システイン非含有で有効なテクネチウム（Ｔｃ）又はレニウム（Ｒｅ）のキレート化ペプチドタグ及びその使用
本発明は、このペプチドタグを含む興味ある蛋白質に放射性核種を結合させるのに用いることができ、このようなタグ化蛋白質をイメージ化させる、テクネチウム（Ｔｃ）又はレニウム（Ｒｅ）放射性核種を含むペプチドタグに関する。特に、本発明は、Ｔｃ又はＲｅ原子をキレート化するが、システイン残基を含まないペプチドタグに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、このペプチドタグを含む興味ある蛋白質に放射性核種を結合させるのに用いることができ、このようなタグ化蛋白質をイメージ化させるペプチドタグに関する。特に、本発明は、Ｔｃ又はＲｅ原子をキレート化するが、システイン残基を含まないペプチドタグ並びに該タグを組み込んだベクター及び存在する蛋白質に前記タグを結合させる化学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効なイメージング剤を生産するための、抗体、蛋白質又はペプチドの放射能標識化は、適切な化合物の欠如により現在妨げられている、分子イメージングの分野において依然非常に重要な目標である。
【０００３】
抗原又は受容体を標的化する天然分子の本来の能力は、それら本来の親和性及び特異性のために、非常に特異的なイメージング用又は治療用分子を生み出すことができる。イメージング剤は、基本的に、このようなペプチド又は蛋白質から標識された分子をイメージングシステムで検出可能にする特性を有する元素での標識化により得ることができる。
【０００４】
開発された様々な方法のうち、99mＴｃでの放射能標識化は、非常に魅力的なアプローチとして長らく認識されてきた。99mＴｃは、テクネチウム‐９９の準安定核同位体であり、これはインビボ診断イメージングにほぼ理想的な特性を有する。それは半減期（約６ｈ）を有し、これはイメージング剤の製造を可能にしたり、診断研究を行ったりするには十分に長いが、患者を重大な照射量に曝露せずにミリキュリー量の投与を許容するには十分短い。
【０００５】
140 Kevの単色光子及びその８９％の同位体存在度は、γカメラ又はＳＰＥＣＴシステムを用いたイメージングの研究に理想的である。更に、99mＴｃは、元の放射性核種99Ｍｏと99mＴｃ放射性核種との間の一過的な平衡を利用して、99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータから容易に得ることができる。99Ｍｏと99mＴｃとの分離は、生理的食塩水溶液を用いたジェネレータからのペルテクネテートＴｃＯ4-の溶離によって容易に達成される。
【０００６】
Ｔｃ核は、次いで溶離したペルテクネテートの還元によって製造できる。Ｔｃの幾つかの酸化状態を生じることがあり、それを用いることができる。最も研究された核の１つは二原子Ｔｃ(V)核[ＴｃＯ]3+に一致し、より最近になって、ペプチド及び蛋白質を標識化するＴｃ(I)トリスカルボニル[Ｔｃ(ＣＯ)3]+の生産及び使用について多数の研究が報告された。
【０００７】
レニウムは、同様に有利な特性を有し、このことは、レニウムを、放射能標識化及びインビボ／インビトロイメージング及び治療用途に適する元素たらしめる。更に、Ｒｅ及びＴｃは非常に似た化学的性質を有し、Ｒｅが生産するのにより安価であり、その幾つかの同位体がＴｃよりも長い半減期を有するので、これはＲｅを幾つかの用途についてより良い放射性核種とし得る。
【０００８】
幾つかのストラテジーは、テクニチウム又はレニウムを用いて、ペプチド及び蛋白質を放射能標識化することを既に提案している：
‐第１の方法は、いわゆる直接的方法に相当し、これは興味ある分子中に存在するジスルフィドブリッジの還元及び生じたスルフヒドリル（sulfudryl）基へのＴｃ核のキレート化を含む（１）。この第１の方法は単純で行うのが容易に見えるが、幾つかの制限を有する（２）。第１は、蛋白質の構造へのキレート化の影響、したがって標的受容体への蛋白質の結合能力に対するキレート化の影響に関する。通常、ジスルフィドブリッジは蛋白質の正確なフォールディング／構造の形成及び維持に重要な役割を果たす。ジスルフィドブリッジを崩壊させることによって、得られた標識化蛋白質は、その標的への親和性を欠落し得る。更に、キレート化したＴｃ核は、興味ある蛋白質の結合領域と相互作用するか、又は該結合領域に位置し、その生物学的活性の部分的又は全体的な喪失をもたらし得る。
【０００９】
‐第２の間接的方法により、二官能性キレート化剤（ＢＦＣＡ）を用いて、Ｔｃ核で蛋白質及びペプチドを標識化することが提案されてきた。この方法は、リジン残基が最も頻繁に関与する化学選択的反応による、強力なＴｃ核配位子の蛋白質表面への化学的グラフト形成に基づいている。最も広く用いられる配位子の１つは、ＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）基である（３，４）。このような強力な配位子の存在が標識化率及び結果として形成されたＴｃ錯体の安定性を増加させるが、この方法の主な欠点は、蛋白質表面のＢＦＣＡの位置を制御できないことであり、よってこのことは、不均一な標識化分子の蓄積をもたらし得る。不均一な標識化分子のサブセットは、結合能力が低下されている可能性を有し、少なくとも定量的及び再現的研究を困難にさせ得る。
【００１０】
‐第３のアプローチは、前形成キレート（preformed chelate）と呼ばれ、抗体を標識化することを提案してきた（５，６）。しかしながら、このアプローチは、存在する任意のリジン残基と反応する前形成Ｔｃ‐キレート錯体の位置に対する制御不能性に関して、直接及び間接的方法と同様の制限に縛られる。
【００１１】
ペプチドタグ配列を用いたＴｃ又はＲｅでの蛋白質の部位特異的標識化は、上記の方法の代案として提唱されてきた。このアプローチは、興味ある蛋白質のＮ‐末端又はＣ‐末端の位置に、Ｔｃ／Ｒｅ核をキレート化できるペプチド配列を付加することからなる。幾つかのペプチド配列は、[ＴｃＯ]3+配位子として記載されている（７）。これらペプチドは、四配位座配位子と四角錐状のオキソ‐テクネチウム錯体を形成する。報告された天然アミノ酸含有ペプチドの大半は、そのチオレート基を介してキレート化に加わるシステイン残基を有する。
【００１２】
このタイプのペプチドタグの例は、Ｎ３Ｓキレート化モチーフを有するＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号２８）及びＬｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号２９）配列並びにＮ２Ｓ２モチーフを有するＣｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号３０）である（８，９）。しかしながら、不対システインの存在が蛋白質のフォールディングプロセスを妨害することによって、改変蛋白質の生産収率を減少させるか、又はその最終的なコンホメーションを変更させ得ることは当該技術において公知である。不対システインはまた、貯蔵中にターゲティング分子の変更をもたらし得る。
【００１３】
