コレステロールを低下および同化する能力を有する酸および胆汁酸塩耐性のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株
【課題】コレステロールを低下させる能力を有する酸および胆汁酸塩耐性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の提供。
【解決手段】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株またはそれらの継代培養した子孫またはそれに由来する突然変異体であり、種々の食品の調製において、そして胃腸管疾患の処置および予防における使用のための、そして血清コレステロールを低下させる際の使用のための医薬品の製造において、使用され得る。この新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、公知のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１、ＡＴＣＣ ４３５６およびＤＤＳ−１と比較して高いコレステロール低下能力を示す。
【解決手段】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株またはそれらの継代培養した子孫またはそれに由来する突然変異体であり、種々の食品の調製において、そして胃腸管疾患の処置および予防における使用のための、そして血清コレステロールを低下させる際の使用のための医薬品の製造において、使用され得る。この新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、公知のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１、ＡＴＣＣ ４３５６およびＤＤＳ−１と比較して高いコレステロール低下能力を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
１）発明の分野
本発明は、血清コレステロールを低下および同化させる能力を有する新規な胃酸および胆汁酸塩耐性のＬａｃｔｏｂｉｃｉｌｌｕｓ分離株ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２）関連分野の説明
「乳酸菌」は、糖を発酵し、主要産物として乳酸を生産し得る細菌の群である。乳酸菌の一般的に受け入れられた形態学的および生理学的特徴は、これらが、（１）グラム陽性であり；（２）桿状またはディスク形（ｄｉｓｋ−ｓｈａｐｅｄ）であり；（３）カタラーゼ陰性であり；（４）代謝されたグルコースを５０％を超える乳酸に変換し得；（５）非胞子形成性であり；（６）不動性であり（ｎｏｎｍｏｔｉｌｅ）；そして（７）微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）である点に存在する。
【０００３】
１９８０年までに、乳酸菌は一般に４つの属（すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃおよびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｗ．Ｃ．ＦｒａｚｉｅｒおよびＤ．Ｃ．Ｗｅｓｔｈｏｆｆ，１９７８，Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第３版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を含むことが知られていた。より広い意味では、乳酸菌は、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの２つの属を更に含む。近年においては、微生物は、ＤＮＡ相同性およびｒＤＮＡ配列比較および分類系における分析に従って分類群として明確に分類され、そして分類学において一定の位置を与えられている。出願人の知識によると、乳酸菌のファミリーは、１９９９年１２月までに１６属および２２３種を含むまでに拡大した。
【０００４】
いわゆる「プロバイオティックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）」は、単一の型の生きている細菌または異なる型の細菌の混合物であり、これらは、ヒトまたは動物宿主によって摂取された後に、ヒトまたは動物の腸管において胃腸管の微生物バランスを改善し得る（Ｏ’ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３０９−３１４；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｈｅｉｄｔ，Ｖ．ＲｕｓｈおよびＤ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｉｊ．（編）（１９９５）、Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｕｓｅ ｉｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｏｌｄ Ｈｅｒｂｏｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｍｉｎａｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｎｏ．８，ｐｐ．１）。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは最も広範に知られており、プロバイオティックスとして使用される。
【０００５】
１９０８年、Ｄｒ．Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．株を含む大量のヨーグルトの消費によって、腸管に通常存在する毒素生産細菌を置き換え、これにより、加齢のない長寿を生じることを提案した（Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆ，１９０８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌｉｆｅ，Ｅｄ．Ｐ．Ｃｈａｌｍｅｒｓ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｐ． Ｐｕｔｎａｍ’ｓ Ｓｏｎｓ，Ｔｈｅ Ｋｎｉｃｋｅｒｂｏｃｋｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ）。近年の研究および臨床試験によって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは健康に重大に関連することがまた示された。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、近年において幅広い注目を受けている。
【０００６】
乳酸菌は、腸管の複雑なバイオシステムにおいて重要な役割を果たすだけでなく、これらはまた宿主に対してプロバイオティック効果を有する。乳酸菌の認識された効果としては、以下が挙げられる：宿主のえさの栄養値を改善すること；ビタミンの合成および酵素の生産を促進すること（Ｊ．ＤｅｎｔｅｒおよびＢ．Ｂｉｓｐｉｎｇ，１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２２：２３−３１）、腸内病原菌の増殖を阻害することおよび正常な腸管マイクロフローラ（ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）のバランスを維持すること（Ｈｏｓｅ，Ｈ．およびＳｏｚｚｉ，Ｔ．（１９９１）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１：５４０−５４４）、宿主の免疫を強化するために抗体を産生すること（Ｈ．Ｍａｊａｍａａら（１９９５）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０：３３３−３３８）、結腸癌の危険を減少させること、ならびに腫瘍形成を抑制すること（Ｅ．Ｊ．Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎら、１９９７，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６：５１５Ｓ−５２０Ｓ）。研究により、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓで発酵したミルクの消費が血清コレステロールレベルを低下させ得ることがまた示されている。
【０００７】
心血管疾患は、工業国における主要な原因として示されている。米国において、より多くの人が、癌および他の疾患よりも冠動脈性心疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）で死亡し、そしてその死亡の約４分の３が、動脈硬化およびその合併症によって引き起こされる。高血清コレステロールレベルは、心血管疾患および動脈硬化の原因の１つである（Ｋａｎｎｅｌら（１９７９）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，９０：８５−９１；Ｐｅｋｋａｎｅｎら（１９９０）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，３２２：１７００−１７０７）。台湾において、脳血管疾患および心血管疾患は、死亡のトップ１０の主要な原因のリスト上に存在し、そして老年の人々における病気および死の主要な原因である。従って、高コレステロール血症は、無視できない病気の原因である。
【０００８】
１９７４年、ＭａｎｎおよびＳｐｏｅｒｒｙは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株で発酵したヨーグルトの消費後に、ヒトにおける血清コレステロールレベルが減少したが、新鮮なミルクを消費した者においては有意な変化が観察されなかったことを見出した（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２７：４６４−４６９，１９７４）。このことは、乳酸菌の適用およびコレステロールを低下させる際のそれらの効果に関する研究に拍車をかけた。
【０００９】
Ｋ．Ｋ．Ｇｒｕｎｅｗａｌｄは、Ｊ．ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：４７：２０７８−２０７９（１９８２）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓによって４週間発酵された１０％ミルクを含むえさがラットに与えられた場合に、ラットにおける血清コレステロールレベルが有意に減少し得ることを報告した。Ｄａｎｉｅｌｓｏｎらによってもまた、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．：６７：９６６−９７４（１９８９）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＬＡ１６分離株で５６日間発酵したヨーグルトと組み合わせた高コレステロールの食餌を与えられたイノシシにおいて、ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルトが、血清コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を低下させるが、血清トリグリセリドおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に影響を与えなかったことがまた報告された。
【００１０】
上述の報告（これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの分離株（ＬＡ１６）に関連する）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの特徴および生物活性に関するＤｒ．Ｋｈｅｍ Ｍ．Ｓｈａｈａｎｉが率いる研究グループによる多数の研究の１つである。詳細には、Ｄｒ．Ｓｈａｈａｎｉのグループは、血清コレステロールレベルを減少させる際のその効果に関する研究を含む、ヒト起源のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１の特に分離株および培養株の特徴および生物活性に関するかなり広範な研究を行ってきた。ＤＤＳ−１分離株は、後に特許化された（ＤＤＳ−１TMに関する情報は、Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイト、 HYPERLINK "http://www.nebraskacultures.com.benefits.html"
http://www.nebraskacultures.com.benefits.html上で入手可能である）。
【００１１】
１９９７年、Ａｋａｌｉｎらは、マウスにおける血清コレステロールレベルに対する通常のヨーグルト（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓによって発酵された）およびａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルト（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓによって発酵された）の効果を比較し、そしてＡａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルトの血清コレステロール濃度を減少させる能力が通常のヨーグルトのそれよりも有意に高いことを見出した（Ａ．Ｓ．Ａｋａｌｉｎら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０：２７２１−２７２５）。
【００１２】
Ｄｅ Ｓｍｅｔらは、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、７９：１８５−１９４（１９９８）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓで４週間（３〜７週間）飼育したブタにおいて、胆汁酸塩の排泄物（ｆｅｃａｌ ｏｕｔｐｕｔ）が有意に増加し、そしてブタにおける総血清コレステロール濃度がまた有意に減少したことを報告した。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ中の胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ，Ｅ．Ｃ．３．５．１．２４）の酵素学的活性が処置されたブタにおける血清コレステロールを低下させることを担う機構であり得ると結論づけられた。
【００１３】
ヒトにおけるコレステロールは肝臓によって合成され得、そしてまた肉から摂取され得る。コレステロールの２つの排出経路が存在する：（１）肝臓代謝の結果としてコール酸を形成し、これは次いで、糞便中における排泄のためにグリシンまたはタウリンと抱合されて水溶性となり、次いでカリウムまたはナトリウムイオンと共にグリココール酸塩およびタウロコール酸塩のような胆汁酸塩を形成する；および（２）ホルモン代謝の結果として、尿中に排泄されるステロイドホルモンを形成する；しかし、コレステロールのごく一部のみがこの様式で排泄される。
【００１４】
胆汁酸塩は、コレステロール代謝における水溶性の最終産物である。これらの塩は腸肝循環に入り得、腸内細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄなどを含む）の胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ）の酵素学的活性に起因して、コール酸をグリシンまたはタウリンから分離して脱抱合胆汁酸塩を生じ得る。脱抱合胆汁酸塩は、水中で溶解せず、そして体からの排出のために血清コレステロールと共に同時沈殿する（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）ようである。
【００１５】
上述に加えて、コレステロールの代謝機構は同化および同時沈殿の両方を含むことが報告されている。
【００１６】
１９８５年、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓはコレステロールに接着しそして同化すること、そして０．３％雄牛の胆汁を含む培地において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓはより高いコレステロールの減少を達成し得ることが指摘された（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４９：３７７−３８１）。同様に、Ｎｏｈらによって、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．（１９９７）、８２：３１０７−３１１３において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、細胞膜にコレステロールを取り込むことができ、そして取り込まれたコレステロールは、さらに同化および代謝され、細胞によって必要とされる物質を形成し得ることが報告された。
【００１７】
一方、Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒによって、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）、５９：１１２０−１１２４において、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはコレステロールを同化し得なかったが、ｐＨ値が６．０より低い場合に細菌の胆汁酸塩の抱合活性を増加させることによって培地中のコレステロール含量を減少し、胆汁酸塩とコレステロールとの同時沈殿を生じ得る（この現象は細菌のＢＳＨ活性に関連し得る）ことが報告された。
【００１８】
１９９７年、Ｍ．Ｍ．ＢａｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄは、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓがｐＨ制御なしで（すなわち、４．５〜５．５の正常のｐＨにおいて）増殖の間に良好なコレステロール同時沈殿を示すことを示した。しかし、ｐＨ値は約６．０に維持されれば、前記細菌のコレステロールを除去する能力は有意に減少した（Ｍ．Ｍ．ＢｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄ（１９９７）、Influences of pH during growth on removal of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus, Animal Science Research Report, pp.32-37; http://www.ansi.okstate.edu/research/1997rr/006.htm）。
【００１９】
１９９８年、Ｚｈａｎｇ Ｊｉａ−ｃｈｅｎｇらは、「同化」が高脂質ミルクおよび食用油で実験することによって乳酸菌によるコレステロールの減少における主要な機構であることを証明しようと試みた（Ｚｈａｎｇ Ｊｉａ−ｃｈｅｎｇら（１９９８）、「The research of cholesterol elimination in food by lactic acid bacteria − the screening of lactic acid bacteria species (strains)」Food Science (P.R.O.C),19:20-22）。
【００２０】
１９９９年、ＵｓｍａｎおよびＨｏｓｏｎｏは、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：２４３−２４８において、新たに見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉは、胆汁酸塩なしの培養条件下でコレステロールを取り込み得ることを示した。
【００２１】
ヒトにおける血清コレステロールレベルを減少させる生物学的方法を使用することは、より経済的かつ効果的である。上述の参考文献から、乳酸菌は、インビボおよびインビトロの両方において、コレステロールを減少させる効果を示し得ることが明らかであり、そしてあり得る機構としては、胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ）による脱抱合、酸性条件下での脱抱合した胆汁酸塩とのコレステロールの同時沈殿、および乳酸菌細胞によるコレステロールの同化が挙げられる。
【００２２】
しかし、ヒト身体に摂取された後、乳酸菌は、胃腸管環境からの圧力および小腸の吸収作用の特異性に遭遇する。従って、乳酸菌は、腸管において増殖しそしてそれらの反応を発揮するために、まず、好ましくない消化系の環境を克服し、そして腸管にコロニー形成しなければならない。さらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株は、複雑な栄養要求（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）を有する細菌群である。この細菌は、発酵ミルクにおいて比較的安定である。しかし、（乾燥粉末、顆粒（ｇｒａｉｎｓ）、錠剤の形態の）市販の製品中の細菌は、室温または冷蔵庫の温度での長期貯蔵後にほとんど生存可能ではなく、細菌のレベルは最初の貯蔵レベルで容易に維持され得ない。従って、非発酵乳製品中の実際の細菌数は、製品ラベルに示されるものよりもしばしば少ない。従って、市販および貯蔵の間の乳酸菌製品中の乳酸菌のレベルの維持の仕方は、製造業者にとって最高に重要である。さらに、酸および胆汁酸塩に対する良好な耐性を有し、かつ血清コレステロールを低下させ得る細菌株を得るために細菌をスクリーニングすることは、優れたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ製品の開発において非常に重要な課題である。
【００２３】
上述したように、酸および胆汁酸塩に対する耐性および貯蔵安定性は、細菌をスクリーニングする際に考慮され、コスト削減が引き続く製造プロセスにおいて達成され得、そしてスクリーニングされた細菌株は、より広範な適用を有し得る。さらに、有効な細菌株についてスクリーニングすることはまた、起源および局在性に関連している。従って、近年、研究者らの努力は、ヒト起源の細菌株のスクリーニングに焦点が当てられている。
【００２４】
日本では、全部で１７１のＦＯＳＨＵ（特定保健用食品（Ｆｏｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｕｓｅ））承認製品において、３６がプロバイオティック細菌を含んでいる。これらは、製品総数の約２１％を構成するが、８２％までの生産価値（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を有する。欧州では、食品市場におけるプロバイオティック細菌の生産価値は、１０億ＵＳドルに相当する。米国では、２０００年のヨーグルト販売は、１８．６億ＵＳドルであった。台湾では、プロバイオティック細菌市場は、２０００年に４２億ＮＴドルまで成長した。プロバイオティック細菌の応用は毎年増加し、そしてもはや、発酵ミルク、アイスクリーム、キャンディーおよびダイエタリーサプリメントに制限されない。これらの製品は、大人、幼児、家禽、および家畜によって消費される。プロバイオティック市場の成長については巨大な余地があると期待されている。
【００２５】
乳酸菌に関する多数の研究が世界中に存在する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の酸耐性およびコレステロール低下能力に関する多数の特許および刊行物がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関するものであり、そしてほとんどが胆汁および酸耐性細菌株に関しているか、またはコレステロールおよび胆汁酸耐性を減少させる能力について主に焦点を当てている。現在のところ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の胆汁酸耐性に関して実施された研究によって、この細菌株は０．３％グリココール酸を含む環境中で増殖し得、そして酸耐性はｐＨ２（初期段階の胃液分泌において胃腸管において生じる酸性条件）の培地を使用して試験される。
【００２６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の血清コレステロールを減少させる能力は、公開された特許によると約２０％であり、そして刊行物によると、使用される方法に依存して約１０％〜約８０％の範囲に存在する。
【００２７】
米国特許第４，８３９，２８１号および米国特許第５，０３２，３９９号はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）株を開示し、これはヒトの糞便から分離された。この株は、０．１５％胆汁酸塩を含む環境中で増殖し得、そしてｐＨ１〜２で２時間培養した後の残りの細菌量は、１０3ＣＦＵである。Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒによって、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．：７３：９０５−９１１（１９９０）において、ブタ起源のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１（ＣＣＲＣ１７０６４に対応）およびヒト起源のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ４３５６（ＣＣＲＣ１０６９５に対応）は共に、０．３％胆汁酸塩で補充したＭＲＳブロス中で増殖し得、そして血清コレステロールレベルを減少させる能力を有する。
【００２８】
さらに、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＬＡ１６（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎらによって、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．（１９８９）、６７：９６６−９７４において報告されるようにブタから分離された株）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１（ヒト起源の分離株（内因性ヒト株））（これは、Ｄｒ．Ｋｈｅｍ Ｍ．Ｓｈａｈａｎｉによって率いられた科学者らによって開発され、現在Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．，の特許製品である）は、血清コレステロールを減少させる能力を示した（http://www/nebraskacultures.com./benefits.html）。
