コージビオースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途
【課題】 新規酵素コージビオースホスホリラーゼを提供するとともに本酵素の製造方法及び本酵素を利用したグルコシル転移糖含有糖質並びにその用途を提供する。
【解決手段】 コージビオースホスホリラーゼ活性を有する新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物から採取する酵素の製造方法と、その酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とそれ以外の糖質に作用させて得られるグルコシル転移糖含有糖質、並びに、そのグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物により解決する。
【解決手段】 コージビオースホスホリラーゼ活性を有する新規酵素と、当該酵素をコードするＤＮＡと、当該酵素を産生する微生物を栄養培地中で培養し、産生した酵素を培養物から採取する酵素の製造方法と、その酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とそれ以外の糖質に作用させて得られるグルコシル転移糖含有糖質、並びに、そのグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物により解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵素コージビオースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、無機質のリン酸および／またはその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す新規酵素コージビオースホスホリラーゼとその製造方法、並びに、このコージビオースホスホリラーゼを用いて製造されるグルコシル転移糖含有糖質、さらには、これら糖質を含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。また、これらホスホリラーゼの給源としては、種々の微生物が知られている。
【０００３】
これらホスホリラーゼとその作用並びに給源微生物については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは未だ知られておらず、その提供が望まれる。
【０００４】
【非特許文献１】『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを提供するとともに本酵素の製造方法及び本酵素を利用したグルコシル転移糖含有糖質並びにその用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決するために未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだすとともに、本酵素の製造方法を確立した。さらに、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られる、新規および／または既知のグルコシル転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立して本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、従来知られていなかったコージビオースを生産し得るホスホリラーゼ、すなわち、コージビオースホスホリラーゼの発見に基づくものである。本発明のコージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、また、ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広く、しかも至適ｐＨはそのｐＨ域内にあり、更に産生微生物からの酵素生産量も高い。したがって、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質の存在下で本発明の酵素を作用させれば、従来公知ではあるが入手の極めて困難であったコージビオース等や、新規のグルコシルソルボース等を始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質を大量且つ安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のコージビオースホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する作用を有する酵素すべてを包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるコージビオースホスホリラーゼとしては、例えば、下記のような作用を示し、理化学的性質を有する酵素を挙げることができる。
（１） 作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン。
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５。
（４） 至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近。
（５） 至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近。
（６） 温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定。
（７） ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０。
（８） 阻害
本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ＋＋で阻害を受ける。
【０００９】
斯かるコージビオースホスホリラーゼとしてさらに具体的には、例えば、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１、２又は３に示すアミノ酸配列を含み、全体としては配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を含む蛋白質や、その機能性誘導体を挙げることができる。ここでいう機能性誘導体とは、上述したようなコージビオースホスホリラーゼとしての作用を実質的に失わない範囲で、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１又は複数を他のアミノ酸で置換したもの、そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数のアミノ酸を付加したもの、そのアミノ酸配列における中間部に１個又は複数のアミノ酸を挿入したもの、そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したもの、及び、そのアミノ酸配列における中間部のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したものを意味する。以上の如き本発明のコージビオースホスホリラーゼは、当該酵素を産生する微生物の培養物など天然の給源から分離したものであっても、当該微生物を変異誘起剤等で処理して得られる変異株の培養物から分離したものであっても、さらには、組換えＤＮＡ技術やペプチド合成法を適用して人工的に合成したものであっても構わない。なお、後に詳述するように当該コージビオースホスホリラーゼは、本発明の製造方法によれば、天然の給源からでも、組換えＤＮＡ技術を適用した場合にもいずれも良好なものを得ることができる。
【００１０】
本発明のＤＮＡは、上述の、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡすべてを包含するものである。斯かるＤＮＡとしては、例えば、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡや、その機能性誘導体を挙げることができる。ここでいう機能性誘導体とは、当該ＤＮＡがコードする蛋白質が、上述したようなコージビオースホスホリラーゼとしての作用を実質的に消失しない範囲で、その塩基配列における塩基の１又は複数を他の塩基で置換したもの、その塩基配列における５′末端及び／又は３′末端に１又は複数の塩基を付加したもの、その塩基配列における中間部に１又は複数の塩基を挿入したもの、その塩基配列における５′末端及び／又は３′末端の塩基が１又は複数欠失したもの、その塩基配列における中間部の塩基が１又は複数欠失したもの、及び、これら塩基配列に相補的な塩基配列のものを意味する。斯かる機能性誘導体としては、例えば、配列表の配列番号５に示す塩基配列において、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を含んでなるＤＮＡが挙げられる。また、本発明のＤＮＡには、以上の如きＤＮＡのみならず、斯かるＤＮＡの５′末端及び／又は３′末端に、当該コージビオースホスホリラーゼをコードする塩基配列以外のＤＮＡ、例えば、開始コドン、終始コドン、シャイン・ダルガノ配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等から選ばれる１又は複数を連結してなるＤＮＡも包含される。
【００１１】
本発明においては、斯かるＤＮＡの給源や調製方法は問わない。例えば、斯かるＤＮＡの天然の給源として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を含む、サーモアナエロビウム属の微生物を挙げることができ、常法により、当該微生物を培養して得られる菌体破砕物よりＤＮＡ画分を回収すれば、本発明のＤＮＡを含むＤＮＡを得ることができる。斯くして得られるＤＮＡはそれ自体でこの発明に用いることもできるが、さらに、本発明のＤＮＡを、当該ＤＮＡ含む断片を自律複製可能なベクターに挿入してなる組換えＤＮＡとして得る場合には、この発明を実施する上で極めて有利なものとなる。当該組換えＤＮＡは、例えば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を上記のようにして得たＤＮＡに適用して遺伝子ライブラリーを作製し、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列、例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配列に基づいて、目的とする組換えＤＮＡを当該遺伝子ライブラリーより選択する、ハイブリダイゼーション法などを適用して得ることができる。斯くして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌等の適宜の宿主に導入して得られる形質転換体を培養したとき増幅され、培養物に通常一般のアルカリ−ＳＤＳ法などを適用すれば、この発明のＤＮＡの所望量を極めて容易に得られることとなる。一方、当該微生物の菌体破砕物又はそこから回収されるＤＮＡを鋳型として用い、配列表における配列番号５に示す塩基配列に基づき化学合成したＤＮＡをプライマーとして用い、常法にしたがってＰＣＲ法を適用したり、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡを化学合成することによっても本発明のＤＮＡは容易に得ることができる。また、先述の機能性誘導体たる本発明のＤＮＡを得るには、例えば、当該組換えＤＮＡに部位特異的変異導入法を適用したり、当該組換えＤＮＡを鋳型に用い、所望の配列に変換せしめた塩基配列を含む化学合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法を適用することによって得ることができる。
【００１２】
また、本発明のＤＮＡは、自律複製可能なベクターに挿入された組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように、本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用のみならず、後に詳述するように、本発明のコージビオースホスホリラーゼを製造する上においても極めて有用である。斯かる組換えＤＮＡは、先述のようにして目的とするＤＮＡが一旦得られれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を適用すれば、所望のベクターに当該ＤＮＡを挿入して得ることは比較的容易である。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターは、適宜の宿主内で自律複製する性質を有しているものであればいずれでもよく、例えば、大腸菌を宿主として用いるｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の宿主を用いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等はいずれも有利に用いることができる。斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法の一例を述べると、先ず、上述のようにして得られる本発明のＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むＤＮＡと、適宜のベクターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ここで用いられる制限酵素としては、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ ＸＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉなどはいずれも有利に用いることができる。また、ＤＮＡ断片とベクター断片の連結の際に、必要に応じて、例えば、適宜の制限酵素認識配列等を有する化学合成したＤＮＡを介在させることも随意である。ＤＮＡの連結には、両者をアニーリングした後細胞内又は細胞外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。
【００１３】
さらに、本発明のＤＮＡは、適宜の宿主微生物に導入された形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、本発明のコージビオースホスホリラーゼや本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用である。斯かる形質転換体の宿主微生物として、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などはいずれも有利に用いることができる。斯かる形質転換体は、通常、先述のようにして得られる組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して得られ、具体的には、宿主が大腸菌の場合には宿主を当該組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。以上に説明した本発明のＤＮＡを得るための個々の方法は、いずれも斯界においては慣用であり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行などに詳述されている。
【００１４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼの製造方法は、当該酵素産生能有する微生物を培養し、培養物から当該酵素を採取することを特徴とするものであり、この製造に用いる微生物の種類や培養方法は問わない。斯かる微生物としては、例えば、サーモアナエロビウム属に属する微生物、より望ましくは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）や、本発明のＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入してなる形質転換体を挙げることができる。
【００１５】
本発明の製造方法において、微生物の培養に用いる培地は、当該微生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化できる物であればよく、例えば、マルトース、トレハロース、デキストリン、澱粉などの糖質、糖蜜、および酵母エキスなどの糖含有物などの天然物なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、培養液の糖質の濃度は、２０ｗ／ｖ％以下が望ましく、菌の生育および増殖からは、通常、５ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが必要に応じて適宜用いられる。
【００１６】
培養には、製造に用いる微生物が良好に生育する条件を適宜に選択して適用すればよい。例えば、先述のサーモアナエロビウム属に属する微生物を用いる場合、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは６０乃至７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくはｐＨ６．５乃至７．５から選ばれる条件で、嫌気的に行われる。培養時間は本微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０乃至５０時間である。一方、先述の形質転換体微生物を用いる場合は、その微生物種にもよるが、通常、温度２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で、培養時間を約１乃至６日間とすればよい。
【００１７】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、通常、培養物の菌体内に認められ、菌体または菌体処理物を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などが採用される。菌体または菌体処理物をそのまま粗酵素液として用いることもできる。さらに必要ならば部分精製した酵素として用いることも可能である。なお、例えば、枯草菌等を宿主に用いた形質転換体の場合には、形質転換に用いた組換えＤＮＡの種類によっては、当該酵素が培養に用いた培地中に産生される場合がある。このような場合には、当該培養上清を粗酵素として用いることもできる。
【００１８】
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタンパク質画分、菌体または菌体処理物の固定化物などがあげられる。酵素としては粗酵素または精製酵素のいずれも用いられ、菌体処理物を、通常、酵素の精製に用いられる方法、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮・透析法などが採用される。
【００１９】
更に、菌体および菌体処理物は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体との結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。
【００２０】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ＣＭ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、ウルトロゲル ＡｃＡ４４樹脂（フランス国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００２１】
本発明のコージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、撹拌し、４０℃に３０分放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。また、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの活性は、基質としてのコージビオースを、それぞれ、マルトース及びトレハロースに代えて用いること以外は全て同一の手順により測定することができる。
【００２２】
本発明のコージビオースホスホリラーゼを利用してグルコシル転移糖含有糖質を製造する酵素反応は、基質として、通常、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体とし、他の適切な糖質、例えばＤ−グルコース、Ｌ−ソルボースなどの単糖類、マルトース、コージビオース、トレハロース、スクロースなどの二糖類、さらには、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどの三糖以上よりなるオリゴ糖類を受容体として、後述するような条件下で当該酵素を作用させる。その結果、用いた受容体に応じて、例えば、コージビオース、グルコシルソルボース、コージビオシルグルコース、コージトリオース、コージビオシルグルコシド、コージビオシルフラクトシド、コージビオシルマルトース、コージビオシルマルトトリオース及びコージビオシルマルトテトラオースを始めとする種々のグルコシル転移糖を生成せしめることができる。なお、これら転移糖のうち、グルコシルソルボース及びコージビオシルフラクトシドは、本発明で初めて見出された新規の糖質である。
【００２３】
糖供与体としてのβ−Ｄ−グルコース−１リン酸は、市販の試薬をそのまま用いてもよいし、また、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で適宜のホスホリラーゼをその基質たる糖質に作用させ、生成させて調製してもよい。具体的には、例えば、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で、コージビオースにコージビオースホスホリラーゼを作用させるか、マルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、あるいはトレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させて調製してもよい。さらにまた、これらホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反応のいずれかを、当該コージビオースホスホリラーゼを利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で行う場合には、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を当該転移糖生成反応系に直接供給できることとなり、製造コストを低減したり、製造工程を簡略化することができるので極めて有利である。受容体としては、上記の如き糖質の２種以上を同時に用いることも有利に実施できる。なお、ここでいう無機質のリン酸とは、オルトリン酸のみならず縮合リン酸をも包含するが、通常、オルトリン酸を用いるのが望ましい。また、ここでいうその塩とは、前記の無機質のリン酸に由来するリン酸イオンの化合物全般を包含するが、通常は、これらのうち、水溶性の高いナトリウム塩やカリウム塩等を用いるのが望ましい。
【００２４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼを用いたグルコシル転移糖生成反応における基質濃度は特に限定されない。一般的には、糖供与体としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を１乃至２０ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限りｗ／ｗ％を％と略称する。）程度の水溶液として、受容体を１乃至２０％程度の水溶液として用いるのが好適である。一方、前述のごとく、適宜のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移糖生成反応と同一反応系内で行う場合には、以下のようにするのが望ましい。すなわち、コージビオースホスホリラーゼの作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、１乃至２０％程度のコージビオース水溶液を用い、更に、０．５乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリン酸塩を共存させる。また、その他のホスホリラーゼの作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、例えば、１乃至２０％程度のマルトース又はトレハロースと、０．５乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリン酸塩を共存させ、更に、用いる糖質に基づき、それぞれ、マルトースホスホリラーゼ又はトレハロースホスホリラーゼを当該糖質１ｇ当たり０．１乃至５０単位程度共存させておくのが望ましい。
【００２５】