蛋白質を生成するアミノ酸を含むがシステイン残基を含まない[ＴｃＯ]3+キレート化‐ペプチド配列は、したがって、優良な候補分子であるように見えるであろう。しかしながら、このようなペプチド配列は極端に珍しく、当該技術において、グリシン及びアラニン残基を含むペプチド配列だけが、Ｎ４モチーフ内の[ＴｃＯ]3+核をキレート化できることが示されている（１０，１１）。これらペプチドは、[ＴｃＯ]3+のsyn及びanti異性体の相互変換を示し、インビボ試験より前のこれら錯体についての安定性のデータは報告されていない。解離した[ＴｃＯ]3+錯体がバックグラウンドのより大きな非特異的シグナルを生じ、より低いSN比をもたらすので、安定性は放射能標識化試薬に必須の特性である。
更に、[ＡＧＧＧ]ＴｃＯ錯体（配列番号３１）が３０当量のシステインに対して完全に不安定であることが近年証明された（１２）。
【００１４】
近年、ジペプチド配列がＴｃＯ／ＲｅＯキレート化配列として提案されている（１３）。これらジペプチドは、それらがＴｃ／Ｒｅをキレート化する官能基を３つしか含まないという大きな欠点を有し、このことが錯体の安定性に対して影響し、インビボ応用のためのそれらの有用性が低下することが予測される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ペプチド化学又は分子生物学のいずれかによって蛋白質に組み込まれ得る、新規で有効な[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列の同定は、したがって、依然としてイメージング剤の開発のための重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明の第１の観点によれば：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり；特にＸ1はスレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択され、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型
からなる群より選択されるペプチドタグの、Ｔｃ又はＲｅ放射性核種で興味ある蛋白質を放射能標識化するための使用が提供される。
【００１７】
本発明において、キレート化は、本発明により標識化されるペプチド又は蛋白質である二配位座又は多配位座配位子へのＴｃ／Ｒｅ核の結合を意味する。
【００１８】
本発明者らは、ペプチドＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）の[ＴｃＯ]3+標識化を詳細に調査した。このペプチドは、マウスのマクロファージから最初に単離された蛋白質ユビキチジンの２９〜４１位残基に対応するトリデカマーである（１４）。ＵＢＩ ２９‐４１は、５つのアルギニン残基及び１つのリジンを有する配列ＴＧＲＡＫＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号１）のカチオン性抗菌ペプチドである。
【００１９】
システイン残基の不在にも拘らず、ＵＢＩ ２９‐４１は、以前に直接的アプローチによって、イメージング剤としてのその使用を可能にする比放射能並びにインビトロ及びインビボでの安定性で標識化された（１５‐１７）。しかしながら、ＵＢＩ ２９‐４１中の[ＴｃＯ]3+核キレート化部位の明確な同定を可能にする実験データは、どの標識化研究からも報告されなかった。しかしながら、実験データがなくとも、半経験則的な予測に基づいて、ＵＢＩ ２９‐４１中のアルギニン７又はリジン５の側鎖残基を介して、ＴｃＯ核をキレート化できることが提唱されてきた（１８）。
【００２０】
本発明者らの発見は、[ＴｃＯ]3+核にリジン５及びアルギニン７側鎖の化学官能基を介して配位したというＦｅｒｒｏ‐Ｆｌｏｒｅｓらの提唱（１８）に対する反証を挙げる。この関係において、本発明者らは、残基Ｋ５のノルロイシン残基による置換え（ＵＢＩ‐Ａ３類似体、表I）及びＲ７のノルバリン残基による置換え（ＵＢＩ‐Ａ５類似体、表I）が、標識化率の如何なる減少ももたらさないことを示し、これらの残基が[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に関与しないことをはっきりと示している。
【００２１】
その代わりに、本発明者らは、ＵＢＩ ２９‐４１中の配列Ｔ1Ｇ2Ｒ3Ａ4に対応する最初の４残基Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4がキレート化に最も大きな影響を与えることを示した。特に、本発明者らは、天然のスレオニン残基（Ｘ1）の側鎖中に存在するＯＨ基が、放射性核種のキレート化において非常に重要な役割を果たすことを見出した。これらの発見を基礎に、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に用いることができ、ＵＢＩ ２９‐４１よりも小さいサイズであり、[ＴｃＯ]3+核に対する同等又はより優れた標識化率を有するペプチドタグ及び／又はＵＢＩ ２９‐４１と同等のサイズであるが[ＴｃＯ]3+核に対する著しく優れた標識化率を有するペプチドタグの組を開発した。
【００２２】
ペプチドタグは、興味ある蛋白質のＣ又はＮ末端への該タグの組込みを容易にするように、それぞれそのＮ又はＣ末端にリンカーを更に含んでいてもよい。蛋白質配列のＣ又はＮ末端への付加が、蛋白質の予測されず望ましくないコンホメーション及び／又は機能的変化をもたらし得ることは、当該技術において公知である。このような問題を多少なりとも解決するために、ペプチドリンカーを用いて、Ｃ又はＮ末端に位置する蛋白質の本来の機能的ドメインを新規な機能的ドメインに結合させることができる。このようなペプチドリンカーは、通常、天然又は新規のいずれかの機能的ドメインに影響を与えることが予測されない一連の幾つかのアミノ酸残基を含む。例としては、一連の６ヒスチジン残基又は２グリシン残基が含まれるが、種々の長さ及びアミノ酸組成のその他多くのリンカーが当該技術において公知である。
【００２３】
更に、ペプチドタグは、ＵＢＩ ２９‐４１の残基５〜１３に対応する更なるＵＢＩ ２９‐４１の一部を含んでいてもよく、この中の少なくとも１つの残基が、天然残基の側鎖を欠落する非天然又は天然アミノ酸残基で置き換えられるときに、ペプチドタグの放射性核種標識化を増大させることが本発明者らにより示されている。
【００２４】
これら放射能標識化蛋白質は、インビトロ及びインビボイメージング並びに放射線療法のような多様な目的のために用いられてもよい。
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ2はグリシンを含む。
【００２５】
特に、ペプチドタグは以下から選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００２６】
本発明者らはまた、ＣＯ‐ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ‐ＣＯ結合を含むペプチドである、本発明者らが開発したペプチドタグのレトロインベルソ型が類似の特性を有することを示した。更に、レトロインベルソペプチドは、Ｌ‐ペプチドよりも大いに蛋白質分解に耐性であり、それゆえインビトロ及びインビボイメージング試薬のためのより優良な候補分子である。このようなレトロインベルソペプチドは、標識化される蛋白質の末端に組み込むことができる。
【００２７】
特に、タグは、Ｎ末端残基上に遊離Ｎ末端を含む。
本発明者らは、遊離アミン基と共に、遊離Ｎ末端を有するペプチドタグが、遊離Ｎ末端を欠落するものよりも高いレベルの[ＴｃＯ]3+核キレート化を示すことを示した。
特に、ペプチドタグは、Ｃ末端残基上に遊離カルボキシレートを含む。
特に、Ｔｃ放射性核種は99mＴｃである。
