コリネバクテリウム属細菌に由来するプロモーター核酸、プロモーターを含む発現カセットおよびカセットを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞およびそれを利用して遺伝子を発現させる方法
【課題】コリネ型細菌のための適切なプロモーターの提供。
【解決手段】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来する特定の配列からなる群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含むプロモーター、それを含む発現カセットおよびカセットを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞およびそれを利用して遺伝子を発現させる方法。
【解決手段】コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来する特定の配列からなる群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含むプロモーター、それを含む発現カセットおよびカセットを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞およびそれを利用して遺伝子を発現させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリウム属細菌に由来する新規のプロモーター核酸、それを含む発現カセットおよび発現カセットを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞およびそれを利用して遺伝子を発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンおよび各種の核酸を含んだ飼料、医用薬剤および食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産する微生物である。遺伝工学的および代謝工学的技術を利用して、高力価コリネ型細菌株を開発できる。このような高力価コリネ型細菌株を得るためには、コリネ型細菌内で色々な代謝過程に関連した遺伝子の発現を可能にしなければならない。このためには、適切なプロモーターの開発が必須である。
【０００３】
コリネ型細菌で遺伝子を発現させるためには、それ自体が元来含むプロモーターを使用することが一般的であった（Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999（非特許文献１））。一方、コリネ型細菌での遺伝子発現のためのプロモーターの配列構造は、大腸菌や枯草菌のような他の産業用微生物とは異なり、公知でない。したがって、コリネ型細菌での遺伝子発現を可能とするプロモーターを作製するため、以下の方法が示唆されてきた。まず、クロラムフェニコールのような抗生剤耐性遺伝子のプロモーター部分を除去する。別に、コリネ型細菌から分離した染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で切断して導入し、得られた断片を、プロモーター部分を除去した遺伝子に導入する。その後、得られた遺伝子を用いてコリネ型細菌を形質転換して形質転換株を作製し、形質転換株の抗生剤耐性を測定する（Gene, 102, 93-98, 1991;Microbiology, 142, 1297-1309, 1996（非特許文献２））。特に、核酸生産微生物としてよく知られたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで利用されるプロモーターについては、非常に少ない数しか開発されていない。例えば、ｔａｃプロモーターと比較して約１０％向上した活性を有するプロモーターが、大腸菌で用いられる（Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003（非特許文献３））。しかし、遺伝子の大量発現のために利用される場合、そのようなプロモーターは低い効率しか示さない。また、米国特許第５，５９３，７８１号（特許文献１）には、ブレビバクテリウム・フラブム株ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）から分離され、ｔａｃプロモーターより強力な活性を有するプロモーターＤＮＡが開示されている。しかし、このプロモーターは、ブレビバクテリウム属から単離されたものであって、他の細菌で作用しない可能性がある。したがって、産業的に多く利用されるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来し、強力であり、かつ他の細菌でも活性を有するプロモーター配列が依然として要求されている。
【０００４】
したがって、本発明者らは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索し、本発明のプロモーターがコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで発現可能であり、強力な活性を有することを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，５９３，７８１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999
【非特許文献２】Gene, 102, 93-98, 1991;Microbiology, 142, 1297-1309, 1996
【非特許文献３】Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コリネバクテリウム属で強力なプロモーター活性を有するプロモーターを提供するところにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記プロモーターを含む発現カセットおよびベクターを提供するところにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供するところにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明の宿主細胞を利用して遺伝子を発現させる方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列番号１ないし７で構成される群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含む単離されたプロモーターを提供する。
【００１２】
本発明のプロモーターは、単離された核酸であって、プロモーター活性を有する。本発明において、“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域をいう。“ｔａｃプロモーター”とは、大腸菌のトリプトファンオペロンプロモーターの−３５領域から得られた配列と、大腸菌の乳糖オペロンプロモーターの−１０領域から得られた配列とを融合して得られたプロモーターを意味する。ｔａｃプロモーターは、強力なプロモーター活性を有することが公知である。本発明のプロモーターのうち、配列番号１，４，５，６および７から選択される一つ以上の核酸を含むプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でｔａｃプロモーターに比べてさらに強力なプロモーター活性を有する。特に、配列番号１および４から選択される一つ以上の核酸を含むプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でｔａｃプロモーターに比べて１０倍以上強力なプロモーター活性を有する。
【００１３】
本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞だけでなく、エシェリキア属バクテリア細胞でもプロモーター活性を有する。特に、配列番号１を含むプロモーターは、エシェリキア属バクテリア細胞でもｔａｃプロモーターに比べて２倍以上さらに強力なプロモーター活性を有する。
【００１４】
本発明のプロモーターが機能できる細胞は、任意のコリネバクテリウム属バクテリア細胞であり得る。コリネバクテリウム属バクテリアの例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）およびＡＴＣＣ ６８７１、ならびにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２およびＡＴＣＣ １３０６０などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のプロモーターが機能できるエシェリキア属バクテリア細胞の例としては、大腸菌が挙げられる。
【００１５】
