コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用
【課題】遺伝子発現解析において、「２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としてのポリヌクレオチド」の使用が必須となる、特定の塩基配列等からなる塩基配列群に属するいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド等を提供する。
【解決手段】コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及び、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片。
【解決手段】コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、及び、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
種差の問題から、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をラット、マウス等のげっ歯類では十分評価することが困難であり、よりヒトに近い実験動物の利用が求められている。
現在、アカゲザル、カニクイザル等の大型サルが当該目的のために利用されているが、コスト、操作性等の面から小型サルが実験動物として注目を集めている（例えば、非特許文献１参照）。
一方で、ラット、マウス等のげっ歯類を用いた研究では、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が盛んになってきている（例えば、非特許文献２参照）。
上記の研究動向において、実験動物として注目を集めている小型サルにおいても、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が一層重要になると考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】Mansfield, K., Comp. Med., 53, 383 (2003)
【非特許文献２】Hamadeh, H. K. et al, Tox. Sci., 67, 219 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、このような遺伝子発現解析において、異なる被検試料、特に異なる個体や異なる種類の組織由来の被検試料を用いる場合には、当該被検試料の中に含まれている各遺伝子の転写産物量は大きくばらついているために、「２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としてのポリヌクレオチド」の使用が必須となる。しかしながら、小型サルにおいては、現時点ではこのようなポリヌクレオチドが十分に知られておらず、当該ポリヌクレオチドの早急な取得・開発等が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、実験動物として注目を集めている小型サルのなかでも新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Callithrix Jacchus）という超小型サルに注目し、当該サルを用いた遺伝子発現解析に関する研究において必須となる、「２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としてのポリヌクレオチド」としてコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）；
２．コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
３．下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列；
４．DNA又は検出のための組成物であって、前項２又は３記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物（以下、本発明組成物と記すこともある。）；
５．前項２又は３記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする前項４記載の組成物；
６．２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての前項２又は３記載のポリヌクレオチドの使用（以下、本発明使用と記すこともある。）；
７．前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項６記載のポリヌクレオチドの使用；
８．２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
（１）前項２又は３記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
９．前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項８記載の測定方法；
１０．第一工程及び／又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする前項８又は９記載の測定方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明において利用される小型サルは、新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Callithrix Jacchus）である。当該サルは、ヒトに近縁な真猿類に属する超小型サルであり、大型サルに比べて繁殖効率が良くしかも小型で取り扱いが容易である。
【０００９】
本発明遺伝子は、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子である。当該遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）としての性質を有しているために、当該遺伝子の発現は、各種の薬剤処理、疾患の有無、生理的な刺激等により影響を受けにくく、その転写産物が生体組織において普遍的かつ恒常的に発現している。そのため、当該遺伝子の発現量を被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準として用いることにより、所望の遺伝子の転写産物量の補正を行うことが可能となる。勿論、特定の生物種（例えば、コモンマーモセット等が属するマーモセット種）を対象として遺伝子発現解析を行う場合には、その生物種に特有のハウスキーピング遺伝子の転写産物量を用いて当該遺伝子の転写産物量を補正することが特に好ましい。
【００１０】
本発明ポリヌクレオチドは、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
【００１１】
ここで、項目番号（４）で示される「部分塩基配列」とは、本発明遺伝子又はこれを取得若しくは検出するために用いられるプライマー若しくはプローブを構成する塩基配列であり、項目番号（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列よりも短い長さの塩基配列である。具体的には例えば、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等を挙げることができる。
【００１２】
本発明において「塩基同一性」とは、２つのＤＮＡ又はＲＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はＲＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.、22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、当該同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１３】
本発明における「塩基同一性」は塩基配列基準であって、例えば、約95％以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得すればよいが、これらを取得できる方法であれば如何なる方法を用いて取得してもよい。
例えば、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載される遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
【００１５】
まず、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞由来の全ＲＮＡを調製する。
具体的には例えば、コモンマーモセットの肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等のタンパク質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに当該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、Trizol試薬（インビトロジェン社）、Isogen（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。
次いで、得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴdTプライマーをＲＮＡのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。更に一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲＮＡ断片をプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIを用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成することもできる。得られたｃＤＮＡは、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）やSuperScript Choice System（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10等のベクターとリガーゼとを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
また、コモンマーモセットの組織片又はそれらの動物由来培養細胞から、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善1998）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製する。
例えば、試料が肝臓の場合には、抽出緩衝液［10mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1 mM EDTA (pH8.0), 20μ g/ml, 0.5%SDS］を組織重量に対し10倍量（v/w）加え粉砕し、さらにProteinaseKを最終濃度100μｌ/ml になるように加え混合する。この混合物を50℃で３時間保温した後、フェノール／クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分にエタノールを添加しゲノムＤＮＡを沈殿させ回収する。また、試料が末梢血の場合には、DNA-Extraction kit(ストラータジーン社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt10等のベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを得ることができる。
【００１６】
上記のような一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡそのもの、又は、ｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１で示される塩基配列の部分塩基配列又は当該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応や、上記ｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１で示される塩基配列又は当該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示される塩基配列の５’端側から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１で示される塩基配列の３’端側から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、反応液50μl中に、Ex-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液（タカラバイオ社製）5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5 mMのdATP, dGTP, dCTP及びdTTPを含む。）5μl（dATP, dGTP, dCTP及びdTTP各々の最終濃度が0.25 mM）、10μMプライマー 各0.5〜2.5μl（終濃度が0.1〜0.5μM）、鋳型ｃＤＮＡ 0.1〜0.5μg、Ex-Taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、以下の条件による３工程の増幅サイクルを繰り返して行う。まず変性工程として、例えば約90℃から約96℃、好ましくは約94℃から約95℃で、1分から15分間、好ましくは1分から2分間の保温を行う。次にプライマーのアニーリング工程として、例えば約30℃から約70℃、好ましくは約40℃から約60℃で、約3秒から約3分間、好ましくは約5秒間から約2分間の保温が行われる。さらにＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約70℃から約75℃、好ましくは約72℃から約73℃で、約15秒間から約5分間、好ましくは約30秒間から約4分間の保温が行われる。この３工程からなる増幅サイクルを、約20回から約50回、好ましくは約25回から約40回行う。このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿により回収することにより、或いは、例えば、QIAquick ＰＣＲ Purification Kit（キアゲン社製）のような市販のＤＮＡ断片精製用のカラムを用いて、精製及び回収することができる。回収の際にＤＮＡ断片を溶解させる溶媒として、水、生理食塩水、1 から100 mMトリス塩酸、ＴＥ緩衝液［10 mMトリス塩酸、1 mM EDTA、pH7.4から8.0］等の適当な溶液を用いることができる。
【００１７】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、当該ポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を２回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等を挙げることができる。また、例えば、5xSSC、50mMHEPES pH7.0、10xデンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に65℃にて保温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件を挙げることもできる。尚、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１８】
このようにして得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載された遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）等の市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法（例えば、Maxam, A. M. & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977等に記載される）やSanger法（例えば、Sanger, F. & A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F. & Nicklen & A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に準じて確認することができる。ABI社製モデル377等の自動ＤＮＡシークエンサーを用いる場合には、対応するＤＮＡシークエンスキット、例えば、ABI社製Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等を用いることができる。
【００１９】
次いで、DNA又はRNAの検出のために用いられる本発明ポリヌクレオチドについて説明する（以下、ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドと記すこともある）。
ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、以下のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
ここで、項目番号（２）としては、例えば、
（２ａ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の６０塩基長を有する塩基配列、（２ｂ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の５０塩基長を有する塩基配列、（２ｃ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の３５塩基長を有する塩基配列、（２ｄ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の３０塩基長を有する塩基配列、（２ｅ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の２０塩基長を有する塩基配列等を挙げることができる。
【００２０】
