システインの定量法
【課題】システインを簡便かつ正確に測定できる酵素的定量法を提供する。
【解決手段】試料に、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（Ｅ１）であるο−アセチルセリン−リアーゼを作用させて発生する硫化水素を測定することにより、試料中のシステイン量を求める。
【解決手段】試料に、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（Ｅ１）であるο−アセチルセリン−リアーゼを作用させて発生する硫化水素を測定することにより、試料中のシステイン量を求める。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のシステインを、酵素を用いて簡便かつ正確に測定できるようにしたシステインの定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の蛋白質を構成する硫黄含有アミノ酸としては、メチオニン、システイン、シスチンが知られており、生体内では、それぞれが一連の代謝サイクルの中で恒常性を維持している。
【０００３】
食物中の蛋白質から由来するメチオニンは、通常、生体内でシステインに代謝されており、この代謝過程で中間体として生成するホモシステインは、再メチル化によるメチオニンへの変換、あるいはセリンとの縮合によるシスタチオニンの形成後、システインに導かれる経路により速やかに代謝されるため正常時にはほとんど存在しない。
【０００４】
しかしながら、メチル化を触媒する酵素であるメチルテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼやその補助因子である葉酸及びビタミンＢ１２の欠乏、シスタチオニン形成を触媒するシスタチオニンβシンターゼの機能不全等により、代謝サイクルの中で異常が発生すると、ホモシステインが蓄積されてしてしまう。
【０００５】
一方、システインはメチオニンの代謝により生成するアミノ酸であることから、ホモシステインとの関連が注目されている。最近、ホモシステインとシステインの比を指標として、シスタチオニンβシンターゼのヘテロ接合体遺伝子異常のスクリーニングに有用であるとの報告もなされている（下記非特許文献１参照）。
【０００６】
近年、ホモシステインは、心筋梗塞、脳梗塞などの血栓塞栓症あるいは動脈硬化症において、独立したリスクファクターとして注目されており、血中濃度と疾患との関係における臨床データが数多く報告されている。
【０００７】
また、システインに関しても、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標とも成り得るため、ホモシステイン及びシステインの血中濃度測定は有用と考えられる。
【０００８】
ホモシステインの測定法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が主流で行われており、多くの場合、システインも同時に分離測定できる長所があるが、操作が煩雑で時間を必要とし、多数検体を処理するには不向きである（非特許文献２−４参照）。
【０００９】
最近、ホモシステインの測定法として、酵素反応によってＳ−アデノシルホモシステインに変換し、該変換物に対する抗体を用いて間接的に定量する方法も開発されているが、この方法では、抗原となる変換物もまた低分子であることから、抗体を用いた反応原理は競合阻害法をとらざるを得ず、複雑なものとなっている（非特許文献５参照）。
【００１０】
また、システインの酵素的測定法として、グルタチオン・スルヒィドリル・オキシダーゼを用いた方法（特許文献１参照）が開示されているが、該酵素はグルタチオンやジチオスレイトールのようなチオール化合物にも反応を示すなど基質特異性に乏しく、特異的な測定法とは言い難かった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｏｄｄｉｅ等．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４７（２）；２０７−２１１（１９９８）
【非特許文献２】Ａｒａｋｉ等.，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４２２；４３−５２（１９８７）
【非特許文献３】Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄ等.，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（２）；２６３−２７１（１９９３）
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（８）；１５９０−１５９７（１９９３）
【非特許文献５】Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ等．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１(７)；９９１−９９４（１９９５）
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許１５９４８９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
酵素を用いたホモシステイン及びシステインの測定法は、操作性などの面から有用と考えられるが、上述したように、現在までその測定系に応用可能な特異的な酵素が見出されていない。
【００１４】
したがって、本発明は、血栓塞栓症や動脈硬化症の指標となるホモシステインや、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標となるシステインに関し、簡便で特異的な酵素的定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明のシステインの定量法は、試料に、ο−アセチルセリン−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素を測定することを特徴とする。
【００１６】
本発明によれば、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（以下「Ｅ１」ともいう。）であるο−アセチルセリン−リアーゼを用いることにより、システイン定量の操作が簡便となり、多数の検体も短時間で定量することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する作用を有する酵素を用いることにより、簡便にシステインの定量ができる。
【００１８】
本発明のシステインの定量法は、多数の検体を処理する場合などに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】システイン共存及び非共存下でのホモシステインの検量線を示す図表である。
【図２】ホモシステイン共存及び非共存下でのシステインの検量線を示す図表である。
