サンプル構造の顕微鏡結像用の方法および装置
【課題】サンプル構造の顕微鏡結像用の方法および装置を提供する。
【解決手段】サンプル構造３４は、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができるマーカーを備え、マーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、所定の活性状態が存在する場合に、サンプル構造３４は、画像信号をそれぞれ生成するセンサ素子の配列４０上に結像され、これらの画像信号は、全体において、サンプル構造３４の単一フレームをもたらす。さらに、所定の活性状態の存在は、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて生成され、かつ少なくともセンサ素子の一部に対して、２つのテスト単一フレーム間の画像信号におけるそれぞれの変化が検出されることによって、チェックされる。所定の活性状態の存在は、画像信号の全体における検出された変化が、所定量を超える場合に決定される。
【解決手段】サンプル構造３４は、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができるマーカーを備え、マーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、所定の活性状態が存在する場合に、サンプル構造３４は、画像信号をそれぞれ生成するセンサ素子の配列４０上に結像され、これらの画像信号は、全体において、サンプル構造３４の単一フレームをもたらす。さらに、所定の活性状態の存在は、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて生成され、かつ少なくともセンサ素子の一部に対して、２つのテスト単一フレーム間の画像信号におけるそれぞれの変化が検出されることによって、チェックされる。所定の活性状態の存在は、画像信号の全体における検出された変化が、所定量を超える場合に決定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１および１０のプリアンブル部分（所謂おいて書き部分）にそれぞれ従った、サンプル構造の顕微鏡結像用の方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ごく最近、光学顕微鏡結像方法が開発され、この方法を用いれば、個別マーカー、特に蛍光分子の連続的で確率論的な局在性に基づいて、従来の光学顕微鏡における回折依存の解像限界より小さいサンプル構造を結像することができる。かかる方法は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献１および非特許文献２に説明されている。顕微鏡法のこの新しい分野はまた、局在性顕微鏡法と呼ばれる。適用される方法は、例えば、（Ｆ）ＰＡＬＭ（（蛍光）光活性化局在性顕微鏡法）、ＰＡＬＭＩＲＡ（独立画像取得型ＰＡＬＭ）、ＧＳＤ（ＩＭ）（基底状態抑制（個別分子リターン）顕微鏡法）、または（Ｆ）ＳＴＯＲＭ（（蛍光）確率論的光学再構成顕微鏡法）なる名称の下で文献において周知である。
【０００３】
新しい方法には、結像されるサンプル構造が、識別可能な２つの状態、すなわち「明」状態および「暗」状態を有するマーカーを備えるという共通点がある。例えば、蛍光染料がマーカーとして用いられる場合に、明状態は、それらが蛍光発光できる状態であり、暗状態は、それらが蛍光発光できない状態である。結像光学系の従来の解像限界より高い解像度でサンプル構造を結像するために、マーカーの小さなサブセットが、繰り返し明状態にされる。下記では、このサブセットは、活性サブセットと呼ばれる。これに関連して、「活性」サブセットを形成するマーカーの密度が、次のように選択されることになる。すなわち、明状態における、およびしたがって光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態における隣接マーカーの平均距離が、結像光学系の解像限界より大きいように選択されることになる。活性サブセットを形成するマーカーは、光学系の解像限界によってサイズが決定される、各マーカーの光点の形態をした光分布が検出されるように、センサ素子の空間解像配列上に結像される。
【０００４】
上記のように、活性サブセットに含まれるマーカーの密度が非常に低いので、マーカーの平均距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定される最小距離を超える場合には、所望の活性状態が存在する。この活性状態によって、センサ素子配列により検出される各光点が、正確に１つの活性化されたマーカーから生じることが保証される。
【０００５】
上記の方法は、図１に示されている。図１の左側では、一連の生データ単一フレームが示され、それらは、１、．．．、Ｎの番号を付けられている。これらの生データ単一フレームにおいて結像された光点のそれぞれは、所望の活性状態にある活性マーカーサブセットから生じる。すなわち、そのマーカー密度が非常に低いので、マーカーの平均距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きいことが保証される。
【０００６】
図１の右上部には、生データ単一フレーム１．．．、Ｎの重ね合わせからもたらされた全体画像が示されている。この全体画像は、結像されるサンプル構造を詳細に再現しない、分散され空間的に解像されていない光分布を有する。
【０００７】
図１の右下部には、生データ単一フレームから決定された光分布の重心の重ね合わせからもたらされた全体画像が示されている。この全体画像は、サンプル構造を、その３つの同心円環を備えた本例において詳細によく識別できるように、はるかに高い解像度を有する。
【０００８】
上記の方法で達成されることになる局在性精度を定量化するために、図２を参照する。図２では、図１に示した状況が、単に概略的に再び図示される。図２の上部には、一連の生データ単一フレームが示されている。結像されるサンプル構造は、同心円環で構成されるが、図２では破線で示され、かつ参照符号２で識別される。
【０００９】
活性サブセットの個々のマーカーは、光分布４、すなわち、そのサイズが、結像光学系の解像能力によって決定され、かつ図２においてΔＸＡｂｂで識別される光分布４を生成する。図２に概略的に示すように、マーカーは、光分布４が重ならないように、サイズΔＸＡｂｂより小さい平均距離を互いに対して有する。
【００１０】
図２の下部には、重心決定によって得られた、光分布４からもたらされる光分布６が示されている。達成可能な局在性精度は、光分布６のサイズΔＸＳＰによって与えられる。局在性精度ΔＸＳＰ用に、下記が適用される。
【数１】
ここで、ｎは、光分布４ごとに検出される光子数を示す。局在性精度ΔＸＳＰは、典型的には、約１０〜５０ｎｍの範囲である。
【００１１】
生データ単一フレームの捕捉前に、上記の活性状態が確立されることになる。この活性状態が確立される基となる初期状態は、方法から方法へと異なる。基本的に、２つの方法、すなわち「ボトムアップ」方法と呼ばれる方法、および「トップダウン」方法と呼ばれる方法が、区別されなければならない。ボトムアップ方法では、最初に、全てのマーカーは、それらの暗状態にある。高解像度局在性のために必要とされるような活性マーカーサブセットの生成は、適切な活性化によって、例えば活性化光の照射によって達成される。これは、例えば（Ｆ）ＰＡＬＭ方法の場合である。それとは対照的に、トップダウン方法では、最初に、全てのマーカーは、それらの明状態、すなわち光学顕微鏡によってそれらを結像できる状態にある。次に、活性マーカーサブセットを生成するために、ほとんどのマーカーは、例えば再び光の照射によって暗状態にされる。ここで、マーカーは、いわゆる「切り替え可能な」マーカー、例えば切り替え可能なタンパク質とすることができる。同様に、これらのマーカーは、例えば、励起光で照射された場合に寿命の長い暗状態、例えば三重項状態に変化する（したがって、真の意味で切り替え不可能なマーカーである）従来の特定の蛍光染料とすることができる。例えば、ＧＳＤ（ＩＭ）方法は、これを使用する。
【００１２】