上記、項目番号（１）から（３）のいずれかの特徴を有するＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、解析対象となる、所望の遺伝子を検出するために使用される１個から複数個のポリヌクレオチドと、性質の類似性を指標にして選択することができる。例えば、後述するような、長鎖のｃＤＮＡを用いてＤＮＡ又はＲＮＡを検出するＤＮＡアレイを用いる場合には、項目番号（１）で示される、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。また、短鎖のポリヌクレオチドを用いたＤＮＡアレイや、ＲＴ−ＰＣＲの如くの方法によりＤＮＡ又はＲＮＡを検出する場合には、項目番号（２）又は（３）で示される、ポリヌクレオチドのいずれかを用いるのが好ましい。具体的には、項目番号（２）としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１４６１から１４７８、１５９５から１６９０、１７６８から１８０９のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５２０から１５３７、１６５４から１７４９、１８２７から１８６８で終了する、連続する６０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２７５、１４６１から１４８７、１５９５から１６９５、１７７３から１８１４のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３２３から１３２４、１５１０から１５３６、１６４４から１７４４、１８２２から１８６３で終了する、連続する５０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２８２、１４６１から１４９０、１５７２から１７０２、１７８０から１８２１のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３０８から１３１６、１４９５から１５２４、１６０６から１７３６、１８１４から１８５５で終了する、連続する３５塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２８５、１４６１から１４９３、１５７６から１５８０、１５９５から１７０５、１７８３から１７９９、１８１７から１８２４のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３０３から１３１４、１４９０から１５２２、１６０５から１６０９、１６２４から１７３４、１８１２から１８２８、１８４６から１８５３で終了する、連続する３０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３３２、１３３５、１３３６、１３４８、１３４９、１３５３、１３８２、１４４８、１４４９、１５３３、１６２１、１７２４、１７２６のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３５１、１３５４、１３５５、１３６７、１３６８、１３７２、１４０１、１４６７、１４６８、１５５２、１６４０、１７４３、１７４５で終了する、連続する２０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。より具体的には、上記で指定される塩基配列の中から、所望の遺伝子を検出するために使用される、１個から複数個のポリヌクレオチドと、配列長、融点等の性質が同等となるポリヌクレオチドを選択することが好ましい。
また、項目番号（３）で示すように、ＤＮＡアレイやノーザン法の如く、ハイブリダイゼーション法を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを検出する場合には、上記項目番号（１）又は（２）のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。
上述した項目番号（１）から（３）のいずれかで示される塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドは、それぞれ単独で使用することもできるだけではなく、複数個の組み合わせで使用することもできる。後述するＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマー、又はプローブとしての使用においては、項目番号（２）から（３）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（塩基長２０〜６０、好ましくは塩基長２０〜５０）の中から、ＰＣＲ反応を実施するのに適切なポリヌクレオチドを選択することが好ましい。ポリヌクレオチドの選択には、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて、上記に示したポリヌクレオチドから行うことができる。また、検出時の信頼性を高める目的で、複数個の異なった遺伝子の塩基配列領域を検出するポリヌクレオチドを用いることも行われているが、この場合には、項目番号（２）又は（３）で示される塩基配列を有し、それぞれ互いに重複しない塩基配列を有するポリヌクレオチドを、複数個使用するのが望ましい。
【００２１】
ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、これらを取得できる方法であれば如何なる
方法を用いて取得してもよい。
例えば、取得本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの項で具体的に示したように、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得することができる他、塩基配列の情報を基づき、市販のＤＮＡ合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。
【００２２】
次いで、本発明組成物について説明する。
本発明組成物は、DNA又はRNA検出のための組成物であって、本発明ポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。当該組成物は、本発明ポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなる形態であってもよい。当該形態のうち、本発明ポリヌクレオチドが固体基板の表面に固定されてなる代表的なものはＤＮＡアレイである（以下、本発明ＤＮＡアレイと記すこともある。）。
遺伝子発現解析手法は、疾患の診断、分類若しくは発生予測、又は薬剤の効力若しくは毒性・副作用の機構解析等の、様々な局面で盛んに利用されている。遺伝子発現解析手法には、ノーザンブロッティング法が従来から利用されてきたが、定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法（以下、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法と記すこともある。）や、ＤＮＡアレイを用いた手法（以下、DNAアレイ法と記すこともある。）が開発され、現在ではこれら手法も活用されている。
前者の遺伝子発現解析手法（即ち、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法）では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又は全ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡをリバーストランスクリプターゼを用いて合成した後、合成されたｃＤＮＡ量をＰＣＲ法を用いて定量し、定量されたｃＤＮＡ量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
後者の遺伝子発現解析手法（即ち、DNAアレイ法）では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又は全ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡ又はこれをin vitro転写反応することによって得られるｃＲＮＡが蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体を、ＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした標識体量を蛍光強度、放射線強度等に基づき定量し、定量されたｃＤＮＡ量又はｃＲＮＡ量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
【００２３】
本発明ＤＮＡアレイは、固体基板の表面に配置されたＤＮＡプローブの数により、おおよそ数個から数百個のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイ及びそれ以上の数のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイの２種類に大別されるが、ここでは両者を含むものである。
本発明ＤＮＡアレイは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含むものであり、これ以外のプローブの数やその塩基配列については特に制限されない。例えば、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外の遺伝子に対応するプローブを含むＤＮＡアレイが挙げられる。好ましくは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外のコモンマーモセット由来の遺伝子に対応するプローブを含むＤＮＡアレイが挙げられる。
【００２４】
本発明ＤＮＡアレイは、例えば、ゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて、配列番号１で示された塩基配列の全部又は一部よりなるＤＮＡ断片を含むＤＮＡプローブを調製する工程、及び、調製されたＤＮＡプローブを固体基板の表面に固定化する工程の両工程により製造することができる。また、ＤＮＡプローブが有する塩基配列の情報に基づき、Fodor, S. P.A. et al., Science, 251, 767 (1991) に記載されたように、固体基板の上に塩基を順次添加して化学合成させてゆくことにより、ＤＮＡアレイを直接的に製造することも可能である。以下に、前者の製造方法を詳細に説明するが、本発明ＤＮＡアレイに係る製造法はこれに限定されるものではない。
まず、ＤＮＡプローブを調製する。ＤＮＡプローブの調製方法として、例えば、コモンマーモセットの組織から調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により調製することができる。当該ｃＤＮＡを鋳型にして、Ex Taq（タカラバイオ）等のＤＮＡホ゜リメラーセ゛を用いてＰＣＲすることにより、ＤＮＡを増幅する。このようにして増幅されたＤＮＡをpUC118等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。尚、当該ＤＮＡの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
【００２５】
ＰＣＲ反応後の増幅されたＤＮＡはプローブとして用いることができる。
ＰＣＲ反応後の増幅されたＤＮＡを、当該ＤＮＡを含む溶液からエタノール沈殿によって回収することにより、又は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）等の市販のＤＮＡ断片精製用カラムを用いて精製することができる。精製において当該ＤＮＡを溶解させる溶媒として、ジメチルスルホキシド、水、生理食塩水、1〜100 mMトリス塩酸等の適当な緩衝液又は3xSSC等の溶液を用いることができる。好ましくは、3XSSCを用いればよい。溶解の際のＤＮＡの濃度は、約1〜約100μMに調整する。ベクターにクローニングされたＤＮＡを用いる場合には、適当な制限酵素で目的とするＤＮＡ断片を切り出し、必要に応じてアガロースゲルで精製を行う。得られたＤＮＡ断片は、例えば、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）のような市販のＤＮＡ断片精製用カラムを用いて、ゲルを分離することができる。ゲルから分離されたＤＮＡ断片を上記の溶媒に溶解させる。また、クローニングベクターのクローニング領域の両端に通常設定されているようなT7、T3、SP6等の塩基配列をプライマーとして再度ＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡプローブのためのＤＮＡを取得してもよい。
ＤＮＡアレイに配置されるＤＮＡ断片の長さが約20塩基〜約100塩基の場合には、塩基配列の情報を基づき、市販のＤＮＡ合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。化学合成後のＤＮＡ断片を、上記のＤＮＡ断片精製用カラム、高速液体クロマトグラフィー等により精製し、これを上記の溶媒に溶解させる。
【００２６】
次に、上記で得られたＤＮＡを、固体基板等の担体上に固定化する。担体としては、ガラス板、石英板、シリコンウエハー、メンブレンフィルター等の固体基板を挙げることができる。担体の大きさは、担体上のＤＮＡプローブの配置数、ＤＮＡプローブのスポットの大きさ等に応じて適宜設定すればよい。ＤＮＡを固定化するための方法としては、ＤＮＡの種類、担体の種類等に応じて適当な方法を選択すればよい。例えば、固定化するＤＮＡがｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物等の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等のポリ陽イオンで表面処理された固体担体に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等の官能基が導入された固層表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチン等の官能基が導入されたＤＮＡを共有結合させる方法等を挙げることができる。調製されたＤＮＡを担体に配置するには、マイクロピペット、ピペットマン等を用いて、当該ＤＮＡが溶解させた溶液を手操作により滴下する方法、数10μm〜数100μmのサイズで予め指示された位置に機械操作により配置する方法を用いてもよい。ＤＮＡの配置方法としては、ピン先端の担体の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を応用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等があり、いずれの方式を用いても良い。ピン方式としては、Affymetrix 427 Arrayer（アフィメトリクス社製）、キャピラリ−方式としてはLucidea Array Spotter（アマシャムバイオサイエンス社製）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。配置されるＤＮＡの溶液量としては、機械式に配置する場合には0.01〜100 nl、手操作操作により配置する場合には0.1〜100μlを好ましく挙げることができる。
【００２７】
次に、本発明使用及び本発明測定方法について説明する。
本発明使用は、２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての本発明ポリヌクレオチドの使用である。本発明使用では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
本発明測定方法は、２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、（１）前項２記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、を有することを特徴とする。本発明測定方法では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
【００２８】
本発明測定方法における第一工程及び第二工程での、遺伝子の転写産物量を測定する方法としては、転写産物量を定量的に測定できる方法であれば如何なる方法であってもよいが、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。好ましくは、例えば、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法等が挙げられる。
【００２９】
（１） ノーザンハイブリダイゼーション法
まず、解析対象である所望の遺伝子の塩基配列に相当するＤＮＡを調製し、次いで、その全部若しくは一部からなるＤＮＡを標識して標識化プローブを調製する。ここで「標識化ＤＮＡプローブ」とは、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられる蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体であるＤＮＡ断片である。また、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドについても同様に、そのＤＮＡを標識して標識化プローブを調製する。尚、所望の遺伝子は、コモンマーモセットの組織から上記の方法により調製されたｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法等によって調製することができる。当該ｃＤＮＡを鋳型にして、Ex Taq（タカラバイオ）等のＤＮＡホ゜リメラーセ゛を用いてＰＣＲすることにより、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲの条件は、所望の遺伝子の種類、使用するプライマーの塩基配列等により異なるが、例えば、前述のような反応条件等を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡはpUC118等をベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該ＤＮＡの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert 法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
