サッカロミセス・セレビシェ及びピキア・アノマラを用いたアルコール飲料の製造
【課題】 一種類のサッカロミセス・セレビシェで製造されていたアルコール飲料に比べて、香気成分を多く含むアルコール飲料の製造法を提供すること。
【解決手段】 ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を臭化エチジウムにより変異処理した後、ＹＰＤＧ培地上で小コロニーを選択分離することにより、皮膜形成能が低下した変異株を取得する。この変異株とサッカロミセス・セレビシェを用いてアルコールを製造することにより、香気成分が豊富なアルコール飲料が提供される。
【解決手段】 ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を臭化エチジウムにより変異処理した後、ＹＰＤＧ培地上で小コロニーを選択分離することにより、皮膜形成能が低下した変異株を取得する。この変異株とサッカロミセス・セレビシェを用いてアルコールを製造することにより、香気成分が豊富なアルコール飲料が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膜形成能の低い又はないピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母の双方を用いてアルコール飲料を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
香気の豊かな酒類の製造を行うために、サッカロミセス・セレビシェに属する酵母の育種が行われている（例えば、特許文献１−３）。現状では、酢酸イソアミル高生成酵母、カプロン酸高生成酵母が知られているが、サッカロミセス・セレビシェに属さない異種酵母と香気成分を高生成しないサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料の製造に成功した例は報告されていない。
また、ピキア・アノマラに属する酵母はオフフレーバーである酢酸エチルを高生成することから、これまで飲食品の利用に成功した例は報告されていない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１９４５０４号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５２３号公報
【特許文献３】特開２００２−１９４５０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アルコール飲料において、香気成分の有無は品質の重要な要素であり、香気成分の付与はアルコール飲料に対する消費者の多様なニーズに応えるものである。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、従来単一のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母でのみでは、香気成分の多く含むアルコール飲料が製造できなかったという問題点に対して、香気成分を多く含むアルコール飲料の製造法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、より多くの香気成分を含むアルコール飲料の製造を目的に、サッカロミセス・セレビシェに属さない酵母であるピキア・アノマラ（Pichia anomala）の利用に着目した。そして、ピキア・アノマラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択分離したところ、当該属酵母の特徴である皮膜形成能が低い又はない株を得ることができ、この株は不快臭となる酢酸エチルの生成が低いという新規な性質を有することをはじめて見出したことにより、基本的には本発明を完成した。
そして更に、自然界よりピキア・アノマラに属する酵母を分離し、変異処理することなく、上記呼吸変異株選択培地上で皮膜形成能の低い酵母を単離できることを確認し、これらの新知見に基づき研究を更に進め、下記第３の発明に至ったものである。
【０００６】
こうして、第１の発明は、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法である。
「変異処理」としては、従来に酵母に対して用いられているいかなる方法を用いることができる。例えば、紫外線照射・放射線照射等の照射方法、変異剤（例えば、臭化エチジウム、エチルメタンサルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素など）を用いた化学的方法がある。これらの方法のうち、化学的方法（特に、臭化エチジウムを用いた方法）が簡便であることから好ましい。
【０００７】
本発明においては、上記変異処理を施すことができるが、主として変異酵母の選別に特色を有するものである。選別には、例えばＹＰＤＧ培地の様な呼吸変異株選択培地を使用する。
「呼吸変異株選択培地」とは、ピキア・アマノラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択するための培地を意味しており、その成分としては、酵母エキス、ポリペプトン、少量のグルコース（デキストロース）、及び主炭素源を含有する培地のことを意味している。
【０００８】
主炭素源とは、酵母がその炭素源資化に呼吸酵素を必要とする物質のことを意味しており、例えばグリセロール、エタノール、乳酸、コハク酸が使用できる。上記各成分の具体的な濃度としては、酵母エキス０.１〜３ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、ポリペプトン０.２〜５ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、グルコース０.０１〜０.５ｗ／ｖ％（好ましくは０.０５〜０.３ｗ／ｖ％）、主炭素源１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは２〜５ｗ／ｖ％）を用いる。
ここで、本発明においては、主炭素源／グルコースの比（Ｒ）を１よりも大きくしておくことが好ましく、具体的には１０００〜２（好ましくは５００〜３、更に好ましくは２００〜５、更にさらに好ましくは１００〜１０）を用いる。また、培地のｐＨは、ｐＨ４.０〜ｐＨ７.０を用いる。
【０００９】
