は、各種の疾患、および処置方法に有用である。それゆえ本発明の実施形態の修飾Ｃ３タンパク質の機能品質を解析して、それに従ってそれらを使用することが有用である。以下の方法を、実施例２で生成された精製修飾Ｃ３タンパク質の機能を分析するために使用する。本明細書で述べる方法は、当業者に既知の他の方法と同様に使用できる。
【００９７】
コンバターゼ活性を決定するアッセイ。以下で触れる特異性アッセイに加えて、血清補体活性の枯渇およびバイスタンダー溶解の誘発に関する２つの溶血アッセイをスクリーニングに利用できる。
【００９８】
補体枯渇アッセイ。修飾Ｃ３タンパク質の抗補体（補体消費）活性を測定するために、少量のヒト血清をＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質によって、３時間またはそれより短い期間に渡り３７℃にて、タンパク質濃度５μｇ／ｍＬでインキュベートして、タンパク質に補体を枯渇させる。次に残存する補体溶血活性を感作ヒツジ赤血球を使用して、Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １１７：６３０−４）の方法を含む当業者に既知の方法を使用し、測定する。
【００９９】
バイスタンダー溶解アッセイ。バイスタンダー溶解アッセイは、３７℃の正常モルモット血清２０μＬを濃度５μｇ／ｍＬのＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質２０μＬおよびモルモット赤血球２０μＬ（５ｘ１０８／ｍＬ）と共にインキュベートすることによって実施する。ＣＶＦまたはハイブリッドタンパク質は、赤血球の溶解を引き起こすＣ５の流体相活性化に関与する。それゆえ上澄み中のヘモグロビンの存在はＣ５活性化を示す。反応を３７℃で３０分間インキュベートして、冷緩衝液１ｍＬの添加によって停止させる。遠心分離の後、放出されたヘモグロビンを分光光度法で測定する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ，Ｃ．Ｗ．，ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，Ｈ．Ｊ．（１９８４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７３（１），２０３−２２０）。
【０１００】
Ｃ３コンバターゼ形成／因子Ｂ活性化。因子ＢのＢａおよびＢｂへの開裂を検出するために、ハイブリッドタンパク質（１μＭにて）は、最長２４時間まで３倍モル過剰の因子Ｂおよび因子Ｄ０．５μＭの存在下で、ＭｇＣｌ２の存在下で３７℃にてインキュベートする。因子Ｂの消失および開裂生成物ＢａおよびＢｂの出現を監視するために、反応混合物を非還元条件下にて７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって分析する。必要な場合、次のウェスタンブロットを実施してＢａおよびＢｂ開裂断片を検出できる。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、コブラＣ３、ｉＣ３、ヒトＣ３、ｉＣ３、Ｃ３ｂ、およびＥＤＴＡを含みうる（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８２９２−９）。
【０１０１】
Ｃ３開裂活性。Ｃ３開裂活性を検査するために、Ｃ３コンバターゼは、「Ｃ３コンバターゼ形成／因子Ｂ活性化」を参照して、ハイブリッドタンパク質ならびにヒト因子Ｂおよび因子Ｄを使用して、本発明で述べたように予備形成する。コンバターゼ形成をＥＤＴＡの添加によって停止して、精製ヒトＣ３を添加する。反応混合物は、３７℃で１時間または他の任意の適切な期間に渡ってインキュベートする。分割量を取り、ただちに氷水浴に移して、さらなるＣ３活性化を停止させる。還元条件下で７．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに反応生成物を流すことによって、Ｃ３α鎖の消失およびＣ３α’鎖の出現によってＣ３開裂を監視する。必要な場合、抗Ｃ３抗血清を用いた次のウェスタンブロットを実施する。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、ならびにヒトおよびコブラｉＣ３またはＣ３ｂを含む（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｖｏｇｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８２９２−９）。
【０１０２】
Ｃ５開裂アッセイ。Ｃ５開裂アッセイは、精製ヒトＣ５を基質として使用して、Ｃ３開裂アッセイについて上述したように実施する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｐｅｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４７４２−４７５１）。たとえば図１２を参照。
【０１０３】