特に、Ｒｅ放射性核種は186Ｒｅ又は188Ｒｅである。
【００２８】
本発明のこの観点によれば：
１）ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり；特に、Ｘ1は、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型
からなる群より選択されるペプチドタグを、前記興味ある蛋白質に組み込む工程と、
２）工程１）で得られた生成物でＴｃ又はＲｅ放射性核種をキレート化する工程と
を含む興味ある蛋白質を放射能標識化する方法もまた提供される。
【００２９】
更に、本発明のこの第１の観点はまた、本発明のこの第１の観点に記載の１つ又はそれより多いペプチドタグをコードする、単離又は精製されたヌクレオチド分子に関する。
【００３０】
本発明の第２の観点によれば、本発明の第１の観点に記載のペプチドタグのコード配列と、前記ペプチドタグにインフレームで蛋白質コード配列が導入され、融合蛋白質を形成するように配置されたクローニングサイトと、標的細胞又は無細胞発現系において前記融合蛋白質を発現させるのに必要な転写因子とを含むことを特徴とするベクターが提供される。
【００３１】
ベクターは、他には発現ベクター又は発現構築物として知られ、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために用いられるプラスミドである。一旦ベクターが細胞内に入れば、遺伝子によりコードされる蛋白質は、細胞の転写及び翻訳機構により生産される。プラスミドは、エンハンサ及びプロモータ領域として作用する調節配列を含み、ベクターが有する遺伝子の効率的な転写をもたらすようにしばしば工学的に操作される。巧みに設計されたベクターの目標は、順次遺伝子産物に翻訳される安定的なメッセンジャーＲＮＡの大量生産である。
【００３２】
遺伝子産物の発現後、蛋白質の精製を要する場合があり、遺伝子産物を宿主細胞の蛋白質から精製できる。精製プロセスを簡素化するために、クローニングされた遺伝子は、連続ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（multiple histidine(His) tag）又は任意のその他の適切な小さく検出可能なペプチド配列のようなタグを有していてもよい。
【００３３】
興味ある蛋白質のクローニングされたコード配列を、選択されたペプチドタグにインフレームであるように配置することは、標準的な分子生物学的手法に従って、特にJoseph Sambrook及びDavid Russellによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第３版）（ISBN 978-087969576-7）に従って行われ得る。
【００３４】
特に、本発明のこの観点によれば、ベクターは、少なくとも１つの真核及び／又は原核細胞において、ペプチドタグを含む蛋白質の発現を駆動できる。
或いは、本発明のこの観点によれば、ベクターは、少なくとも１つの細胞非含有発現系において、ペプチドタグを含む蛋白質の発現を駆動でき得る。
【００３５】
本発明の第３の観点によれば、ペプチドタグが液相ペプチド合成（４１）又は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（４０）により合成される本発明の第１の観点に記載のペプチドタグを合成する方法が提供される。
【００３６】
ペプチドは、１つのアミノ酸のカルボキシ基又はＣ末端を、別のアミノ酸のアミノ基又はＮ末端に結合させることにより合成される。意図しない反応の可能性が明瞭であるとき、保護基が通常必要となる。一般に、ペプチド合成方法は、液相又は固相で行われる。
【００３７】
ＳＰＰＳにおいて、不溶性であるが多孔性の小さな固体ビーズは、ペプチド鎖をその上に構築できる機能性ユニット（「リンカー」）で処理される。ペプチドは、切断試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合的に付着し続ける。ペプチドは、したがって、固相表面で「固定化され」、濾過プロセス中保持できるが、液相の合成試薬は洗い流される。
【００３８】
この方法は、カップリング‐脱保護の反復サイクルに基づいている。固相に付着したペプチドの遊離Ｎ末端アミンは、Ｎ末端が保護されたアミノ酸の単一ユニットに結合される。このユニットは次いで脱保護され、更なるアミノ酸が付着し得る新規なＮ末端アミンが露われる。
【００３９】
これらペプチド合成方法について多くの変化形が当該技術において存在し、これらは本発明の範囲内である。
本発明において、ペプチドタグとペプチドタグを含む蛋白質との両方を、更なる使用のために合成できる。
【００４０】
本発明の第４の観点によれば、前記蛋白質が液相又は固相合成により合成される本発明の第１の観点によるペプチドタグを含む蛋白質を合成する方法が提供される。
【００４１】
本発明の第５の観点によれば：
ａ）前記標的蛋白質の精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｂ）前記ペプチドタグの精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｃ）工程ａ）及び工程ｂ）の生成物をインキュベートし、ペプチドタグ‐標的蛋白質複合体を精製する工程と
を含む、本発明の第１の観点によるペプチドタグを標的蛋白質に化学的に結合させる方法が提供される。
【００４２】
液相ペプチド合成に類似の手法を用いて、ペプチドタグを興味ある蛋白質にインビトロで、ライゲーション又は架橋手法を用いることにより付着できる。当該技術においてはその他の結合手法が存在し、本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の第６の観点によれば：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号４２）と、
ここで、
‐Ｘaは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＫＶＡＫＱＥＫＫＫＫＫ（配列番号４３）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型と
からなる群より選択される単離又は精製されたペプチドタグが提供される。
【００４４】
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ1はスレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
特に、Ｘ2はグリシンである。
【００４５】
特に、ペプチドタグは以下から選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００４６】
本発明の第７の観点によれば、前記ペプチドタグが：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号４２）と、
ここで、
‐Ｘaは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＫＶＡＫＱＥＫＫＫＫＫ（配列番号４３）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型と
からなる群より選択される、単離又は精製された、Ｔｃ核をキレート化するペプチドタグが提供される。
【００４７】
本発明者らは、本発明者らが開発したペプチドタグは、Ｔｃ核を安定的にキレート化できることを示した。
