システインタグ付きブドウ球菌タンパク質Ｇ変異体
本発明は、Ｎ末端システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体に関する。前記変形体は、バイオチップおよびバイオセンサの表面に方向性をもって結合するので、システインをタグ付けしていないタンパク質Ｇに比べて抗体固定能力が向上したバイオチップおよびバイトセンサを提供する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｎ末端システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体、これをコードする核酸配列、発現ベクターおよび宿主細胞、前記変異体を製造する方法、並びに前記変異体または重合体を用いて製造されたバイオチップおよびバイオセンサに関する。
【０００２】
［背景技術］
抗体は、抗原に特異的に結合するために、疾病の診断および治療に関連した医学的研究と生物学的分析に広範囲に使用されてきた(Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40-45)。最近では、免疫学的測定法の一環として、抗体を固体支持物質に固定化し、電流、抵抗、質量の変化および光学的特徴などを測定する免疫センサが開発されている(Affinity Biosensors. vol. 7: Techniques and Protocols)。これらの中でも、光学的な特徴を用いた表面プラズモン共鳴に基づいた免疫センサが商業化されたが、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサは、定性的情報（２分子が特異的に結合するか）と定量的情報（反応速度と平衡定数）を提供するだけでなく、標識なしで実時間で感知することができるため、抗原・抗体の結合の測定に特に有用である(J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390-408)。
【０００３】
免疫センサでは、固体支持物質に抗体を選択的且つ安定的に固定化することが非常に重要である。抗体固定化技術は化学的な固定化方法と物理的な固定化方法に大別される。物理的な方法(Trends Anal. Chem.2000 19, 530-540)は、再現性が少なく、タンパク質を変性させるため、殆ど使用されていない。これに対し、化学的な方法(Langumur, 1997, 13, 6485-6490)は、タンパク質を共有結合によって結合させて再現性が良く、適用範囲が広いため、多く使用されている。ところが、化学的な方法によって抗体を固定化するとき、抗体が非対称巨大分子なので、抗体が方向性および抗原との結合活性を失うことがある(Analyst 121, 29R-32R)。
【０００４】
抗体の抗原結合能力をさらに良くするために、抗体を固体支持物質に結合させる前に支持体を使用する場合があり、この支持体としてタンパク質Ｇを使用する技術が公知になっている。ところが、このようなタンパク質Ｇ自体も、支持体に結合するとき、方向性を失って抗体との結合能力が減少するという問題がある。
【０００５】
したがって、このような問題を解決するために様々な方法が提案された。例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇに２−イミノチオラン(2-iminothiolane)を処理してタンパク質のアミノ酸基をリン酸化した後、リン酸化された連鎖球菌タンパク質Ｇを用いて抗体を固定することである。ところが、この方法は、特定の部分をリン酸化するのではなく、アミノ基を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）のアミノ基をリン酸化するので、特異性が低下するうえ、化学処理の後で精製を行わなければならないという煩わしさがある(Biosensors and Bioelectronics, 2005, 21, 103-110)。
【０００６】
［発明の開示］
［技術的課題］
そこで、本発明者らは、上述した免疫センサにおいて抗体が結合するときに方向性を失うという問題点を解消するために研究した結果、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を製造し、その有用性を実験によって確認した。
【０００７】
［技術的解決方法］
本発明の目的は、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体、およびこれをコードする核酸配列を提供することにある。タンパク質Ｇは、例えば、連鎖球菌に由来したものである。前記システインタグはリンカーを介してタンパク質Ｇに連結できる。
【０００８】
本発明の他の目的は、システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を培養してタンパク質Ｇ変異体を発現させ、これを分離することを特徴とするタンパク質Ｇ変異体の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記タンパク質Ｇ変異体を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオセンサ、並びにチオール基を介してタンパク質Ｇ変異体を固体支持物質に結合させることを特徴とするバイオチップおよびバイオセンサの製造方法を提供することにある。
【００１１】
［図面の簡単な説明］
図１は連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体と結合する結合ドメインＢ１、Ｂ２を示す。
【００１２】
図２Ａはタンパク質Ｇを作るために製作したフラグメントおよびタンパク質Ｇ変異体を作るために製作した５つのフラグメントを示し、図２Ｂは前記フラグメントを挿入するベクターおよびフラグメントを挿入して連鎖球菌タンパク質Ｇに１個〜５個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇ変異体を作るために発現ベクターを製造する方法を示す（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｃｙｓ：システイン、Ｌ：リンカー、４個のアスパラギンと１個のリシン、ｐｒｏｔｅｉｎＧ：連鎖球菌タンパク質Ｇの構造である。）
【００１３】
図３はシステインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の大腸菌における発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【００１４】
図４は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させて測定した表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである（４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ；ｐｒｏｔｅｉｎＧ：対照群としてチオール基が結合していない連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ１−Ｇ：１個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ２−Ｇ：２個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ３−Ｇ：３個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ）。
【００１５】
図５は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にヒトの抗体を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【００１６】
図６は金ナノ粒子に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）を固定化した後、抗体を結合させて抗体の固定化様相をタンパク質電気泳動によって示す写真である。
【００１７】
図７はマレイミド基が結合しているガラス表面にシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を固定化した後、その表面に、蛍光標識物質が付いている抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて得たイメージ写真である。
【００１８】
図８は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にＰＳＡに対する抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させた後、抗原としてのＰＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【００１９】
図９はＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）を介して表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した結果である。
【００２０】
［発明を実施するための最善の様態］
前述した本発明の目的を達成するための第１様態として、本発明は、下記構造を有する、システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体に関する。
【００２１】
Ｍｅｔx−（Ｃｙｓ）ｎ−Ｌy−タンパク質Ｇ−Ｑ2
（Ｍｅｔはメチオニン、Ｌはリンカー、タンパク質Ｇは抗体に結合する２つのドメイン（Ｂ１、Ｂ２）を含み、Ｑはタンパク質精製のためのタグであり、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１であり、ｎは１〜１０である。）
タンパク質Ｇは、グループＧ連鎖球菌(streptococci)から分離されたバクテリア細胞膜タンパク質であって、哺乳動物の抗体のＦｃ部分およびＦａｂ部分に結合するものと知られている (J. Immunol. Methods 1988, 112,113-120)。ところが、タンパク質Ｇは、抗体のＦｃ部分に対する結合力がＦａｂ部分に対する結合力より約１０倍程度高いと知られている。天然のタンパク質ＧのＤＮＡ配列は分析されて公知になっている。連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と連鎖球菌タンパク質Ａは、グラム陽性細菌(Gram-positive bacteria)から発見される、細胞表面に関連した多様なタンパク質の一つであって、免疫グロブリン抗体に結合するという特徴がある。それらの中でも、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が連鎖球菌タンパク質Ａよりさらに有用に用いられているが、これは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体がより広い範囲の哺乳動物の抗体と結合することができるから、抗体の受容体としての使用にさらに適するためである。
【００２２】
本発明において、タンパク質Ｇは、その起源が特に制限されず、抗体結合力を保有する限りは、天然型のタンパク質Ｇにアミノ酸の欠失、付加、置換などがなされたものも本発明の目的に応じて使用できる。本発明の実施例では、連鎖球菌タンパク質Ｇの遺伝子のうち抗体に結合する結合ドメイン（Ｂ１、Ｂ２）のみを使用した。
【００２３】
タンパク質Ｇ−Ｂ１ドメインは３つのβ−ｓｈｅｅｔと１つのα−ｈｅｌｉｘから構成されるが、これらの中でもＣ末端の３番目のβ−ｓｈｅｅｔとα−ｈｅｌｉｘが抗体Ｇとの結合に関与する。Ｂ１ドメインは配列番号１で示し、Ｂ２ドメインは配列番号２で示す。Ｂ１のアミノ酸配列とＢ２のアミノ酸配列とを比較すると、４個の配列の差異があるが、構造の差異は殆どない。本実施例では、Ｂ１ドメインの場合、Ｎ末端側に１０個のアミノ酸を除去した形態を使用したが（図１）、１０個のアミノ酸が除去された形態は抗体との結合機能に何の影響もないことが知られている(Biochem. J. (1990) 267, 171-177, J. mol. Biol (1994) 243, 906-918, Biochemistry (2000) 39, 6564-6571)。
【００２４】
本発明において、システインタグ「（Ｃｙｓ）ｎ」とは、タンパク質ＧのＮ末端に融合する少なくとも一つのシステインからなるペプチドのことをいう。システインタグは、例えば１〜１０個のシステインから構成される。好ましくは、システインは１〜５個のシステイン、さらに好ましくは１〜３個のシステインからなるタグである。
【００２５】
本発明のタンパク質Ｇ変異体において、システインタグは、タンパク質Ｇに直接共有結合によってあるいはリンカーＬを介して連結できる。リンカーは、タンパク質Ｇとシステインとの間に挿入されるもので、任意の配列を有するペプチドである。リンカーは２個〜１０個のアミノ酸からなるペプチドであれば済む。本発明の実施例では、５個のアミノ酸からなるリンカーを使用した。本発明のシステインタグは、タンパク質Ｇの内部に挿入されたものではなく、タンパク質Ｇが固体支持物質に付着するときに方向性を提供するためのものであって、リンカーを付着させると、チオール基が外部にさらに露出され易くてバイオセンサに効率よく方向性を付与して結合させることができる。
【００２６】
本発明のタンパク質Ｇ変異体は、分離を便利にするために、Ｃ末端にタンパク質精製のためのタグ（Ｑ）をさらに含むことができる。本発明の実施例では、ヘキサヒスチジンをＣ末端に結合させたが、本発明の目的上、タンパク質精製のためのタグは公知のタグを制限なく使用することができる。本発明の変異体は、原核細胞の開始コドンであるメチオニンを含んでもよく、含まなくてもよい。本発明の実施例では、それぞれ１〜５個のシステインが連結された変異体を製造した。