ボトムアップ方法およびトップダウン方法の両方において、個々のマーカーの高解像度局在性を可能にするだけの所定の活性状態を再現可能に確立するのは比較的困難である。特に、この所定の活性状態が存在するか否かを、容易な方法で決定することは、今日まで不可能である。したがって、多すぎるマーカーが、それらの明状態にあり、その結果、マーカーによって生成された光分布が、生データ単一フレームにおいて互いに空間的に分離されないことがしばしば発生する。これによって、サンプル構造の光学顕微鏡結像がより困難になる。特に、実際の測定を開始することができる状況、すなわち、実際に非常に少数のマーカーだけが、依然として明状態にあるので、マーカーによって生成された光分布が、十分に高確率で光分布の分離検出を可能にする空間分布を有する状況、の判定をより困難にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２７６９２Ａ２号パンフレット
【特許文献２】独国特許出願公告第１０２００６０２１３１７Ｂ３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１２８４３４Ａ１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０１３４３４２Ａ１号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２００８０２４５６８Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）”，Nature Methods ３，７９３−７９６（２００６），M. J. Rust，M. Bates，X. Zhuang
【非特許文献２】“Resolution of Lambda／１０ in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”，Geisler Ｃ．et al，Appl. Phys. Ａ，８８，２２３−２２６（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、マーカーが互いから十分に長い平均距離を有する所定の活性状態が存在するか否かを、容易で正確なやり方で決定できるように、請求項１のプリアンブルに従ってサンプル構造の光学顕微鏡結像用の方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、この目的を、所定の活性状態の存在が次の点でチェックされることにおいて、請求項１の特徴部分に従って解決する。すなわち、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて生成され、かつ少なくともセンサ素子の一部に対して、２つのテスト単一フレーム間の画像信号におけるそれぞれの変化が検出され、かつ画像信号のそれらの全体における検出された変化が所定量を超える場合に、所定の活性状態の存在が決定される点である。
【００１７】
本発明は、次の発見に基づいている。すなわち、マーカーによって放射された光信号が空間的に別々に検出される状態では、これらの信号のその全体における時間的変化が、光信号が別々に検出されない場合におけるよりも大きいという発見に基づいている。最初の場合において、いわゆる点滅は、顕微鏡画像において識別することができ、したがって、それは、マーカーの所望の活性状態の存在にとっては典型的である。この点滅は、次の点において生じる。すなわち、マーカーが、それらの明状態から、つまり光学顕微鏡がマーカーを結像できる状態から、それらの暗状態（例えば、光退色による）へ繰り返しランダムに変化し、他のマーカーが、それらの暗状態から明状態（この状態では、マーカーは、暗状態に再び変化する前に、再びある数の光子を放射する）に変化する点において発生する。
【００１８】
本発明は、上述の現象を用いて、所定の活性状態が存在するか否かをチェックする。これは、次の点において行われる。すなわち、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて捕捉され、センサ素子によって生成された画像信号の変化が、上記の点滅がどれほど明確であるかの尺度として判定されるという点で行われる。明状態におけるマーカーの空間的密度が非常に高いために、個々のマーカーによって放射される光信号が互いに空間的に重なる場合には、点滅動作は、それほど明確ではない。より多くのマーカーが、それらの光信号を同一のセンサ素子上に放射すればするほど、顕微鏡画像における点滅動作はそれだけ弱くなる。その場合に、個々のセンサ素子によって受信される光信号の時間的な平均化が行われる。
【００１９】
したがって、本発明は、間隔を置いて捕捉された２つのテスト単一フレーム間の変化に基づいて点滅動作用の尺度を検出し、かつそれに基づいて、サンプル構造の実際の結像を開始できるときを決定することを意図している。
【００２０】
好ましくは、画像信号の検出された変化に基づいて、２つのテスト単一フレームの対応する画像信号の時間的相関関係が決定され、所定の活性状態の存在は、時間的相関関係が所定の相関閾値より下にある場合に決定される。２つの連続する単一フレームの時間的相関関係は、点滅動作およびしたがって所望の活性状態の存在を決定する、適切な測定量である。点滅動作が活発であればあるほど、２つのテスト単一フレーム間の時間的相関関係は、それだけ低くなる。
【００２１】
本発明の方法の有利な発展において、検出された画像信号が第１の値の範囲内にある場合に、２つのテスト単一フレームの検出された画像信号のそれぞれに第１の値を割り当てることと、検出された画像信号が第１の値の範囲に対して相補的である第２の値の範囲内にある場合に、第１の値と異なる第２の値を、２つのテスト単一フレームの検出された画像信号のそれぞれに割り当てることと、が規定される。例えば、値０は、所定の閾値より小さい画像信号に割り当てることができるのに対して、値１は、この閾値以上の画像信号に割り当てられる。したがって、２つのテスト単一フレームから、それぞれ値１および０だけを含むデータセットが導き出され、したがって、例えば、時間的相関関係の判定によって点滅動作を検出することに特によく適している。
【００２２】
２つのテスト単一フレームが生成される間隔は、次のように設定されるのが好ましい。すなわち、間隔が、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にマーカーが留まる平均期間の約１〜３倍にほぼ等しいように設定されるのが好ましい。間隔がこの範囲内にある限り、所定の活性状態が存在する場合には、十分に活発な、したがって２つのテスト単一フレームに基づいて決定できる点滅動作が提供されることが保証される。
【００２３】
所定の活性状態が存在するならば、画像信号のそれらの全体における検出された変化が、所定量をもはや超えなくなるまで、２つのテスト単一フレームが生成される時間間隔を縮小しながら、活性状態を繰り返しチェックするのが好ましく、かつセンサ素子の露光時間は、画像信号のそれらの全体における検出された変化が、所定量をもはや超えない間隔を考慮しながら設定される。したがって、この方法の好ましい実施形態は、所望の活性状態から開始して、活性状態がもはや存在しなくなるまで、２つのテスト単一フレームが生成される時間間隔を連続的に縮小することを規定する。このアプローチによって、できるだけ好ましい露光時間、すなわち、できるだけ短いが、しかし活性状態の存在を確実に検出するのに必要なだけ長い時間を見つけることが可能になる。
【００２４】
最初に説明したように、通常は、複数の単一フレームの画像シーケンスが、サンプル構造を結像するために捕捉される。この場合に、本発明のテストステップが、各単一フレームの捕捉前に実行される。すなわち、所定の活性状態の存在が、各単一フレームの捕捉の前にチェックされる。ここで、一テストステップ中に捕捉されたテスト単一フレーム（必要ならば修正された形態で）を画像シーケンスの単一フレームとして用いることは、所定の活性状態の存在がこのテストステップで決定されたならば、さらに有利である。同様に、テスト単一フレームの１つだけを画像シーケンスの単一フレームとして用いることが可能である。
【００２５】
本発明は、さらに、請求項１０に示す特徴を有する、サンプル構造の光学顕微鏡結像用の装置を提供する。
【００２６】
下記において、図に関連して本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】一連の生データ単一フレームと同様に、重心の決定前および後における、これらのフレームで構成された全体画像を示す。
【図２】重心の決定前および後における、図１に示す画像シーケンスの概略図を示す。
【図３】本発明による方法を実行するための光学顕微鏡の構造を示す。
【図４】実施形態に関連して、本発明による方法を説明するために流れ図を示す。
【図５】所定の活性状態が存在しない場合、および所定の活性状態が存在する場合における２つの連続する生データ単一フレームをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