反応温度は基質存在下で酵素が失活しない温度、すなわち約７０℃までで行えばよく、好ましくは約１５乃至６５℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、約４．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ約５．０乃至７．５の範囲に調整すればよい。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常基質固形物１ｇ当たり約０．１乃至５０単位の使用量で０．１乃至１００時間程度である。また、前述のように、その他のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反応を、当該コージビオースホスホリラーゼを利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で行う場合には、共存させるホスホリラーゼの安定性に応じて、用いるいずれのホスホリラーゼも失活しない反応温度や反応ｐＨに調整するのが望ましい。
【００２６】
斯くして反応物中には、基質として用いた糖質に応じてグルコシル転移糖が生成する。その生成率は、酵素反応の基質濃度、用いる基質の種類、反応条件などによって異なる。例えば、濃度５％のβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び濃度２５％のソルボースを基質として用いた場合、グルコシルソルボースの生成率は約３０％である。なお、生成率は本明細書を通じて、反応液中の全糖質質量に対する、生成した当該転移糖質量の百分率を意味する。
【００２７】
また、反応物中の当該グルコシル転移糖含量をできるだけ高めるために、反応液中に生成するＤ−グルコースを分解除去する活性を有する酵素源を共存させ、該転移反応を促進することも有利に実施できる。この方法は、前述の、適宜のホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移反応と同一系内で行い糖供与体を直接供給する場合、反応過程で副生するＤ−グルコースを分解除去し、該転移反応を促進するのに特に有利に適用できる。
【００２８】
Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素源としては、Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物、微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物またはＤ−グルコース分解活性を有する酵素などがあげられる。Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物としては、Ｄ−グルコース分解活性が高く、転移糖分解活性を有さないか又はほとんど有さない微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。好ましくは酵母が用いられる。Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼなどいずれも用いることができる。好ましくはグルコースオキシダーゼ又はカタラーゼが用いられる。
【００２９】
以上のようにしてグルコシル転移糖を生成せしめた反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３０】
また、本発明のグルコシル転移糖含有糖質は、酵素反応液から当該グルコシル転移糖を分離、精製して、当該グルコシル転移糖の高含有物とすることもできる。その方法としては、例えば、酵母を用いた発酵法により単糖類を除去する方法（酵母発酵法）、膜濾過法、カラムクロマトグラフィーなどにより、夾雑糖質を分離除去する方法が適宜採用できる。とりわけ、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖質を除去して目的とするグルコシル転移糖高含有画分を採取する方法は、工業的規模で有利に実施できる。この際、公知の固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれを採用することも随意である。
【００３１】
斯くして夾雑糖質を分離した液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３２】
このようにして得られる本発明のグルコシル転移糖含有糖質は、通常グルコシル転移糖を固形物当たり５％以上、望ましくは１０％以上含有している。
【００３３】
このようにして得られる本発明のコージビオースホスホリラーゼにより生成されるグルコシル転移糖含有糖質は、味質良好な甘味を有し、また、浸透圧調節性、保湿性、照付与性、結晶防止性、澱粉老化防止性などの性質を有し、また、抗う蝕性、ビフィズス菌増殖促進性、ミネラル吸収促進性などの機能を有し、広く飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、成形物など、さらには、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品などの各種組成物に有利に利用される。
【００３４】
グルコシル転移糖含有糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができるが、必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、トレハロース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００３５】
また、グルコシル転移糖含有糖質の呈味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００３６】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料に有利に使用できる。
【００３７】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、米飯、麺類、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、また、物性改良などに有利に利用できる。
【００３８】
また、家畜、家禽、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００３９】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分の活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８などのサイトカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分の活性を失うことなく、安定で高品質の健康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００４０】
以上述べたように、本発明でいう組成物は、経口的または非経口的に利用する飲食物、化粧品、医薬品のみならず、それ以外にも、例えば、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品など広範な用途を有する。
【００４１】
また、これら組成物に、本発明のグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。その含有せしめる量は、組成物によっても異なるが、一般的には、グルコシル転移糖として、０．１％以上、望ましくは０．５％以上の量が好適である。
【００４２】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４３】
＜実験１：コージビオースホスホリラーゼの生産＞
炭素源として０．５ｗ／ｖ％グルコースに代えて０．５ｗ／ｖ％トレハロースを用いたこと以外は全て『ＡＴＣＣカタログ・オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション発行、１９９２年）、４５２乃至４５６頁に記載のサーモアナエロビウム・ブロッキイ培地の調製法に従って、培地を１００ｍｌ容耐圧ボトルに１００ｍｌずつ調製した後、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ３５０４７を接種し、６０℃、４８時間静置培養したものを種培養とした。
【００４４】
容量１１ｌのステンレスボトル４本に種培養の場合と同組成の培地を約１０ｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液をこの培地体積当たり１ｖ／ｖ％接種し、温度６０℃で、約４０時間静置培養した。
【００４５】
培養液約４０ｌを遠心分離して、培養菌体９２ｇを得た。菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕した後遠心分離して菌体破砕上清を得た。培養液ｍｌ当たりに換算するとコージビオースホスホリラーゼの活性は、０．１単位／ｍｌであった。
【００４６】
＜実験２：コージビオースホスホリラーゼの精製＞
実験１で得た菌体破砕上清をＵＦ膜濃縮し、コージビオースホスホリラーゼを１ｍｌ当たり約１０単位有する濃縮酵素液約３６０ｍｌを回収した。
【００４７】
得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清（３８０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）にかけた。
【００４８】
本発明のコージビオースホスホリラーゼをＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲルに吸着せしめ、０Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエントにより、カラムより溶出させた。約０．２Ｍの食塩で溶出される酵素活性画分を回収した後、以下の方法で更に精製を行った。１．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍｌ）を行った。吸着したコージビオースホスホリラーゼを、１．５Ｍ硫安から０Ｍ硫安までのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００４９】
続いて、ウルトロゲル ＡｃＡ４４（フランス国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【００５０】
以上の精製手段により得られた精製酵素標品の回収率は、活性換算で、菌体破砕上清に対して約２０％であった。また、精製酵素標品の比活性は蛋白質ｍｇ当たり７１．４単位であった。なお、蛋白質はローリー法に従って牛血清アルブミンを標準にして定量した。
【００５１】
精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００５２】
＜実験３：コージビオースホスホリラーゼの性質＞
実験２で得たコージビオースホスホリラーゼ標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量８３，０００±５，０００ダルトンであった。また、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷカラム（φ７．５ｍｍ×６００ｍｍ，東ソー株式会社製）を用いたゲル濾過法により、分子量を測定した結果、５００，０００±３０，０００ダルトンであった。
【００５３】
精製コージビオースホスホリラーゼを２ｗ／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は４．４±０．５であった。
【００５４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。すなわち、温度の影響を調べる際には、活性測定法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至約８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定法において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至約８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。測定結果を、最大値に対する相対値として表した結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度はｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨは６０℃、３０分間反応で５．５付近であった。本酵素の温度安定性は、当該酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に当該酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。測定結果を最大値に対する相対値として表した結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は６５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であった。また、本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ＋＋で阻害された。
【００５５】
＜実験４：コージビオースホスホリラーゼの部分アミノ酸配列＞
（１）Ｎ末端アミノ酸配列
実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約４０μｇをＮ末端配列分析用の試料とした。Ｎ末端配列はプロテインシーケンサー・モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析した。Ｎ末端から得られた配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列であった。さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に解析したところ、当該酵素はＮ末端に、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００５６】
（２）中間部部分アミノ酸配列
実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、同緩衝液にて１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製、米国）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−０％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液までの１２０分間のリニアグラジエントの条件で行った。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２ペプチド、ＫＰ１５（保持時間６６分）、ＫＰ２３（保持時間９６分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解した。これらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれＮ末端から５残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチドＫＰ１５からは、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列が、またペプチドＫＰ２３からは、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列が得られた。さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に分析したところ、ペプチドＫＰ１５及びペプチドＫＰ２３はそのＮ末端部に、それぞれ、配列表における配列番号７及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００５７】
＜実験５：コージビースホスホリラーゼの糖分解反応における基質特異性＞
Ｄ−グルコース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、ネオトレハロース、セロビオース、メリビオース、コージビオース、イソマルトース、ソホロース、ゲンチオビオース、ニゲロース及びラミナリビオースから選ばれる糖質の水溶液に、実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼを糖質固形物１ｇ当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、５ｍＭリン酸二水素ナトリウム存在下、６０℃、ｐＨ５．５で２４時間作用させた。各反応液中の糖質濃度はいずれも２ｗ／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製；アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略称する。）に供した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝７：３：１（容積比）を用いて室温で１回展開した後、２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して発色させた。両反応液に由来するスポットを比較し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を判定した。結果を表１に示した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１に示されるように、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、コージビオースに極めて高い特異性で作用してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とを生成することが判明した。一方、他の糖質には作用しないことが判明した。
【００６０】
＜実験６：コージビースホスホリラーゼのグルコシル転移糖生成反応における受容体特異性＞
受容体として表２に示す各種単糖類、オリゴ糖類および糖アルコール類のいずれかと、糖供与体としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とを、固形物質量で等量溶解含有している水溶液に、実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位ずつ加え、６０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。なお、受容体及び糖供与体の反応液中の濃度はいずれも１ｗ／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液を、実験５と同様にＴＬＣに供した後発色させた。両反応液に由来するスポットを比較し、反応後に新たに生成したスポットより、転移糖を生成しているかどうかを判定した。また転移糖と判定されたスポットの発色強度を肉眼観察することにより、転移糖の生成率を相対的に評価した。結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示されるように、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボースなどの単糖類、マルトース、コージビオース、トレハロース、スクロースなどの二糖類、及びマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどの三糖以上のオリゴ糖類にグルコシル基を良く転移し、グルコシル転移糖を生成することが判った。なお、β−Ｄ−グルコース−１リン酸にかえてα−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として用いた場合、グルコシル転移糖は得られなかった。
【００６３】
この実験６により、本発明のコージビオースホスホリラーゼによる糖転移反応で生成することが明らかとなったグルコシル転移糖のうちのいくつかの詳細な構造について、次の実験７乃至１２を示しながら説明する。
【００６４】
＜実験７：β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖＞
実験６で得たβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとを基質とした酵素反応液の糖成分をガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＬＣ」と略称する。）で分析した。酵素反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後、トリメチルシリル化したものをＧＬＣの分析試料とした。ＧＬＣカラムは、２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは、窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は、１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出は、水素炎イオン検出器を用いた。
【００６５】
その結果、本発明のコージビオースホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖のピークの保持時間は、既知糖質コージビオースのそれと一致した。本発明のコージビオースホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖は、コージビオースであると判断される。
【００６６】
＜実験８：グルコシルソルボース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるＬ−ソルボースへの糖転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を２．５％、Ｌ−ソルボースを２．５％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びＬ−ソルボースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約２４％であった。本反応液の残り全量を活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５０％まで濃縮して、以下に説明するカラムクロマトグラフィーを行い、当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。
【００６７】
分画用樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。
【００６８】
当該転移糖高含有画分を脱塩、精製し、濃度約４０％に濃縮してオクタデシルシリカゲルを充填したカラム（株式会社ワイエムシー、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｋ ＯＤＳ』）を用いたクロマトグラフィーを行い、当該グルコシル転移糖画分を採取した。採取された画分を濃度約４０％に濃縮し、再度オクタデシルシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供する操作を繰り返し、採取された当該グルコシル転移糖高含有液を脱塩、精製、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０％で得た。実験７で示した方法に準じて本粉末標品をＧＬＣで分析したところ、本標品は固形物当たり約９８％当該グルコシル転移糖を含有していた。
【００６９】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコシル転移糖は酸分解によりほぼ１対１のモル比でＤ−グルコースとＬ−ソルボースを生成することが分かった。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣで分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールが認められた。以上のことは、当該グルコシル転移糖が、Ｄ−グルコースとＬ−ソルボースが１対１のモル比で結合したものであり、更に、Ｄ−グルコースの１位のＯＨ基がその結合に関与していることを示唆している。なお、ソルボースのメチル化誘導体は認められなかったが、これは酸により分解されたためと思われる。