【００２７】
本発明は、前記タンパク質Ｇ変異体をコードする核酸配列、これを含む発現ベクター、および前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。ベクターは、宿主細胞にＤＮＡを導入してタンパク質Ｇ変異体を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなどが使用でき、プラスミドベクターが好ましい。本発明の目的上、発現ベクターはプロモータ、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサなどの発現調節エレメントを含むことができる。
【００２８】
実施例では、Ｎ末端に１〜５個のシステインがタグ付けされた連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をコードする塩基配列を含む発現ベクター（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ）を図２に示すように製造した。図３は前記発現ベクターによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉから発現されたシステインタグ付きタンパク質の発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【００２９】
宿主細胞は、本発明のタンパク質Ｇ変異体を発現することが可能な任意の宿主細胞を使用することができる。大腸菌(E. coli)、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)などがその例である。
【００３０】
本発明のタンパク質Ｇ変異体は、ペプチド合成法によって製造することもできるが、遺伝工学的方法によって特に効率よく製造することができる。遺伝工学的方法は、遺伝子操作によって所望のタンパク質を大腸菌(E. coli)などの宿主細胞から多量発現させる方法であって、これに関する技術は、公知の文献に詳細に記述されている(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA ; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13)。
【００３１】
システインはチオール残基を持っているアミノ酸であり、このシステインを遺伝工学的にタンパク質に挿入すればタンパク質を特異的に固定化することができることが知られている(FEBS Lett. 1990, 270, 41-44, Biotechnol. Lett. 1993, 15, 29-34)。連鎖球菌タンパク質ＧのＣ末端にシステインを結合させる方法は公知になっている。ところが、本発明では、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の活性部位から遠く離れているＮ末端に、チオール基のあるシステインをタグ付けした。連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体に結合する活性部位はＣ末端（３番目のβ−ｓｈｅｅｔとα−ｈｅｌｉｘ）に存在するので、システインをタンパク質Ｇ変異体の内部ではなくＮ末端に付着させることにより、Ｃ末端にシステインをタグ付けするなどの方法によるときに生じうる抗体の結合能力喪失を最小化した。
【００３２】
これを立証する具体的な一実施例として、本発明者らは、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化から測定した。同一濃度のＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とを金薄膜の表面に結合させ、類似な量のタンパク質が結合したことを確認した。その後、低濃度の抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させ、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体の抗体結合能力を確認した。その結果、０．５μｇ／ｍＬの抗体を反応させたとき、支持体に固定されたＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体の抗体結合能力が、支持体に固定されたＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体に比べて約３０％（Ｎ末端：３９６ＲＵ、Ｃ末端：２７６ＲＵ）程度高かった。上記結果より、低濃度では支持体に固体されたＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体が、支持体に固定されたＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体より高い抗体結合率を持つことが分かった。よって、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇが、抗体に結合する活性部位としてのＣ末端部位から遠く離れているので、タンパク質Ｇが抗体に結合する能力の喪失が最小化されたことを立証した（図９）。
【００３３】
本発明の実施例では、１個、２個、３個、４個および５個のシステインを結合させた連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を製造した（実施例２）。上記の発明によって遺伝子操作を行った後、タンパク質発現ベクターに挿入してタンパク質を発現させ、しかる後に、タンパク質電気泳動によってタンパク質を分離した。この際、１個〜３個のシステインをタグ付けした場合より多い活性型の組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が生産された。
【００３４】
本発明の他の様態では、前記タンパク質Ｇ変異体を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオチップおよびバイオセンサの製造方法に関する。
【００３５】
前記固体支持物質としては、表１に記載された金属またはメンブレイン、セラミック、ガラス、高分子表面またはシリカなどが使用できる。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本発明の好適な一具体例では、前記で製造したタンパク質Ｇ変異体が直接金属表面（金、銀、銅、鉄、白金、亜鉛など）および半導体に結合して固定化されたバイオチップおよびバイオセンサを提供する。本発明では、システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体が金薄膜の表面に吸着される反応を実時間で感知することが可能な表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した。その結果、１個〜３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質（平均約２４００ＲＵ）と、タグ付けしていない組み換えタンパク質（平均約２７００ＲＵ）の表面プラズモン共鳴信号の変化にあまり差異がなかったが（図４）。１〜３個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを金薄膜の表面に結合させた後、抗体に結合させたとき、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付けしていない組み換えタンパク質（１０００ＲＵ）に比べて、１個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は約４倍（４０００ＲＵ）、２個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は約３．２倍（３２００ＲＵ）、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質は約４．８倍（４８００ＲＵ）程度それぞれ増加した（図５）。これは、本発明に係るタンパク質Ｇ変異体が金薄膜の表面に抗体を固定化することに非常に有用であることを示す。
【００３８】
本発明の別の具体例では、システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体によって抗体が結合した金ナノ粒子を提供する。金ナノ粒子に、システインをタグ付けしていない組み換えタンパク質Ｇと１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が結合した後、抗体と反応する様相をタンパク質電気泳動によって確認した。その結果、金ナノ粒子に抗体のみ反応したときよりは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後で抗体を反応させたときにさらに多くの抗原が結合した。また、タグ付けしていない組み換えタンパク質より、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体はさらに多くの抗原が結合した。上記の結果より、システインタグ付き組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が、金ナノ粒子における抗原の固定化に有用であることを確認することができた（図６）。
【００３９】
本発明の別の実施例では、本発明のシステインタグのチオール基がセラミック、ガラス、高分子、シリコン、メンブレインなどに結合しているマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基に共有結合してタンパク質Ｇ変異体を固体支持物質に固定させた後、これに抗体を結合させたバイオセンサに関する。
【００４０】
本発明の実施例では、ガラス表面上に作られたマレイミド基に、１個、２個、３個のシステインを有するシステインタグのチオール基を用いて特異的に連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後、蛍光で標識されている抗体および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作り、しかる後に、蛍光スキャナーを用いて特異的タンパク質の結合度合いと非特異的結合が及ぼす影響を測定した。その結果、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光シグナルが現れておらず、抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３の濃度が増加するほど、蛍光シグナルが増加することからみて、１個、２個、および３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と抗体反応が特異的に行われたことを確認した。また、同一濃度の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をそれぞれ反応させた後、抗体を反応させたとき、低濃度の抗体と高い結合力を示すことからみて、１個、２個および３個のシステインがタグ付けされた組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇのマレイミド基が結合しているガラス表面などに抗体を固定させることに有用であることを確認することができた（図７）。
【００４１】
本発明の別の具体例では、タンパク質Ｇ変異体を前記固体支持物質に固定させた後、これに抗体を結合させたバイオセンサを用いて抗原を感知するものに関する。金薄膜の表面にシステインをタグ付けしていない組み換えタンパク質、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後、抗体を固定化し、しかる後に、抗原が結合することを、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化から測定した。抗体を結合するにおいて、高濃度の抗体を結合することは抗原の認識に寧ろ妨害になると知られているため(Biosensors and Bioeletronics 21 (2005) 103-110)、低濃度の抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を固定化した後、抗原を結合した。その結果、抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を結合したとき、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付きしていない組み換えタンパク質は（１１４ＲＵ）、１個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４７２ＲＵ）、２個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（３７６ＲＵ）、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質は（４９１ＲＵ）程度増加した。その上に、抗体に結合する抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ、０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたところ、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付けしていない組み換えタンパク質は（７ＲＵ）、１つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４９ＲＵ）、２つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４１ＲＵ）、３つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（７４ＲＵ）程度増加した。この実験によって、３つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質が効果的に抗原を結合させるということが分かった（図８）。