図３は、サンプル構造の光学顕微鏡結像用の本発明の方法を実現するのに適した実施形態としての光学顕微鏡２０を示す。
【００２９】
光学顕微鏡２０には、２つのレンズ２４および２６で構成されたレンズ系に励起光を放射する光源２２が含まれる。このレンズ系は、光源２２によって放射された励起光を所望の方法でコリメートする役割をする。次に、コリメートされた励起光は、集光レンズ２８に入射する。集光レンズ２８は、対物レンズ３０の絞りに励起光を合焦させる。ここで、励起光は、最初は、励起光に対して透過性のダイクロイックミラー３２を通過する。次に、対物レンズ３０から出た励起光は、スライド３６に取り付けられたサンプル構造３４に入射する。
【００３０】
最初に説明したように、サンプル構造３４は、マーカー、例えば蛍光分子を備える。ここで、最初に言及した方法を用いて、これらのマーカーのそれぞれの部分を明状態、すなわち光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にし、それによって、活性サブセットを生成してもよい。
【００３１】
サンプル構造３４から放射された光は、対物レンズ３０を通過し、ダイクロイックミラー３２に入射する。ダイクロイックミラー３２は、それが、サンプル構造３４から放射された光を反射し、したがってこの光を、空間解像光検出器４０に光を合焦するレンズ３８上に導くように設計されている。光検出器４０は、センサ素子、例えばＣＣＤ素子のマトリックス状配列によって形成される。これらのセンサ素子のそれぞれは、それが受信した光を電気画像信号に変換する。次に、画像信号は、制御ユニット４２に出力される。制御ユニット４２は、個々の顕微鏡コンポーネントを制御し、かつ特に、光検出器４０から受信した画像信号を処理する機能を有する。
【００３２】
図３に示す光学顕微鏡２０を用いれば、サンプル構造３４は、図１に関連して最初に説明したように結像される。したがって、一連の生データ単一フレームが捕捉され、そのそれぞれのために、マーカーの別個の活性サブセットが結像される。次に、画像解析プロセスでは、各生データ単一フレームにおいて、光分布の重心が、制御ユニット４２によって決定されるが、これらの重心は、明状態にあるマーカーを表す。次に、生データ単一フレームから決定された光分布の重心は、高度に解像された全体画像へと組み合わされる。
【００３３】
ここで、本発明による方法は、次のことを規定する。すなわち、それぞれの生データ単一フレームの生成の前に、高解像度光学顕微鏡結像のために必要な活性状態が存在するかどうか、つまりそれぞれの活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有するかどうかがチェックされることを規定する。これは、図４による流れ図に関連して下記で説明する。
【００３４】
図４に示すプロセスは、ステップＳ１で始まる。ステップＳ２において、生データ単一フレームを数える制御変数ｐが、値１に設定される。
【００３５】
ステップＳ２に続き、かつステップＳ３〜Ｓ６で形成されるループは、Ｎ単一フレームの所望のシーケンス（ｐ＝１、．．．、Ｎ）を生成する役割をする。したがって、ステップＳ３（ｐ＝１）が、第１の生データ単一フレームとして生成される生データ単一フレーム用に初めて実行されるときに、マーカーの一部は、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にされて、最初の活性マーカーサブセットを生成する。
【００３６】
ここで、本発明は、ステップＳ４において、次のことに関するチェックを規定する。すなわち、所望の活性状態が存在するかどうか、つまり第１の活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有するかどうかに関するチェックを規定する。この本発明のチェックは、やはり以下でさらに詳細に説明する。ステップＳ４におけるチェックが、所定の活性状態が存在するという結果になる場合には、図４によるプロセスは、ステップＳ５で継続され、ステップＳ５では、ｐ番目の生データ単一フレームが生成される。その後、ステップＳ６において、制御変数ｐは、値１だけ増分される。しかしながら、ステップＳ４において、所定の活性状態がまだ存在しないという結果になる場合には、プロセスは、ステップＳ３にもどり、ステップＳ３において、所望の空間的密度を備えたマーカーを、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にし、かくして所望の活性状態を確立するために、別の試みがなされる。ステップＳ３およびＳ４で形成されるループは、ステップＳ４におけるチェックが、所定の活性状態が存在するという結果になるまで続けられる。
【００３７】
ステップＳ７において、制御変数ｐが、単一フレームの総数Ｎに既に達したかどうかどうかが毎回チェックされる。これが真でない場合には、プロセスは、ステップＳ３に戻る。制御変数ｐが値Ｎに達したらすぐに、すなわち所望の数Ｎの単一フレームが生成されたらすぐに、図４に示すプロセスは終了する。
【００３８】
最初に説明したように、重心は、所望の高解像度を備えた全体画像を得るために、生データ単一フレームにおいて決定されなければならない。本実施形態において、重心は、既にステップＳ４において、さもなければ図４に示すプロセスの終了後にのみ決定することができる。
【００３９】
下記において、ステップＳ３で実行される活性状態のチェックをより詳細に説明する。
【００４０】
ステップＳ３において活性状態をチェックするために、最初に、２つのテスト単一フレームが、２つの生データ単一フレームの形態で、間隔を置いて捕捉される。本実施形態において、この間隔は、画像信号を生成するために光検出器４０が必要とする露光時間によって定義される。これは、第１の生データ単一フレームを生成した後で、光検出器４０が、第２の生データ単一フレームを直ちに生成し始めることを意味する。次に、これらの２つのテスト単一フレームに基づいて、所望の活性状態が存在するか否かを決定するために、点滅動作が検出される。
【００４１】
本実施形態において、点滅動作は、２つのテスト単一フレームの時間的相関関係が決定されることによって検出される。これは、例えば、次の関係によって行われる。
【数２】
この関係において、ｋは相関パラメータを示し、ｒｉｊは、光検出器４０を形成するセンサ素子のマトリックス状配列において、ｉ番目の行およびｊ番目の列に位置するセンサ素子の画像信号の信号値を、２つのテスト単一フレームの第１の捕捉されたテスト単一フレーム用に示し、ここで、ｉ＝１、２、．．．、ｎおよびｊ＝１、２、．．．、ｍであり、ｎは、行の総数を示し、ｍは、列の総数を示す。したがって、
【数３】
は、２つのテスト単一フレームの、後の時点で捕捉された単一フレーム用のｉ番目の行およびｊ番目の列に配置されたセンサ素子における画像信号の信号値を示す。
【００４２】
上記で提示した関係は、次のことを表す。すなわち、各センサ素子用に、２つのテスト単一フレームの信号値が互いに乗算され、次に、この積が、全てのセンサ素子にわたって合計されることを表す。このように得られた和は、それが、２つのテスト単一フレームのうちの１つの信号値の二乗和で割られることによって正規化される。次に、このようにして決定された相関パラメータｋは、０と１との間の値を取る。すなわち０≦ｋ≦１である。値ｋが値０に近い場合に、２つのテスト単一フレーム間の時間的相関関係は低い。すなわち、２つのテスト単一フレーム間で別個の変化が生じる。これは、今度は、点滅動作が活発であり、したがって所望の活性状態が存在することを意味する。
【００４３】
対照的に、相関パラメータｋが値１に近い場合には、時間的相関関係は高く、２つのテスト単一フレーム間でわずかな変化だけが生じる。これは、今度は、点滅動作が低調であることを意味する。この場合に、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にあるマーカーの空間的密度は、まだ高すぎて、所望の局在性精度を達成するために、さらに低減されなければならない。
【００４４】
所定の活性状態が存在するか否かに関する判定を伝達するために、０と１との間の閾値が前もって設定される。相関パラメータｋが、この閾値より小さい場合に、点滅動作が十分に活発であり、したがって所定の活性状態が存在すると仮定される。対照的に、これが真でない場合に、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの空間的密度は、さらに低減すべきである。
【００４５】
本実施形態において、相関パラメータｋは、全てのセンサ素子を考慮して検出される。しかしながら、相関パラメータｋを決定するためにセンサ素子の一部だけを用いることも同様に可能である。
