シクロデキストリンのデオキシポドフィロトキシン包接錯体、その調製法、および癌治療への使用
シクロデキストリンのデオキシポドフィロトキシン包接錯体、その調製法、および癌治療への使用を開示する。包接錯体はデオキシポドフィロトキシンおよびβ-シクロデキストリン誘導体から成り、デオキシポドフィロトキシン対β-シクロデキストリン誘導体のモル比は１：１〜１：１０である。β-シクロデキストリン誘導体は、スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は製剤分野、特に、シクロデキストリンのデオキシポドフィロトキシン包接錯体、その調製法、および癌治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシポドフィロトキシン（ＤＰＴ)は漢方薬のＳｉｎｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｅｍｏｄｉ（モモイロミヤオソウ）から抽出し精製された組成物である。１９９０年代にＤＰＴのＰ-３８８白血病、ヒトの肺癌Ａ-５４９、結腸癌ＨＴ-２９の細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制効果が既に報告されている(下記非特許文献１参照）が、この研究はそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性についての実験のみに焦点を当てるものである。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性についての試験は１０年以上報告されていないが、その理由としては、この化合物が非水溶性であり、静脈内投与用に製剤しづらいことに主に起因していると見られる。１９７０年代に、よく知られているエトポシドおよびテニポシドが臨床診療に応用されている、ポドフィロトキシンの4位にあるヒドロキシル基を使用して一連のグリコシド誘導体が合成された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）.１９９４ Ｍａｒ；３２７（３）：１５７〜９.Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．１９９３ Ｊｕｎ；５９（３）：２４６〜９)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ヒドロキシル基はＤＰＴの４位には存在しない。したがって、ＤＰＴをグリコシド誘導体の製剤に使用できない。ＤＰＴ製剤投与法をどのように使用して動物でのｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を検証し、また、臨床治療に応用するかが、科学者達にとって重要なプロジェクトとなった。
【０００６】
本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を動物を用いて実施し、さらには異なる種類の癌治療の薬物を開発するための水溶性のデオキシポドフィロトキシン（ＤＰＴ）製剤を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は（ａ）ＤＰＴ、（ｂ）ＳＢＥ-β-ＣＤ、および（ｃ）その包接錯体のＸ線粉末回折スペクトルである。
【０００８】
【図２】図２は（ａ）ＤＰＴ、（ｂ）ＳＢＥ-β-ＣＤ、および（ｃ）その包接錯体の示差走査熱量測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
水中でのＤＰＴの溶解度は約０．５ｍｇ／Ｌであり、ほぼ不溶性である。本発明によれば、ＤＰＴをβ-シクロデキストリン（β-ＣＤ）誘導体に包接させることで、比較的良好な水溶解度のＤＰＴ包接錯体を調製することができる。
【００１０】
実験によって、ＤＰＴ包接錯体の調製中に、β-ＣＤの親水性誘導体であるヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（ＨＰ-β-ＣＤ）およびそのイオン誘導体であるスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリン（ＳＢＥ-β-ＣＤ）を用いて調製された包接錯体の包接能は、他のβ-ＣＤ誘導体による包接錯体よりも有意に良好であり、得られた包接錯体が非常に高い水溶解度を有しており、動物で実施するｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性試験の実施要件を満たすことが出来ることが示された。
【００１１】
本発明においては、デオキシポドフィロトキシン対β-シクロデキストリン誘導体の好ましいモル比は１：１〜１：１０であり、本発明の以下に記載されるβ-シクロデキストリン誘導体はスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。
【００１２】
実験によって、包接錯体中のβ-シクロデキストリン対ＤＰＴのモル比の違いにより、ＤＰＴの溶解度が異なってくることが判明した。異なる条件下でＨＰ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を調製し、包接錯体中のＤＰＴ濃度を紫外分光光度法で測定し、続いて、包接錯体中のＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤの組成物のモル比を求め、中国薬局方（中国▲薬▼典；Chinese Pharmacopeia）２００５年版の凡例に規定された方法に基づいて包接錯体の水溶解度を測定し、この包接錯体におけるＤＰＴの溶解度の計算を行った。実験結果を表1に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
表１によって、包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ比率が増大するに従って、ＤＰＴの溶解度が上昇することがわかる。包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が２．２４：１のとき、ＤＰＴの溶解度が５９７ｍｇ／Ｌに上昇するのでｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的試験の実施要件を満たす。
【００１５】
一方、包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が６．３５：１より高くなると、ＤＰＴの溶解度は上昇するが相対的な上昇度が緩やかになり、より重要なこととして、反応溶液においてＨＰ-β-ＣＤが非常に高濃度なので反応システム中で非常に高粘性となり、濾過、濃縮、乾燥等のプロセスが困難で操作性が悪くなる。したがって、包接錯体の調製のためにＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤを使用する場合は、ＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤのモル比は１：２．２４〜１：６．３５であることが好ましい。
【００１６】
同様に、ＳＢＥ-β-ＣＤをＤＰＴの包接のために選択する場合は、表２に示されるように包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が異なる場合、ＤＰＴの溶解度は異なる値を示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２によって、包接錯体のＳＢＥ-β-ＣＤ比率が増大するに従って、ＤＰＴの溶解度が上昇することがわかる。包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が１．００：１のとき、ＤＰＴの溶解度が６１５ｍｇ／Ｌに上昇するのでｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的試験の実施要件を満たすことが出来る。
【００１９】
包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が８．０６より高くなると、ＤＰＴの溶解度は上昇するが相対的な上昇度が緩やかになり、より重要なことは、反応溶液の粘性が非常に高くなり、濾過、濃縮、乾燥等のプロセスが困難で操作性が悪くなる。したがって、包接錯体の調製のためにＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤを使用する場合は、ＤＰＴ対ＳＢＥ-β-ＣＤのモル比は１：１．００〜１：８．０６であることが好ましい。