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４３】
［発明の様態］
実施例１：システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体のタンパク質発現の分析
<１−１>１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の遺伝子製作
Ｎ末端に１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けするために、６個のプライマーを製作した。これらの６個のプライマーのうち、５個のセンスプライマーの塩基配列にはＡＴＧ（開始コドン）の後にＴＧＣ（システインコドン）を１個〜５個まで添加し、タンパク質Ｇとの連結環としてＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ（４個のＡｓｐコドンと１個のリシンコドン）を含んでいる。また、この遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入するために、Ｎ末端のプライマーにはＮｄｅＩを、Ｃ末端のプライマーにはＸｈｏＩ制限酵素切断部位を導入した。連鎖球菌ゲノム遺伝子を得て前記プライマー（配列番号３と配列番号８の塩基対、配列番号４と配列番号８の塩基対、配列番号５と配列番号８の塩基対、配列番号６と配列番号８の塩基対、配列番号７と配列番号８の塩基対）で重合鎖反応（ＰＣＲ(polymerase chain reaction)）して、抗体に結合するドメインとして知られている（Ｂ１[１０個の切断された初期アミノ酸残基を有する形態]、Ｂ２）アミノ酸部分のみを得た。得られたフラグメントを各プライマーに導入された制限酵素で切断した後、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断されたｐＥＴ２１ａベクターに挿入してｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧベクターを製作した（図２）。前記発現ベクターはＮ末端にＭｅｔを発現する。
プライマー１：センス（配列番号３）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー２：センス（配列番号４）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー３：センス（配列番号５）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー４：センス（配列番号６）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー５：センス（配列番号７）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー６：アンチセンス（配列番号８）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＴＡＧＴ−３’
【００４４】
<１−２>１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の発現を示すタンパク質電気泳動写真
製作されたｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧによって形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１を３７℃でＯ．Ｄ．(optical density)（Ａ６００ｎｍ）０．６となるまで振とう培養した後、総濃度１ｍＭのＩＰＴＧ(isopropyl β- D-thiogalactopyranoside)を添加して２５℃でタンパク質発現を誘導した。１４時間の後、細胞を遠心分離して得た大腸菌を超音波（Ｂｒａｓｏｎ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０、３ＫＨｚ、３Ｗ、５ｍｉｎ）で破砕した後、全体タンパク質溶液を得た。また、遠心分離によって溶解性分画タンパク質溶液と非溶解性分画タンパク質に分離して溶液をそれぞれ得た。ここで得られたタンパク質溶液を緩衝液（１２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、５％グリセロール、２．８８ｍＭメルカプトエタノール、０．４％ ＳＤＳ、０．０２％臭化フェノールブルー）と混合して１００℃で５分間加熱した後、厚さ１ｍｍの１５％分離ゲル（ｐＨ８．８、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍ）上に５％貯蔵ゲル（ｐＨ６．８、横１０ｃｍ、縦１２．０ｃｍ）を覆ったポリアクリルアミドゲルにロードした後、２００〜１００Ｖ、２５ｍＡで１時間電気永動し、クマシー染色液で染色して組み換えタンパク質を確認した。
【００４５】
図２のＬａｎｅの説明は、次のとおりである。
【００４６】
（Ａ）Ｌａｎｅ１：タンパク質サイズマーカー
Ｌａｎｅ２：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ３：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ４：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ５：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ６：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ７：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ８：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ９：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ１０：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
（Ｂ）Ｌａｎｅ１：タンパク質サイズマーカー
Ｌａｎｅ２：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ３：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ４：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ５：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ６：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ７：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ１−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ２−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ３−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ４−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ５−Ｇ
【００４７】
<１−３>１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と対照群（システインをタグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体）の発現および精製
<１−２>のように発現した後で得られた溶解性タンパク質溶液を精製するために、ＩＤＡ ｅｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅで充填されたカラムにヘキサヒスチジンが結合されている６種の組み換え遺伝子を発現させた細胞を破砕した溶液をロードした。ヒスチジンが結合されている６種の組み換えタンパク質を溶離溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶離した。溶離されたタンパク質溶液は緩衝溶液ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。
【００４８】
実施例２：１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させて抗体を固定化：表面プラズモン共鳴センサを介して表面上の変形された組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させ、抗体を固定化する反応を表面プラズモン共鳴信号の変化から測定。
【００４９】
金薄膜チップを９５％硫酸と３０％過酸化水素水（体積比３：１）の混合溶液（６５℃）で３０分間処理し、３次蒸留水でチップを洗浄した後、エタノールで洗浄し、３次蒸留水でチップを洗浄した。その後、窒素ガスでチップを乾燥させてＢｉａ−ｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴センサに装着した。装着されたチップに濃度２００μｇ／ｍＬの１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質と、タグ付けしていない組み換えタンパク質を１５０μＬずつ金薄膜の表面に５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させ、前記タンパク質を固定化した。金薄膜の表面と前記タンパク質とを反応させた後、非特異的な反応を防ぐために、ＢＳＡ（３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入した。その後、抗体（１００μｇ／ｍＬ、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ）、１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入して金薄膜にタンパク質Ｇ変異体および抗体が固定されたバイオセンサを製作し、プラズモン共鳴信号の変化を測定した（図５）。
【００５０】
実施例３：金ナノ粒子に１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体とを結合させ、抗体を固定化：金ナノ粒子に１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体とを結合させ、抗体を固定化してタンパク質電気泳動によって確認
２．５Ｏ．Ｄ／ｍＬの金ナノ粒子をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した後、１００μＬの一連の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（２００μｇ／ｍＬ）と４℃で１６時間反応させた後、抗体１０μＬ（３．５ｇ／ｍＬ、抗−ウサギＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＴＲＩＴＣコンジュケート、Ｓｉｇｍａ）を常温で２時間反応させた。また、対照群として２．５Ｏ．Ｄ／ｍＬの金ナノ粒子に抗体１０μＬ（３．５ｇ／ｍＬ）を常温で２時間反応させた。前記反応の後、遠心分離を用いて、反応していない抗体を除去し、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した。
【００５１】
その後、金ナノ粒子に結合されているタンパク質は、タンパク質電気泳動によって確認した。図６のｌａｎｅの説明は次のとおりである；
ｌａｎｅ１：金ナノ粒子に直接抗体を結合、
ｌａｎｅ２：金ナノ粒子に、システインをタグ付けしていないタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ３：金ナノ粒子に、１個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ４：金ナノ粒子に、２個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ５：ナノ粒子に、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
その結果、金ナノ粒子に抗体のみ反応したときよりは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合し抗体を反応させたときにさらに多くの抗原が結合した。また、タグ付けしていない組み換えタンパク質より、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体はさらに多くの抗原が結合した。上記の結果より、システインタグ付き組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が金ナノ粒子における抗原の固定化に有用であることを確認することができた（図６）。
【００５２】
実施例４：ガラス表面上に作られたマレイミド基に、１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を反応させて抗体を固定化：蛍光スキャナを用いて前記変形された組み換えタンパク質を、ガラス表面上にチオール基と共有結合するマレイミド基に結合させ、特異的に抗体が結合する反応を測定