【図３】システインの検量線を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、これまでアミノ酸合成作用（例えば、ο−アセチルホモセリンと硫化水素からはホモシステインが、メタンチオールからはメチオニンが生成する作用）を有する酵素として知られていたが、本発明者らは、後述する試験例に示すように、この酵素をチオール化合物存在下でホモシステインに作用させると、γ−置換反応により硫化水素を生成する触媒作用を示すことを新たに見い出した。
【００２１】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、ホモシステイン及びシステインを基質として硫化水素を生成する作用を有する酵素（以下「Ｅ２」ともいう。）であり、ホモシステインの定量に利用できる。
【００２２】
すなわち、Ａ）試料に、ホモシステイン及びシステインを基質として硫化水素を生成する作用を有する酵素（Ｅ２）であるο−アセチルホモセリン−リアーゼを作用させて、生成する硫化水素量（１）を測定する工程と、Ｂ）該試料中のシステイン由来の硫化水素量（２）を測定する工程とを行い、前記硫化水素量（１）から前記硫化水素量（２）を差し引いた硫化水素量からホモシステインを定量することができる。そのホモシステインの定量法においては、あらかじめ上記酵素（Ｅ２）を用いて、システイン含量と硫化水素生成量の関係を定数化しておき、システインとホモシステインを含有する試料に上記酵素（Ｅ２）をある条件下で作用させ、発生する硫化水素量（１）を測定する。次に、別途求めた該試料中のシステイン含量から、上記定数を用いてシステイン由来の硫化水素量（２）を求め、それを硫化水素量（１）から差し引くことにより、試料中のホモシステイン含量を求めることもできる。
【００２３】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、それを産生する様々な微生物（例えば、Ｏｚａｋｉ等.,Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１；１１６３−１１７１（１９８２）、Ｙａｍａｇａｔａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６；１５１１−１５２３(１９８４)、Ｂｒｚｙｗｃｚｙ等．，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ．Ｐｏｌｏｎｉｃａ．４０（３）；４２１−４２８（１９９３））等から公知の方法により得ることができる。
【００２４】
また、市販の酵素、例えばユニチカ株式会社製のバチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」）を使用してもよい。ユニチカ株式会社製の上記ο−アセチルホモセリン−リアーゼの理化学的性質は次の通りである。なお、下記理化学的性質のうち、分子量以外の項目は、本発明者らにより求めたものである。
【００２５】
＜ο−アセチルホモセリン−リアーゼの理化学的性質＞
１）作用：Ｌ−ホモシステインとチオール化合物のγ置換反応を触媒し、硫化水素及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。また、Ｌ−メチオニンとチオール化合物の置換反応を触媒し、メタンチオール及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。
２）基質特異性：Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニンに作用する。また、Ｌ−システインにはβ置換反応として若干反応する。
３）分子量：１８０，０００（ゲル濾過法）
４）至適ｐＨ：８．５〜９．０
５）Ｋｍ：０．９ｍＭ（Ｌ−ホモシステイン）
【００２６】
本発明であるシステインの定量法においては、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（Ｅ１）を用いる。このような酵素としては、チオール化合物存在下で置換反応を触媒する酵素、すなわち、ο−アセチルセリン−リアーゼが挙げられる。
【００２７】
ο−アセチルセリン−リアーゼは、これまでシステイン合成作用（ο−アセチルセリンと硫化水素からシステインを生成する作用）を有する酵素として知られていたが、今回本発明者らによって、チオール化合物存在下で、システインに作用させると、システイン特異的にβ−置換反応により硫化水素を生成する触媒作用を示すことが新たに見出された。
【００２８】
本発明において、ο−アセチルセリン−リアーゼは、それを産生する微生物や植物（例えば、Ｂｕｒｎｅｌｌ等．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４８１；２４６−２６５（１９７７）、Ｎａｇａｓａｗ等．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４３；４７４−４７８（１９８７）、Ｄｒｏｕｘ等．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９５（２）；３７９−３９０（１９９２）、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２５１；9１−９８（１９９５））等より公知の方法で得ることができる。
【００２９】
例えば、植物（ホウレンソウ）から得たο−アセチルセリン−リアーゼの理化学的性質は次の通りである。なお、下記理化学的性質のうち、分子量以外の項目は、本発明者らにより求めたものである。
【００３０】
＜ο−アセチルセリン−リアーゼの理化学的性質＞
１）作用：Ｌ−システインとチオール化合物のβ置換反応を触媒し、硫化水素及びチオール化合物置換システインを生成する。
２）基質特異性：Ｌ−システインに特異的に作用する。
３）分子量：６３，０００（ゲル濾過法）
４）至適ｐＨ：９．０〜１１．０
５）Ｋｍ：０．２７ｍＭ（Ｌ−システイン）
本発明であるシステインの定量方法、又は上述のホモシステインの定量において、上記酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）の添加量は、試料中のホモシステイン又はシステインを完全に消費することができる最低必要量を基本とする。
【００３１】
特に、ホモシステインの定量においては、システインに対する反応が、システイン含量依存的に進行する条件とすることが好ましい。これは、酵素（Ｅ１）の添加量や反応時間を増減することによって、システインから生成する硫化水素量を調節することで達成される。
【００３２】
ホモシステイン及びシステインは、血清などの生体試料中では主に生体内タンパク質とジスルフィド結合しており、一部は遊離ジスルフィド形態として存在している。よって、上記酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）は、フリーな遊離状態のホモシステイン及びシステインに作用させるため、チオール類、ホスヒィン類や水素化硼素類などの還元剤を用いて解離処理を行うことが好ましい。特にチオール類は、容易にホモシステイン及びシステインを特異的に還元し、さらにそのまま酵素反応も行うことができるため好ましい。