本発明のプロモーター配列は、公知の突然変異誘発法、例えば定向進化法および部位特異的突然変異法などで当業者により容易に変形されうる。したがって、配列番号１ないし７から選択される一つ以上の核酸を含む単離されたプロモーター配列と、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でプロモーターとして機能できる核酸は、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明は、また、コーディング配列と作動可能に連結された本発明の前記プロモーターを含む発現カセットを提供する。前記コーディング配列は、例えば遺伝子全体、またはその一定領域をコーディングする配列でありうる。本発明において、“作動可能に連結された”とは、プロモーター配列が前記コーディング配列の転写を開始および媒介するように、前記コーディング配列とプロモーターとが機能的に連結されていることを意味する。本発明のカセットは、前記配列と作動可能に連結された５´および３´調節配列をさらに含みうる。コーディング配列は、ＩＭＰ、ＧＭＰ、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンのような代謝産物に関連している遺伝子でありうる。
【００１７】
本発明は、また、本発明の発現カセットが含まれるベクターを提供する。本発明で使われるベクターは、限定されないが、当技術分野で公知の任意のベクターでありうる。使われるベクターの例には、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）およびｐＥＣＣＧ１１７（ＫＦＣＣ−１０６７３）が含まれる。本発明の発現カセットが含まれるベクターの例には、ｐ１１７−ｃｊ１−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ２−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ３−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ４−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ５−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ６−ｇｆｐおよびｐ１１７−ｃｊ７−ｇｆｐが含まれる。
【００１８】
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明に使われる宿主細胞は、望ましくは、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属するバクテリア細胞であるが、それらの例に限定されるものではない。宿主細胞は、さらに望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）または大腸菌である。
【００１９】
本発明は、また、本発明の宿主細胞を培養して外来遺伝子を発現させる方法を提供する。宿主細胞の培養は、選択される宿主細胞によって公知の任意の培養培地および培養条件を使用して行われうる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子は、大腸菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで、効率的に発現する。本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリアを利用した菌株開発に有用に使われうる。
【００２１】
本発明のプロモーターを含む発現カセット、および本発明の発現カセットを含むベクターは、外来遺伝子を大腸菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで効率的に発現させるのに使われうる。
【００２２】
本発明の宿主細胞によれば、外来遺伝子を効率的に発現できる。
【００２３】
本発明の遺伝子の発現方法によれば、外来遺伝子を効果的に発現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】コリネバクテリウム・アンモニアゲネス細胞抽出物試料を２次元電気泳動分析し、銀染色を行った後に現像した結果を示す図である。
【図２】スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐの作製過程を示す図である。
【図３】スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐからの本発明のプロモーター配列ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７を含む組み換えベクターの作製過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
本発明の実施例では、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を培養して培養段階によって細胞抽出物を調製する。細胞抽出物について２次元電気泳動を行って各培養時期で過剰発現される蛋白質を選択し、選択された蛋白質を切断してペプチド配列を分析する。得られたペプチド配列データを利用して過剰発現された蛋白質の遺伝子を同定する。その後、プロモーター領域を単離し、プロモーター領域を含むベクターを作製した。次いで、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）および大腸菌でプロモーター活性を測定した。
【００２７】
実施例１：コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）培養および培養時期による過剰発現蛋白質の選択
【００２８】
（１）細胞の培養
原糖加水分解物（ブドウ糖５０％＋フルクトース５０％の混合物）を含有する培地で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を培養した。培養中に細胞の濃度を測定した。初期定常期および定常期で培養物試料を採取した。遠心分離して上澄み液を除去した。得られた細胞を破砕緩衝液中で破砕して約１００μlの細胞抽出物を得た。
【００２９】
（２）２次元電気泳動分析
（１）で得た細胞抽出物について、細胞抽出物を含んで総体積が３５０μlになるように６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．４％ＤＴＴで希釈した。その後、７μlのＩＰＧ緩衝液、３μlの１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）を加えた。得られた溶液について、イモビラインｐＨ勾配ドライストリップを用い再水和トレイ上に載せた。試料の気化および尿素の結晶化を防止するために２ｍｌのカバー液を加え、約２４時間室温で再水和させた。
【００３０】
再水和されたストリップゲルについて、０ないし１００Ｖで１時間、３００Ｖで１時間、６００Ｖで１時間、および約４３ないし９７ｋＶｈｒになるように８０００Ｖを所定の時間としつつ（ｐＨ ４〜７：４３．４ｋＶｈｒ，ｐＨ４．５〜５．５，ｐＨ５．５〜６．７：９７ｋＶｈｒ）、等電点フォーカシング装置（ＭｕｌｔｉｐｈｏｒII：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を利用して２０℃で等電点フォーカシングを行った。
【００３１】
等電点フォーカシングが完了すれば、各ストリップゲルをｐＨ８．８の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミドおよび５ｍＭ ＴＢＰを含む溶液で１５分間平衡化させた。平衡化された各ストリップを２次元ゲル（９ないし１６％濃度勾配）上に載せ、０．５％低沸点アガロースと０．００１％ＢＰＢとを有するＳＤＳ溶液で封じ込め、１００Ｖで約１９時間電気泳動を行った。
【００３２】
電気泳動後、ゲルを４５％メタノールおよび５％酢酸溶液で固定した。蒸留水で１時間の間酢酸を洗浄した。０．０２％チオ硫酸ナトリウムで２分間感化させ、蒸留水を利用して洗浄した。次いで、ゲルを０．１％硝酸銀と２０分間反応させた後、蒸留水で洗浄した。２％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウムおよび０．０４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含有する溶液で、反応産物を現像した。所望の強度のスポットが現れれば、１％酢酸で反応を停止させた。最後に、ゲルを蒸留水で洗浄し、密封されたプラスチックバック中に保存し４℃で保管した。
【００３３】
クーマシー染色を行う場合には、ゲルを取り出した後、３０％メタノールおよび１０％酢酸溶液で１時間の間固定して蒸留水で簡単に洗浄した後、コロイド性のクーマシーブリリアントＧ−２５０で２４時間の間染色し、１０％メタノールおよび７％酢酸溶液で４時間の間脱染色した。
【００３４】
（３）スポットから質量分析のためのペプチド試料の準備