特に、キレート化したＴｃ核は、(ＴｃＯ)3+又は[Ｔｃ(ＣＯ)3]+、好ましくは(ＴｃＯ)3+である。
【００４８】
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ1はスレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
特に、Ｘ2はグリシンである。
【００４９】
特に、ペプチドタグは以下からなる群より選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００５０】
本発明の第８の観点によれば：
ａ）興味ある蛋白質を含む水溶液に
（i）塩基性ｐＨ条件下の還元剤の水溶液と、
（ii）テクネチウム酸（VII）の塩（ペルテクネテート塩）の水溶液と
を逐次的に加える工程と：
ｂ）１〜１０分間室温における、工程ａ）からの溶液をインキュベートする工程と
を含む、本発明のここまでの観点によるペプチドタグを含む興味ある蛋白質をＴｃ核で標識化する方法が提供される。
好ましくは、還元剤の水溶液は、ＳｎＣｌ2である。
好ましくは、前記ペルテクネテート塩は、ナトリウム、カリウム又はリチウム塩である。
【００５１】
本発明者らは、本発明者らが開発したキレート化ペプチドタグの１つを含む興味ある蛋白質が、幾つかのプロトコルを用いてＴｃ核で標識化できることを示した。本発明者らはまた、このような標識化された興味ある蛋白質が安定的に標識化されることを示した。
好ましくは、工程ａ）中、（iii）テクネチウム酸（VII）のアンモニウム塩（アンモニウムペルテクネテート又はＮＨ4ＴｃＯ4）の水溶液も加える。
【００５２】
本発明をより深く理解するために、そして如何にして本発明を実施できるかを示すために、例示だけの目的で、本発明に記載の特定の実施態様、方法及びプロセスを、添付の図面に関連付けて以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＵＢＩ ２９‐４１の直接的[ＴｃＯ]3+標識化： 99mＴｃ／99Ｍｏジェネレータからの(99m+g)Ｔｃ（Ａ）及び99mＴｃ／99Ｍｏジェネレータからの[ＮＨ499ＴｃＯ4]＋(99m+g)Ｔｃからの99gＴｃ（Ｂ）を用いたＵＶ吸収を実線で示し、放射活性を点線で示す。
【図２】遊離型（点線）及び[ＴｃＯ]3+との錯体（実線）にあるＵＢＩ ２９‐４１の220 nmでの吸収スペクトル。
【図３】ａ）ＲＣ‐１２１（配列番号４０）及びｂ）ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）の概略図。
【図４】１μｇのＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]（134 μＣｉ）（Ａ、Ｂ）の注射並びに１μｇのHＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（134 μＣｉ）及び125μｇのＲＣ‐１２１（Ｃ、Ｄ）の同時注射の４時間後のＡＲ４‐２Ｊ異種移植マウスの全身断面図。Ａ及びＣは断面の写真であり、Ｂ及びＤはβ‐イメージャ（BIOSPACE inc.）で作製された99mＴｃ（１５Ｋｅｖ）のβ‐放射の検出を表す。
【００５４】
本発明者らにより意図される特定の態様を、実施例によって以下に記載する。以下の記載において、非常に多数の詳細が、本発明の徹底的な理解を提供するために設定される。しかしながら、本発明がこれら特定の詳細に限定されずに行われ得ることは、当業者に明らかである。その他の場合において、周知の方法及び構造は、記載を不必要に不明瞭にしないように、記載していない。
【００５５】
定義
‐ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中で一字コードに従って示し、これにおいて、例えばＱはＧｌｎ又はグルタミン残基を意味し、ＲはＡｒｇ又はアルギニン残基を意味し、ＤはＡｓｐ又はアスパラギン酸残基を意味する。
‐キレート化されたペプチドタグは、Ｔｃ又はＲｅ核をキレート化しており、それに化学的に結合されている短いペプチド配列を指称する。
【００５６】
‐Ｎ３Ｏキレート化配列は、３つの窒素原子及び１つの酸素原子を介して、ＴｃＯ核をキレート化する配列を指称する。同様に、Ｎ４キレート化配列は、４つの窒素原子を介してＴｃＯ核をキレート化する配列を指称する。
‐天然残基は、別の天然又は非天然アミノ酸によるその置換え前の明記されたペプチド配列中に存在するアミノ酸残基を指称する。
【００５７】
‐非天然／天然アミノ酸残基。天然アミノ酸残基は、様々な化学的手段により製造することもできるが、インビボで発見され、少なくとも１つの自然に発生する生物により生産されるものである。非天然アミノ酸残基はインビボで発生せず、様々な化学的手段によってのみ製造できる。
【００５８】
‐ペプチドリンカーは、天然の機能的ドメイン又は新規な機能的ドメインのいずれにも影響しないと予測される、一連の幾つかのアミノ酸残基を指称する。例として、一連の６ヒスチジン残基又は２グリシン残基を含むが、様々な長さ及びアミノ酸組成の多くのその他のリンカーが当該技術において公知である。
‐ペプチドタグは、Ｔｃ又はＲｅ核をキレート化できる短いペプチド配列を指称する。
【００５９】
‐Ｔｃ又はＲｅ核は、活性型に化学的に還元されているＴｃ又はＲｅ原子を指称する。Ｔｃ核の例として、Ｔｃ(V)二原子核[ＴｃＯ]3+又はＴｃ(I)トリスカルボニル[Ｔｃ(ＣＯ)3]+を含む。
‐ＴｃＯは、記載されたキレート化ペプチドタグ配列との錯体にあるときのＴｃ核の呼称であり得、ＴｃＯ[ペプチド]又はＴｃＯ‐ペプチドの形式にある。
【００６０】
‐側鎖は、種々の自然に発生するアミノ酸残基間で異なるアミノ酸の化学基を指称し、例えばグリシンにおいてＨ‐であり、アラニンにおいてＣＨ3‐である。別の残基の側鎖を欠落する天然又は非天然アミノ酸は、関連する側鎖が失われているものであり、例えばチロシンは、ＯＨ基を有する環状炭化水素からなる側鎖を含むが、類似のアミノ酸であるフェニルアラニンはＯＨ基を含まず、よって天然の（チロシン）残基の側鎖を欠落するアミノ酸としてチロシンを置き換えるのに用いることができる。
【００６１】
‐ＳＰＥＣＴは、γ線を用いた核医薬断層撮影イメージング手法である単色光子放射型コンピュータ断層撮影法を意味する。それは、γカメラを用いた従来の核医学平面イメージングに非常に類似している。しかしながら、それは３Ｄ情報を提供できる。この情報は、患者の横断面図を提供するが、必要に応じて自由にリフォーマット又は操作できる。
‐「syn／anti異性体」‐一般に用いられるジグザグ図において、置換基は、炭素鎖と同側、すなわちsyn配向又は反対側、すなわちanti配向にあり得る。
【実施例】
【００６２】
実施例１：材料及び方法
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸（Nova Biochem, Laufelfingen, Switzerland）は、以下の側鎖保護基と共に用いた：Ｓｅｒ及びＴｈｒにtert‐ブチルエーテル；Ａｓｐ及びＧｌｕにtert‐ブチルエステル；Ａｒｇに2,2,5,7,8‐ペンタメチルクロマン‐6‐スルホニル；Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎにトリチル；並びにＬｙｓにtert‐ブチルオキシカルボニル。ペプチド合成のための溶剤及び試薬は、ＳＤＳ（Peypin, France）又はＦｌｕｋａ（St. Quentin Fallavier, France）からであった。