コンバターゼ安定性のアッセイ。上述のようにハイブリッドタンパク質および精製ヒト因子Ｂおよび因子Ｄを使用して、２分子コンバターゼを予備形成する。ＥＤＴＡの添加後、混合物を３７℃でインキュベートして、分割量を２４時間または適切ならばより短い期間に渡って取り出して、各分割量をただちに氷水浴に入れる。次にＣ３コンバターゼ活性を上述のＣ３開裂アッセイによって決定する。時間に対するＣ３開裂活性の低下から、各種のコンバターゼの自発的な崩壊解離の半減期を計算する。本アッセイのために不十分な量のハイブリッドタンパク質しか入手できない場合、酵素活性を蛍光発生トリペプチドｔ−ブチルオキシ−カルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニル−アミノメチルクマリンを使用して決定する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ｌ．Ｈ．，Ｇａｂａｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｅｌｌ，Ｗ．，ａｎｄ Ｇｏｔｚｅ，Ｏ．１９８１ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（５），１９６３−１９６５）。
【０１０４】
因子Ｈ結合のアッセイ。ハイブリッドタンパク質への因子Ｈ結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定する。ハイブリッドタンパク質はマイクロタイタープレートに吸収される。オボアルブミンおよびＢＳＡを用いた遮断の後、精製ヒト因子Ｈを１０μｇ／ｍＬにて添加して、室温にて３０分間インキュベートする。洗浄後、結合した因子Ｈを抗因子Ｈ抗体によって、続いて適切なホスファターゼ結合２次抗体によって検出する。因子Ｈがタンパク質に結合できる場合、適切な色変化が観察される。対照は、未変性ＣＶＦ、ｐｒｏ−ＣＶＦ、コブラおよびヒトＣ３はもちろんのこと、コブラおよびヒトｉＣ３も含みうる（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ａｌｓｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：６３−７６）。
【０１０５】
因子Ｉ開裂のアッセイ。ハイブリッドタンパク質は、精製ヒト因子Ｈおよび因子Ｉを用いて３７℃で数時間インキュベートする。反応物を次の４〜２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって還元条件下で分析する。因子Ｉ活性は、１０５ｋＤａα’鎖バンドの強度の低下、および分子量３７および４０ｋＤａのバンドの出現によって決定する。必要ならば、次のウェスタンブロットは、抗ＣＶＦおよび／または抗Ｃ３抗体を使用して実施する。あるいはハイブリッドタンパク質は、ヨードジェン法（Ｆｒａｋｅｒ ａｎｄ Ｓｐｅｃｋ，１９７８）を使用して１２５Ｉによって標識する。開裂生成物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、オートラジオグラフィーによって検出する（参考としてその全体が本明細書に援用される、Ｌａｍｂｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４８２１−３２）。たとえば図１２を参照。
【０１０６】
免疫原性のアッセイ。これに限定されるわけではないが、皮膚試験、そのようなトランスジェニック動物で産生された血清を使用するＲＩＡ試験を含む、試験管内法でヒト免疫系を有するように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物における修飾Ｃ３タンパク質の試験、放射性免疫沈降アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気化学発光、および表面プラスモン共鳴を含む、各種の方法を使用して、免疫原性を分析することができる。加えて一部のタンパク質のマウス、ラットまたはモルモット類似物質を、マウス、ラットまたはモルモットＣ３およびＣＶＦ配列のどれかを使用して構築する。これらを適切な動物に注入して、血清を収集し、ハイブリッドタンパク質に対する抗体の生成について分析する。
【０１０７】
（実施例１０）
血漿半減期を測定する方法
これに限定されるわけではないが、免疫系によって生成される特異的抗体、血清内で循環するプロテアーゼ、非特異的免疫反応、および因子ＨおよびＩなど特異的調節因子を含む、修飾Ｃ３タンパク質の血漿半減期に影響を及ぼす多くの因子がある。修飾Ｃ３タンパク質を活性化させて、次に補体を枯渇できるようにするために、好ましいＣ３タンパク質は、ヒト血漿内で少なくとも最小限の量の時間に渡って持続するであろう。それゆえ修飾Ｃ３タンパク質の血漿半減期を確認して、それらがある疾患の処置にどのように有用であるかを判定することは興味深い。
【０１０８】
本方法は、３つの方法で血漿中の修飾Ｃ３タンパク質の安定性を測定する。しかしながら方法の１つまたはすべてはもちろんのこと、当業者に既知の他の任意の方法も使用できることが理解されるはずである。
【０１０９】
第１の方法は、試験管内での血清の安定性を測定する。ヒト血清は患者の全血から単離および分離する。各種の濃度の修飾Ｃ３タンパク質の分割量を血清に添加し、インキュベートする。血清の分割量を各種の時間間隔で取り出して、持続する修飾Ｃ３の量をＣ３に対して特異的であるモノクローナル抗体を使用してＥＬＩＳＡアッセイで確認する。
【０１１０】
第２の方法は、ヒト化動物における血清の安定性の確認を可能にする。修飾Ｃ３タンパク質を動物に投与して、血液サンプルを時間と共に取り出す。修飾Ｃ３タンパク質の量は、ＥＬＩＳＡアッセイでタンパク質に対する特異的抗体を使用して同定する。
【０１１１】
第３の方法は、ヒト患者での安定性の確認を可能にする。修飾Ｃ３を患者に投与して、血液サンプルを時間と共に取り出す。修飾Ｃ３タンパク質の量はＥＬＩＳＡアッセイを使用して同定する。これは修飾Ｃ３タンパク質が患者の血漿中を循環する期間の明確な表示を与えるであろう。