スポットからのペプチドの分離は、公知の方法の変法を使用した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８（５），８５０−８，１９９６）。
【００３５】
まず、蛋白質スポットを（２）の項で調製されたゲルから切断し、３０ｍＭフェリシアン化カリウムおよび１００ｍＭチオ硫酸ナトリウムの１：１混合液の１２０μl中で脱染色し、蒸留水で洗浄した後、１２０μlの５０％アセトニトリル／２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７．８で１０分間洗浄した。５０μlの１００％アセトニトリルと白色になるまで約５分間反応させた後、真空乾燥した。
【００３６】
乾燥された各スポットに０．０２μg／μlの２次元電気泳動級トリプシン１０μlを加えて氷中で４５分間反応させた。その後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．８を添加し、３７℃で１２ないし１４時間反応させた。得られた産物について、１０μlの０．５％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル中で１０分間３回超音波処理を行い、ペプチドを抽出した。
【００３７】
（４）質量分析
前記のように抽出されたペプチドをＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、１１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｉｅｎｔ社製、米国）、およびナノスプレーイオン化源が装着されたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ＤＥＣＡ ｉｏｎ−ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製、米国）装置により行った。ＨＰＬＣは、Ｃ１８マイクロプローブ逆相カラムを使用し、０．１％ギ酸（溶媒Ａ）と、９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．１％ギ酸の溶液（溶媒Ｂ）とを直線勾配（流速１μl／ｍｉｎ）において提供し、ペプチドを単離した。
【００３８】
ペプチドの検出は、ナノスプレーイオン化（Ｎａｎｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＮＳＩ）を用いて３回行われた（スプレー電圧：１．８ｋＶ；毛細管温度：２００℃；毛細管電圧：３４Ｖ；管レンズオフセット：４０Ｖ；電子増幅器：−６０Ｖ）。測定はセントロイドモードで収集された。４００ないし２０００Ｄａの全ＭＳスキャンを得た後、しきい値を１×１０５カウントにセットし、最も強力なイオンを高解像度ズームスキャンで分離した。その後、衝突誘導解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳを実施した。エンコードされないＣＩＤスペクトルの配列を、ＴｕｒｂｏＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社、米国）を使用して同定し、ＳＥＱＵＥＳＴ検索の結果は、交差相関および△Ｃｎ（デルタ標準化相関）で同定した。
【００３９】
ペプチドのアミノ酸配列は、Ｑ−ｓｔａｒＰｕｌｓａｒ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を利用して確認および同定された。
【００４０】
その結果、５０個の蛋白質を確認し、それらのうち過剰発現される７種類の蛋白質を選択した。図１は、本実施例の試料を２次元電気泳動分析し、銀染色を行った後に現像した結果を示す図である。図１に示したように、ＣＪ１ないしＣＪ７と示された７種類の過剰発現されたスポットが同定された。それらの７種類の蛋白質の機能は、表１に示した。それらの蛋白質の機能は、得られたペプチド配列を公知のＮＣＢＩジーンバンクデータベースのアミノ酸配列と比較して同定された。
【００４１】
【表１】
【００４２】
選択された７種類の過剰発現蛋白質から遺伝子配列が推定され、プロモーター部位を選択するために分析された。その結果、ＣＪ１ないしＣＪ７で示された蛋白質に対応する遺伝子配列から分離された配列番号１ないし７のオリゴヌクレオチドがプロモーター活性を有すると推定された。
【００４３】
実施例２：プロモーター配列を含有する組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐの作製およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのプロモーター活性の確認
【００４４】
（１）コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００のゲノムからのプロモーター配列の増幅
Ｅｉｋｍａｎｎら（Ｇｅｎｅ，１０２，９３−９８，１９９１）の方法によって、１日間培養したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００ ２５mlから染色体ＤＮＡ ５００μgを分離した。分離された染色体を鋳型として使用した。ＣＪ１ないしＣＪ７の各プロモーターを増幅するためのプライマーセット（それぞれ配列番号１０および１１、１２および１３、１４および１５、１６および１７、１８および１９、２０および２１、２２および２３）を利用してＰＣＲを行った（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応を３０回）。その結果、各プロモーター配列（ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７）が増幅された。
【００４５】
（２）スクリーニングベクターの作製
まず、ｐＧＦｕｖベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を鋳型とし、配列番号８および９をプライマーとしてＰＣＲを行った（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を３０回）。その結果、プロモーター部分を含まない緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子が増幅された。次いで、得られたプロモーター部分を含まないＧＦＰ遺伝子を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングした後、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断して、大腸菌およびコリネ型細菌で発現可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（ＫＦＣＣ−１０６７３／ＫＦＣＣ−１０６７４）のＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位に導入した。それをプロモーター分離のためのスクリーニングベクター（ｐ１１７−ｇｆｐ）として使用した。図２は、スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐの作製過程を示す図である。
【００４６】
（３）スクリーニングベクターへのプロモーター配列の導入、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００でのプロモーター活性の同定
（２）の項で得たスクリーニングベクターを制限酵素ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、同じ酵素で切断されたプロモーター配列（ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７）と連結して、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００から分離されたプロモーター活性を有すると推定されるｐｃｊ１ないしｐｃｊ７の各オリゴヌクレオチドがＧＦＰと連結されている組み換えベクター（ｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐ）を作製した。図３は、スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐからの、本発明のプロモーター配列ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７を含む組み換えベクターの作製過程を示す図である。
【００４７】