【００６３】
アンモニウムペルテクネテート（ＮＨ4ＴｃＯ4）は、National Oak Ridge Laboratory（USA）から購入し、開示される手順を用いて再酸化した（３７）。標識化実験において用いられる水溶液の濃度を、244 nmにおいて、純粋なペルテクネテートについて6220 M‐1 cm‐1の吸収係数を仮定し、電子吸収分光法を用いて測定した。
標識化反応混合物の分析は、Prostar 335フォトダイオードアレイ検出器（Varian, Les Ulis, France）とBerthold HERM LB500 γ‐検出器（Berthold, Thoiry, France）とを備えたVarian Prostar HPLCシステムを用いて行った。
【００６４】
１．１ ペプチド合成
設計されたペプチドを、自動ペプチド合成装置（モデル433A, Applied Biosystems, Foster City, USA）上での固相合成により、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）‐アミノ酸誘導体、Novasyn TGR（Nova Biochem, France）及びＮ‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／Ｎ,Ｎ'‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCI, Applied Biosystems）媒介結合を用いることによって得た。ペプチド合成を、１回当たり３０分のカップリング及び１０倍過剰量のＦｍｏｃ‐アミノ酸（1 mモル）を用いて0.10 mmolのスケールで行い、その後無水酢酸でキャップした。合成完了後、95％トリフルオロ酢酸、2.5％の水、2.5％のトリイソプロピルシランの混合物で室温にて、13‐マーペプチドについては２時間及びより短いペプチドについては３０分間処理することにより、側鎖保護基を同時に除去しながら、樹脂からペプチドを切断した。13‐マーについて、次いで樹脂を濾過し、メチル‐tert‐ブチルエーテル中で４℃にて遊離ペプチドを沈降させた。３回の遠心分離及びエーテルでの洗浄後、ペプチドを20％酢酸に溶解させ、凍結乾燥させた。より短いペプチドについて、溶媒を真空中で除去し、得られた黄色の油状物を20％酢酸に溶解させ、凍結乾燥させた。還元された（reduced）ペプチドを、溶離剤Ａ（水中の0.1％トリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（水中の0.09％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の非線形勾配を80分間にわたって、Supelco BioWide Pore C18カラム（10 × 250 mm）上で、4.5 mL／分の流速にて用いる、分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製した。ピークを分析的ＨＰＬＣで分析し、＞95％純粋な画分を集積し、凍結乾燥させた。
【００６５】
１．２ ペプチド配列分析
アミノ酸配列の分析は、ＡＢＩ モデル ４９２ Ｐｒｏｃｉｓｅ 蛋白質配列決定システム（Applied Biosystems）を用いて、自動エドマン分解により行った。
【００６６】
１．３ 標識化手順及びＨＰＬＣ分析
典型的な実験において、15 μlの580 μＭペプチド水溶液に、水中の1 mg／mlのＳｎＣｌ2溶液5 μlを加え、その後10 μlの0.1N NaOH溶液及び新しく調製したＮＨ4ＴｃＯ4の5.5 mM水溶液2.5 μlを加えた。反応混合物を室温にて５分間インキュベートした。水中の0.05％トリフルオロ酢酸中のカフェインの0.1 mg／ml溶液50 μlを加え、定量化標準として用いた。溶液を0.8 μlの1N HClで酸性化し、溶離剤Ａ（水中の0.05％トリフルオロ酢酸；最終ｐＨ 〜2.5）で120 μlに希釈した。この混合物をGrace Altima C8カラム（Grace Davison, Lokeren, Belgium）及び溶離剤Ａ中の溶離剤Ｂ（水中の0.045％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の最適化された非線形勾配を用いて分析した。
【００６７】
ＢＰＴＩ（配列番号３２）及びＴＧＲＲＲペプチドタグ（配列番号２２）とペプチドリンカーＧＧ（配列番号３６）とを含むその変化形ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩ（配列番号３３）の場合に、50 μgの蛋白質を[ＴｃＯ]3+標識化実験に用いたことを除き、プロトコル２（実施例２を参照）に記載のものと同様の条件を適用した。
【００６８】
各ペプチドについて、標識化率は、内部キャリブレーションを用いて算出する。第１の実験を上記条件下に行い、反応しなかったペプチドに対応するピークの面積を、内部基準カフェインに対応するピークのものに対して標準化し、比Ｒ1を得た。第２の実験を、ＴｃＯ4-を反応混合物に加えないことを除いて、同一の条件下に行った。反応しなかったペプチドに対応するピークを、カフェインのものに対して標準化し、比Ｒ2を得た。標識化率を（１−Ｒ1／Ｒ2）として算出した。
【００６９】
１．４ システイン攻撃（Cysteine challenge）
16 μgの凍結乾燥させたＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]（配列番号１）を含む溶液をＰＢＳ ｐＨ ７．４中のシステイン溶液32 μlに加えた。システイン溶液の３つの濃度を用いた：333、53及び３のシステイン：Ｔｃ‐ＵＢＩ‐ＷＴモル比にそれぞれ対応する100 mM、15 mM及び1 mM。サンプルを20時間310Ｋにてインキュベートし、その後ＨＰＬＣ及びＥＳＩ‐ＭＳ分析を行った。類似の実験をＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]（配列番号２２）錯体について行った。13 μｇの凍結乾燥させたＴＧＲＲＲ（配列番号２２）‐ＴｃＯ錯体を、50のＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]（配列番号２２）：システインのモル比に対応する、ＰＢＳ ｐＨ ７．４中の15 mMシステイン溶液64 μlに加えた。この溶液を20時間室温にてインキュベートし、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００７０】
１．５ ＴｃＯ[ペプチド]錯体の大規模精製及び単離
水１ ml中の１ mgのＵＢＩ 29‐41（配列番号１）に、333 μlの１ mg／ml ＳｎＣｌ2水溶液、667 μlの0.1 N NaOH及び133 μlの新しく調製したアンモニウムペルテクネテート水溶液を加えた。反応混合物を５時間室温にてインキュベートした。それを９ mlの50 mM水性トリフルオロ酢酸アンモニウム溶液で希釈した後に、ＨＰＬＣに注入した。テクネチウム錯体を、4.6 × 150 mmのAltima C8カラム上で、40分間にわたる溶離剤Ａ（50 mMアンモニウムトリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（70％水性メタノール溶液中の50 mMアンモニウムトリフルオロ酢酸）の20％〜80％の線形勾配を用いて精製した。
【００７１】
１．６ 質量分析