【０１１２】
一部の実施形態において、使用した抗体は、修飾Ｃ３に対して特異的である必要はない。たとえば正常なＣ３を認識する抗体は、ＥＬＩＳＡ手順で修飾Ｃ３を同定するために試験および使用できる。
【０１１３】
（実施例１１）
表面プラスモン共鳴を使用して測定されるような修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質のＣ３コンバターゼ形成
表２は、補体タンパク質のＣ３、ＣＶＦ、および組換えヒトＣ３／ＣＶＦタンパク質への相対結合を示す。すべての場合で、数字が大きいほどタンパク質相互作用が強いことを示す。タンパク質（Ｃ３ｂなど）をＢＩＡＣＯＲＥＣＨＩＰＴＭに結合させて、次に補体因子と接触させる。チップに結合された（それゆえ修飾Ｃ３タンパク質に結合された）補体因子それぞれの量は、表面プラスモン共鳴によって決定した。結果は：１）Ｃ５を開裂できるコンバターゼを形成できないことと一致して、Ｃ５に結合した組換えタンパク質のどちらも示さず、２）両方のタンパク質は因子Ｈに結合したが、ＣＶＦは結合せず、因子Ｈは、Ｃ３ｂ，Ｂｂコンバターゼ複合体を解離させて、開裂によってＣ３ｂを不活性化するために第２の補体タンパク質、因子Ｉを向けることができる調節タンパク質の１つであることと、３）因子Ｄおよびマグネシウムの存在下での因子Ｂへのタンパク質の親和性は、タンパク質がＣ３コンバターゼを形成する速度（因子Ｂ開裂を仲介するその能力によって測定された−図１０を参照）にほぼ比例したことを示した。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１３４８の両方を開裂させたが、Ｃ３ｂよりも低速であった。ＣＶＦはＨまたはＩ部位を持たないため、ＣＶＦはＨまたはＩによって全く開裂されない。組換えＣＶＦの２鎖分子は２または３個のＩ部位を有するが、因子Ｉによってなお開裂されないことは、興味深い。
【０１１４】
表２：補体タンパク質のＣ３、ＣＶＦ、および組換えヒトＣ３／ＣＶＦタンパク質への相対結合
【０１１５】
【表２】
表３は、表面プラスモン共鳴によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で２５℃にて測定した、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質によって形成されたＣ３コンバターゼの安定性を示す。結果は、両方のタンパク質が実質的にＣ３ｂ含有コンバターゼよりも安定であるＣ３コンバターゼを形成できることを示した。表は、ＨＣ３−１３４８含有コンバターゼが実際にＣＶＦ含有酵素よりも安定であることも示している。これらの結果は、ＣＶＦが３７℃にて７時間の半減期を有し、Ｃ３ｂが３７℃にて１．５分間の半減期を有することを示した、より高温での半減期の他の測定と一致している。
【０１１６】
【表３】
（実施例１２）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の因子Ｂ開裂
図１０の因子Ｂ開裂のグラフは、修飾ヒト補体Ｃ３ｂタンパク質がマグネシウムイオンおよび因子Ｄの存在下で因子Ｂの開裂を仲介する能力の時間経過を示す。これはタンパク質がＣ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するのに使用できる。本アッセイでは、それが因子Ｄおよびマグネシウムの存在下で因子Ｂを非常に効率的に結合する（実施例１１のデータを参照）ことと、得られた複合体が非常に安定であることの両方のために、Ｃ３ｂがコンバターゼを非常に効率的に形成することは注目に値した。ＣＶＦ、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１５０４はすべてコンバターゼをほぼ同じ速度で形成したが、ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１５５０／１６１７は、そのコンバターゼを形成する能力がＣ３ｂとＣＶＦとの中間である。ＨＣ３−１３４８は非常に低速で因子Ｂを結合する。これはいったん形成されたコンバターゼより長い半減期と、因子Ｂへのハイブリッドタンパク質のより低い親和性との組合せによって最も確からしく説明される。
【０１１７】
（実施例１３）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質のＣ３開裂
図１１は、コンバターゼがＣ３を開裂する能力を示し、開裂反応の時間経過を示す。はめ込み図は、主グラフで使用したコンバターゼの２０％で実施した時間経過である。結果は、ＣＶＦおよびＨＣ３−１５５０がＣ３開裂にてほぼ等しく効率的であるコンバターゼを形成したが、ＨＣ３−１３４８およびＨＣ３−１４９６はどちらもＣ３の開裂でＣＶＦよりも約５倍効率的であるコンバターゼを形成したことを示している。ＨＣ３−１５５０／１６１７含有コンバターゼは非常に不安定であるように見えたが、約１０分後にはＣ３開裂を補助しなかったことは興味深い。
【０１１８】
（実施例１４）
修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質の補体枯渇
図９の補体枯渇チャートのデータは、ＨＣ３−１５５０／１６１７を除くすべてのタンパク質が、非常に異なる効率であるが補体を枯渇できたことを示している。ＨＣ３−１５５０およびＨＣ３−１５０４はどちらも補体の枯渇ではきわめて非効率的であったが、ＨＣ３−１４９６およびＨＣ３−１３４８は、天然または組換えＣＶＦと全く同様というわけではないが、補体をきわめて効率的に枯渇することができた。以前にＨＣ３−１３４８を、前出願ではＨＣ３−１３２５と呼んだが、置換マッピングは次に、置換が１３２５ではなくて１３４８であることを示している。