【００２９】
ＵｓｍａｎおよびＨｏｓｏｎｏは、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：２４３−２４８（１９９９）において、分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉは酸および胆汁酸塩に対する耐性およびコレステロールを減少させる能力を示すことを報告した。
【００３０】
米国特許第５，５１６，６８４号および米国特許第５，７０７，８５４号において、Ｙｏｓｈｉｏ ＳａｉｔｏおよびＪｕｎ Ｍｉｚｕｔａｎｉは、２つのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株（すなわち、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＲＭ−Ｐ−１４２０４およびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＲＭ−Ｐ−１４２０５）を開示する。これらの株は、胆汁酸塩の脱抱合を示さず、そして栄養分吸収作用を阻害しないが、これらは血液および肝臓においてコレステロールの低下を示す。
【００３１】
しかし、上述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は外来起源である。台湾における細菌株をスクリーニングすることによって、酸および胆汁酸耐性でありかつ血清コレステロールを低下し得るＬａｃｔｏｂｉｃｉｌｌｕｓ分離株を得ることが望ましく、こうして得られた分離株は、スターターとして使用される場合または処理された製品に添加される場合に、台湾の人々の胃腸管環境に適応し得、腸に達しそして摂取後に腸にコロニー形成し得、これにより製品の機能性を強化する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３２】
（発明の要旨）
従って、第１の局面において、本発明は、台湾におけるヒト被験体からサンプルをスクリーニングすることによって、酸および胆汁酸耐性ならびに血清コレステロールを減少させる優れた能力を含む特徴を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を提供する。
【００３３】
本発明において、健康な幼児由来の糞便試料を、細菌株の起源として使用した。試料をスクリーニングして、胃腸管環境において酸および胆汁酸塩に耐え、コレステロールを低下させ得る細菌株を分離する。結果として、上述の特徴を有する６つの新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株（すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８ならびにＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７）を得た。これらの分離株は、それぞれアクセッション番号ＣＣＲＣ９１０１９５、ＣＣＲＣ ９１０１９６、ＣＣＲＣ ９１０１９８、ＣＣＲＣ ９１０１９９、ＣＣＲＣ ９１０１９７およびＣＣＲＣ ９１０１９４で、食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ，３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に２００２年６月１８日に寄託した。これらの分離株はまた、２００２年６月２１にブタペスト条約下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８、 ＵＳＡ）において寄託し、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４４８３、ＰＴＡ−４４８４、ＰＴＡ−４４７９、ＰＴＡ−４４８０、ＰＴＡ−４４８１およびＰＴＡ−４４８２が付与された。
【００３４】
本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、以前に公知のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１、ＡＴＣＣ ４３５６およびＤＤＳ−１と比較して高いコレステロール低下能力を示した。
【００３５】
第２の局面において、本発明は、本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、またはその継代培養した子孫またはそれから由来する突然変異体の少なくとも１つを含む組成物、および食品（例えば、飲料、ケーキ、幼児食品、発酵ミルク、ダイエタリーサプリメント、および動物のえさなど）の製造に適した賦形剤を提供する。
【００３６】
第３の局面に従って、本発明は、胃腸管疾患を処置および予防するためならびに血清コレステロールを低下させるための、本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株またはその継代培養した子孫またはそれに由来する突然変異体の少なくとも１つのプロバイオティック有効量を含む薬学的組成物を提供する。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
台湾に固有でありかつ台湾の人々の胃腸管環境における増殖に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を得るために、本出願人は、所望な細菌株をスクリーニングするための起源として、Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに暮らしている１〜６歳の健康な幼児の糞便を使用し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓと疑われる菌株をスクリーニングするために一連のＲｏｇｏｓａ寒天ベースの選択培地を利用した。４３の試料から得た８２８分離株中４００の疑わしい菌株を見出した。これらの疑わしい菌株を、上記本発明の要旨において言及した特徴についてさらに試験した。これらは以下の通りに要約され得る：１．酸に対する安定性；
２．胆汁酸塩に対する安定性；および
３．コレステロールを減少させる能力。
【００３８】
これらの疑わしい菌株を、上述した特徴の点において、公知の菌株と比較し、スクリーニングして所望の能力を有する６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を得た。
【００３９】
得られた６つの分離株を、ＡＰＩ同定システム、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳシステムおよび１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析を使用してさらに同定した。同定結果に従って、これらの６つの分離株をそれぞれ分類し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８、ならびにＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７と命名した。これらの分離株を、それぞれアクセッション番号ＣＣＲＣ ９１０１９５、ＣＣＲＣ ９１０１９６、ＣＣＲＣ ９１０１９８、ＣＣＲＣ ９１０１９９、ＣＣＲＣ ９１０１９７およびＣＣＲＣ ９１０１９４で、２００２年６月１８日に食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ，３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に寄託した。これらの分離株はまた、２００２年６月２１にブタペスト条約下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８、 ＵＳＡ）において寄託し、それぞれアクセッション番号ＰＴＡ−４４８３、ＰＴＡ−４４８４、ＰＴＡ−４４７９、ＰＴＡ−４４８０、ＰＴＡ−４４８１およびＰＴＡ−４４８２が付与された。
【００４０】
上述の有利な特徴を考慮して、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、プロバイオティックスとしての使用に適している。例えば、これらの分離株は、流動性ミルク（ミルク、濃縮ミルク）、発酵ミルク（ヨーグルト、サワーミルク（ｓｏｕｒ ｍｉｌｋ）、フローズンヨーグルト（ｆｒｏｚｅｎ ｙｏｇｕｒｔ）、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子類（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒｙ）、キャンディー、幼児食品、栄養食品（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、動物のえさおよびダイエタリーサプリメントを含む、広範な食用材料に処方され得る。これらの製品の各々における細菌のカウントは、１グラムまたは１ミリリットル当たり約１０6〜１０9ＣＦＵ（コロニー形成単位）であり得る。
【００４１】
本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、公知の方法論に従って、食品添加成分として使用され得、これらは、ヒトおよび動物による摂取に適した形態に処方するために、原材料の調製の間に添加され得るか、または発酵物中のこれらの参加（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）が所望でない場合、これらは発酵プロセスに引き続いて添加され得る。好ましくは、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、食用材料単独に処方されてもよいし、少なくとも１つの他のプロバイオティック生物と組み合わせて処方されてもよい。これらのプロバイオティック生物としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｃａｕｓａｓｉｃｕｓおよびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ＫｅｆｙｒおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）；あるいはこれらの組み合わせが挙げられ得る。
【００４２】
別の応用において、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、それ自体またはこれらの分離株を組み込む上述の製品は、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として調製され、その結果、各製品は、約１０8〜約１０9ＣＦＵを超える活性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。さらに、このような製品は、酵母粉末、糖または他の充填剤（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含む消化改善薬物またはインスタント食品）および直接消費のための細菌粉末をそこに添加することによって、錠剤またはカプセル形態で調製され得る。
【００４３】
さらに、本発明はまた、これらの望ましくない腸内微生物によって引き起こされる胃腸管問題を軽減するために、哺乳動物の消化管における望ましくない腸内微生物のコロニー形成を制御する際に医薬品として単独でかまたは他の活性成分と組み合わせて、上述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の使用を意図する。医薬品の組成物は、液剤、乳濁剤、散剤、錠剤、カプセル剤または経口投与に適切な他の形態に処方され得る。
【００４４】
さらに、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株のコレステロールを減少させる能力を考慮して、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、血清コレステロールを減少させるための健康食品および非処方箋薬物の調製において使用され得る。
【００４５】
上記のように、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、これらの継代培養した子孫またはこれらの由来する突然変異体のものと同一の細菌学的特徴を有する細菌株は、本発明の範囲および技術概念内であることが意図される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「突然変異体」は、例えば、ヌクレオチド置換、挿入または欠失に起因する少なくとも１つのヌクレオチドによって、遺伝子組成が参考株または親株のものと異なる細菌株をいう。本発明の突然変異体は、天然変異以外の多数の方法論によって生成され得る。例えば、突然変異体は、例えば、化学的突然変異原、トランスポゾンまたは放射線照射によって、その親株の無作為な突然変異誘発から獲得され得る。さらに、本発明の変異株は、組換え核酸配列を含み得る。例えば、突然変異体は、さらなる核酸配列（例えば、形質転換されたか、形質導入されたか、または他にその親株の細胞中に挿入された配列）を保有する細菌株であり得る。さらなる核酸配列は、一般的にまたは条件的に発現されるポリペプチドをコードし得る。あるいは、さらなる核酸配列は、細胞生理学を変更し得る核酸配列（例えば、アンチセンス、リボザイム、または任意の他の核酸配列）をコードし得る。別の例において、核酸は、内因性遺伝子に挿入され、それによって前記内因性遺伝子の機能を変更（強化または破壊）する。例えば、挿入された核酸は、内因性遺伝子を不活化するノックアウト構築物、または内因性遺伝子の転写を増加する人工エンハンサーまたはプロモーターであり得る。
【００４７】
本発明は、以下の実施例を参照してより詳細に説明される。これらの実施例は、例示の目的だけに与えられ、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
（実施例１ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の分離およびスクリーニング）
材料および方法：
Ｉ．培養培地および希釈物：
１．スクリーニング培養培地：
（Ａ）トマトジュース寒天培地：
カゼイン酵素加水分解物 １０ｇ
（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）
スキムミルク １０ｇ
トマトジュース ４００ｍｌ
寒天 １２ｇ
蒸留水 １Ｌに調整
（Ｂ）Ｒｏｇｏｓａ寒天培地：
Ｒｏｇｏｓａ寒天（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ７４．５ｇ
蒸留水 １Ｌ
マイクロ波加熱によって寒天を溶解し、得られた混合物を５５℃まで冷却し、酢酸でｐＨを５．５に調整する
（Ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ選択培地（ＬＢＳ）：
Ｒｏｇｏｓａ寒天 ８．４ｇ
トマトジュース ４０ｍｌ
蒸留水 ６０ｍｌ
マイクロ波加熱によって寒天を溶解し、得られた混合物を５５℃まで冷却し、酢酸でｐＨを５．５に調整する
（Ｄ）Ｒｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天培地：
８０ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ｇｌｕ，Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を１００ｍｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）中に添加し、そして超音波処理を使用して溶解した。１０ｍｌの得られた溶液を１９０ｍｌのＲｏｇｏｓａ寒天に５５℃で添加し、４０μｇ/ｍＬの最終濃度
でＸ−ｇｌｕを含むＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天を形成した。
【００４９】
２．細菌活性化培地：
（Ａ）Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｅｒｏｉｔ、ＭＩ，ＵＳＡ）；および
（Ｂ）ＭＲＳ寒天：Ａｇａｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）（１５ｇ/Ｌ）で補充したＢａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス。
【００５０】
３．リボース利用培地：
基礎培地の組成：
Ｂａｃｔｏ ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ ｎｏ．３ １０ｇ
（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
Ｔｗｅｅｎ ８０ １ｇ
アンモニウムハイドロジェンシトレート(ammonium hydrogen citrate) ２ｇ
酢酸ナトリウム ５ｇ
硫酸マグネシウム ０．１ｇ
硫酸マンガン ０．０５ｇ
リン酸（水素）二カリウム ２ｇ
クロロフェノールレッド ０．０５％
蒸留水 １Ｌ
ＨＣｌでｐＨを６．３に調整する。
【００５１】
上で調製したような基礎培地を１チューブ当たり４．５ｍｌの基礎培地の量で試験管にパッケージングした。１２１℃で１５分間オートクレーブして滅菌した後、各試験管に、濾過によって滅菌した０．５ｍｌの１０％リボース溶液を添加した。
【００５２】
４．希釈液：０．１％ペプトン水（ＢＡＣＴＯTM ペプトン，Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
ＩＩ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を分離およびスクリーニングするための手順
１． およそ指先の大きさの糞便（これらは、スティックを使用して１〜６歳の幼児の糞便試料の中間部分からサンプリングした）を、９ｍｌの上述の希釈液（０．１％ペプトン水）を含む試験管に添加し、１０倍希釈の試験溶液を得た。希釈した試験溶液を十分かつ均一に撹拌し、次いで数分間静置させ、試料中の微生物を希釈液中に遊離させた。
２． １ｍｌの上述の希釈試験溶液を、９ｍｌの同一の希釈液を含む別の試験管に導入した。連続希釈を、１０4倍希釈液が作製されるまで、この様式で行った。
３． １０2、１０3、および１０4倍希釈試験溶液（各々０．２ｍｌの量で存在し、工程２で記載される連続希釈によって調製される）を、種々のスクリーニング培地（Ｒｏｇｏｓａ寒天、トマトジュース寒天、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ選択培地およびＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天）にそれぞれ適用し、Ｌ型ガラスロッドを使用して均等に広げた。次いでこれらのスクリーニング培地を、３７℃の温度に設定した混合気体（５％Ｈ2，１０％ＣＯ2および８５％Ｎ2）を含む嫌気性インキュベーター中に配置し、２〜４日間培養した。
４． 桿形の細菌コロニー（これはＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天上で青色を示し、顕微鏡試験下で不動性であることが示されたか、または他のスクリーニング培地上で増殖する場合に半透明であるように見え、顕微鏡試験下で不動性でもある）を選択した。スティックによって取り上げた細菌を、ＭＲＳブロスを含む試験管および内部発酵チューブ（ｉｎｎｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ ｔｕｂｅ）中に導入した。３７℃で１〜２日培養した後、細菌株（これは、気体を生成することなく増殖し、グラム陽性染色によって陽性結果を有することが示される）を回収した。
５． ＭＲＳブロス中で２回活性化した後、工程４で回収した細菌株を、以下の様式で、増殖温度およびリボース利用について試験した：
（ｉ）ＭＲＳブロス培地を、１％の細菌接種物で接種し、そして１５℃で１４日間静置した。培地がそこで細菌増殖を有することを示した場合、このことは、接種された細菌株が１５℃で増殖し得ることを示す。一方、細菌増殖が１４日目に見出されない場合、このことは、接種された細菌株が１５℃で増殖し得ないことを示す。
（ｉｉ）ＭＲＳブロス培地を、１％の細菌接種物で接種し、そして４５℃で２日間静置した。培地がそこで細菌増殖を有することを示した場合、このことは、接種された細菌株が４５℃で増殖し得ることを示す。一方、細菌増殖が見出されない場合、このことは、接種された細菌株が４５℃で増殖し得ないこと示す。
（ｉｉｉ）リボソーム利用培地を１％の細菌接種物で接種し、３７℃で数日間静置した。（ｉｖ）培養培地の色が紫色から黄色に変わった場合、このことは、接種された細菌株が、増殖のためにリボースを利用することができそして酸を生成し得ることを示す。培養培地の色が７日後も紫色のままである場合、培地をさらに数日間静置する。培養培地の色がまだ黄色に変わらない場合、このことは、接種された細菌株が増殖のためにリボースを利用することができず酸を生成できないことを示す。
【００５３】
ＩＩＩ．結果：
本実施例において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓスクリーニング培地は主にＲｏｇｏｓａ寒天に基づいており、そしてこれらのいくつかは、トマトジュースまたはＸ−ｇｌｕでさらに補充した。トマトジュースは、ビタミンＢ群が豊富であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増殖に対して有益である。Ｒｏｇｏｓａ寒天に関しては、そこに含まれる酢酸が細菌増殖を阻害するようにｐＨ値を低下させることを助け、そして高濃度の酢酸イオンがまた、微生物の増殖を阻害する効果を有する。
【００５４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株がＲｏｇｏｓａ寒天上で培養される場合、これは白色コロニーを形成し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの他の株から容易に区別可能ではない。Ｘ−ｇｌｕがＲｏｇｏｓａ寒天に添加される場合、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細菌コロニーは色が青色となる。これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細胞が、Ｘ−ｇｌｕのβ−Ｄ−グルコシド結合を破壊して青色色原体（これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細菌コロニーを青色にする）を生成し得るβ−Ｄ−グルコシダーゼの活性を有するためである。しかし、この酵素はまた、多数の他の微生物の細胞中にも存在するので、選択された細菌株は、所望の特性を有すると疑われる菌株が選択され得る前に、顕微鏡試験、グラム染色、ならびにリボース利用および増殖温度についての上述の生理学的および生化学的試験を受けなければならない。
【００５５】
本出願人は、Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに住んでいる１〜６歳の健康な幼児から４３の糞便試料を集めた。各試料の希釈サンプルを、上記の手順に従って選択培地のそれぞれの上にプレートした。選択培地上に細菌コロニーの形成が観察される場合、異なる色および形態を有する細菌コロニーを選択し、顕微鏡試験を受けるために選択した。桿形の細菌細胞によって形成される細菌コロニーをさらにグラム染色に供した。次いで、グラム陽性桿菌を含むことが見出された任意の細菌コロニーを選択し、「分離株」と称する。
【００５６】
このようにして選択された分離株を、そこに内部発酵チューブを含むＭＲＳブロスにそれぞれ導入し、培養中に気体を生成しないものを選択して、増殖温度およびリボース利用試験を受けた。１５℃ではなく４５℃で増殖し得、そして増殖のための炭素供給源としてリボースを利用し得ない、任意の試験株を別にとっておき、そしてこの段階で選択された菌株を「疑わしい菌株（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ）」と称する。
【００５７】
表１を参照すると、出願人らは、回収した４３の試料から選択された全部で８２８分離株から４００の疑わしい菌株を得た。
【００５８】
表１．回収した試料*の番号付けおよび前記試料から得られた細菌分離株の数
【００５９】
【表１】
【００６０】
*試料の起源：Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに住む１〜６歳の幼児由来の糞
便。
**本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株が得られた試料番号。
【００６１】
次いで、疑わしい菌株を、以下の実施例において記載される酸耐性試験、胆汁酸塩耐性試験、およびコレステロール低下試験に供した。６つの分離株（すなわち、Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７、Ｂ３８Ｔ３８およびＢ６Ｔ７）は、これらの試験において優れた特性を示し、従って、上記特性の点において、以下の公知の細菌株と比較した。
１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４（ＡＴＣＣ ４３１２１に対応；ブタから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、血清コレステロールを低下させる能力を有する（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：３７７−３８１；Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９０），Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７３：９０５−９１１；Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５９：１１２０−１１２４；Ｄ．Ｏ．Ｎｏｈら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：３１０７−３１１３）；