【００４６】
相関パラメータｋを決定するための上記で提示した関係は、光を受信しないセンサ素子が、値０を有する画像信号を放射すると仮定する。しかしながら、背景騒音がある場合、すなわちこの場合にそれぞれのセンサ素子が、０より大きい値を有する画像信号を放射する場合には、これは、平均された背景騒音が差し引かれるという点で、上記で提示した式で考慮することができる。
【００４７】
信号値ｒｉｊおよび
【数４】
が所定の閾値より大きいか否かに依存して、これらの信号値のそれぞれに値１または値０のいずれかを割り当てることがまた可能である。この方策によって、値０および１だけを有する２つのテスト単一フレームのそれぞれからデータセットが得られ、これによって、相関パラメータｋの決定はより簡単になる。
【００４８】
決定された相関パラメータｋが比較されることになる閾値は、個々のケースに対して定義されることになるエラー耐性に依存して設定するのが好ましい。「エラー」によって分かることは、単一のマーカーからではなく、互いに対する距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より小さいいくつかのマーカーから生じる光分布の検出である。
【実施例】
【００４９】
図５には、生データ単一フレームにおけるマーカー密度の影響を示す実例が示されている。これらの例において、Ｒｈ６Ｇで染色されたＰｔＫ２細胞の微小管が、光学顕微鏡で結像される。毎回、２つの連続する生データ単一フレームが示される。
【００５０】
図５の２つの上部の生データ単一フレームにおいて、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの密度は、高すぎる。すなわち、所望の活性状態は存在しない。したがって、２つの連続的に捕捉された生データ単一フレームは、互いにほんのわずかしか異ならない。
【００５１】
対照的に、図５における２つの下部の生データ単一フレームの場合には、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの密度は、非常に低いので、所望の活性状態が存在する。２つの連続的に捕捉された生データ単一フレームの比較から分かるように、この活性状態では個々のマーカーを検出することができる。さらに、２つの生データ単一フレームの一方において光信号を放射するマーカーが、もう一方の生データ単一フレームにおいてほとんど検出できないこと（逆も同様である）が明らかになる。これは、これらの生データ単一フレームが捕捉される場合に、点滅動作が活発であることを意味する。
【符号の説明】
【００５２】
２ 結像されるサンプル構造
４ 光分布
６ 光分布
２０ 光学顕微鏡
２２ 光源
２４ レンズ
２６ レンズ
２８ 集光レンズ
３０ 対物レンズ
３２ ダイクロイックミラー
３４ サンプル構造
３８ レンズ
４０ 空間解像光検出器
４２ 制御ユニット
ΔＸＡｂｂ 光分布４のサイズ
ΔＸＳＰ 光分布６のサイズ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１および１０のプリアンブル部分（所謂おいて書き部分）にそれぞれ従った、サンプル構造の顕微鏡結像用の方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ごく最近、光学顕微鏡結像方法が開発され、この方法を用いれば、個別マーカー、特に蛍光分子の連続的で確率論的な局在性に基づいて、従来の光学顕微鏡における回折依存の解像限界より小さいサンプル構造を結像することができる。かかる方法は、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献１および非特許文献２に説明されている。顕微鏡法のこの新しい分野はまた、局在性顕微鏡法と呼ばれる。適用される方法は、例えば、（Ｆ）ＰＡＬＭ（（蛍光）光活性化局在性顕微鏡法）、ＰＡＬＭＩＲＡ（独立画像取得型ＰＡＬＭ）、ＧＳＤ（ＩＭ）（基底状態抑制（個別分子リターン）顕微鏡法）、または（Ｆ）ＳＴＯＲＭ（（蛍光）確率論的光学再構成顕微鏡法）なる名称の下で文献において周知である。
【０００３】
新しい方法には、結像されるサンプル構造が、識別可能な２つの状態、すなわち「明」状態および「暗」状態を有するマーカーを備えるという共通点がある。例えば、蛍光染料がマーカーとして用いられる場合に、明状態は、それらが蛍光発光できる状態であり、暗状態は、それらが蛍光発光できない状態である。結像光学系の従来の解像限界より高い解像度でサンプル構造を結像するために、マーカーの小さなサブセットが、繰り返し明状態にされる。下記では、このサブセットは、活性サブセットと呼ばれる。これに関連して、「活性」サブセットを形成するマーカーの密度が、次のように選択されることになる。すなわち、明状態における、およびしたがって光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態における隣接マーカーの平均距離が、結像光学系の解像限界より大きいように選択されることになる。活性サブセットを形成するマーカーは、光学系の解像限界によってサイズが決定される、各マーカーの光点の形態をした光分布が検出されるように、センサ素子の空間解像配列上に結像される。
【０００４】
上記のように、活性サブセットに含まれるマーカーの密度が非常に低いので、マーカーの平均距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定される最小距離を超える場合には、所望の活性状態が存在する。この活性状態によって、センサ素子配列により検出される各光点が、正確に１つの活性化されたマーカーから生じることが保証される。
【０００５】
上記の方法は、図１に示されている。図１の左側では、一連の生データ単一フレームが示され、それらは、１、．．．、Ｎの番号を付けられている。これらの生データ単一フレームにおいて結像された光点のそれぞれは、所望の活性状態にある活性マーカーサブセットから生じる。すなわち、そのマーカー密度が非常に低いので、マーカーの平均距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きいことが保証される。
【０００６】
図１の右上部には、生データ単一フレーム１．．．、Ｎの重ね合わせからもたらされた全体画像が示されている。この全体画像は、結像されるサンプル構造を詳細に再現しない、分散され空間的に解像されていない光分布を有する。
【０００７】
図１の右下部には、生データ単一フレームから決定された光分布の重心の重ね合わせからもたらされた全体画像が示されている。この全体画像は、サンプル構造を、その３つの同心円環を備えた本例において詳細によく識別できるように、はるかに高い解像度を有する。
【０００８】
上記の方法で達成されることになる局在性精度を定量化するために、図２を参照する。図２では、図１に示した状況が、単に概略的に再び図示される。図２の上部には、一連の生データ単一フレームが示されている。結像されるサンプル構造は、同心円環で構成されるが、図２では破線で示され、かつ参照符号２で識別される。
【０００９】
活性サブセットの個々のマーカーは、光分布４、すなわち、そのサイズが、結像光学系の解像能力によって決定され、かつ図２においてΔＸＡｂｂで識別される光分布４を生成する。図２に概略的に示すように、マーカーは、光分布４が重ならないように、サイズΔＸＡｂｂより小さい平均距離を互いに対して有する。
【００１０】
図２の下部には、重心決定によって得られた、光分布４からもたらされる光分布６が示されている。達成可能な局在性精度は、光分布６のサイズΔＸＳＰによって与えられる。局在性精度ΔＸＳＰ用に、下記が適用される。
【数１】
ここで、ｎは、光分布４ごとに検出される光子数を示す。局在性精度ΔＸＳＰは、典型的には、約１０〜５０ｎｍの範囲である。
【００１１】
生データ単一フレームの捕捉前に、上記の活性状態が確立されることになる。この活性状態が確立される基となる初期状態は、方法から方法へと異なる。基本的に、２つの方法、すなわち「ボトムアップ」方法と呼ばれる方法、および「トップダウン」方法と呼ばれる方法が、区別されなければならない。ボトムアップ方法では、最初に、全てのマーカーは、それらの暗状態にある。高解像度局在性のために必要とされるような活性マーカーサブセットの生成は、適切な活性化によって、例えば活性化光の照射によって達成される。これは、例えば（Ｆ）ＰＡＬＭ方法の場合である。それとは対照的に、トップダウン方法では、最初に、全てのマーカーは、それらの明状態、すなわち光学顕微鏡によってそれらを結像できる状態にある。次に、活性マーカーサブセットを生成するために、ほとんどのマーカーは、例えば再び光の照射によって暗状態にされる。ここで、マーカーは、いわゆる「切り替え可能な」マーカー、例えば切り替え可能なタンパク質とすることができる。同様に、これらのマーカーは、例えば、励起光で照射された場合に寿命の長い暗状態、例えば三重項状態に変化する（したがって、真の意味で切り替え不可能なマーカーである）従来の特定の蛍光染料とすることができる。例えば、ＧＳＤ（ＩＭ）方法は、これを使用する。