【００７０】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０１．２，１００．４，９９．５，９９．３，７７．１，７５．６，７４．９，７４．５，７４．０，７３．２，７２．２，６６．３，６３．２，６２．１の各値が得られた。この分析データから当該グルコシル転移糖はＤ−グルコースの１位がＬ−ソルボースの５位にα型で結合した２糖類であるグルコシルソルボース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→５）−Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅであることが分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な糖質である。
【００７１】
＜実験９：コージビオシルグルコース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるマルトースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、マルトースを１０％含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びマルトースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約４０％であった。本反応液の残り全量を実験７と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７２】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールおよび２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールが約１対１対１の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているか又は２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と４位のグルコースがともに結合に関与しているか又は４位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、それぞれ１対１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。
【００７３】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．５，９９．４，９９．１，９８．６，９４．６，７９．２，７８．８，７８．６，７８．０，７７．６，７７．３，７７．０，７６．１，７５．６，７５．３，７４．７，７４．２，７４．１，７３．８，７２．７，７２．２，７２．１，６３．６，６３．５，６３．２，６３．１の各値が得られた。この分析データから本グルコシル転移糖の構造はマルトースの非還元末端グルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージビオシルグルコース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→４）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅであることが分かった。
【００７４】
＜実験１０：コージトリオース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるコージビオースへの糖転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、２０％コージビオースを溶解含有する５ｍＭリン酸二水素ナトリウムをｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果反応終了液にはコージビオースとも、また、Ｄ−グルコースやβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約３０％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供したコージビオースの固形物当たり収率約１５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７５】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが約１対２の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているか又は２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、１対２の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。さらに、グルコースの結合様式の可能性を考慮に入れるとこのことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているグルコースと、２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、それぞれ１対１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを強く示唆している。
【００７６】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．３，９９．０，９８．３，９７．６，９６．５，９２．２，８１．３，７８．８，７８．６，７８．５，７７．２，７７．１，７５．７，７５．６，７４．７，７４．６，７４．５，７４．３，７４．２，７４．１，７４．０，７３．９，７２．６，７２．３，７２．２，７２．１，７２．０，６３．６，６３．４，６３．２，６３．１，６３．１，６３．０の各値が得られた。この分析データから本グルコシルコージビオースの構造はコージビオースの非還元末端グルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージトリオース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅであることが分かった。
【００７７】
＜実験１１：コージビオシルグルコシド＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるトレハロースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース及びトレハロースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約７５％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約６５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７８】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが２対１の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているグルコースとが、２対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。
【００７９】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９８．６，９６．２，９３．３，７７．３，７５．８，７５．４，７５．１，７４．８，７４．６，７４．６，７４．０，７３．９，７２．５，７２．３，７２．２，６３．４，６３．４，６３．３の各値が得られた。この分析データから本グルコシルトレハロースの構造はトレハロースにＤ−グルコースが１，２結合した３糖類であるコージビオシルグルコシド（別名セラギノース）、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１，１）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが分かった。
【００８０】
＜実験１２：コージビオシルフラクトシド＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるスクロースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、スクロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びスクロースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約７０％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約５０％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００８１】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコシル転移糖は酸分解によりほぼ２対１のモル比でＤ−グルコースとＤ−フラクトースを生成することが分かった。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチルした後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣで分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが１対１の比率で認められた。以上のことは、当該グルコシル転移糖が、Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースが２対１のモル比で結合したものであり、更に、当該グルコシル転移糖を構成するＤ−グルコースは、１位のＯＨ基のみが結合に関与するものと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与するものとが、１対１のモル比で存在していることを示唆している。なお、Ｄ−フラクトースのメチル化誘導体は認められなかったが、これは酸により分解されたためと思われる。
【００８２】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０７．０，９９．３，９２．５，８４．０，７９．１，７８．５，７６．５，７５．７，７４．９，７４．７，７４．１，７４．０，７２．２，７２．１，６４．９，６４．６，６３．２，６３．１の各値が得られた。この分析データから本グルコシルスクロースの構造はスクロースのグルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージビオシルフラクトシド、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅであることが分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な糖質である。
【００８３】
＜実験１３：急性毒性＞
７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８乃至１２で得たグルコシルソルボース高含有粉末、コージビオシルグルコース高含有粉末、コージトリオース高含有粉末、コージビオシルグルコシド高含有粉末及びコージビオシルフラクトシド高含有粉末を、それぞれ別個に経口投与して急性毒性テストをしたところ、いずれの場合にも投与可能な最大投与量すなわち、５０ｇ／ｋｇマウス体重においても死亡例は認められなかった。従って、本発明のこれら転移糖は、いずれも毒性の極めて低い物質である。
【００８４】
以下、本発明のコージビオースホスホリラーゼ及び当該コージビオースホスホリラーゼをコードする本発明のＤＮＡと、それを利用したグルコシル転移糖含有糖質の製造方法を実施例１乃至１６で、このグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物を実施例１７乃至３２で示す。
【実施例１】
【００８５】
＜酵素液＞
サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ３５０４７を、実験１に示した方法で種培養した後、実験１に示した方法に準じて嫌気ファーメンターに調製した同じ組成の培地に、この培地体積当たり１ｖ／ｖ％の種培養液を接種し、培養温度６５℃で約３０時間培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、０．０８単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃縮液を透析してｍｌ当たりコージビオースホスホリラーゼ活性約８単位を有する酵素液を、もとの培養液の総活性に対して約７０％の収率で得た。
【実施例２】
【００８６】
＜ＤＮＡの調製＞
実験１に示した培地と同一組成の培地１１ｌで、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、実験１に示した方法に準じて６０℃で２４時間培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以下、「ＴＥＳ緩衝液」と略記する。）（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。その後この処理物を−８０℃で１時間保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加えて充分に撹拌し、さらに氷冷後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここに、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて撹拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【実施例３】
【００８７】
＜形質転換体と組換えＤＮＡの調製＞
実施例２の方法で得たＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、ここに制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを約２０単位加え、３７℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により、鎖長約２，０００乃至５，０００塩基対のＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．３μｇと先に得たＤＮＡ断片約３μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結し、得られた組換えＤＮＡで、通常のコンピテントセル法によりストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００８８】
このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約４，０００個をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験４の方法で明らかにした、配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列における第１より７番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＴＴＹＧＡＹＧＡＲＡＡＹＡＡＹＡＴＧＣＣ−３′で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブとしての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定されたコロニーのうち、当該プローブと顕著な会合を示すコロニーを、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用して選択し、当該形質転換体を『ＴＫＰ１』と命名した。
【００８９】
この形質転換体ＴＫＰ１を常法にしたがい、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）に由来する、鎖長３９５６塩基対の、配列表における配列番号９に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。図５に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号９に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験４の方法で確認された本発明のコージビオースホスホリラーゼのＮ末端アミノ酸配列及び中間部部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１乃至３及び配列番号６乃至８に示すアミノ酸配列とを比較したところ、配列表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９に併記したアミノ酸配列における第１乃至５番目、第５９０乃至５９４番目及び第３５７乃至３６１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号６、７及び８に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号９に併記したアミノ酸配列における第１乃至１０番目、第５９０乃至５９９番目及び第３５７乃至３６６番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のコージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はサーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）においては、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＴＫＰ１』と命名した。
【実施例４】
【００９０】
＜形質転換体によるコージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び５ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例３の方法で得た形質転換体ＴＫＰ１を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養液とした。次に１０ｌ容ファーメンターに、種培養に用いたのと同一組成の培地を、種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養液７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を採取した。その上清を１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した後、透析液中のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約５００単位の当該酵素が産生されていた。
【００９１】
第一の対照として、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第二の対照として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、アンピシリンを含有しないこと以外は上述の形質転換体の場合と同一組成の培地を用い、実験１に示した方法に準じて６０℃で静置培養し、さらに上述の形質転換体の場合と同じく培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第一の対照の透析物には当該酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の透析物には当該酵素活性が認められたが、この場合は、培養物１ｌ当たり約１００単位であり、形質転換体ＴＫＰ１の場合に比較して明らかに低い値であった。
【００９２】
この実施例４の方法で得た透析物を、さらに実験２に示した方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素を実験３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量８３，０００±５，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量５００，０００±３０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点４．４±０．５、コージビオースホスホリラーゼ活性の至適温度６５℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性は６５℃付近まで、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であり、実験１乃至２に示した方法で調製された当該酵素の理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によっても良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性も有意に向上することを示している。
【実施例５】
【００９３】
＜酵素液＞
実施例３に示した方法で得た形質転換体ＴＫＰ１を実施例４に示した方法で培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、約０．５単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃縮液を透析してｍｌ当たりコージビオースホスホリラーゼ活性約１０単位を有する酵素液を、もとの培養液の総活性に対して約７０％の収率で得た。
【実施例６】
【００９４】
＜コージビオース含有糖液＞
マルトースを５％含む２５ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５単位、実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させた。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【００９５】
本品は、コージビオースを固形物当たり約３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【００９６】
＜コージビオース高含有粉末＞
実施例６の方法で反応、精製した固形物当たり約３０％のコージビオースを含有する糖液を原料として固形物濃度約２０％に調整し、これにグルコアミラーゼを固形物１ｇ当たり５単位加えてｐＨ４．５、４０℃で１６時間反応させ残存するマルトースを分解した。１００℃で３０分加熱して反応を停止した後、濃度約４０％まで濃縮した。本糖液中のコージビオース含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、コージビオース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、コージビオース高含有粉末を原料固形物当たり収率約２０％で得た。
【００９７】
本品は、固形物当たり約９０％のコージビオースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例８】
【００９８】
＜グルコシルソルボース含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸及びＬ−ソルボースをそれぞれ５％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のグルコシルソルボース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【００９９】
本品は、固形物当たりグルコシルソルボースを約３０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例９】
【０１００】
＜グルコシルソルボース高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％及びＬ−ソルボースを１０％含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり３０単位になるように加えて、６０℃で７２時間反応させた。反応後冷却し、市販パン酵母を固形物質量当たり湿質量で５％になるように加え、１規定の水酸化ナトリウム溶液を用いて該反応液をｐＨ５乃至６に制御しながら２７℃で６時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、反応を停止させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のグルコシルソルボース含有糖液を原料固形物当たり収率約６５％で得た。
【０１０１】