なお、本明細書中において、「皮膜形成能が低下した」とは、皮膜形成能の低いものに加えて、皮膜形成能を失ったものを含む。
第２の発明は、上記第１の発明の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母である。
また、第３の発明は、上記第２の発明に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低い又はない酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合、これまでただ一つのサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料よりも、多くの好ましい香気成分を含むものができ、品質の良いアルコール飲料を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明を実施するには、ピキア・アノマラに属する酵母を用い、皮膜形成能低い又はない酵母を分離する。そして、ピキア・アノマラに属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母であれば全ての酵母が使用可能であり、例えば清酒酵母（協会７号酵母等）、ワイン酵母（協会ブトウ酒１号酵母）が有効に使用できる。
【００１２】
＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞
ピキア・アノマラを、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）１０ｍｌで３０℃にて一晩振とう培養した。遠心分離により集菌した後、滅菌水で洗浄し、臭化エチジウム１０μｇ／ｍｌを含むイーストニトロゲン液体培地に約１０７個／ｍｌとなるように植菌した。３０℃で一晩培養後、ＹＰＤＧ寒天培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グリセロール３ｗ／ｖ％、０.１％グルコース０.１ｗ／ｖ％、寒天２ｗ／ｖ％）上に約２００コロニーとなるように塗布し、小コロニーを形成する株を選択した。
【００１３】
ここで、小コロニーとは、変異を起こしていない株のコロニーに比べて、成長が遅く、明らかに小さなものでプチット突然変異株を意味している。また、上記の方法によれば、約０．０１〜１％程度の割合で、変異株を取得することが可能である。
この様にして分離した酵母をＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）に植菌し、３０℃で３−７日間培養し、皮膜形成能の低い又はない酵母を取得することができる。
【００１４】
（実施例１）
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
ナバナの花より分離したピキア・アノマラに属する酵母（ＫＧ−２株）及び一般に清酒製造に利用されている清酒協会７号酵母（Ｋ−７０１株）を用い，単独及び双方の酵母を含む酒母で、表１に示す仕込配合により、総米５００ｇの仕込をし、清酒を製造した。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この清酒の製造では、麹米には精米歩合６０％（ｗ／ｖ）の乾燥麹（徳島精工株式会社製）を使用し、掛米には６０％（ｗ／ｖ）の山田錦を用いた。発酵温度は１５℃の一定温度で行った。Ｋ−７０１株とＫＧ−２株を同時に用いて時の酒母において、各酵母の菌数の比が１：１となるように調整した。留添後、２１日目に上槽し、上槽液の分析結果を表２に示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
Ｋ−７０１単独で製成された清酒に比べて、Ｋ−７０１とＫＧ−２を用いて製成された清酒では、好ましい香気成分である酢酸イソアミル及びカプロン酸エチルが多く含まれていた。
【００１９】
（実施例２）
ピキア・アノマラ ＮＢＲＣ １０２１３（独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲）を親株とし、上記＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞に従って変異処理した後、皮膜形成の低い株Ｐ−２０を分離した。親株及びＰ−２０の両株とブドウ酒用協会１号酵母（ＯＣ−２：日本醸造協会）を用いて、小規模ワイン醸造を行った。なお、対照はブトウ酒用協会酵母１号のみを用いたもの、及び親株であるピキア・アノマラ ＮＢＲＣ １０２１３株とブドウ酒用協会１号酵母を同時に用いたものとした。
【００２０】
メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含むブドウ品種マスカットベリーに上記酵母を接種し、２５℃で３日間培養し、これを酒母とした。これら培養菌体をブドウ糖で２６％の糖度に調整された果汁（メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含む）に対して３ｖ／ｖ％植菌し、２０℃で１４日間発酵させた。
発酵終了後、発酵液を遠心分離し、上層液にメタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ添加した後、１５℃で貯蔵した。ワインの香気成分はヘッドスペースクロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】
サッカロミセス・セレビシェに属するＯＣ−２株とピキア・アノマラに属する酵母Ｐ−２０を同時に用いて製成されたワインの香気成分において、対照となるＯＣ−２及びＯＣ−２とＮＢＲＣ１０２１３株で造られたワインよりも果実様のカプロン酸エチルとカプリル酸エチルが多く含まれていた。
【００２３】
このように、本実施形態によれば、（１）ピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低下した変異株を取得することが可能であり、（２）この変異株とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合には、従来のように一種類のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料に比べて、多くの好ましい香気成分を含むアルコール飲料を製造できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膜形成能の低い又はないピキア・アノマラ（Pichia anomala）に属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母の双方を用いてアルコール飲料を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