２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １０６９５T（
ＡＴＣＣ ４３５６に対応；ヒトから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの標準株であり、そしてヒト起源である（Ｄ．Ｋ．ＷａｌｋｅｒおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９９３）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７６：９５６−９６１）；
３．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１（ヒトから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は市販製品である（Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．）；
４．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １４０６５［ＣＳＣＯ ２４０１に対応、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＣＳＩＲＯ）、Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａより市販］；および
５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＣＣＲＣ １４６１９T（ＡＴＣＣ
３３３２３に対応；ヒトから分離された）（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８０）、３０，６０１；Ｅ．ＬａｕｅｒおよびＯ．Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ．Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎｓｋｒ．Ｈｙｇ．Ａｂｔ．１
Ｏｒｉｇ．Ｒｅｉｈｅ Ｃ，１９８０，１，７５−７８）。
【００６２】
（実施例２ 酸耐性試験）
Ｉ．実験手順：
この実施例で実施された細菌細胞生存試験を、Ｊ．Ｅ．Ｈｏｌｃｏｍｂｅら（１９９１）、Ｃｕｌｔ．Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄ．Ｊ．，２６（３）：４−５に記載され、そしてＹ．Ｓ．Ｙａｎｇらに対して発行された米国特許第５，７１１，９７７号（ここで、中性環境（ｐＨ７）および胃をシミュレートする酸性環境（ｐＨ２）を使用した）に記載された方法を参照して行った。
【００６３】
ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験した細菌株の各々の培養物を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の除去後、細胞ペレットを１ｍｌの通常生理食塩溶液（０．８５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中で再懸濁し、スティックで撹拌し、次いでボルテックスして均一な細菌懸濁液を得た。得られた細菌細胞懸濁物のアリコート（０．５ｍｌ）を、それぞれｐＨ７およびｐＨ２の通常生理食塩溶液と混合し、得られた混合物を３７℃のインキュベーターで２時間静置した。その後、生存している細菌細胞をカウントし、そして各試験細菌株の酸耐性を、Δｌｏｇ（細菌細胞の数）［すなわち、（ｐＨ７の通常生理食塩溶液処理後に生存した細菌細胞数−ｐＨ２の通常生理食塩溶液処理後に生存した細菌細胞数）の計算したｌｏｇ値］によって表した。Δｌｏｇ（細菌細胞数）のより小さい値を有する細菌株が、より高い酸耐性を有すると考えた。
【００６４】
ＩＩ．結果：
ほとんどの微生物は酸性環境において何らの耐性を有さない。乳酸菌自体は酸生成細菌であるが、これらはｐＨ３．２〜４．５の環境でのみ増殖する。従って、胃の極端な酸性環境（ｐＨ２．０〜３．２）はまた、乳酸菌の生存率に影響を与える主要な因子である。胃の内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）のエントリー時間およびタイプに依存して、胃酸のｐＨ値は、平均して２時間の間にｐＨ１．５〜４．５の範囲で変化する。従って、この実施例における実験において、ｐＨ２を胃のｐＨ値の代表値として使用した。さらに、胃酸は性質において塩酸に類似しているので、塩酸によって２に調整したｐＨを有する通常生理食塩溶液を使用して、３７℃で二時間試験細菌株を処理した。この酸処理において生存した細菌細胞をカウントし、そしてｐＨ７における通常生理食塩溶液で処理したコントロール群のものと比較した。
【００６５】
得られた実験結果によると、３７℃で２時間の上記の２つの異なるｐＨ値での処理後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４は最も高い酸耐性を示し（図１）、そして酸処理後のその細菌カウントは、ｌｏｇ値において単に１．９減少した。一方、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＣＣＲＣ １４６１９Tは乏しい酸耐性を示し、そしてこれらの細菌カウントはそれぞれｌｏｇ値において４．３および４．４減少した。
【００６６】
本発明の実施例１において得られた新しい分離株Ｂ２１Ｔ１（これは、以下の実施例において記載されるように、その細菌学的特徴に従ってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉとして分類される）の酸耐性は、ＣＣＲＣ １４０６５のそれと類似であり、そしてそれらの細菌カウントは、ｌｏｇ値において３．９減少した。本発明の他の５つの新規分離株（Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７、Ｂ３８Ｔ３８およびＢ６Ｔ７）は、同様のレベルの酸耐性を有し、そして酸耐性のスクリーニング指標（Δｌｏｇ（細菌数）の値＜４）（Ｙ．Ｓ．Ｙａｎｇらに対して発行された米国特許第５，７１１，９７７号）を満たすことができる。
【００６７】
（実施例３．胆汁酸塩耐性試験）
Ｉ．実験手順：１％の細菌接種物
ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、各試験細菌株の１％接種物を、それぞれ１０ｍｌ
ＭＲＳブロスおよび０．３％雄牛胆汁(oxgall)で補充した１０ｍＬ ＭＲＳブロス（ＭＲＳＯ）に接種した。３７℃で２４時間培養した後、各培養物の細菌密度（ＯＤ660）を
分光光度計によって測定し、そして生存細菌細胞の数もまたカウントした。胆汁酸塩耐性をΔｌｏｇ（細菌数）（すなわち、［ＭＲＳブロス中で培養した細菌細胞数−ＭＲＳＯブロス中で培養した細菌細胞数］の計算したｌｏｇ値）によって表した。ここで、計算Δｌｏｇ（細菌細胞数）が小さいほど、試験細菌株の胆汁酸塩耐性が高い。
【００６８】
ＩＩ．結果：
異なる乳酸菌は、胆汁酸塩で処理した後の生存率において大きな差異を示した。従って、胆汁酸塩耐性を有する乳酸菌をスクリーニングすることは、プロバイオティック細菌の選択において重要である（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８４）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６７：３０４５−３０５１；Ｐ．Ｍａｒｔｅａｕら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０：１０３１−１０３７）。以前の研究において、雄牛胆汁(oxgall)は、ヒト腸内細菌の選択的な培養のための培地において広範に使用されていた。従って、雄牛胆汁(oxgall)の有効性は、ヒト胆汁酸塩のものと非常に類似しているはずであり、そして雄牛胆汁(oxgall)は、０．３％（ｗ/ｖ）の平均濃度で一般に使用された（Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９０）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７３：９０５−９１１；Ｄ．Ｋ．ＷａｌｋｅｒおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９９３）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７６：９５６−９６１）。
【００６９】
得られた実験結果は、ＣＣＲＣ １０６９５T、ＣＣＲＣ １４６１９TおよびＣＣＲＣ １４０６５を除き、各試験細菌株の測定したＯＤ660値（細菌密度）は、試験された細菌株が０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むかまたは含まない培地で培養されたかに関わらず、２より大きかった（表２）。このことは、０．３％雄牛胆汁(oxgall)の添加が試験された細菌株の増殖に対してほとんど影響を与えないように見えることを示す。
【００７０】
表２． ０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むかまたは含まないＭＲＳブロス中で２４時間培養した試験細菌株の増殖比較
【００７１】
【表２】
【００７２】
しかし、本発明に従う２つの新しい分離株（すなわち、Ｂ６Ｔ７およびＣ２１Ｔ１）の細菌密度は、ＭＲＳブロスよりもＭＲＳＯブロスにおいてより高いことにまた注意する。このことは、軽度の吸収作用と干渉する他の因子が存在し得ることを示す。従って、これらの２つの培地中で２４時間培養した試験細菌株の生存細菌細胞数をさらに調べた。
【００７３】
図２を参照すると、試験した細菌株の細胞数の減少から、ＣＣＲＣ １４６１９Tは非
常に乏しい胆汁酸塩耐性を有し、そしてＣＣＲＣ １０６９５Tおよび本発明の新規分離
株Ｂ３８Ｔ３８は、それぞれＣＣＲＣ １４６１９Tのそれよりも高い胆汁酸塩耐性を有
することが示された。最も高い胆汁酸塩耐性を示す細菌株は、本発明の新規分離株Ｂ６Ｔ７であり、残りの細菌株の胆汁酸塩耐性は実質的に類似している。すなわち、０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中での２４時間の培養後、その死滅した細菌細胞数は、ｌｏｇ値において１〜２の範囲である。
【００７４】
さらに、０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中で培養したいくつかの細菌株の増殖曲線を観察した。試験した菌株の各々の増殖速度は、増殖曲線の勾配によって示される。すなわち、勾配が大きい程、増殖速度は速く、従って、胆汁酸塩に対する耐性がより高い。図３から観察され得るように、ＣＣＲＣ １７０６４の増殖速度が最も速く、本発明の新規分離株Ｘ２１Ｂ７およびＢ２１Ｔ１のものはより遅く、そしてＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＤＤＳ−１のそれは最も遅い。
【００７５】
異なる観察方法から得られた実験結果においてわずかな差異が存在するが、これらの試験から、本発明においてスクリーニングされた６つの新規Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は酸および胆汁酸塩に対して同じ耐性を示すことが理解され得る。
【００７６】
（実施例４．コレステロールを低下させることにおける試験した細菌株の能力についてのアッセイ）
Ｉ．実験手順：
（Ａ）コレステロールの供給源：
コレステロールを低下させる際の細菌株の試験に関して、ＰＰＬＯ（ＢＡＣＴ ＰＰＬＯ ＳＥＲＵＭ ＦＲＡＣＴＩＯＮ）は、ほとんどの先行技術文献および特許刊行物におけるコレステロールの供給源として使用された。しかし、この製品の生産はすでに中止されている。従って、この実施例においては、本出願人は、Ｈｕａｎｇ，Ｃ．およびＴ．Ｅ．Ｔｈｏｍｏｐｓｏｎ（１９７４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２：４８５−４８９およびＳ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０において開示されるホスファチジルコリン−コレステロール調製方法を採用した。ここで、ウマ血清およびフォスファチジルコリン−コレステロールをコレステロールの供給源として使用し、均一に分散したホスファチジルコリン−コレステロール溶液を調製した。この容量は、コレステロール濃度と正の一次関数関係にある（図４）。
【００７７】
１．ウマ血清
水中に溶解したウマ血清を、０．４５μｍメンブランフィルターを通過させて濾過し、そして−２０℃の冷凍庫中で貯蔵した。
【００７８】
２．ホスファチジルコリン−コレステロール（卵レシチン＋コレステロール）
Ｓ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０に従って、卵レシチンおよびコレステロールを、ロータリーバキュウムエバポレータ（ＥＹＥＬＡ）のグラウンドストッパーボトルに配置し、そして十分な量のクロロホルム中で均一に溶解し、続いて窒素パージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）を介して乾燥し、コレステロールおよび卵レシチンを均一に混合し、グラウンドストッパーボトルのガラス壁上に均一なフィルムを形成した。０．４Ｍスクロース溶液中に該フィルムを再溶解した後、グラウンドストッパーボトルにＮ2ガスをチャージし、次いでキャップでシールし、続いてアルミニウム箔でラッピングし、脂質酸化の可能性を減少させた。
【００７９】
シールしたグラウンドストッパーボトルを、４℃で１５分間水浴型超音波処理器中で超音波処理した後、このようにして形成された混合溶液を、圧力下で２回、０．２２μｍメンブランフィルターを通過させ、次いで、４℃の冷蔵庫中で貯蔵した（溶液はその調製の３日以内に使用されなければならない）。
【００８０】
（Ｂ）試験グループ分け：
試験（１）：ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験細菌株の各々の１％接種物を、８．８ｍｌ ＭＲＳ、上で調製した１．２ｍｌのコレステロール溶液および０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含む１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種し、３７℃嫌気性インキュベーター（１０％ＣＯ2および９０％Ｎ2）中で２４時間培養した。その後、以下の項目（Ｃ）において記載された方法に従って、上清サンプルおよび細胞ペレットサンプルを、コレステロール含有量の測定のために試験細菌株で接種した得られた接種物からそれぞれ回収した。
【００８１】
試験（２）：ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験細菌株の各々の１％接種物を、１０ｍＬ ＭＲＳＯ中に接種し、そして３７℃で２０〜２２時間培養した。その後、各試験細菌株の得られた培養物から採取した１％接種物を、１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種し、そして３７℃嫌気性インキュベーター（１０％ＣＯ2および９０％Ｎ2）中で２４時間培養した。その後、以下の項目（Ｃ）において記載された方法に従って、上清サンプルおよび細胞ペレットサンプルを、コレステロール含有量の測定のために試験細菌株で接種した得られた接種物からそれぞれ回収した。
【００８２】
（Ｃ）コレステロール含有量の測定
コレステロール含有量の測定を、ｏ−フタルアルデヒド法（Ｌ．Ｌ．ＲｕｄｅｌおよびＭ．Ｄ．Ｍｏｒｒｉｓ（１９７３）、Ｎｏｔｅｓ ｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，１４：３６４−３６６；Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４９：３７７−３８１）に従って行った。
【００８３】
上記試験（１）および試験（２）において記載されるような試験細菌株で接種した得られた培養物の各々に関して、１ｍｌ量における試験細菌溶液をサンプリングして、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。このようにして形成された０．５ｍｌの上清をチューブに配置し、それぞれの試験細菌株で接種した得られた培養物の上清試料とした。
【００８４】
上記試験（１）および試験（２）において記載されるような試験細菌株で接種した得られた培養物の各々に関して、１ｍｌ量における試験細菌溶液をサンプリングして、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を除去した。残った細胞ペレットを１０ｍｌ ＭＲＳＯブロス中で再溶解し、均一に混合した。０．５ｍｌ溶液を得られた混合物から採取し、試験管に配置し、それぞれの試験細菌株で接種した得られた培養物の細胞−ペレット試料とした。
【００８５】
各試験試料に３ｍｌの９５％エタノールを添加し、均一に振盪することによって十分に混合した。２ｍｌの５０％ ＫＯＨをそこにさらに添加し、そして得られた混合物を再び均一に振盪した。その後、混合物を水浴中で１０分間６０℃で加熱し、次いで室温で冷却した。冷却した混合物に５ｍｌヘキサンを添加し、均一に撹拌し、続いて３ｍｌ Ｈ2Ｏを添加した。均一に振盪した後、そのように形成した混合物を室温で１５分間静置した。２．７ｍｌの得られたヘキサン層を別の試験管に取り出し、そしてヘキサンをＮ2下で６０℃で蒸発させた。蒸発後に残った固形残渣に４ｍｌのｏ−フタルアルデヒド試薬溶液（０．５ｍｇ ｏ−フタルアルデヒド/１ｍｌ酢酸）を添加した。得られた混合物を均一に振盪し、室温で１０分間静置し、続いて２ｍｌ濃硫酸を添加した。このようにして形成された混合物を均一に振盪し、そして室温で１０分間静置した。その後、混合物を分光光度計を使用してＯＤ550測定に供した。
【００８６】
（Ｄ）コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価
コレステロールを低下させることにおける細菌株の能力を以下の式を使用して推定した：
Ａ＝１００−［（Ｂ／Ｃ）×１００］
Ａ＝コレステロールの減少（％）
Ｂ＝試験細菌株で接種した培養物の上清におけるコレステロール含有量（ｍｇ）
Ｃ＝試験細菌株の接種なしの培養物の上清におけるコレステロール含有量（ｍｇ）（コントロール群）
「Ａ」値の値が８０％より大きい場合、細菌株はコレステロールを低下させることにおいて著しい能力を有すると考えられる。
【００８７】
（Ｅ）コレステロールを同化することにおける試験細菌株の能力の評価
Ａ’＝１００−［（Ｂ’＋Ｃ’）×１００］
Ａ’＝コレステロールの同化（％）
Ｂ’＝試験細菌株で接種した培養物の上清中のコレステロール含有量（ｍｇ）
Ｃ’＝試験細菌株で接種した培養物の細胞−ペレット中のコレステロール含有量（ｍｇ）
「Ａ’」の値が１５％より大きい場合、細菌株はコレステロールを同化することにおいて著しい能力を有すると考えられる。
【００８８】
ＩＩ．結果：
（ｉ）コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力
試験（１）（すなわち、ＭＲＳブロス中で試験細菌株を培養する）および試験（２）（すなわち、ＭＲＳＯブロス中で試験細菌株を培養する）のそれらを比較する際、試験（２）において、試験細菌株をＭＲＳＯブロス中に接種し、２０〜２２時間培養したという点で、これらの間に差異が存在する。１％接種物をそこから採取し、そしてさらなる培養のために１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種した。試験（２）の目的は、試験細菌株を再びスクリーニングして、これらが優れた胆汁酸遠耐性を有するか否かを決定し、そしてまたコレステロールを低下させることにおいて能力を有する細菌株をスクリーニングすることである。
【００８９】
ウマ血清をコレステロール供給源として使用する試験の結果（表３）は、先のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４およびＤＤＳ−１がまたこの試験において有意な効果を実証することを示し、そしてコレステロールを低下させることにおけるこれらの能力は、８８〜９８％に達した。一方、コレステロールを低下させることにおけるＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＣＣＲＣ １４６１９Tの能力は有意なものではなかった。このことは、これらの細菌株が乏しい胆汁酸耐性を有し、そしてＭＲＳＯブロス中で十分に増殖せず、その結果、観察されるようなこれらのコレステロール低下能力は単に３０〜４３％に達するという事実に起因し得る。
【００９０】
これらの２つの試験において、本発明の新規分離株（すなわち、Ｂ６Ｔ７、Ｃ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｂ３８Ｔ３８およびＸ２１Ｂ７）は、９１〜９９％までまたはこれを超えるコレステロール低下能力を有し、これはＣＣＲＣ １７０６４およびＤＤＳ−１のそれよりもわずかに高いことが示された。
【００９１】
このことは、本発明に従ってスクリーニングされた細菌株がまた、血清コレステロールを低下させることにおいて優れた能力を有することを示す。
【００９２】
表３．コレステロールを減少させることにおける試験細菌株の能力の評価（ウマ血清モデル）a
【００９３】
【表３】
【００９４】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ウマ血清で補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：ブロス中の最初のコレステロール含有量は８６．０６μｇ/ｍｌであった。
【００９５】
表４を参照すると、コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価に関して、試験におけるコレステロール供給源としてウマ血清の代わりに、ホスファチジルコリン−コレステロールを使用した場合、コレステロール減少（％）の観点における各細菌株の能力は減少する傾向にあることが観察された。このことは、コレステロールレベルを低下させることにおけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の能力が、使用されるコレステロールの型と共に変化し得ることを示す。ホスファチジルコリン−コレステロールを低下させることにおけるＣＣＲＣ １７０６４の能力は１１〜２９％であるが、ホスファチジルコリン−コレステロールを低下させることにおける本発明の細菌株の能力は２３〜４８％に達し、これは、ＤＤＳ−１によって達成されるよりもわずかに低いが（５０％）、ＣＣＲＣ １７０６４によって達成されるものよりも明確に高い。
【００９６】
表４．コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価（ホスファチジルコリン−コレステロールミセルモデル）a
【００９７】
【表４】
【００９８】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ホスファチジルコリン−コレステロールミセルで補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：ブロス中の最初のコレステロール含有量は５９．２２μｇ/ｍｌであった。
【００９９】
（ｉｉ）試験細菌株によるコレステロール同化
コレステロールを低下させることにおける乳酸菌の機構に関して、コレステロールは、コレステロールおよび脱抱合胆汁酸塩の同時沈殿（Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ（１９９３）、前出、Ｍ．Ｍ．ＢｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄ（１９９７）、前出）および細菌株自体によるコレステロールの同化（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、前出；Ｄ．Ｏ．Ｎｏｈら（１９９７）、前出；およびＺｈａｎｇら（１９９８）、前出）によって取り除かれる。
【０１００】
表５を参照すると、ＣＣＲＣ １７０６４（本発明に従って得られた６つの分離株）およびＤＤＳ−１がコレステロールを同化し得ることが理解され得る。しかし、異なる細菌株は、コレステロールを同化するそれらの能力においてわずかに異なる。観察された同化率は、１１〜４０％の範囲である。ＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＣＣＲＣ １４６１９Tによるコレステロールの同化は、有意なものではなかった。
【０１０１】
表５．試験細菌株のコレステロール同化aの評価
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ウマ血清で補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：コントロール中のコレステロール濃度を１００部として定義した。
【０１０４】
上記の試験結果を要約すると、６つの新規Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株（本発明に従って台湾において得られそしてスクリーニングされた）は優れた酸および胆汁酸塩耐性ならびにコレステロールを低下させる能力を示すことは明らかである。これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株のさらなる同定および特徴付け試験を以下の実施例において行った。
【０１０５】
（実施例５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の同定および特徴付け）
Ｉ．実験手順：
（１）予備同定試験：
新たに培養した細菌株（１８〜２４時間培養した）を予備同定試験に供し、この試験の実施した項目としては以下が挙げられる：グラム染色、形態観察、カタラーゼ試験、運動性、好気性および嫌気性条件下での増殖（Ｏ．ＫａｎｄｌｅｒおよびＮ．Ｗｅｉｓｓ（１９８６）、Ｒｅｇｕｌａｒ，ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｃｃｉ．：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．（Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．，Ｍａｉｒ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，およびＨｏｔｌ，Ｊ．Ｇ．，編）第ＩＩ巻、１２０８−１２３４頁．Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）。