【０１１９】
結論として、ＨＣ３−１４９６は、それのみがＨＣ３−１５０４よりも長いインサート８アミノ酸を有しているが、補体枯渇およびＣ３開裂に関しては非常にＨＣ３−１３４８と似たように、因子Ｂ開裂に関してはＨＣ３−１５０４と似たように作用するため、興味深いタンパク質である。ＨＣ３−１４９６はＨＣ３−１５０４またはＣＶＦと同様にコンバターゼを形成するが、得られたコンバターゼはＣ３の開裂でより活性が高い。
【０１２０】
ＨＣ３１５５０／１６１７は、１５５０からＣ３端までの領域をＣＶＦ領域と置換して、次に最後の４６アミノ酸を除去して、それらをＣ３と置換することによって作製した。このキメラ分子は補体枯渇を示さず、ＨＣ３−１５５０と同様にＣ３コンバターゼを形成して、形成されたＣ３コンバターゼはＨＣ３−５５０とほぼ同じくらい活性であったが、明らかにより短い半減期を有していた。
【０１２１】
（実施例１５）
修飾Ｃ３タンパク質の変異形を生成する方法
好都合な品質を有する修飾Ｃ３タンパク質の変異形が生成される。好都合なとは、変異形がこれに限定されるわけではないが：Ｃ３コンバターゼ活性、血清補体除去、因子Ｂ結合、Ｃ３の開裂、Ｂｂの結合およびＣ３の結合を含む、タンパク質の１つまたは複数の活性を向上させることを意味する。変異形は各領域に１つまたは複数の突然変異体を含むことが可能であり、１つまたは複数のアミノ酸を含むことができる。一部の特異的変異形を以下に述べる：
Ｃ末端がＣ３コンバターゼの安定化に関与しているため、突然変異は任意の修飾Ｃ３タンパク質のＣ末端（ａａ１６１７の後）に生成される。突然変異は挿入、欠失、および置換でありうる。しかしながら突然変異は好ましくは置換である。突然変異はＣ３コンバターゼを安定化する。Ｃ末端における突然変異の例は、これに限定されるわけではないが：位置１６３３、１６５４、および１６５８における突然変異を含む。非保存的変異は保存的変異と同様に、形態に影響するアミノ酸変化に加えて、実施形態に含まれる。しかしながら好ましくは、突然変異は、非保存的アミノ酸変化を生じる。
【０１２２】
コンバターゼの活性の大きな変化の原因と思われる１４９６〜１５０４（８アミノ酸残基）のスパンにおいて、ＣＶＦとヒトＣ３との間には３つの変化がある。それゆえ修飾Ｃ３タンパク質のいずれかの位置１４９６と１５０４との間には、Ｃ３開裂および／または血清の補体枯渇におけるコンバターゼの活性上昇を引き起こす突然片を含む突然変異が含まれている。突然変異は、その領域内の１つまたは複数のアミノ酸に変化できる。好ましくは、突然変異はその領域での１つまたは複数のアミノ酸の置換、特に非保存的アミノ酸変化を生じる突然変異である。
【０１２３】
タンパク質が因子Ｂを結合する能力（特にＣ３ｂおよび因子Ｂが結合する能力）を修飾する、任意の修飾Ｃ３タンパク質における位置１３４８と１４９６との間の突然変異が生成され、好ましくは修飾が因子Ｂに結合する能力を向上させる。ＣＶＦからの領域全体がＣ３に交換され、またはその反対も同様である。含まれるさらなる突然変異がアミノ酸置換を生じさせる。さらに詳細には、ＣＶＦおよびＣ３については１３６７−１３７９の領域が交換され、この領域内の特異的アミノ酸は置換される。
【０１２４】
配列は、Ｂｂの結合または標的Ｃ３分子の結合のどちらかから、Ｃ３開裂のＣ３コンバターゼ活性に関与する、ＣＶＦにおける１５５０付近の領域およびＣ３の１５７０−１５８４の領域の配列において変化する。ＣＶＦ／コブラＣ３置換を使用すると、はるかに低いＣ３開裂の活性を持つタンパク質を生じる一連の４アミノ酸残基が同定された（ＣＶＦ配列ナンバリングに従ってナンバリングされたＱ１５５０Ｇ、Ｅ１５５４Ｒ、Ｐ１５５６ＡおよびＲ１５５７Ｑ位置）。したがって変異形は、修飾Ｃ３タンパク質のＣ３開裂でのＣ３コンバターゼの活性向上を生じる位置１５７０−１５８４のアミノ酸にて生成される。変異形は好ましくは、その領域の１つまたは複数のアミノ酸のアミノ酸置換である。
【０１２５】
上述した各種の方法および技法は、本発明を実施する多数の方法を提供する。もちろん、説明された必ずしもすべての目的および利点が本明細書で述べた任意の詳細な実施形態に従って実現されないことが理解されるはずである。それゆえたとえば、当業者は、本明細書で教示または示唆できる他の目的または利点を必ずしも達成することなく、方法が本明細書で教示した１つの利点または利点の群を達成または最適化する方法で実施できることを認識するであろう。
【０１２６】
さらに当業者は、異なる実施形態から各種の特徴の互換性を認識するであろう。同様に上述した各種の特徴およびステップは、そのような特徴およびステップそれぞれの他の既知の同等物と同様に、本明細書に述べた原理に従って方法を実施するために当業者が組合せおよび／または交換することができる。本明細書で引用した各特許、文献引用などは、参考としてその全体が本明細書に援用される。
【０１２７】
本発明は一部の実施形態および実施例の状況で開示されているが、当業者によって、本発明が特に開示された実施形態を超えて、他の代わりの実施形態および／または用途ならびにその明らかな改良および同等物に及ぶことが理解されるはずである。したがって本発明は、本明細書の好ましい実施形態の具体的な開示によって制限されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】斜線部分が成熟タンパク質中に存在する、Ｃ３およびＣＶＦの鎖構造を示す。