ガラス表面をピラニア（硫酸：過酸化水素、３：１ｖ／ｖ）溶液に浸漬させて２０分間９０℃のオーブンで反応させた。反応の後、水とエタノールで洗った後、アミン表面を作るために、１％ＡＰＴＳ（(3-Aminopropyl)trimethoxysilane、０９３２６、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が含まれたエタノール１５〜２０分間浸漬させて反応させた。反応済みのガラス表面はエタノールで洗浄した後、１００℃のオーブンで使用する前まで加熱した。作られたアミン表面上に１０ｍＭ ＢＭＰＳ（N-[b-Maleimidopropyloxy]succinimide ester、２２２９８、ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）をＤＭＳ（dimethyl sulfoxide、Ｄ２６５０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に溶かして３０分間浸漬させて反応させた。ＳＨ基と共有結合すべき、最終ガラスの表面上に作られたマレイミド基と１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を表面上に反応させてタンパク質を固定化した。一連の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が固定化された表面に、蛍光標識物質を付着させた抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３（Ｃ５５８５、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＩＲＣＨ）および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３（Streptavidin-Cy3 from Streptomyces avidinii、Ｓ６４２０ ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて特異的タンパク質の結合度合いと非特異的結合が及ぼす影響を測定した。その結果、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光シグナルが現れておらず、抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３の濃度が増加するほど蛍光シグナルが増加することからみて、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌Ｇ変異体との抗体反応が特異的に行われたことを確認した。また、同一濃度の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をそれぞれ反応させた後で抗体を反応させたとき、低濃度の抗体と高い結合力を示すことからみて、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇが、マレイミド基が結合されているガラスの表面などに抗体を固定化することに有用であることを確認することができた（図７）。
【００５３】
実施例５：１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させた後、抗原−抗体反応：表面プラズモン共鳴センサによって表面上の変形された組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させ、抗体を固定化した後、抗原を感知する反応を表面プラズモン共鳴信号の変化から測定
金薄膜チップを９５％硫酸と３０％過酸化水素水（体積比３：１）との混合溶液（６５℃）で３０分間処理し、３次蒸留水でチップを洗浄した後、エタノールで洗浄し、３次蒸留水でチップを洗浄した。その後、窒素ガスでチップを乾燥させてＢｉａ−ｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴センサに装着した。装着されたチップの金薄膜の表面に、濃度２００μｇ／ｍＬの１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質とタグ付けしていない組み換えタンパク質を１５０μＬずつ５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させて前記タンパク質を固定化した。金薄膜の表面と前記タンパク質を反応させた後、非特異的な反応を防ぐために、ＢＳＡ（３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させた。その後、抗体（０．５μｇ／ｍＬ、抗−ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入して、抗体が固定されたバイオセンサに５０μＬの抗原（０．５μｇ／ｍＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ）を反応させてプラズモン共鳴信号の変化を測定した（図８）。
【００５４】
［産業上の利用可能性］
本発明に係るシステインタグ付きタンパク質Ｇ変異体は、そのチオール基を介してバイオセンサの固体支持物質に方向性をもって結合して抗体を効率よく結合させることにより、抗原−抗体反応を用いるバイオチップおよびバイオセンサに有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体と結合する結合ドメインＢ１、Ｂ２を示す。
【図２】図２Ａはタンパク質Ｇを作るために製作したフラグメントおよびタンパク質Ｇ変異体を作るために製作した５つのフラグメントを示し、図２Ｂは前記フラグメントを挿入するベクターおよびフラグメントを挿入して連鎖球菌タンパク質Ｇに１個〜５個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇ変異体を作るために発現ベクターを製造する方法を示す（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｃｙｓ：システイン、Ｌ：リンカー、４個のアスパラギンと１個のリシン、ｐｒｏｔｅｉｎＧ：連鎖球菌タンパク質Ｇの構造である。）
【図３】図３はシステインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の大腸菌における発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図４】図４は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させて測定した表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである（４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ；ｐｒｏｔｅｉｎＧ：対照群としてチオール基が結合していない連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ１−Ｇ：１個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ２−Ｇ：２個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ３−Ｇ：３個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ）。
【図５】図５は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にヒトの抗体を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【図６】図６は金ナノ粒子に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）を固定化した後、抗体を結合させて抗体の固定化様相をタンパク質電気泳動によって示す写真である。
【図７】図７はマレイミド基が結合しているガラス表面にシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を固定化した後、その表面に、蛍光標識物質が付いている抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて得たイメージ写真である。
【図８】図８は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にＰＳＡに対する抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させた後、抗原としてのＰＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【図９】図９はＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）を介して表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した結果である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、Ｎ末端システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体、これをコードする核酸配列、発現ベクターおよび宿主細胞、前記変異体を製造する方法、並びに前記変異体または重合体を用いて製造されたバイオチップおよびバイオセンサに関する。
【０００２】
［背景技術］
抗体は、抗原に特異的に結合するために、疾病の診断および治療に関連した医学的研究と生物学的分析に広範囲に使用されてきた(Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40-45)。最近では、免疫学的測定法の一環として、抗体を固体支持物質に固定化し、電流、抵抗、質量の変化および光学的特徴などを測定する免疫センサが開発されている(Affinity Biosensors. vol. 7: Techniques and Protocols)。これらの中でも、光学的な特徴を用いた表面プラズモン共鳴に基づいた免疫センサが商業化されたが、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサは、定性的情報（２分子が特異的に結合するか）と定量的情報（反応速度と平衡定数）を提供するだけでなく、標識なしで実時間で感知することができるため、抗原・抗体の結合の測定に特に有用である(J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390-408)。
【０００３】
免疫センサでは、固体支持物質に抗体を選択的且つ安定的に固定化することが非常に重要である。抗体固定化技術は化学的な固定化方法と物理的な固定化方法に大別される。物理的な方法(Trends Anal. Chem.2000 19, 530-540)は、再現性が少なく、タンパク質を変性させるため、殆ど使用されていない。これに対し、化学的な方法(Langumur, 1997, 13, 6485-6490)は、タンパク質を共有結合によって結合させて再現性が良く、適用範囲が広いため、多く使用されている。ところが、化学的な方法によって抗体を固定化するとき、抗体が非対称巨大分子なので、抗体が方向性および抗原との結合活性を失うことがある(Analyst 121, 29R-32R)。
【０００４】
抗体の抗原結合能力をさらに良くするために、抗体を固体支持物質に結合させる前に支持体を使用する場合があり、この支持体としてタンパク質Ｇを使用する技術が公知になっている。ところが、このようなタンパク質Ｇ自体も、支持体に結合するとき、方向性を失って抗体との結合能力が減少するという問題がある。
【０００５】
したがって、このような問題を解決するために様々な方法が提案された。例えば、連鎖球菌タンパク質Ｇに２−イミノチオラン(2-iminothiolane)を処理してタンパク質のアミノ酸基をリン酸化した後、リン酸化された連鎖球菌タンパク質Ｇを用いて抗体を固定することである。ところが、この方法は、特定の部分をリン酸化するのではなく、アミノ基を有するアミノ酸（Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ）のアミノ基をリン酸化するので、特異性が低下するうえ、化学処理の後で精製を行わなければならないという煩わしさがある(Biosensors and Bioelectronics, 2005, 21, 103-110)。
【０００６】
［発明の開示］
［技術的課題］
そこで、本発明者らは、上述した免疫センサにおいて抗体が結合するときに方向性を失うという問題点を解消するために研究した結果、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を製造し、その有用性を実験によって確認した。
【０００７】
［技術的解決方法］
本発明の目的は、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体、およびこれをコードする核酸配列を提供することにある。タンパク質Ｇは、例えば、連鎖球菌に由来したものである。前記システインタグはリンカーを介してタンパク質Ｇに連結できる。
【０００８】
本発明の他の目的は、システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体をコードする核酸配列を含む発現ベクターと、前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を培養してタンパク質Ｇ変異体を発現させ、これを分離することを特徴とするタンパク質Ｇ変異体の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の別の目的は、前記タンパク質Ｇ変異体を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオセンサ、並びにチオール基を介してタンパク質Ｇ変異体を固体支持物質に結合させることを特徴とするバイオチップおよびバイオセンサの製造方法を提供することにある。