【００３３】
本発明で用いられるチオール化合物は、メタンチオール、２−メルカプトエタン、ジチオスレイトール、チオグリセロール、システアミンなど、酵素による置換反応の基質となるものであれば特に制限無く使用できる。
【００３４】
例えば、上述のホモシステインの定量は、以下のようにして行われる。
（i）あらかじめ、システイン及びホモシステインに、上記酵素（Ｅ２）を作用させたときに発生する硫化水素量とシステイン及びホモシステイン含量の定数をそれぞれ求めておく。
（ii）試料に上記還元剤を添加して、試料中のホモシステイン及びシステインを還元したあと、上記酵素（Ｅ２）を添加して反応を行い、発生する硫化水素量（１）を測定する。
（iii）試料中に含まれるシステイン含量を、公知の方法又は本発明のシステイン定量法などにより求め、上記定数から換算して、硫化水素量（２）とする。
（iv）上記硫化水素量（１）から硫化水素量（２）を差し引いたものと上記定数から換算して試料中のホモシステイン量を求める。
【００３５】
また、上記方法以外としては、まず上述した２種類の酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）を用いて、生成した硫化水素量からホモシステイン及びシステインの総和を求め、次にシステインに特異的な酵素（Ｅ１）のみを作用させ、生成した硫化水素量をシステイン量とし、総和から差し引くことによりホモシステイン含量を求める方法も可能である。
【００３６】
一方、本発明であるシステインの定量法も、上述したホモシステインの定量法と同様に、以下のようにして行うことができる。
（i）あらかじめ、システインに、上記酵素（Ｅ１）を作用させたときに発生する硫化水素量とシステイン含量の定数を求めておく。
（ii）試料に上記還元剤を添加して、試料中のシステインを還元したあと、上記酵素（Ｅ１）を添加して反応を行い、発生する硫化水素量を測定して上記定数からシステイン量に換算する。
【００３７】
ホモシステイン及びシステインの定量は、酵素の反応生成物である硫化水素を測定することにより行われるが、その硫化水素を定量する方法は、公知の方法を使用することができ、硫化水素を直接定量する方法のみならず、硫化水素に起因する硫化物イオンを定量する方法であってもよい。
【００３８】
例えば、発色検出として、２，２’−ジピリジルジスルファイド（Ｓｖｅｎｓｏｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７；５１−５５（１９８０））やニトロプルシッドナトリウムを用いる方法、さらに、強酸性下で、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンと塩化第二鉄を用いてメチレンブルーを生成させ青色発色を検出する方法（メチレンブルー法）などを用いることができる。また、セレニウムを触媒として、色素（トルジンブルーやメチレンブルー）の退色量及びその速度を測定する方法（Ｍｏｕｓａｖｉ等．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６５；２７７０−２７７２(１９９２)、Ｇｏｋｍｅｎ等．，Ａｎａｌｙｓｔ １１９；７０３−７０８（１９９４））などがあるが、チオール化合物存在下で硫化水素の定量を行う場合は、特異性及び発色感度が良好なメチレンブルー法が好適である。
【実施例】
【００３９】
以下、試験例及び実施例、又は参考例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
参考例としては、ホモシステインの定量に用いる酵素（Ｅ２）として、バチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製、以下に記載した力価はメーカー表示値による）を使用し、実施例としては、システイン定量に用いる酵素（Ｅ１）として、ο−アセチルセリン−リアーゼ（ホウレンソウ由来）を使用した。
【００４１】
ο−アセチルセリン−リアーゼは、山口等の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２５１；９１−９８(１９９５)）に基づいて調製した。
【００４２】
具体的には、ホウレンソウ葉２ｋｇから、抽出、イオン交換クロマト、疎水クロマト及びゲル濾過クロマトの工程を経て、約４０００単位の酵素を調製して用いた。なお、力価は、同文献に記載の方法により測定した。
【００４３】
試験例１
２０ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭＤＬ−ホモシステイン（アルドリッチ社製）を含有する１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）を添加し、３７℃で反応させ、経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを、表１に示す条件でＨＰＬＣにて分析した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
その結果、反応の進行と共にリテンションタイム６．７分のＤＬ−ホモシステインのピークが減少し、新たにリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。
【００４６】
試験例２
ＤＬ−ホモシステインをＬ−メチオニンに換え、試験例１と同様の条件で反応させた。また、ο−アセチルホモセリン−リアーゼと同様の作用を有すると考えられるＬ−メチオニンγ−リアーゼ（和光純薬株式会社製）をο−アセチルホモセリン−リアーゼに換えて添加し、同様の条件で反応させ、ＨＰＬＣで分析を行った。
【００４７】
その結果、いずれの場合もリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。
【００４８】
試験例１及び２の結果において、ο−アセチルホモセリン−リアーゼをＤＬ−ホモシステイン及びＬ−メチオニンに作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが共に一致していること、更にＬ−メチオニンγ−リアーゼを作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムもすべて一致していることから、ο−アセチルホモセリン−リアーゼの作用は、下記化学式１及び化学式２に示す通り、含硫アミノ酸とチオール化合物の置換反応であることがわかった。
【００４９】
【化１】
【００５０】
【化２】
【００５１】
試験例３
２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２５ｍｌに、２００ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０２５ｍｌ加え、さらに１０ｍＭのＬ−システィン（シグマ社製）溶液又は１０ｍＭのＤＬ−ホモシステインを０．０５ｍｌ加えた後、精製水を０．１２５ｍｌ添加させ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、精製したο−アセチルセリン−リアーゼ酵素液（ホウレンソウ由来、６Ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄 塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、Ｌ−システイン添加時の吸光度が１．０１（ＯＤ）だったのに対して、ＤＬ−ホモシステイン添加時の吸光度は０（ＯＤ）であった。よって、ο−アセチルセリン−リアーゼは、ホモシステインに対する反応性はまったく認められず、Ｌ−システインに特異的であることがわかった。