香気の豊かな酒類の製造を行うために、サッカロミセス・セレビシェに属する酵母の育種が行われている（例えば、特許文献１−３）。現状では、酢酸イソアミル高生成酵母、カプロン酸高生成酵母が知られているが、サッカロミセス・セレビシェに属さない異種酵母と香気成分を高生成しないサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料の製造に成功した例は報告されていない。
また、ピキア・アノマラに属する酵母はオフフレーバーである酢酸エチルを高生成することから、これまで飲食品の利用に成功した例は報告されていない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１９４５０４号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０５２３号公報
【特許文献３】特開２００２−１９４５０４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アルコール飲料において、香気成分の有無は品質の重要な要素であり、香気成分の付与はアルコール飲料に対する消費者の多様なニーズに応えるものである。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、従来単一のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母でのみでは、香気成分の多く含むアルコール飲料が製造できなかったという問題点に対して、香気成分を多く含むアルコール飲料の製造法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、より多くの香気成分を含むアルコール飲料の製造を目的に、サッカロミセス・セレビシェに属さない酵母であるピキア・アノマラ（Pichia anomala）の利用に着目した。そして、ピキア・アノマラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択分離したところ、当該属酵母の特徴である皮膜形成能が低い又はない株を得ることができ、この株は不快臭となる酢酸エチルの生成が低いという新規な性質を有することをはじめて見出したことにより、基本的には本発明を完成した。
そして更に、自然界よりピキア・アノマラに属する酵母を分離し、変異処理することなく、上記呼吸変異株選択培地上で皮膜形成能の低い酵母を単離できることを確認し、これらの新知見に基づき研究を更に進め、下記第３の発明に至ったものである。
【０００６】
こうして、第１の発明は、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法である。
「変異処理」としては、従来に酵母に対して用いられているいかなる方法を用いることができる。例えば、紫外線照射・放射線照射等の照射方法、変異剤（例えば、臭化エチジウム、エチルメタンサルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン系色素など）を用いた化学的方法がある。これらの方法のうち、化学的方法（特に、臭化エチジウムを用いた方法）が簡便であることから好ましい。
【０００７】
本発明においては、上記変異処理を施すことができるが、主として変異酵母の選別に特色を有するものである。選別には、例えばＹＰＤＧ培地の様な呼吸変異株選択培地を使用する。
「呼吸変異株選択培地」とは、ピキア・アマノラに属する酵母のうち、呼吸変異を伴うものを選択するための培地を意味しており、その成分としては、酵母エキス、ポリペプトン、少量のグルコース（デキストロース）、及び主炭素源を含有する培地のことを意味している。
【０００８】
主炭素源とは、酵母がその炭素源資化に呼吸酵素を必要とする物質のことを意味しており、例えばグリセロール、エタノール、乳酸、コハク酸が使用できる。上記各成分の具体的な濃度としては、酵母エキス０.１〜３ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、ポリペプトン０.２〜５ｗ／ｖ％（好ましくは０.５〜２ｗ／ｖ％）、グルコース０.０１〜０.５ｗ／ｖ％（好ましくは０.０５〜０.３ｗ／ｖ％）、主炭素源１〜１０ｗ／ｖ％（好ましくは２〜５ｗ／ｖ％）を用いる。
ここで、本発明においては、主炭素源／グルコースの比（Ｒ）を１よりも大きくしておくことが好ましく、具体的には１０００〜２（好ましくは５００〜３、更に好ましくは２００〜５、更にさらに好ましくは１００〜１０）を用いる。また、培地のｐＨは、ｐＨ４.０〜ｐＨ７.０を用いる。
【０００９】
なお、本明細書中において、「皮膜形成能が低下した」とは、皮膜形成能の低いものに加えて、皮膜形成能を失ったものを含む。
第２の発明は、上記第１の発明の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母である。
また、第３の発明は、上記第２の発明に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低い又はない酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合、これまでただ一つのサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料よりも、多くの好ましい香気成分を含むものができ、品質の良いアルコール飲料を製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
次に、本発明の実施形態について、詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