【００２０】
表１と表２を比較してみると、ＳＢＥ-β-ＣＤのＤＰＴ可溶化能はＨＰ-β-ＣＤよりも高いことがわかる。したがって、ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌活性試験に選択する。
【００２１】
本発明における包接錯体の調製方法は以下のとおりである。すなわち、β-ＣＤ誘導体の水溶液を調製した後、保温状態で撹拌または破砕を行い、次いで、ＤＰＴをエタノール、アセトン、メタノール等の有機溶媒に溶かした後、β-シクロデキストリン誘導体の水溶液に滴下し、その後保温状態での撹拌または破砕を継続して、乾燥させることで包接錯体を得る。
【００２２】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、β-ＣＤ誘導体で調製された水溶液の濃度が３０〜４０％Ｗ／Ｖである。
【００２３】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、包接のための温度が４０〜７０℃である。より好ましくは、温度が５０〜５５℃である。
【００２４】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、有機溶剤はエタノールである。
【００２５】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、ＤＰＴ溶液が滴下された後の撹拌または破砕を続ける時間は０．５〜３時間、より好ましくは１〜２時間である。
【００２６】
実験によって、異なる条件で調製されたＤＰＴ-β-ＣＤ包接錯体では、異なる結果となることが示された。
【００２７】
［ＤＰＴ-ＨＰ-β-ＣＤ包接錯体の調製］
水溶液から撹拌-減圧濃縮-乾燥法により調製する、具体的な操作方法を以下に示す。
異なる濃度のＨＰ-β-ＣＤ水溶液１００ｍｌを調製し、ビーカー内で加熱しながらマグネチックスターラーによる撹拌を実施し、ＤＰＴエタノール溶液の添加（ＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤが１対２のモル比となるように添加）を行い、添加後所定時間の保温撹拌を続けた後、０．４５μｍのフィルター膜を用いて高温状態のまま溶液を濾過し、抱合されていないＤＰＴは除去し、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて真空乾燥させて、最終的に白色個体を得る。
【００２８】
ＨＰ-β-ＣＤ溶液濃度、包接の温度、包接の時間の３つの因子に関しては、直交解析を３つのレベル（ＨＰ-β-ＣＤの濃度が１０％、２０％、３０％。温度が４０℃、５０℃、６０℃。時間が１時間、２時間、３時間）で実施し、包接錯体中のＤＰＴの含有量と溶解度を包接の有効性の評価パラメータとして使用した。これらの結果を表３に示す。包接錯体中のＤＰＴ含有量を紫外分光光度法で測定し、溶解度を中国薬局方２００５年版の凡例に規定された方法で測定した、これらの結果を表４に示す。
【００２９】
表３の総合スコアに対するＲ値から以下のように判断された、すなわち、３つの因子の中で包接の有効性に最も大きな影響を与えるのは、ＨＰ-β-ＣＤ濃度であり、３０％の場合が最良であった。次に影響度が大きいのは温度であり、５０℃が最良であった。影響度が一番小さいのは時間で、１時間が好ましい。したがって、包接するための最適条件は以下のようになる。すなわち、３０％濃度のＨＰ-β-ＣＤ水溶液を用いて、温度は５０℃とし、ＤＰＴのエタノール溶液滴下後の撹拌継続時間は１時間となる。
【００３０】
上述の９つの試料におけるＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤのモル比は１：２．０７〜１：２．４０、平均は１：２．２４であり、溶解度は３５２〜９４３ｍｇ／Ｌであり、平均は５９７ｍｇ／Ｌである。
【００３１】
【表３】
【００３２】
【表４】
【００３３】
［ＤＰＴ-ＳＢＥ-β-ＣＤ包接錯体の調製］
水溶液からの撹拌-凍結乾燥法により調製する、具体的な操作方法を以下に示す。
異なる濃度のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液１００ｍｌを調製し、ビーカー内で加熱しながらマグネチックスターラーによる撹拌を実施し、ＤＰＴアセトン溶液の添加（ＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤが１対３のモル比となるように添加）を行い、次に、添加後所定時間の保温撹拌を続けた後、溶液を室温で２時間保存し、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を濾過し、ろ液を冷凍機内で１２時間予備凍結し、凍結乾燥器で４８時間凍結乾燥させ、最後に、白色個体を得る。
【００３４】
ＳＢＥ-β-ＣＤ溶液濃度、包接の温度、包接の時間の３つの因子に関しては、直交解析を３つのレベル（ＳＢＥ-β-ＣＤの濃度が１０％、２５％、４０％。温度が４０℃、５５℃、７０℃。時間が０．５時間、１時間、２時間）で実施し、包接錯体中のＤＰＴの含有量と溶解度を包接の有効性の評価パラメータとして使用した。これらの結果を表５に示す。包接錯体中のＤＰＴ含有量を紫外分光光度法で測定し、溶解度を中国薬局方２００５年版の凡例に規定された方法で測定した、これらの結果を表６に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
表５の総合スコアに対するＲ値から以下のように判断された、３つの因子の中で包接の有効性に最も大きな影響を与えるのは、ＳＢＥ-β-ＣＤ濃度であり、４０％の場合が最良であった。次に影響度が大きいのは温度であり、５５℃が最良であった。影響度が一番小さいのは時間で、好ましいのは２時間である。したがって、包接反応のための最適条件は以下のようになる。すなわち、４０％濃度のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液を用いて、温度は５５℃とし、ＤＰＴアセトン溶液滴下後の撹拌継続時間は２時間となる。
【００３８】
上述の９つの試料におけるＤＰＴ対ＳＢＥ-β-ＣＤのモル比は１：２．７４〜１：３．８９、平均は１：３．２７であり、溶解度は７３６〜５０９５ｍｇ／Ｌであり、平均は２３５１ｍｇ／Ｌである。
【００３９】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を用いて１種類の動物腫瘍細胞および６種類のヒト腫瘍細胞に対して実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験では、ＤＰＴは顕著な抑制効果を示した。すなわち、マウス神経膠細胞腫細胞株（Ｃ６）、ヒト肺腺癌細胞株（Ａ-５４９）、ヒト白血病細胞株（ＨＬ-６０）、ヒト赤血病細胞株（Ｋ-５６２）、ヒト子宮頚癌細胞株（Ｈｅｌａ）、及びヒト胃癌細胞株（ＢＧＣ-８２３）に対する抑制効果はエトポシド（濃度は１０−５〜１０−８Ｍの範囲）よりも有意に良好である。
【００４０】
さらに、ＤＰＴにおいては、１０−５〜１０−８Ｍの濃度範囲では上述した全ての株に対する抑制効果について大きな変化は見られないが、一方で、エトポシドについては、１０−５から１０−８Ｍまで濃度が下がるに従って抑制効果が顕著に低下する。
【００４１】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を生理食塩水に溶解後、尾静脈に静脈内注射することによる、マウスの移植腫瘍Ｓ１８０及びＨｅｐｓに対する抑制効果試験を以下に示す：ＤＰＴの投与量が１０、５ｍｇ／Ｋｇのとき、Ｓ１８０に対しては腫瘍抑制率はそれぞれ５４．５３％と４１．６７％であり、Ｈｅｐｓに対してはそれぞれ５２．０９％および４２．２７％となり、有意な抑制効果を観察できた。すなわち、陽性対照であるシクロホスファミド（２０ｍｇ／Ｋｇ）とエトポシド（２０ｍｇ／Ｋｇ）の腫瘍抑制効果と類似していた。