得られた組み換えベクターを、ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔらの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１〜５４５，１９９９）で形質転換を可能にしたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）に導入した。形質転換された菌株をカナマイシン１０μg／mlが含まれたＣＭ培地（ペプトン１％、ブロス１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母抽出物１％、アデニン１００ｍｇ／ｍｌ、グアニン１００ｍｇ／ｍｌ、寒天２％（ｐＨ７．２））に塗抹して３２℃で３日間培養した。成長を示す生存菌株を選択した。次いで、選択された菌株に紫外線を照射して蛍光を発する菌株を選択した。
【００４８】
蛍光を発する菌株の選択は、プロモーターｐｃｊ１ないしｐｃｊ７がコリネ型細菌でプロモーター活性を有しているということを示す。
【００４９】
次いで、プロモーター活性を定量的に測定した。組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐが導入されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を同じ方法で培養した。培養物を遠心分離して細菌のペレットを得た。次いで、細菌のペレットを蛋白質抽出緩衝液（ＰＢＳ中のＥＤＴＡ １ｍＭ、グリセロール３％、トリトン−Ｘ−１００ １％溶液、ｐＨ−７．５）に懸濁し、超音波処理して細胞を破砕した。細胞破砕物を遠心分離し、細胞抽出物が含まれている上澄み液を分離した。得られた細胞抽出物に対してブラッドフォード分析法により蛋白質量を測定した。次いで、上記と同量の細胞抽出物に対して、Ｌａｕｒｅ Ｇｏｒｙらの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９４，１２７−１３３，２００１）を利用して４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍの放射光をＬＳ−５０Ｂ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）機器を利用して測定することによって、ＧＦＰ遺伝子の発現の程度を測定した。
【００５０】
その結果を下記表２に示した。表２に示したように、本発明のプロモーターは、ＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させた。特に、ｐｃｊ１およびｐｃｊ４プロモーターは、他のプロモーターに比べて相対的に非常に強力な効率を示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例３：ｔａｃプロモーターと本発明のプロモーターとのコリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのプロモーター活性の比較
【００５３】
本実施例では、本発明のプロモーターと従来一般的に使われるｔａｃプロモーターとのプロモーター活性を、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで比較した。
【００５４】
（１）ｔａｃプロモーターとＧＦＰ遺伝子とが融合された配列を含むベクターの作製
まず、ｐＫＫ２２３−２ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）を鋳型とし、配列番号２４および２５をプライマーとして、実施例１と同じ条件でＰＣＲを行ってｔａｃプロモーター配列を増幅した。増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、米国）にクローニングした。次いで、得られたｔａｃプロモーター配列を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、同じ酵素で切断されたｐ１１７−ｇｆｐに連結して組み換え発現ベクター（ｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐ）を作製した。
【００５５】
この組み換えベクターを用いて、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００を実施例１と同じ方法により形質転換し、ＧＦＰ遺伝子の活性を測定した。ｔａｃプロモーターによるＧＦＰ遺伝子の活性を実施例２で選択したプロモーターでのＧＦＰ活性と比較した。その結果を表３に示した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３に示したように、本発明のプロモーターがＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させることを確認した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのｔａｃプロモーターの活性と比較した結果、ｐｃｊ１，ｐｃｊ４，ｐｃｊ５，ｐｃｊ６およびｐｃｊ７プロモーターは、ｔａｃプロモーターよりも強力であることが示された。特に、ｐｃｊ１およびｐｃｊ４プロモーターは、ｔａｃプロモーターに比べて１０倍以上の活性を示した。
【００５８】
実施例４：大腸菌で本発明のプロモーターのプロモーター活性の確認
【００５９】
本発明のプロモーターがコリネ型細菌だけでなく、大腸菌でもプロモーター活性を有しているかどうかを確認した。実施例１および２で使用した組み換え発現ベクターを大腸菌に形質転換した。実施例１と同じ方法でＧＦＰ遺伝子の活性を測定することによって、本発明のプロモーターが大腸菌でＧＦＰ遺伝子の効率的な発現を可能とするかどうか調べた。対照ベクターとして、ｔａｃプロモーターを含む組み換えベクターｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐを使用した。表４は、大腸菌での本発明のプロモーターのプロモーター活性を示したものである。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表４に示したように、本発明のプロモーターが大腸菌でもＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させることを確認した。特に、ｐｃｊ１プロモーターは、コリネ型細菌および大腸菌の双方で高い活性を示した。
【００６２】
実施例５：ＩＰＴＧが本発明のプロモーターの活性に及ぼす影響
【００６３】
ｔａｃプロモーターは、大腸菌内でＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）により発現が誘導される代表的なプロモーターであることが周知である。すなわち、大腸菌において、ＩＰＴＧの有無によってｔａｃプロモーターから発現される遺伝子の発現量が変動する。
【００６４】
本実施例では、ＩＰＴＧが本発明のプロモーターからのＧＦＰ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。このために、本発明のプロモーターのうち、活性が最も良好なｐｃｊ１プロモーターを含む組み換えベクター（ｐ１１７−ｃｊ１−ｇｆｐ）を、大腸菌とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）とに実施例１および２と同じ方法で導入し、それによるＧＦＰの発現量を測定した。対照として、ｔａｃプロモーターを含む組み換えベクターｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐを使用した。
【００６５】
その結果を表５に示した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
表５に示したように、本発明のプロモーターは、大腸菌およびコリネバクテリウムアンモニアゲネスでＩＰＴＧの有無に関係なく、ｔａｃプロモーターより効率的にＧＦＰ遺伝子を発現させる。
【００６８】
以上のような実施例の結果から得られたプロモーターｐＣＪ１，ｐＣＪ２，ｐＣＪ３，ｐＣＪ４，ｐＣＪ５，ｐＣＪ６およびｐＣＪ７をｐＥＣＣＧ１１７に挿入した。得られたベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られた形質転換体を、ブダペスト条約による国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年６月１１日付で寄託した（各受託番号ＫＣＣＭ−１０６１１，ＫＣＣＭ−１０６１２，ＫＣＣＭ−１０６１３，ＫＣＣＭ−１０６１４，ＫＣＣＭ−１０６１５，ＫＣＣＭ−１０６１６およびＫＣＣＭ−１０６１７）。