【００１２】
ボトムアップ方法およびトップダウン方法の両方において、個々のマーカーの高解像度局在性を可能にするだけの所定の活性状態を再現可能に確立するのは比較的困難である。特に、この所定の活性状態が存在するか否かを、容易な方法で決定することは、今日まで不可能である。したがって、多すぎるマーカーが、それらの明状態にあり、その結果、マーカーによって生成された光分布が、生データ単一フレームにおいて互いに空間的に分離されないことがしばしば発生する。これによって、サンプル構造の光学顕微鏡結像がより困難になる。特に、実際の測定を開始することができる状況、すなわち、実際に非常に少数のマーカーだけが、依然として明状態にあるので、マーカーによって生成された光分布が、十分に高確率で光分布の分離検出を可能にする空間分布を有する状況、の判定をより困難にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２７６９２Ａ２号パンフレット
【特許文献２】独国特許出願公告第１０２００６０２１３１７Ｂ３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１２８４３４Ａ１号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００９／０１３４３４２Ａ１号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２００８０２４５６８Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】“Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy（STORM）”，Nature Methods ３，７９３−７９６（２００６），M. J. Rust，M. Bates，X. Zhuang
【非特許文献２】“Resolution of Lambda／１０ in fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching”，Geisler Ｃ．et al，Appl. Phys. Ａ，８８，２２３−２２６（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、マーカーが互いから十分に長い平均距離を有する所定の活性状態が存在するか否かを、容易で正確なやり方で決定できるように、請求項１のプリアンブルに従ってサンプル構造の光学顕微鏡結像用の方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、この目的を、所定の活性状態の存在が次の点でチェックされることにおいて、請求項１の特徴部分に従って解決する。すなわち、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて生成され、かつ少なくともセンサ素子の一部に対して、２つのテスト単一フレーム間の画像信号におけるそれぞれの変化が検出され、かつ画像信号のそれらの全体における検出された変化が所定量を超える場合に、所定の活性状態の存在が決定される点である。
【００１７】
本発明は、次の発見に基づいている。すなわち、マーカーによって放射された光信号が空間的に別々に検出される状態では、これらの信号のその全体における時間的変化が、光信号が別々に検出されない場合におけるよりも大きいという発見に基づいている。最初の場合において、いわゆる点滅は、顕微鏡画像において識別することができ、したがって、それは、マーカーの所望の活性状態の存在にとっては典型的である。この点滅は、次の点において生じる。すなわち、マーカーが、それらの明状態から、つまり光学顕微鏡がマーカーを結像できる状態から、それらの暗状態（例えば、光退色による）へ繰り返しランダムに変化し、他のマーカーが、それらの暗状態から明状態（この状態では、マーカーは、暗状態に再び変化する前に、再びある数の光子を放射する）に変化する点において発生する。
【００１８】
本発明は、上述の現象を用いて、所定の活性状態が存在するか否かをチェックする。これは、次の点において行われる。すなわち、少なくとも２つのテスト単一フレームが、間隔を置いて捕捉され、センサ素子によって生成された画像信号の変化が、上記の点滅がどれほど明確であるかの尺度として判定されるという点で行われる。明状態におけるマーカーの空間的密度が非常に高いために、個々のマーカーによって放射される光信号が互いに空間的に重なる場合には、点滅動作は、それほど明確ではない。より多くのマーカーが、それらの光信号を同一のセンサ素子上に放射すればするほど、顕微鏡画像における点滅動作はそれだけ弱くなる。その場合に、個々のセンサ素子によって受信される光信号の時間的な平均化が行われる。
【００１９】
したがって、本発明は、間隔を置いて捕捉された２つのテスト単一フレーム間の変化に基づいて点滅動作用の尺度を検出し、かつそれに基づいて、サンプル構造の実際の結像を開始できるときを決定することを意図している。
【００２０】
好ましくは、画像信号の検出された変化に基づいて、２つのテスト単一フレームの対応する画像信号の時間的相関関係が決定され、所定の活性状態の存在は、時間的相関関係が所定の相関閾値より下にある場合に決定される。２つの連続する単一フレームの時間的相関関係は、点滅動作およびしたがって所望の活性状態の存在を決定する、適切な測定量である。点滅動作が活発であればあるほど、２つのテスト単一フレーム間の時間的相関関係は、それだけ低くなる。
【００２１】
本発明の方法の有利な発展において、検出された画像信号が第１の値の範囲内にある場合に、２つのテスト単一フレームの検出された画像信号のそれぞれに第１の値を割り当てることと、検出された画像信号が第１の値の範囲に対して相補的である第２の値の範囲内にある場合に、第１の値と異なる第２の値を、２つのテスト単一フレームの検出された画像信号のそれぞれに割り当てることと、が規定される。例えば、値０は、所定の閾値より小さい画像信号に割り当てることができるのに対して、値１は、この閾値以上の画像信号に割り当てられる。したがって、２つのテスト単一フレームから、それぞれ値１および０だけを含むデータセットが導き出され、したがって、例えば、時間的相関関係の判定によって点滅動作を検出することに特によく適している。
【００２２】
２つのテスト単一フレームが生成される間隔は、次のように設定されるのが好ましい。すなわち、間隔が、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にマーカーが留まる平均期間の約１〜３倍にほぼ等しいように設定されるのが好ましい。間隔がこの範囲内にある限り、所定の活性状態が存在する場合には、十分に活発な、したがって２つのテスト単一フレームに基づいて決定できる点滅動作が提供されることが保証される。
【００２３】
所定の活性状態が存在するならば、画像信号のそれらの全体における検出された変化が、所定量をもはや超えなくなるまで、２つのテスト単一フレームが生成される時間間隔を縮小しながら、活性状態を繰り返しチェックするのが好ましく、かつセンサ素子の露光時間は、画像信号のそれらの全体における検出された変化が、所定量をもはや超えない間隔を考慮しながら設定される。したがって、この方法の好ましい実施形態は、所望の活性状態から開始して、活性状態がもはや存在しなくなるまで、２つのテスト単一フレームが生成される時間間隔を連続的に縮小することを規定する。このアプローチによって、できるだけ好ましい露光時間、すなわち、できるだけ短いが、しかし活性状態の存在を確実に検出するのに必要なだけ長い時間を見つけることが可能になる。
【００２４】
最初に説明したように、通常は、複数の単一フレームの画像シーケンスが、サンプル構造を結像するために捕捉される。この場合に、本発明のテストステップが、各単一フレームの捕捉前に実行される。すなわち、所定の活性状態の存在が、各単一フレームの捕捉の前にチェックされる。ここで、一テストステップ中に捕捉されたテスト単一フレーム（必要ならば修正された形態で）を画像シーケンスの単一フレームとして用いることは、所定の活性状態の存在がこのテストステップで決定されたならば、さらに有利である。同様に、テスト単一フレームの１つだけを画像シーケンスの単一フレームとして用いることが可能である。