【００４２】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を水に溶解後、ヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０株移植ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射することによる移植腫瘍の増殖抑制効果試験によって、以下について判明した：ＤＰＴの投与量が８ｍｇ／Ｋｇでは、腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）は４９．６８％で、腫瘍抑制率は４３．０８％であり、顕著な抑制作用が見られ、陽性対照であるエトポシド（２０ｍｇ／Ｋｇ）の抑制効果と類似するものであった。さらに、この試験によって以下のことがが判明した：ＤＰＴの投与群は実験動物の優位な体重減少は見られず、一方で、エトポシド群においては実験動物の体重が有意に減少した。これはＤＰＴの毒性がエトポシドよりも低いことを示す。
【００４３】
ＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体の薬理試験及びその結果を下記に示す。
［複数の腫瘍細胞に対するＤＰＴ包接錯体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験］
腫瘍株はＡ-５４９（ヒト肺腺癌細胞株）、ＢＧＣ-８２３（ヒト胃癌細胞株）、Ｃ-６（マウス神経膠細胞腫細胞株）、Ｈｅｐ Ｇ２（ヒト肝癌細胞株）、ＨＬ-６０（ヒト白血病細胞株）、Ｋ-５６２（ヒト赤血病細胞株）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚癌細胞株）である。試験試料はＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり（含有量は５．０５％）、対照薬はエトポシド注射液（５ｍｌ ０．１ｇ；Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製）である。予め、各薬物を生理食塩水を用いて１０−２Ｍ濃度に調製しておき、５つの濃度勾配、すなわち、Ｃ１ ５×１０−５Ｍ、Ｃ２ １０−５Ｍ、Ｃ３ １０−６Ｍ、Ｃ４ １０−７Ｍ、Ｃ５ １０−８Ｍ、に希釈して試験液として用いた。
【００４４】
実験方法：指数増殖期にある各腫瘍細胞株を一定量で９６-ウェルプレートに接種し、各細胞を２４時間培養した後、選択した各試料を添加（接種した後であれば懸濁細胞を直接添加できる）し、次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後で、ＭＩＴを４時間のさらなる培養のために添加し、最後に、試料をＤＭＳＯで溶解した後にマイクロプレートリーダーで検査する。結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】
結果から以下のことが判明した。ＤＰＴが１つの動物腫瘍細胞と６つのヒト腫瘍細胞に対して有意な抑制効果を持つことが示された。すなわち、マウス神経膠細胞腫細胞株（Ｃ６）、ヒト肺腺癌細胞株（Ａ-５４９）、ヒト白血病細胞株（ＨＬ-６０）、ヒト赤血病細胞株（Ｋ-５６２）、ヒト子宮頚癌細胞株（Ｈｅｌａ）、ヒト胃癌細胞株（ＢＧＣ-８２３）に対する抑制効果はエトポシド（濃度は１０−５〜１０−８Ｍの範囲）よりも有意に良好であった。
【００４７】
作用の特徴は以下の通りである。ＤＰＴにおいては、１０−５〜１０−８Ｍの濃度範囲では上述した全ての株に対する抑制効果について大きな変化は見られないが、一方で、エトポシドについては、１０−５から１０−８Ｍまで濃度が下がるに従って抑制効果が顕著に低下した。
【００４８】
［マウスの移植腫瘍Ｓ１８０及びＨｅｐｓに対するＤＰＴ包接錯体の尾静脈注射による抑制効果］
試験試料：ＤＰＴおよびＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり、その含有量は５．０５％であり、生理食塩水で所定濃度に調製する。
実験群：ＤＰＴ群については１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇを設け、加えて、ブランク対照群、及び、陽性対照群としてのシクロホスファミド（ＣＴＸ）群とエトポシド群を設けた。
投与経路：尾静脈への注射とした。体重当たり投与量として０．４ｍｌ／２０ｇとなるように投与した。
投与期間：薬物は株接種から２４時間後の投与し、その後２日おきに１回、合計４回の投与とした。
【００４９】
実験方法：標準体重１８〜２２ｇである６０匹のＩＣＲマウスに対し、移植腫瘍の試験法に従って、Ｓ１８０またはＨｅｐｓの固形腫瘍を接種した。マウスの前肢の脇の下に０．２ｍｌの皮下接種を実施し、接種２４時間後に体重を測定した後、ブランクコントロール群、ＣＴＸ群（２０ｍｇ／ｋｇ）、エトポシド群（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＤＰＴ群（１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇ）の６群に無作為に分ける。薬物は接種から２４時間後に投与し、その後２日おきに１回、合計４回投与を行い、投薬終了後、次に、腫瘍耐性マウスを殺して体重を測定し、分離した腫瘍塊を測定し、全てのデータの統計分析（t検定）をする。実験結果を表８と表９に示す。
【００５０】
【表８】
【００５１】
実験結果から以下のことがわかる。マウス移植腫瘍Ｓ１８０に対しては、ブランクコントロール群との比較により、ＤＰＴ群（１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍抑制率がそれぞれ５４．５３％と４１．６７％であり、これら２つの投与量はＳ１８０腫瘍の増殖を有意に（Ｐ＜０．０１）に抑制している。
【００５２】
次に、マウス移植腫瘍Ｈｅｐｓに関しては、ブランクコントロール群との比較により、ＤＰＴ群（１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率はそれぞれ５２．０９％と４２．２７％であり、これらの２つの投与量はＨｅｐｓ腫瘍の増殖を有意（Ｐ＜０．０１）に抑制している。
【００５３】
これらは、抗腫瘍薬の研究ガイダンスに関する中国のＳＦＤＡの要求（抑制率は４０％を超えなければならない）を満たしていることを示す。抗腫瘍効果は、陽性対照であるシクロホスファミド（２０ｍｇ／ｋｇ）とエトポシド（２０ｍｇ／ｋｇ）の効果に類似している。
【００５４】
【表９】
【００５５】
［ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌の移植腫瘍の増殖に対するＤＰＴ包接錯体の抑制効果」
試験試料：ＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり、その含有量は５．０５％である。
調製方法：至適量の食塩水中に穏やかに振盪しながらで溶解して濃度を０．４ｍｇ／ｍｌ（これは、８ｍｇ／ｋｇ群の試験液）に調製し、別の濃度のものは０．４ｍｇ／ｍｌ溶液を生理食塩水を用いて必要な濃度まで希釈して調製した。
【００５６】
対照試料：Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製造のエトポシド注射液、バッチ番号は８０６００１２ＥＶ、規格は５ｍｌ ０．１ｇ。
調製方法：エトポシド注射液は透明性、粘着性があり、至適量の生理食塩水で希釈し、穏やかに振とうして均一な溶液として調製するが、濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。
【００５７】
用量の設定：ＤＰＴの高用量群は８ｍｇ／ｋｇ、ＤＰＴの中用量群は４ｍｇ／ｋｇ、ＤＰＴの低用量群は２ｍｇ／ｋｇとした。陽性対照群であるエトポシド注射液の用量は２０ｍｇ／ｋｇである。
【００５８】
実験動物：採取源、生殖細胞系および血統：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスはＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されている。日令：３５〜４０日。体重：１８〜２４ｇ。性別：オス。
【００５９】
移植腫瘍：ヒト非小細胞肺癌株Ｈ４６０のヌードマウスへの移植腫瘍。さらには、ヌードマウスの脇の下にヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０細胞株を皮下接種。細胞接種量は２×１０６とした。
【００６０】
［実験方法］
指数増殖期にあるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０細胞株を無菌状態下で、２×１０７／ｍｌの細胞懸濁液として調製し、０．１ｍｌをヌードマウスの右脇の下に皮下接種する。ヌードマウスの移植腫瘍の直径をスライドカリパスで測定し、腫瘍が１００〜３００ｍｍ３に増殖したら動物を異なる群に無作為に分ける。試験試料の抗腫瘍効果を、腫瘍の直径を計測することで動的に観察する。腫瘍の直径を２日に１回測定する。体重当たり投与量は０．４ｍｌ／２０ｇである。投与から２１日後にマウスを殺し腫瘍を外科的に分離して重さを測る。腫瘍体積（tumor volume;ＴＶ）の計算式は以下の通りである：