【００３０】
このようにして調製された所望の遺伝子のＤＮＡ、及び本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを、次のようにして蛍光色素、放射性同位元素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたＤＮＡを鋳型とし、当該ＤＮＡの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、[α-32P]dCTP又は[α-32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してＰＣＲを行うことにより、32Pで標識されたプローブが得られる。また、上記のようにして調製されたＤＮＡを、例えば、Random prime labeling Kit（ロシュダイアグノースティック社）、MEGALABEL（タカラバイオ）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００３１】
次に、このようにして調製されたプローブを使用して、ノーザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には、本発明測定方法での第二工程において、所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとするコモンマーモセット由来の２種以上の被検試料から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。調製された全ＲＮＡ20μg又はｍＲＮＡ 2μｇをアガロースゲルで分離し、10ｘSSC（1.5M NaCl、0.35M クエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブレン［例えば、Hybond−N（アマシャムバイオサイエンス社製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブレンを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9M NaCl、0.21M クエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1% (w/v)フィコール400、0.1％ (w/v) ポリビニルピロリドン、0.1% ＢＳＡ］、0.1％ (w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ、50％ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに2 ml〜6 mlのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に上記方法で得られた標識化プローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ロシュダイアグノースティック社)等を用いることができる。メンブレンを取り出して、50 ml〜100 mlの2xSSC、0.1% SDS中で室温、15分間インキュベートし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50 ml〜100 mlの0.1xSSC、0.1% SDS中で68℃、30分間インキュベートする。メンブレン上の標識量を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
別途、同一の被験試料から調製された全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを上記の方法でアガロースゲルを用いて分離し、ナイロンメンブレンに移す。上記方法で得られた、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブを加え、上記の条件に従ってハイブリダイゼーションを行い、メンブレン上の標識量を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを移したナイロンメンブレンを別途用意する他に、所望の遺伝子の転写産物量を測定したナイロンメンブレンから、標識化プローブを除去して、本発明遺伝子の転写産物量を測定することもできる。この場合には、例えば、メンブレンを0.1〜 1 ％ のSDSを含む溶液中で 5 〜30 分間加温又は煮沸することにより、ハイブリダイズした標識化プローブを除去する。ナイロンメンブレンを室温に戻した後、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブと前述の条件でハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３２】
（２） 定量的ＲＴ−ＰＣＲ
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとするコモンマーモセット由来の２種以上の被検試料から上記（１）ノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法によりｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、ＭＭＬＶ（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3 mM MgCl2、75 mM KCl、10 mM DTT］中、0.5 mM dNTP及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で42℃、15分間〜1時間反応させることにより、前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製する。尚、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ）を用いて対応するｃＤＮＡを調製してもよい。
調製されたｃＤＮＡを鋳型にして、所望の遺伝子の塩基配列の一部分からなるＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲを行う。ＰＣＲに用いられるプライマーは、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、2.5 mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたＤＮＡの放射線強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの蛍光強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、当該ｃＤＮＡを鋳型にして、本発明ポリヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行う。当該ＰＣＲは所望の遺伝子の転写産物量を測定する目的のためのＰＣＲと同時点又は別時点のいずれの時期でもかまわないが、同時点が望ましい。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基〜約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。ＰＣＲの条件としては、所望の遺伝子の転写産物量を測定するために用いられた条件と同一な条件であることが好ましい。例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、2.5 mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたＤＮＡの放射線強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。また、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの蛍光強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３３】
（３） ＤＮＡアレイ解析
被検試料における、解析対象である所望の遺伝子の転写産物量及び本発明遺伝子の転写産物量を測定するには、通常の技術に基づいたＤＮＡアレイを用いて行えばよい。このようなＤＮＡアレイは、メンブレンフィルター、スライドガラス等の固体基板の表面に数個から数万個のＤＮＡプローブがアレイ状に配置されたものである。これを用いることにより、被検試料における所望の遺伝子の発現の有無及びその発現量を一度に調べることができる。ここで用いられるＤＮＡプローブとしては、上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に使用されるものと同様、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられるＤＮＡ断片である。ＤＮＡアレイは、固体基板の表面に配置されたＤＮＡプローブの数により、おおよそ数個から数百個までのＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイ及びそれ以上の数のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイの２種類に大別されるが、ここでは両者を含むものである。
本発明で用いられるＤＮＡアレイは、例えば、ゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて製造することができる。また、ＤＮＡプローブが有する塩基配列の情報を基づき、Fodor, S. P.A. et al., Science, 251, 767 (1991) に記載されたように、固体基板の上に塩基を順次添加して化学合成させてゆくことにより、ＤＮＡアレイを直接的に製造することも可能である。ＤＮＡアレイの製造法の詳細については、例えば、上記の通りである。
【００３４】
以下、ＤＮＡアレイを用いて本発明遺伝子等の転写産物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１） ＤＮＡマクロアレイによる定量（その１）
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、ｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、MMTV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3 mM MgCl2、75 mM KCl及び10 mM DTTを含む液］中、0.5 mM dNT［α32P］-dCTP、P及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で、42℃、15分間〜1時間反応させることにより、標識ｃＤＮＡを調製する。このとき、ｃDNA合成キット（タカラバイオ）等を用いてもよい。解析対象である所望の遺伝子、本発明遺伝子又は本発明完全長ｃＤＮＡの塩基配列の全て又は一部に一致する塩基配列を有するＤＮＡプローブをメンブレンフィルター上にスポットして作製されたＤＮＡアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9M NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.１％BSA］、0.１％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに2 ml〜6 mlのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に、これに上記のＤＮＡプローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb (ロシュダイアグノースティク社)等を用いることもできる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡアレイを取り出して、これを50 ml〜100 mlの２×SSC、0.1%SDSに浸した後、室温で１５分間程度インキュベートする。さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50 ml〜100 mlの0.1×SSC、0.1％SDS中、68℃、30分間インキュベートする。次いで、ＤＮＡアレイ上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３５】
（３−２） ＤＮＡマイクロアレイによる定量（その２）
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、ｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、MMTV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM ｄＮＴＰ、Cy3-dUTP（又はCy5-dUTP）及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で、42℃、15分間〜１時間反応させる。これにアルカリバッファー（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン社)等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより、蛍光標識ＤＮＡを調製する。調製された蛍光標識ＤＮＡを、ＤＮＡアレイに対して、上記（３−１）のＤＮＡアレイによる定量（その１）に記載された方法と同様な方法により、ハイブリダイゼーションを及びその後の処理を行う。ＤＮＡアレイ上の標識量をスキャナー等で測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３６】
（４） インサイチューハイブリダイゼーション法
基本的には、（a）組織の固定、包埋及び切片の作製、（b）プローブの調製、（c）ハイブリダイゼーションによる検出からなり、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとすること以外は、例えば、Heiles, H. et al., Biotechniques, 6, 978, 1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック、羊土社, 214, 1992、細胞工学ハンドブック、羊土社, 222, 1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
ＲＮＡプローブを調製する場合には、まず、例えば、上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子又は完全長ｃＤＮＡを取得し、当該ＤＮＡをSP6、T7、T3ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクター（例えば、Stratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等）に組み込んで大腸菌に導入することにより、プラスミドＤＮＡを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロール用）、アンチセンス（ハイブリダイゼーション用）ＲＮＡができるようにプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断する。両プラスミドＤＮＡを鋳型とし、放射性標識の場合にはα-35S-UTP等、非放射性標識の場合にはディゴキシゲニンUTP若しくはフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成しながら標識した後、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡを調製する。尚、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはＲＮＡラベリングキット（アマシャムバイオサイエンス社）が市販され、また非放射性標識用にはＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（ロシュダイアグノースティック社）、ＲＮＡカラーキット（アマシャムバイオサイエンス社）等が市販されている。また、ＤＮＡプローブを調製する場合には、例えば、32Ｐ等で標識された放射性ヌクレオチド若しくはビオチン、ディゴキシゲニン或いはフルオレセインで標識されたヌクレオチドを、ニックトランスレーション法[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]又はランダムプライム法[Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 132, 6 (1083), Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 137, 266 (1984)]によって取り込ませることにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＤＮＡを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシャムバイオサイエンス社）、Random Prime Labeling Kit（ロシュダイアグノースティック社）が市販され、また非放射性標識用にはDIG DNA標識キット（ロシュダイアグノースティック社）、ＤＮＡカラーキット（アマシャムバイオサイエンス社）等が市販されている。
具体的には、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。また、当該被検試料を液体窒素中にて凍結させ、その微小薄層切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。このようにしてスライドグラス切片を得る。
次に、当該被検試料の中に存在しかつ使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼＫで処理し、アセチル化する。次いで、当該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを90℃、3分間加熱した後、これをハイブリダイゼーション溶液で希釈して得られる溶液を前記のスライドグラス切片の上に滴下する。滴下後、当該スライドグラス切片をフィルムで覆い、モイスチャーチャンバー中で、45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着又は未反応のプローブを洗浄すること等（ＲＮＡプローブを用いた場合には、ＲＮａｓｅ処理も加える。）により除去する。スライドグラス切片の上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３７】