【００２５】
本発明は、さらに、請求項１０に示す特徴を有する、サンプル構造の光学顕微鏡結像用の装置を提供する。
【００２６】
下記において、図に関連して本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】一連の生データ単一フレームと同様に、重心の決定前および後における、これらのフレームで構成された全体画像を示す。
【図２】重心の決定前および後における、図１に示す画像シーケンスの概略図を示す。
【図３】本発明による方法を実行するための光学顕微鏡の構造を示す。
【図４】実施形態に関連して、本発明による方法を説明するために流れ図を示す。
【図５】所定の活性状態が存在しない場合、および所定の活性状態が存在する場合における２つの連続する生データ単一フレームをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
図３は、サンプル構造の光学顕微鏡結像用の本発明の方法を実現するのに適した実施形態としての光学顕微鏡２０を示す。
【００２９】
光学顕微鏡２０には、２つのレンズ２４および２６で構成されたレンズ系に励起光を放射する光源２２が含まれる。このレンズ系は、光源２２によって放射された励起光を所望の方法でコリメートする役割をする。次に、コリメートされた励起光は、集光レンズ２８に入射する。集光レンズ２８は、対物レンズ３０の絞りに励起光を合焦させる。ここで、励起光は、最初は、励起光に対して透過性のダイクロイックミラー３２を通過する。次に、対物レンズ３０から出た励起光は、スライド３６に取り付けられたサンプル構造３４に入射する。
【００３０】
最初に説明したように、サンプル構造３４は、マーカー、例えば蛍光分子を備える。ここで、最初に言及した方法を用いて、これらのマーカーのそれぞれの部分を明状態、すなわち光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にし、それによって、活性サブセットを生成してもよい。
【００３１】
サンプル構造３４から放射された光は、対物レンズ３０を通過し、ダイクロイックミラー３２に入射する。ダイクロイックミラー３２は、それが、サンプル構造３４から放射された光を反射し、したがってこの光を、空間解像光検出器４０に光を合焦するレンズ３８上に導くように設計されている。光検出器４０は、センサ素子、例えばＣＣＤ素子のマトリックス状配列によって形成される。これらのセンサ素子のそれぞれは、それが受信した光を電気画像信号に変換する。次に、画像信号は、制御ユニット４２に出力される。制御ユニット４２は、個々の顕微鏡コンポーネントを制御し、かつ特に、光検出器４０から受信した画像信号を処理する機能を有する。
【００３２】
図３に示す光学顕微鏡２０を用いれば、サンプル構造３４は、図１に関連して最初に説明したように結像される。したがって、一連の生データ単一フレームが捕捉され、そのそれぞれのために、マーカーの別個の活性サブセットが結像される。次に、画像解析プロセスでは、各生データ単一フレームにおいて、光分布の重心が、制御ユニット４２によって決定されるが、これらの重心は、明状態にあるマーカーを表す。次に、生データ単一フレームから決定された光分布の重心は、高度に解像された全体画像へと組み合わされる。
【００３３】
ここで、本発明による方法は、次のことを規定する。すなわち、それぞれの生データ単一フレームの生成の前に、高解像度光学顕微鏡結像のために必要な活性状態が存在するかどうか、つまりそれぞれの活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有するかどうかがチェックされることを規定する。これは、図４による流れ図に関連して下記で説明する。
【００３４】
図４に示すプロセスは、ステップＳ１で始まる。ステップＳ２において、生データ単一フレームを数える制御変数ｐが、値１に設定される。
【００３５】
ステップＳ２に続き、かつステップＳ３〜Ｓ６で形成されるループは、Ｎ単一フレームの所望のシーケンス（ｐ＝１、．．．、Ｎ）を生成する役割をする。したがって、ステップＳ３（ｐ＝１）が、第１の生データ単一フレームとして生成される生データ単一フレーム用に初めて実行されるときに、マーカーの一部は、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にされて、最初の活性マーカーサブセットを生成する。
【００３６】
ここで、本発明は、ステップＳ４において、次のことに関するチェックを規定する。すなわち、所望の活性状態が存在するかどうか、つまり第１の活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有するかどうかに関するチェックを規定する。この本発明のチェックは、やはり以下でさらに詳細に説明する。ステップＳ４におけるチェックが、所定の活性状態が存在するという結果になる場合には、図４によるプロセスは、ステップＳ５で継続され、ステップＳ５では、ｐ番目の生データ単一フレームが生成される。その後、ステップＳ６において、制御変数ｐは、値１だけ増分される。しかしながら、ステップＳ４において、所定の活性状態がまだ存在しないという結果になる場合には、プロセスは、ステップＳ３にもどり、ステップＳ３において、所望の空間的密度を備えたマーカーを、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にし、かくして所望の活性状態を確立するために、別の試みがなされる。ステップＳ３およびＳ４で形成されるループは、ステップＳ４におけるチェックが、所定の活性状態が存在するという結果になるまで続けられる。
【００３７】
ステップＳ７において、制御変数ｐが、単一フレームの総数Ｎに既に達したかどうかどうかが毎回チェックされる。これが真でない場合には、プロセスは、ステップＳ３に戻る。制御変数ｐが値Ｎに達したらすぐに、すなわち所望の数Ｎの単一フレームが生成されたらすぐに、図４に示すプロセスは終了する。
【００３８】
最初に説明したように、重心は、所望の高解像度を備えた全体画像を得るために、生データ単一フレームにおいて決定されなければならない。本実施形態において、重心は、既にステップＳ４において、さもなければ図４に示すプロセスの終了後にのみ決定することができる。
【００３９】
下記において、ステップＳ３で実行される活性状態のチェックをより詳細に説明する。
【００４０】
ステップＳ３において活性状態をチェックするために、最初に、２つのテスト単一フレームが、２つの生データ単一フレームの形態で、間隔を置いて捕捉される。本実施形態において、この間隔は、画像信号を生成するために光検出器４０が必要とする露光時間によって定義される。これは、第１の生データ単一フレームを生成した後で、光検出器４０が、第２の生データ単一フレームを直ちに生成し始めることを意味する。次に、これらの２つのテスト単一フレームに基づいて、所望の活性状態が存在するか否かを決定するために、点滅動作が検出される。
【００４１】
本実施形態において、点滅動作は、２つのテスト単一フレームの時間的相関関係が決定されることによって検出される。これは、例えば、次の関係によって行われる。
【数２】
この関係において、ｋは相関パラメータを示し、ｒｉｊは、光検出器４０を形成するセンサ素子のマトリックス状配列において、ｉ番目の行およびｊ番目の列に位置するセンサ素子の画像信号の信号値を、２つのテスト単一フレームの第１の捕捉されたテスト単一フレーム用に示し、ここで、ｉ＝１、２、．．．、ｎおよびｊ＝１、２、．．．、ｍであり、ｎは、行の総数を示し、ｍは、列の総数を示す。したがって、
【数３】
は、２つのテスト単一フレームの、後の時点で捕捉された単一フレーム用のｉ番目の行およびｊ番目の列に配置されたセンサ素子における画像信号の信号値を示す。
【００４２】
上記で提示した関係は、次のことを表す。すなわち、各センサ素子用に、２つのテスト単一フレームの信号値が互いに乗算され、次に、この積が、全てのセンサ素子にわたって合計されることを表す。このように得られた和は、それが、２つのテスト単一フレームのうちの１つの信号値の二乗和で割られることによって正規化される。次に、このようにして決定された相関パラメータｋは、０と１との間の値を取る。すなわち０≦ｋ≦１である。値ｋが値０に近い場合に、２つのテスト単一フレーム間の時間的相関関係は低い。すなわち、２つのテスト単一フレーム間で別個の変化が生じる。これは、今度は、点滅動作が活発であり、したがって所望の活性状態が存在することを意味する。