ＴＶ ＝ １／２×ａ×ｂ２
ここで、ａとｂは、それぞれ全長と幅を表す。
【００６１】
計測値に基づき相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算するが、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０である。ここで、Ｖ０はグループ化と薬物投与が行われた間に測定された腫瘍の大きさであり（ｄ０）、Ｖｔは複数回行った各測定時の腫瘍の大きさである。抗腫瘍活性の評価パラメータは相対的腫瘍増殖倍率Ｔ／Ｃ（％）であり、以下の式で計算した。
【数１】
ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：陰性対照群：ＲＴＶ。
【００６２】
［実験結果］
ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍に関する、ＤＰＴ実験的治療の結果を表１０と表１１に示す。ＤＰＴを尾静脈を介した静脈注射で、投薬量８ｍｇ／ｋｇで週３回、合計９回投与した。ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍のＴ／Ｃ（％）は４９．６８％、腫瘍抑制率は４３．０８％である。ＤＰＴ投与群では、各群において実験動物の体重におよぼす明らかな抑制作用はみられなかった。
【００６３】
陽性対照としてエトポシド注射液を尾静脈へ注射した群では、投与量２０ｍｇ／ｋｇで週３回、合計９回投与したが、ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍のＴ／Ｃ（％）は３２．１８％、腫瘍抑制率は６１．０８％である。但し、動物の体重に対して明らかな抑制作用があり、明確な毒性がみられた。
【００６４】
［結論］
ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０移植腫瘍に関するＤＰＴのＴ／Ｃおよび腫瘍抑制率の実験結果によると、ＤＰＴはヌードマウスでのヒト非小細胞肺癌の移植腫瘍Ｈ４６０の増殖におよぼす抑制効果は顕著であり、ＤＰＴは良好な抗癌活性を備えること、新規の抗腫瘍剤の有効性に関する中国のＳＦＤＡの要件（Ｔ／Ｃ＜６０％、腫瘍抑制率＞４０％）を満たしており、加えて毒性は比較的少ないこと、が示された。
【００６５】
【表１０】
【００６６】
【表１１】
【００６７】
本発明の包接錯体の調製方法にかかる実施例を以下に示す。
【実施例１】
【００６８】
３０％のＨＰ-β-ＣＤ水溶液１００ｍＬを５００ｍｌの三つ首フラスコに移し、ウォーターバスで加熱して５０±５℃の温度に維持し、撹拌しながら１０％ＤＰＴエタノール溶液４４ｍｌを滴下した後、さらに１時間保温撹拌を継続すると同時に、エタノール蒸気を収集した。
【００６９】
次いで、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を高温状態のまま濾過し、濾液を薄膜式エバポレーターで減圧濃縮させて、得られた粘性の物質を真空乾燥させることで、３３．６ｇの白色メッシュが得られた。紫外分光光度法による測定で、ＤＰＴ含有量は１２．１２％であった。また、２００５年版の中国薬局方の凡例の方法によって測定された、得られた包接錯体におけるＤＰＴの水溶解度は、８４．１％（ｍｇ／ｍｌ）であった。
【実施例２】
【００７０】
化合物２の調製
３０％のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液１００ｍＬを２００ｍｌの三つ首フラスコに移し、ウォーターバスで加熱して５０±５℃の温度に維持し、撹拌しながら１０％ＤＰＴアセトン溶液３７．３ｍｌを滴下した後、さらに２時間保温撹拌を継続してから室温で２時間保持し、その後、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を高温状態のまま濾過した。
【００７１】
次いで、濾液を１２時間予備凍結してから、-４５℃で４８時間凍結乾燥させることで白色の多孔質固体６２．９ｇを得た。紫外分光光度法による測定で、ＤＰＴ含有量は５．０５％であった。また、２００５年版の中国薬局方の凡例の方法によって測定された、得られた包接錯体におけるＤＰＴの水溶解度は、４６０％（ｍｇ／ｍｌ）であった。
【００７２】
ＤＰＴ-ＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体に対するＸ線粉末回折スペクトルを図１に示し、示差走査熱量計（ＤＳＣ）についての図を図２として示す。これらにより、当該化合物が確実に得られていることが示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は製剤分野、特に、シクロデキストリンのデオキシポドフィロトキシン包接錯体、その調製法、および癌治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシポドフィロトキシン（ＤＰＴ)は漢方薬のＳｉｎｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ ｅｍｏｄｉ（モモイロミヤオソウ）から抽出し精製された組成物である。１９９０年代にＤＰＴのＰ-３８８白血病、ヒトの肺癌Ａ-５４９、結腸癌ＨＴ-２９の細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの抑制効果が既に報告されている(下記非特許文献１参照）が、この研究はそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性についての実験のみに焦点を当てるものである。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｖｏ活性についての試験は１０年以上報告されていないが、その理由としては、この化合物が非水溶性であり、静脈内投与用に製剤しづらいことに主に起因していると見られる。１９７０年代に、よく知られているエトポシドおよびテニポシドが臨床診療に応用されている、ポドフィロトキシンの4位にあるヒドロキシル基を使用して一連のグリコシド誘導体が合成された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｒｃｈ Ｐｈａｒｍ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）.１９９４ Ｍａｒ；３２７（３）：１５７〜９.Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄ．１９９３ Ｊｕｎ；５９（３）：２４６〜９)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ヒドロキシル基はＤＰＴの４位には存在しない。したがって、ＤＰＴをグリコシド誘導体の製剤に使用できない。ＤＰＴ製剤投与法をどのように使用して動物でのｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を検証し、また、臨床治療に応用するかが、科学者達にとって重要なプロジェクトとなった。
【０００６】
本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を動物を用いて実施し、さらには異なる種類の癌治療の薬物を開発するための水溶性のデオキシポドフィロトキシン（ＤＰＴ）製剤を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は（ａ）ＤＰＴ、（ｂ）ＳＢＥ-β-ＣＤ、および（ｃ）その包接錯体のＸ線粉末回折スペクトルである。
【０００８】
【図２】図２は（ａ）ＤＰＴ、（ｂ）ＳＢＥ-β-ＣＤ、および（ｃ）その包接錯体の示差走査熱量測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
水中でのＤＰＴの溶解度は約０．５ｍｇ／Ｌであり、ほぼ不溶性である。本発明によれば、ＤＰＴをβ-シクロデキストリン（β-ＣＤ）誘導体に包接させることで、比較的良好な水溶解度のＤＰＴ包接錯体を調製することができる。
【００１０】