次に、本発明測定方法における第三工程では、２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量をSxとし、i番目（i≦n）の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量をSiとし、当該Siを基準として算出する場合には、その相対比Cxは下記の式で表される。
Cx＝Si/Sx
ここで「任意の被検試料」とは、測定を行った被検試料のうちのどの被験試料であってもかまわないが、対照となるような被検試料を測定に用いた場合にはそれを用いることが好ましい。
【００３８】
本発明測定方法における第四工程では、第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料における解析対象である所望の遺伝子の転写産物量をTxとし、上記の第三工程により算出されたi番目（i≦n）の被検試料に対するx番目の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比をCxとし、i番目の被検試料１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を基準として算出する場合には、当該工程により補正された解析対象である所望の遺伝子の転写産物量ATxは下記の式で表される。
ATx＝Tx・Cx
【実施例】
【００３９】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施例により限定されるものではない。
【００４０】
実施例１（コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のクローニング）
（１）全ＲＮＡの調製
コモンマーモセット（日本クレア社より入手）の肝臓から全ＲＮＡの抽出を行った。
47ヶ月齢の雄コモンマーモセットを解剖し、肝臓を摘出した後、摘出された肝臓をピンセットとハサミとを用いて細分化した後、これを直ちにRNAlater（アンビオン社）に浸漬し、一晩室温で静置した後、使用直前まで−20℃にて保存した。保存された肝臓組織の湿重量1gに対して10mlのTRIZOL試薬(インビトロジェン社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、水層を50ml遠心チューブ（旭テクノグラス社製）に回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/5容量のクロロホルム（関東化学製）を添加した。得られた混合物を15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/2容量の2-プロパノール（関東化学製）を添加した。得られた混合物を転倒混和した後、室温で10分間静置した。静置後、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、上清を除去することにより、ＲＮＡのペレットを得た。得られたペレットを、1 mlのDEPC処理滅菌蒸留水（ナカライテスク製）で溶解した。このようにして得られたＲＮＡ溶液1 mlにRNeasy Midi Kit(キアゲン社製)添付のRLT buffer (10μl β−メルカプトエタノール/mL RLT buffer) 3.8 mlを添加し、混合した。更に、当該混合物に2.8 ml エタノール(関東化学製)を添加し、混合した。当該混合液を等量に分割した後、これをRNeasy Midi Kit添付のRNeasy Spin Column 2本にアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈されたRNeasy Midi Kit添付のRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、再び溶出液を捨て、エタノールで希釈されたRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離（室温、14,000rpm、2分間）した。遠心分離後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Midi Kit添付の蒸留水をそれぞれ0.25 ml添加し、1分間室温で静置した。静置後、これを遠心分離（室温、10,000rpm、1分間）することにより、その溶出物として全RNAを得た。
【００４１】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製された全ＲＮＡ 6μg及び配列番号４で示される塩基配列を有するプライマー1μg を含む20μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 8μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 4μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 2μl、DEPC処理水4μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μlを添加した後、37℃、2時間加熱し、さらに75℃、5分間加熱した後、当該混合物を氷上で冷却することにより、ｃＤＮＡを得た。このようにして得られたｃＤＮＡは、冷却後使用時まで−20℃で保存された。
【００４２】
（３）ＰＣＲ法による本発明遺伝子の増幅
上記で得られたｃＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号２で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号３で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡを得た。尚、ＰＣＲの反応液組成は、上記のｃＤＮＡ 1μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された10xPCR緩衝液 5μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された2.5 mM dNTP 4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ1μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水37.5μlとした。ＰＣＲ反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で1分間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された50μlを、アガロースゲル電気泳動に供し、当該増幅ＤＮＡに相当する泳動度を示したバンドを切り出し後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて精製し、30μlの滅菌精製水に回収した。
【００４３】
（４）本発明遺伝子クローンの作製
上記（３）で得られた増幅ＤＮＡをＴＡベクターを用いてクローン化した。
当該増幅ＤＮＡを含む溶液5μlと50mg/mlのpGEM-Tベクター（プロメガ社製）1μlとを混合し、両者をＤＮＡライゲーションキットVer.2（タカラバイオ製）を用いて反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性、IPTG及びX-galを用いたベータガラクトシダーゼに対する染色性の欠如を指標にコロニーを採取した後、採取されたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をABIモデル3700オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてダイターミネーター法で決定した。シークエンシング用プライマーとしては、ＤＮＡ合成装置にて化学合成された配列番号５乃至８で示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。得られた塩基配列に係るデータをDNA配列解析ソフトウエアDNASIS（日立ソフト社製）を用いて編集、整列化することにより、配列番号１で示された塩基配列を得た。このようにして得られた塩基配列を、BLAST法を用いて公的データベースであるNCBIの遺伝子配列に対して相同性検索を行ったところ、登録番号X03205であるヒト１８ＳリボソームＲＮＡが有する塩基配列に相同性が高いことを見出し、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子であることを確認した。
【００４４】
（５）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた本発明遺伝子の発現確認
上記（４）でクローン化された、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の各組織における転写産物量を確認するために、種々の異なる個体や異なる種類の組織からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｍＲＮＡの発現を調べた。
47〜132ヶ月齢の４匹のコモンマーモセット（日本クレア社より入手）より組織を摘出し、上記（１）に記載した方法を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した組織は、肝臓、肺、心臓、骨格筋、脳及び腎臓（以上、個体番号１）、肝臓、心臓及び骨格筋（以上、個体番号２）、肝臓及び肺（以上、個体番号３）、脳（個体番号４）の12種類である。次に、前記全ＲＮＡそれぞれ1μg及びd(T)12-18プライマー（アマシャムバイオサイエンス製）1μg を含む12μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 1μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 1μlを添加した後、42℃、60分加熱し、さらに75℃、15分間加熱した後、当該混合物を4℃で冷却することにより、ｃＤＮＡを得た。
このようにして得られたｃＤＮＡに精製水80μlを添加し希釈した後、使用時まで−20℃で保存した。このようにして得られたｃＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号９で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号１０で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。尚、ＲＴ−ＰＣＲの反応液組成は、上記希釈後のｃＤＮＡ溶液を3μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された10xPCR緩衝液 3μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された2.5 mM dNTP 2.4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ0.6μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水22.6μlとした。ＰＣＲ反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で30秒間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された3μlを、エチジウムブロミドを含んだアガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、図１に示すように、電気泳動に供した12種類のサンプルに均等の蛍光を発するバンドが検出された。この結果から、電気泳動に供した12種類のすべての組織において、個体や組織の種類に関わらずほぼ同量の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡが含まれていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用等が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコモンマーモセットの各組織における発現分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果である。尚、図中の「１」、「２」、「３」、「４」は各組織を摘出した個体番号を示す（実施例５）。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号1
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
配列番号2
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
ｃＤＮＡ合成のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
種差の問題から、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をラット、マウス等のげっ歯類では十分評価することが困難であり、よりヒトに近い実験動物の利用が求められている。
現在、アカゲザル、カニクイザル等の大型サルが当該目的のために利用されているが、コスト、操作性等の面から小型サルが実験動物として注目を集めている（例えば、非特許文献１参照）。
一方で、ラット、マウス等のげっ歯類を用いた研究では、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が盛んになってきている（例えば、非特許文献２参照）。
上記の研究動向において、実験動物として注目を集めている小型サルにおいても、医薬品の有効成分となる化学物質等のヒトに対する薬剤の効力若しくは毒性・副作用といった影響をより精緻に検討する目的で遺伝子発現解析に関する研究が一層重要になると考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】Mansfield, K., Comp. Med., 53, 383 (2003)
【非特許文献２】Hamadeh, H. K. et al, Tox. Sci., 67, 219 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、このような遺伝子発現解析において、異なる被検試料、特に異なる個体や異なる種類の組織由来の被検試料を用いる場合には、当該被検試料の中に含まれている各遺伝子の転写産物量は大きくばらついているために、「２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としてのポリヌクレオチド」の使用が必須となる。しかしながら、小型サルにおいては、現時点ではこのようなポリヌクレオチドが十分に知られておらず、当該ポリヌクレオチドの早急な取得・開発等が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、実験動物として注目を集めている小型サルのなかでも新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Callithrix Jacchus）という超小型サルに注目し、当該サルを用いた遺伝子発現解析に関する研究において必須となる、「２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としてのポリヌクレオチド」としてコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（以下、本発明遺伝子と記すこともある。）；
２．コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド（以下、本発明ポリヌクレオチドと記すこともある。）
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
３．下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列；
４．DNA又は検出のための組成物であって、前項２又は３記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物（以下、本発明組成物と記すこともある。）；
５．前項２又は３記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする前項４記載の組成物；
６．２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての前項２又は３記載のポリヌクレオチドの使用（以下、本発明使用と記すこともある。）；
７．前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項６記載のポリヌクレオチドの使用；
８．２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
（１）前項２又は３記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
９．前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする前項８記載の測定方法；
１０．第一工程及び／又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする前項８又は９記載の測定方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、詳細に本発明を説明する。
本発明において利用される小型サルは、新世界サルの一種であるコモンマーモセット（Callithrix Jacchus）である。当該サルは、ヒトに近縁な真猿類に属する超小型サルであり、大型サルに比べて繁殖効率が良くしかも小型で取り扱いが容易である。