【００４３】
対照的に、相関パラメータｋが値１に近い場合には、時間的相関関係は高く、２つのテスト単一フレーム間でわずかな変化だけが生じる。これは、今度は、点滅動作が低調であることを意味する。この場合に、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態にあるマーカーの空間的密度は、まだ高すぎて、所望の局在性精度を達成するために、さらに低減されなければならない。
【００４４】
所定の活性状態が存在するか否かに関する判定を伝達するために、０と１との間の閾値が前もって設定される。相関パラメータｋが、この閾値より小さい場合に、点滅動作が十分に活発であり、したがって所定の活性状態が存在すると仮定される。対照的に、これが真でない場合に、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの空間的密度は、さらに低減すべきである。
【００４５】
本実施形態において、相関パラメータｋは、全てのセンサ素子を考慮して検出される。しかしながら、相関パラメータｋを決定するためにセンサ素子の一部だけを用いることも同様に可能である。
【００４６】
相関パラメータｋを決定するための上記で提示した関係は、光を受信しないセンサ素子が、値０を有する画像信号を放射すると仮定する。しかしながら、背景騒音がある場合、すなわちこの場合にそれぞれのセンサ素子が、０より大きい値を有する画像信号を放射する場合には、これは、平均された背景騒音が差し引かれるという点で、上記で提示した式で考慮することができる。
【００４７】
信号値ｒｉｊおよび
【数４】
が所定の閾値より大きいか否かに依存して、これらの信号値のそれぞれに値１または値０のいずれかを割り当てることがまた可能である。この方策によって、値０および１だけを有する２つのテスト単一フレームのそれぞれからデータセットが得られ、これによって、相関パラメータｋの決定はより簡単になる。
【００４８】
決定された相関パラメータｋが比較されることになる閾値は、個々のケースに対して定義されることになるエラー耐性に依存して設定するのが好ましい。「エラー」によって分かることは、単一のマーカーからではなく、互いに対する距離が、光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より小さいいくつかのマーカーから生じる光分布の検出である。
【実施例】
【００４９】
図５には、生データ単一フレームにおけるマーカー密度の影響を示す実例が示されている。これらの例において、Ｒｈ６Ｇで染色されたＰｔＫ２細胞の微小管が、光学顕微鏡で結像される。毎回、２つの連続する生データ単一フレームが示される。
【００５０】
図５の２つの上部の生データ単一フレームにおいて、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの密度は、高すぎる。すなわち、所望の活性状態は存在しない。したがって、２つの連続的に捕捉された生データ単一フレームは、互いにほんのわずかしか異ならない。
【００５１】
対照的に、図５における２つの下部の生データ単一フレームの場合には、光学顕微鏡によってマーカーを結像できる状態におけるマーカーの密度は、非常に低いので、所望の活性状態が存在する。２つの連続的に捕捉された生データ単一フレームの比較から分かるように、この活性状態では個々のマーカーを検出することができる。さらに、２つの生データ単一フレームの一方において光信号を放射するマーカーが、もう一方の生データ単一フレームにおいてほとんど検出できないこと（逆も同様である）が明らかになる。これは、これらの生データ単一フレームが捕捉される場合に、点滅動作が活発であることを意味する。
【符号の説明】
【００５２】
２ 結像されるサンプル構造
４ 光分布
６ 光分布
２０ 光学顕微鏡
２２ 光源
２４ レンズ
２６ レンズ
２８ 集光レンズ
３０ 対物レンズ
３２ ダイクロイックミラー
３４ サンプル構造
３８ レンズ
４０ 空間解像光検出器
４２ 制御ユニット
ΔＸＡｂｂ 光分布４のサイズ
ΔＸＳＰ 光分布６のサイズ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル構造（３４）の光学顕微鏡結像のための方法であって、
前記サンプル構造（３４）が、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができるマーカーを備え、
前記マーカーの一部が光学顕微鏡によって結像できる状態にされることによって、活性マーカーサブセットが生成され、
前記活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが前記光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有する所定の活性状態が存在する場合に、前記サンプル構造（３４）が、画像信号をそれぞれ生成するセンサ素子の配列（４０）上に結像され、これらの画像信号が、その全体にて、前記サンプル構造（３４）の単一フレームをもたらすものである、結像方法において、
少なくとも２つのテスト単一フレームが間隔を置いて生成され、かつ少なくとも前記センサ素子の一部に対して、前記２つのテスト単一フレーム間の前記画像信号のそれぞれの変化が検出され、かつ前記画像信号のその全体で検出された変化が所定量を超える場合に前記所定の活性状態の存在が決定されることで、前記所定の活性状態の存在がチェックされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記画像信号の前記検出された変化に基づいて、前記２つのテスト単一フレームの対応する画像信号の時間的相関関係が決定され、前記時間的相関関係が所定の相関閾値より下にある場合に前記所定の活性状態の存在が決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記時間的相関関係が、次の関係、
【数１】
に従って決定され、
ここで、ｋが相関パラメータを示し、
ｒｉｊが、ｎ個の行およびｍ個の列を備えたマトリックス状のセンサ素子配列にて、ｉ番目の行およびｊ番目の列に位置する前記センサ素子の前記画像信号の信号値を、前記２つのテスト単一フレームの第１の捕捉されたテスト単一フレーム用に示し、ここでｉ＝１、２、．．．、ｎであり、ｊ＝１、２、．．．、ｍであり、
【数２】
が、前記２つのテスト単一フレームの、後の時点で捕捉された単一フレーム用に、前記ｉ番目の行および前記ｊ番目の列に配置された前記センサ素子における前記画像信号の信号値を示すことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出された画像信号が第１の値の範囲内にある場合に、前記２つのテスト単一フレームの前記検出された画像信号のそれぞれに第１の値が割り当てられること、および前記検出された画像信号が前記第１の値の範囲に対して相補的な第２の値の範囲内にある場合に、前記第１の値と異なる第２の値が、前記２つのテスト単一フレームの前記検出された画像信号のそれぞれに割り当てられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記２つのテスト単一フレームが生成される間隔が、好ましくは、光学顕微鏡によって結像できる状態に前記マーカーが留まる平均期間の１〜３倍にほぼ等しいように設定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記センサ素子の露光時間が、光学顕微鏡によって結像できる状態に前記マーカーが留まる前記平均期間にほぼ等しいように設定されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の活性状態が存在するならば、前記画像信号のその全体での前記検出された変化が、前記所定量をもはや超えなくなるまで、前記２つのテスト単一フレームが生成される前記間隔を縮小しながら、前記活性状態が繰り返しチェックされること、および前記センサ素子の前記露光時間が、前記画像信号のその全体での前記検出された変化が、前記所定量をもはや超えない前記間隔を考慮して設定されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