【００５２】
試験例４（ＨＰＬＣによる反応生成物同定）
２０ｍＭメチルメルカプタン（東京化成社製）及び１０ｍＭＬ−システイン（シグマ社製）を含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）にο−アセチルセリン−リアーゼ（ホウレンソウ由来）を添加し、３７℃で反応させ、経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを、前記表１に示す条件でＨＰＬＣにて分析した。
【００５３】
その結果、反応の進行と共にリテンションタイム７．２分のＬ−システインのピークが減少し、新たにリテンションタイム６．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。
【００５４】
試験例５
試験例４のＬ−システインをＳ−メチルシステイン（シグマ社製）に換え、酵素無添加条件で、ＨＰＬＣにてピークを確認した。その結果、リテンションタイム６．８分の位置にピークを確認した。
【００５５】
試験例４及び５の結果から、ο−アセチルセリン−リアーゼをメチルメルカプタン存在下、Ｌ−システインに作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが、Ｓ−メチルシステインと一致していることから、ο−アセチルセリン−リアーゼの作用は、下記化学式３に示す通り、Ｌ−システインとチオール化合物の置換反応であることが分かった。
【００５６】
【化３】
【００５７】
参考例１
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０５ｍｌ加え、さらに、各種濃度(０〜５０μＭ)のＬ−ホモシスチン（シグマ社）溶液を０．０５ｍｌ加えた後、Ｌ−システインの添加回収率を求めるために３００μＭＬ−システインを０．１ｍｌ添加し、Ｌ−ホモシステインへの反応定数を求めるために精製水を０．１ｍｌ添加して、それぞれ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、ο−アセチルホモセリンーリアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）酵素液（２０ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図１に示した。
【００５８】
図１の実線（−◆−）は、Ｌ−システイン非共存下でのホモシステインの検量線で、０〜１００μＭ（Ｌ−ホモシステイン換算）まで直線となり、その回帰式の切片を０として計算すると、傾きは０．９２６であった。
【００５９】
一方、図１の破線（…●…）は、Ｌ−システイン共存下でのホモシステインの検量線で、０〜１００μＭ（Ｌ−ホモシステイン換算）まで直線となり、その回帰式の傾きは０．９１７であり、切片は８０．９となった。
【００６０】
以上の結果から、ο−アセチルホモセリンーリアーゼは、Ｌ−システインの存在にかかわらず、濃度依存的にホモシステインと反応することが分かった。
また、Ｌ−システインに対する反応誤差が一定であることが分かった。
【００６１】
参考例２
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０５ｍｌ加え、さらに各種濃度（０〜４００μＭ）のＬ−システイン（シグマ社）溶液を０．１ｍｌ加えた後、Ｌ−ホモシステインの添加回収率を求めるために１５μＭＬ−ホモシスチンを０．０５ｍｌ添加し、Ｌ−システインへの反応定数を求めるために精製水を０．０５ｍｌ添加して、それぞれ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、ο−アセチルホモセリンーリアーゼ（ユニチカ株式会社製）酵素液（２０ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図２に示した。
【００６２】
図２の実線（−◆−）は、ホモシステイン非存在下でのＬ−システインの検量線で、０〜４００μＭまで直線となり、その回帰式の切片を０として計算すると、傾きは０．２５９であった。
【００６３】
一方、図２中の破線（…●…）は、Ｌ−ホモシスチンを添加した場合のＬ−システインの検量線で、０〜４００μＭまで直線となり、その回帰式の傾きは０．２６３であり、切片は２８．４となった。
【００６４】
以上の結果から、ο−アセチルホモセリンーリアーゼのＬ−システインへの反応が、ホモシステインの存在にかかわらず、濃度依存的であることが分かった。
【００６５】
また、参考例１、２の結果より、添加したＬ−システイン及びＬ−ホモシステインの濃度及び添加回収率を算出した。すなわち、参考例１のＬ−システイン実添加量３００μＭに対して、図１の破線（…●…）の切片値を図２の実線（−◆−）の回帰式に当てはめ、添加濃度を算出すると濃度は３１２μＭとなり、添加回収率は１０４％となった。さらに、参考例２のＬ−ホモシスチン実添加量１５μＭ（Ｌ−ホモシステインとして３０μＭ）に対して、図２の破線（…●…）の切片値を図１の実線（−◆−）の回帰式に当てはめ、添加濃度を算出するとＬ−ホモシステインとしては濃度は３０．７μＭとなり、添加回収率は１０２％となった。
【００６６】
よって、システインを含有した試料中のホモシステイン量は、Ｌ−システイン含量を換算して差し引くことにより、算出可能であることが分かった。
【００６７】
実施例１
２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２５ｍｌに、２００ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０２５ｍｌ加え、さらに各種濃度（０〜２００μＭ）のＬ−システイン（シグマ社）溶液を０．１ｍｌ加えた後、精製水を０．０７５ｍｌ添加させ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、精製したο−アセチルセリンーリアーゼ酵素液（６ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１５分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図３に示した。
【００６８】
図３に示されるように、０〜２００μＭまで直線となり、本酵素が触媒する置換反応を利用してシステインの定量が可能であることが分かった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のシステインを、酵素を用いて簡便かつ正確に測定できるようにしたシステインの定量法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の蛋白質を構成する硫黄含有アミノ酸としては、メチオニン、システイン、シスチンが知られており、生体内では、それぞれが一連の代謝サイクルの中で恒常性を維持している。