【０００９】
本発明遺伝子は、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子である。当該遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）としての性質を有しているために、当該遺伝子の発現は、各種の薬剤処理、疾患の有無、生理的な刺激等により影響を受けにくく、その転写産物が生体組織において普遍的かつ恒常的に発現している。そのため、当該遺伝子の発現量を被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準として用いることにより、所望の遺伝子の転写産物量の補正を行うことが可能となる。勿論、特定の生物種（例えば、コモンマーモセット等が属するマーモセット種）を対象として遺伝子発現解析を行う場合には、その生物種に特有のハウスキーピング遺伝子の転写産物量を用いて当該遺伝子の転写産物量を補正することが特に好ましい。
【００１０】
本発明ポリヌクレオチドは、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
【００１１】
ここで、項目番号（４）で示される「部分塩基配列」とは、本発明遺伝子又はこれを取得若しくは検出するために用いられるプライマー若しくはプローブを構成する塩基配列であり、項目番号（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列よりも短い長さの塩基配列である。具体的には例えば、配列番号２で示される塩基配列、配列番号３で示される塩基配列等を挙げることができる。
【００１２】
本発明において「塩基同一性」とは、２つのＤＮＡ又はＲＮＡ間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「同一性」は、比較対象の配列の全領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はＲＮＡは、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.、22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、当該同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１３】
本発明における「塩基同一性」は塩基配列基準であって、例えば、約95％以上であることが好ましい。
【００１４】
本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得すればよいが、これらを取得できる方法であれば如何なる方法を用いて取得してもよい。
例えば、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載される遺伝子工学的方法に準じて取得することができる。
【００１５】
まず、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞由来の全ＲＮＡを調製する。
具体的には例えば、コモンマーモセットの肝臓等の組織を塩酸グアニジンやグアニジンチオシアネート等のタンパク質変性剤を含む溶液中で粉砕し、さらに当該粉砕物にフェノール、クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離により除去した後、回収された上清画分から塩酸グアニジン／フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート／CsCl法等の方法により全ＲＮＡを抽出する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、Trizol試薬（インビトロジェン社）、Isogen（ニッポンジーン社製）等が挙げられる。
次いで、得られた全ＲＮＡを鋳型としてオリゴdTプライマーをＲＮＡのポリA配列にアニールさせ、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。更に一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、かつ大腸菌RNaseHを用いてＲＮＡ鎖にニックとギャップを入れることにより得られるＲＮＡ断片をプライマーとして大腸菌のＤＮＡポリメラーゼIを用いて二本鎖のｃＤＮＡを合成することもできる。得られたｃＤＮＡは、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿等の通常の方法により精製、回収する。尚、これらの方法に基づいた市販のキットとしては、例えば、ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）やSuperScript Choice System（インビトロジェン社製）等が挙げられる。
次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを、例えば、プラスミドpUC118やファージλgt10等のベクターとリガーゼとを用いて連結することによりｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。
また、コモンマーモセットの組織片又はそれらの動物由来培養細胞から、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等や、村松正寶、”ラボマニュアル遺伝子工学”（丸善1998）等に記載される通常の方法に準じてゲノムＤＮＡを調製する。
例えば、試料が肝臓の場合には、抽出緩衝液［10mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1 mM EDTA (pH8.0), 20μ g/ml, 0.5%SDS］を組織重量に対し10倍量（v/w）加え粉砕し、さらにProteinaseKを最終濃度100μｌ/ml になるように加え混合する。この混合物を50℃で３時間保温した後、フェノール／クロロホルム等を加えることによりタンパク質を変性させる。変性タンパク質を遠心分離等により除去した後、回収された上清画分にエタノールを添加しゲノムＤＮＡを沈殿させ回収する。また、試料が末梢血の場合には、DNA-Extraction kit(ストラータジーン社製)等を用いて該試料を処理することによりゲノムＤＮＡを得ることができる。得られたゲノムＤＮＡをλgt10等のベクターとリガーゼを用いて連結することによりゲノムＤＮＡライブラリーを得ることができる。
【００１６】
上記のような一本鎖又は二本鎖ｃＤＮＡそのもの、又は、ｃＤＮＡライブラリー若しくはゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１で示される塩基配列の部分塩基配列又は当該部分塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ反応や、上記ｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーから、配列番号１で示される塩基配列又は当該塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを取得することができる。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１で示される塩基配列の５’端側から始まる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び、配列番号１で示される塩基配列の３’端側から始まる塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。具体的には、フォワードプライマーとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。また、リバースプライマーとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、反応液50μl中に、Ex-Taqポリメラーゼ用10倍濃緩衝液（タカラバイオ社製）5μl、2.5mM dNTP混合液（各2.5 mMのdATP, dGTP, dCTP及びdTTPを含む。）5μl（dATP, dGTP, dCTP及びdTTP各々の最終濃度が0.25 mM）、10μMプライマー 各0.5〜2.5μl（終濃度が0.1〜0.5μM）、鋳型ｃＤＮＡ 0.1〜0.5μg、Ex-Taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）1.25ユニットを含む組成の反応液にて、以下の条件による３工程の増幅サイクルを繰り返して行う。まず変性工程として、例えば約90℃から約96℃、好ましくは約94℃から約95℃で、1分から15分間、好ましくは1分から2分間の保温を行う。次にプライマーのアニーリング工程として、例えば約30℃から約70℃、好ましくは約40℃から約60℃で、約3秒から約3分間、好ましくは約5秒間から約2分間の保温が行われる。さらにＤＮＡポリメラーゼによる伸長工程として、たとえば、約70℃から約75℃、好ましくは約72℃から約73℃で、約15秒間から約5分間、好ましくは約30秒間から約4分間の保温が行われる。この３工程からなる増幅サイクルを、約20回から約50回、好ましくは約25回から約40回行う。このようなＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片を、必要に応じて低融点アガロース電気泳動等に供して精製した後、エタノール沈殿により回収することにより、或いは、例えば、QIAquick ＰＣＲ Purification Kit（キアゲン社製）のような市販のＤＮＡ断片精製用のカラムを用いて、精製及び回収することができる。回収の際にＤＮＡ断片を溶解させる溶媒として、水、生理食塩水、1 から100 mMトリス塩酸、ＴＥ緩衝液［10 mMトリス塩酸、1 mM EDTA、pH7.4から8.0］等の適当な溶液を用いることができる。
【００１７】
ハイブリダイゼーション法に用いられるプローブとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、当該ポリヌクレオチドの部分塩基配列を有するポリヌクレオチド等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、6×SSC（0.9M塩化ナトリウム、0.09Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液（0.1(w/v)フィコール400、0.1(w/v)ポリビニルピロリドン、0.1(w/v)BSA）、0.5(w/v)SDS及び100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、65℃で保温し、次いで１×SSC（0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、室温で15分間の保温を２回行い、さらに0.1×SSC（0.015M 塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウム）及び0.5(w/v)SDS存在下に、68℃で30分間保温する条件等を挙げることができる。また、例えば、5xSSC、50mMHEPES pH7.0、10xデンハルト溶液及び20μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ存在下に65℃にて保温し、次いで2xSSC中で室温にて３０分間の保温を行い、さらに0.1xSSC中で６５℃にて４０分間の保温を２回行う条件を挙げることもできる。尚、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示される塩基配列に基づいて、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller, M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００１８】
このようにして得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 等に記載された遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
具体的には例えば、TAクローニングキット（Invitrogen社）やpBluescriptII（Stratagene社）等の市販のプラスミドベクターを用いてクローニングすることができる。得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの塩基配列は、Maxam Gilbert法（例えば、Maxam, A. M. & W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560, 1977等に記載される）やSanger法（例えば、Sanger, F. & A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94, 441, 1975, Sanger, F. & Nicklen & A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463, 1977等に記載される）に準じて確認することができる。ABI社製モデル377等の自動ＤＮＡシークエンサーを用いる場合には、対応するＤＮＡシークエンスキット、例えば、ABI社製Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit等を用いることができる。
【００１９】
次いで、DNA又はRNAの検出のために用いられる本発明ポリヌクレオチドについて説明する（以下、ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドと記すこともある）。
ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、以下のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチドである。
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
ここで、項目番号（２）としては、例えば、
（２ａ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の６０塩基長を有する塩基配列、（２ｂ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の５０塩基長を有する塩基配列、（２ｃ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の３５塩基長を有する塩基配列、（２ｄ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の３０塩基長を有する塩基配列、（２ｅ）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の２０塩基長を有する塩基配列等を挙げることができる。
【００２０】
上記、項目番号（１）から（３）のいずれかの特徴を有するＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、解析対象となる、所望の遺伝子を検出するために使用される１個から複数個のポリヌクレオチドと、性質の類似性を指標にして選択することができる。例えば、後述するような、長鎖のｃＤＮＡを用いてＤＮＡ又はＲＮＡを検出するＤＮＡアレイを用いる場合には、項目番号（１）で示される、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３の塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。また、短鎖のポリヌクレオチドを用いたＤＮＡアレイや、ＲＴ−ＰＣＲの如くの方法によりＤＮＡ又はＲＮＡを検出する場合には、項目番号（２）又は（３）で示される、ポリヌクレオチドのいずれかを用いるのが好ましい。具体的には、項目番号（２）としては、例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１４６１から１４７８、１５９５から１６９０、１７６８から１８０９のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５２０から１５３７、１６５４から１７４９、１８２７から１８６８で終了する、連続する６０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２７５、１４６１から１４８７、１５９５から１６９５、１７７３から１８１４のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３２３から１３２４、１５１０から１５３６、１６４４から１７４４、１８２２から１８６３で終了する、連続する５０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２８２、１４６１から１４９０、１５７２から１７０２、１７８０から１８２１のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３０８から１３１６、１４９５から１５２４、１６０６から１７３６、１８１４から１８５５で終了する、連続する３５塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１２８５、１４６１から１４９３、１５７６から１５８０、１５９５から１７０５、１７８３から１７９９、１８１７から１８２４のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３０３から１３１４、１４９０から１５２２、１６０５から１６０９、１６２４から１７３４、１８１２から１８２８、１８４６から１８５３で終了する、連続する３０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。また例えば、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３３２、１３３５、１３３６、１３４８、１３４９、１３５３、１３８２、１４４８、１４４９、１５３３、１６２１、１７２４、１７２６のいずれかから開始し、それぞれ、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１３５１、１３５４、１３５５、１３６７、１３６８、１３７２、１４０１、１４６７、１４６８、１５５２、１６４０、１７４３、１７４５で終了する、連続する２０塩基長を有する塩基配列をあげることができる。より具体的には、上記で指定される塩基配列の中から、所望の遺伝子を検出するために使用される、１個から複数個のポリヌクレオチドと、配列長、融点等の性質が同等となるポリヌクレオチドを選択することが好ましい。