単一フレームの画像シーケンスが捕捉され、かつ各単一フレームの捕捉前に前記所定の活性状態の存在がチェックされることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の活性状態の存在が決定されている場合に、前記２つのテスト単一フレームの少なくとも１つが、前記画像シーケンスの単一フレームとして用いられることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル構造の光学顕微鏡結像のための装置であって、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができる前記マーカーを前記サンプル構造に備えるように構成された手段と、
前記マーカーの一部を、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることによって、活性マーカーサブセットを生成するように構成された手段と、
前記活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、前記光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有する所定の活性状態が存在する場合に、画像信号をそれぞれが生成するセンサ素子の配列上に前記サンプル構造を結像するように構成された手段であって、これらの画像信号が、全体で、前記サンプル構造の単一フレームをもたらす手段と、
を備えて構成される装置において、
少なくとも２つのテスト単一フレームが間隔を置いて生成され、かつ少なくとも前記センサ素子の一部に対して、前記２つのテスト単一フレーム間の前記画像信号におけるそれぞれの変化が決定され、かつ前記画像信号のその全体での前記検出された変化が所定量を超える場合に、前記所定の活性状態の存在が決定されることで、前記所定の活性状態の存在をチェックするように構成された手段を特徴とする装置。
【請求項１】
サンプル構造（３４）の光学顕微鏡結像のための方法であって、
前記サンプル構造（３４）が、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができるマーカーを備え、
前記マーカーの一部が光学顕微鏡によって結像できる状態にされることによって、活性マーカーサブセットが生成され、
前記活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが前記光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有する所定の活性状態が存在する場合に、前記サンプル構造（３４）が、画像信号をそれぞれ生成するセンサ素子の配列（４０）上に結像され、これらの画像信号が、その全体にて、前記サンプル構造（３４）の単一フレームをもたらすものである、結像方法において、
少なくとも２つのテスト単一フレームが間隔を置いて生成され、かつ少なくとも前記センサ素子の一部に対して、前記２つのテスト単一フレーム間の前記画像信号のそれぞれの変化が検出され、かつ前記画像信号のその全体で検出された変化が所定量を超える場合に前記所定の活性状態の存在が決定されることで、前記所定の活性状態の存在がチェックされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記画像信号の前記検出された変化に基づいて、前記２つのテスト単一フレームの対応する画像信号の時間的相関関係が決定され、前記時間的相関関係が所定の相関閾値より下にある場合に前記所定の活性状態の存在が決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記時間的相関関係が、次の関係、
【数１】
に従って決定され、
ここで、ｋが相関パラメータを示し、
ｒｉｊが、ｎ個の行およびｍ個の列を備えたマトリックス状のセンサ素子配列にて、ｉ番目の行およびｊ番目の列に位置する前記センサ素子の前記画像信号の信号値を、前記２つのテスト単一フレームの第１の捕捉されたテスト単一フレーム用に示し、ここでｉ＝１、２、．．．、ｎであり、ｊ＝１、２、．．．、ｍであり、
【数２】
が、前記２つのテスト単一フレームの、後の時点で捕捉された単一フレーム用に、前記ｉ番目の行および前記ｊ番目の列に配置された前記センサ素子における前記画像信号の信号値を示すことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出された画像信号が第１の値の範囲内にある場合に、前記２つのテスト単一フレームの前記検出された画像信号のそれぞれに第１の値が割り当てられること、および前記検出された画像信号が前記第１の値の範囲に対して相補的な第２の値の範囲内にある場合に、前記第１の値と異なる第２の値が、前記２つのテスト単一フレームの前記検出された画像信号のそれぞれに割り当てられることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記２つのテスト単一フレームが生成される間隔が、好ましくは、光学顕微鏡によって結像できる状態に前記マーカーが留まる平均期間の１〜３倍にほぼ等しいように設定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記センサ素子の露光時間が、光学顕微鏡によって結像できる状態に前記マーカーが留まる前記平均期間にほぼ等しいように設定されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記所定の活性状態が存在するならば、前記画像信号のその全体での前記検出された変化が、前記所定量をもはや超えなくなるまで、前記２つのテスト単一フレームが生成される前記間隔を縮小しながら、前記活性状態が繰り返しチェックされること、および前記センサ素子の前記露光時間が、前記画像信号のその全体での前記検出された変化が、前記所定量をもはや超えない前記間隔を考慮して設定されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
単一フレームの画像シーケンスが捕捉され、かつ各単一フレームの捕捉前に前記所定の活性状態の存在がチェックされることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記所定の活性状態の存在が決定されている場合に、前記２つのテスト単一フレームの少なくとも１つが、前記画像シーケンスの単一フレームとして用いられることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル構造の光学顕微鏡結像のための装置であって、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることができる前記マーカーを前記サンプル構造に備えるように構成された手段と、
前記マーカーの一部を、光学顕微鏡によって結像できる状態にすることによって、活性マーカーサブセットを生成するように構成された手段と、
前記活性マーカーサブセットに含まれるマーカーが、前記光学顕微鏡結像の解像限界によって予め決定された最小距離より大きい、互いからの平均距離を有する所定の活性状態が存在する場合に、画像信号をそれぞれが生成するセンサ素子の配列上に前記サンプル構造を結像するように構成された手段であって、これらの画像信号が、全体で、前記サンプル構造の単一フレームをもたらす手段と、
を備えて構成される装置において、
少なくとも２つのテスト単一フレームが間隔を置いて生成され、かつ少なくとも前記センサ素子の一部に対して、前記２つのテスト単一フレーム間の前記画像信号におけるそれぞれの変化が決定され、かつ前記画像信号のその全体での前記検出された変化が所定量を超える場合に、前記所定の活性状態の存在が決定されることで、前記所定の活性状態の存在をチェックするように構成された手段を特徴とする装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１０３６９１（Ｐ２０１２−１０３６９１Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２２８７１９（Ｐ２０１１−２２８７１９）
【出願日】平成２３年１０月１８日（２０１１．１０．１８）
【出願人】（５００１７８８７６）ライカ マイクロシステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー (80)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２８７１９（Ｐ２０１１−２２８７１９）
【出願日】平成２３年１０月１８日（２０１１．１０．１８）
【出願人】（５００１７８８７６）ライカ マイクロシステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー (80)
【Ｆターム（参考）】
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