本品は、固形物当たりグルコシルソルボースを約４０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【０１０２】
＜グルコシルソルボース高含有粉末＞
実施例９の方法で反応、精製した固形物当たり約４０％のグルコシルソルボースを含有する糖液を原料として、これを固形物濃度約４５％に調整した。本糖液中のグルコシルソルボース含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、グルコシルソルボース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、グルコシルソルボース高含有粉末を原料固形物当たり収率約２５％で得た。
【０１０３】
本品は、固形物当たり約９０％のグルコシルソルボースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１１】
【０１０４】
＜コージビオシルフラクトシド含有糖液＞
コージビオースを１０％及びスクロースを１０％含む水溶液を調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり４０単位になるように加え、５ｍＭリン酸二水素ナトリウム塩存在下ｐＨ５．０、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルフラクトシド含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１０５】
本品は、固形物当たり約５５％のコージビオシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１２】
【０１０６】
＜コージビオシルフラクトシド高含有粉末＞
実施例１１の方法で反応、精製した、固形物当たり約５５％のコージビオシルフラクトシドを含有する糖液を原料として、これを固形物濃度約４５％に調整した。本糖液中のコージビオシルフラクトシド含有率を高めるため、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名『ダウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ型）を用いた以外は、実施例１０の方法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、コージビオシルフラクトシド高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、コージビオシルフラクトシド高含有粉末を原料固形物当たり収率約４０％で得た。
【０１０７】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１３】
【０１０８】
＜コージビオシルグルコース含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を１０％及びマルトースを２０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１０９】
本品は、固形物当たり約４５％のコージビオシルグルコースを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１４】
【０１１０】
＜コージビオシルグルコシド高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形物当たり収率約６０％で得た。
【０１１１】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１５】
【０１１２】
＜コージビオース含有糖液＞
マルトースを５％含む２５ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５単位、実施例５の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させた。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１１３】
本品は、コージビオースを固形物当たり約３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１６】
【０１１４】
＜コージビオシルグルコシド高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例５の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形物当たり収率約６０％で得た。
【０１１５】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１７】
【０１１６】
＜甘味剤＞
実施例１０の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末１質量部に対し、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社製造、商品名α−Ｇスィート）０．０５質量部を加えて均一に混合して粉末甘味剤を製造した。本品は、上品な甘味で、砂糖の約２倍の甘味を有し、カロリーは甘味度当たり砂糖の約２分の１となる。したがって、この甘味剤は低カロリー甘味料として、カロリーの摂取を制限している人、例えば、肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物に対する味付けに好適である。また、この甘味剤は、虫歯誘発菌による酸の生成も少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことにより、虫歯を抑制する飲食物などの味付けにも好適である。
【実施例１８】
【０１１７】
＜ハードキャンディー＞
実施例８の方法で得たグルコシルソルボース含有糖液３０質量部に対し、還元麦芽糖水飴（水分２５％）８０質量部を加えて混合溶解し、減圧下で水分が２％未満になるまで濃縮し、これにクエン酸１質量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、次いで、常法に従って成形しハードキャンディーを製造した。本品は、上品な甘味を有し、吸湿性少なく、ダレを起こしにくい歯切れの良いハードキャンディーである。
【実施例１９】
【０１１８】
＜チューインガム＞
実施例１２の方法で得たコージビオシルフラクトシド高含有粉末４質量部に対し、グルコース３質量部および、柔らかくなる程度に加熱溶融したガムベース２質量部を加えて混合し、さらに適量のハッカ香料を混合した後、常法に従ってロールにより練り合わせ成形することによってチューインガムを製造した。本品は、テクスチャー、風味ともに優れた製品である。
【実施例２０】
【０１１９】
＜チョコレート＞
実施例７の方法で得たコージビオース高含有粉末１５質量部に対し、カカオペースト４０質量部、カカオバター１０質量部、蔗糖１０質量部及び全脂粉乳１５質量部を加えて混合し、レファイナーを通した。そして粒度を下げた後、コンチェに入れ、レシチン０．５質量部を加えて、５０℃で二昼夜練り上げた。次いで、常法に従い成型機に流し込み成型固化してチョコレートを製造した。本品は、ファットブルーム、シュガーブルームの恐れがなく、舌にのせた時の融け具合、風味ともに良好である。
【実施例２１】
【０１２０】
＜カスタードクリーム＞
実施例１０の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末４００質量部に対し、コーンスターチ５００質量部、マルトース５００質量部及び食塩５質量部を加え、篩いを通して充分に混合し、さらに鶏卵１，４００質量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳５，０００質量部を徐々に加え、さらにこれをとろ火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却して少量のバニラ香料を加えることによりカスタードクリームを製造した。本品は、なめらかで光沢を有し、甘味が強すぎず美味である。
【実施例２２】
【０１２１】
＜ういろう＞
実施例１１の方法で得たコージビオシルフラクトシド含有糖液９０質量部に対し、米粉９０質量部、コーンスターチ２０質量部、砂糖２０質量部、抹茶粉末１質量部及び水の適量を加えて混練した後、これを容器に入れて６０分間蒸して抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たり良好で、風味もよいものであった。また、澱粉の老化も抑制され、長時間安定であった。
【実施例２３】
【０１２２】
＜べったら漬＞
実施例１３の方法で得たコージビオシルグルコース含有糖液１質量部に対し、マルトース３質量部、甘草製剤０．０５質量部、リンゴ酸０．００８質量部、グルタミン酸ナトリウム０．０７質量部、ソルビン酸カリウム０．０３質量部及びプルラン０．２質量部を均一に混合してべったら漬の素を製造した。大根３０ｋｇを常法に従って食塩により下漬けし、次いで砂糖で中漬けしたものを、ここで得たべったら漬の素４ｋｇで調製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本品は、色艶、香気ともに良好で、適度の甘味を有し歯切れも良かった。
【実施例２４】
【０１２３】
＜乳酸菌飲料＞
実施例６の方法で得たコージビオース含有糖液１３０質量部に対し、脱脂粉乳１７５質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標「乳果オリゴ」）５０質量部を、水１，１５０質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法にしたがって、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【実施例２５】
【０１２４】
＜合成酒＞
３０ｖ／ｖ％アルコール水溶液６５１８質量部（温度１５℃の場合）、７０％ぶどう糖水溶液６００質量部、実施例６の方法で得たコージビオース含有糖液５０質量部、コハク酸１１．１質量部、７５％乳酸水溶液３．６６質量部、グルタミン酸ナトリウム２．３質量部、グリシン１．２質量部、アラニン１．２質量部、コハク酸ナトリウム２．２２質量部、食塩１．６質量部、天然塩１．４質量部及び水２５００質量部を混合して、アルコール含量約２０ｖ／ｖ％の原酒を得た。これを水で希釈して、アルコール含量１５乃至１６ｖ／ｖ％の製品を得た。本品は、まろやかな甘みと上品な風味を有し美味である。
【実施例２６】
【０１２５】
＜乳液＞
実施例９の方法で得たグルコシルソルボース高含有糖液３．５質量部に対し、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル０．５質量部、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール１質量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１質量部、ベヘニルアルコール０．５質量部、アボガド油１質量部、α−グリコシルルチン１質量部、ビタミンＥ及び防腐剤の適量を加え、常法に従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、カルボキシビニルポリマー０．１質量部及び精製水８５．３質量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、乳液を製造した。本品は、保湿性に優れ、日焼け止め、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２７】
【０１２６】
＜スキンクリーム＞
実験１２の方法で得たコージビオシルフラクトシド高含有粉末４質量部に対し、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、α−グリコシルルチン２質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリル１０質量部及び防腐剤の適量を加え、常法に従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、及び精製水６６質量部を更に加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、香料の適量を加えて撹拌混合し、スキンクリームを製造した。本品は、伸びのよいクリームで、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２８】
【０１２７】
＜練歯磨＞
実施例１４の方法で得たコージビオシルグルコシド高含有糖液１５質量部に対し、第二リン酸カルシウム質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、サッカリン０．０２質量部、防腐剤０．０５質量部及び水１３質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、光沢、洗浄力も良好で、練歯磨として好適である。
【実施例２９】
【０１２８】
＜経管栄養剤＞
実施例７の方法で得たコージビオース高含有粉末８０質量部と、乾燥卵黄１９０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８５質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製した。この配合物２５ｇずつをラミネートアルミ製小包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃３００ｍｌの水に溶解して栄養補給液とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃などへ投与して使用する。
【実施例３０】
【０１２９】
＜錠剤＞
実験８の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末４質量部に対し、アスピリン５０質量部、マルトース１０質量部及びコーンスターチ４質量部を加え、均一に混合した後、直径１２ｍｍ、２０Ｒ杆を用いて１錠６８０ｍｇ、錠剤の厚さ５．２５ｍｍ、硬度８ｋｇ±１ｋｇで打錠した。本品は、適度の甘味を有する飲みやすい錠剤である。
【実施例３１】
【０１３０】
＜いちごジャム＞
生いちご１５０質量部、蔗糖６０質量部、マルトース２０質量部、実施例１５の方法で得たコージビオース含有糖液４０質量部、ペクチン５質量部及びクエン酸１質量部を鍋で煮詰め、瓶詰めして製品を得た。本品は風味、色調とも良好なジャムである。
【実施例３２】
【０１３１】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例１６の方法で得たコージビオシルグルコシド高含有糖液３質量部及び蔗糖１質量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
叙上のように本発明は、従来知られていなかったコージビオースを生産し得るホスホリラーゼ、すなわち、コージビオースホスホリラーゼの発見に基づくものである。本発明のコージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、また、ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広く、しかも至適ｐＨはそのｐＨ域内にあり、更に産生微生物からの酵素生産量も高い。したがって、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質の存在下で本発明の酵素を作用させれば、従来公知ではあるが入手の極めて困難であったコージビオース等や、新規のグルコシルソルボース等を始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質を大量且つ安価に製造することができる。
【０１３３】
この様にして製造されるグルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質は、上品な甘味の甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤などとして、さらには、栄養補給剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に供しうることが大きな特徴であることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義のある発明といえる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】本発明の組換えＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。図中矢印は、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規酵素コージビオースホスホリラーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、無機質のリン酸および／またはその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「無機リン酸」と略称する。）の存在下コージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩（以下、不都合が生じない限り、本明細書を通じて「β−Ｄ−グルコース−１リン酸」と略称する。）を生成し、また、逆に、β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースからコージビオースと無機リン酸を生成する作用を示す新規酵素コージビオースホスホリラーゼとその製造方法、並びに、このコージビオースホスホリラーゼを用いて製造されるグルコシル転移糖含有糖質、さらには、これら糖質を含有せしめた組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マルトース、トレハロースなどのオリゴ糖とその機能が注目され、これらオリゴ糖の多様な生産方法が各方面から広く検討されるようになってきた。これらオリゴ糖を生産する方法としてマルトースホスホリラーゼ、トレハロースホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼ、セロビオースホスホリラーゼ、ラミナリビオースホスホリラーゼなど種々のホスホリラーゼの利用が知られている。また、これらホスホリラーゼの給源としては、種々の微生物が知られている。
【０００３】
これらホスホリラーゼとその作用並びに給源微生物については非特許文献１にまとめられている。しかしながら、コージビオースを生成しうるホスホリラーゼは未だ知られておらず、その提供が望まれる。
【０００４】
【非特許文献１】『酵素ハンドブック』朝倉書店（１９８２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを提供するとともに本酵素の製造方法及び本酵素を利用したグルコシル転移糖含有糖質並びにその用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題を解決するために未知のコージビオースホスホリラーゼを求めて、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、サーモアナエロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）属に属する微生物サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ ３５０４７）が、新規酵素コージビオースホスホリラーゼを産生することを見いだすとともに、本酵素の製造方法を確立した。さらに、本酵素をβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質共存下で作用させることにより得られる、新規および／または既知のグルコシル転移糖含有糖質並びに該糖質を含有せしめた組成物の製造方法を確立して本発明を完成した。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、従来知られていなかったコージビオースを生産し得るホスホリラーゼ、すなわち、コージビオースホスホリラーゼの発見に基づくものである。本発明のコージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、また、ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広く、しかも至適ｐＨはそのｐＨ域内にあり、更に産生微生物からの酵素生産量も高い。したがって、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質の存在下で本発明の酵素を作用させれば、従来公知ではあるが入手の極めて困難であったコージビオース等や、新規のグルコシルソルボース等を始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質を大量且つ安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のコージビオースホスホリラーゼは、無機リン酸の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する作用を有する酵素すべてを包含するものであり、その出所・由来は問わない。斯かるコージビオースホスホリラーゼとしては、例えば、下記のような作用を示し、理化学的性質を有する酵素を挙げることができる。
（１） 作用
（ａ）無機リン酸存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を生成する。
（ｂ）β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸を生成し、さらにβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する。
（２） 分子量
ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、８３，０００±５，０００ダルトン。
（３） 等電点
アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ４．４±０．５。
（４） 至適温度
ｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近。
（５） 至適ｐＨ
６０℃、３０分間反応でｐＨ５．５付近。
（６） 温度安定性
ｐＨ５．５、１時間保持の条件で６５℃付近まで安定。
（７） ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件でｐＨ約５．５乃至１０．０。
（８） 阻害
本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ＋＋で阻害を受ける。
【０００９】
斯かるコージビオースホスホリラーゼとしてさらに具体的には、例えば、部分アミノ酸配列として配列表における配列番号１、２又は３に示すアミノ酸配列を含み、全体としては配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を含む蛋白質や、その機能性誘導体を挙げることができる。ここでいう機能性誘導体とは、上述したようなコージビオースホスホリラーゼとしての作用を実質的に失わない範囲で、そのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１又は複数を他のアミノ酸で置換したもの、そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端に１個又は複数のアミノ酸を付加したもの、そのアミノ酸配列における中間部に１個又は複数のアミノ酸を挿入したもの、そのアミノ酸配列におけるＮ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したもの、及び、そのアミノ酸配列における中間部のアミノ酸が１個又は２個以上欠失したものを意味する。以上の如き本発明のコージビオースホスホリラーゼは、当該酵素を産生する微生物の培養物など天然の給源から分離したものであっても、当該微生物を変異誘起剤等で処理して得られる変異株の培養物から分離したものであっても、さらには、組換えＤＮＡ技術やペプチド合成法を適用して人工的に合成したものであっても構わない。なお、後に詳述するように当該コージビオースホスホリラーゼは、本発明の製造方法によれば、天然の給源からでも、組換えＤＮＡ技術を適用した場合にもいずれも良好なものを得ることができる。
【００１０】