また、項目番号（３）で示すように、ＤＮＡアレイやノーザン法の如く、ハイブリダイゼーション法を用いてＤＮＡ又はＲＮＡを検出する場合には、上記項目番号（１）又は（２）のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いるのが好ましい。
上述した項目番号（１）から（３）のいずれかで示される塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチドは、それぞれ単独で使用することもできるだけではなく、複数個の組み合わせで使用することもできる。後述するＲＴ−ＰＣＲ法におけるプライマー、又はプローブとしての使用においては、項目番号（２）から（３）で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド（塩基長２０〜６０、好ましくは塩基長２０〜５０）の中から、ＰＣＲ反応を実施するのに適切なポリヌクレオチドを選択することが好ましい。ポリヌクレオチドの選択には、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて、上記に示したポリヌクレオチドから行うことができる。また、検出時の信頼性を高める目的で、複数個の異なった遺伝子の塩基配列領域を検出するポリヌクレオチドを用いることも行われているが、この場合には、項目番号（２）又は（３）で示される塩基配列を有し、それぞれ互いに重複しない塩基配列を有するポリヌクレオチドを、複数個使用するのが望ましい。
【００２１】
ＤＮＡ等検出用本発明ポリヌクレオチドは、これらを取得できる方法であれば如何なる
方法を用いて取得してもよい。
例えば、取得本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドの項で具体的に示したように、コモンマーモセット等のマーモセット組織又はそれらの動物由来培養細胞から、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得することができる他、塩基配列の情報を基づき、市販のＤＮＡ合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。
【００２２】
次いで、本発明組成物について説明する。
本発明組成物は、DNA又はRNA検出のための組成物であって、本発明ポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。当該組成物は、本発明ポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなる形態であってもよい。当該形態のうち、本発明ポリヌクレオチドが固体基板の表面に固定されてなる代表的なものはＤＮＡアレイである（以下、本発明ＤＮＡアレイと記すこともある。）。
遺伝子発現解析手法は、疾患の診断、分類若しくは発生予測、又は薬剤の効力若しくは毒性・副作用の機構解析等の、様々な局面で盛んに利用されている。遺伝子発現解析手法には、ノーザンブロッティング法が従来から利用されてきたが、定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法（以下、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法と記すこともある。）や、ＤＮＡアレイを用いた手法（以下、DNAアレイ法と記すこともある。）が開発され、現在ではこれら手法も活用されている。
前者の遺伝子発現解析手法（即ち、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法）では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又は全ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡをリバーストランスクリプターゼを用いて合成した後、合成されたｃＤＮＡ量をＰＣＲ法を用いて定量し、定量されたｃＤＮＡ量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
後者の遺伝子発現解析手法（即ち、DNAアレイ法）では、通常、複数の被検試料から独立して、所望の遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡ又は全ＲＮＡ等のポリヌクレオチドを抽出・精製し、抽出・精製されたポリヌクレオチドに対応するｃＤＮＡ又はこれをin vitro転写反応することによって得られるｃＲＮＡが蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体を、ＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた後、ハイブリダイズした標識体量を蛍光強度、放射線強度等に基づき定量し、定量されたｃＤＮＡ量又はｃＲＮＡ量を複数の被検試料間で相対比較することにより、当該所望の遺伝子の発現量の差異を測定する。当該相対比較を伴う遺伝子発現解析手法を行う際に本発明組成物は有益である。
【００２３】
本発明ＤＮＡアレイは、固体基板の表面に配置されたＤＮＡプローブの数により、おおよそ数個から数百個のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイ及びそれ以上の数のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイの２種類に大別されるが、ここでは両者を含むものである。
本発明ＤＮＡアレイは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含むものであり、これ以外のプローブの数やその塩基配列については特に制限されない。例えば、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外の遺伝子に対応するプローブを含むＤＮＡアレイが挙げられる。好ましくは、本発明ポリヌクレオチドをプローブとして含み、かつ、数個から数万個までの本発明遺伝子以外のコモンマーモセット由来の遺伝子に対応するプローブを含むＤＮＡアレイが挙げられる。
【００２４】
本発明ＤＮＡアレイは、例えば、ゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて、配列番号１で示された塩基配列の全部又は一部よりなるＤＮＡ断片を含むＤＮＡプローブを調製する工程、及び、調製されたＤＮＡプローブを固体基板の表面に固定化する工程の両工程により製造することができる。また、ＤＮＡプローブが有する塩基配列の情報に基づき、Fodor, S. P.A. et al., Science, 251, 767 (1991) に記載されたように、固体基板の上に塩基を順次添加して化学合成させてゆくことにより、ＤＮＡアレイを直接的に製造することも可能である。以下に、前者の製造方法を詳細に説明するが、本発明ＤＮＡアレイに係る製造法はこれに限定されるものではない。
まず、ＤＮＡプローブを調製する。ＤＮＡプローブの調製方法として、例えば、コモンマーモセットの組織から調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法等により調製することができる。当該ｃＤＮＡを鋳型にして、Ex Taq（タカラバイオ）等のＤＮＡホ゜リメラーセ゛を用いてＰＣＲすることにより、ＤＮＡを増幅する。このようにして増幅されたＤＮＡをpUC118等のベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。尚、当該ＤＮＡの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
【００２５】
ＰＣＲ反応後の増幅されたＤＮＡはプローブとして用いることができる。
ＰＣＲ反応後の増幅されたＤＮＡを、当該ＤＮＡを含む溶液からエタノール沈殿によって回収することにより、又は、例えば、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社製）等の市販のＤＮＡ断片精製用カラムを用いて精製することができる。精製において当該ＤＮＡを溶解させる溶媒として、ジメチルスルホキシド、水、生理食塩水、1〜100 mMトリス塩酸等の適当な緩衝液又は3xSSC等の溶液を用いることができる。好ましくは、3XSSCを用いればよい。溶解の際のＤＮＡの濃度は、約1〜約100μMに調整する。ベクターにクローニングされたＤＮＡを用いる場合には、適当な制限酵素で目的とするＤＮＡ断片を切り出し、必要に応じてアガロースゲルで精製を行う。得られたＤＮＡ断片は、例えば、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）のような市販のＤＮＡ断片精製用カラムを用いて、ゲルを分離することができる。ゲルから分離されたＤＮＡ断片を上記の溶媒に溶解させる。また、クローニングベクターのクローニング領域の両端に通常設定されているようなT7、T3、SP6等の塩基配列をプライマーとして再度ＰＣＲを行うことにより、ＤＮＡプローブのためのＤＮＡを取得してもよい。
ＤＮＡアレイに配置されるＤＮＡ断片の長さが約20塩基〜約100塩基の場合には、塩基配列の情報を基づき、市販のＤＮＡ合成機により化学合成することも好ましい方法として挙げることができる。化学合成後のＤＮＡ断片を、上記のＤＮＡ断片精製用カラム、高速液体クロマトグラフィー等により精製し、これを上記の溶媒に溶解させる。
【００２６】
次に、上記で得られたＤＮＡを、固体基板等の担体上に固定化する。担体としては、ガラス板、石英板、シリコンウエハー、メンブレンフィルター等の固体基板を挙げることができる。担体の大きさは、担体上のＤＮＡプローブの配置数、ＤＮＡプローブのスポットの大きさ等に応じて適宜設定すればよい。ＤＮＡを固定化するための方法としては、ＤＮＡの種類、担体の種類等に応じて適当な方法を選択すればよい。例えば、固定化するＤＮＡがｃＤＮＡ、ＰＣＲ増幅産物等の場合には、ＤＮＡの荷電を利用して、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等のポリ陽イオンで表面処理された固体担体に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等の官能基が導入された固層表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチン等の官能基が導入されたＤＮＡを共有結合させる方法等を挙げることができる。調製されたＤＮＡを担体に配置するには、マイクロピペット、ピペットマン等を用いて、当該ＤＮＡが溶解させた溶液を手操作により滴下する方法、数10μm〜数100μmのサイズで予め指示された位置に機械操作により配置する方法を用いてもよい。ＤＮＡの配置方法としては、ピン先端の担体の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を応用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等があり、いずれの方式を用いても良い。ピン方式としては、Affymetrix 427 Arrayer（アフィメトリクス社製）、キャピラリ−方式としてはLucidea Array Spotter（アマシャムバイオサイエンス社製）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。配置されるＤＮＡの溶液量としては、機械式に配置する場合には0.01〜100 nl、手操作操作により配置する場合には0.1〜100μlを好ましく挙げることができる。
【００２７】
次に、本発明使用及び本発明測定方法について説明する。
本発明使用は、２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての本発明ポリヌクレオチドの使用である。本発明使用では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
本発明測定方法は、２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、（１）前項２記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、を有することを特徴とする。本発明測定方法では、当該被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることがよい。
【００２８】
本発明測定方法における第一工程及び第二工程での、遺伝子の転写産物量を測定する方法としては、転写産物量を定量的に測定できる方法であれば如何なる方法であってもよいが、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法 [Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、インサイチューハイブリダイゼーション法等を挙げることができる。好ましくは、例えば、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法等が挙げられる。
【００２９】
（１） ノーザンハイブリダイゼーション法
まず、解析対象である所望の遺伝子の塩基配列に相当するＤＮＡを調製し、次いで、その全部若しくは一部からなるＤＮＡを標識して標識化プローブを調製する。ここで「標識化ＤＮＡプローブ」とは、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられる蛍光色素、放射性同位元素等を用いて標識された標識体であるＤＮＡ断片である。また、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドについても同様に、そのＤＮＡを標識して標識化プローブを調製する。尚、所望の遺伝子は、コモンマーモセットの組織から上記の方法により調製されたｃＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法等によって調製することができる。当該ｃＤＮＡを鋳型にして、Ex Taq（タカラバイオ）等のＤＮＡホ゜リメラーセ゛を用いてＰＣＲすることにより、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲの条件は、所望の遺伝子の種類、使用するプライマーの塩基配列等により異なるが、例えば、前述のような反応条件等を挙げることができる。このようにして増幅されたＤＮＡはpUC118等をベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。当該ＤＮＡの塩基配列は、上記のMaxam Gilbert 法、Sanger法等に準じた方法を用いて確認することができる。
【００３０】
このようにして調製された所望の遺伝子のＤＮＡ、及び本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドを、次のようにして蛍光色素、放射性同位元素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、上記のようにして調製されたＤＮＡを鋳型とし、当該ＤＮＡの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、[α-32P]dCTP又は[α-32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してＰＣＲを行うことにより、32Pで標識されたプローブが得られる。また、上記のようにして調製されたＤＮＡを、例えば、Random prime labeling Kit（ロシュダイアグノースティック社）、MEGALABEL（タカラバイオ）等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。
【００３１】
次に、このようにして調製されたプローブを使用して、ノーザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には、本発明測定方法での第二工程において、所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとするコモンマーモセット由来の２種以上の被検試料から全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。調製された全ＲＮＡ20μg又はｍＲＮＡ 2μｇをアガロースゲルで分離し、10ｘSSC（1.5M NaCl、0.35M クエン酸ナトリウム）で洗浄した後、ナイロンメンブレン［例えば、Hybond−N（アマシャムバイオサイエンス社製）等］に移す。ポリエチレン袋にメンブレンを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9M NaCl、0.21M クエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1% (w/v)フィコール400、0.1％ (w/v) ポリビニルピロリドン、0.1% ＢＳＡ］、0.1％ (w/v) SDS，100μg/ml変性サケ精子ＤＮＡ、50％ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに2 ml〜6 mlのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に上記方法で得られた標識化プローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ロシュダイアグノースティック社)等を用いることができる。メンブレンを取り出して、50 ml〜100 mlの2xSSC、0.1% SDS中で室温、15分間インキュベートし、さらに同じ操作を１回繰り返し行い、最後に50 ml〜100 mlの0.1xSSC、0.1% SDS中で68℃、30分間インキュベートする。メンブレン上の標識量を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