【００６９】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリネバクテリウム属細菌に由来する新規のプロモーター核酸、それを含む発現カセットおよび発現カセットを含むベクター、ベクターを含む宿主細胞およびそれを利用して遺伝子を発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネ型細菌は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンおよび各種の核酸を含んだ飼料、医用薬剤および食品などの分野で多様な用途を有する化学物質を生産する微生物である。遺伝工学的および代謝工学的技術を利用して、高力価コリネ型細菌株を開発できる。このような高力価コリネ型細菌株を得るためには、コリネ型細菌内で色々な代謝過程に関連した遺伝子の発現を可能にしなければならない。このためには、適切なプロモーターの開発が必須である。
【０００３】
コリネ型細菌で遺伝子を発現させるためには、それ自体が元来含むプロモーターを使用することが一般的であった（Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999（非特許文献１））。一方、コリネ型細菌での遺伝子発現のためのプロモーターの配列構造は、大腸菌や枯草菌のような他の産業用微生物とは異なり、公知でない。したがって、コリネ型細菌での遺伝子発現を可能とするプロモーターを作製するため、以下の方法が示唆されてきた。まず、クロラムフェニコールのような抗生剤耐性遺伝子のプロモーター部分を除去する。別に、コリネ型細菌から分離した染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で切断して導入し、得られた断片を、プロモーター部分を除去した遺伝子に導入する。その後、得られた遺伝子を用いてコリネ型細菌を形質転換して形質転換株を作製し、形質転換株の抗生剤耐性を測定する（Gene, 102, 93-98, 1991;Microbiology, 142, 1297-1309, 1996（非特許文献２））。特に、核酸生産微生物としてよく知られたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで利用されるプロモーターについては、非常に少ない数しか開発されていない。例えば、ｔａｃプロモーターと比較して約１０％向上した活性を有するプロモーターが、大腸菌で用いられる（Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003（非特許文献３））。しかし、遺伝子の大量発現のために利用される場合、そのようなプロモーターは低い効率しか示さない。また、米国特許第５，５９３，７８１号（特許文献１）には、ブレビバクテリウム・フラブム株ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）から分離され、ｔａｃプロモーターより強力な活性を有するプロモーターＤＮＡが開示されている。しかし、このプロモーターは、ブレビバクテリウム属から単離されたものであって、他の細菌で作用しない可能性がある。したがって、産業的に多く利用されるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスに由来し、強力であり、かつ他の細菌でも活性を有するプロモーター配列が依然として要求されている。
【０００４】
したがって、本発明者らは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスから強力なプロモーター配列を有する領域を探索し、本発明のプロモーターがコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで発現可能であり、強力な活性を有することを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，５９３，７８１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Bacteriology, 181(19), 6188-6191, 1999
【非特許文献２】Gene, 102, 93-98, 1991;Microbiology, 142, 1297-1309, 1996
【非特許文献３】Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、コリネバクテリウム属で強力なプロモーター活性を有するプロモーターを提供するところにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記プロモーターを含む発現カセットおよびベクターを提供するところにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供するところにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明の宿主細胞を利用して遺伝子を発現させる方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列番号１ないし７で構成される群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含む単離されたプロモーターを提供する。
【００１２】
本発明のプロモーターは、単離された核酸であって、プロモーター活性を有する。本発明において、“プロモーター”とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域をいう。“ｔａｃプロモーター”とは、大腸菌のトリプトファンオペロンプロモーターの−３５領域から得られた配列と、大腸菌の乳糖オペロンプロモーターの−１０領域から得られた配列とを融合して得られたプロモーターを意味する。ｔａｃプロモーターは、強力なプロモーター活性を有することが公知である。本発明のプロモーターのうち、配列番号１，４，５，６および７から選択される一つ以上の核酸を含むプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でｔａｃプロモーターに比べてさらに強力なプロモーター活性を有する。特に、配列番号１および４から選択される一つ以上の核酸を含むプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でｔａｃプロモーターに比べて１０倍以上強力なプロモーター活性を有する。
【００１３】
本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリア細胞だけでなく、エシェリキア属バクテリア細胞でもプロモーター活性を有する。特に、配列番号１を含むプロモーターは、エシェリキア属バクテリア細胞でもｔａｃプロモーターに比べて２倍以上さらに強力なプロモーター活性を有する。
【００１４】
本発明のプロモーターが機能できる細胞は、任意のコリネバクテリウム属バクテリア細胞であり得る。コリネバクテリウム属バクテリアの例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）およびＡＴＣＣ ６８７１、ならびにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３０３２およびＡＴＣＣ １３０６０などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のプロモーターが機能できるエシェリキア属バクテリア細胞の例としては、大腸菌が挙げられる。
【００１５】
本発明のプロモーター配列は、公知の突然変異誘発法、例えば定向進化法および部位特異的突然変異法などで当業者により容易に変形されうる。したがって、配列番号１ないし７から選択される一つ以上の核酸を含む単離されたプロモーター配列と、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、コリネバクテリウム属バクテリア細胞でプロモーターとして機能できる核酸は、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明は、また、コーディング配列と作動可能に連結された本発明の前記プロモーターを含む発現カセットを提供する。前記コーディング配列は、例えば遺伝子全体、またはその一定領域をコーディングする配列でありうる。本発明において、“作動可能に連結された”とは、プロモーター配列が前記コーディング配列の転写を開始および媒介するように、前記コーディング配列とプロモーターとが機能的に連結されていることを意味する。本発明のカセットは、前記配列と作動可能に連結された５´および３´調節配列をさらに含みうる。コーディング配列は、ＩＭＰ、ＧＭＰ、Ｌ−リジンおよびＬ−スレオニンのような代謝産物に関連している遺伝子でありうる。
【００１７】
本発明は、また、本発明の発現カセットが含まれるベクターを提供する。本発明で使われるベクターは、限定されないが、当技術分野で公知の任意のベクターでありうる。使われるベクターの例には、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）およびｐＥＣＣＧ１１７（ＫＦＣＣ−１０６７３）が含まれる。本発明の発現カセットが含まれるベクターの例には、ｐ１１７−ｃｊ１−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ２−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ３−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ４−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ５−ｇｆｐ，ｐ１１７−ｃｊ６−ｇｆｐおよびｐ１１７−ｃｊ７−ｇｆｐが含まれる。