本発明のＤＮＡは、上述の、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡすべてを包含するものである。斯かるＤＮＡとしては、例えば、配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列をコードする、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡや、その機能性誘導体を挙げることができる。ここでいう機能性誘導体とは、当該ＤＮＡがコードする蛋白質が、上述したようなコージビオースホスホリラーゼとしての作用を実質的に消失しない範囲で、その塩基配列における塩基の１又は複数を他の塩基で置換したもの、その塩基配列における５′末端及び／又は３′末端に１又は複数の塩基を付加したもの、その塩基配列における中間部に１又は複数の塩基を挿入したもの、その塩基配列における５′末端及び／又は３′末端の塩基が１又は複数欠失したもの、その塩基配列における中間部の塩基が１又は複数欠失したもの、及び、これら塩基配列に相補的な塩基配列のものを意味する。斯かる機能性誘導体としては、例えば、配列表の配列番号５に示す塩基配列において、それがコードするアミノ酸配列を変更することなく、塩基の１又は複数を他の塩基で置換した塩基配列を含んでなるＤＮＡが挙げられる。また、本発明のＤＮＡには、以上の如きＤＮＡのみならず、斯かるＤＮＡの５′末端及び／又は３′末端に、当該コージビオースホスホリラーゼをコードする塩基配列以外のＤＮＡ、例えば、開始コドン、終始コドン、シャイン・ダルガノ配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、適宜の制限酵素による認識配列、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等から選ばれる１又は複数を連結してなるＤＮＡも包含される。
【００１１】
本発明においては、斯かるＤＮＡの給源や調製方法は問わない。例えば、斯かるＤＮＡの天然の給源として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を含む、サーモアナエロビウム属の微生物を挙げることができ、常法により、当該微生物を培養して得られる菌体破砕物よりＤＮＡ画分を回収すれば、本発明のＤＮＡを含むＤＮＡを得ることができる。斯くして得られるＤＮＡはそれ自体でこの発明に用いることもできるが、さらに、本発明のＤＮＡを、当該ＤＮＡ含む断片を自律複製可能なベクターに挿入してなる組換えＤＮＡとして得る場合には、この発明を実施する上で極めて有利なものとなる。当該組換えＤＮＡは、例えば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を上記のようにして得たＤＮＡに適用して遺伝子ライブラリーを作製し、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列、例えば、配列表における配列番号５に示す塩基配列に基づいて、目的とする組換えＤＮＡを当該遺伝子ライブラリーより選択する、ハイブリダイゼーション法などを適用して得ることができる。斯くして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌等の適宜の宿主に導入して得られる形質転換体を培養したとき増幅され、培養物に通常一般のアルカリ−ＳＤＳ法などを適用すれば、この発明のＤＮＡの所望量を極めて容易に得られることとなる。一方、当該微生物の菌体破砕物又はそこから回収されるＤＮＡを鋳型として用い、配列表における配列番号５に示す塩基配列に基づき化学合成したＤＮＡをプライマーとして用い、常法にしたがってＰＣＲ法を適用したり、配列表における配列番号５に示す塩基配列を含むＤＮＡを化学合成することによっても本発明のＤＮＡは容易に得ることができる。また、先述の機能性誘導体たる本発明のＤＮＡを得るには、例えば、当該組換えＤＮＡに部位特異的変異導入法を適用したり、当該組換えＤＮＡを鋳型に用い、所望の配列に変換せしめた塩基配列を含む化学合成したＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ法を適用することによって得ることができる。
【００１２】
また、本発明のＤＮＡは、自律複製可能なベクターに挿入された組換えＤＮＡとしての形態のものをも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように、本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用のみならず、後に詳述するように、本発明のコージビオースホスホリラーゼを製造する上においても極めて有用である。斯かる組換えＤＮＡは、先述のようにして目的とするＤＮＡが一旦得られれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術を適用すれば、所望のベクターに当該ＤＮＡを挿入して得ることは比較的容易である。この発明のＤＮＡを挿入し得るベクターは、適宜の宿主内で自律複製する性質を有しているものであればいずれでもよく、例えば、大腸菌を宿主として用いるｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の宿主を用いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等はいずれも有利に用いることができる。斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法の一例を述べると、先ず、上述のようにして得られる本発明のＤＮＡ又は当該ＤＮＡを含むＤＮＡと、適宜のベクターとを制限酵素により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ここで用いられる制限酵素としては、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ ＸＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉなどはいずれも有利に用いることができる。また、ＤＮＡ断片とベクター断片の連結の際に、必要に応じて、例えば、適宜の制限酵素認識配列等を有する化学合成したＤＮＡを介在させることも随意である。ＤＮＡの連結には、両者をアニーリングした後細胞内又は細胞外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。
【００１３】
さらに、本発明のＤＮＡは、適宜の宿主微生物に導入された形質転換体としての形態のものをも包含する。斯かる形質転換体は、本発明のコージビオースホスホリラーゼや本発明のＤＮＡを得る上で極めて有用である。斯かる形質転換体の宿主微生物として、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母などはいずれも有利に用いることができる。斯かる形質転換体は、通常、先述のようにして得られる組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して得られ、具体的には、宿主が大腸菌の場合には宿主を当該組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。以上に説明した本発明のＤＮＡを得るための個々の方法は、いずれも斯界においては慣用であり、例えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行などに詳述されている。
【００１４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼの製造方法は、当該酵素産生能有する微生物を培養し、培養物から当該酵素を採取することを特徴とするものであり、この製造に用いる微生物の種類や培養方法は問わない。斯かる微生物としては、例えば、サーモアナエロビウム属に属する微生物、より望ましくは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）や、本発明のＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入してなる形質転換体を挙げることができる。
【００１５】
本発明の製造方法において、微生物の培養に用いる培地は、当該微生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が資化できる物であればよく、例えば、マルトース、トレハロース、デキストリン、澱粉などの糖質、糖蜜、および酵母エキスなどの糖含有物などの天然物なども使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択される。例えば、培養液の糖質の濃度は、２０ｗ／ｖ％以下が望ましく、菌の生育および増殖からは、通常、５ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが必要に応じて適宜用いられる。
【００１６】
培養には、製造に用いる微生物が良好に生育する条件を適宜に選択して適用すればよい。例えば、先述のサーモアナエロビウム属に属する微生物を用いる場合、通常、温度５０乃至８０℃、好ましくは６０乃至７０℃、ｐＨ５乃至８、好ましくはｐＨ６．５乃至７．５から選ばれる条件で、嫌気的に行われる。培養時間は本微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０乃至５０時間である。一方、先述の形質転換体微生物を用いる場合は、その微生物種にもよるが、通常、温度２０乃至６５℃、ｐＨ２乃至９に保ちつつ、通気撹拌などによる好気的条件下で、培養時間を約１乃至６日間とすればよい。
【００１７】
このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、通常、培養物の菌体内に認められ、菌体または菌体処理物を粗酵素として回収すればよく、また、培養物全体を粗酵素として用いることもできる。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるいは、プレコートすることにより濾過分離する手段、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などが採用される。菌体または菌体処理物をそのまま粗酵素液として用いることもできる。さらに必要ならば部分精製した酵素として用いることも可能である。なお、例えば、枯草菌等を宿主に用いた形質転換体の場合には、形質転換に用いた組換えＤＮＡの種類によっては、当該酵素が培養に用いた培地中に産生される場合がある。このような場合には、当該培養上清を粗酵素として用いることもできる。
【００１８】
菌体処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波破砕物、機械的摩砕処理物、機械的圧力処理物、菌体のタンパク質画分、菌体または菌体処理物の固定化物などがあげられる。酵素としては粗酵素または精製酵素のいずれも用いられ、菌体処理物を、通常、酵素の精製に用いられる方法、例えば、硫安塩析法、アセトンおよびアルコール沈殿法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮・透析法などが採用される。
【００１９】
更に、菌体および菌体処理物は、通常の手段で固定化することもできる。例えば、イオン交換体との結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用される。
【００２０】
粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の手段によって精製することもできる。一例として、菌体処理物を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、続いて、ＣＭ−トヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパール樹脂（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、ウルトロゲル ＡｃＡ４４樹脂（フランス国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーにて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。
【００２１】
本発明のコージビオースホスホリラーゼの活性は次のようにして測定する。基質として１．０ｗ／ｖ％コージビオースを含む２０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加え、６０℃で３０分間反応させた後、反応液０．５ｍｌを１００℃、１０分間加熱し反応を停止させる。この反応停止液にＤ−グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ試薬０．５ｍｌを添加、撹拌し、４０℃に３０分放置した後、５Ｎ塩酸２．５ｍｌを添加、攪拌し、５２５ｎｍにおける吸光度を測定する。酵素活性１単位は、前記反応条件下で、１分間当たり１μｍｏｌのＤ−グルコースを生成する酵素量とする。また、マルトースホスホリラーゼ及びトレハロースホスホリラーゼの活性は、基質としてのコージビオースを、それぞれ、マルトース及びトレハロースに代えて用いること以外は全て同一の手順により測定することができる。
【００２２】
本発明のコージビオースホスホリラーゼを利用してグルコシル転移糖含有糖質を製造する酵素反応は、基質として、通常、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体とし、他の適切な糖質、例えばＤ−グルコース、Ｌ−ソルボースなどの単糖類、マルトース、コージビオース、トレハロース、スクロースなどの二糖類、さらには、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどの三糖以上よりなるオリゴ糖類を受容体として、後述するような条件下で当該酵素を作用させる。その結果、用いた受容体に応じて、例えば、コージビオース、グルコシルソルボース、コージビオシルグルコース、コージトリオース、コージビオシルグルコシド、コージビオシルフラクトシド、コージビオシルマルトース、コージビオシルマルトトリオース及びコージビオシルマルトテトラオースを始めとする種々のグルコシル転移糖を生成せしめることができる。なお、これら転移糖のうち、グルコシルソルボース及びコージビオシルフラクトシドは、本発明で初めて見出された新規の糖質である。
【００２３】
糖供与体としてのβ−Ｄ−グルコース−１リン酸は、市販の試薬をそのまま用いてもよいし、また、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で適宜のホスホリラーゼをその基質たる糖質に作用させ、生成させて調製してもよい。具体的には、例えば、無機質のリン酸及び／又はその塩の存在下で、コージビオースにコージビオースホスホリラーゼを作用させるか、マルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、あるいはトレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させて調製してもよい。さらにまた、これらホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反応のいずれかを、当該コージビオースホスホリラーゼを利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で行う場合には、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を当該転移糖生成反応系に直接供給できることとなり、製造コストを低減したり、製造工程を簡略化することができるので極めて有利である。受容体としては、上記の如き糖質の２種以上を同時に用いることも有利に実施できる。なお、ここでいう無機質のリン酸とは、オルトリン酸のみならず縮合リン酸をも包含するが、通常、オルトリン酸を用いるのが望ましい。また、ここでいうその塩とは、前記の無機質のリン酸に由来するリン酸イオンの化合物全般を包含するが、通常は、これらのうち、水溶性の高いナトリウム塩やカリウム塩等を用いるのが望ましい。
【００２４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼを用いたグルコシル転移糖生成反応における基質濃度は特に限定されない。一般的には、糖供与体としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸を１乃至２０ｗ／ｗ％（以下、本明細書では、特にことわらない限りｗ／ｗ％を％と略称する。）程度の水溶液として、受容体を１乃至２０％程度の水溶液として用いるのが好適である。一方、前述のごとく、適宜のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移糖生成反応と同一反応系内で行う場合には、以下のようにするのが望ましい。すなわち、コージビオースホスホリラーゼの作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、１乃至２０％程度のコージビオース水溶液を用い、更に、０．５乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリン酸塩を共存させる。また、その他のホスホリラーゼの作用による場合は、当該グルコシル転移反応の基質たるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸に代えて、例えば、１乃至２０％程度のマルトース又はトレハロースと、０．５乃至２０ｍＭ程度のリン酸二水素ナトリウムなどのリン酸塩を共存させ、更に、用いる糖質に基づき、それぞれ、マルトースホスホリラーゼ又はトレハロースホスホリラーゼを当該糖質１ｇ当たり０．１乃至５０単位程度共存させておくのが望ましい。
【００２５】
反応温度は基質存在下で酵素が失活しない温度、すなわち約７０℃までで行えばよく、好ましくは約１５乃至６５℃の範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、約４．０乃至９．０の範囲、好ましくはｐＨ約５．０乃至７．５の範囲に調整すればよい。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常基質固形物１ｇ当たり約０．１乃至５０単位の使用量で０．１乃至１００時間程度である。また、前述のように、その他のホスホリラーゼの作用によるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸の生成反応を、当該コージビオースホスホリラーゼを利用したグルコシル転移糖生成反応と同一の反応系内で行う場合には、共存させるホスホリラーゼの安定性に応じて、用いるいずれのホスホリラーゼも失活しない反応温度や反応ｐＨに調整するのが望ましい。
【００２６】
斯くして反応物中には、基質として用いた糖質に応じてグルコシル転移糖が生成する。その生成率は、酵素反応の基質濃度、用いる基質の種類、反応条件などによって異なる。例えば、濃度５％のβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び濃度２５％のソルボースを基質として用いた場合、グルコシルソルボースの生成率は約３０％である。なお、生成率は本明細書を通じて、反応液中の全糖質質量に対する、生成した当該転移糖質量の百分率を意味する。
【００２７】
また、反応物中の当該グルコシル転移糖含量をできるだけ高めるために、反応液中に生成するＤ−グルコースを分解除去する活性を有する酵素源を共存させ、該転移反応を促進することも有利に実施できる。この方法は、前述の、適宜のホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸生成反応を当該グルコシル転移反応と同一系内で行い糖供与体を直接供給する場合、反応過程で副生するＤ−グルコースを分解除去し、該転移反応を促進するのに特に有利に適用できる。
【００２８】
Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素源としては、Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物、微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物またはＤ−グルコース分解活性を有する酵素などがあげられる。Ｄ−グルコース分解活性を有する微生物としては、Ｄ−グルコース分解活性が高く、転移糖分解活性を有さないか又はほとんど有さない微生物であればいずれの微生物でも用いることができる。好ましくは酵母が用いられる。Ｄ−グルコース分解活性を有する酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼなどいずれも用いることができる。好ましくはグルコースオキシダーゼ又はカタラーゼが用いられる。
【００２９】
以上のようにしてグルコシル転移糖を生成せしめた反応液は、常法により、瀘過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３０】
また、本発明のグルコシル転移糖含有糖質は、酵素反応液から当該グルコシル転移糖を分離、精製して、当該グルコシル転移糖の高含有物とすることもできる。その方法としては、例えば、酵母を用いた発酵法により単糖類を除去する方法（酵母発酵法）、膜濾過法、カラムクロマトグラフィーなどにより、夾雑糖質を分離除去する方法が適宜採用できる。とりわけ、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖質を除去して目的とするグルコシル転移糖高含有画分を採取する方法は、工業的規模で有利に実施できる。この際、公知の固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれを採用することも随意である。
【００３１】
斯くして夾雑糖質を分離した液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩などの精製工程を経た後、濃縮し、シラップ状製品にする。必要ならば、更に、噴霧乾燥などの方法で乾燥して粉末状製品にすることも随意である。
【００３２】
このようにして得られる本発明のグルコシル転移糖含有糖質は、通常グルコシル転移糖を固形物当たり５％以上、望ましくは１０％以上含有している。
【００３３】
このようにして得られる本発明のコージビオースホスホリラーゼにより生成されるグルコシル転移糖含有糖質は、味質良好な甘味を有し、また、浸透圧調節性、保湿性、照付与性、結晶防止性、澱粉老化防止性などの性質を有し、また、抗う蝕性、ビフィズス菌増殖促進性、ミネラル吸収促進性などの機能を有し、広く飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、成形物など、さらには、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品などの各種組成物に有利に利用される。
【００３４】
グルコシル転移糖含有糖質は、そのまま甘味付けのための調味料として使用することができるが、必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マルトース、トレハロース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の一種または二種以上の適量と混合して使用してもよく、また必要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量剤と混合して使用することもできる。
【００３５】
また、グルコシル転移糖含有糖質の呈味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００３６】
例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料に有利に使用できる。
【００３７】
また、例えば、せんべい、あられ、おこし、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、米飯、麺類、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、また、物性改良などに有利に利用できる。
【００３８】
また、家畜、家禽、魚などの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、または呈味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有利に利用できる。
【００３９】