【図２】元のＣＶＦ／コブラＣ３ハイブリッドタンパク質のマップを示し、５つのハイブリッドタンパク質それぞれにおいてコブラＣ３配列と置換されたＣＶＦの領域を示す。
【図３Ａ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｂ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｃ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｄ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｅ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｆ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図３Ｇ】ＣＶＦ１のｃＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列（配列番号：３および４）を示す。α−、γ−、およびβ−鎖のＮＨ２末端およびＣ末端、機能的に重要な領域、および既知のリガンド結合部位を示す。アミノ酸残基のナンバリングは、ｐｒｏ−ＣＶＦ１分子のＮＨ２末端にて開始する。
【図４】ＣＶＦと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）のヒト血清における補体枯渇アッセイの結果を示す。
【図５】ＣＶＦおよびＣ３ｂと比較して修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）が因子Ｂを活性化して、Ｃ３／Ｃ５コンバターゼを形成する能力を測定するアッセイの結果を示す。
【図６】ＣＶＦと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質（ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０）に関する、Ｃ３を活性化するためにＣ３／Ｃ５コンバターゼの活性を測定するアッセイの結果を示す。
【図７】ＣＶＦと比較した、修飾ヒトＣ３タンパク質ＨＣ３−１３４８のＣ３開裂（図６の実験で使用したコンバターゼの量の２０％を使用して）を測定するアッセイの結果を示す。
【図８】ＣＶＦおよびヒトＣ３ｂと比較した、３つの修飾ヒトＣ３タンパク質：ＨＣ３−１３４８、ＨＣ３−１５０４、およびＨＣ３−１５５０の活性測定の結果のまとめを示す。
【図９】天然ＣＶＦおよび各種のヒトＣ３タンパク質の補体枯渇の結果を示すグラフである。
【図１０】Ｃ３ｂ、組換えＣＶＦおよび各種の修飾ヒトＣ３タンパク質による因子Ｂの開裂の結果を示すグラフである。
【図１１】天然ＣＶＦおよび各種の修飾ヒトＣ３タンパク質のＣ３開裂の結果を示すグラフである。はめ込みグラフは、主グラフのコンバターゼの２０％を使用して実施した同じ反応である。
【図１２】因子ＨおよびＩによる、選択したハイブリッドタンパク質の開裂の結果を示すグラフである。
【図１３】ヒトＣ３／ＣＶＦハイブリッドタンパク質によるＣ５変換の結果を示すゲルの写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連する配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を含む、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質。
【請求項２】
ＣＶＦの置換部分がＣ３のアルファ鎖内である、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項３】
ＣＶＦの置換部分がＣ３のアルファ鎖のＣ末端部分である、請求項２に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項４】
置換Ｃ末端部分がヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含む、請求項３に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項５】
置換Ｃ末端部分がヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延伸しない内部部分である、請求項３に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項６】
修飾タンパク質が未修飾ヒトＣ３タンパク質と実質的に同数のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項７】
置換がヒトＣ３タンパク質のアミノ酸位置７００−１６６３内の任意の位置を含む、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項８】
置換が最初の位置および最後の位置を含み、最初の位置が７４９、８７４、９３６、１２６４、１３４８、１４９６、１５０４、および１５５０から成る群より選択され、最後の位置が７８４、９２１、９７０ １３２４、１５５０、１６１７、および１６６３から成る群より選択される、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項９】