【００１８】
本発明は、また、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明に使われる宿主細胞は、望ましくは、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属するバクテリア細胞であるが、それらの例に限定されるものではない。宿主細胞は、さらに望ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）または大腸菌である。
【００１９】
本発明は、また、本発明の宿主細胞を培養して外来遺伝子を発現させる方法を提供する。宿主細胞の培養は、選択される宿主細胞によって公知の任意の培養培地および培養条件を使用して行われうる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子は、大腸菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで、効率的に発現する。本発明のプロモーターは、コリネバクテリウム属バクテリアを利用した菌株開発に有用に使われうる。
【００２１】
本発明のプロモーターを含む発現カセット、および本発明の発現カセットを含むベクターは、外来遺伝子を大腸菌およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスで効率的に発現させるのに使われうる。
【００２２】
本発明の宿主細胞によれば、外来遺伝子を効率的に発現できる。
【００２３】
本発明の遺伝子の発現方法によれば、外来遺伝子を効果的に発現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】コリネバクテリウム・アンモニアゲネス細胞抽出物試料を２次元電気泳動分析し、銀染色を行った後に現像した結果を示す図である。
【図２】スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐの作製過程を示す図である。
【図３】スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐからの本発明のプロモーター配列ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７を含む組み換えベクターの作製過程を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
本発明の実施例では、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を培養して培養段階によって細胞抽出物を調製する。細胞抽出物について２次元電気泳動を行って各培養時期で過剰発現される蛋白質を選択し、選択された蛋白質を切断してペプチド配列を分析する。得られたペプチド配列データを利用して過剰発現された蛋白質の遺伝子を同定する。その後、プロモーター領域を単離し、プロモーター領域を含むベクターを作製した。次いで、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）および大腸菌でプロモーター活性を測定した。
【００２７】
実施例１：コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）培養および培養時期による過剰発現蛋白質の選択
【００２８】
（１）細胞の培養
原糖加水分解物（ブドウ糖５０％＋フルクトース５０％の混合物）を含有する培地で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を培養した。培養中に細胞の濃度を測定した。初期定常期および定常期で培養物試料を採取した。遠心分離して上澄み液を除去した。得られた細胞を破砕緩衝液中で破砕して約１００μlの細胞抽出物を得た。
【００２９】
（２）２次元電気泳動分析
（１）で得た細胞抽出物について、細胞抽出物を含んで総体積が３５０μlになるように６Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、０．４％ＤＴＴで希釈した。その後、７μlのＩＰＧ緩衝液、３μlの１％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）を加えた。得られた溶液について、イモビラインｐＨ勾配ドライストリップを用い再水和トレイ上に載せた。試料の気化および尿素の結晶化を防止するために２ｍｌのカバー液を加え、約２４時間室温で再水和させた。
【００３０】
再水和されたストリップゲルについて、０ないし１００Ｖで１時間、３００Ｖで１時間、６００Ｖで１時間、および約４３ないし９７ｋＶｈｒになるように８０００Ｖを所定の時間としつつ（ｐＨ ４〜７：４３．４ｋＶｈｒ，ｐＨ４．５〜５．５，ｐＨ５．５〜６．７：９７ｋＶｈｒ）、等電点フォーカシング装置（ＭｕｌｔｉｐｈｏｒII：Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を利用して２０℃で等電点フォーカシングを行った。
【００３１】
等電点フォーカシングが完了すれば、各ストリップゲルをｐＨ８．８の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、２．５％アクリルアミドおよび５ｍＭ ＴＢＰを含む溶液で１５分間平衡化させた。平衡化された各ストリップを２次元ゲル（９ないし１６％濃度勾配）上に載せ、０．５％低沸点アガロースと０．００１％ＢＰＢとを有するＳＤＳ溶液で封じ込め、１００Ｖで約１９時間電気泳動を行った。
【００３２】
電気泳動後、ゲルを４５％メタノールおよび５％酢酸溶液で固定した。蒸留水で１時間の間酢酸を洗浄した。０．０２％チオ硫酸ナトリウムで２分間感化させ、蒸留水を利用して洗浄した。次いで、ゲルを０．１％硝酸銀と２０分間反応させた後、蒸留水で洗浄した。２％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウムおよび０．０４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドを含有する溶液で、反応産物を現像した。所望の強度のスポットが現れれば、１％酢酸で反応を停止させた。最後に、ゲルを蒸留水で洗浄し、密封されたプラスチックバック中に保存し４℃で保管した。
【００３３】
クーマシー染色を行う場合には、ゲルを取り出した後、３０％メタノールおよび１０％酢酸溶液で１時間の間固定して蒸留水で簡単に洗浄した後、コロイド性のクーマシーブリリアントＧ−２５０で２４時間の間染色し、１０％メタノールおよび７％酢酸溶液で４時間の間脱染色した。
【００３４】
（３）スポットから質量分析のためのペプチド試料の準備
スポットからのペプチドの分離は、公知の方法の変法を使用した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８（５），８５０−８，１９９６）。
【００３５】
まず、蛋白質スポットを（２）の項で調製されたゲルから切断し、３０ｍＭフェリシアン化カリウムおよび１００ｍＭチオ硫酸ナトリウムの１：１混合液の１２０μl中で脱染色し、蒸留水で洗浄した後、１２０μlの５０％アセトニトリル／２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム、ｐＨ７．８で１０分間洗浄した。５０μlの１００％アセトニトリルと白色になるまで約５分間反応させた後、真空乾燥した。
【００３６】
乾燥された各スポットに０．０２μg／μlの２次元電気泳動級トリプシン１０μlを加えて氷中で４５分間反応させた。その後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．８を添加し、３７℃で１２ないし１４時間反応させた。得られた産物について、１０μlの０．５％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル中で１０分間３回超音波処理を行い、ペプチドを抽出した。
【００３７】
（４）質量分析
前記のように抽出されたペプチドをＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、１１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｉｅｎｔ社製、米国）、およびナノスプレーイオン化源が装着されたＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ ＤＥＣＡ ｉｏｎ−ｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ社製、米国）装置により行った。ＨＰＬＣは、Ｃ１８マイクロプローブ逆相カラムを使用し、０．１％ギ酸（溶媒Ａ）と、９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．１％ギ酸の溶液（溶媒Ｂ）とを直線勾配（流速１μl／ｍｉｎ）において提供し、ペプチドを単離した。