ＬＣ‐ＭＳ分析を、ＥＳＩ‐イオントラップ質量分析器Ｅｓｑｕｉｒｅ ＨＣＴ（Bruker-Daltonics, Germany）とオンラインで連結したＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓで行った。溶離は、Ｇｒａｃｅ Ａｌｔｉｍａ Ｃ８カラム（Grace Davison, Lokeren, Belgium）上で、600 μＬ／分の流速にて、溶離剤Ａ（水中の0.05％トリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（水中の0.045％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の線形勾配で行った。分離システムを用いて、カラムからの溶離物の90％をＤＡＤ（ダイオード‐アレイ検出器）検出器に割り当て、ＵＶ吸収を測定した。
【００７２】
カラムからの溶離物の残り10％は、ＭＳ収集のためにＥＳＩ‐ＭＳに割り当てた。窒素を乾燥及び噴霧用ガスとし、ＥＳＩにより生じたイオンのトラップ及び冷却の効率化並びにフラグメント化プロセスのためにヘリウムガスをイオントラップに導入した。イオン化及び質量分析条件（キャピラリ高電圧、スキマ及びキャピラリ出口電圧並びにイオン移動パラメータ）を変化させ、化合物の検出に最適化した。
【００７３】
１．７ ＮＭＲ実験
ＵＢＩ‐29‐41ペプチド（配列番号１）及び精製したＴｃＯ錯体を、1.5 mMにて、600 μlの90％Ｈ2Ｏ／10％Ｄ2Ｏ中で調製した。ｐＨを両方のサンプルについて5.8に調整した。1Ｈ化学シフトを内部基準3‐(トリメチルシリル)[2,2,3,3,-2H4]プロピオネート（ＴＳＰ）を用いて測定した。
主鎖及び側鎖帰属実験を、295Ｋにて、ＵＢＩ‐29‐41（配列番号１）及びそのＴｃＯ錯体について、５ mmの三重共鳴凍結探針を備えたBruker DRX-700分光計で行った。
ＮＭＲ実験を行って、ＴＧＲＲＲ（配列番号２２）の側鎖及び主鎖共鳴を帰属させ、そのＴｃＯ錯体を、90％Ｈ2Ｏ／10％Ｄ2Ｏ及び100％Ｄ2Ｏ中に５ mm ＢＢＩ Ｚ 勾配探針を備えたBruker DRX-500に記録した。
【００７４】
1Ｈ‐1Ｈ及び1Ｈ‐13Ｃの２Ｄ実験を相次いで記録した。1Ｈ‐1Ｈ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）は、混合用ＤＩＰＳＩ２シークエンスでの80ミリ秒の混合時間を用いて記録し、勾配での３‐９‐１９パルスシークエンスでのウォーターサプレッションを用いて記録した。２Ｄオフ共鳴ＲＯＥＳＹスペクトル（ＴＲＯＥＳＹ）は、100ミリ秒のＲＯＥＳＹスピンロック時間を用いて記録した。
２Ｄ1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験は、感度が改善された同核種Ｈａｒｔｍａｎ‐Ｈａｈｎ混合用ＤＩＰＳＩ２シークエンスを用いて、double-INEPT移動による相関を用いて記録した。スペクトルをTopspin Brukerソフトウェアで処理し、プログラムＳＰＡＲＫＹで分析した。
【００７５】
１．８ ラット細胞培養
ソマトスタチン受容体サブタイプ２（ＳＳＴ‐２）を主に発現するラット膵カルチノーマＡＲ４‐２Ｊ細胞を用いて、99mTcO標識化ソマトスタチン類似体をインビボで評価した。細胞を組織培養皿（Falcon）中で、３７℃にて５％ＣＯ2及び95％加湿空気下に、１％Ｌ‐グルタミン、20％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）を補給した４．５ｇ／ｌグルコースを有するＤＭＥＭ培地中でインキュベートし、成長させた。継代培養は、トリプシン／ＥＤＴＡ（0,05％／0,02％ w/v）溶液を用いて行った。全ての製品をＳｉｇｍａ社（Saint-Quentin Fallavier; France）から購入した。100％のコンフルーエンスにて、培地を除去し、Versenバッファ（ＰＢＳ ＋ ５ mM EDTA）を用いて細胞を回収し、氷冷ホスフェートバッファで洗浄し、最後に1000ｇにて７分間（４℃）遠心分離した。ペレットを氷冷バッファ（10 mM MgCl2, 0,25% BSA, 50 mM HEPES pH 7.5, 1%プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社））中に懸濁し、細胞懸濁液を氷中に保存し、結合実験に用いた。
【００７６】
１．９ [125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチン結合アッセイ
ＡＲ４‐２Ｊ細胞について全ての結合実験を３７℃にて、10 mM MgCl2, 0,25% BSA, 50 mM HEPES pH 7.5, 1%プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）中で行った。ＡＲ４‐２Ｊ細胞懸濁液の密度を結合アッセイ前に毎回確認し、提示された放射性リガンドが10％より多く特異的に結合しないよう（概しておよそ3000 cpm）に調整した。類似の実験を行って、ＳＳＴ‐２を発現するＡＲ４‐２Ｊ細胞懸濁液との[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンの平衡結合に対するＲＣ‐１２１（配列番号４０）、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）及びＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の濃度上昇の効果を測定した。概して、トレーサとしての0.5 nM [125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンは、15 μlの細胞懸濁液と共に、45分間100 μｌの最終アッセイ体積中でインキュベートした。非特異的結合は、５μＭのソマトスタチン‐28の存在下に測定した。インキュベーションを、氷冷洗浄バッファ（Ｔｒｉｓ 10 mM pH7.2）を加えて終了させ、0.5％ポリエチレンイミン中に予め浸漬させたWhatman GF/Cガラスファイバフィルタで迅速に濾過した。フィルタ活性をCobraγカウンタ中で測定した。各実験を少なくとも２回重複して行った。
【００７７】
１．１０ 結合データ分析
個々の実験（n≧2）からの競合結合曲線を、Kaleidagraph 4.0（Synergy Software, Reading, PA）を用いた非線形回帰分析により分析した。
非特異的結合の減算と標準化との後に、[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンで得られたデータを、Hill方程式を用いて分析し、ＩＣ50値を推定した。[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンの結合阻害におけるペプチドの親和性は、ｐＫiとして表され、Cheng‐Prussoff補正（ＳＳＴ‐２についてＫｄ＝１nM）を適用することによって、ＩＣ50値から算出した。
【００７８】
１．１１ マウスにおける生体分布及びイメージング研究
体重20ｇの雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをCharles River Laboratories（L'Arbresle, France）から購入した。マウスは従来の動物施設で飼育され、食物及び飲料を自由に摂取できた。実験プロトコルは、動物実験についての地方倫理委員会によって認可されている。