実験によって、ＤＰＴ包接錯体の調製中に、β-ＣＤの親水性誘導体であるヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン（ＨＰ-β-ＣＤ）およびそのイオン誘導体であるスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリン（ＳＢＥ-β-ＣＤ）を用いて調製された包接錯体の包接能は、他のβ-ＣＤ誘導体による包接錯体よりも有意に良好であり、得られた包接錯体が非常に高い水溶解度を有しており、動物で実施するｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性試験の実施要件を満たすことが出来ることが示された。
【００１１】
本発明においては、デオキシポドフィロトキシン対β-シクロデキストリン誘導体の好ましいモル比は１：１〜１：１０であり、本発明の以下に記載されるβ-シクロデキストリン誘導体はスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。
【００１２】
実験によって、包接錯体中のβ-シクロデキストリン対ＤＰＴのモル比の違いにより、ＤＰＴの溶解度が異なってくることが判明した。異なる条件下でＨＰ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を調製し、包接錯体中のＤＰＴ濃度を紫外分光光度法で測定し、続いて、包接錯体中のＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤの組成物のモル比を求め、中国薬局方（中国▲薬▼典；Chinese Pharmacopeia）２００５年版の凡例に規定された方法に基づいて包接錯体の水溶解度を測定し、この包接錯体におけるＤＰＴの溶解度の計算を行った。実験結果を表1に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】
表１によって、包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ比率が増大するに従って、ＤＰＴの溶解度が上昇することがわかる。包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が２．２４：１のとき、ＤＰＴの溶解度が５９７ｍｇ／Ｌに上昇するのでｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的試験の実施要件を満たす。
【００１５】
一方、包接錯体中のＨＰ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が６．３５：１より高くなると、ＤＰＴの溶解度は上昇するが相対的な上昇度が緩やかになり、より重要なこととして、反応溶液においてＨＰ-β-ＣＤが非常に高濃度なので反応システム中で非常に高粘性となり、濾過、濃縮、乾燥等のプロセスが困難で操作性が悪くなる。したがって、包接錯体の調製のためにＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤを使用する場合は、ＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤのモル比は１：２．２４〜１：６．３５であることが好ましい。
【００１６】
同様に、ＳＢＥ-β-ＣＤをＤＰＴの包接のために選択する場合は、表２に示されるように包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が異なる場合、ＤＰＴの溶解度は異なる値を示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】
表２によって、包接錯体のＳＢＥ-β-ＣＤ比率が増大するに従って、ＤＰＴの溶解度が上昇することがわかる。包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が１．００：１のとき、ＤＰＴの溶解度が６１５ｍｇ／Ｌに上昇するのでｉｎ ｖｉｖｏ薬力学的試験の実施要件を満たすことが出来る。
【００１９】
包接錯体中のＳＢＥ-β-ＣＤ対ＤＰＴのモル比が８．０６より高くなると、ＤＰＴの溶解度は上昇するが相対的な上昇度が緩やかになり、より重要なことは、反応溶液の粘性が非常に高くなり、濾過、濃縮、乾燥等のプロセスが困難で操作性が悪くなる。したがって、包接錯体の調製のためにＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤを使用する場合は、ＤＰＴ対ＳＢＥ-β-ＣＤのモル比は１：１．００〜１：８．０６であることが好ましい。
【００２０】
表１と表２を比較してみると、ＳＢＥ-β-ＣＤのＤＰＴ可溶化能はＨＰ-β-ＣＤよりも高いことがわかる。したがって、ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ抗癌活性試験に選択する。
【００２１】
本発明における包接錯体の調製方法は以下のとおりである。すなわち、β-ＣＤ誘導体の水溶液を調製した後、保温状態で撹拌または破砕を行い、次いで、ＤＰＴをエタノール、アセトン、メタノール等の有機溶媒に溶かした後、β-シクロデキストリン誘導体の水溶液に滴下し、その後保温状態での撹拌または破砕を継続して、乾燥させることで包接錯体を得る。
【００２２】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、β-ＣＤ誘導体で調製された水溶液の濃度が３０〜４０％Ｗ／Ｖである。
【００２３】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、包接のための温度が４０〜７０℃である。より好ましくは、温度が５０〜５５℃である。
【００２４】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、有機溶剤はエタノールである。
【００２５】
また、本発明における包接錯体の調製方法においては、好ましくは、ＤＰＴ溶液が滴下された後の撹拌または破砕を続ける時間は０．５〜３時間、より好ましくは１〜２時間である。
【００２６】
実験によって、異なる条件で調製されたＤＰＴ-β-ＣＤ包接錯体では、異なる結果となることが示された。
【００２７】
［ＤＰＴ-ＨＰ-β-ＣＤ包接錯体の調製］
水溶液から撹拌-減圧濃縮-乾燥法により調製する、具体的な操作方法を以下に示す。
異なる濃度のＨＰ-β-ＣＤ水溶液１００ｍｌを調製し、ビーカー内で加熱しながらマグネチックスターラーによる撹拌を実施し、ＤＰＴエタノール溶液の添加（ＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤが１対２のモル比となるように添加）を行い、添加後所定時間の保温撹拌を続けた後、０．４５μｍのフィルター膜を用いて高温状態のまま溶液を濾過し、抱合されていないＤＰＴは除去し、ろ液をロータリーエバポレーターを用いて真空乾燥させて、最終的に白色個体を得る。
【００２８】
ＨＰ-β-ＣＤ溶液濃度、包接の温度、包接の時間の３つの因子に関しては、直交解析を３つのレベル（ＨＰ-β-ＣＤの濃度が１０％、２０％、３０％。温度が４０℃、５０℃、６０℃。時間が１時間、２時間、３時間）で実施し、包接錯体中のＤＰＴの含有量と溶解度を包接の有効性の評価パラメータとして使用した。これらの結果を表３に示す。包接錯体中のＤＰＴ含有量を紫外分光光度法で測定し、溶解度を中国薬局方２００５年版の凡例に規定された方法で測定した、これらの結果を表４に示す。
【００２９】
表３の総合スコアに対するＲ値から以下のように判断された、すなわち、３つの因子の中で包接の有効性に最も大きな影響を与えるのは、ＨＰ-β-ＣＤ濃度であり、３０％の場合が最良であった。次に影響度が大きいのは温度であり、５０℃が最良であった。影響度が一番小さいのは時間で、１時間が好ましい。したがって、包接するための最適条件は以下のようになる。すなわち、３０％濃度のＨＰ-β-ＣＤ水溶液を用いて、温度は５０℃とし、ＤＰＴのエタノール溶液滴下後の撹拌継続時間は１時間となる。
【００３０】
上述の９つの試料におけるＤＰＴ対ＨＰ-β-ＣＤのモル比は１：２．０７〜１：２．４０、平均は１：２．２４であり、溶解度は３５２〜９４３ｍｇ／Ｌであり、平均は５９７ｍｇ／Ｌである。
【００３１】
【表３】
【００３２】
【表４】
【００３３】
［ＤＰＴ-ＳＢＥ-β-ＣＤ包接錯体の調製］
水溶液からの撹拌-凍結乾燥法により調製する、具体的な操作方法を以下に示す。