【００１１】
［図面の簡単な説明］
図１は連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体と結合する結合ドメインＢ１、Ｂ２を示す。
【００１２】
図２Ａはタンパク質Ｇを作るために製作したフラグメントおよびタンパク質Ｇ変異体を作るために製作した５つのフラグメントを示し、図２Ｂは前記フラグメントを挿入するベクターおよびフラグメントを挿入して連鎖球菌タンパク質Ｇに１個〜５個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇ変異体を作るために発現ベクターを製造する方法を示す（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｃｙｓ：システイン、Ｌ：リンカー、４個のアスパラギンと１個のリシン、ｐｒｏｔｅｉｎＧ：連鎖球菌タンパク質Ｇの構造である。）
【００１３】
図３はシステインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の大腸菌における発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【００１４】
図４は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させて測定した表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである（４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ；ｐｒｏｔｅｉｎＧ：対照群としてチオール基が結合していない連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ１−Ｇ：１個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ２−Ｇ：２個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ３−Ｇ：３個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ）。
【００１５】
図５は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にヒトの抗体を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【００１６】
図６は金ナノ粒子に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）を固定化した後、抗体を結合させて抗体の固定化様相をタンパク質電気泳動によって示す写真である。
【００１７】
図７はマレイミド基が結合しているガラス表面にシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を固定化した後、その表面に、蛍光標識物質が付いている抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて得たイメージ写真である。
【００１８】
図８は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にＰＳＡに対する抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させた後、抗原としてのＰＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【００１９】
図９はＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）を介して表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した結果である。
【００２０】
［発明を実施するための最善の様態］
前述した本発明の目的を達成するための第１様態として、本発明は、下記構造を有する、システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体に関する。
【００２１】
Ｍｅｔx−（Ｃｙｓ）ｎ−Ｌy−タンパク質Ｇ−Ｑ2
（Ｍｅｔはメチオニン、Ｌはリンカー、タンパク質Ｇは抗体に結合する２つのドメイン（Ｂ１、Ｂ２）を含み、Ｑはタンパク質精製のためのタグであり、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１であり、ｎは１〜１０である。）
タンパク質Ｇは、グループＧ連鎖球菌(streptococci)から分離されたバクテリア細胞膜タンパク質であって、哺乳動物の抗体のＦｃ部分およびＦａｂ部分に結合するものと知られている (J. Immunol. Methods 1988, 112,113-120)。ところが、タンパク質Ｇは、抗体のＦｃ部分に対する結合力がＦａｂ部分に対する結合力より約１０倍程度高いと知られている。天然のタンパク質ＧのＤＮＡ配列は分析されて公知になっている。連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と連鎖球菌タンパク質Ａは、グラム陽性細菌(Gram-positive bacteria)から発見される、細胞表面に関連した多様なタンパク質の一つであって、免疫グロブリン抗体に結合するという特徴がある。それらの中でも、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が連鎖球菌タンパク質Ａよりさらに有用に用いられているが、これは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体がより広い範囲の哺乳動物の抗体と結合することができるから、抗体の受容体としての使用にさらに適するためである。
【００２２】
本発明において、タンパク質Ｇは、その起源が特に制限されず、抗体結合力を保有する限りは、天然型のタンパク質Ｇにアミノ酸の欠失、付加、置換などがなされたものも本発明の目的に応じて使用できる。本発明の実施例では、連鎖球菌タンパク質Ｇの遺伝子のうち抗体に結合する結合ドメイン（Ｂ１、Ｂ２）のみを使用した。
【００２３】
タンパク質Ｇ−Ｂ１ドメインは３つのβ−ｓｈｅｅｔと１つのα−ｈｅｌｉｘから構成されるが、これらの中でもＣ末端の３番目のβ−ｓｈｅｅｔとα−ｈｅｌｉｘが抗体Ｇとの結合に関与する。Ｂ１ドメインは配列番号１で示し、Ｂ２ドメインは配列番号２で示す。Ｂ１のアミノ酸配列とＢ２のアミノ酸配列とを比較すると、４個の配列の差異があるが、構造の差異は殆どない。本実施例では、Ｂ１ドメインの場合、Ｎ末端側に１０個のアミノ酸を除去した形態を使用したが（図１）、１０個のアミノ酸が除去された形態は抗体との結合機能に何の影響もないことが知られている(Biochem. J. (1990) 267, 171-177, J. mol. Biol (1994) 243, 906-918, Biochemistry (2000) 39, 6564-6571)。
【００２４】
本発明において、システインタグ「（Ｃｙｓ）ｎ」とは、タンパク質ＧのＮ末端に融合する少なくとも一つのシステインからなるペプチドのことをいう。システインタグは、例えば１〜１０個のシステインから構成される。好ましくは、システインは１〜５個のシステイン、さらに好ましくは１〜３個のシステインからなるタグである。
【００２５】
本発明のタンパク質Ｇ変異体において、システインタグは、タンパク質Ｇに直接共有結合によってあるいはリンカーＬを介して連結できる。リンカーは、タンパク質Ｇとシステインとの間に挿入されるもので、任意の配列を有するペプチドである。リンカーは２個〜１０個のアミノ酸からなるペプチドであれば済む。本発明の実施例では、５個のアミノ酸からなるリンカーを使用した。本発明のシステインタグは、タンパク質Ｇの内部に挿入されたものではなく、タンパク質Ｇが固体支持物質に付着するときに方向性を提供するためのものであって、リンカーを付着させると、チオール基が外部にさらに露出され易くてバイオセンサに効率よく方向性を付与して結合させることができる。
【００２６】
本発明のタンパク質Ｇ変異体は、分離を便利にするために、Ｃ末端にタンパク質精製のためのタグ（Ｑ）をさらに含むことができる。本発明の実施例では、ヘキサヒスチジンをＣ末端に結合させたが、本発明の目的上、タンパク質精製のためのタグは公知のタグを制限なく使用することができる。本発明の変異体は、原核細胞の開始コドンであるメチオニンを含んでもよく、含まなくてもよい。本発明の実施例では、それぞれ１〜５個のシステインが連結された変異体を製造した。
【００２７】
本発明は、前記タンパク質Ｇ変異体をコードする核酸配列、これを含む発現ベクター、および前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。ベクターは、宿主細胞にＤＮＡを導入してタンパク質Ｇ変異体を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターなどが使用でき、プラスミドベクターが好ましい。本発明の目的上、発現ベクターはプロモータ、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサなどの発現調節エレメントを含むことができる。
【００２８】
実施例では、Ｎ末端に１〜５個のシステインがタグ付けされた連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をコードする塩基配列を含む発現ベクター（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ）を図２に示すように製造した。図３は前記発現ベクターによって形質転換されたＥ．ｃｏｌｉから発現されたシステインタグ付きタンパク質の発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【００２９】
宿主細胞は、本発明のタンパク質Ｇ変異体を発現することが可能な任意の宿主細胞を使用することができる。大腸菌(E. coli)、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)などがその例である。
【００３０】
本発明のタンパク質Ｇ変異体は、ペプチド合成法によって製造することもできるが、遺伝工学的方法によって特に効率よく製造することができる。遺伝工学的方法は、遺伝子操作によって所望のタンパク質を大腸菌(E. coli)などの宿主細胞から多量発現させる方法であって、これに関する技術は、公知の文献に詳細に記述されている(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA ; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13)。
【００３１】
システインはチオール残基を持っているアミノ酸であり、このシステインを遺伝工学的にタンパク質に挿入すればタンパク質を特異的に固定化することができることが知られている(FEBS Lett. 1990, 270, 41-44, Biotechnol. Lett. 1993, 15, 29-34)。連鎖球菌タンパク質ＧのＣ末端にシステインを結合させる方法は公知になっている。ところが、本発明では、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の活性部位から遠く離れているＮ末端に、チオール基のあるシステインをタグ付けした。連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体に結合する活性部位はＣ末端（３番目のβ−ｓｈｅｅｔとα−ｈｅｌｉｘ）に存在するので、システインをタンパク質Ｇ変異体の内部ではなくＮ末端に付着させることにより、Ｃ末端にシステインをタグ付けするなどの方法によるときに生じうる抗体の結合能力喪失を最小化した。
【００３２】
これを立証する具体的な一実施例として、本発明者らは、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化から測定した。同一濃度のＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とを金薄膜の表面に結合させ、類似な量のタンパク質が結合したことを確認した。その後、低濃度の抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させ、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体の抗体結合能力を確認した。その結果、０．５μｇ／ｍＬの抗体を反応させたとき、支持体に固定されたＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体の抗体結合能力が、支持体に固定されたＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体に比べて約３０％（Ｎ末端：３９６ＲＵ、Ｃ末端：２７６ＲＵ）程度高かった。上記結果より、低濃度では支持体に固体されたＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体が、支持体に固定されたＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体より高い抗体結合率を持つことが分かった。よって、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇが、抗体に結合する活性部位としてのＣ末端部位から遠く離れているので、タンパク質Ｇが抗体に結合する能力の喪失が最小化されたことを立証した（図９）。
【００３３】