【０１０６】
（２）ＡＰＩ同定システム：
この同定試験は、Ｇ．Ｈ．Ｆｌｅｅｔら（１９８４）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：１０３４−１０３８において記載されるものに基づいている。乳酸菌の同一性は、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ Ｋｉｔ（Ｆｒｅｎｃｈ ＡＰＩ ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌａ Ｂａｌｍｅ Ｌｅｓ Ｇｒｏｔｔｅｓ，Ｍｏｎｔａｌｉｅｎ，Ｊｅｒａｅｈ，Ｆｒａｎｃｅ）で確認した。試験した項目は：以下を含む４９炭素供給源由来の酸生成試験であった：グリセリン、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−キシロシド（ｘｙｌｏｓｉｄｅ）、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ソルボース、ラムノース、ドゥルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎｅ）、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、トレハロース、イヌリン（ｉｎｕｌｉｎｅ）、メレジトース、Ｄ−ラフィノース、アミドン、グリコーゲン、キシリトール、β−ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸塩、２−ケト−グルコン酸塩、および５−ケト−グルコン酸塩。
【０１０７】
ＡＰＩシステムは以下の操作手順に従って機能する：培養プレート上で増殖した細菌コロニーを取り上げるために滅菌綿棒（ｓｗａｂ）を使用し、そして取り上げた細菌コロニーを２ｍｌの０．８５％通常生理食塩溶液中に均等に懸濁する；滅菌ピペットを使用して細菌細胞−懸濁溶液を吸引し、そして別の５ｍｌの０．８５％滅菌通常生理食塩溶液にｎ滴滴下し、その結果、得られた細菌溶液の濃度は、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．２標準溶液（９．８ｍｌの１％Ｈ2ＳＯ4および０．２ｍｌの１％ＢａＣｌ2から形成される混合溶液）の濃度と等しくなる。その間、さらなる細菌細胞−懸濁溶液を採取し、そして２ｎ滴の溶液をＡＰＩ５０ ＣＨＬ培地を含むガラス管中にピペットで入れる。均一に混合した後、このように調製された接種物の適切な容量を試験ストリップの管の各々に添加し、ミネラルオイルで重層し、そしてインキュベーショントレイに配置した（インキュベーション間の蒸発を介する培地の喪失を避けるために予めトレイに水を添加する）。インキュベーションのふたでカバーした後、インキュベーショントレイを３７℃で４８時間静置し、読み(reading)目的で引き続き採取する。結果を記録し、ＡＰＩ ＬＡＢ Ｓｏｆｔｗａｒｅ同定システムのデータベースと比較し、試験下の細菌コロニーについての最も適切な分類法の属および種を決定する。
【０１０８】
（３）Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ：
Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｍ．Ｒｏｇｏｓａら（１９７１）、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｄｉｎｇ ｄａｔａ ｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＢ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２１：１Ａ−１８４Ａによって提案される方法に基づき、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍのＭａｔｒｉｘ ５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．について適している）を利用する。試験項目としては以下が挙げられる：運動性；増殖温度試験（１５℃、４５℃）；好気性条件下での増殖；Ｄ−グルコースおよびグルコース由来の気体生成試験；アミグダリン、Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、ラクトース、マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、メレジトース、メリビオース、ラムノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−リボース、サリシン、Ｄ−ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびＤ−キシロース由来の酸生成試験；ならびにエスクリン加水分解およびＬ−アルギニン脱アミノ化反応についての増殖試験。各試験の陽性および陰性結果はＭｉｃｒｏ−ＩＳコンピューター同定プログラムに入力され、同定された細菌の分類学上の属および種を与える。
【０１０９】
（４）１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析：
この同定試験は、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５：４５００−４５０４において記載される方法に基づいており、そして以下の操作手順に従って機能する：少量の新たに培養した細菌株を引き剥がし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに配置する。細菌サンプルをプロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅで処理し、スピンカラムを使用して、そこから細菌ゲノムＤＮＡを得、ＰＣＲ増幅を行い、続いて精製する。電気泳動による確認後、ＰＣＲ増幅産物をＭｉｃｒｏＳｅｑTM １６ＳｒＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いる反応に供し、その後ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してＤＮＡ配列決定する。さらに、このようにして得た１２ストリップのＤＮＡ配列を分析し、ＭｉｃｒｏＳｅｑTMソフトウェア（ＰＥ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を使用することによって積分し、約１５００ｂｐの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を得る。この配列は、ＤＮＡデータベースとの比較に供される（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）。
【０１１０】
ＩＩ．結果：
１．本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１
（ｉ）予備同定試験の結果に従って、分離株Ｂ２１Ｔ１は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表６に示し、ここで、同一性スコアは９１．０（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図５に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1群）（Ｇ．Ｋｌｅｉｎら（１９８８）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４１：１０３−１２５）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
２．本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ２１Ｔ６は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表８に示し、ここで、同一性スコアは９３．６（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認される。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図６に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1群）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１４】
【表８】
【０１１５】
３．本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｃ２１Ｔ１は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表９に示し、ここで、同一性スコアは９５．６（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図７に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
４．本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｘ２１Ｂ７は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１０に示し、ここで、同一性スコアは９４．３（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図８に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１８】
【表１０】
【０１１９】
５．本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ３８Ｔ３８は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１１に示し、ここで、同一性スコアは９０．８（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表１２に示し、同一性スコアは０．６４６である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図９に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
【表１２】
【０１２２】
６．本発明の分離株Ｂ６Ｔ７
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ６Ｔ７は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１３に示し、ここで、同一性スコアは９２．４（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ６Ｔ７は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図１０に示す。ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットで得られた同定結果およびＭｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ同定システムで得られた結果は、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７がそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると分類し、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号８）と比較した。本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と大きく異なることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
同定結果を要約すると、本発明に従ってスクリーニングされた６つの分離株の全てが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株に属し、ここで、Ｂ６Ｔ７はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであり、そしてＢ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１２５】
表１４を参照すると、先行特許および技術文献において開示されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株と比較して、本発明に従って得られた６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、０．３％胆汁酸塩を含む環境中で増殖し得るだけでなく、ｐＨ２の酸性環境中で２時間培養された後により高い生存率および良好なコレステロール低下能力も有する。さらに、本発明の６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、コレステロールと同時沈殿しそしてコレステロールを同化する能力を有する。本発明の分離株およびこれらの継代培養した子孫は優れたプロバイオティック細菌であることが明らかであり、食品（例えば、飲料、ケーキ、幼児食品、発酵ミルク、ダイエタリーサプリメント、および動物のえさ）の製造において使用され得る。また、胃腸管疾患の処置および予防ならびに血清コレステロールを低下させるための薬学的組成物の製造において使用され得る。
【０１２６】
例えば、本発明に従って得られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、米国特許第５，５１６，６８４号において開示される参考実施例１および参考実施例２を参照して、乳酸飲料およびヨーグルトドリンクの製造において使用され得る。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
本明細書中に援用される全ての特許及び参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。抵触の場合には、定義を含む本発明の説明が優先する。
【０１２９】
本発明は上記の特定の実施形態を参照して記載されているが、多数の改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われ得ることが明らかである。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によって示される場合にのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
本発明の上記および他の目的および特徴は、添付の図面と組み合わせて、好ましい実施形態の上記の説明を参照して明らかとなる。
【図１】図１は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の酸耐性比較を示す棒グラフである。ここで、酸耐性は、Δｌｏｇ（ａ−ｂ）として表され、ここで、「ａ」はｐＨ７で２時間の塩処理後の生存細胞数を表し、「ｂ」はｐＨ２で２時間の塩処理後の生存細胞数を表す。
【図２】図２は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の胆汁酸塩耐性比較を示す棒グラフである。ここで、胆汁酸塩耐性は、Δｌｏｇ（ｃ−ｄ）として表され、ここで、「ｃ」はＭＲＳブロス中での２４時間のインキュベーション後の生存細胞数を表し、「ｄ」は０．３％の雄牛の胆汁(oxgall)で補充したＭＲＳブロス中での２４時間のインキュベーション後の生存細胞数を表す。
【図３】図３は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の増殖比較を示す棒グラフである。これらは共に、０．３％雄牛の胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中で増殖した。
【図４】図４は、コレステロール濃度とフォスファチジルコリン−コレステロールミセルの量との間の関係を示す。このミセルは、本発明に従う分離された細菌株のコレステロール低下能力を試験するために、Ｓ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０を参照して調製した。
【図５】図５は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７分離株、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの間での１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列における差異を示す。ここで、Ｂ６Ｔ７分離株とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとの間のヌクレオチドの差異の部位は影付きで示し、そしてＢ６Ｔ７分離株とＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍとの間のヌクレオチドの差異の部分は「＊」印によって示す。
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
１）発明の分野
本発明は、血清コレステロールを低下および同化させる能力を有する新規な胃酸および胆汁酸塩耐性のＬａｃｔｏｂｉｃｉｌｌｕｓ分離株ならびにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２）関連分野の説明
「乳酸菌」は、糖を発酵し、主要産物として乳酸を生産し得る細菌の群である。乳酸菌の一般的に受け入れられた形態学的および生理学的特徴は、これらが、（１）グラム陽性であり；（２）桿状またはディスク形（ｄｉｓｋ−ｓｈａｐｅｄ）であり；（３）カタラーゼ陰性であり；（４）代謝されたグルコースを５０％を超える乳酸に変換し得；（５）非胞子形成性であり；（６）不動性であり（ｎｏｎｍｏｔｉｌｅ）；そして（７）微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）である点に存在する。
【０００３】
１９８０年までに、乳酸菌は一般に４つの属（すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃおよびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｗ．Ｃ．ＦｒａｚｉｅｒおよびＤ．Ｃ．Ｗｅｓｔｈｏｆｆ，１９７８，Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第３版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を含むことが知られていた。より広い意味では、乳酸菌は、ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＳｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの２つの属を更に含む。近年においては、微生物は、ＤＮＡ相同性およびｒＤＮＡ配列比較および分類系における分析に従って分類群として明確に分類され、そして分類学において一定の位置を与えられている。出願人の知識によると、乳酸菌のファミリーは、１９９９年１２月までに１６属および２２３種を含むまでに拡大した。
【０００４】
いわゆる「プロバイオティックス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）」は、単一の型の生きている細菌または異なる型の細菌の混合物であり、これらは、ヒトまたは動物宿主によって摂取された後に、ヒトまたは動物の腸管において胃腸管の微生物バランスを改善し得る（Ｏ’ｓｕｌｌｉｖａｎら（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３０９−３１４；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｈｅｉｄｔ，Ｖ．ＲｕｓｈおよびＤ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｉｊ．（編）（１９９５）、Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｕｓｅ ｉｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｏｌｄ Ｈｅｒｂｏｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｍｉｎａｒ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ｎｏ．８，ｐｐ．１）。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは最も広範に知られており、プロバイオティックスとして使用される。
【０００５】
１９０８年、Ｄｒ．Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．株を含む大量のヨーグルトの消費によって、腸管に通常存在する毒素生産細菌を置き換え、これにより、加齢のない長寿を生じることを提案した（Ｅｌｉ Ｍｅｔｃｈｎｉｋｏｆｆ，１９０８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｌｉｆｅ，Ｅｄ．Ｐ．Ｃｈａｌｍｅｒｓ Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｐ． Ｐｕｔｎａｍ’ｓ Ｓｏｎｓ，Ｔｈｅ Ｋｎｉｃｋｅｒｂｏｃｋｅｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＆Ｌｏｎｄｏｎ）。近年の研究および臨床試験によって、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは健康に重大に関連することがまた示された。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、近年において幅広い注目を受けている。
【０００６】
乳酸菌は、腸管の複雑なバイオシステムにおいて重要な役割を果たすだけでなく、これらはまた宿主に対してプロバイオティック効果を有する。乳酸菌の認識された効果としては、以下が挙げられる：宿主のえさの栄養値を改善すること；ビタミンの合成および酵素の生産を促進すること（Ｊ．ＤｅｎｔｅｒおよびＢ．Ｂｉｓｐｉｎｇ，１９９４、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２２：２３−３１）、腸内病原菌の増殖を阻害することおよび正常な腸管マイクロフローラ（ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ）のバランスを維持すること（Ｈｏｓｅ，Ｈ．およびＳｏｚｚｉ，Ｔ．（１９９１）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５１：５４０−５４４）、宿主の免疫を強化するために抗体を産生すること（Ｈ．Ｍａｊａｍａａら（１９９５）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，２０：３３３−３３８）、結腸癌の危険を減少させること、ならびに腫瘍形成を抑制すること（Ｅ．Ｊ．Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎら、１９９７，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６６：５１５Ｓ−５２０Ｓ）。研究により、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓで発酵したミルクの消費が血清コレステロールレベルを低下させ得ることがまた示されている。
【０００７】
心血管疾患は、工業国における主要な原因として示されている。米国において、より多くの人が、癌および他の疾患よりも冠動脈性心疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）で死亡し、そしてその死亡の約４分の３が、動脈硬化およびその合併症によって引き起こされる。高血清コレステロールレベルは、心血管疾患および動脈硬化の原因の１つである（Ｋａｎｎｅｌら（１９７９）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，９０：８５−９１；Ｐｅｋｋａｎｅｎら（１９９０）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，３２２：１７００−１７０７）。台湾において、脳血管疾患および心血管疾患は、死亡のトップ１０の主要な原因のリスト上に存在し、そして老年の人々における病気および死の主要な原因である。従って、高コレステロール血症は、無視できない病気の原因である。
【０００８】
１９７４年、ＭａｎｎおよびＳｐｏｅｒｒｙは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株で発酵したヨーグルトの消費後に、ヒトにおける血清コレステロールレベルが減少したが、新鮮なミルクを消費した者においては有意な変化が観察されなかったことを見出した（Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２７：４６４−４６９，１９７４）。このことは、乳酸菌の適用およびコレステロールを低下させる際のそれらの効果に関する研究に拍車をかけた。
【０００９】
Ｋ．Ｋ．Ｇｒｕｎｅｗａｌｄは、Ｊ．ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ：４７：２０７８−２０７９（１９８２）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓによって４週間発酵された１０％ミルクを含むえさがラットに与えられた場合に、ラットにおける血清コレステロールレベルが有意に減少し得ることを報告した。Ｄａｎｉｅｌｓｏｎらによってもまた、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．：６７：９６６−９７４（１９８９）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＬＡ１６分離株で５６日間発酵したヨーグルトと組み合わせた高コレステロールの食餌を与えられたイノシシにおいて、ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルトが、血清コレステロールおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を低下させるが、血清トリグリセリドおよび高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に影響を与えなかったことがまた報告された。