異なる濃度のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液１００ｍｌを調製し、ビーカー内で加熱しながらマグネチックスターラーによる撹拌を実施し、ＤＰＴアセトン溶液の添加（ＤＰＴとＨＰ-β-ＣＤが１対３のモル比となるように添加）を行い、次に、添加後所定時間の保温撹拌を続けた後、溶液を室温で２時間保存し、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を濾過し、ろ液を冷凍機内で１２時間予備凍結し、凍結乾燥器で４８時間凍結乾燥させ、最後に、白色個体を得る。
【００３４】
ＳＢＥ-β-ＣＤ溶液濃度、包接の温度、包接の時間の３つの因子に関しては、直交解析を３つのレベル（ＳＢＥ-β-ＣＤの濃度が１０％、２５％、４０％。温度が４０℃、５５℃、７０℃。時間が０．５時間、１時間、２時間）で実施し、包接錯体中のＤＰＴの含有量と溶解度を包接の有効性の評価パラメータとして使用した。これらの結果を表５に示す。包接錯体中のＤＰＴ含有量を紫外分光光度法で測定し、溶解度を中国薬局方２００５年版の凡例に規定された方法で測定した、これらの結果を表６に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】
【表６】
【００３７】
表５の総合スコアに対するＲ値から以下のように判断された、３つの因子の中で包接の有効性に最も大きな影響を与えるのは、ＳＢＥ-β-ＣＤ濃度であり、４０％の場合が最良であった。次に影響度が大きいのは温度であり、５５℃が最良であった。影響度が一番小さいのは時間で、好ましいのは２時間である。したがって、包接反応のための最適条件は以下のようになる。すなわち、４０％濃度のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液を用いて、温度は５５℃とし、ＤＰＴアセトン溶液滴下後の撹拌継続時間は２時間となる。
【００３８】
上述の９つの試料におけるＤＰＴ対ＳＢＥ-β-ＣＤのモル比は１：２．７４〜１：３．８９、平均は１：３．２７であり、溶解度は７３６〜５０９５ｍｇ／Ｌであり、平均は２３５１ｍｇ／Ｌである。
【００３９】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を用いて１種類の動物腫瘍細胞および６種類のヒト腫瘍細胞に対して実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験では、ＤＰＴは顕著な抑制効果を示した。すなわち、マウス神経膠細胞腫細胞株（Ｃ６）、ヒト肺腺癌細胞株（Ａ-５４９）、ヒト白血病細胞株（ＨＬ-６０）、ヒト赤血病細胞株（Ｋ-５６２）、ヒト子宮頚癌細胞株（Ｈｅｌａ）、及びヒト胃癌細胞株（ＢＧＣ-８２３）に対する抑制効果はエトポシド（濃度は１０−５〜１０−８Ｍの範囲）よりも有意に良好である。
【００４０】
さらに、ＤＰＴにおいては、１０−５〜１０−８Ｍの濃度範囲では上述した全ての株に対する抑制効果について大きな変化は見られないが、一方で、エトポシドについては、１０−５から１０−８Ｍまで濃度が下がるに従って抑制効果が顕著に低下する。
【００４１】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を生理食塩水に溶解後、尾静脈に静脈内注射することによる、マウスの移植腫瘍Ｓ１８０及びＨｅｐｓに対する抑制効果試験を以下に示す：ＤＰＴの投与量が１０、５ｍｇ／Ｋｇのとき、Ｓ１８０に対しては腫瘍抑制率はそれぞれ５４．５３％と４１．６７％であり、Ｈｅｐｓに対してはそれぞれ５２．０９％および４２．２７％となり、有意な抑制効果を観察できた。すなわち、陽性対照であるシクロホスファミド（２０ｍｇ／Ｋｇ）とエトポシド（２０ｍｇ／Ｋｇ）の腫瘍抑制効果と類似していた。
【００４２】
ＳＢＥ-β-ＣＤとＤＰＴの包接錯体を水に溶解後、ヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０株移植ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射することによる移植腫瘍の増殖抑制効果試験によって、以下について判明した：ＤＰＴの投与量が８ｍｇ／Ｋｇでは、腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）は４９．６８％で、腫瘍抑制率は４３．０８％であり、顕著な抑制作用が見られ、陽性対照であるエトポシド（２０ｍｇ／Ｋｇ）の抑制効果と類似するものであった。さらに、この試験によって以下のことがが判明した：ＤＰＴの投与群は実験動物の優位な体重減少は見られず、一方で、エトポシド群においては実験動物の体重が有意に減少した。これはＤＰＴの毒性がエトポシドよりも低いことを示す。
【００４３】
ＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体の薬理試験及びその結果を下記に示す。
［複数の腫瘍細胞に対するＤＰＴ包接錯体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性試験］
腫瘍株はＡ-５４９（ヒト肺腺癌細胞株）、ＢＧＣ-８２３（ヒト胃癌細胞株）、Ｃ-６（マウス神経膠細胞腫細胞株）、Ｈｅｐ Ｇ２（ヒト肝癌細胞株）、ＨＬ-６０（ヒト白血病細胞株）、Ｋ-５６２（ヒト赤血病細胞株）、Ｈｅｌａ（ヒト子宮頚癌細胞株）である。試験試料はＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり（含有量は５．０５％）、対照薬はエトポシド注射液（５ｍｌ ０．１ｇ；Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製）である。予め、各薬物を生理食塩水を用いて１０−２Ｍ濃度に調製しておき、５つの濃度勾配、すなわち、Ｃ１ ５×１０−５Ｍ、Ｃ２ １０−５Ｍ、Ｃ３ １０−６Ｍ、Ｃ４ １０−７Ｍ、Ｃ５ １０−８Ｍ、に希釈して試験液として用いた。
【００４４】
実験方法：指数増殖期にある各腫瘍細胞株を一定量で９６-ウェルプレートに接種し、各細胞を２４時間培養した後、選択した各試料を添加（接種した後であれば懸濁細胞を直接添加できる）し、次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後で、ＭＩＴを４時間のさらなる培養のために添加し、最後に、試料をＤＭＳＯで溶解した後にマイクロプレートリーダーで検査する。結果を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】
結果から以下のことが判明した。ＤＰＴが１つの動物腫瘍細胞と６つのヒト腫瘍細胞に対して有意な抑制効果を持つことが示された。すなわち、マウス神経膠細胞腫細胞株（Ｃ６）、ヒト肺腺癌細胞株（Ａ-５４９）、ヒト白血病細胞株（ＨＬ-６０）、ヒト赤血病細胞株（Ｋ-５６２）、ヒト子宮頚癌細胞株（Ｈｅｌａ）、ヒト胃癌細胞株（ＢＧＣ-８２３）に対する抑制効果はエトポシド（濃度は１０−５〜１０−８Ｍの範囲）よりも有意に良好であった。
【００４７】
作用の特徴は以下の通りである。ＤＰＴにおいては、１０−５〜１０−８Ｍの濃度範囲では上述した全ての株に対する抑制効果について大きな変化は見られないが、一方で、エトポシドについては、１０−５から１０−８Ｍまで濃度が下がるに従って抑制効果が顕著に低下した。
【００４８】
［マウスの移植腫瘍Ｓ１８０及びＨｅｐｓに対するＤＰＴ包接錯体の尾静脈注射による抑制効果］
試験試料：ＤＰＴおよびＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり、その含有量は５．０５％であり、生理食塩水で所定濃度に調製する。
実験群：ＤＰＴ群については１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇを設け、加えて、ブランク対照群、及び、陽性対照群としてのシクロホスファミド（ＣＴＸ）群とエトポシド群を設けた。
投与経路：尾静脈への注射とした。体重当たり投与量として０．４ｍｌ／２０ｇとなるように投与した。
投与期間：薬物は株接種から２４時間後の投与し、その後２日おきに１回、合計４回の投与とした。
【００４９】
実験方法：標準体重１８〜２２ｇである６０匹のＩＣＲマウスに対し、移植腫瘍の試験法に従って、Ｓ１８０またはＨｅｐｓの固形腫瘍を接種した。マウスの前肢の脇の下に０．２ｍｌの皮下接種を実施し、接種２４時間後に体重を測定した後、ブランクコントロール群、ＣＴＸ群（２０ｍｇ／ｋｇ）、エトポシド群（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＤＰＴ群（１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇ）の６群に無作為に分ける。薬物は接種から２４時間後に投与し、その後２日おきに１回、合計４回投与を行い、投薬終了後、次に、腫瘍耐性マウスを殺して体重を測定し、分離した腫瘍塊を測定し、全てのデータの統計分析（t検定）をする。実験結果を表８と表９に示す。