本発明の実施例では、１個、２個、３個、４個および５個のシステインを結合させた連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を製造した（実施例２）。上記の発明によって遺伝子操作を行った後、タンパク質発現ベクターに挿入してタンパク質を発現させ、しかる後に、タンパク質電気泳動によってタンパク質を分離した。この際、１個〜３個のシステインをタグ付けした場合より多い活性型の組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が生産された。
【００３４】
本発明の他の様態では、前記タンパク質Ｇ変異体を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオチップおよびバイオセンサの製造方法に関する。
【００３５】
前記固体支持物質としては、表１に記載された金属またはメンブレイン、セラミック、ガラス、高分子表面またはシリカなどが使用できる。
【００３６】
【表１】
【００３７】
本発明の好適な一具体例では、前記で製造したタンパク質Ｇ変異体が直接金属表面（金、銀、銅、鉄、白金、亜鉛など）および半導体に結合して固定化されたバイオチップおよびバイオセンサを提供する。本発明では、システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体が金薄膜の表面に吸着される反応を実時間で感知することが可能な表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した。その結果、１個〜３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質（平均約２４００ＲＵ）と、タグ付けしていない組み換えタンパク質（平均約２７００ＲＵ）の表面プラズモン共鳴信号の変化にあまり差異がなかったが（図４）。１〜３個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを金薄膜の表面に結合させた後、抗体に結合させたとき、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付けしていない組み換えタンパク質（１０００ＲＵ）に比べて、１個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は約４倍（４０００ＲＵ）、２個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は約３．２倍（３２００ＲＵ）、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質は約４．８倍（４８００ＲＵ）程度それぞれ増加した（図５）。これは、本発明に係るタンパク質Ｇ変異体が金薄膜の表面に抗体を固定化することに非常に有用であることを示す。
【００３８】
本発明の別の具体例では、システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体によって抗体が結合した金ナノ粒子を提供する。金ナノ粒子に、システインをタグ付けしていない組み換えタンパク質Ｇと１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が結合した後、抗体と反応する様相をタンパク質電気泳動によって確認した。その結果、金ナノ粒子に抗体のみ反応したときよりは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後で抗体を反応させたときにさらに多くの抗原が結合した。また、タグ付けしていない組み換えタンパク質より、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体はさらに多くの抗原が結合した。上記の結果より、システインタグ付き組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が、金ナノ粒子における抗原の固定化に有用であることを確認することができた（図６）。
【００３９】
本発明の別の実施例では、本発明のシステインタグのチオール基がセラミック、ガラス、高分子、シリコン、メンブレインなどに結合しているマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基に共有結合してタンパク質Ｇ変異体を固体支持物質に固定させた後、これに抗体を結合させたバイオセンサに関する。
【００４０】
本発明の実施例では、ガラス表面上に作られたマレイミド基に、１個、２個、３個のシステインを有するシステインタグのチオール基を用いて特異的に連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後、蛍光で標識されている抗体および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作り、しかる後に、蛍光スキャナーを用いて特異的タンパク質の結合度合いと非特異的結合が及ぼす影響を測定した。その結果、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光シグナルが現れておらず、抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３の濃度が増加するほど、蛍光シグナルが増加することからみて、１個、２個、および３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と抗体反応が特異的に行われたことを確認した。また、同一濃度の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をそれぞれ反応させた後、抗体を反応させたとき、低濃度の抗体と高い結合力を示すことからみて、１個、２個および３個のシステインがタグ付けされた組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇのマレイミド基が結合しているガラス表面などに抗体を固定させることに有用であることを確認することができた（図７）。
【００４１】
本発明の別の具体例では、タンパク質Ｇ変異体を前記固体支持物質に固定させた後、これに抗体を結合させたバイオセンサを用いて抗原を感知するものに関する。金薄膜の表面にシステインをタグ付けしていない組み換えタンパク質、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させた後、抗体を固定化し、しかる後に、抗原が結合することを、表面プラズモン共鳴に基づくバイオセンサ（ＳＰＲ）によって表面プラズモン共鳴信号の変化から測定した。抗体を結合するにおいて、高濃度の抗体を結合することは抗原の認識に寧ろ妨害になると知られているため(Biosensors and Bioeletronics 21 (2005) 103-110)、低濃度の抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を固定化した後、抗原を結合した。その結果、抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を結合したとき、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付きしていない組み換えタンパク質は（１１４ＲＵ）、１個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４７２ＲＵ）、２個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（３７６ＲＵ）、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質は（４９１ＲＵ）程度増加した。その上に、抗体に結合する抗原（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ、０．５μｇ／ｍＬ）を反応させたところ、表面プラズモン共鳴信号の変化が、タグ付けしていない組み換えタンパク質は（７ＲＵ）、１つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４９ＲＵ）、２つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（４１ＲＵ）、３つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質は（７４ＲＵ）程度増加した。この実験によって、３つのシステインをタグ付けした組み換えタンパク質が効果的に抗原を結合させるということが分かった（図８）。
【００４２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００４３】
［発明の様態］
実施例１：システインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体のタンパク質発現の分析
<１−１>１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の遺伝子製作
Ｎ末端に１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けするために、６個のプライマーを製作した。これらの６個のプライマーのうち、５個のセンスプライマーの塩基配列にはＡＴＧ（開始コドン）の後にＴＧＣ（システインコドン）を１個〜５個まで添加し、タンパク質Ｇとの連結環としてＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＧＡＣ ＡＡＧ（４個のＡｓｐコドンと１個のリシンコドン）を含んでいる。また、この遺伝子を発現ベクターｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入するために、Ｎ末端のプライマーにはＮｄｅＩを、Ｃ末端のプライマーにはＸｈｏＩ制限酵素切断部位を導入した。連鎖球菌ゲノム遺伝子を得て前記プライマー（配列番号３と配列番号８の塩基対、配列番号４と配列番号８の塩基対、配列番号５と配列番号８の塩基対、配列番号６と配列番号８の塩基対、配列番号７と配列番号８の塩基対）で重合鎖反応（ＰＣＲ(polymerase chain reaction)）して、抗体に結合するドメインとして知られている（Ｂ１[１０個の切断された初期アミノ酸残基を有する形態]、Ｂ２）アミノ酸部分のみを得た。得られたフラグメントを各プライマーに導入された制限酵素で切断した後、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断されたｐＥＴ２１ａベクターに挿入してｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧベクターを製作した（図２）。前記発現ベクターはＮ末端にＭｅｔを発現する。
プライマー１：センス（配列番号３）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー２：センス（配列番号４）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー３：センス（配列番号５）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー４：センス（配列番号６）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー５：センス（配列番号７）
５’−ＣＡＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’
プライマー６：アンチセンス（配列番号８）
５’−ＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＣＧＴＡＡＡＧＧＴＣＴＴＡＧＴ−３’
【００４４】
<１−２>１個、２個、３個、４個および５個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の発現を示すタンパク質電気泳動写真
製作されたｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧによって形質転換されたＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１を３７℃でＯ．Ｄ．(optical density)（Ａ６００ｎｍ）０．６となるまで振とう培養した後、総濃度１ｍＭのＩＰＴＧ(isopropyl β- D-thiogalactopyranoside)を添加して２５℃でタンパク質発現を誘導した。１４時間の後、細胞を遠心分離して得た大腸菌を超音波（Ｂｒａｓｏｎ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０、３ＫＨｚ、３Ｗ、５ｍｉｎ）で破砕した後、全体タンパク質溶液を得た。また、遠心分離によって溶解性分画タンパク質溶液と非溶解性分画タンパク質に分離して溶液をそれぞれ得た。ここで得られたタンパク質溶液を緩衝液（１２ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ６．８、５％グリセロール、２．８８ｍＭメルカプトエタノール、０．４％ ＳＤＳ、０．０２％臭化フェノールブルー）と混合して１００℃で５分間加熱した後、厚さ１ｍｍの１５％分離ゲル（ｐＨ８．８、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍ）上に５％貯蔵ゲル（ｐＨ６．８、横１０ｃｍ、縦１２．０ｃｍ）を覆ったポリアクリルアミドゲルにロードした後、２００〜１００Ｖ、２５ｍＡで１時間電気永動し、クマシー染色液で染色して組み換えタンパク質を確認した。
【００４５】
図２のＬａｎｅの説明は、次のとおりである。
【００４６】
（Ａ）Ｌａｎｅ１：タンパク質サイズマーカー