置換がアミノ酸：１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４９６−１６６３、１３４８−１６１７、１４９６−１６１７、１２６４−１３２４、７４９−７８４、８７４−９２１、９９４−１６６３、９９４−１５５０および９３６−９７０から成る群より選択される、請求項８に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１０】
修飾Ｃ３タンパク質が因子Ｂへの親和性を有し、活性コンバターゼの形成を補助する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１１】
コンバターゼが３７℃にて約１５分間の固有半減期を有する、請求項１０に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１２】
修飾タンパク質がＣ３またはＣＶＦによってコードされないＮ末端に追加の１〜１９アミノ酸を有する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１３】
修飾タンパク質が実質的に非免疫原性である、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１４】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を患者に補体の枯渇に有効な量で投与するステップを含む、補体を枯渇させる方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を補体を枯渇させるのに十分な量で送達するステップと；
遺伝子治療を提供するステップと；
そこから向上した結果を観察するステップと；
を含む、遺伝子治療の効率および／または有効性を向上させる方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を血流を向上させるのに十分な量で送達するステップと；
治療剤または診断剤を提供するステップと；
を含む、治療剤または診断剤の送達を向上させる方法。
【請求項１７】
送達ステップの前に修飾Ｃ３タンパク質を特定の組織に対する親和性を備えた抗体に化学的に結合させるステップ；
をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
補体を枯渇させるのに十分な量で修飾Ｃ３タンパク質を投与するステップ；
を含む、望ましくない補体活性化に関連する状態または疾患を処置する方法。
【請求項１９】
状態または疾患がぜんそく、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、関節リウマチ、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋虚血、再潅流、敗血症、超急性拒絶、移植片拒絶、心肺バイパス、心筋梗塞症、血管形成、腎炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、脊髄損傷およびパーキンソン病から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
修飾タンパク質の機能プロフィールを形成するために、修飾Ｃ３タンパク質の少なくとも１つの特性を特徴付けるステップと；
機能プロフィールを処置される疾患または状態と結び付けるステップと；
を含む、修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２２】
請求項１に記載の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を発現する発現系。
【請求項１】
ヒトＣ３タンパク質の部分の、実質的にそれに関連する配列のコブラ毒因子タンパク質の対応する部分による置換を含む、修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質。
【請求項２】
ＣＶＦの置換部分がＣ３のアルファ鎖内である、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項３】
ＣＶＦの置換部分がＣ３のアルファ鎖のＣ末端部分である、請求項２に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項４】
置換Ｃ末端部分がヒトＣ３タンパク質のアミノ酸１６６３を含む、請求項３に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項５】
置換Ｃ末端部分がヒトＣ３タンパク質のＣ末端全体を通じて延伸しない内部部分である、請求項３に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項６】
修飾タンパク質が未修飾ヒトＣ３タンパク質と実質的に同数のアミノ酸残基を有する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項７】
置換がヒトＣ３タンパク質のアミノ酸位置７００−１６６３内の任意の位置を含む、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項８】
置換が最初の位置および最後の位置を含み、最初の位置が７４９、８７４、９３６、１２６４、１３４８、１４９６、１５０４、および１５５０から成る群より選択され、最後の位置が７８４、９２１、９７０ １３２４、１５５０、１６１７、および１６６３から成る群より選択される、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項９】