【０００３】
食物中の蛋白質から由来するメチオニンは、通常、生体内でシステインに代謝されており、この代謝過程で中間体として生成するホモシステインは、再メチル化によるメチオニンへの変換、あるいはセリンとの縮合によるシスタチオニンの形成後、システインに導かれる経路により速やかに代謝されるため正常時にはほとんど存在しない。
【０００４】
しかしながら、メチル化を触媒する酵素であるメチルテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼやその補助因子である葉酸及びビタミンＢ１２の欠乏、シスタチオニン形成を触媒するシスタチオニンβシンターゼの機能不全等により、代謝サイクルの中で異常が発生すると、ホモシステインが蓄積されてしてしまう。
【０００５】
一方、システインはメチオニンの代謝により生成するアミノ酸であることから、ホモシステインとの関連が注目されている。最近、ホモシステインとシステインの比を指標として、シスタチオニンβシンターゼのヘテロ接合体遺伝子異常のスクリーニングに有用であるとの報告もなされている（下記非特許文献１参照）。
【０００６】
近年、ホモシステインは、心筋梗塞、脳梗塞などの血栓塞栓症あるいは動脈硬化症において、独立したリスクファクターとして注目されており、血中濃度と疾患との関係における臨床データが数多く報告されている。
【０００７】
また、システインに関しても、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標とも成り得るため、ホモシステイン及びシステインの血中濃度測定は有用と考えられる。
【０００８】
ホモシステインの測定法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法が主流で行われており、多くの場合、システインも同時に分離測定できる長所があるが、操作が煩雑で時間を必要とし、多数検体を処理するには不向きである（非特許文献２−４参照）。
【０００９】
最近、ホモシステインの測定法として、酵素反応によってＳ−アデノシルホモシステインに変換し、該変換物に対する抗体を用いて間接的に定量する方法も開発されているが、この方法では、抗原となる変換物もまた低分子であることから、抗体を用いた反応原理は競合阻害法をとらざるを得ず、複雑なものとなっている（非特許文献５参照）。
【００１０】
また、システインの酵素的測定法として、グルタチオン・スルヒィドリル・オキシダーゼを用いた方法（特許文献１参照）が開示されているが、該酵素はグルタチオンやジチオスレイトールのようなチオール化合物にも反応を示すなど基質特異性に乏しく、特異的な測定法とは言い難かった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｏｄｄｉｅ等．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ４７（２）；２０７−２１１（１９９８）
【非特許文献２】Ａｒａｋｉ等.，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４２２；４３−５２（１９８７）
【非特許文献３】Ｆｉｓｋｅｒｓｔｒａｎｄ等.，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（２）；２６３−２７１（１９９３）
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９（８）；１５９０−１５９７（１９９３）
【非特許文献５】Ｓｈｉｐｃｈａｎｄｌｅｒ等．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１(７)；９９１−９９４（１９９５）
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許１５９４８９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
酵素を用いたホモシステイン及びシステインの測定法は、操作性などの面から有用と考えられるが、上述したように、現在までその測定系に応用可能な特異的な酵素が見出されていない。
【００１４】
したがって、本発明は、血栓塞栓症や動脈硬化症の指標となるホモシステインや、ホモシステイン代謝異常の原因把握の補助的な指標となるシステインに関し、簡便で特異的な酵素的定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明のシステインの定量法は、試料に、ο−アセチルセリン−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素を測定することを特徴とする。
【００１６】
本発明によれば、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（以下「Ｅ１」ともいう。）であるο−アセチルセリン−リアーゼを用いることにより、システイン定量の操作が簡便となり、多数の検体も短時間で定量することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する作用を有する酵素を用いることにより、簡便にシステインの定量ができる。
【００１８】
本発明のシステインの定量法は、多数の検体を処理する場合などに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】システイン共存及び非共存下でのホモシステインの検量線を示す図表である。
【図２】ホモシステイン共存及び非共存下でのシステインの検量線を示す図表である。
【図３】システインの検量線を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、これまでアミノ酸合成作用（例えば、ο−アセチルホモセリンと硫化水素からはホモシステインが、メタンチオールからはメチオニンが生成する作用）を有する酵素として知られていたが、本発明者らは、後述する試験例に示すように、この酵素をチオール化合物存在下でホモシステインに作用させると、γ−置換反応により硫化水素を生成する触媒作用を示すことを新たに見い出した。
【００２１】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、ホモシステイン及びシステインを基質として硫化水素を生成する作用を有する酵素（以下「Ｅ２」ともいう。）であり、ホモシステインの定量に利用できる。
【００２２】