Ｌａｎｅ２：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ３：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ４：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ５：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ６：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ７：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ８：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ９：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ１０：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
（Ｂ）Ｌａｎｅ１：タンパク質サイズマーカー
Ｌａｎｅ２：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ３：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ４：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ５：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Ｌａｎｅ６：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Ｌａｎｅ７：プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ１−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ２−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ３−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ４−Ｇ
プラスミドｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧで生産されたタンパク質：ｃｙｓ５−Ｇ
【００４７】
<１−３>１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と対照群（システインをタグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体）の発現および精製
<１−２>のように発現した後で得られた溶解性タンパク質溶液を精製するために、ＩＤＡ ｅｘｃｅｌｌｕｌｏｓｅで充填されたカラムにヘキサヒスチジンが結合されている６種の組み換え遺伝子を発現させた細胞を破砕した溶液をロードした。ヒスチジンが結合されている６種の組み換えタンパク質を溶離溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、０．５Ｍイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で溶離した。溶離されたタンパク質溶液は緩衝溶液ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。
【００４８】
実施例２：１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させて抗体を固定化：表面プラズモン共鳴センサを介して表面上の変形された組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させ、抗体を固定化する反応を表面プラズモン共鳴信号の変化から測定。
【００４９】
金薄膜チップを９５％硫酸と３０％過酸化水素水（体積比３：１）の混合溶液（６５℃）で３０分間処理し、３次蒸留水でチップを洗浄した後、エタノールで洗浄し、３次蒸留水でチップを洗浄した。その後、窒素ガスでチップを乾燥させてＢｉａ−ｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴センサに装着した。装着されたチップに濃度２００μｇ／ｍＬの１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質と、タグ付けしていない組み換えタンパク質を１５０μＬずつ金薄膜の表面に５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させ、前記タンパク質を固定化した。金薄膜の表面と前記タンパク質とを反応させた後、非特異的な反応を防ぐために、ＢＳＡ（３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入した。その後、抗体（１００μｇ／ｍＬ、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ）、１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入して金薄膜にタンパク質Ｇ変異体および抗体が固定されたバイオセンサを製作し、プラズモン共鳴信号の変化を測定した（図５）。
【００５０】
実施例３：金ナノ粒子に１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体とを結合させ、抗体を固定化：金ナノ粒子に１個、２個または３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体とを結合させ、抗体を固定化してタンパク質電気泳動によって確認
２．５Ｏ．Ｄ／ｍＬの金ナノ粒子をＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した後、１００μＬの一連の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（２００μｇ／ｍＬ）と４℃で１６時間反応させた後、抗体１０μＬ（３．５ｇ／ｍＬ、抗−ウサギＩｇＧ（Ｗｈｏｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）−ＴＲＩＴＣコンジュケート、Ｓｉｇｍａ）を常温で２時間反応させた。また、対照群として２．５Ｏ．Ｄ／ｍＬの金ナノ粒子に抗体１０μＬ（３．５ｇ／ｍＬ）を常温で２時間反応させた。前記反応の後、遠心分離を用いて、反応していない抗体を除去し、ＰＢＳ緩衝溶液で洗浄した。
【００５１】
その後、金ナノ粒子に結合されているタンパク質は、タンパク質電気泳動によって確認した。図６のｌａｎｅの説明は次のとおりである；
ｌａｎｅ１：金ナノ粒子に直接抗体を結合、
ｌａｎｅ２：金ナノ粒子に、システインをタグ付けしていないタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ３：金ナノ粒子に、１個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ４：金ナノ粒子に、２個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
ｌａｎｅ５：ナノ粒子に、３個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇを固定化した後、抗体を結合
その結果、金ナノ粒子に抗体のみ反応したときよりは、連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合し抗体を反応させたときにさらに多くの抗原が結合した。また、タグ付けしていない組み換えタンパク質より、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体はさらに多くの抗原が結合した。上記の結果より、システインタグ付き組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が金ナノ粒子における抗原の固定化に有用であることを確認することができた（図６）。
【００５２】
実施例４：ガラス表面上に作られたマレイミド基に、１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を反応させて抗体を固定化：蛍光スキャナを用いて前記変形された組み換えタンパク質を、ガラス表面上にチオール基と共有結合するマレイミド基に結合させ、特異的に抗体が結合する反応を測定
ガラス表面をピラニア（硫酸：過酸化水素、３：１ｖ／ｖ）溶液に浸漬させて２０分間９０℃のオーブンで反応させた。反応の後、水とエタノールで洗った後、アミン表面を作るために、１％ＡＰＴＳ（(3-Aminopropyl)trimethoxysilane、０９３２６、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）が含まれたエタノール１５〜２０分間浸漬させて反応させた。反応済みのガラス表面はエタノールで洗浄した後、１００℃のオーブンで使用する前まで加熱した。作られたアミン表面上に１０ｍＭ ＢＭＰＳ（N-[b-Maleimidopropyloxy]succinimide ester、２２２９８、ＰＩＥＲＣＥ、ＵＳＡ）をＤＭＳ（dimethyl sulfoxide、Ｄ２６５０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）に溶かして３０分間浸漬させて反応させた。ＳＨ基と共有結合すべき、最終ガラスの表面上に作られたマレイミド基と１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を表面上に反応させてタンパク質を固定化した。一連の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体が固定化された表面に、蛍光標識物質を付着させた抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３（Ｃ５５８５、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＩＲＣＨ）および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３（Streptavidin-Cy3 from Streptomyces avidinii、Ｓ６４２０ ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて特異的タンパク質の結合度合いと非特異的結合が及ぼす影響を測定した。その結果、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（１ｍｇ／ｍＬ）の蛍光シグナルが現れておらず、抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３の濃度が増加するほど蛍光シグナルが増加することからみて、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌Ｇ変異体との抗体反応が特異的に行われたことを確認した。また、同一濃度の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体をそれぞれ反応させた後で抗体を反応させたとき、低濃度の抗体と高い結合力を示すことからみて、１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Ｇが、マレイミド基が結合されているガラスの表面などに抗体を固定化することに有用であることを確認することができた（図７）。
【００５３】
実施例５：１個、２個、３個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体と、タグ付けしていない連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させた後、抗原−抗体反応：表面プラズモン共鳴センサによって表面上の変形された組み換えタンパク質を金薄膜の表面に結合させ、抗体を固定化した後、抗原を感知する反応を表面プラズモン共鳴信号の変化から測定
金薄膜チップを９５％硫酸と３０％過酸化水素水（体積比３：１）との混合溶液（６５℃）で３０分間処理し、３次蒸留水でチップを洗浄した後、エタノールで洗浄し、３次蒸留水でチップを洗浄した。その後、窒素ガスでチップを乾燥させてＢｉａ−ｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴センサに装着した。装着されたチップの金薄膜の表面に、濃度２００μｇ／ｍＬの１個、２個および３個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質とタグ付けしていない組み換えタンパク質を１５０μＬずつ５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させて前記タンパク質を固定化した。金薄膜の表面と前記タンパク質を反応させた後、非特異的な反応を防ぐために、ＢＳＡ（３ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入させた。その後、抗体（０．５μｇ／ｍＬ、抗−ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ抗体、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）１００μＬを５μＬ／ｍｉｎの流れ率で注入して、抗体が固定されたバイオセンサに５０μＬの抗原（０．５μｇ／ｍＬ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ ３／ＰＳＡ）を反応させてプラズモン共鳴信号の変化を測定した（図８）。
【００５４】
［産業上の利用可能性］