【００１０】
上述の報告（これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの分離株（ＬＡ１６）に関連する）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの特徴および生物活性に関するＤｒ．Ｋｈｅｍ Ｍ．Ｓｈａｈａｎｉが率いる研究グループによる多数の研究の１つである。詳細には、Ｄｒ．Ｓｈａｈａｎｉのグループは、血清コレステロールレベルを減少させる際のその効果に関する研究を含む、ヒト起源のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１の特に分離株および培養株の特徴および生物活性に関するかなり広範な研究を行ってきた。ＤＤＳ−１分離株は、後に特許化された（ＤＤＳ−１TMに関する情報は、Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．のウェブサイト、 HYPERLINK "http://www.nebraskacultures.com.benefits.html"
http://www.nebraskacultures.com.benefits.html上で入手可能である）。
【００１１】
１９９７年、Ａｋａｌｉｎらは、マウスにおける血清コレステロールレベルに対する通常のヨーグルト（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｋｉｉ ｓｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓによって発酵された）およびａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルト（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓによって発酵された）の効果を比較し、そしてＡａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓヨーグルトの血清コレステロール濃度を減少させる能力が通常のヨーグルトのそれよりも有意に高いことを見出した（Ａ．Ｓ．Ａｋａｌｉｎら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０：２７２１−２７２５）。
【００１２】
Ｄｅ Ｓｍｅｔらは、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、７９：１８５−１９４（１９９８）において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓで４週間（３〜７週間）飼育したブタにおいて、胆汁酸塩の排泄物（ｆｅｃａｌ ｏｕｔｐｕｔ）が有意に増加し、そしてブタにおける総血清コレステロール濃度がまた有意に減少したことを報告した。従って、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ中の胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ，Ｅ．Ｃ．３．５．１．２４）の酵素学的活性が処置されたブタにおける血清コレステロールを低下させることを担う機構であり得ると結論づけられた。
【００１３】
ヒトにおけるコレステロールは肝臓によって合成され得、そしてまた肉から摂取され得る。コレステロールの２つの排出経路が存在する：（１）肝臓代謝の結果としてコール酸を形成し、これは次いで、糞便中における排泄のためにグリシンまたはタウリンと抱合されて水溶性となり、次いでカリウムまたはナトリウムイオンと共にグリココール酸塩およびタウロコール酸塩のような胆汁酸塩を形成する；および（２）ホルモン代謝の結果として、尿中に排泄されるステロイドホルモンを形成する；しかし、コレステロールのごく一部のみがこの様式で排泄される。
【００１４】
胆汁酸塩は、コレステロール代謝における水溶性の最終産物である。これらの塩は腸肝循環に入り得、腸内細菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄなどを含む）の胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ）の酵素学的活性に起因して、コール酸をグリシンまたはタウリンから分離して脱抱合胆汁酸塩を生じ得る。脱抱合胆汁酸塩は、水中で溶解せず、そして体からの排出のために血清コレステロールと共に同時沈殿する（ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）ようである。
【００１５】
上述に加えて、コレステロールの代謝機構は同化および同時沈殿の両方を含むことが報告されている。
【００１６】
１９８５年、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓはコレステロールに接着しそして同化すること、そして０．３％雄牛の胆汁を含む培地において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓはより高いコレステロールの減少を達成し得ることが指摘された（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４９：３７７−３８１）。同様に、Ｎｏｈらによって、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．（１９９７）、８２：３１０７−３１１３において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓは、細胞膜にコレステロールを取り込むことができ、そして取り込まれたコレステロールは、さらに同化および代謝され、細胞によって必要とされる物質を形成し得ることが報告された。
【００１７】
一方、Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒによって、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９３）、５９：１１２０−１１２４において、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍはコレステロールを同化し得なかったが、ｐＨ値が６．０より低い場合に細菌の胆汁酸塩の抱合活性を増加させることによって培地中のコレステロール含量を減少し、胆汁酸塩とコレステロールとの同時沈殿を生じ得る（この現象は細菌のＢＳＨ活性に関連し得る）ことが報告された。
【００１８】
１９９７年、Ｍ．Ｍ．ＢａｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄは、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓがｐＨ制御なしで（すなわち、４．５〜５．５の正常のｐＨにおいて）増殖の間に良好なコレステロール同時沈殿を示すことを示した。しかし、ｐＨ値は約６．０に維持されれば、前記細菌のコレステロールを除去する能力は有意に減少した（Ｍ．Ｍ．ＢｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄ（１９９７）、Influences of pH during growth on removal of cholesterol from MRS broth by Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus, Animal Science Research Report, pp.32-37; http://www.ansi.okstate.edu/research/1997rr/006.htm）。
【００１９】
１９９８年、Ｚｈａｎｇ Ｊｉａ−ｃｈｅｎｇらは、「同化」が高脂質ミルクおよび食用油で実験することによって乳酸菌によるコレステロールの減少における主要な機構であることを証明しようと試みた（Ｚｈａｎｇ Ｊｉａ−ｃｈｅｎｇら（１９９８）、「The research of cholesterol elimination in food by lactic acid bacteria − the screening of lactic acid bacteria species (strains)」Food Science (P.R.O.C),19:20-22）。
【００２０】
１９９９年、ＵｓｍａｎおよびＨｏｓｏｎｏは、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：２４３−２４８において、新たに見出されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉは、胆汁酸塩なしの培養条件下でコレステロールを取り込み得ることを示した。
【００２１】
ヒトにおける血清コレステロールレベルを減少させる生物学的方法を使用することは、より経済的かつ効果的である。上述の参考文献から、乳酸菌は、インビボおよびインビトロの両方において、コレステロールを減少させる効果を示し得ることが明らかであり、そしてあり得る機構としては、胆汁酸塩ヒドラーゼ（ＢＳＨ）による脱抱合、酸性条件下での脱抱合した胆汁酸塩とのコレステロールの同時沈殿、および乳酸菌細胞によるコレステロールの同化が挙げられる。
【００２２】
しかし、ヒト身体に摂取された後、乳酸菌は、胃腸管環境からの圧力および小腸の吸収作用の特異性に遭遇する。従って、乳酸菌は、腸管において増殖しそしてそれらの反応を発揮するために、まず、好ましくない消化系の環境を克服し、そして腸管にコロニー形成しなければならない。さらに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株は、複雑な栄養要求（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ）を有する細菌群である。この細菌は、発酵ミルクにおいて比較的安定である。しかし、（乾燥粉末、顆粒（ｇｒａｉｎｓ）、錠剤の形態の）市販の製品中の細菌は、室温または冷蔵庫の温度での長期貯蔵後にほとんど生存可能ではなく、細菌のレベルは最初の貯蔵レベルで容易に維持され得ない。従って、非発酵乳製品中の実際の細菌数は、製品ラベルに示されるものよりもしばしば少ない。従って、市販および貯蔵の間の乳酸菌製品中の乳酸菌のレベルの維持の仕方は、製造業者にとって最高に重要である。さらに、酸および胆汁酸塩に対する良好な耐性を有し、かつ血清コレステロールを低下させ得る細菌株を得るために細菌をスクリーニングすることは、優れたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ製品の開発において非常に重要な課題である。
【００２３】
上述したように、酸および胆汁酸塩に対する耐性および貯蔵安定性は、細菌をスクリーニングする際に考慮され、コスト削減が引き続く製造プロセスにおいて達成され得、そしてスクリーニングされた細菌株は、より広範な適用を有し得る。さらに、有効な細菌株についてスクリーニングすることはまた、起源および局在性に関連している。従って、近年、研究者らの努力は、ヒト起源の細菌株のスクリーニングに焦点が当てられている。
【００２４】
日本では、全部で１７１のＦＯＳＨＵ（特定保健用食品（Ｆｏｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｕｓｅ））承認製品において、３６がプロバイオティック細菌を含んでいる。これらは、製品総数の約２１％を構成するが、８２％までの生産価値（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）を有する。欧州では、食品市場におけるプロバイオティック細菌の生産価値は、１０億ＵＳドルに相当する。米国では、２０００年のヨーグルト販売は、１８．６億ＵＳドルであった。台湾では、プロバイオティック細菌市場は、２０００年に４２億ＮＴドルまで成長した。プロバイオティック細菌の応用は毎年増加し、そしてもはや、発酵ミルク、アイスクリーム、キャンディーおよびダイエタリーサプリメントに制限されない。これらの製品は、大人、幼児、家禽、および家畜によって消費される。プロバイオティック市場の成長については巨大な余地があると期待されている。
【００２５】
乳酸菌に関する多数の研究が世界中に存在する。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の酸耐性およびコレステロール低下能力に関する多数の特許および刊行物がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓに関するものであり、そしてほとんどが胆汁および酸耐性細菌株に関しているか、またはコレステロールおよび胆汁酸耐性を減少させる能力について主に焦点を当てている。現在のところ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の胆汁酸耐性に関して実施された研究によって、この細菌株は０．３％グリココール酸を含む環境中で増殖し得、そして酸耐性はｐＨ２（初期段階の胃液分泌において胃腸管において生じる酸性条件）の培地を使用して試験される。
【００２６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．の血清コレステロールを減少させる能力は、公開された特許によると約２０％であり、そして刊行物によると、使用される方法に依存して約１０％〜約８０％の範囲に存在する。
【００２７】
米国特許第４，８３９，２８１号および米国特許第５，０３２，３９９号はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）株を開示し、これはヒトの糞便から分離された。この株は、０．１５％胆汁酸塩を含む環境中で増殖し得、そしてｐＨ１〜２で２時間培養した後の残りの細菌量は、１０3ＣＦＵである。Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒによって、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．：７３：９０５−９１１（１９９０）において、ブタ起源のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１（ＣＣＲＣ１７０６４に対応）およびヒト起源のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ４３５６（ＣＣＲＣ１０６９５に対応）は共に、０．３％胆汁酸塩で補充したＭＲＳブロス中で増殖し得、そして血清コレステロールレベルを減少させる能力を有する。
【００２８】
さらに、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＬＡ１６（Ｄａｎｉｅｌｓｏｎらによって、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．（１９８９）、６７：９６６−９７４において報告されるようにブタから分離された株）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１（ヒト起源の分離株（内因性ヒト株））（これは、Ｄｒ．Ｋｈｅｍ Ｍ．Ｓｈａｈａｎｉによって率いられた科学者らによって開発され、現在Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．，の特許製品である）は、血清コレステロールを減少させる能力を示した（http://www/nebraskacultures.com./benefits.html）。
【００２９】
ＵｓｍａｎおよびＨｏｓｏｎｏは、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：２４３−２４８（１９９９）において、分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉは酸および胆汁酸塩に対する耐性およびコレステロールを減少させる能力を示すことを報告した。
【００３０】
米国特許第５，５１６，６８４号および米国特許第５，７０７，８５４号において、Ｙｏｓｈｉｏ ＳａｉｔｏおよびＪｕｎ Ｍｉｚｕｔａｎｉは、２つのＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株（すなわち、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＲＭ−Ｐ−１４２０４およびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＦＥＲＭ−Ｐ−１４２０５）を開示する。これらの株は、胆汁酸塩の脱抱合を示さず、そして栄養分吸収作用を阻害しないが、これらは血液および肝臓においてコレステロールの低下を示す。
【００３１】
しかし、上述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は外来起源である。台湾における細菌株をスクリーニングすることによって、酸および胆汁酸耐性でありかつ血清コレステロールを低下し得るＬａｃｔｏｂｉｃｉｌｌｕｓ分離株を得ることが望ましく、こうして得られた分離株は、スターターとして使用される場合または処理された製品に添加される場合に、台湾の人々の胃腸管環境に適応し得、腸に達しそして摂取後に腸にコロニー形成し得、これにより製品の機能性を強化する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３２】
（発明の要旨）
従って、第１の局面において、本発明は、台湾におけるヒト被験体からサンプルをスクリーニングすることによって、酸および胆汁酸耐性ならびに血清コレステロールを減少させる優れた能力を含む特徴を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を提供する。
【００３３】
本発明において、健康な幼児由来の糞便試料を、細菌株の起源として使用した。試料をスクリーニングして、胃腸管環境において酸および胆汁酸塩に耐え、コレステロールを低下させ得る細菌株を分離する。結果として、上述の特徴を有する６つの新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株（すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８ならびにＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７）を得た。これらの分離株は、それぞれアクセッション番号ＣＣＲＣ９１０１９５、ＣＣＲＣ ９１０１９６、ＣＣＲＣ ９１０１９８、ＣＣＲＣ ９１０１９９、ＣＣＲＣ ９１０１９７およびＣＣＲＣ ９１０１９４で、食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ，３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に２００２年６月１８日に寄託した。これらの分離株はまた、２００２年６月２１にブタペスト条約下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８、 ＵＳＡ）において寄託し、それぞれＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−４４８３、ＰＴＡ−４４８４、ＰＴＡ−４４７９、ＰＴＡ−４４８０、ＰＴＡ−４４８１およびＰＴＡ−４４８２が付与された。
【００３４】
本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、以前に公知のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ４３１２１、ＡＴＣＣ ４３５６およびＤＤＳ−１と比較して高いコレステロール低下能力を示した。
【００３５】
第２の局面において、本発明は、本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、またはその継代培養した子孫またはそれから由来する突然変異体の少なくとも１つを含む組成物、および食品（例えば、飲料、ケーキ、幼児食品、発酵ミルク、ダイエタリーサプリメント、および動物のえさなど）の製造に適した賦形剤を提供する。
【００３６】
第３の局面に従って、本発明は、胃腸管疾患を処置および予防するためならびに血清コレステロールを低下させるための、本発明に従う新規なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株またはその継代培養した子孫またはそれに由来する突然変異体の少なくとも１つのプロバイオティック有効量を含む薬学的組成物を提供する。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
台湾に固有でありかつ台湾の人々の胃腸管環境における増殖に適したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を得るために、本出願人は、所望な細菌株をスクリーニングするための起源として、Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに暮らしている１〜６歳の健康な幼児の糞便を使用し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓと疑われる菌株をスクリーニングするために一連のＲｏｇｏｓａ寒天ベースの選択培地を利用した。４３の試料から得た８２８分離株中４００の疑わしい菌株を見出した。これらの疑わしい菌株を、上記本発明の要旨において言及した特徴についてさらに試験した。これらは以下の通りに要約され得る：１．酸に対する安定性；
２．胆汁酸塩に対する安定性；および
３．コレステロールを減少させる能力。
【００３８】
これらの疑わしい菌株を、上述した特徴の点において、公知の菌株と比較し、スクリーニングして所望の能力を有する６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株を得た。
【００３９】
得られた６つの分離株を、ＡＰＩ同定システム、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳシステムおよび１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析を使用してさらに同定した。同定結果に従って、これらの６つの分離株をそれぞれ分類し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８、ならびにＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７と命名した。これらの分離株を、それぞれアクセッション番号ＣＣＲＣ ９１０１９５、ＣＣＲＣ ９１０１９６、ＣＣＲＣ ９１０１９８、ＣＣＲＣ ９１０１９９、ＣＣＲＣ ９１０１９７およびＣＣＲＣ ９１０１９４で、２００２年６月１８日に食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ，３３１ Ｓｈｉｈ−Ｐｉｎ Ｒｏａｄ，Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ ３００，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）に寄託した。これらの分離株はまた、２００２年６月２１にブタペスト条約下で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １５４９、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８、 ＵＳＡ）において寄託し、それぞれアクセッション番号ＰＴＡ−４４８３、ＰＴＡ−４４８４、ＰＴＡ−４４７９、ＰＴＡ−４４８０、ＰＴＡ−４４８１およびＰＴＡ−４４８２が付与された。
【００４０】
上述の有利な特徴を考慮して、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、プロバイオティックスとしての使用に適している。例えば、これらの分離株は、流動性ミルク（ミルク、濃縮ミルク）、発酵ミルク（ヨーグルト、サワーミルク（ｓｏｕｒ ｍｉｌｋ）、フローズンヨーグルト（ｆｒｏｚｅｎ ｙｏｇｕｒｔ）、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−フルーツジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、菓子類（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎｅｒｙ）、キャンディー、幼児食品、栄養食品（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、動物のえさおよびダイエタリーサプリメントを含む、広範な食用材料に処方され得る。これらの製品の各々における細菌のカウントは、１グラムまたは１ミリリットル当たり約１０6〜１０9ＣＦＵ（コロニー形成単位）であり得る。
【００４１】
本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、公知の方法論に従って、食品添加成分として使用され得、これらは、ヒトおよび動物による摂取に適した形態に処方するために、原材料の調製の間に添加され得るか、または発酵物中のこれらの参加（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）が所望でない場合、これらは発酵プロセスに引き続いて添加され得る。好ましくは、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、食用材料単独に処方されてもよいし、少なくとも１つの他のプロバイオティック生物と組み合わせて処方されてもよい。これらのプロバイオティック生物としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌ．ｂｉｆｉｄｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｃａｕｓａｓｉｃｕｓおよびＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）；酵母（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ＫｅｆｙｒおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）；あるいはこれらの組み合わせが挙げられ得る。