【００７９】
滅菌ＰＢＳ中に新しく懸濁した、500〜600万のＡＲ４‐２Ｊ細胞をマウスに皮下移植した。接種から１３日後、触診可能な充実性腫瘍塊を示した。この時、150‐250μＣｉに相当する、約１μｇの99(m+g)ＴｃＯ‐標識化化合物をマウスの尾静脈に注入した。１時間、４時間又は２４時間後、マウスを麻酔中に放血して犠牲にした。興味ある器官、血液及び尿を回収し、重さを測った。放射活性をγカウンタで測定した。評価した化合物はＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]及びＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]であった。ブロックコントロール実験は、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体と、125倍過剰量の参照化合物ＲＣ‐１２１との同時注入により達成した。
【００８０】
１．１２ イメージング
全身断面分析：マウスの尾静脈に注射し、４時間後犠牲にした。イメージングについて、マウスを麻酔し、次いで、ＣＮＴ組織再分布を防ぐためにドライアイスとイソペンタンとの‐８０℃の混合物に浸漬した。マウンティングミディアム中で身体をブロッキングした後、スライシングミクロトーム（LEICA Microsystems, France）を用いて、組織断片（20 μm）を‐２０℃にて作製した。断片を室温にて２時間、シリカゲルの存在下に保持し、確実に完全乾燥させた。乾燥組織断片の放射活性の定量的測定及びイメージングは、β‐イメージャ（Bioscape Lab, Paris, France）を用いて行った。
【００８１】
実施例２ 結果
２．１ 99m+gＴｃ ＵＢＩ ２９‐４１の合成、放射能標識化及び特徴決定
２つの異なるプロトコルを用いて、ペプチドＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）を標識化し、その錯体を特徴決定した。99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータから溶離した、商業的に入手可能なペルテクネテート溶液を用いたＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）の直接的な標識化のために、プロトコル１は、Melendez-Alafortらにより報告されたものから適合させた（１９）。
【００８２】
プロトコル１において、即時調製した１ｍｇ／ｍｌのＳｎＣｌ2水溶液５μｌ、10μｌのＮａＯＨ 0.1 N溶液、2.4μｌの生理的食塩水中の100 nM 99(m+g)ＴｃＯ4-を、水中の１ｍｇ／ｍｌＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）水溶液15μｌに逐次的に加えた。ＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）、ＳｎＣｌ2、99(m+g)ＴｃＯ4-の最終濃度は、それぞれ270μＭ、840μＭ及び7.4μＭであった。溶液のｐＨは10.5であった。
【００８３】
反応物は、５分間室温にて放置した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣによって特徴決定した。ペプチドＵＢＩ２９‐４１（配列番号１）の標識化中に形成した錯体を特徴決定するための、本発明者らが好んだ方法はＥＳＩ‐ＭＳである。この手法に適合する酸性条件が錯体の脱配位を生じないことを確実にするために、ｐＨ2.5、5.5及び6.8の３つの溶離条件を用いた。これら３つの条件間で著しい差は見られなかった。
【００８４】
図１Ａは、ｐＨ2.5で溶離される標識化溶液の（220 nmにおける）ＵＶクロマトグラムとγ‐ラジオクロマトグラムとの重ね合わせを示す。γ‐ラジオクロマトグラムは、220 nmにて最も大きな吸収を示す主要な種よりも長い保持時間で溶離する生成物の存在を示す。しかしながら、プロトコル１で用いられる反応条件では、本発明者らは相当な量のＴｃ［ＵＢＩ 29‐41］（配列番号１）錯体を得ることができず、ＥＳＩ‐ＭＳによる生成物の特徴決定の妨げとなった。これは主に、99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータにより導出されるＴｃ濃度の限界による。
【００８５】
標識化率を増加させ、Ｔｃ標識化実験の生成物を特徴決定するために、本発明者らは第２の標識化プロトコルであるプロトコル２を設計した。即時調製した１mg/ml SnCl2水溶液2.5μl、10μlのNaOH 0.1N溶液、生理的食塩水中の100 nM 99(m+g)ＴｃＯ4- 2.4μl及び[NH499gTcO4]の5.5 mM溶液2.4μlを、水中の１mg/mlＵＢＩ 29‐41（配列番号１）水溶液15μlに逐次的に加えた。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）、SnCl2及び99Tcの最終濃度は、それぞれ270μＭ、840μＭ及び407μＭであった。反応混合物を、５分室温にて放置した。
【００８６】
プロトコル２を用いたＴｃ標識化実験の生成物の特徴決定は、ＬＣ−陽イオンＥＳＩ−ＭＳ分析により達成した。図１Ｂに説明するように、ＨＰＬＣ ＵＶ及び放射性プロフィールは、同一の保持時間にて１つの最も豊富なピークを示した。この最も豊富なピークのＬＣ‐陽イオン‐ＥＳＩ‐ＭＳ特徴決定は、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]モノアダクト（1845.6 Daのm/z）の形成によく一致した。この質量は、1733.5 Da（ＵＢＩ 29‐41）＋115 Da（ＴｃＯ3+）−3 Da（3H+）に一致し得る。これは、実験誤差の範囲内で見られた質量に合致した。更に、モノアダクトの電子吸収スペクトルは、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の吸収スペクトルでは観察されない、274 nmを中心とした大きな吸収を示した（図２）。この吸収は、配位子‐金属電荷移動（ＬＭＣＴ）のバンド（ε＝8887 mol-1.l.cm-1）に一致し得る。
【００８７】
プロトコル２を用いたＵＢＩ 29‐41（配列番号１）のＴｃＯ標識化率は、材料及び方法に記載のカリブレーション手順を用いて測定した。これは、ＵＢＩ 29‐41について表Iに報告する、ＴｃＯ標識化率の正確な測定を可能にした。プロトコル２の実験条件において、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の標識化率が７９％であったことに注意しなければならない。
【００８８】
２．２ ＴｃＯ3+キレート化を担う側鎖の同定
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）中のＴｃＯ3+キレート化部位の位置を同定するために、本発明者らは、このペプチドの１１の類似体を合成した（表Ｉ）。これら類似体の各々は、本来の残基の官能基が除去されている非天然又は天然アミノ酸でのユビキチジンのこのフラグメント中に存在する１つの側鎖の置換えに相当する。アルギニン残基はノルバリン（Nva）残基で置き換え、スレオニン、グルタミン酸及びアスパラギン残基はアミノ酪酸（Abu）残基で置き換え、リジン及びメチオニン残基はノルロイシン（Nle）残基で置き換え、チロシンはフェニルアラニンで置き換えた。アラニン及びグリシン残基は置き換えなかった。