本発明を実施するには、ピキア・アノマラに属する酵母を用い、皮膜形成能低い又はない酵母を分離する。そして、ピキア・アノマラに属する酵母とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母であれば全ての酵母が使用可能であり、例えば清酒酵母（協会７号酵母等）、ワイン酵母（協会ブトウ酒１号酵母）が有効に使用できる。
【００１２】
＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞
ピキア・アノマラを、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）１０ｍｌで３０℃にて一晩振とう培養した。遠心分離により集菌した後、滅菌水で洗浄し、臭化エチジウム１０μｇ／ｍｌを含むイーストニトロゲン液体培地に約１０７個／ｍｌとなるように植菌した。３０℃で一晩培養後、ＹＰＤＧ寒天培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グリセロール３ｗ／ｖ％、０.１％グルコース０.１ｗ／ｖ％、寒天２ｗ／ｖ％）上に約２００コロニーとなるように塗布し、小コロニーを形成する株を選択した。
【００１３】
ここで、小コロニーとは、変異を起こしていない株のコロニーに比べて、成長が遅く、明らかに小さなものでプチット突然変異株を意味している。また、上記の方法によれば、約０．０１〜１％程度の割合で、変異株を取得することが可能である。
この様にして分離した酵母をＹＰＤ液体培地（酵母エキス１ｗ／ｖ％、ポリペプトン２ｗ／ｖ％、グルコース２ｗ／ｖ％）に植菌し、３０℃で３−７日間培養し、皮膜形成能の低い又はない酵母を取得することができる。
【００１４】
（実施例１）
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
ナバナの花より分離したピキア・アノマラに属する酵母（ＫＧ−２株）及び一般に清酒製造に利用されている清酒協会７号酵母（Ｋ−７０１株）を用い，単独及び双方の酵母を含む酒母で、表１に示す仕込配合により、総米５００ｇの仕込をし、清酒を製造した。
【００１５】
【表１】
【００１６】
この清酒の製造では、麹米には精米歩合６０％（ｗ／ｖ）の乾燥麹（徳島精工株式会社製）を使用し、掛米には６０％（ｗ／ｖ）の山田錦を用いた。発酵温度は１５℃の一定温度で行った。Ｋ−７０１株とＫＧ−２株を同時に用いて時の酒母において、各酵母の菌数の比が１：１となるように調整した。留添後、２１日目に上槽し、上槽液の分析結果を表２に示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
Ｋ−７０１単独で製成された清酒に比べて、Ｋ−７０１とＫＧ−２を用いて製成された清酒では、好ましい香気成分である酢酸イソアミル及びカプロン酸エチルが多く含まれていた。
【００１９】
（実施例２）
ピキア・アノマラ ＮＢＲＣ １０２１３（独立行政法人製品評価技術基盤機構より分譲）を親株とし、上記＜酵母の変異処理、及び変異株の選択分離＞に従って変異処理した後、皮膜形成の低い株Ｐ−２０を分離した。親株及びＰ−２０の両株とブドウ酒用協会１号酵母（ＯＣ−２：日本醸造協会）を用いて、小規模ワイン醸造を行った。なお、対照はブトウ酒用協会酵母１号のみを用いたもの、及び親株であるピキア・アノマラ ＮＢＲＣ １０２１３株とブドウ酒用協会１号酵母を同時に用いたものとした。
【００２０】
メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含むブドウ品種マスカットベリーに上記酵母を接種し、２５℃で３日間培養し、これを酒母とした。これら培養菌体をブドウ糖で２６％の糖度に調整された果汁（メタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ含む）に対して３ｖ／ｖ％植菌し、２０℃で１４日間発酵させた。
発酵終了後、発酵液を遠心分離し、上層液にメタ重亜硫酸カリウムを１００ｐｐｍ添加した後、１５℃で貯蔵した。ワインの香気成分はヘッドスペースクロマトグラフィーを用いて測定し、その結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】
サッカロミセス・セレビシェに属するＯＣ−２株とピキア・アノマラに属する酵母Ｐ−２０を同時に用いて製成されたワインの香気成分において、対照となるＯＣ−２及びＯＣ−２とＮＢＲＣ１０２１３株で造られたワインよりも果実様のカプロン酸エチルとカプリル酸エチルが多く含まれていた。
【００２３】
このように、本実施形態によれば、（１）ピキア・アノマラに属する酵母で、皮膜形成能が低下した変異株を取得することが可能であり、（２）この変異株とサッカロミセス・セレビシェに属する酵母を同時に用いてアルコール飲料を製造した場合には、従来のように一種類のサッカロミセス・セレビシェに属する酵母で製造したアルコール飲料に比べて、多くの好ましい香気成分を含むアルコール飲料を製造できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母。
【請求項３】
請求項２に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法。
【請求項１】
ピキア・アノマラ(Pichia anomala)に属する酵母を、変異処理することなく又は変異処理した後、呼吸変異株選択培地上で小コロニーを選択分離すること、を特徴とする皮膜形成能の低い又はない酵母の育種方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって育種、分離された皮膜形成能の低い又はない酵母。
【請求項３】
請求項２に記載の酵母とサッカロミセス・セレビシェを用いて製造してなるアルコール飲料の製造方法。
【公開番号】特開２００６−１９７８４０（Ｐ２００６−１９７８４０Ａ）
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１２１８５（Ｐ２００５−１２１８５）
【出願日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５９４１５６８８０）三重県 (58)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５９４１５６８８０）三重県 (58)
【Ｆターム（参考）】
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