すなわち、Ａ）試料に、ホモシステイン及びシステインを基質として硫化水素を生成する作用を有する酵素（Ｅ２）であるο−アセチルホモセリン−リアーゼを作用させて、生成する硫化水素量（１）を測定する工程と、Ｂ）該試料中のシステイン由来の硫化水素量（２）を測定する工程とを行い、前記硫化水素量（１）から前記硫化水素量（２）を差し引いた硫化水素量からホモシステインを定量することができる。そのホモシステインの定量法においては、あらかじめ上記酵素（Ｅ２）を用いて、システイン含量と硫化水素生成量の関係を定数化しておき、システインとホモシステインを含有する試料に上記酵素（Ｅ２）をある条件下で作用させ、発生する硫化水素量（１）を測定する。次に、別途求めた該試料中のシステイン含量から、上記定数を用いてシステイン由来の硫化水素量（２）を求め、それを硫化水素量（１）から差し引くことにより、試料中のホモシステイン含量を求めることもできる。
【００２３】
ο−アセチルホモセリン−リアーゼは、それを産生する様々な微生物（例えば、Ｏｚａｋｉ等.,Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１；１１６３−１１７１（１９８２）、Ｙａｍａｇａｔａ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６；１５１１−１５２３(１９８４)、Ｂｒｚｙｗｃｚｙ等．，Ａｃｔａ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ．Ｐｏｌｏｎｉｃａ．４０（３）；４２１−４２８（１９９３））等から公知の方法により得ることができる。
【００２４】
また、市販の酵素、例えばユニチカ株式会社製のバチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」）を使用してもよい。ユニチカ株式会社製の上記ο−アセチルホモセリン−リアーゼの理化学的性質は次の通りである。なお、下記理化学的性質のうち、分子量以外の項目は、本発明者らにより求めたものである。
【００２５】
＜ο−アセチルホモセリン−リアーゼの理化学的性質＞
１）作用：Ｌ−ホモシステインとチオール化合物のγ置換反応を触媒し、硫化水素及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。また、Ｌ−メチオニンとチオール化合物の置換反応を触媒し、メタンチオール及びチオール化合物置換ホモシステインを生成する。
２）基質特異性：Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニンに作用する。また、Ｌ−システインにはβ置換反応として若干反応する。
３）分子量：１８０，０００（ゲル濾過法）
４）至適ｐＨ：８．５〜９．０
５）Ｋｍ：０．９ｍＭ（Ｌ−ホモシステイン）
【００２６】
本発明であるシステインの定量法においては、システインに特異的に反応して硫化水素を生成する酵素（Ｅ１）を用いる。このような酵素としては、チオール化合物存在下で置換反応を触媒する酵素、すなわち、ο−アセチルセリン−リアーゼが挙げられる。
【００２７】
ο−アセチルセリン−リアーゼは、これまでシステイン合成作用（ο−アセチルセリンと硫化水素からシステインを生成する作用）を有する酵素として知られていたが、今回本発明者らによって、チオール化合物存在下で、システインに作用させると、システイン特異的にβ−置換反応により硫化水素を生成する触媒作用を示すことが新たに見出された。
【００２８】
本発明において、ο−アセチルセリン−リアーゼは、それを産生する微生物や植物（例えば、Ｂｕｒｎｅｌｌ等．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４８１；２４６−２６５（１９７７）、Ｎａｇａｓａｗ等．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４３；４７４−４７８（１９８７）、Ｄｒｏｕｘ等．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９５（２）；３７９−３９０（１９９２）、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２５１；9１−９８（１９９５））等より公知の方法で得ることができる。
【００２９】
例えば、植物（ホウレンソウ）から得たο−アセチルセリン−リアーゼの理化学的性質は次の通りである。なお、下記理化学的性質のうち、分子量以外の項目は、本発明者らにより求めたものである。
【００３０】
＜ο−アセチルセリン−リアーゼの理化学的性質＞
１）作用：Ｌ−システインとチオール化合物のβ置換反応を触媒し、硫化水素及びチオール化合物置換システインを生成する。
２）基質特異性：Ｌ−システインに特異的に作用する。
３）分子量：６３，０００（ゲル濾過法）
４）至適ｐＨ：９．０〜１１．０
５）Ｋｍ：０．２７ｍＭ（Ｌ−システイン）
本発明であるシステインの定量方法、又は上述のホモシステインの定量において、上記酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）の添加量は、試料中のホモシステイン又はシステインを完全に消費することができる最低必要量を基本とする。
【００３１】
特に、ホモシステインの定量においては、システインに対する反応が、システイン含量依存的に進行する条件とすることが好ましい。これは、酵素（Ｅ１）の添加量や反応時間を増減することによって、システインから生成する硫化水素量を調節することで達成される。
【００３２】
ホモシステイン及びシステインは、血清などの生体試料中では主に生体内タンパク質とジスルフィド結合しており、一部は遊離ジスルフィド形態として存在している。よって、上記酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）は、フリーな遊離状態のホモシステイン及びシステインに作用させるため、チオール類、ホスヒィン類や水素化硼素類などの還元剤を用いて解離処理を行うことが好ましい。特にチオール類は、容易にホモシステイン及びシステインを特異的に還元し、さらにそのまま酵素反応も行うことができるため好ましい。
【００３３】
本発明で用いられるチオール化合物は、メタンチオール、２−メルカプトエタン、ジチオスレイトール、チオグリセロール、システアミンなど、酵素による置換反応の基質となるものであれば特に制限無く使用できる。
【００３４】
例えば、上述のホモシステインの定量は、以下のようにして行われる。
（i）あらかじめ、システイン及びホモシステインに、上記酵素（Ｅ２）を作用させたときに発生する硫化水素量とシステイン及びホモシステイン含量の定数をそれぞれ求めておく。
（ii）試料に上記還元剤を添加して、試料中のホモシステイン及びシステインを還元したあと、上記酵素（Ｅ２）を添加して反応を行い、発生する硫化水素量（１）を測定する。
（iii）試料中に含まれるシステイン含量を、公知の方法又は本発明のシステイン定量法などにより求め、上記定数から換算して、硫化水素量（２）とする。
（iv）上記硫化水素量（１）から硫化水素量（２）を差し引いたものと上記定数から換算して試料中のホモシステイン量を求める。
【００３５】
また、上記方法以外としては、まず上述した２種類の酵素（Ｅ１）、（Ｅ２）を用いて、生成した硫化水素量からホモシステイン及びシステインの総和を求め、次にシステインに特異的な酵素（Ｅ１）のみを作用させ、生成した硫化水素量をシステイン量とし、総和から差し引くことによりホモシステイン含量を求める方法も可能である。