品質改良剤、安定剤としては、有効成分の活性などを失い易い各種生理活性物質またはこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツモア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファクター、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン６、インターロイキン１２、インターロイキン１５、インターロイキン１８などのサイトカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソイド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフェロール、などのビタミン含有液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテアーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポリスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母などの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、その有効成分の活性を失うことなく、安定で高品質の健康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００４０】
以上述べたように、本発明でいう組成物は、経口的または非経口的に利用する飲食物、化粧品、医薬品のみならず、それ以外にも、例えば、生活用品、農林水産用品、試薬、化学工業用品など広範な用途を有する。
【００４１】
また、これら組成物に、本発明のグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめる方法は、その製品が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、混和、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入、固化などの公知の方法が適宜選ばれる。その含有せしめる量は、組成物によっても異なるが、一般的には、グルコシル転移糖として、０．１％以上、望ましくは０．５％以上の量が好適である。
【００４２】
次に実験により本発明をさらに具体的に説明する。
【００４３】
＜実験１：コージビオースホスホリラーゼの生産＞
炭素源として０．５ｗ／ｖ％グルコースに代えて０．５ｗ／ｖ％トレハロースを用いたこと以外は全て『ＡＴＣＣカタログ・オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション発行、１９９２年）、４５２乃至４５６頁に記載のサーモアナエロビウム・ブロッキイ培地の調製法に従って、培地を１００ｍｌ容耐圧ボトルに１００ｍｌずつ調製した後、サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ３５０４７を接種し、６０℃、４８時間静置培養したものを種培養とした。
【００４４】
容量１１ｌのステンレスボトル４本に種培養の場合と同組成の培地を約１０ｌずつ入れて、加熱滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液をこの培地体積当たり１ｖ／ｖ％接種し、温度６０℃で、約４０時間静置培養した。
【００４５】
培養液約４０ｌを遠心分離して、培養菌体９２ｇを得た。菌体を１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁し、超音波破砕した後遠心分離して菌体破砕上清を得た。培養液ｍｌ当たりに換算するとコージビオースホスホリラーゼの活性は、０．１単位／ｍｌであった。
【００４６】
＜実験２：コージビオースホスホリラーゼの精製＞
実験１で得た菌体破砕上清をＵＦ膜濃縮し、コージビオースホスホリラーゼを１ｍｌ当たり約１０単位有する濃縮酵素液約３６０ｍｌを回収した。
【００４７】
得られた濃縮酵素液のうち３００ｍｌを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透析液上清（３８０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル量３８０ｍｌ）にかけた。
【００４８】
本発明のコージビオースホスホリラーゼをＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲルに吸着せしめ、０Ｍ食塩水から０．５Ｍ食塩水までのリニアグラジエントにより、カラムより溶出させた。約０．２Ｍの食塩で溶出される酵素活性画分を回収した後、以下の方法で更に精製を行った。１．５Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量１００ｍｌ）を行った。吸着したコージビオースホスホリラーゼを、１．５Ｍ硫安から０Ｍ硫安までのリニアグラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００４９】
続いて、ウルトロゲル ＡｃＡ４４（フランス国、セプラコル社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。
【００５０】
以上の精製手段により得られた精製酵素標品の回収率は、活性換算で、菌体破砕上清に対して約２０％であった。また、精製酵素標品の比活性は蛋白質ｍｇ当たり７１．４単位であった。なお、蛋白質はローリー法に従って牛血清アルブミンを標準にして定量した。
【００５１】
精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品であった。
【００５２】
＜実験３：コージビオースホスホリラーゼの性質＞
実験２で得たコージビオースホスホリラーゼ標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０ｗ／ｖ％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を測定したところ、分子量８３，０００±５，０００ダルトンであった。また、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷカラム（φ７．５ｍｍ×６００ｍｍ，東ソー株式会社製）を用いたゲル濾過法により、分子量を測定した結果、５００，０００±３０，０００ダルトンであった。
【００５３】
精製コージビオースホスホリラーゼを２ｗ／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンドおよびゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点（ｐＩ）は４．４±０．５であった。
【００５４】
本発明のコージビオースホスホリラーゼ活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を、活性測定方法に準じて調べた。すなわち、温度の影響を調べる際には、活性測定法における反応温度６０℃に代えて約４０℃乃至約８０℃のいずれかの温度で反応を行い、ｐＨの影響を調べる際には、活性測定法において用いられる緩衝液に代えて、ｐＨ約４乃至約８のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液を用いて反応を行い、この後、活性測定法と同様に反応停止し、グルコース生成量を測定した。測定結果を、最大値に対する相対値として表した結果を図１（温度の影響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度はｐＨ５．５、３０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨは６０℃、３０分間反応で５．５付近であった。本酵素の温度安定性は、当該酵素を溶解せしめた１０ｍＭマッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．５）を約４０℃乃至８０℃のいずれかの温度に１時間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ約３．５乃至約１０のいずれかのｐＨに緩衝能を有する緩衝液に当該酵素を溶解せしめ、４℃で２４時間保持した後、ｐＨ５．５に調整し、残存する酵素活性を活性測定法にしたがって求めた。測定結果を最大値に対する相対値として表した結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は６５℃付近までであり、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であった。また、本酵素活性は、１ｍＭのＨｇ＋＋で阻害された。
【００５５】
＜実験４：コージビオースホスホリラーゼの部分アミノ酸配列＞
（１）Ｎ末端アミノ酸配列
実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を蒸留水に対して透析した後、蛋白量として約４０μｇをＮ末端配列分析用の試料とした。Ｎ末端配列はプロテインシーケンサー・モデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製、米国）を用い、Ｎ末端から５残基まで分析した。Ｎ末端から得られた配列は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列であった。さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に解析したところ、当該酵素はＮ末端に、配列表における配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００５６】
（２）中間部部分アミノ酸配列
実験２の方法で得られた精製酵素標品の一部を１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して透析した後、同緩衝液にて１ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう希釈した。この試料液（１ｍｌ）に１０μｇのリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬株式会社販売）を加え、３０℃、２２時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相ＨＰＬＣを行った。マイクロボンダスフェアーＣ１８カラム（直径２．１ｍｍ×長さ１５０ｍｍ、ウォーターズ社製、米国）を用い、流速０．９ｍｌ／分、室温で０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−０％アセトニトリル溶液から０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−４８ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液までの１２０分間のリニアグラジエントの条件で行った。カラムから溶出したペプチドは、波長２１０ｎｍの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した２ペプチド、ＫＰ１５（保持時間６６分）、ＫＰ２３（保持時間９６分）を分取し、それぞれを真空乾燥した後、２００μｌの０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸−５０ｖ／ｖ％アセトニトリル溶液に溶解した。これらペプチド試料をプロテインシーケンサーに供し、それぞれＮ末端から５残基までアミノ酸配列を分析した。ペプチドＫＰ１５からは、配列表における配列番号２に示すアミノ酸配列が、またペプチドＫＰ２３からは、配列表における配列番号３に示すアミノ酸配列が得られた。さらに同じ試料を用いて同じ方法により、より詳細に分析したところ、ペプチドＫＰ１５及びペプチドＫＰ２３はそのＮ末端部に、それぞれ、配列表における配列番号７及び配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでいることが判明した。
【００５７】
＜実験５：コージビースホスホリラーゼの糖分解反応における基質特異性＞
Ｄ−グルコース、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、ネオトレハロース、セロビオース、メリビオース、コージビオース、イソマルトース、ソホロース、ゲンチオビオース、ニゲロース及びラミナリビオースから選ばれる糖質の水溶液に、実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼを糖質固形物１ｇ当たりそれぞれ１０単位ずつ加え、５ｍＭリン酸二水素ナトリウム存在下、６０℃、ｐＨ５．５で２４時間作用させた。各反応液中の糖質濃度はいずれも２ｗ／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６０（メルク社製；アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を用いた薄層クロマトグラフィー（以下、「ＴＬＣ」と略称する。）に供した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリジン：水＝７：３：１（容積比）を用いて室温で１回展開した後、２０ｖ／ｖ％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、１１０℃で約１０分間加熱して発色させた。両反応液に由来するスポットを比較し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無を判定した。結果を表１に示した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
表１に示されるように、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、コージビオースに極めて高い特異性で作用してＤ−グルコースとβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とを生成することが判明した。一方、他の糖質には作用しないことが判明した。
【００６０】
＜実験６：コージビースホスホリラーゼのグルコシル転移糖生成反応における受容体特異性＞
受容体として表２に示す各種単糖類、オリゴ糖類および糖アルコール類のいずれかと、糖供与体としてβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とを、固形物質量で等量溶解含有している水溶液に、実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位ずつ加え、６０℃、ｐＨ５．５で２４時間反応させた。なお、受容体及び糖供与体の反応液中の濃度はいずれも１ｗ／ｖ％とした。酵素反応前後の反応液を、実験５と同様にＴＬＣに供した後発色させた。両反応液に由来するスポットを比較し、反応後に新たに生成したスポットより、転移糖を生成しているかどうかを判定した。また転移糖と判定されたスポットの発色強度を肉眼観察することにより、転移糖の生成率を相対的に評価した。結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】
表２に示されるように、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として、Ｄ−グルコース、Ｌ−ソルボースなどの単糖類、マルトース、コージビオース、トレハロース、スクロースなどの二糖類、及びマルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなどの三糖以上のオリゴ糖類にグルコシル基を良く転移し、グルコシル転移糖を生成することが判った。なお、β−Ｄ−グルコース−１リン酸にかえてα−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として用いた場合、グルコシル転移糖は得られなかった。
【００６３】
この実験６により、本発明のコージビオースホスホリラーゼによる糖転移反応で生成することが明らかとなったグルコシル転移糖のうちのいくつかの詳細な構造について、次の実験７乃至１２を示しながら説明する。
【００６４】
＜実験７：β−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖＞
実験６で得たβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとを基質とした酵素反応液の糖成分をガスクロマトグラフィー（以下、「ＧＬＣ」と略称する。）で分析した。酵素反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後、トリメチルシリル化したものをＧＬＣの分析試料とした。ＧＬＣカラムは、２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレスカラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは、窒素ガスを流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は、１６０℃から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。検出は、水素炎イオン検出器を用いた。
【００６５】
その結果、本発明のコージビオースホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖のピークの保持時間は、既知糖質コージビオースのそれと一致した。本発明のコージビオースホスホリラーゼによるβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とＤ−グルコースとからのグルコシル転移糖は、コージビオースであると判断される。
【００６６】
＜実験８：グルコシルソルボース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるＬ−ソルボースへの糖転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を２．５％、Ｌ−ソルボースを２．５％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びＬ−ソルボースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約２４％であった。本反応液の残り全量を活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、濃度約５０％まで濃縮して、以下に説明するカラムクロマトグラフィーを行い、当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。
【００６７】
分画用樹脂は、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、当該グルコシル転移糖高含有画分を採取した。
【００６８】
当該転移糖高含有画分を脱塩、精製し、濃度約４０％に濃縮してオクタデシルシリカゲルを充填したカラム（株式会社ワイエムシー、商品名『ＹＭＣ−Ｐａｋ ＯＤＳ』）を用いたクロマトグラフィーを行い、当該グルコシル転移糖画分を採取した。採取された画分を濃度約４０％に濃縮し、再度オクタデシルシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供する操作を繰り返し、採取された当該グルコシル転移糖高含有液を脱塩、精製、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０％で得た。実験７で示した方法に準じて本粉末標品をＧＬＣで分析したところ、本標品は固形物当たり約９８％当該グルコシル転移糖を含有していた。
【００６９】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコシル転移糖は酸分解によりほぼ１対１のモル比でＤ−グルコースとＬ−ソルボースを生成することが分かった。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣで分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールが認められた。以上のことは、当該グルコシル転移糖が、Ｄ−グルコースとＬ−ソルボースが１対１のモル比で結合したものであり、更に、Ｄ−グルコースの１位のＯＨ基がその結合に関与していることを示唆している。なお、ソルボースのメチル化誘導体は認められなかったが、これは酸により分解されたためと思われる。
【００７０】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０１．２，１００．４，９９．５，９９．３，７７．１，７５．６，７４．９，７４．５，７４．０，７３．２，７２．２，６６．３，６３．２，６２．１の各値が得られた。この分析データから当該グルコシル転移糖はＤ−グルコースの１位がＬ−ソルボースの５位にα型で結合した２糖類であるグルコシルソルボース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→５）−Ｌ−ｓｏｒｂｏｓｅであることが分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な糖質である。
【００７１】
＜実験９：コージビオシルグルコース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるマルトースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、マルトースを１０％含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びマルトースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約４０％であった。本反応液の残り全量を実験７と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約２０％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７２】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールおよび２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールが約１対１対１の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているか又は２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と４位のグルコースがともに結合に関与しているか又は４位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、それぞれ１対１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。
【００７３】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．５，９９．４，９９．１，９８．６，９４．６，７９．２，７８．８，７８．６，７８．０，７７．６，７７．３，７７．０，７６．１，７５．６，７５．３，７４．７，７４．２，７４．１，７３．８，７２．７，７２．２，７２．１，６３．６，６３．５，６３．２，６３．１の各値が得られた。この分析データから本グルコシル転移糖の構造はマルトースの非還元末端グルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージビオシルグルコース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→４）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅであることが分かった。
【００７４】
＜実験１０：コージトリオース＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるコージビオースへの糖転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、２０％コージビオースを溶解含有する５ｍＭリン酸二水素ナトリウムをｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果反応終了液にはコージビオースとも、また、Ｄ−グルコースやβ−Ｄ−グルコース−１リン酸とも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約３０％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供したコージビオースの固形物当たり収率約１５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７５】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが約１対２の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているか又は２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、１対２の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。さらに、グルコースの結合様式の可能性を考慮に入れるとこのことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているグルコースと、２位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースとが、それぞれ１対１対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを強く示唆している。