【００４２】
別の応用において、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、それ自体またはこれらの分離株を組み込む上述の製品は、凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として調製され、その結果、各製品は、約１０8〜約１０9ＣＦＵを超える活性Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を含む。さらに、このような製品は、酵母粉末、糖または他の充填剤（例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを含む消化改善薬物またはインスタント食品）および直接消費のための細菌粉末をそこに添加することによって、錠剤またはカプセル形態で調製され得る。
【００４３】
さらに、本発明はまた、これらの望ましくない腸内微生物によって引き起こされる胃腸管問題を軽減するために、哺乳動物の消化管における望ましくない腸内微生物のコロニー形成を制御する際に医薬品として単独でかまたは他の活性成分と組み合わせて、上述のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の使用を意図する。医薬品の組成物は、液剤、乳濁剤、散剤、錠剤、カプセル剤または経口投与に適切な他の形態に処方され得る。
【００４４】
さらに、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株のコレステロールを減少させる能力を考慮して、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、血清コレステロールを減少させるための健康食品および非処方箋薬物の調製において使用され得る。
【００４５】
上記のように、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株、これらの継代培養した子孫またはこれらの由来する突然変異体のものと同一の細菌学的特徴を有する細菌株は、本発明の範囲および技術概念内であることが意図される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「突然変異体」は、例えば、ヌクレオチド置換、挿入または欠失に起因する少なくとも１つのヌクレオチドによって、遺伝子組成が参考株または親株のものと異なる細菌株をいう。本発明の突然変異体は、天然変異以外の多数の方法論によって生成され得る。例えば、突然変異体は、例えば、化学的突然変異原、トランスポゾンまたは放射線照射によって、その親株の無作為な突然変異誘発から獲得され得る。さらに、本発明の変異株は、組換え核酸配列を含み得る。例えば、突然変異体は、さらなる核酸配列（例えば、形質転換されたか、形質導入されたか、または他にその親株の細胞中に挿入された配列）を保有する細菌株であり得る。さらなる核酸配列は、一般的にまたは条件的に発現されるポリペプチドをコードし得る。あるいは、さらなる核酸配列は、細胞生理学を変更し得る核酸配列（例えば、アンチセンス、リボザイム、または任意の他の核酸配列）をコードし得る。別の例において、核酸は、内因性遺伝子に挿入され、それによって前記内因性遺伝子の機能を変更（強化または破壊）する。例えば、挿入された核酸は、内因性遺伝子を不活化するノックアウト構築物、または内因性遺伝子の転写を増加する人工エンハンサーまたはプロモーターであり得る。
【００４７】
本発明は、以下の実施例を参照してより詳細に説明される。これらの実施例は、例示の目的だけに与えられ、本発明の範囲を制限することを意図しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
（実施例１ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の分離およびスクリーニング）
材料および方法：
Ｉ．培養培地および希釈物：
１．スクリーニング培養培地：
（Ａ）トマトジュース寒天培地：
カゼイン酵素加水分解物 １０ｇ
（Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）
スキムミルク １０ｇ
トマトジュース ４００ｍｌ
寒天 １２ｇ
蒸留水 １Ｌに調整
（Ｂ）Ｒｏｇｏｓａ寒天培地：
Ｒｏｇｏｓａ寒天（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ） ７４．５ｇ
蒸留水 １Ｌ
マイクロ波加熱によって寒天を溶解し、得られた混合物を５５℃まで冷却し、酢酸でｐＨを５．５に調整する
（Ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ選択培地（ＬＢＳ）：
Ｒｏｇｏｓａ寒天 ８．４ｇ
トマトジュース ４０ｍｌ
蒸留水 ６０ｍｌ
マイクロ波加熱によって寒天を溶解し、得られた混合物を５５℃まで冷却し、酢酸でｐＨを５．５に調整する
（Ｄ）Ｒｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天培地：
８０ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−ｇｌｕ，Ｓｉｇｍａ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を１００ｍｌの０．２Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）中に添加し、そして超音波処理を使用して溶解した。１０ｍｌの得られた溶液を１９０ｍｌのＲｏｇｏｓａ寒天に５５℃で添加し、４０μｇ/ｍＬの最終濃度
でＸ−ｇｌｕを含むＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天を形成した。
【００４９】
２．細菌活性化培地：
（Ａ）Ｂａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｅｒｏｉｔ、ＭＩ，ＵＳＡ）；および
（Ｂ）ＭＲＳ寒天：Ａｇａｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｃｈａｒｌａｕ Ｃｈｅｍｉｅ Ｓ．Ａ．，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）（１５ｇ/Ｌ）で補充したＢａｃｔｏ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳブロス。
【００５０】
３．リボース利用培地：
基礎培地の組成：
Ｂａｃｔｏ ｐｒｏｔｅｏｓｅ ｐｅｐｔｏｎｅ ｎｏ．３ １０ｇ
（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ
（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
Ｔｗｅｅｎ ８０ １ｇ
アンモニウムハイドロジェンシトレート(ammonium hydrogen citrate) ２ｇ
酢酸ナトリウム ５ｇ
硫酸マグネシウム ０．１ｇ
硫酸マンガン ０．０５ｇ
リン酸（水素）二カリウム ２ｇ
クロロフェノールレッド ０．０５％
蒸留水 １Ｌ
ＨＣｌでｐＨを６．３に調整する。
【００５１】
上で調製したような基礎培地を１チューブ当たり４．５ｍｌの基礎培地の量で試験管にパッケージングした。１２１℃で１５分間オートクレーブして滅菌した後、各試験管に、濾過によって滅菌した０．５ｍｌの１０％リボース溶液を添加した。
【００５２】
４．希釈液：０．１％ペプトン水（ＢＡＣＴＯTM ペプトン，Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）
ＩＩ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を分離およびスクリーニングするための手順
１． およそ指先の大きさの糞便（これらは、スティックを使用して１〜６歳の幼児の糞便試料の中間部分からサンプリングした）を、９ｍｌの上述の希釈液（０．１％ペプトン水）を含む試験管に添加し、１０倍希釈の試験溶液を得た。希釈した試験溶液を十分かつ均一に撹拌し、次いで数分間静置させ、試料中の微生物を希釈液中に遊離させた。
２． １ｍｌの上述の希釈試験溶液を、９ｍｌの同一の希釈液を含む別の試験管に導入した。連続希釈を、１０4倍希釈液が作製されるまで、この様式で行った。
３． １０2、１０3、および１０4倍希釈試験溶液（各々０．２ｍｌの量で存在し、工程２で記載される連続希釈によって調製される）を、種々のスクリーニング培地（Ｒｏｇｏｓａ寒天、トマトジュース寒天、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ選択培地およびＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天）にそれぞれ適用し、Ｌ型ガラスロッドを使用して均等に広げた。次いでこれらのスクリーニング培地を、３７℃の温度に設定した混合気体（５％Ｈ2，１０％ＣＯ2および８５％Ｎ2）を含む嫌気性インキュベーター中に配置し、２〜４日間培養した。
４． 桿形の細菌コロニー（これはＲｏｇｏｓａ＋Ｘ−ｇｌｕ寒天上で青色を示し、顕微鏡試験下で不動性であることが示されたか、または他のスクリーニング培地上で増殖する場合に半透明であるように見え、顕微鏡試験下で不動性でもある）を選択した。スティックによって取り上げた細菌を、ＭＲＳブロスを含む試験管および内部発酵チューブ（ｉｎｎｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｉｏｎ ｔｕｂｅ）中に導入した。３７℃で１〜２日培養した後、細菌株（これは、気体を生成することなく増殖し、グラム陽性染色によって陽性結果を有することが示される）を回収した。
５． ＭＲＳブロス中で２回活性化した後、工程４で回収した細菌株を、以下の様式で、増殖温度およびリボース利用について試験した：
（ｉ）ＭＲＳブロス培地を、１％の細菌接種物で接種し、そして１５℃で１４日間静置した。培地がそこで細菌増殖を有することを示した場合、このことは、接種された細菌株が１５℃で増殖し得ることを示す。一方、細菌増殖が１４日目に見出されない場合、このことは、接種された細菌株が１５℃で増殖し得ないことを示す。
（ｉｉ）ＭＲＳブロス培地を、１％の細菌接種物で接種し、そして４５℃で２日間静置した。培地がそこで細菌増殖を有することを示した場合、このことは、接種された細菌株が４５℃で増殖し得ることを示す。一方、細菌増殖が見出されない場合、このことは、接種された細菌株が４５℃で増殖し得ないこと示す。
（ｉｉｉ）リボソーム利用培地を１％の細菌接種物で接種し、３７℃で数日間静置した。（ｉｖ）培養培地の色が紫色から黄色に変わった場合、このことは、接種された細菌株が、増殖のためにリボースを利用することができそして酸を生成し得ることを示す。培養培地の色が７日後も紫色のままである場合、培地をさらに数日間静置する。培養培地の色がまだ黄色に変わらない場合、このことは、接種された細菌株が増殖のためにリボースを利用することができず酸を生成できないことを示す。
【００５３】
ＩＩＩ．結果：
本実施例において、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓスクリーニング培地は主にＲｏｇｏｓａ寒天に基づいており、そしてこれらのいくつかは、トマトジュースまたはＸ−ｇｌｕでさらに補充した。トマトジュースは、ビタミンＢ群が豊富であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの増殖に対して有益である。Ｒｏｇｏｓａ寒天に関しては、そこに含まれる酢酸が細菌増殖を阻害するようにｐＨ値を低下させることを助け、そして高濃度の酢酸イオンがまた、微生物の増殖を阻害する効果を有する。
【００５４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株がＲｏｇｏｓａ寒天上で培養される場合、これは白色コロニーを形成し、そしてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの他の株から容易に区別可能ではない。Ｘ−ｇｌｕがＲｏｇｏｓａ寒天に添加される場合、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細菌コロニーは色が青色となる。これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細胞が、Ｘ−ｇｌｕのβ−Ｄ−グルコシド結合を破壊して青色色原体（これは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの細菌コロニーを青色にする）を生成し得るβ−Ｄ−グルコシダーゼの活性を有するためである。しかし、この酵素はまた、多数の他の微生物の細胞中にも存在するので、選択された細菌株は、所望の特性を有すると疑われる菌株が選択され得る前に、顕微鏡試験、グラム染色、ならびにリボース利用および増殖温度についての上述の生理学的および生化学的試験を受けなければならない。
【００５５】
本出願人は、Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに住んでいる１〜６歳の健康な幼児から４３の糞便試料を集めた。各試料の希釈サンプルを、上記の手順に従って選択培地のそれぞれの上にプレートした。選択培地上に細菌コロニーの形成が観察される場合、異なる色および形態を有する細菌コロニーを選択し、顕微鏡試験を受けるために選択した。桿形の細菌細胞によって形成される細菌コロニーをさらにグラム染色に供した。次いで、グラム陽性桿菌を含むことが見出された任意の細菌コロニーを選択し、「分離株」と称する。
【００５６】
このようにして選択された分離株を、そこに内部発酵チューブを含むＭＲＳブロスにそれぞれ導入し、培養中に気体を生成しないものを選択して、増殖温度およびリボース利用試験を受けた。１５℃ではなく４５℃で増殖し得、そして増殖のための炭素供給源としてリボースを利用し得ない、任意の試験株を別にとっておき、そしてこの段階で選択された菌株を「疑わしい菌株（ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ）」と称する。
【００５７】
表１を参照すると、出願人らは、回収した４３の試料から選択された全部で８２８分離株から４００の疑わしい菌株を得た。
【００５８】
表１．回収した試料*の番号付けおよび前記試料から得られた細菌分離株の数
【００５９】
【表１】
【００６０】
*試料の起源：Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎに住む１〜６歳の幼児由来の糞
便。
**本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株が得られた試料番号。
【００６１】
次いで、疑わしい菌株を、以下の実施例において記載される酸耐性試験、胆汁酸塩耐性試験、およびコレステロール低下試験に供した。６つの分離株（すなわち、Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７、Ｂ３８Ｔ３８およびＢ６Ｔ７）は、これらの試験において優れた特性を示し、従って、上記特性の点において、以下の公知の細菌株と比較した。
１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４（ＡＴＣＣ ４３１２１に対応；ブタから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、血清コレステロールを低下させる能力を有する（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４９：３７７−３８１；Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９０），Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７３：９０５−９１１；Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ（１９９３）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５９：１１２０−１１２４；Ｄ．Ｏ．Ｎｏｈら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８２：３１０７−３１１３）；
２．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １０６９５T（
ＡＴＣＣ ４３５６に対応；ヒトから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの標準株であり、そしてヒト起源である（Ｄ．Ｋ．ＷａｌｋｅｒおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９９３）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７６：９５６−９６１）；
３．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＤＤＳ−１（ヒトから分離された）：このＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株は市販製品である（Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．）；
４．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １４０６５［ＣＳＣＯ ２４０１に対応、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＣＳＩＲＯ）、Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａより市販］；および
５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＣＣＲＣ １４６１９T（ＡＴＣＣ
３３３２３に対応；ヒトから分離された）（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８０）、３０，６０１；Ｅ．ＬａｕｅｒおよびＯ．Ｋａｎｄｌｅｒ，Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ．Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ．Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎｓｋｒ．Ｈｙｇ．Ａｂｔ．１
Ｏｒｉｇ．Ｒｅｉｈｅ Ｃ，１９８０，１，７５−７８）。
【００６２】
（実施例２ 酸耐性試験）
Ｉ．実験手順：
この実施例で実施された細菌細胞生存試験を、Ｊ．Ｅ．Ｈｏｌｃｏｍｂｅら（１９９１）、Ｃｕｌｔ．Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄ．Ｊ．，２６（３）：４−５に記載され、そしてＹ．Ｓ．Ｙａｎｇらに対して発行された米国特許第５，７１１，９７７号（ここで、中性環境（ｐＨ７）および胃をシミュレートする酸性環境（ｐＨ２）を使用した）に記載された方法を参照して行った。
【００６３】
ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験した細菌株の各々の培養物を、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清の除去後、細胞ペレットを１ｍｌの通常生理食塩溶液（０．８５％ ＮａＣｌ、ｐＨ７）中で再懸濁し、スティックで撹拌し、次いでボルテックスして均一な細菌懸濁液を得た。得られた細菌細胞懸濁物のアリコート（０．５ｍｌ）を、それぞれｐＨ７およびｐＨ２の通常生理食塩溶液と混合し、得られた混合物を３７℃のインキュベーターで２時間静置した。その後、生存している細菌細胞をカウントし、そして各試験細菌株の酸耐性を、Δｌｏｇ（細菌細胞の数）［すなわち、（ｐＨ７の通常生理食塩溶液処理後に生存した細菌細胞数−ｐＨ２の通常生理食塩溶液処理後に生存した細菌細胞数）の計算したｌｏｇ値］によって表した。Δｌｏｇ（細菌細胞数）のより小さい値を有する細菌株が、より高い酸耐性を有すると考えた。
【００６４】
ＩＩ．結果：
ほとんどの微生物は酸性環境において何らの耐性を有さない。乳酸菌自体は酸生成細菌であるが、これらはｐＨ３．２〜４．５の環境でのみ増殖する。従って、胃の極端な酸性環境（ｐＨ２．０〜３．２）はまた、乳酸菌の生存率に影響を与える主要な因子である。胃の内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）のエントリー時間およびタイプに依存して、胃酸のｐＨ値は、平均して２時間の間にｐＨ１．５〜４．５の範囲で変化する。従って、この実施例における実験において、ｐＨ２を胃のｐＨ値の代表値として使用した。さらに、胃酸は性質において塩酸に類似しているので、塩酸によって２に調整したｐＨを有する通常生理食塩溶液を使用して、３７℃で二時間試験細菌株を処理した。この酸処理において生存した細菌細胞をカウントし、そしてｐＨ７における通常生理食塩溶液で処理したコントロール群のものと比較した。
【００６５】
得られた実験結果によると、３７℃で２時間の上記の２つの異なるｐＨ値での処理後、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４は最も高い酸耐性を示し（図１）、そして酸処理後のその細菌カウントは、ｌｏｇ値において単に１．９減少した。一方、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ ＣＣＲＣ １４６１９Tは乏しい酸耐性を示し、そしてこれらの細菌カウントはそれぞれｌｏｇ値において４．３および４．４減少した。
【００６６】
本発明の実施例１において得られた新しい分離株Ｂ２１Ｔ１（これは、以下の実施例において記載されるように、その細菌学的特徴に従ってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉとして分類される）の酸耐性は、ＣＣＲＣ １４０６５のそれと類似であり、そしてそれらの細菌カウントは、ｌｏｇ値において３．９減少した。本発明の他の５つの新規分離株（Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７、Ｂ３８Ｔ３８およびＢ６Ｔ７）は、同様のレベルの酸耐性を有し、そして酸耐性のスクリーニング指標（Δｌｏｇ（細菌数）の値＜４）（Ｙ．Ｓ．Ｙａｎｇらに対して発行された米国特許第５，７１１，９７７号）を満たすことができる。
【００６７】
（実施例３．胆汁酸塩耐性試験）
Ｉ．実験手順：１％の細菌接種物
ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、各試験細菌株の１％接種物を、それぞれ１０ｍｌ
ＭＲＳブロスおよび０．３％雄牛胆汁(oxgall)で補充した１０ｍＬ ＭＲＳブロス（ＭＲＳＯ）に接種した。３７℃で２４時間培養した後、各培養物の細菌密度（ＯＤ660）を
分光光度計によって測定し、そして生存細菌細胞の数もまたカウントした。胆汁酸塩耐性をΔｌｏｇ（細菌数）（すなわち、［ＭＲＳブロス中で培養した細菌細胞数−ＭＲＳＯブロス中で培養した細菌細胞数］の計算したｌｏｇ値）によって表した。ここで、計算Δｌｏｇ（細菌細胞数）が小さいほど、試験細菌株の胆汁酸塩耐性が高い。
【００６８】
ＩＩ．結果：
異なる乳酸菌は、胆汁酸塩で処理した後の生存率において大きな差異を示した。従って、胆汁酸塩耐性を有する乳酸菌をスクリーニングすることは、プロバイオティック細菌の選択において重要である（Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８４）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，６７：３０４５−３０５１；Ｐ．Ｍａｒｔｅａｕら（１９９７）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，８０：１０３１−１０３７）。以前の研究において、雄牛胆汁(oxgall)は、ヒト腸内細菌の選択的な培養のための培地において広範に使用されていた。従って、雄牛胆汁(oxgall)の有効性は、ヒト胆汁酸塩のものと非常に類似しているはずであり、そして雄牛胆汁(oxgall)は、０．３％（ｗ/ｖ）の平均濃度で一般に使用された（Ｓ．Ｅ．ＧｉｌｌｉｌａｎｄおよびＤ．Ｋ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９０）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７３：９０５−９１１；Ｄ．Ｋ．ＷａｌｋｅｒおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ（１９９３）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，７６：９５６−９６１）。
【００６９】
得られた実験結果は、ＣＣＲＣ １０６９５T、ＣＣＲＣ １４６１９TおよびＣＣＲＣ １４０６５を除き、各試験細菌株の測定したＯＤ660値（細菌密度）は、試験された細菌株が０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むかまたは含まない培地で培養されたかに関わらず、２より大きかった（表２）。このことは、０．３％雄牛胆汁(oxgall)の添加が試験された細菌株の増殖に対してほとんど影響を与えないように見えることを示す。
【００７０】
表２． ０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むかまたは含まないＭＲＳブロス中で２４時間培養した試験細菌株の増殖比較
【００７１】
【表２】
【００７２】