【００３６】
一方、本発明であるシステインの定量法も、上述したホモシステインの定量法と同様に、以下のようにして行うことができる。
（i）あらかじめ、システインに、上記酵素（Ｅ１）を作用させたときに発生する硫化水素量とシステイン含量の定数を求めておく。
（ii）試料に上記還元剤を添加して、試料中のシステインを還元したあと、上記酵素（Ｅ１）を添加して反応を行い、発生する硫化水素量を測定して上記定数からシステイン量に換算する。
【００３７】
ホモシステイン及びシステインの定量は、酵素の反応生成物である硫化水素を測定することにより行われるが、その硫化水素を定量する方法は、公知の方法を使用することができ、硫化水素を直接定量する方法のみならず、硫化水素に起因する硫化物イオンを定量する方法であってもよい。
【００３８】
例えば、発色検出として、２，２’−ジピリジルジスルファイド（Ｓｖｅｎｓｏｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７；５１−５５（１９８０））やニトロプルシッドナトリウムを用いる方法、さらに、強酸性下で、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンと塩化第二鉄を用いてメチレンブルーを生成させ青色発色を検出する方法（メチレンブルー法）などを用いることができる。また、セレニウムを触媒として、色素（トルジンブルーやメチレンブルー）の退色量及びその速度を測定する方法（Ｍｏｕｓａｖｉ等．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．６５；２７７０−２７７２(１９９２)、Ｇｏｋｍｅｎ等．，Ａｎａｌｙｓｔ １１９；７０３−７０８（１９９４））などがあるが、チオール化合物存在下で硫化水素の定量を行う場合は、特異性及び発色感度が良好なメチレンブルー法が好適である。
【実施例】
【００３９】
以下、試験例及び実施例、又は参考例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
参考例としては、ホモシステインの定量に用いる酵素（Ｅ２）として、バチルス属由来のο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製、以下に記載した力価はメーカー表示値による）を使用し、実施例としては、システイン定量に用いる酵素（Ｅ１）として、ο−アセチルセリン−リアーゼ（ホウレンソウ由来）を使用した。
【００４１】
ο−アセチルセリン−リアーゼは、山口等の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２５１；９１−９８(１９９５)）に基づいて調製した。
【００４２】
具体的には、ホウレンソウ葉２ｋｇから、抽出、イオン交換クロマト、疎水クロマト及びゲル濾過クロマトの工程を経て、約４０００単位の酵素を調製して用いた。なお、力価は、同文献に記載の方法により測定した。
【００４３】
試験例１
２０ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１０ｍＭＤＬ−ホモシステイン（アルドリッチ社製）を含有する１００ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）にο−アセチルホモセリン−リアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）を添加し、３７℃で反応させ、経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを、表１に示す条件でＨＰＬＣにて分析した。
【００４４】
【表１】
【００４５】
その結果、反応の進行と共にリテンションタイム６．７分のＤＬ−ホモシステインのピークが減少し、新たにリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。
【００４６】
試験例２
ＤＬ−ホモシステインをＬ−メチオニンに換え、試験例１と同様の条件で反応させた。また、ο−アセチルホモセリン−リアーゼと同様の作用を有すると考えられるＬ−メチオニンγ−リアーゼ（和光純薬株式会社製）をο−アセチルホモセリン−リアーゼに換えて添加し、同様の条件で反応させ、ＨＰＬＣで分析を行った。
【００４７】
その結果、いずれの場合もリテンションタイム７．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。
【００４８】
試験例１及び２の結果において、ο−アセチルホモセリン−リアーゼをＤＬ−ホモシステイン及びＬ−メチオニンに作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが共に一致していること、更にＬ−メチオニンγ−リアーゼを作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムもすべて一致していることから、ο−アセチルホモセリン−リアーゼの作用は、下記化学式１及び化学式２に示す通り、含硫アミノ酸とチオール化合物の置換反応であることがわかった。
【００４９】
【化１】
【００５０】
【化２】
【００５１】
試験例３
２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２５ｍｌに、２００ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０２５ｍｌ加え、さらに１０ｍＭのＬ−システィン（シグマ社製）溶液又は１０ｍＭのＤＬ−ホモシステインを０．０５ｍｌ加えた後、精製水を０．１２５ｍｌ添加させ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、精製したο−アセチルセリン−リアーゼ酵素液（ホウレンソウ由来、６Ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄 塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、Ｌ−システイン添加時の吸光度が１．０１（ＯＤ）だったのに対して、ＤＬ−ホモシステイン添加時の吸光度は０（ＯＤ）であった。よって、ο−アセチルセリン−リアーゼは、ホモシステインに対する反応性はまったく認められず、Ｌ−システインに特異的であることがわかった。
【００５２】
試験例４（ＨＰＬＣによる反応生成物同定）
２０ｍＭメチルメルカプタン（東京化成社製）及び１０ｍＭＬ−システイン（シグマ社製）を含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）にο−アセチルセリン−リアーゼ（ホウレンソウ由来）を添加し、３７℃で反応させ、経時的に反応液中の生成物と反応のモルバランスを、前記表１に示す条件でＨＰＬＣにて分析した。
【００５３】
その結果、反応の進行と共にリテンションタイム７．２分のＬ−システインのピークが減少し、新たにリテンションタイム６．８分の位置に反応生成物のピークが現れた。この反応のモルバランスは一致していた。
【００５４】
試験例５