置換がアミノ酸：１５５０−１６６３、１５０４−１６６３、１３４８−１６６３、１５５０−１６１７、１５０４−１６１７、１４９６−１６６３、１３４８−１６１７、１４９６−１６１７、１２６４−１３２４、７４９−７８４、８７４−９２１、９９４−１６６３、９９４−１５５０および９３６−９７０から成る群より選択される、請求項８に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１０】
修飾Ｃ３タンパク質が因子Ｂへの親和性を有し、活性コンバターゼの形成を補助する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１１】
コンバターゼが３７℃にて約１５分間の固有半減期を有する、請求項１０に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１２】
修飾タンパク質がＣ３またはＣＶＦによってコードされないＮ末端に追加の１〜１９アミノ酸を有する、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１３】
修飾タンパク質が実質的に非免疫原性である、請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質。
【請求項１４】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を患者に補体の枯渇に有効な量で投与するステップを含む、補体を枯渇させる方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を補体を枯渇させるのに十分な量で送達するステップと；
遺伝子治療を提供するステップと；
そこから向上した結果を観察するステップと；
を含む、遺伝子治療の効率および／または有効性を向上させる方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を血流を向上させるのに十分な量で送達するステップと；
治療剤または診断剤を提供するステップと；
を含む、治療剤または診断剤の送達を向上させる方法。
【請求項１７】
送達ステップの前に修飾Ｃ３タンパク質を特定の組織に対する親和性を備えた抗体に化学的に結合させるステップ；
をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
補体を枯渇させるのに十分な量で修飾Ｃ３タンパク質を投与するステップ；
を含む、望ましくない補体活性化に関連する状態または疾患を処置する方法。
【請求項１９】
状態または疾患がぜんそく、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、関節リウマチ、アルツハイマー病、多発性硬化症、心筋虚血、再潅流、敗血症、超急性拒絶、移植片拒絶、心肺バイパス、心筋梗塞症、血管形成、腎炎、皮膚筋炎、類天疱瘡、脊髄損傷およびパーキンソン病から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
修飾タンパク質の機能プロフィールを形成するために、修飾Ｃ３タンパク質の少なくとも１つの特性を特徴付けるステップと；
機能プロフィールを処置される疾患または状態と結び付けるステップと；
を含む、修飾Ｃ３タンパク質を選択する方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２２】
請求項１に記載の修飾ヒト補体Ｃ３タンパク質および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の修飾Ｃ３タンパク質を発現する発現系。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図３Ｅ】
【図３Ｆ】
【図３Ｇ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２００８−５０２３２３（Ｐ２００８−５０２３２３Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１１０７７（Ｐ２００７−５１１０７７）
【出願日】平成１７年４月２９日（２００５．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５１１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７８５
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９２２２５４３４）ユニバーシティ・オブ・ハワイ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＡＷＡＩＩ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２９日（２００５．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５１１９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７８５
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５９２２２５４３４）ユニバーシティ・オブ・ハワイ (4)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＡＷＡＩＩ
【Ｆターム（参考）】
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