しかし、本発明に従う２つの新しい分離株（すなわち、Ｂ６Ｔ７およびＣ２１Ｔ１）の細菌密度は、ＭＲＳブロスよりもＭＲＳＯブロスにおいてより高いことにまた注意する。このことは、軽度の吸収作用と干渉する他の因子が存在し得ることを示す。従って、これらの２つの培地中で２４時間培養した試験細菌株の生存細菌細胞数をさらに調べた。
【００７３】
図２を参照すると、試験した細菌株の細胞数の減少から、ＣＣＲＣ １４６１９Tは非
常に乏しい胆汁酸塩耐性を有し、そしてＣＣＲＣ １０６９５Tおよび本発明の新規分離
株Ｂ３８Ｔ３８は、それぞれＣＣＲＣ １４６１９Tのそれよりも高い胆汁酸塩耐性を有
することが示された。最も高い胆汁酸塩耐性を示す細菌株は、本発明の新規分離株Ｂ６Ｔ７であり、残りの細菌株の胆汁酸塩耐性は実質的に類似している。すなわち、０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中での２４時間の培養後、その死滅した細菌細胞数は、ｌｏｇ値において１〜２の範囲である。
【００７４】
さらに、０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中で培養したいくつかの細菌株の増殖曲線を観察した。試験した菌株の各々の増殖速度は、増殖曲線の勾配によって示される。すなわち、勾配が大きい程、増殖速度は速く、従って、胆汁酸塩に対する耐性がより高い。図３から観察され得るように、ＣＣＲＣ １７０６４の増殖速度が最も速く、本発明の新規分離株Ｘ２１Ｂ７およびＢ２１Ｔ１のものはより遅く、そしてＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＤＤＳ−１のそれは最も遅い。
【００７５】
異なる観察方法から得られた実験結果においてわずかな差異が存在するが、これらの試験から、本発明においてスクリーニングされた６つの新規Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は酸および胆汁酸塩に対して同じ耐性を示すことが理解され得る。
【００７６】
（実施例４．コレステロールを低下させることにおける試験した細菌株の能力についてのアッセイ）
Ｉ．実験手順：
（Ａ）コレステロールの供給源：
コレステロールを低下させる際の細菌株の試験に関して、ＰＰＬＯ（ＢＡＣＴ ＰＰＬＯ ＳＥＲＵＭ ＦＲＡＣＴＩＯＮ）は、ほとんどの先行技術文献および特許刊行物におけるコレステロールの供給源として使用された。しかし、この製品の生産はすでに中止されている。従って、この実施例においては、本出願人は、Ｈｕａｎｇ，Ｃ．およびＴ．Ｅ．Ｔｈｏｍｏｐｓｏｎ（１９７４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３２：４８５−４８９およびＳ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０において開示されるホスファチジルコリン−コレステロール調製方法を採用した。ここで、ウマ血清およびフォスファチジルコリン−コレステロールをコレステロールの供給源として使用し、均一に分散したホスファチジルコリン−コレステロール溶液を調製した。この容量は、コレステロール濃度と正の一次関数関係にある（図４）。
【００７７】
１．ウマ血清
水中に溶解したウマ血清を、０．４５μｍメンブランフィルターを通過させて濾過し、そして−２０℃の冷凍庫中で貯蔵した。
【００７８】
２．ホスファチジルコリン−コレステロール（卵レシチン＋コレステロール）
Ｓ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０に従って、卵レシチンおよびコレステロールを、ロータリーバキュウムエバポレータ（ＥＹＥＬＡ）のグラウンドストッパーボトルに配置し、そして十分な量のクロロホルム中で均一に溶解し、続いて窒素パージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）を介して乾燥し、コレステロールおよび卵レシチンを均一に混合し、グラウンドストッパーボトルのガラス壁上に均一なフィルムを形成した。０．４Ｍスクロース溶液中に該フィルムを再溶解した後、グラウンドストッパーボトルにＮ2ガスをチャージし、次いでキャップでシールし、続いてアルミニウム箔でラッピングし、脂質酸化の可能性を減少させた。
【００７９】
シールしたグラウンドストッパーボトルを、４℃で１５分間水浴型超音波処理器中で超音波処理した後、このようにして形成された混合溶液を、圧力下で２回、０．２２μｍメンブランフィルターを通過させ、次いで、４℃の冷蔵庫中で貯蔵した（溶液はその調製の３日以内に使用されなければならない）。
【００８０】
（Ｂ）試験グループ分け：
試験（１）：ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験細菌株の各々の１％接種物を、８．８ｍｌ ＭＲＳ、上で調製した１．２ｍｌのコレステロール溶液および０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含む１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種し、３７℃嫌気性インキュベーター（１０％ＣＯ2および９０％Ｎ2）中で２４時間培養した。その後、以下の項目（Ｃ）において記載された方法に従って、上清サンプルおよび細胞ペレットサンプルを、コレステロール含有量の測定のために試験細菌株で接種した得られた接種物からそれぞれ回収した。
【００８１】
試験（２）：ＭＲＳブロス中で二回活性化した後、試験細菌株の各々の１％接種物を、１０ｍＬ ＭＲＳＯ中に接種し、そして３７℃で２０〜２２時間培養した。その後、各試験細菌株の得られた培養物から採取した１％接種物を、１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種し、そして３７℃嫌気性インキュベーター（１０％ＣＯ2および９０％Ｎ2）中で２４時間培養した。その後、以下の項目（Ｃ）において記載された方法に従って、上清サンプルおよび細胞ペレットサンプルを、コレステロール含有量の測定のために試験細菌株で接種した得られた接種物からそれぞれ回収した。
【００８２】
（Ｃ）コレステロール含有量の測定
コレステロール含有量の測定を、ｏ−フタルアルデヒド法（Ｌ．Ｌ．ＲｕｄｅｌおよびＭ．Ｄ．Ｍｏｒｒｉｓ（１９７３）、Ｎｏｔｅｓ ｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，１４：３６４−３６６；Ｓ．Ｅ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，４９：３７７−３８１）に従って行った。
【００８３】
上記試験（１）および試験（２）において記載されるような試験細菌株で接種した得られた培養物の各々に関して、１ｍｌ量における試験細菌溶液をサンプリングして、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。このようにして形成された０．５ｍｌの上清をチューブに配置し、それぞれの試験細菌株で接種した得られた培養物の上清試料とした。
【００８４】
上記試験（１）および試験（２）において記載されるような試験細菌株で接種した得られた培養物の各々に関して、１ｍｌ量における試験細菌溶液をサンプリングして、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清を除去した。残った細胞ペレットを１０ｍｌ ＭＲＳＯブロス中で再溶解し、均一に混合した。０．５ｍｌ溶液を得られた混合物から採取し、試験管に配置し、それぞれの試験細菌株で接種した得られた培養物の細胞−ペレット試料とした。
【００８５】
各試験試料に３ｍｌの９５％エタノールを添加し、均一に振盪することによって十分に混合した。２ｍｌの５０％ ＫＯＨをそこにさらに添加し、そして得られた混合物を再び均一に振盪した。その後、混合物を水浴中で１０分間６０℃で加熱し、次いで室温で冷却した。冷却した混合物に５ｍｌヘキサンを添加し、均一に撹拌し、続いて３ｍｌ Ｈ2Ｏを添加した。均一に振盪した後、そのように形成した混合物を室温で１５分間静置した。２．７ｍｌの得られたヘキサン層を別の試験管に取り出し、そしてヘキサンをＮ2下で６０℃で蒸発させた。蒸発後に残った固形残渣に４ｍｌのｏ−フタルアルデヒド試薬溶液（０．５ｍｇ ｏ−フタルアルデヒド/１ｍｌ酢酸）を添加した。得られた混合物を均一に振盪し、室温で１０分間静置し、続いて２ｍｌ濃硫酸を添加した。このようにして形成された混合物を均一に振盪し、そして室温で１０分間静置した。その後、混合物を分光光度計を使用してＯＤ550測定に供した。
【００８６】
（Ｄ）コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価
コレステロールを低下させることにおける細菌株の能力を以下の式を使用して推定した：
Ａ＝１００−［（Ｂ／Ｃ）×１００］
Ａ＝コレステロールの減少（％）
Ｂ＝試験細菌株で接種した培養物の上清におけるコレステロール含有量（ｍｇ）
Ｃ＝試験細菌株の接種なしの培養物の上清におけるコレステロール含有量（ｍｇ）（コントロール群）
「Ａ」値の値が８０％より大きい場合、細菌株はコレステロールを低下させることにおいて著しい能力を有すると考えられる。
【００８７】
（Ｅ）コレステロールを同化することにおける試験細菌株の能力の評価
Ａ’＝１００−［（Ｂ’＋Ｃ’）×１００］
Ａ’＝コレステロールの同化（％）
Ｂ’＝試験細菌株で接種した培養物の上清中のコレステロール含有量（ｍｇ）
Ｃ’＝試験細菌株で接種した培養物の細胞−ペレット中のコレステロール含有量（ｍｇ）
「Ａ’」の値が１５％より大きい場合、細菌株はコレステロールを同化することにおいて著しい能力を有すると考えられる。
【００８８】
ＩＩ．結果：
（ｉ）コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力
試験（１）（すなわち、ＭＲＳブロス中で試験細菌株を培養する）および試験（２）（すなわち、ＭＲＳＯブロス中で試験細菌株を培養する）のそれらを比較する際、試験（２）において、試験細菌株をＭＲＳＯブロス中に接種し、２０〜２２時間培養したという点で、これらの間に差異が存在する。１％接種物をそこから採取し、そしてさらなる培養のために１０ｍｌ ＭＲＳＳ中に接種した。試験（２）の目的は、試験細菌株を再びスクリーニングして、これらが優れた胆汁酸遠耐性を有するか否かを決定し、そしてまたコレステロールを低下させることにおいて能力を有する細菌株をスクリーニングすることである。
【００８９】
ウマ血清をコレステロール供給源として使用する試験の結果（表３）は、先のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ＣＣＲＣ １７０６４およびＤＤＳ−１がまたこの試験において有意な効果を実証することを示し、そしてコレステロールを低下させることにおけるこれらの能力は、８８〜９８％に達した。一方、コレステロールを低下させることにおけるＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＣＣＲＣ １４６１９Tの能力は有意なものではなかった。このことは、これらの細菌株が乏しい胆汁酸耐性を有し、そしてＭＲＳＯブロス中で十分に増殖せず、その結果、観察されるようなこれらのコレステロール低下能力は単に３０〜４３％に達するという事実に起因し得る。
【００９０】
これらの２つの試験において、本発明の新規分離株（すなわち、Ｂ６Ｔ７、Ｃ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｂ３８Ｔ３８およびＸ２１Ｂ７）は、９１〜９９％までまたはこれを超えるコレステロール低下能力を有し、これはＣＣＲＣ １７０６４およびＤＤＳ−１のそれよりもわずかに高いことが示された。
【００９１】
このことは、本発明に従ってスクリーニングされた細菌株がまた、血清コレステロールを低下させることにおいて優れた能力を有することを示す。
【００９２】
表３．コレステロールを減少させることにおける試験細菌株の能力の評価（ウマ血清モデル）a
【００９３】
【表３】
【００９４】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ウマ血清で補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：ブロス中の最初のコレステロール含有量は８６．０６μｇ/ｍｌであった。
【００９５】
表４を参照すると、コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価に関して、試験におけるコレステロール供給源としてウマ血清の代わりに、ホスファチジルコリン−コレステロールを使用した場合、コレステロール減少（％）の観点における各細菌株の能力は減少する傾向にあることが観察された。このことは、コレステロールレベルを低下させることにおけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の能力が、使用されるコレステロールの型と共に変化し得ることを示す。ホスファチジルコリン−コレステロールを低下させることにおけるＣＣＲＣ １７０６４の能力は１１〜２９％であるが、ホスファチジルコリン−コレステロールを低下させることにおける本発明の細菌株の能力は２３〜４８％に達し、これは、ＤＤＳ−１によって達成されるよりもわずかに低いが（５０％）、ＣＣＲＣ １７０６４によって達成されるものよりも明確に高い。
【００９６】
表４．コレステロールを低下させることにおける試験細菌株の能力の評価（ホスファチジルコリン−コレステロールミセルモデル）a
【００９７】
【表４】
【００９８】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ホスファチジルコリン−コレステロールミセルで補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：ブロス中の最初のコレステロール含有量は５９．２２μｇ/ｍｌであった。
【００９９】
（ｉｉ）試験細菌株によるコレステロール同化
コレステロールを低下させることにおける乳酸菌の機構に関して、コレステロールは、コレステロールおよび脱抱合胆汁酸塩の同時沈殿（Ｆ．Ａ．Ｍ．ＫａｌｖｅｒおよびＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ（１９９３）、前出、Ｍ．Ｍ．ＢｒａｓｈｅａｒｓおよびＳ．Ｅ．Ｇｉｌｉｌｌａｎｄ（１９９７）、前出）および細菌株自体によるコレステロールの同化（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら（１９８５）、前出；Ｄ．Ｏ．Ｎｏｈら（１９９７）、前出；およびＺｈａｎｇら（１９９８）、前出）によって取り除かれる。
【０１００】
表５を参照すると、ＣＣＲＣ １７０６４（本発明に従って得られた６つの分離株）およびＤＤＳ−１がコレステロールを同化し得ることが理解され得る。しかし、異なる細菌株は、コレステロールを同化するそれらの能力においてわずかに異なる。観察された同化率は、１１〜４０％の範囲である。ＣＣＲＣ １４０６５、ＣＣＲＣ １０６９５TおよびＣＣＲＣ １４６１９Tによるコレステロールの同化は、有意なものではなかった。
【０１０１】
表５．試験細菌株のコレステロール同化aの評価
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
a：０．３％雄牛胆汁(oxgall)および１２％ウマ血清で補充したＭＲＳブロス
b：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳブロス中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
c：試験前に、全ての培養物を、１％接種物を使用してＭＲＳＯブロス（０．３％雄牛胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス）中で継代培養し、３７℃で２４時間インキュベートした。
d：コントロール中のコレステロール濃度を１００部として定義した。
【０１０４】
上記の試験結果を要約すると、６つの新規Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株（本発明に従って台湾において得られそしてスクリーニングされた）は優れた酸および胆汁酸塩耐性ならびにコレステロールを低下させる能力を示すことは明らかである。これらのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株のさらなる同定および特徴付け試験を以下の実施例において行った。
【０１０５】
（実施例５．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株の同定および特徴付け）
Ｉ．実験手順：
（１）予備同定試験：
新たに培養した細菌株（１８〜２４時間培養した）を予備同定試験に供し、この試験の実施した項目としては以下が挙げられる：グラム染色、形態観察、カタラーゼ試験、運動性、好気性および嫌気性条件下での増殖（Ｏ．ＫａｎｄｌｅｒおよびＮ．Ｗｅｉｓｓ（１９８６）、Ｒｅｇｕｌａｒ，ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｃｃｉ．：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．（Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．，Ｍａｉｒ，Ｎ．Ｓ．，Ｓｈａｒｐｅ，Ｍ．Ｅ．，およびＨｏｔｌ，Ｊ．Ｇ．，編）第ＩＩ巻、１２０８−１２３４頁．Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ）。
【０１０６】
（２）ＡＰＩ同定システム：
この同定試験は、Ｇ．Ｈ．Ｆｌｅｅｔら（１９８４）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：１０３４−１０３８において記載されるものに基づいている。乳酸菌の同一性は、ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ Ｋｉｔ（Ｆｒｅｎｃｈ ＡＰＩ ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌａ Ｂａｌｍｅ Ｌｅｓ Ｇｒｏｔｔｅｓ，Ｍｏｎｔａｌｉｅｎ，Ｊｅｒａｅｈ，Ｆｒａｎｃｅ）で確認した。試験した項目は：以下を含む４９炭素供給源由来の酸生成試験であった：グリセリン、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチル−キシロシド（ｘｙｌｏｓｉｄｅ）、ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ソルボース、ラムノース、ドゥルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−マンノシド、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン（ａｒｂｕｔｉｎｅ）、エスクリン、サリシン、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース、サッカロース、トレハロース、イヌリン（ｉｎｕｌｉｎｅ）、メレジトース、Ｄ−ラフィノース、アミドン、グリコーゲン、キシリトール、β−ゲンチオビオース、Ｄ−ツラノース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコン酸塩、２−ケト−グルコン酸塩、および５−ケト−グルコン酸塩。
【０１０７】
ＡＰＩシステムは以下の操作手順に従って機能する：培養プレート上で増殖した細菌コロニーを取り上げるために滅菌綿棒（ｓｗａｂ）を使用し、そして取り上げた細菌コロニーを２ｍｌの０．８５％通常生理食塩溶液中に均等に懸濁する；滅菌ピペットを使用して細菌細胞−懸濁溶液を吸引し、そして別の５ｍｌの０．８５％滅菌通常生理食塩溶液にｎ滴滴下し、その結果、得られた細菌溶液の濃度は、ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．２標準溶液（９．８ｍｌの１％Ｈ2ＳＯ4および０．２ｍｌの１％ＢａＣｌ2から形成される混合溶液）の濃度と等しくなる。その間、さらなる細菌細胞−懸濁溶液を採取し、そして２ｎ滴の溶液をＡＰＩ５０ ＣＨＬ培地を含むガラス管中にピペットで入れる。均一に混合した後、このように調製された接種物の適切な容量を試験ストリップの管の各々に添加し、ミネラルオイルで重層し、そしてインキュベーショントレイに配置した（インキュベーション間の蒸発を介する培地の喪失を避けるために予めトレイに水を添加する）。インキュベーションのふたでカバーした後、インキュベーショントレイを３７℃で４８時間静置し、読み(reading)目的で引き続き採取する。結果を記録し、ＡＰＩ ＬＡＢ Ｓｏｆｔｗａｒｅ同定システムのデータベースと比較し、試験下の細菌コロニーについての最も適切な分類法の属および種を決定する。
【０１０８】
（３）Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ：
Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｍ．Ｒｏｇｏｓａら（１９７１）、Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｄｉｎｇ ｄａｔａ ｏｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ（ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＢ），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２１：１Ａ−１８４Ａによって提案される方法に基づき、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍのＭａｔｒｉｘ ５（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．について適している）を利用する。試験項目としては以下が挙げられる：運動性；増殖温度試験（１５℃、４５℃）；好気性条件下での増殖；Ｄ−グルコースおよびグルコース由来の気体生成試験；アミグダリン、Ｌ−アラビノース、セロビオース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、ラクトース、マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、メレジトース、メリビオース、ラムノース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−リボース、サリシン、Ｄ−ソルビトール、スクロース、トレハロースおよびＤ−キシロース由来の酸生成試験；ならびにエスクリン加水分解およびＬ−アルギニン脱アミノ化反応についての増殖試験。各試験の陽性および陰性結果はＭｉｃｒｏ−ＩＳコンピューター同定プログラムに入力され、同定された細菌の分類学上の属および種を与える。
【０１０９】
（４）１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析：
この同定試験は、Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２５：４５００−４５０４において記載される方法に基づいており、そして以下の操作手順に従って機能する：少量の新たに培養した細菌株を引き剥がし、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに配置する。細菌サンプルをプロテイナーゼＫおよびＲＮａｓｅで処理し、スピンカラムを使用して、そこから細菌ゲノムＤＮＡを得、ＰＣＲ増幅を行い、続いて精製する。電気泳動による確認後、ＰＣＲ増幅産物をＭｉｃｒｏＳｅｑTM １６ＳｒＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を用いる反応に供し、その後ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用してＤＮＡ配列決定する。さらに、このようにして得た１２ストリップのＤＮＡ配列を分析し、ＭｉｃｒｏＳｅｑTMソフトウェア（ＰＥ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を使用することによって積分し、約１５００ｂｐの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を得る。この配列は、ＤＮＡデータベースとの比較に供される（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）。
【０１１０】
ＩＩ．結果：
１．本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１
（ｉ）予備同定試験の結果に従って、分離株Ｂ２１Ｔ１は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表６に示し、ここで、同一性スコアは９１．０（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図５に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1群）（Ｇ．Ｋｌｅｉｎら（１９８８）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４１：１０３−１２５）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ１は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
２．本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ２１Ｔ６は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表８に示し、ここで、同一性スコアは９３．６（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認される。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図６に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1群）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ２１Ｔ６は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１４】
【表８】
【０１１５】