本発明に係るシステインタグ付きタンパク質Ｇ変異体は、そのチオール基を介してバイオセンサの固体支持物質に方向性をもって結合して抗体を効率よく結合させることにより、抗原−抗体反応を用いるバイオチップおよびバイオセンサに有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は連鎖球菌タンパク質Ｇが抗体と結合する結合ドメインＢ１、Ｂ２を示す。
【図２】図２Ａはタンパク質Ｇを作るために製作したフラグメントおよびタンパク質Ｇ変異体を作るために製作した５つのフラグメントを示し、図２Ｂは前記フラグメントを挿入するベクターおよびフラグメントを挿入して連鎖球菌タンパク質Ｇに１個〜５個のシステインをタグ付けしたタンパク質Ｇ変異体を作るために発現ベクターを製造する方法を示す（ｐＥＴ−ｃｙｓ１−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ２−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ３−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ４−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｐＥＴ−ｃｙｓ５−Ｌ−ｐｒｏｔｅｉｎＧ、ｃｙｓ：システイン、Ｌ：リンカー、４個のアスパラギンと１個のリシン、ｐｒｏｔｅｉｎＧ：連鎖球菌タンパク質Ｇの構造である。）
【図３】図３はシステインタグ付き連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体の大腸菌における発現様相を示すタンパク質電気泳動写真（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。
【図４】図４は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を結合させて測定した表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである（４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ；ｐｒｏｔｅｉｎＧ：対照群としてチオール基が結合していない連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ１−Ｇ：１個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ２−Ｇ：２個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ、ｃｙｓ３−Ｇ：３個のシステインが結合している連鎖球菌タンパク質Ｇ）。
【図５】図５は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にヒトの抗体を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【図６】図６は金ナノ粒子に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）を固定化した後、抗体を結合させて抗体の固定化様相をタンパク質電気泳動によって示す写真である。
【図７】図７はマレイミド基が結合しているガラス表面にシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体を固定化した後、その表面に、蛍光標識物質が付いている抗体モノクローナル抗−ビオチンＣｙ３および対照群としてのストレプトアビジン−Ｃｙ３のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて得たイメージ写真である。
【図８】図８は金薄膜の表面に４個の異なる種類の連鎖球菌タンパク質Ｇ変異体（図４に示したものと同一）が結合している層上にＰＳＡに対する抗体（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させた後、抗原としてのＰＳＡ（０．５μｇ／ｍＬ）を反応させて得た表面プラズモン共鳴信号の変化を示すグラフである。
【図９】図９はＮ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体とＣ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体を金薄膜の表面に結合させ、抗体の結合能力を、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサ（ＳＰＲ）を介して表面プラズモン共鳴信号の変化を測定した結果である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体。
Ｍｅｔx−（Ｃｙｓ）ｎ−Ｌy−タンパク質Ｇ−Ｑz
（Ｍｅｔはメチオニン、Ｌはリンカー、Ｑはタンパク質精製のためのタグであり、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１であり、ｎは１〜１０である。）
【請求項２】
前記タンパク質Ｇは連鎖球菌に由来したタンパク質ＧのＢ１およびＢ２ドメインからなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項３】
前記タンパク質ＧのＢ１ドメインはＮ末端の１０個のアミノ酸が除去されたことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項４】
システインタグが１〜５個のシステインからなる、請求項１または２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項５】
システインタグが３個のシステインからなる、請求項２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項６】
リンカーが４個のアスパラギンと１個のリシンからなる、請求項１に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項７】
請求項２または３のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８の発現ベクターを含むＫＣＴＣ１０９４８ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９４９ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９５０ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９５１ＢＰ、およびＫＣＴＣ１０９５２ＢＰよりなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９の宿主細胞を培養し、これからタンパク質Ｇ変異体を分離することを特徴とする、タンパク質Ｇ変異体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１のタンパク質を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１２】
固体支持物質がセラミック、ガラス、高分子、シリコンおよび金属の中から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１３】
前記金属が金である、請求項１１に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１４】
請求項１のタンパク質に抗体を結合させて製造された、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のバイオチップイまたはバイオセンサ。
【請求項１５】
固体支持物はセラミック、ガラス、高分子およびシリコンの中から選ばれ、これらの表面はマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基から選ばれるいずれか一つの基で修飾されたことを特徴とする、請求項１２に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１６】
請求項１のタンパク質がチオール基を介して前記表面のマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基のいずれか一つに共有結合されることを特徴とする、請求項１５に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１７】
請求項１４のバイオチップまたはバイオセンサを用いて抗原を分析する方法。
【請求項１】
下記式で表される、Ｎ末端システインタグ付きタンパク質Ｇ変異体。
Ｍｅｔx−（Ｃｙｓ）ｎ−Ｌy−タンパク質Ｇ−Ｑz
（Ｍｅｔはメチオニン、Ｌはリンカー、Ｑはタンパク質精製のためのタグであり、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１であり、ｎは１〜１０である。）
【請求項２】
前記タンパク質Ｇは連鎖球菌に由来したタンパク質ＧのＢ１およびＢ２ドメインからなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項３】
前記タンパク質ＧのＢ１ドメインはＮ末端の１０個のアミノ酸が除去されたことを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項４】
システインタグが１〜５個のシステインからなる、請求項１または２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項５】
システインタグが３個のシステインからなる、請求項２に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項６】
リンカーが４個のアスパラギンと１個のリシンからなる、請求項１に記載のタンパク質Ｇ変異体。
【請求項７】
請求項２または３のタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項７の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項８の発現ベクターを含むＫＣＴＣ１０９４８ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９４９ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９５０ＢＰ、ＫＣＴＣ１０９５１ＢＰ、およびＫＣＴＣ１０９５２ＢＰよりなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９の宿主細胞を培養し、これからタンパク質Ｇ変異体を分離することを特徴とする、タンパク質Ｇ変異体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１のタンパク質を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１２】
固体支持物質がセラミック、ガラス、高分子、シリコンおよび金属の中から選ばれることを特徴とする、請求項１０に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１３】
前記金属が金である、請求項１１に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１４】
請求項１のタンパク質に抗体を結合させて製造された、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のバイオチップイまたはバイオセンサ。
【請求項１５】
固体支持物はセラミック、ガラス、高分子およびシリコンの中から選ばれ、これらの表面はマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基から選ばれるいずれか一つの基で修飾されたことを特徴とする、請求項１２に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１６】
請求項１のタンパク質がチオール基を介して前記表面のマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基のいずれか一つに共有結合されることを特徴とする、請求項１５に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
【請求項１７】
請求項１４のバイオチップまたはバイオセンサを用いて抗原を分析する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５４２２０３（Ｐ２００９−５４２２０３Ａ）
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５１７９６４（Ｐ２００９−５１７９６４）
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１６２２１
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年６月２０日（２００７．６．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００２９９６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１６２２１
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０５０９３３６７）コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー (13)
【Ｆターム（参考）】
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