試験例４のＬ−システインをＳ−メチルシステイン（シグマ社製）に換え、酵素無添加条件で、ＨＰＬＣにてピークを確認した。その結果、リテンションタイム６．８分の位置にピークを確認した。
【００５５】
試験例４及び５の結果から、ο−アセチルセリン−リアーゼをメチルメルカプタン存在下、Ｌ−システインに作用させた場合の反応生成物のリテンションタイムが、Ｓ−メチルシステインと一致していることから、ο−アセチルセリン−リアーゼの作用は、下記化学式３に示す通り、Ｌ−システインとチオール化合物の置換反応であることが分かった。
【００５６】
【化３】
【００５７】
参考例１
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０５ｍｌ加え、さらに、各種濃度(０〜５０μＭ)のＬ−ホモシスチン（シグマ社）溶液を０．０５ｍｌ加えた後、Ｌ−システインの添加回収率を求めるために３００μＭＬ−システインを０．１ｍｌ添加し、Ｌ−ホモシステインへの反応定数を求めるために精製水を０．１ｍｌ添加して、それぞれ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、ο−アセチルホモセリンーリアーゼ（商品名「ＧＣＳ」、ユニチカ株式会社製）酵素液（２０ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図１に示した。
【００５８】
図１の実線（−◆−）は、Ｌ−システイン非共存下でのホモシステインの検量線で、０〜１００μＭ（Ｌ−ホモシステイン換算）まで直線となり、その回帰式の切片を０として計算すると、傾きは０．９２６であった。
【００５９】
一方、図１の破線（…●…）は、Ｌ−システイン共存下でのホモシステインの検量線で、０〜１００μＭ（Ｌ−ホモシステイン換算）まで直線となり、その回帰式の傾きは０．９１７であり、切片は８０．９となった。
【００６０】
以上の結果から、ο−アセチルホモセリンーリアーゼは、Ｌ−システインの存在にかかわらず、濃度依存的にホモシステインと反応することが分かった。
また、Ｌ−システインに対する反応誤差が一定であることが分かった。
【００６１】
参考例２
２００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）０．２５ｍｌに、１０ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０５ｍｌ加え、さらに各種濃度（０〜４００μＭ）のＬ−システイン（シグマ社）溶液を０．１ｍｌ加えた後、Ｌ−ホモシステインの添加回収率を求めるために１５μＭＬ−ホモシスチンを０．０５ｍｌ添加し、Ｌ−システインへの反応定数を求めるために精製水を０．０５ｍｌ添加して、それぞれ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、ο−アセチルホモセリンーリアーゼ（ユニチカ株式会社製）酵素液（２０ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１０分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図２に示した。
【００６２】
図２の実線（−◆−）は、ホモシステイン非存在下でのＬ−システインの検量線で、０〜４００μＭまで直線となり、その回帰式の切片を０として計算すると、傾きは０．２５９であった。
【００６３】
一方、図２中の破線（…●…）は、Ｌ−ホモシスチンを添加した場合のＬ−システインの検量線で、０〜４００μＭまで直線となり、その回帰式の傾きは０．２６３であり、切片は２８．４となった。
【００６４】
以上の結果から、ο−アセチルホモセリンーリアーゼのＬ−システインへの反応が、ホモシステインの存在にかかわらず、濃度依存的であることが分かった。
【００６５】
また、参考例１、２の結果より、添加したＬ−システイン及びＬ−ホモシステインの濃度及び添加回収率を算出した。すなわち、参考例１のＬ−システイン実添加量３００μＭに対して、図１の破線（…●…）の切片値を図２の実線（−◆−）の回帰式に当てはめ、添加濃度を算出すると濃度は３１２μＭとなり、添加回収率は１０４％となった。さらに、参考例２のＬ−ホモシスチン実添加量１５μＭ（Ｌ−ホモシステインとして３０μＭ）に対して、図２の破線（…●…）の切片値を図１の実線（−◆−）の回帰式に当てはめ、添加濃度を算出するとＬ−ホモシステインとしては濃度は３０．７μＭとなり、添加回収率は１０２％となった。
【００６６】
よって、システインを含有した試料中のホモシステイン量は、Ｌ−システイン含量を換算して差し引くことにより、算出可能であることが分かった。
【００６７】
実施例１
２００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１１．０）０．２５ｍｌに、２００ｍＭ２−メルカプトエタノールを０．０２５ｍｌ加え、さらに各種濃度（０〜２００μＭ）のＬ−システイン（シグマ社）溶液を０．１ｍｌ加えた後、精製水を０．０７５ｍｌ添加させ混和後、３７℃で５分間加温した。その液に、精製したο−アセチルセリンーリアーゼ酵素液（６ｕ／ｍｌ）を０．０５ｍｌ加え、３７℃で１５分間反応させた後、３％ＮａＯＨ液を０．１ｍｌ、１６ｍＭＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン・硫酸塩溶液０．３２５ｍｌ及び１０ｍＭ塩化第二鉄塩酸溶液０．０７５ｍｌを順次添加し、室温で１５分放置後、６７０ｎｍの吸光度を測定して検量線を作成し、図３に示した。
【００６８】
図３に示されるように、０〜２００μＭまで直線となり、本酵素が触媒する置換反応を利用してシステインの定量が可能であることが分かった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に、ο−アセチルセリン−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素を測定することを特徴とするシステインの定量法。
【請求項１】
試料に、ο−アセチルセリン−リアーゼを作用させ、生成する硫化水素を測定することを特徴とするシステインの定量法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１００７６４（Ｐ２００９−１００７６４Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１４１９３（Ｐ２００９−１４１９３）
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【分割の表示】特願平１１−８４０３５の分割
【原出願日】平成１１年３月２６日（１９９９．３．２６）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【分割の表示】特願平１１−８４０３５の分割
【原出願日】平成１１年３月２６日（１９９９．３．２６）
【出願人】（３９００３７３２７）積水メディカル株式会社 (111)
【Ｆターム（参考）】
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