【００５０】
【表８】
【００５１】
実験結果から以下のことがわかる。マウス移植腫瘍Ｓ１８０に対しては、ブランクコントロール群との比較により、ＤＰＴ群（１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）は腫瘍抑制率がそれぞれ５４．５３％と４１．６７％であり、これら２つの投与量はＳ１８０腫瘍の増殖を有意に（Ｐ＜０．０１）に抑制している。
【００５２】
次に、マウス移植腫瘍Ｈｅｐｓに関しては、ブランクコントロール群との比較により、ＤＰＴ群（１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）の腫瘍抑制率はそれぞれ５２．０９％と４２．２７％であり、これらの２つの投与量はＨｅｐｓ腫瘍の増殖を有意（Ｐ＜０．０１）に抑制している。
【００５３】
これらは、抗腫瘍薬の研究ガイダンスに関する中国のＳＦＤＡの要求（抑制率は４０％を超えなければならない）を満たしていることを示す。抗腫瘍効果は、陽性対照であるシクロホスファミド（２０ｍｇ／ｋｇ）とエトポシド（２０ｍｇ／ｋｇ）の効果に類似している。
【００５４】
【表９】
【００５５】
［ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌の移植腫瘍の増殖に対するＤＰＴ包接錯体の抑制効果」
試験試料：ＤＰＴとＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体であり、その含有量は５．０５％である。
調製方法：至適量の食塩水中に穏やかに振盪しながらで溶解して濃度を０．４ｍｇ／ｍｌ（これは、８ｍｇ／ｋｇ群の試験液）に調製し、別の濃度のものは０．４ｍｇ／ｍｌ溶液を生理食塩水を用いて必要な濃度まで希釈して調製した。
【００５６】
対照試料：Ｑｉｌｕ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．製造のエトポシド注射液、バッチ番号は８０６００１２ＥＶ、規格は５ｍｌ ０．１ｇ。
調製方法：エトポシド注射液は透明性、粘着性があり、至適量の生理食塩水で希釈し、穏やかに振とうして均一な溶液として調製するが、濃度は１ｍｇ／ｍｌとした。
【００５７】
用量の設定：ＤＰＴの高用量群は８ｍｇ／ｋｇ、ＤＰＴの中用量群は４ｍｇ／ｋｇ、ＤＰＴの低用量群は２ｍｇ／ｋｇとした。陽性対照群であるエトポシド注射液の用量は２０ｍｇ／ｋｇである。
【００５８】
実験動物：採取源、生殖細胞系および血統：ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスはＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより提供されている。日令：３５〜４０日。体重：１８〜２４ｇ。性別：オス。
【００５９】
移植腫瘍：ヒト非小細胞肺癌株Ｈ４６０のヌードマウスへの移植腫瘍。さらには、ヌードマウスの脇の下にヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０細胞株を皮下接種。細胞接種量は２×１０６とした。
【００６０】
［実験方法］
指数増殖期にあるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０細胞株を無菌状態下で、２×１０７／ｍｌの細胞懸濁液として調製し、０．１ｍｌをヌードマウスの右脇の下に皮下接種する。ヌードマウスの移植腫瘍の直径をスライドカリパスで測定し、腫瘍が１００〜３００ｍｍ３に増殖したら動物を異なる群に無作為に分ける。試験試料の抗腫瘍効果を、腫瘍の直径を計測することで動的に観察する。腫瘍の直径を２日に１回測定する。体重当たり投与量は０．４ｍｌ／２０ｇである。投与から２１日後にマウスを殺し腫瘍を外科的に分離して重さを測る。腫瘍体積（tumor volume;ＴＶ）の計算式は以下の通りである：
ＴＶ ＝ １／２×ａ×ｂ２
ここで、ａとｂは、それぞれ全長と幅を表す。
【００６１】
計測値に基づき相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算するが、計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０である。ここで、Ｖ０はグループ化と薬物投与が行われた間に測定された腫瘍の大きさであり（ｄ０）、Ｖｔは複数回行った各測定時の腫瘍の大きさである。抗腫瘍活性の評価パラメータは相対的腫瘍増殖倍率Ｔ／Ｃ（％）であり、以下の式で計算した。
【数１】
ＴＲＴＶ：治療群ＲＴＶ、ＣＲＴＶ：陰性対照群：ＲＴＶ。
【００６２】
［実験結果］
ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍に関する、ＤＰＴ実験的治療の結果を表１０と表１１に示す。ＤＰＴを尾静脈を介した静脈注射で、投薬量８ｍｇ／ｋｇで週３回、合計９回投与した。ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍のＴ／Ｃ（％）は４９．６８％、腫瘍抑制率は４３．０８％である。ＤＰＴ投与群では、各群において実験動物の体重におよぼす明らかな抑制作用はみられなかった。
【００６３】
陽性対照としてエトポシド注射液を尾静脈へ注射した群では、投与量２０ｍｇ／ｋｇで週３回、合計９回投与したが、ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０の移植腫瘍のＴ／Ｃ（％）は３２．１８％、腫瘍抑制率は６１．０８％である。但し、動物の体重に対して明らかな抑制作用があり、明確な毒性がみられた。
【００６４】
［結論］
ヌードマウスにおけるヒト非小細胞肺癌Ｈ４６０移植腫瘍に関するＤＰＴのＴ／Ｃおよび腫瘍抑制率の実験結果によると、ＤＰＴはヌードマウスでのヒト非小細胞肺癌の移植腫瘍Ｈ４６０の増殖におよぼす抑制効果は顕著であり、ＤＰＴは良好な抗癌活性を備えること、新規の抗腫瘍剤の有効性に関する中国のＳＦＤＡの要件（Ｔ／Ｃ＜６０％、腫瘍抑制率＞４０％）を満たしており、加えて毒性は比較的少ないこと、が示された。
【００６５】
【表１０】
【００６６】
【表１１】
【００６７】
本発明の包接錯体の調製方法にかかる実施例を以下に示す。
【実施例１】
【００６８】
３０％のＨＰ-β-ＣＤ水溶液１００ｍＬを５００ｍｌの三つ首フラスコに移し、ウォーターバスで加熱して５０±５℃の温度に維持し、撹拌しながら１０％ＤＰＴエタノール溶液４４ｍｌを滴下した後、さらに１時間保温撹拌を継続すると同時に、エタノール蒸気を収集した。
【００６９】
次いで、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を高温状態のまま濾過し、濾液を薄膜式エバポレーターで減圧濃縮させて、得られた粘性の物質を真空乾燥させることで、３３．６ｇの白色メッシュが得られた。紫外分光光度法による測定で、ＤＰＴ含有量は１２．１２％であった。また、２００５年版の中国薬局方の凡例の方法によって測定された、得られた包接錯体におけるＤＰＴの水溶解度は、８４．１％（ｍｇ／ｍｌ）であった。
【実施例２】
【００７０】
化合物２の調製
３０％のＳＢＥ-β-ＣＤ水溶液１００ｍＬを２００ｍｌの三つ首フラスコに移し、ウォーターバスで加熱して５０±５℃の温度に維持し、撹拌しながら１０％ＤＰＴアセトン溶液３７．３ｍｌを滴下した後、さらに２時間保温撹拌を継続してから室温で２時間保持し、その後、０．４５μｍのフィルター膜で溶液を高温状態のまま濾過した。
【００７１】
次いで、濾液を１２時間予備凍結してから、-４５℃で４８時間凍結乾燥させることで白色の多孔質固体６２．９ｇを得た。紫外分光光度法による測定で、ＤＰＴ含有量は５．０５％であった。また、２００５年版の中国薬局方の凡例の方法によって測定された、得られた包接錯体におけるＤＰＴの水溶解度は、４６０％（ｍｇ／ｍｌ）であった。
【００７２】
ＤＰＴ-ＳＢＥ-β-ＣＤの包接錯体に対するＸ線粉末回折スペクトルを図１に示し、示差走査熱量計（ＤＳＣ）についての図を図２として示す。これらにより、当該化合物が確実に得られていることが示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシポドフィロトキシンとβ-シクロデキストリン誘導体の包接錯体であって、