別途、同一の被験試料から調製された全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを上記の方法でアガロースゲルを用いて分離し、ナイロンメンブレンに移す。上記方法で得られた、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブを加え、上記の条件に従ってハイブリダイゼーションを行い、メンブレン上の標識量を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを移したナイロンメンブレンを別途用意する他に、所望の遺伝子の転写産物量を測定したナイロンメンブレンから、標識化プローブを除去して、本発明遺伝子の転写産物量を測定することもできる。この場合には、例えば、メンブレンを0.1〜 1 ％ のSDSを含む溶液中で 5 〜30 分間加温又は煮沸することにより、ハイブリダイズした標識化プローブを除去する。ナイロンメンブレンを室温に戻した後、本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドに対応する標識化プローブと前述の条件でハイブリダイゼーションを行うことにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３２】
（２） 定量的ＲＴ−ＰＣＲ
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとするコモンマーモセット由来の２種以上の被検試料から上記（１）ノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法によりｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、ＭＭＬＶ（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［50 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3 mM MgCl2、75 mM KCl、10 mM DTT］中、0.5 mM dNTP及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で42℃、15分間〜1時間反応させることにより、前記ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製する。尚、ｃＤＮＡ合成キット（タカラバイオ）を用いて対応するｃＤＮＡを調製してもよい。
調製されたｃＤＮＡを鋳型にして、所望の遺伝子の塩基配列の一部分からなるＤＮＡをプライマーとしたＰＣＲを行う。ＰＣＲに用いられるプライマーは、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基から約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。ＰＣＲの条件としては、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、2.5 mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたＤＮＡの放射線強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの蛍光強度を測定することにより、当該遺伝子の転写産物量を測定することができる。
また、当該ｃＤＮＡを鋳型にして、本発明ポリヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行う。当該ＰＣＲは所望の遺伝子の転写産物量を測定する目的のためのＰＣＲと同時点又は別時点のいずれの時期でもかまわないが、同時点が望ましい。
ＰＣＲに用いられるプライマーとしては、市販の遺伝子解析ソフト、例えば、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等を用いて設計すればよい。例えば、約15塩基〜約50塩基程度の長さのオリゴヌクレオチドであって、不必要な二次構造を形成しにくく当該遺伝子に対して特異性の高い塩基配列を有するプライマー等を用いることができる。ＰＣＲの条件としては、所望の遺伝子の転写産物量を測定するために用いられた条件と同一な条件であることが好ましい。例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、2.5 mM dNTP及び［α32P］-dCTP存在下で、例えば、94℃，30秒間次いで40℃〜60℃，2分間さらに72℃，2分間の保温を1サイクルとしてこれを25〜55サイクル行う条件を挙げることができる。増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、分離されたＤＮＡの放射線強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。また、例えば、Ex taq（タカラバイオ）を使用し、反応緩衝液［10 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、50 mM KCl，1.5 mM MgCl2］中、SYBR Green PCR Reagents (アプライドバイオシステムズ社) 25μlを含む50μlの反応液を調製し、ABI7700(アプライドバイオシステムズ社)を用いて、50℃，2分間次いで95℃，10分間の保温の後、95℃，15秒間次いで60℃，1分間の保温を１サイクルとしてこれを40サイクル実施する条件でＰＣＲを行う。増幅されたＤＮＡの蛍光強度を測定することにより、本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３３】
（３） ＤＮＡアレイ解析
被検試料における、解析対象である所望の遺伝子の転写産物量及び本発明遺伝子の転写産物量を測定するには、通常の技術に基づいたＤＮＡアレイを用いて行えばよい。このようなＤＮＡアレイは、メンブレンフィルター、スライドガラス等の固体基板の表面に数個から数万個のＤＮＡプローブがアレイ状に配置されたものである。これを用いることにより、被検試料における所望の遺伝子の発現の有無及びその発現量を一度に調べることができる。ここで用いられるＤＮＡプローブとしては、上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に使用されるものと同様、特定の塩基配列を有する遺伝子に特異的にハイブリダイズし、当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を測定する目的で用いられるＤＮＡ断片である。ＤＮＡアレイは、固体基板の表面に配置されたＤＮＡプローブの数により、おおよそ数個から数百個までのＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイ及びそれ以上の数のＤＮＡプローブが配置されたＤＮＡアレイの２種類に大別されるが、ここでは両者を含むものである。
本発明で用いられるＤＮＡアレイは、例えば、ゲノム機能研究プロトコール 実験医学別冊（羊土社刊）等に記載された方法に準じて製造することができる。また、ＤＮＡプローブが有する塩基配列の情報を基づき、Fodor, S. P.A. et al., Science, 251, 767 (1991) に記載されたように、固体基板の上に塩基を順次添加して化学合成させてゆくことにより、ＤＮＡアレイを直接的に製造することも可能である。ＤＮＡアレイの製造法の詳細については、例えば、上記の通りである。
【００３４】
以下、ＤＮＡアレイを用いて本発明遺伝子等の転写産物量を測定する方法の一例を示す。
（３−１） ＤＮＡマクロアレイによる定量（その１）
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、ｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、MMTV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50 mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3 mM MgCl2、75 mM KCl及び10 mM DTTを含む液］中、0.5 mM dNT［α32P］-dCTP、P及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で、42℃、15分間〜1時間反応させることにより、標識ｃＤＮＡを調製する。このとき、ｃDNA合成キット（タカラバイオ）等を用いてもよい。解析対象である所望の遺伝子、本発明遺伝子又は本発明完全長ｃＤＮＡの塩基配列の全て又は一部に一致する塩基配列を有するＤＮＡプローブをメンブレンフィルター上にスポットして作製されたＤＮＡアレイをポリエチレン袋に入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC（0.9M NaCl、0.21Mクエン酸ナトリウム）、5×デンハルト溶液［0.1％(w/v)フィコール400、0.1％(w/v)ポリビニルピロリドン、0.１％BSA］、0.１％(w/v)SDS，100μg/ml変性サケ精子DNA、50％ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを除去し、新たに2 ml〜6 mlのハイブリダイゼーションバッファーを添加する。更に、これに上記のＤＮＡプローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb (ロシュダイアグノースティク社)等を用いることもできる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡアレイを取り出して、これを50 ml〜100 mlの２×SSC、0.1%SDSに浸した後、室温で１５分間程度インキュベートする。さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50 ml〜100 mlの0.1×SSC、0.1％SDS中、68℃、30分間インキュベートする。次いで、ＤＮＡアレイ上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３５】
（３−２） ＤＮＡマイクロアレイによる定量（その２）
解析対象である所望の遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料から上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、ｍＲＮＡを調製する。調製されたｍＲＮＡに、例えば、MMTV（東洋紡）等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液［例えば、50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.3）、3mM MgCl2、75mM KCl及び10mM DTTを含む液］中、0.5mM ｄＮＴＰ、Cy3-dUTP（又はCy5-dUTP）及び25μg/mlオリゴｄＴ存在下で、42℃、15分間〜１時間反応させる。これにアルカリバッファー（例えば、１N NaOH、20mM EDTAを含む液）を加え、65℃10分間保温した後、Qiaquick PCR Purification kit (キアゲン社)等を用いて遊離のCy3又はCy5を除くことにより、蛍光標識ＤＮＡを調製する。調製された蛍光標識ＤＮＡを、ＤＮＡアレイに対して、上記（３−１）のＤＮＡアレイによる定量（その１）に記載された方法と同様な方法により、ハイブリダイゼーションを及びその後の処理を行う。ＤＮＡアレイ上の標識量をスキャナー等で測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３６】
（４） インサイチューハイブリダイゼーション法
基本的には、（a）組織の固定、包埋及び切片の作製、（b）プローブの調製、（c）ハイブリダイゼーションによる検出からなり、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡ又はＤＮＡをプローブとすること以外は、例えば、Heiles, H. et al., Biotechniques, 6, 978, 1988、遺伝子工学ハンドブック 羊土社 278 1991、細胞工学ハンドブック、羊土社, 214, 1992、細胞工学ハンドブック、羊土社, 222, 1992等に記載される方法に準じて行うことができる。
ＲＮＡプローブを調製する場合には、まず、例えば、上記（１）のノーザンハイブリダイゼーション法に記載される方法と同様な方法により、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子又は完全長ｃＤＮＡを取得し、当該ＤＮＡをSP6、T7、T3ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクター（例えば、Stratagene社のBluescript、Promega社のpGEM等）に組み込んで大腸菌に導入することにより、プラスミドＤＮＡを調製する。次いで、センス（ネガティブコントロール用）、アンチセンス（ハイブリダイゼーション用）ＲＮＡができるようにプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断する。両プラスミドＤＮＡを鋳型とし、放射性標識の場合にはα-35S-UTP等、非放射性標識の場合にはディゴキシゲニンUTP若しくはフルオレセイン修飾UTP等を基質として、SP6、T7、T3ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを合成しながら標識した後、アルカリ加水分解によりハイブリダイゼーションに適したサイズに切断することにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＲＮＡを調製する。尚、これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはＲＮＡラベリングキット（アマシャムバイオサイエンス社）が市販され、また非放射性標識用にはＤＩＧ ＲＮＡラベリングキット（ロシュダイアグノースティック社）、ＲＮＡカラーキット（アマシャムバイオサイエンス社）等が市販されている。また、ＤＮＡプローブを調製する場合には、例えば、32Ｐ等で標識された放射性ヌクレオチド若しくはビオチン、ディゴキシゲニン或いはフルオレセインで標識されたヌクレオチドを、ニックトランスレーション法[Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]又はランダムプライム法[Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 132, 6 (1083), Feinberg, A. P., B. Vogelstein, Anal. Biochem., 137, 266 (1984)]によって取り込ませることにより、予め放射性若しくは非放射性物質で標識されたＤＮＡを調製する。これらの方法に基づいたキットとしては、例えば、放射性標識用にはニックトランスレーションキット（アマシャムバイオサイエンス社）、Random Prime Labeling Kit（ロシュダイアグノースティック社）が市販され、また非放射性標識用にはDIG DNA標識キット（ロシュダイアグノースティック社）、ＤＮＡカラーキット（アマシャムバイオサイエンス社）等が市販されている。
具体的には、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定しようとする被検試料をパラホルムアルデヒド等で固定し、パラフィン等に包埋した後、薄切切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。また、当該被検試料を液体窒素中にて凍結させ、その微小薄層切片を作製し、これをスライドグラスに張り付ける。このようにしてスライドグラス切片を得る。
次に、当該被検試料の中に存在しかつ使用されるプローブと非特異的に反応する物質を除去するために、上記のようにして作製されたスライドグラス切片をプロテイナーゼＫで処理し、アセチル化する。次いで、当該スライドグラス切片と上記のようにして調製されたプローブとのハイブリダイゼーションを行う。例えば、上記のプローブを90℃、3分間加熱した後、これをハイブリダイゼーション溶液で希釈して得られる溶液を前記のスライドグラス切片の上に滴下する。滴下後、当該スライドグラス切片をフィルムで覆い、モイスチャーチャンバー中で、45℃、16時間保温することにより、ハイブリッドを形成させる。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着又は未反応のプローブを洗浄すること等（ＲＮＡプローブを用いた場合には、ＲＮａｓｅ処理も加える。）により除去する。スライドグラス切片の上の標識量を測定することにより、解析対象である所望の遺伝子及び本発明遺伝子の転写産物量を測定することができる。
【００３７】
次に、本発明測定方法における第三工程では、２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量をSxとし、i番目（i≦n）の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量をSiとし、当該Siを基準として算出する場合には、その相対比Cxは下記の式で表される。
Cx＝Si/Sx
ここで「任意の被検試料」とは、測定を行った被検試料のうちのどの被験試料であってもかまわないが、対照となるような被検試料を測定に用いた場合にはそれを用いることが好ましい。
【００３８】
本発明測定方法における第四工程では、第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する。
具体的には例えば、測定を行った被検試料がn個であり、x番目 (x≦n)の被検試料における解析対象である所望の遺伝子の転写産物量をTxとし、上記の第三工程により算出されたi番目（i≦n）の被検試料に対するx番目の被検試料におけるコモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比をCxとし、i番目の被検試料１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を基準として算出する場合には、当該工程により補正された解析対象である所望の遺伝子の転写産物量ATxは下記の式で表される。