【００７６】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９９．３，９９．０，９８．３，９７．６，９６．５，９２．２，８１．３，７８．８，７８．６，７８．５，７７．２，７７．１，７５．７，７５．６，７４．７，７４．６，７４．５，７４．３，７４．２，７４．１，７４．０，７３．９，７２．６，７２．３，７２．２，７２．１，７２．０，６３．６，６３．４，６３．２，６３．１，６３．１，６３．０の各値が得られた。この分析データから本グルコシルコージビオースの構造はコージビオースの非還元末端グルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージトリオース、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅであることが分かった。
【００７７】
＜実験１１：コージビオシルグルコシド＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるトレハロースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース及びトレハロースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約７５％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約６５％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００７８】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチル化した後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣ分析に供した。その結果、２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが２対１の比率で認められた。このことは、当該グルコシル転移糖が、１位のＯＨ基のみが結合に関与しているグルコースと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与しているグルコースとが、２対１の割合で互いに結合しているオリゴ糖であることを示唆している。
【００７９】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ９８．６，９６．２，９３．３，７７．３，７５．８，７５．４，７５．１，７４．８，７４．６，７４．６，７４．０，７３．９，７２．５，７２．３，７２．２，６３．４，６３．４，６３．３の各値が得られた。この分析データから本グルコシルトレハロースの構造はトレハロースにＤ−グルコースが１，２結合した３糖類であるコージビオシルグルコシド（別名セラギノース）、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１，１）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅであることが分かった。
【００８０】
＜実験１２：コージビオシルフラクトシド＞
本発明のコージビオースホスホリラーゼによるスクロースへの転移反応で生成するグルコシル転移糖を確認するため、当該グルコシル転移糖を生成させ、単離し、構造を調べた。まず、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、スクロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実験２の方法で得た精製コージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位加え、６０℃で４８時間反応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた。実験７で示した方法に準じてこの反応終了液の一部をＧＬＣで分析した。その結果、反応終了液にはβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及びスクロースのいずれとも保持時間の異なる成分が多量生成していることが確認され、本成分が当該グルコシル転移糖と考えられた。また、ＧＬＣでの分析結果より求めた本反応における当該グルコシル転移糖の生成率は約７０％であった。本反応液の残り全量を実験８と同様に分画精製し、濃縮、真空乾燥して、当該グルコシル転移糖高含有粉末を、反応に供した糖質の固形物当たり収率約５０％で得た。本粉末標品は、当該グルコシル転移糖を固形物当たり約９８％含有していた。
【００８１】
次に、当該グルコシル転移糖高含有粉末を酸分解し、ＧＬＣ分析に供した。その結果、当該グルコシル転移糖は酸分解によりほぼ２対１のモル比でＤ−グルコースとＤ−フラクトースを生成することが分かった。また、当該グルコシル転移糖高含有粉末をメチルした後、酸により加水分解し、続いて還元、アセチル化して得られた部分メチルヘキシトールアセテートをＧＬＣで分析すると２，３，４，６−テトラメチル−１，５−ジアセチルグルシトールと３，４，６−トリメチル−１，２，５−トリアセチルグルシトールが１対１の比率で認められた。以上のことは、当該グルコシル転移糖が、Ｄ−グルコースとＤ−フラクトースが２対１のモル比で結合したものであり、更に、当該グルコシル転移糖を構成するＤ−グルコースは、１位のＯＨ基のみが結合に関与するものと、１位と２位のＯＨ基がともに結合に関与するものとが、１対１のモル比で存在していることを示唆している。なお、Ｄ−フラクトースのメチル化誘導体は認められなかったが、これは酸により分解されたためと思われる。
【００８２】
当該グルコシル転移糖の構造をさらに詳細に調べるため１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。その結果、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１００ＭＨｚ,Ｄ２Ｏ）：σｐｐｍ ｆｒｏｍ ＴＳＰ１０７．０，９９．３，９２．５，８４．０，７９．１，７８．５，７６．５，７５．７，７４．９，７４．７，７４．１，７４．０，７２．２，７２．１，６４．９，６４．６，６３．２，６３．１の各値が得られた。この分析データから本グルコシルスクロースの構造はスクロースのグルコース残基にＤ−グルコースがα型で１，２結合した３糖類であるコージビオシルフラクトシド、すなわち、α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）β−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｉｄｅであることが分かった。本物質は、従来知られていなかった新規な糖質である。
【００８３】
＜実験１３：急性毒性＞
７週齢のｄｄ系マウスを使用して、実験８乃至１２で得たグルコシルソルボース高含有粉末、コージビオシルグルコース高含有粉末、コージトリオース高含有粉末、コージビオシルグルコシド高含有粉末及びコージビオシルフラクトシド高含有粉末を、それぞれ別個に経口投与して急性毒性テストをしたところ、いずれの場合にも投与可能な最大投与量すなわち、５０ｇ／ｋｇマウス体重においても死亡例は認められなかった。従って、本発明のこれら転移糖は、いずれも毒性の極めて低い物質である。
【００８４】
以下、本発明のコージビオースホスホリラーゼ及び当該コージビオースホスホリラーゼをコードする本発明のＤＮＡと、それを利用したグルコシル転移糖含有糖質の製造方法を実施例１乃至１６で、このグルコシル転移糖含有糖質を含有せしめた組成物を実施例１７乃至３２で示す。
【実施例１】
【００８５】
＜酵素液＞
サーモアナエロビウム・ブロッキイ ＡＴＣＣ３５０４７を、実験１に示した方法で種培養した後、実験１に示した方法に準じて嫌気ファーメンターに調製した同じ組成の培地に、この培地体積当たり１ｖ／ｖ％の種培養液を接種し、培養温度６５℃で約３０時間培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、０．０８単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃縮液を透析してｍｌ当たりコージビオースホスホリラーゼ活性約８単位を有する酵素液を、もとの培養液の総活性に対して約７０％の収率で得た。
【実施例２】
【００８６】
＜ＤＮＡの調製＞
実験１に示した培地と同一組成の培地１１ｌで、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、実験１に示した方法に準じて６０℃で２４時間培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離し、適量のトリス−ＥＤＴＡ−食塩緩衝液（以下、「ＴＥＳ緩衝液」と略記する。）（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを当該菌体浮遊液の体積に対し０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。その後この処理物を−８０℃で１時間保持して凍結させた後、ここに、予めＴＥＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温しておいたＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加えて充分に撹拌し、さらに氷冷後遠心分離して形成された上層を採取した。この上層に、２倍容の冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）の適量に溶解後、７．５μｇのリボヌクレアーゼ及び１２５μｇのプロテアーゼを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ここに、クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて撹拌後、静置して形成される上層を採取し、この上層に冷エタノールを加えて生成した沈澱を採取した。沈澱を冷７０％（ｖ／ｖ）エタノールで濯ぎ真空乾燥して、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡは、濃度約１ｍｇ／ｍｌとなるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【実施例３】
【００８７】
＜形質転換体と組換えＤＮＡの調製＞
実施例２の方法で得たＤＮＡ溶液を１ｍｌとり、ここに制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを約２０単位加え、３７℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により、鎖長約２，０００乃至５，０００塩基対のＤＮＡ断片を採取した。別途、ストラタジーン・クローニング・システムズ製プラスミドベクター『Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）』を常法により制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩを作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクター０．３μｇと先に得たＤＮＡ断片約３μｇとを宝酒造製『ＤＮＡライゲーション・キット』を用いて、添付の説明書にしたがって操作して連結し、得られた組換えＤＮＡで、通常のコンピテントセル法によりストラタジーン・クローニング・システムズ製大腸菌『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ』１００μｌを形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。
【００８８】
このようにして得た遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、１０ｇ／ｌ トリプトン、５ｇ／ｌ 酵母エキス、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム、７５ｍｇ／ｌ アンピシリンナトリウム塩及び５０ｍｇ／ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で１８時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約４，０００個をアマシャム製ナイロン膜『Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋』上に固定した。別途、実験４の方法で明らかにした、配列表の配列番号７に示すアミノ酸配列における第１より７番目までのアミノ酸配列に基づき、５′−ＴＴＹＧＡＹＧＡＲＡＡＹＡＡＹＡＴＧＣＣ−３′で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブとしての合成ＤＮＡを得た。先に得たナイロン膜上に固定されたコロニーのうち、当該プローブと顕著な会合を示すコロニーを、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適用して選択し、当該形質転換体を『ＴＫＰ１』と命名した。
【００８９】
この形質転換体ＴＫＰ１を常法にしたがい、１００μｇ／ｍｌ アンピシリンナトリウム塩を含むＬ−ブロス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出した。この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）に由来する、鎖長３９５６塩基対の、配列表における配列番号９に示す塩基配列のＤＮＡを含んでいた。図５に示すように、この組換えＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡは、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩによる認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号９に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験４の方法で確認された本発明のコージビオースホスホリラーゼのＮ末端アミノ酸配列及び中間部部分アミノ酸配列である、配列表における配列番号１乃至３及び配列番号６乃至８に示すアミノ酸配列とを比較したところ、配列表における配列番号１、２及び３に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号９に併記したアミノ酸配列における第１乃至５番目、第５９０乃至５９４番目及び第３５７乃至３６１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号６、７及び８に示すアミノ酸配列は、それぞれ、配列表における配列番号９に併記したアミノ酸配列における第１乃至１０番目、第５９０乃至５９９番目及び第３５７乃至３６６番目のアミノ酸配列と完全に一致した。以上のことは、本発明のコージビオースホスホリラーゼが配列表における配列番号４に示すアミノ酸配列を含むものであり、当該酵素はサーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）においては、配列表における配列番号５に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示している。以上のようにして調製し、塩基配列を確認した組換えＤＮＡを『ｐＴＫＰ１』と命名した。
【実施例４】
【００９０】
＜形質転換体によるコージビオースホスホリラーゼの産生＞
１６ｇ／ｌポリペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキス及び５ｇ／ｌ塩化ナトリウムを含む水溶液を５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃で１５分間処理し、冷却し、無菌的にｐＨ７．０に調製した後、アンピシリンナトリウム塩１０ｍｇを無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実施例３の方法で得た形質転換体ＴＫＰ１を接種し、３７℃で約２０時間通気撹拌培養したものを種培養液とした。次に１０ｌ容ファーメンターに、種培養に用いたのと同一組成の培地を、種培養の場合に準じて７ｌ調製し、種培養液７０ｍｌ接種し、約２０時間通気撹拌培養した。この培養物を、常法にしたがい、遠心分離して菌体を回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波処理して菌体を破砕し、さらに遠心分離により不溶物を除去し、上清を採取した。その上清を１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した後、透析液中のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定したところ、培養物１ｌ当たり約５００単位の当該酵素が産生されていた。
【００９１】
第一の対照として、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外はすべて上述の形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第二の対照として、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（ＡＴＣＣ ３５０４７）を、アンピシリンを含有しないこと以外は上述の形質転換体の場合と同一組成の培地を用い、実験１に示した方法に準じて６０℃で静置培養し、さらに上述の形質転換体の場合と同じく培養物から菌体破砕物の上清を採取し、透析した。第一の対照の透析物には当該酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の透析物には当該酵素活性が認められたが、この場合は、培養物１ｌ当たり約１００単位であり、形質転換体ＴＫＰ１の場合に比較して明らかに低い値であった。
【００９２】
この実施例４の方法で得た透析物を、さらに実験２に示した方法に準じて、ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０ゲル、ウルトロゲル ＡｃＡ４４を用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、さらにこの精製酵素を実験３に示した方法に準じて分析した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量８３，０００±５，０００ダルトン、ゲル濾過法による分子量５００，０００±３０，０００ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点４．４±０．５、コージビオースホスホリラーゼ活性の至適温度６５℃付近、至適ｐＨ５．５付近、温度安定性は６５℃付近まで、ｐＨ安定性は約５．５乃至１０．０であり、実験１乃至２に示した方法で調製された当該酵素の理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、本発明のコージビオースホスホリラーゼは、組換えＤＮＡ技術によっても良好に製造でき、なお且つ酵素の生産性も有意に向上することを示している。
【実施例５】
【００９３】
＜酵素液＞
実施例３に示した方法で得た形質転換体ＴＫＰ１を実施例４に示した方法で培養した。培養液を遠心分離して得た菌体を超音波破砕し、破砕液上清のコージビオースホスホリラーゼ活性を測定した。この活性を培養液１ｍｌ当たりに換算すると、約０．５単位であった。破砕液上清を限外濾過膜にて濃縮し、その濃縮液を透析してｍｌ当たりコージビオースホスホリラーゼ活性約１０単位を有する酵素液を、もとの培養液の総活性に対して約７０％の収率で得た。
【実施例６】
【００９４】
＜コージビオース含有糖液＞
マルトースを５％含む２５ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５単位、実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させた。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【００９５】
本品は、コージビオースを固形物当たり約３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例７】
【００９６】
＜コージビオース高含有粉末＞
実施例６の方法で反応、精製した固形物当たり約３０％のコージビオースを含有する糖液を原料として固形物濃度約２０％に調整し、これにグルコアミラーゼを固形物１ｇ当たり５単位加えてｐＨ４．５、４０℃で１６時間反応させ残存するマルトースを分解した。１００℃で３０分加熱して反応を停止した後、濃度約４０％まで濃縮した。本糖液中のコージビオース含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、コージビオース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、コージビオース高含有粉末を原料固形物当たり収率約２０％で得た。
【００９７】
本品は、固形物当たり約９０％のコージビオースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例８】
【００９８】
＜グルコシルソルボース含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸及びＬ−ソルボースをそれぞれ５％含む水溶液をｐＨ５．５に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり１０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のグルコシルソルボース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【００９９】
本品は、固形物当たりグルコシルソルボースを約３０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例９】
【０１００】
＜グルコシルソルボース高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％及びＬ−ソルボースを１０％含む水溶液をｐＨ６．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり３０単位になるように加えて、６０℃で７２時間反応させた。反応後冷却し、市販パン酵母を固形物質量当たり湿質量で５％になるように加え、１規定の水酸化ナトリウム溶液を用いて該反応液をｐＨ５乃至６に制御しながら２７℃で６時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、反応を停止させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のグルコシルソルボース含有糖液を原料固形物当たり収率約６５％で得た。
【０１０１】
本品は、固形物当たりグルコシルソルボースを約４０％含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１０】
【０１０２】
＜グルコシルソルボース高含有粉末＞