前記デオキシポドフィロトキシン対前記β-シクロデキストリン誘導体のモル比が１：１〜１：１０であり、
前記β-シクロデキストリン誘導体がスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであることを特徴とする、デオキシポドフィロトキシンとβ-シクロデキストリン誘導体の包接錯体。
【請求項２】
前記β-シクロデキストリン誘導体がスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンであり、前記デオキシポドフィロトキシン対前記スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンのモル比が１：１．００〜１：８．０６であることを特徴とする、請求項１に記載の包接錯体。
【請求項３】
前記デオキシポドフィロトキシン対前記スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンのモル比が１：２．３３〜１：６．４２であることを特徴とする、請求項２に記載の包接錯体。
【請求項４】
前記β-シクロデキストリン誘導体がヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、前記デオキシポドフィロトキシン対前記ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンのモル比が１：２．２４〜１：６．３５であることを特徴とする、請求項１に記載の包接錯体。
【請求項５】
β-シクロデキストリン誘導体の水溶液を調製し保温状態で撹拌またはすり潰しを行う工程、エタノール、アセトンもしくはメタノールのＤＰＴ溶液を調製する工程、得られた前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程、前記滴下後に保温状態での撹拌またはすり潰しを継続する工程を経た後、乾燥させることで包接錯体を得る工程からなる、請求項１に記載の包接錯体の製造方法。
【請求項６】
前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液中のβ-シクロデキストリン誘導体の重量／体積濃度が１０〜４０％であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程後の撹拌またはすり潰しを継続する工程における前記保温状態の温度が４０〜７０℃であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程後の撹拌またはすり潰しを継続する工程における前記保温状態の温度が５０〜５５℃であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記滴下後に保温状態での撹拌またはすり潰しを継続する工程における継続時間が０．５〜３時間であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項１０】
小細胞肺癌、悪性リンパ腫、悪性胚腫瘍、白血病、神経膠細胞腫、子宮頚癌、非小細胞肺癌、胃癌、または肝癌を治療する薬物を製造するための、請求項１に記載の包接錯体の使用。
【請求項１】
デオキシポドフィロトキシンとβ-シクロデキストリン誘導体の包接錯体であって、
前記デオキシポドフィロトキシン対前記β-シクロデキストリン誘導体のモル比が１：１〜１：１０であり、
前記β-シクロデキストリン誘導体がスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであることを特徴とする、デオキシポドフィロトキシンとβ-シクロデキストリン誘導体の包接錯体。
【請求項２】
前記β-シクロデキストリン誘導体がスルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンであり、前記デオキシポドフィロトキシン対前記スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンのモル比が１：１．００〜１：８．０６であることを特徴とする、請求項１に記載の包接錯体。
【請求項３】
前記デオキシポドフィロトキシン対前記スルホブチルエーテルβ-シクロデキストリンのモル比が１：２．３３〜１：６．４２であることを特徴とする、請求項２に記載の包接錯体。
【請求項４】
前記β-シクロデキストリン誘導体がヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンであり、前記デオキシポドフィロトキシン対前記ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンのモル比が１：２．２４〜１：６．３５であることを特徴とする、請求項１に記載の包接錯体。
【請求項５】
β-シクロデキストリン誘導体の水溶液を調製し保温状態で撹拌またはすり潰しを行う工程、エタノール、アセトンもしくはメタノールのＤＰＴ溶液を調製する工程、得られた前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程、前記滴下後に保温状態での撹拌またはすり潰しを継続する工程を経た後、乾燥させることで包接錯体を得る工程からなる、請求項１に記載の包接錯体の製造方法。
【請求項６】
前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液中のβ-シクロデキストリン誘導体の重量／体積濃度が１０〜４０％であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程後の撹拌またはすり潰しを継続する工程における前記保温状態の温度が４０〜７０℃であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ＤＰＴ溶液を前記β-シクロデキストリン誘導体水溶液に滴下する工程後の撹拌またはすり潰しを継続する工程における前記保温状態の温度が５０〜５５℃であることを特徴とする、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記滴下後に保温状態での撹拌またはすり潰しを継続する工程における継続時間が０．５〜３時間であることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項１０】
小細胞肺癌、悪性リンパ腫、悪性胚腫瘍、白血病、神経膠細胞腫、子宮頚癌、非小細胞肺癌、胃癌、または肝癌を治療する薬物を製造するための、請求項１に記載の包接錯体の使用。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５０７４０１（Ｐ２０１３−５０７４０１Ａ）
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５３３４６９（Ｐ２０１２−５３３４６９）
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７７５５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４４８２４
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９６７９１）ジェージァン ジェンフォン ファーマシューティカル ホールディングス (1)
【出願人】（５０９０１１７４３）チャイナ ファーマシューティカル ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１日（２０１０．１０．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７７５５４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４４８２４
【国際公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【出願人】（５１２０９６７９１）ジェージァン ジェンフォン ファーマシューティカル ホールディングス (1)
【出願人】（５０９０１１７４３）チャイナ ファーマシューティカル ユニバーシティ (2)
【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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