ATx＝Tx・Cx
【実施例】
【００３９】
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの特定の実施例により限定されるものではない。
【００４０】
実施例１（コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のクローニング）
（１）全ＲＮＡの調製
コモンマーモセット（日本クレア社より入手）の肝臓から全ＲＮＡの抽出を行った。
47ヶ月齢の雄コモンマーモセットを解剖し、肝臓を摘出した後、摘出された肝臓をピンセットとハサミとを用いて細分化した後、これを直ちにRNAlater（アンビオン社）に浸漬し、一晩室温で静置した後、使用直前まで−20℃にて保存した。保存された肝臓組織の湿重量1gに対して10mlのTRIZOL試薬(インビトロジェン社製)を加え、氷冷しながらポリトロンホモジナイザーにてホモジナイズし、５分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、水層を50ml遠心チューブ（旭テクノグラス社製）に回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/5容量のクロロホルム（関東化学製）を添加した。得られた混合物を15秒間上下に激しく撹拌した後、5分間室温で放置した。次いで、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、水層を新しい50ml遠心チューブに回収した。回収された水層にTRIZOL試薬の1/2容量の2-プロパノール（関東化学製）を添加した。得られた混合物を転倒混和した後、室温で10分間静置した。静置後、これを遠心分離（4℃、9,000rpm、10分間）した後、上清を除去することにより、ＲＮＡのペレットを得た。得られたペレットを、1 mlのDEPC処理滅菌蒸留水（ナカライテスク製）で溶解した。このようにして得られたＲＮＡ溶液1 mlにRNeasy Midi Kit(キアゲン社製)添付のRLT buffer (10μl β−メルカプトエタノール/mL RLT buffer) 3.8 mlを添加し、混合した。更に、当該混合物に2.8 ml エタノール(関東化学製)を添加し、混合した。当該混合液を等量に分割した後、これをRNeasy Midi Kit添付のRNeasy Spin Column 2本にアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、溶出液を再度同じRNeasy Spin Columnにアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、溶出液を捨て、エタノールで4倍希釈されたRNeasy Midi Kit添付のRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離（室温、10,000rpm、15秒間）した。遠心分離後、再び溶出液を捨て、エタノールで希釈されたRPE bufferをそれぞれ2.5 mlアプライし、遠心分離（室温、14,000rpm、2分間）した。遠心分離後、カラムを新しいエッペンドルフチューブに移してRNeasy Midi Kit添付の蒸留水をそれぞれ0.25 ml添加し、1分間室温で静置した。静置後、これを遠心分離（室温、10,000rpm、1分間）することにより、その溶出物として全RNAを得た。
【００４１】
（２）ｃＤＮＡの調製
上記（１）で調製された全ＲＮＡ 6μg及び配列番号４で示される塩基配列を有するプライマー1μg を含む20μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 8μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 4μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 2μl、DEPC処理水4μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 2μlを添加した後、37℃、2時間加熱し、さらに75℃、5分間加熱した後、当該混合物を氷上で冷却することにより、ｃＤＮＡを得た。このようにして得られたｃＤＮＡは、冷却後使用時まで−20℃で保存された。
【００４２】
（３）ＰＣＲ法による本発明遺伝子の増幅
上記で得られたｃＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号２で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号３で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡを得た。尚、ＰＣＲの反応液組成は、上記のｃＤＮＡ 1μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された10xPCR緩衝液 5μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された2.5 mM dNTP 4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ1μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水37.5μlとした。ＰＣＲ反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で1分間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された50μlを、アガロースゲル電気泳動に供し、当該増幅ＤＮＡに相当する泳動度を示したバンドを切り出し後、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて精製し、30μlの滅菌精製水に回収した。
【００４３】
（４）本発明遺伝子クローンの作製
上記（３）で得られた増幅ＤＮＡをＴＡベクターを用いてクローン化した。
当該増幅ＤＮＡを含む溶液5μlと50mg/mlのpGEM-Tベクター（プロメガ社製）1μlとを混合し、両者をＤＮＡライゲーションキットVer.2（タカラバイオ製）を用いて反応させた。得られた反応液を用いて大腸菌DH5αコンピテントセルを形質転換した。アンピシリン耐性、IPTG及びX-galを用いたベータガラクトシダーゼに対する染色性の欠如を指標にコロニーを採取した後、採取されたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。調製されたプラスミドＤＮＡの塩基配列をABIモデル3700オートシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてダイターミネーター法で決定した。シークエンシング用プライマーとしては、ＤＮＡ合成装置にて化学合成された配列番号５乃至８で示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。得られた塩基配列に係るデータをDNA配列解析ソフトウエアDNASIS（日立ソフト社製）を用いて編集、整列化することにより、配列番号１で示された塩基配列を得た。このようにして得られた塩基配列を、BLAST法を用いて公的データベースであるNCBIの遺伝子配列に対して相同性検索を行ったところ、登録番号X03205であるヒト１８ＳリボソームＲＮＡが有する塩基配列に相同性が高いことを見出し、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子であることを確認した。
【００４４】
（５）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた本発明遺伝子の発現確認
上記（４）でクローン化された、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の各組織における転写産物量を確認するために、種々の異なる個体や異なる種類の組織からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてｍＲＮＡの発現を調べた。
47〜132ヶ月齢の４匹のコモンマーモセット（日本クレア社より入手）より組織を摘出し、上記（１）に記載した方法を用いて全ＲＮＡを抽出した。抽出した組織は、肝臓、肺、心臓、骨格筋、脳及び腎臓（以上、個体番号１）、肝臓、心臓及び骨格筋（以上、個体番号２）、肝臓及び肺（以上、個体番号３）、脳（個体番号４）の12種類である。次に、前記全ＲＮＡそれぞれ1μg及びd(T)12-18プライマー（アマシャムバイオサイエンス製）1μg を含む12μlの混合液を、70℃、10分間加熱した後、氷上で冷却した。冷却後、当該混合物にSuperScript II Choice System for cDNA Synthesis (インビトロジェン社製)に含まれる5×First Strand cDNA Buffer 4μl、当該キットに含まれる0.1M DTT 2μl及び当該キットに含まれる10mM dNTPMix 1μl及び当該キットに含まれるSuper ScriptII RT 1μlを添加した後、42℃、60分加熱し、さらに75℃、15分間加熱した後、当該混合物を4℃で冷却することにより、ｃＤＮＡを得た。
このようにして得られたｃＤＮＡに精製水80μlを添加し希釈した後、使用時まで−20℃で保存した。このようにして得られたｃＤＮＡを鋳型に用いて、配列番号９で示される塩基配列を有するフォワードプライマー、配列番号１０で示される塩基配列を有するリバースプライマー及びEx Taqポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。尚、ＲＴ−ＰＣＲの反応液組成は、上記希釈後のｃＤＮＡ溶液を3μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された10xPCR緩衝液 3μl、Ex taqポリメラーゼ（タカラバイオ社製）に添付された2.5 mM dNTP 2.4μl、10μMの濃度の上記プライマーをそれぞれ0.6μl、Ex taqポリメラーゼ0.5μl及び滅菌精製水22.6μlとした。ＰＣＲ反応は、まず94℃で2分間加温した後、94℃で30秒間、次いで60℃で30秒間、次いで72℃で30秒間の加温をサイクルとしてこれを30サイクル行う反応条件で実施された。更に、反応混合物を72℃で5分間加温した後、4℃で保存した。当該反応混合物から採取された3μlを、エチジウムブロミドを含んだアガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、図１に示すように、電気泳動に供した12種類のサンプルに均等の蛍光を発するバンドが検出された。この結果から、電気泳動に供した12種類のすべての組織において、個体や組織の種類に関わらずほぼ同量の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のｍＲＮＡが含まれていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及びその利用等が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のコモンマーモセットの各組織における発現分布を示すＲＴ−ＰＣＲの結果である。尚、図中の「１」、「２」、「３」、「４」は各組織を摘出した個体番号を示す（実施例５）。
【配列表フリーテキスト】
【００４７】
配列番号1
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子
配列番号2
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
ｃＤＮＡ合成のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
ＤＮＡ塩基配列決定のために用いたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号9
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号10
ＲＴ−ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子。
【請求項２】
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
【請求項３】
下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
【請求項４】
DNA又はRNAを検出のための組成物であって、請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての請求項２又は３記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項７】
前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項６記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
（１）請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法。
【請求項９】
前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項８記載の測定方法。
【請求項１０】
第一工程及び／又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする請求項８又は９記載の測定方法。
【請求項１】
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子。
【請求項２】
コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子又はその部分断片であって、下記のいずれかの塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチド。
（１）配列番号１で示される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列に対して、95％以上の塩基同一性を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（２）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
（４）前項（１）乃至（３）記載のいずれかの塩基配列における部分塩基配列
【請求項３】
下記のいずれかの塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
（１）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列
（２）配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１２７４から１８７３で表される塩基配列で指定される領域の中から選ばれる、連続する任意の、塩基長２０〜６０を有する塩基配列
（３）前項（１）乃至（６）記載のいずれかの塩基配列に対して相補的な塩基配列
【請求項４】
DNA又はRNAを検出のための組成物であって、請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項２又は３記載のポリヌクレオチドが担体上に固定化されてなることを特徴とする請求項４記載の組成物。
【請求項６】
２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する際に、前記転写産物量の補正を行うための前記被検試料における遺伝子の発現量の基準となる内部標準としての請求項２又は３記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項７】
前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項６記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
２種類以上の被検試料における所望の遺伝子の発現量の差異を、当該遺伝子の転写産物量の差異として測定する方法であって、
（１）請求項２又は３記載のポリヌクレオチドを用いて、コモンマーモセット由来の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量を測定する第一工程、
（２）前記被検試料における所望の遺伝子を用いて、当該遺伝子の転写産物量を測定する第ニ工程、
（３）２種類以上の被検試料における各被検試料において、任意の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量に対する、他の被検試料において第一工程により測定された１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写産物量の相対比を算出する第三工程、
（４）第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量に第三工程により算出された相対比を乗じることにより、２種類以上の被検試料における各被検試料での第ニ工程により測定された所望の遺伝子の転写産物量を補正する第四工程、
を有することを特徴とする測定方法。
【請求項９】
前記被検試料がコモンマーモセット由来の試料であることを特徴とする請求項８記載の測定方法。
【請求項１０】
第一工程及び／又は第二工程において遺伝子の転写産物量を測定する方法が、ＤＮＡアレイ法又は定量的リバーストランスクリプターゼ−ポリメラーゼチェイン反応法のいずれかの方法であることを特徴とする請求項８又は９記載の測定方法。
【図１】
【公開番号】特開２００６−４２８０４（Ｐ２００６−４２８０４Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−６０３２９（Ｐ２００５−６０３２９）
【出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月４日（２００５．３．４）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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