実施例９の方法で反応、精製した固形物当たり約４０％のグルコシルソルボースを含有する糖液を原料として、これを固形物濃度約４５％に調整した。本糖液中のグルコシルソルボース含有率を高めるため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（東京有機化学工業株式会社製、商品名『ＸＴ−１０１６』、Ｎａ型、架橋度４％）を使用し、内径３ｃｍ、長さ１ｍのジャケット付きステンレス製カラム４本に水懸濁状で充填し、直列につなぎ、樹脂層全長を約４ｍになるようにした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、糖液を樹脂に対して５ｖ／ｖ％加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．１５の流速で流して分画し、グルコシルソルボース高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、グルコシルソルボース高含有粉末を原料固形物当たり収率約２５％で得た。
【０１０３】
本品は、固形物当たり約９０％のグルコシルソルボースを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１１】
【０１０４】
＜コージビオシルフラクトシド含有糖液＞
コージビオースを１０％及びスクロースを１０％含む水溶液を調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをコージビオース１ｇ当たり４０単位になるように加え、５ｍＭリン酸二水素ナトリウム塩存在下ｐＨ５．０、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルフラクトシド含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１０５】
本品は、固形物当たり約５５％のコージビオシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１２】
【０１０６】
＜コージビオシルフラクトシド高含有粉末＞
実施例１１の方法で反応、精製した、固形物当たり約５５％のコージビオシルフラクトシドを含有する糖液を原料として、これを固形物濃度約４５％に調整した。本糖液中のコージビオシルフラクトシド含有率を高めるため、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダウケミカル社販売、商品名『ダウエックス５０Ｗ×４』、Ｃａ型）を用いた以外は、実施例１０の方法に従ってカラムクロマトグラフィーを行い、コージビオシルフラクトシド高含有画分を採取した。更に、精製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、コージビオシルフラクトシド高含有粉末を原料固形物当たり収率約４０％で得た。
【０１０７】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルフラクトシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１３】
【０１０８】
＜コージビオシルグルコース含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を１０％及びマルトースを２０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液を９０℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１０９】
本品は、固形物当たり約４５％のコージビオシルグルコースを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１４】
【０１１０】
＜コージビオシルグルコシド高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例１の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形物当たり収率約６０％で得た。
【０１１１】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１５】
【０１１２】
＜コージビオース含有糖液＞
マルトースを５％含む２５ｍＭリン酸２カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に、市販の細菌由来マルトースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり５単位、実施例５の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをマルトース１ｇ当たり４０単位になるように加え、３０℃で７２時間反応させた。その反応液を１００℃で３０分間加熱し、酵素を失活させた後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオース含有糖液を原料固形物当たり収率約９５％で得た。
【０１１３】
本品は、コージビオースを固形物当たり約３０％含有するとともにコージビオシルグルコースをも含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味剤、呈味改良剤、安定剤、ビフィズス菌増殖促進剤、ミネラル吸収促進剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１６】
【０１１４】
＜コージビオシルグルコシド高含有糖液＞
β−Ｄ−グルコース−１リン酸を５％、トレハロースを１０％含む水溶液をｐＨ５．０に調整し、これに実施例５の方法で調製したコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸１ｇ当たり２０単位になるように加え、６０℃で７２時間反応させた。その反応液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨ１０以上のアルカリ性に保ちながら１００℃で加熱した後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色、濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７５％のシラップ状のコージビオシルグルコシド高含有糖液を原料固形物当たり収率約６０％で得た。
【０１１５】
本品は、固形物当たり約９５％のコージビオシルグルコシドを含有しており、味質良好な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例１７】
【０１１６】
＜甘味剤＞
実施例１０の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末１質量部に対し、α−グリコシルステビオシド（東洋精糖株式会社製造、商品名α−Ｇスィート）０．０５質量部を加えて均一に混合して粉末甘味剤を製造した。本品は、上品な甘味で、砂糖の約２倍の甘味を有し、カロリーは甘味度当たり砂糖の約２分の１となる。したがって、この甘味剤は低カロリー甘味料として、カロリーの摂取を制限している人、例えば、肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食物に対する味付けに好適である。また、この甘味剤は、虫歯誘発菌による酸の生成も少なく、不溶性グルカンの生成も少ないことにより、虫歯を抑制する飲食物などの味付けにも好適である。
【実施例１８】
【０１１７】
＜ハードキャンディー＞
実施例８の方法で得たグルコシルソルボース含有糖液３０質量部に対し、還元麦芽糖水飴（水分２５％）８０質量部を加えて混合溶解し、減圧下で水分が２％未満になるまで濃縮し、これにクエン酸１質量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、次いで、常法に従って成形しハードキャンディーを製造した。本品は、上品な甘味を有し、吸湿性少なく、ダレを起こしにくい歯切れの良いハードキャンディーである。
【実施例１９】
【０１１８】
＜チューインガム＞
実施例１２の方法で得たコージビオシルフラクトシド高含有粉末４質量部に対し、グルコース３質量部および、柔らかくなる程度に加熱溶融したガムベース２質量部を加えて混合し、さらに適量のハッカ香料を混合した後、常法に従ってロールにより練り合わせ成形することによってチューインガムを製造した。本品は、テクスチャー、風味ともに優れた製品である。
【実施例２０】
【０１１９】
＜チョコレート＞
実施例７の方法で得たコージビオース高含有粉末１５質量部に対し、カカオペースト４０質量部、カカオバター１０質量部、蔗糖１０質量部及び全脂粉乳１５質量部を加えて混合し、レファイナーを通した。そして粒度を下げた後、コンチェに入れ、レシチン０．５質量部を加えて、５０℃で二昼夜練り上げた。次いで、常法に従い成型機に流し込み成型固化してチョコレートを製造した。本品は、ファットブルーム、シュガーブルームの恐れがなく、舌にのせた時の融け具合、風味ともに良好である。
【実施例２１】
【０１２０】
＜カスタードクリーム＞
実施例１０の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末４００質量部に対し、コーンスターチ５００質量部、マルトース５００質量部及び食塩５質量部を加え、篩いを通して充分に混合し、さらに鶏卵１，４００質量部を加えて撹拌し、これに沸騰した牛乳５，０００質量部を徐々に加え、さらにこれをとろ火にかけて撹拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になったとき火を止め、これを冷却して少量のバニラ香料を加えることによりカスタードクリームを製造した。本品は、なめらかで光沢を有し、甘味が強すぎず美味である。
【実施例２２】
【０１２１】
＜ういろう＞
実施例１１の方法で得たコージビオシルフラクトシド含有糖液９０質量部に対し、米粉９０質量部、コーンスターチ２０質量部、砂糖２０質量部、抹茶粉末１質量部及び水の適量を加えて混練した後、これを容器に入れて６０分間蒸して抹茶ういろうを製造した。本品は、照り、口当たり良好で、風味もよいものであった。また、澱粉の老化も抑制され、長時間安定であった。
【実施例２３】
【０１２２】
＜べったら漬＞
実施例１３の方法で得たコージビオシルグルコース含有糖液１質量部に対し、マルトース３質量部、甘草製剤０．０５質量部、リンゴ酸０．００８質量部、グルタミン酸ナトリウム０．０７質量部、ソルビン酸カリウム０．０３質量部及びプルラン０．２質量部を均一に混合してべったら漬の素を製造した。大根３０ｋｇを常法に従って食塩により下漬けし、次いで砂糖で中漬けしたものを、ここで得たべったら漬の素４ｋｇで調製した調味液に漬けて、べったら漬を製造した。本品は、色艶、香気ともに良好で、適度の甘味を有し歯切れも良かった。
【実施例２４】
【０１２３】
＜乳酸菌飲料＞
実施例６の方法で得たコージビオース含有糖液１３０質量部に対し、脱脂粉乳１７５質量部及びラクトスクロース高含有粉末（株式会社林原商事販売、登録商標「乳果オリゴ」）５０質量部を、水１，１５０質量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、４０℃に冷却後、これに、常法にしたがって、乳酸菌のスターターを３０質量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料である。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有する。
【実施例２５】
【０１２４】
＜合成酒＞
３０ｖ／ｖ％アルコール水溶液６５１８質量部（温度１５℃の場合）、７０％ぶどう糖水溶液６００質量部、実施例６の方法で得たコージビオース含有糖液５０質量部、コハク酸１１．１質量部、７５％乳酸水溶液３．６６質量部、グルタミン酸ナトリウム２．３質量部、グリシン１．２質量部、アラニン１．２質量部、コハク酸ナトリウム２．２２質量部、食塩１．６質量部、天然塩１．４質量部及び水２５００質量部を混合して、アルコール含量約２０ｖ／ｖ％の原酒を得た。これを水で希釈して、アルコール含量１５乃至１６ｖ／ｖ％の製品を得た。本品は、まろやかな甘みと上品な風味を有し美味である。
【実施例２６】
【０１２５】
＜乳液＞
実施例９の方法で得たグルコシルソルボース高含有糖液３．５質量部に対し、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル０．５質量部、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール１質量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１質量部、ベヘニルアルコール０．５質量部、アボガド油１質量部、α−グリコシルルチン１質量部、ビタミンＥ及び防腐剤の適量を加え、常法に従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、カルボキシビニルポリマー０．１質量部及び精製水８５．３質量部を加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、乳液を製造した。本品は、保湿性に優れ、日焼け止め、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２７】
【０１２６】
＜スキンクリーム＞
実験１２の方法で得たコージビオシルフラクトシド高含有粉末４質量部に対し、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２質量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５質量部、α−グリコシルルチン２質量部、流動パラフィン１質量部、トリオクタン酸グリセリル１０質量部及び防腐剤の適量を加え、常法に従って加熱溶解し、これに１，３−ブチレングリコール５質量部、及び精製水６６質量部を更に加え、ホモゲナイザーにかけて乳化し、香料の適量を加えて撹拌混合し、スキンクリームを製造した。本品は、伸びのよいクリームで、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【実施例２８】
【０１２７】
＜練歯磨＞
実施例１４の方法で得たコージビオシルグルコシド高含有糖液１５質量部に対し、第二リン酸カルシウム質量部、ラウリル硫酸ナトリウム１．５質量部、グリセリン２５質量部、ポリオキシエチレンソルビタンラウレート０．５質量部、サッカリン０．０２質量部、防腐剤０．０５質量部及び水１３質量部と混合して練歯磨を得た。本品は、光沢、洗浄力も良好で、練歯磨として好適である。
【実施例２９】
【０１２８】
＜経管栄養剤＞
実施例７の方法で得たコージビオース高含有粉末８０質量部と、乾燥卵黄１９０質量部、脱脂粉乳２０９質量部、塩化ナトリウム４．４質量部、塩化カリウム１．８５質量部、硫酸マグネシウム４質量部、チアミン０．０１質量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１質量部、ビタミンＥアセテート０．６質量部及びニコチン酸アミド０．０４質量部からなる配合物を調製した。この配合物２５ｇずつをラミネートアルミ製小包に充填し、ヒートシールして製品を得た。本品は、１袋分を約１５０乃３００ｍｌの水に溶解して栄養補給液とし、経管方法により、鼻腔、食道、胃などへ投与して使用する。
【実施例３０】
【０１２９】
＜錠剤＞
実験８の方法で得たグルコシルソルボース高含有粉末４質量部に対し、アスピリン５０質量部、マルトース１０質量部及びコーンスターチ４質量部を加え、均一に混合した後、直径１２ｍｍ、２０Ｒ杆を用いて１錠６８０ｍｇ、錠剤の厚さ５．２５ｍｍ、硬度８ｋｇ±１ｋｇで打錠した。本品は、適度の甘味を有する飲みやすい錠剤である。
【実施例３１】
【０１３０】
＜いちごジャム＞
生いちご１５０質量部、蔗糖６０質量部、マルトース２０質量部、実施例１５の方法で得たコージビオース含有糖液４０質量部、ペクチン５質量部及びクエン酸１質量部を鍋で煮詰め、瓶詰めして製品を得た。本品は風味、色調とも良好なジャムである。
【実施例３２】
【０１３１】
＜加糖練乳＞
原乳１００質量部に実施例１６の方法で得たコージビオシルグルコシド高含有糖液３質量部及び蔗糖１質量部を溶解し、プレートヒーターで加熱殺菌し、次いで濃度約７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰して製品を得た。本品は温和な甘味で、風味もよく、乳幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調味用に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
叙上のように本発明は、従来知られていなかったコージビオースを生産し得るホスホリラーゼ、すなわち、コージビオースホスホリラーゼの発見に基づくものである。本発明のコージビオースホスホリラーゼは、至適温度、温度安定性における温度が高く、また、ｐＨ安定性におけるｐＨ域が広く、しかも至適ｐＨはそのｐＨ域内にあり、更に産生微生物からの酵素生産量も高い。したがって、β−Ｄ−グルコース−１リン酸を糖供与体として各種糖質の存在下で本発明の酵素を作用させれば、従来公知ではあるが入手の極めて困難であったコージビオース等や、新規のグルコシルソルボース等を始めとする各種グルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質を大量且つ安価に製造することができる。
【０１３３】
この様にして製造されるグルコシル転移糖並びに当該転移糖含有糖質は、上品な甘味の甘味剤、呈味改良剤、品質改良剤、ボディー付与剤、粘度調節剤、保湿剤、照付与剤などとして、さらには、栄養補給剤などとして広く飲食物、化粧品、医薬品、成形物など各種組成物に供しうることが大きな特徴であることから、本発明は、食品、化粧品、医薬品分野のみならず、農水畜産業や、化学工業等の産業界に貢献すること誠に多大な意義のある発明といえる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図２】本発明のコージビオースホスホリラーゼの酵素活性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図３】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼす温度の影響を示す図である。
【図４】本発明のコージビオースホスホリラーゼの安定性に及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図５】本発明の組換えＤＮＡの制限酵素地図を示す図である。図中矢印は、本発明のコージビオースホスホリラーゼをコードするＤＮＡを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸及び／又はその塩を生成する作用を有し、さらに、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有するコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とそれ以外の糖質とに作用させるグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項２】
β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩が、無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースにコージビオースホスホリラーゼを作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でマルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でトレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させることにより生成したものである請求項２記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項３】
それ以外の糖質がＤ−グルコース、Ｌ−ソルボース、マルトース、コージビオース、トレハロース及びスクロースから選ばれる糖質である請求項１又は２記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項４】
反応液中に生成及び／又は残存するグルコシル転移糖以外の夾雑糖質を除去する手段として、酵母発酵法及びカラムクロマトグラフィーから選ばれる方法を含む請求項１乃至３のいずれかに記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項５】
無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸及び／又はその塩を生成する作用を有し、さらに、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有するコージビオースホスホリラーゼを無機リン酸及び／又はその塩の存在下でマルトースにマルトースホスホリラーゼとともに作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でトレハロースにトレハロースホスホリラーゼとともに作用させることを特徴とするコージビオースの製造方法。
【請求項１】
無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸及び／又はその塩を生成する作用を有し、さらに、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有するコージビオースホスホリラーゼをβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とそれ以外の糖質とに作用させるグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項２】
β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩が、無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースにコージビオースホスホリラーゼを作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でマルトースにマルトースホスホリラーゼを作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でトレハロースにトレハロースホスホリラーゼを作用させることにより生成したものである請求項２記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項３】
それ以外の糖質がＤ−グルコース、Ｌ−ソルボース、マルトース、コージビオース、トレハロース及びスクロースから選ばれる糖質である請求項１又は２記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項４】
反応液中に生成及び／又は残存するグルコシル転移糖以外の夾雑糖質を除去する手段として、酵母発酵法及びカラムクロマトグラフィーから選ばれる方法を含む請求項１乃至３のいずれかに記載のグルコシル転移糖含有糖質の製造方法。
【請求項５】
無機リン酸及び／又はその塩の存在下でコージビオースを分解してＤ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を生成し、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩とＤ−グルコースとからコージビオースと無機リン酸及び／又はその塩を生成する作用を有し、さらに、β−Ｄ−グルコース−１リン酸及び／又はその塩を糖供与体として、他の糖質にグルコシル基の転移を触媒する作用を有するコージビオースホスホリラーゼを無機リン酸及び／又はその塩の存在下でマルトースにマルトースホスホリラーゼとともに作用させるか、または無機リン酸及び／又はその塩の存在下でトレハロースにトレハロースホスホリラーゼとともに作用させることを特徴とするコージビオースの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００７−１８５１９５（Ｐ２００７−１８５１９５Ａ）
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−９７０２７（Ｐ２００７−９７０２７）
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【分割の表示】特願平９−３１９１５１の分割
【原出願日】平成９年１１月６日（１９９７．１１．６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年７月２６日（２００７．７．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【分割の表示】特願平９−３１９１５１の分割
【原出願日】平成９年１１月６日（１９９７．１１．６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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