【００３８】
ペプチドの検出は、ナノスプレーイオン化（Ｎａｎｏ Ｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＮＳＩ）を用いて３回行われた（スプレー電圧：１．８ｋＶ；毛細管温度：２００℃；毛細管電圧：３４Ｖ；管レンズオフセット：４０Ｖ；電子増幅器：−６０Ｖ）。測定はセントロイドモードで収集された。４００ないし２０００Ｄａの全ＭＳスキャンを得た後、しきい値を１×１０５カウントにセットし、最も強力なイオンを高解像度ズームスキャンで分離した。その後、衝突誘導解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳを実施した。エンコードされないＣＩＤスペクトルの配列を、ＴｕｒｂｏＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社、米国）を使用して同定し、ＳＥＱＵＥＳＴ検索の結果は、交差相関および△Ｃｎ（デルタ標準化相関）で同定した。
【００３９】
ペプチドのアミノ酸配列は、Ｑ−ｓｔａｒＰｕｌｓａｒ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を利用して確認および同定された。
【００４０】
その結果、５０個の蛋白質を確認し、それらのうち過剰発現される７種類の蛋白質を選択した。図１は、本実施例の試料を２次元電気泳動分析し、銀染色を行った後に現像した結果を示す図である。図１に示したように、ＣＪ１ないしＣＪ７と示された７種類の過剰発現されたスポットが同定された。それらの７種類の蛋白質の機能は、表１に示した。それらの蛋白質の機能は、得られたペプチド配列を公知のＮＣＢＩジーンバンクデータベースのアミノ酸配列と比較して同定された。
【００４１】
【表１】
【００４２】
選択された７種類の過剰発現蛋白質から遺伝子配列が推定され、プロモーター部位を選択するために分析された。その結果、ＣＪ１ないしＣＪ７で示された蛋白質に対応する遺伝子配列から分離された配列番号１ないし７のオリゴヌクレオチドがプロモーター活性を有すると推定された。
【００４３】
実施例２：プロモーター配列を含有する組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐの作製およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのプロモーター活性の確認
【００４４】
（１）コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００のゲノムからのプロモーター配列の増幅
Ｅｉｋｍａｎｎら（Ｇｅｎｅ，１０２，９３−９８，１９９１）の方法によって、１日間培養したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００ ２５mlから染色体ＤＮＡ ５００μgを分離した。分離された染色体を鋳型として使用した。ＣＪ１ないしＣＪ７の各プロモーターを増幅するためのプライマーセット（それぞれ配列番号１０および１１、１２および１３、１４および１５、１６および１７、１８および１９、２０および２１、２２および２３）を利用してＰＣＲを行った（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒間の反応を３０回）。その結果、各プロモーター配列（ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７）が増幅された。
【００４５】
（２）スクリーニングベクターの作製
まず、ｐＧＦｕｖベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を鋳型とし、配列番号８および９をプライマーとしてＰＣＲを行った（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間の反応を３０回）。その結果、プロモーター部分を含まない緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子が増幅された。次いで、得られたプロモーター部分を含まないＧＦＰ遺伝子を、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングした後、ＰｓｔＩとＥｃｏＲＩで切断して、大腸菌およびコリネ型細菌で発現可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（ＫＦＣＣ−１０６７３／ＫＦＣＣ−１０６７４）のＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩ部位に導入した。それをプロモーター分離のためのスクリーニングベクター（ｐ１１７−ｇｆｐ）として使用した。図２は、スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐの作製過程を示す図である。
【００４６】
（３）スクリーニングベクターへのプロモーター配列の導入、およびコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００でのプロモーター活性の同定
（２）の項で得たスクリーニングベクターを制限酵素ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶで切断し、同じ酵素で切断されたプロモーター配列（ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７）と連結して、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００から分離されたプロモーター活性を有すると推定されるｐｃｊ１ないしｐｃｊ７の各オリゴヌクレオチドがＧＦＰと連結されている組み換えベクター（ｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐ）を作製した。図３は、スクリーニングベクターｐ１１７−ｇｆｐからの、本発明のプロモーター配列ｐｃｊ１ないしｐｃｊ７を含む組み換えベクターの作製過程を示す図である。
【００４７】
得られた組み換えベクターを、ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔらの方法（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１〜５４５，１９９９）で形質転換を可能にしたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）に導入した。形質転換された菌株をカナマイシン１０μg／mlが含まれたＣＭ培地（ペプトン１％、ブロス１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母抽出物１％、アデニン１００ｍｇ／ｍｌ、グアニン１００ｍｇ／ｍｌ、寒天２％（ｐＨ７．２））に塗抹して３２℃で３日間培養した。成長を示す生存菌株を選択した。次いで、選択された菌株に紫外線を照射して蛍光を発する菌株を選択した。
【００４８】
蛍光を発する菌株の選択は、プロモーターｐｃｊ１ないしｐｃｊ７がコリネ型細菌でプロモーター活性を有しているということを示す。
【００４９】
次いで、プロモーター活性を定量的に測定した。組み換えベクターｐ１１７−ｃｊ１〜７−ｇｆｐが導入されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）を同じ方法で培養した。培養物を遠心分離して細菌のペレットを得た。次いで、細菌のペレットを蛋白質抽出緩衝液（ＰＢＳ中のＥＤＴＡ １ｍＭ、グリセロール３％、トリトン−Ｘ−１００ １％溶液、ｐＨ−７．５）に懸濁し、超音波処理して細胞を破砕した。細胞破砕物を遠心分離し、細胞抽出物が含まれている上澄み液を分離した。得られた細胞抽出物に対してブラッドフォード分析法により蛋白質量を測定した。次いで、上記と同量の細胞抽出物に対して、Ｌａｕｒｅ Ｇｏｒｙらの方法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９４，１２７−１３３，２００１）を利用して４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍの放射光をＬＳ−５０Ｂ分光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）機器を利用して測定することによって、ＧＦＰ遺伝子の発現の程度を測定した。