３．本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｃ２１Ｔ１は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表９に示し、ここで、同一性スコアは９５．６（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図７に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｃ２１Ｔ１は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
４．本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｘ２１Ｂ７は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１０に示し、ここで、同一性スコアは９４．３（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図８に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｘ２１Ｂ７は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１１８】
【表１０】
【０１１９】
５．本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ３８Ｔ３８は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１１に示し、ここで、同一性スコアは９０．８（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表１２に示し、同一性スコアは０．６４６である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図９に示す。ＤＮＡデータベース（ＭｉｃｒｏＳｅｑTM Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ，１９９９，ＰＥ ＣＯ．，ＵＳＡ）との比較後、本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中のＢ1グループ）の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ３８Ｔ３８は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１２０】
【表１１】
【０１２１】
【表１２】
【０１２２】
６．本発明の分離株Ｂ６Ｔ７
（ｉ）予備同定結果に従って、分離株Ｂ６Ｔ７は、グラム陽性、カタラーゼ陰性、および非移動性であり、そして好気性および嫌気性条件の両方で増殖する。
（ｉｉ）ＡＰＩ ＳｙｓｔｅｍのＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットを使用する試験結果を表１３に示し、ここで、同一性スコアは９２．４（％ＩＤ）である。この分離株の同一性は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍであると確認された。
（ｉｉｉ）本発明の分離株Ｂ６Ｔ７は、Ｍｉｃｒｏ−ＩＳ ＳｙｓｔｅｍによってＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとして同定され、ここで、得られた結果を表７に示し、同一性スコアは０．６８２である（ＩＤスコア）；
（ｉｖ）本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列分析結果を図１０に示す。ＡＰＩ ５０ ＣＨＬ同定キットで得られた同定結果およびＭｉｃｒｏ−ＩＳ Ｓｙｓｔｅｍ同定システムで得られた結果は、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７がそれぞれＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであると分類し、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号８）と比較した。本発明の分離株Ｂ６Ｔ７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と最も相同性であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と大きく異なることが見出された；そして
（ｖ）上述の同一性結果に従って、本発明の分離株Ｂ６Ｔ７は、最もおそらくＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓである。
【０１２３】
【表１３】
【０１２４】
同定結果を要約すると、本発明に従ってスクリーニングされた６つの分離株の全てが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株に属し、ここで、Ｂ６Ｔ７はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであり、そしてＢ２１Ｔ１、Ｂ２１Ｔ６、Ｃ２１Ｔ１、Ｘ２１Ｂ７およびＢ３８Ｔ３８は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓのＢ1サブグループ）である。
【０１２５】
表１４を参照すると、先行特許および技術文献において開示されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株と比較して、本発明に従って得られた６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、０．３％胆汁酸塩を含む環境中で増殖し得るだけでなく、ｐＨ２の酸性環境中で２時間培養された後により高い生存率および良好なコレステロール低下能力も有する。さらに、本発明の６つのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、コレステロールと同時沈殿しそしてコレステロールを同化する能力を有する。本発明の分離株およびこれらの継代培養した子孫は優れたプロバイオティック細菌であることが明らかであり、食品（例えば、飲料、ケーキ、幼児食品、発酵ミルク、ダイエタリーサプリメント、および動物のえさ）の製造において使用され得る。また、胃腸管疾患の処置および予防ならびに血清コレステロールを低下させるための薬学的組成物の製造において使用され得る。
【０１２６】
例えば、本発明に従って得られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株は、米国特許第５，５１６，６８４号において開示される参考実施例１および参考実施例２を参照して、乳酸飲料およびヨーグルトドリンクの製造において使用され得る。
【０１２７】
【表１４】
【０１２８】
本明細書中に援用される全ての特許及び参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。抵触の場合には、定義を含む本発明の説明が優先する。
【０１２９】
本発明は上記の特定の実施形態を参照して記載されているが、多数の改変およびバリエーションが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行われ得ることが明らかである。従って、本発明は添付の特許請求の範囲によって示される場合にのみ限定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
本発明の上記および他の目的および特徴は、添付の図面と組み合わせて、好ましい実施形態の上記の説明を参照して明らかとなる。
【図１】図１は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の酸耐性比較を示す棒グラフである。ここで、酸耐性は、Δｌｏｇ（ａ−ｂ）として表され、ここで、「ａ」はｐＨ７で２時間の塩処理後の生存細胞数を表し、「ｂ」はｐＨ２で２時間の塩処理後の生存細胞数を表す。
【図２】図２は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の胆汁酸塩耐性比較を示す棒グラフである。ここで、胆汁酸塩耐性は、Δｌｏｇ（ｃ−ｄ）として表され、ここで、「ｃ」はＭＲＳブロス中での２４時間のインキュベーション後の生存細胞数を表し、「ｄ」は０．３％の雄牛の胆汁(oxgall)で補充したＭＲＳブロス中での２４時間のインキュベーション後の生存細胞数を表す。
【図３】図３は、本発明に従うＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ分離株と公知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株との間の増殖比較を示す棒グラフである。これらは共に、０．３％雄牛の胆汁(oxgall)を含むＭＲＳブロス中で増殖した。
【図４】図４は、コレステロール濃度とフォスファチジルコリン−コレステロールミセルの量との間の関係を示す。このミセルは、本発明に従う分離された細菌株のコレステロール低下能力を試験するために、Ｓ．Ｒａｚｉｎら（１９８０）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，５９８：６２８−６４０を参照して調製した。
【図５】図５は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ２１Ｔ６の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図７】図７は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｃ２１Ｔ１の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図８】図８は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｘ２１Ｂ７の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図９】図９は、本発明に従う細菌分離株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ Ｂ３８Ｔ３８の１６Ｓ ｒＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図１０】図１０は、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｂ６Ｔ７分離株、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、およびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの間での１６Ｓ ｒＤＮＡヌクレオチド配列における差異を示す。ここで、Ｂ６Ｔ７分離株とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓとの間のヌクレオチドの差異の部位は影付きで示し、そしてＢ６Ｔ７分離株とＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍとの間のヌクレオチドの差異の部分は「＊」印によって示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株であって、ここで、該分離株は、アクセッション番号ＣＣＲＣ ９１０１９７で食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）において、およびアクセッション番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４８１でアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）において寄託されたラクトバチルス ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）Ｂ３８Ｔ３８の分離株と同一の細菌学的特徴を有する。
【請求項２】
食用材料および請求項１に記載のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株またはその継代培養した子孫（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）またはそれに由来する突然変異体を含む食品（ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）
（ここで、該継代培養した子孫または突然変異体は：
０．３％雄牛胆汁を含む環境中、２４時間増殖後の、約０．５〜２ ｌｏｇ値の集団の減少；
ｐＨ２、３７℃で２時間処理後、３〜４ ｌｏｇ値の集団の減少により示される酸耐性（０．８５％ ＮａＣｌ／０．０１Ｎ ＨＣｌ系）；
０．３％雄牛胆汁および１２％ウマ血清を含むブロス中での２４時間嫌気性培養後、コレステロール含有量を９３％を越えて減少させる能力；
０．３％雄牛胆汁および１２％コレステロールミセルを含むブロス中での２４時間嫌気性培養後、コレステロール含有量を２５〜４５％減少させる能力；
コレステロール同化率１２〜４０％、
の細菌学的特徴を示す）。
【請求項３】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、酵母、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つのプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物を更に含む、請求項２に記載の食品。
【請求項４】
該ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）が：ラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス ビフィズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス コーサシクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｓａｓｉｃｕｓ）、およびラクトバチルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３記載の食品。
【請求項５】
該ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）が：ストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびストレプトコッカス ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の食品。
【請求項６】
該酵母が：カンジダ ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｅｆｙｒ）およびサッカロマイセス フロレンティヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の食品。
【請求項７】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例えば、ラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス ビフィズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス コーサシクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｓａｓｉｃｕｓ）およびラクトバチルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ））；ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（例えば、ストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびストレプトコッカス ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））；酵母（例えば、カンジダ ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｅｆｙｒ）およびサッカロマイセス フロレンティヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ））；ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つのプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物を更に含む、請求項２に記載の食品。
【請求項８】
食用材料が：流動性乳製品、発酵ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳および発酵豆乳、フルーツ−野菜ジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、デザート、キャンディー、幼児処方物、健康食品、動物のえさおよびダイエタリーサプリメント（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）からなる群より選択される、請求項２に記載の食品。
【請求項９】
インスタント食品の形態で製造される、請求項２に記載の食品。
【請求項１０】
請求項１に記載のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株のプロバイオティック有効量を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、液剤、乳濁剤、散剤、錠剤およびカプセル剤からなる群より選択される経口用量に処方された、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記組成物が消化改善薬物として製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物が血清コレステロールを低下させるための薬物として製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株であって、ここで、該分離株は、アクセッション番号ＣＣＲＣ ９１０１９７で食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）において、およびアクセッション番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４４８１でアメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８，ＵＳＡ）において寄託されたラクトバチルス ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）Ｂ３８Ｔ３８の分離株と同一の細菌学的特徴を有する。
【請求項２】
食用材料および請求項１に記載のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株またはその継代培養した子孫（ｓｕｂ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）またはそれに由来する突然変異体を含む食品（ｆｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）
（ここで、該継代培養した子孫または突然変異体は：
０．３％雄牛胆汁を含む環境中、２４時間増殖後の、約０．５〜２ ｌｏｇ値の集団の減少；
ｐＨ２、３７℃で２時間処理後、３〜４ ｌｏｇ値の集団の減少により示される酸耐性（０．８５％ ＮａＣｌ／０．０１Ｎ ＨＣｌ系）；
０．３％雄牛胆汁および１２％ウマ血清を含むブロス中での２４時間嫌気性培養後、コレステロール含有量を９３％を越えて減少させる能力；
０．３％雄牛胆汁および１２％コレステロールミセルを含むブロス中での２４時間嫌気性培養後、コレステロール含有量を２５〜４５％減少させる能力；
コレステロール同化率１２〜４０％、
の細菌学的特徴を示す）。
【請求項３】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、酵母、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つのプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物を更に含む、請求項２に記載の食品。
【請求項４】
該ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）が：ラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス ビフィズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス コーサシクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｓａｓｉｃｕｓ）、およびラクトバチルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３記載の食品。
【請求項５】
該ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）が：ストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびストレプトコッカス ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の食品。
【請求項６】
該酵母が：カンジダ ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｅｆｙｒ）およびサッカロマイセス フロレンティヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の食品。
【請求項７】
ラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）（例えば、ラクトバチルス アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス ビフィズス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｉｆｉｄｕｓ）、ラクトバチルス ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス コーサシクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｕｓａｓｉｃｕｓ）およびラクトバチルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ））；ストレプトコッカス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）（例えば、ストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびストレプトコッカス ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ））；酵母（例えば、カンジダ ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ Ｋｅｆｙｒ）およびサッカロマイセス フロレンティヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ））；ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、少なくとも１つのプロバイオティック（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物を更に含む、請求項２に記載の食品。
【請求項８】
食用材料が：流動性乳製品、発酵ミルク、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳および発酵豆乳、フルーツ−野菜ジュース、フルーツジュース、スポーツドリンク、デザート、キャンディー、幼児処方物、健康食品、動物のえさおよびダイエタリーサプリメント（ｄｉｅｔａｒｙ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）からなる群より選択される、請求項２に記載の食品。
【請求項９】
インスタント食品の形態で製造される、請求項２に記載の食品。
【請求項１０】
請求項１に記載のラクトバチルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の分離株のプロバイオティック有効量を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、液剤、乳濁剤、散剤、錠剤およびカプセル剤からなる群より選択される経口用量に処方された、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記組成物が消化改善薬物として製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物が血清コレステロールを低下させるための薬物として製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２００７−８９５８９（Ｐ２００７−８９５８９Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１４６９２（Ｐ２００６−３１４６９２）
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【分割の表示】特願２００３−３３８１２１（Ｐ２００３−３３８１２１）の分割
【原出願日】平成１５年９月２９日（２００３．９．２９）
【出願人】（５９９０７９９７５）食品工業発展研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月２１日（２００６．１１．２１）
【分割の表示】特願２００３−３３８１２１（Ｐ２００３−３３８１２１）の分割
【原出願日】平成１５年９月２９日（２００３．９．２９）
【出願人】（５９９０７９９７５）食品工業発展研究所 (7)
【Ｆターム（参考）】
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