【００５０】
その結果を下記表２に示した。表２に示したように、本発明のプロモーターは、ＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させた。特に、ｐｃｊ１およびｐｃｊ４プロモーターは、他のプロモーターに比べて相対的に非常に強力な効率を示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】
実施例３：ｔａｃプロモーターと本発明のプロモーターとのコリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのプロモーター活性の比較
【００５３】
本実施例では、本発明のプロモーターと従来一般的に使われるｔａｃプロモーターとのプロモーター活性を、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスで比較した。
【００５４】
（１）ｔａｃプロモーターとＧＦＰ遺伝子とが融合された配列を含むベクターの作製
まず、ｐＫＫ２２３−２ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）を鋳型とし、配列番号２４および２５をプライマーとして、実施例１と同じ条件でＰＣＲを行ってｔａｃプロモーター配列を増幅した。増幅産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、米国）にクローニングした。次いで、得られたｔａｃプロモーター配列を、制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶで切断し、同じ酵素で切断されたｐ１１７−ｇｆｐに連結して組み換え発現ベクター（ｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐ）を作製した。
【００５５】
この組み換えベクターを用いて、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００を実施例１と同じ方法により形質転換し、ＧＦＰ遺伝子の活性を測定した。ｔａｃプロモーターによるＧＦＰ遺伝子の活性を実施例２で選択したプロモーターでのＧＦＰ活性と比較した。その結果を表３に示した。
【００５６】
【表３】
【００５７】
表３に示したように、本発明のプロモーターがＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させることを確認した。また、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスでのｔａｃプロモーターの活性と比較した結果、ｐｃｊ１，ｐｃｊ４，ｐｃｊ５，ｐｃｊ６およびｐｃｊ７プロモーターは、ｔａｃプロモーターよりも強力であることが示された。特に、ｐｃｊ１およびｐｃｊ４プロモーターは、ｔａｃプロモーターに比べて１０倍以上の活性を示した。
【００５８】
実施例４：大腸菌で本発明のプロモーターのプロモーター活性の確認
【００５９】
本発明のプロモーターがコリネ型細菌だけでなく、大腸菌でもプロモーター活性を有しているかどうかを確認した。実施例１および２で使用した組み換え発現ベクターを大腸菌に形質転換した。実施例１と同じ方法でＧＦＰ遺伝子の活性を測定することによって、本発明のプロモーターが大腸菌でＧＦＰ遺伝子の効率的な発現を可能とするかどうか調べた。対照ベクターとして、ｔａｃプロモーターを含む組み換えベクターｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐを使用した。表４は、大腸菌での本発明のプロモーターのプロモーター活性を示したものである。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表４に示したように、本発明のプロモーターが大腸菌でもＧＦＰ遺伝子を効率的に発現させることを確認した。特に、ｐｃｊ１プロモーターは、コリネ型細菌および大腸菌の双方で高い活性を示した。
【００６２】
実施例５：ＩＰＴＧが本発明のプロモーターの活性に及ぼす影響
【００６３】
ｔａｃプロモーターは、大腸菌内でＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）により発現が誘導される代表的なプロモーターであることが周知である。すなわち、大腸菌において、ＩＰＴＧの有無によってｔａｃプロモーターから発現される遺伝子の発現量が変動する。
【００６４】
本実施例では、ＩＰＴＧが本発明のプロモーターからのＧＦＰ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べた。このために、本発明のプロモーターのうち、活性が最も良好なｐｃｊ１プロモーターを含む組み換えベクター（ｐ１１７−ｃｊ１−ｇｆｐ）を、大腸菌とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＨＢ１００（ＫＣＣＭ−１０３３０）とに実施例１および２と同じ方法で導入し、それによるＧＦＰの発現量を測定した。対照として、ｔａｃプロモーターを含む組み換えベクターｐ１１７−ｔａｃ−ｇｆｐを使用した。
【００６５】
その結果を表５に示した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
表５に示したように、本発明のプロモーターは、大腸菌およびコリネバクテリウムアンモニアゲネスでＩＰＴＧの有無に関係なく、ｔａｃプロモーターより効率的にＧＦＰ遺伝子を発現させる。
【００６８】
以上のような実施例の結果から得られたプロモーターｐＣＪ１，ｐＣＪ２，ｐＣＪ３，ｐＣＪ４，ｐＣＪ５，ｐＣＪ６およびｐＣＪ７をｐＥＣＣＧ１１７に挿入した。得られたベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。得られた形質転換体を、ブダペスト条約による国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年６月１１日付で寄託した（各受託番号ＫＣＣＭ−１０６１１，ＫＣＣＭ−１０６１２，ＫＣＣＭ−１０６１３，ＫＣＣＭ−１０６１４，ＫＣＣＭ−１０６１５，ＫＣＣＭ−１０６１６およびＫＣＣＭ−１０６１７）。
【００６９】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１ないし７からなる群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含むプロモーター。
【請求項２】
コーディング配列と作動可能に連結された請求項１に記載のプロモーターを含む発現カセット。
【請求項３】
請求項２に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属するバクテリア細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項４または５に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、外来遺伝子を発現させる方法。
【請求項１】
配列番号１ないし７からなる群から選択される一つ以上のポリヌクレオチドを含むプロモーター。
【請求項２】
コーディング配列と作動可能に連結された請求項１に記載のプロモーターを含む発現カセット。
【請求項３】
請求項２に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属するバクテリア細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項４または５に記載の宿主細胞を培養する段階を含む、外来遺伝子を発現させる方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−１９５２４（Ｐ２０１１−１９５２４Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２００６２３（Ｐ２０１０−２００６２３）
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【分割の表示】特願２００７−５４６５６８（Ｐ２００７−５４６５６８）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０８１３９６６４）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月８日（２０１０．９．８）
【分割の表示】特願２００７−５４６５６８（Ｐ２００７−５４６５６８）の分割
【原出願日】平成１７年１２月１６日（２００５．１２．１６）
【出願人】（５０８１３９６６４）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (12)
【Ｆターム（参考）】
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