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の１１の類似体は、以下においてＵＢＩ‐Ａ１〜ＵＢＩ‐Ａ11と称される（表Ｉ）。
【００８９】
表１：ＵＢＩ 29‐41（ＵＢＩ‐ＷＴ）の類似体の99(m+g)Ｔｃ標識化生成物の特徴決定。
【表１】
【００９０】
a標識化率は、（１−Ｒ１／Ｒ２）として算出し、Ｒ１は、プロトコル２の条件下での99(m+g)Ｔｃ標識化実験において内部基準カフェインの比に対する、反応しなかったペプチドの比に合致し、Ｒ２は、ＴｃＯ4-を除くプロトコル２の条件下での内部基準カフェインの比に対する、反応しなかったペプチドの比に合致する。ＨＰＬＣピーク積分の不確定性を考慮し、本発明者らは、算出された標識化率について１０％未満の不確定性を見積もった。
【００９１】
プロトコル２を用いてこれら類似体を標識化し、生成物をＨＰＬＣ及びＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定した。１つの類似体だけが、元のペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）と比較して、標識化率の著しい変化を示した。類似体ＵＢＩ‐Ａ１は、アミノ酪酸残基によるT1の置換に相当する。この結果は、Ｔ１のＯＨ基がＴｃＯキレート化官能基の一部であり得ることを示唆する。類似体ＵＢＩ‐Ａ２はＵＢＩ 29‐41と類似の標識化率を示したので、Ｒ２がＴｃＯのキレート化に関与しないことを示唆する。類似体ＵＢＩ‐Ａ３〜ＵＢＩ‐Ａ11は、８４〜９５％の範囲内の[ＴｃＯ]3+標識化率を示した。これら観察結果は、これら種々の類似体において抑制される化学的官能基のいずれもが、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に直接的に関与しないことを示唆する。
【００９２】
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位及び配位官能基の正確な位置を決定するために、本発明者らは、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体及び遊離ペプチドを、1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲ分光法により、ｐＨ5.8の水溶液中で分析した。遊離ペプチド及びＴｃＯ‐ペプチド錯体において、１組の共鳴だけがＮＭＲ実験で観察されたので、１つのコンホメーションだけが溶液中に存在するか、又は１つのコンホメーションが圧倒的に多いことが示唆される。
【００９３】
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]ペプチドの1Ｈ及び13Ｃの帰属を、表II及びIIIに報告する。
Ｔｃを含まないＵＢＩ 29‐41の場合に残基Ｒ7、Ｒ12及びＲ13並びにＴｃＯ‐ＵＢＩ 29‐41錯体の場合に残基Ｒ6、Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、1Ｈ及び13Ｃ共鳴の併発が原因で帰属できなかった。しかしながら、ＴＲＯＥＳＹとＴＯＣＳＹ実験とを組み合わせたＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験において、その他の残基の特徴的なパターンは、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体の場合にその他の残基全てのＮＨ、Ｈα、Ｈβ、Ｈγ、Ｈδ、Ｈε、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、Ｃδ及びＣε共鳴を明確に帰属させることを可能にした。
【００９４】
表II：ＵＢＩ 29‐41の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【００９５】
【表２】
【００９６】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、295Ｋにて測定した。Ｒ6、Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、シグナルの完全重複が原因で帰属されなかった。b1Ｈ化学シフトは、1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験における残りのＨＤＯシグナルとの共鳴の重複が原因で帰属できなかった。
【００９７】
表III：ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体（ＵＢＩ‐ＷＴ）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属。
【００９８】
【表３】
【００９９】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、295Ｋにて測定した。Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、シグナルの完全重複が原因で帰属されなかった。
【０１００】
[ＴｃＯ]3+の配位部位の位置について情報を与え得る第１の観察結果は、ＴＯＣＳＹスペクトル及びＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験における、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]の残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミドプロトンと対応の側鎖プロトンとの間の相関の不存在に関する。これは、これら３つのプロトンがＴｃＯ核の形成により失われることを示唆する。
【０１０１】
２つのサンプルの1Ｈ及び13Ｃ化学シフトの比較は、その他の興味深い特徴を明らかにした。残基Ｒ3及びＡ4のＣα共鳴は、それぞれ10.72及び4.54 ppmの重要な低磁場シフトを示した。更に、残基Ｔ1のＣβ共鳴は、9.29 ppmの低磁場シフトを示した。遊離ペプチドとその[ＴｃＯ]3+錯体との間のその他重大な化学シフトの変化を観察した。残基Ｔ1のＨα共鳴は0.48 ppmのシフトを示したが、この残基のγＣＨ３は、ＴｃＯ錯体形成により0.376 ppmの高磁場シフトを示した。
【０１０２】
更に、２つのサンプルの1Ｈ共鳴は、遊離ペプチドにおけるＮＭＲタイムスケール中のコンホメーションの平均化が原因で重複したと思われる残基Ｇ2のＨα１及びＨα２プロトンの共鳴が、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体において約0.6 ppmの化学シフトの差を生じたことを示した。これは、[ＴｃＯ]3+核での錯体形成により、ペプチドがＧ2の領域中の規定された構造に適合し、２つのＨαプロトンについて異なる磁場環境をもたらすことを示唆する。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）とその[ＴｃＯ]3+錯体との間の1Ｈ化学シフトの変化に関する１つの更なる観察結果は、残基Ｋ5のＨＮ共鳴に関する。このＨＮプロトンがＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中になお存在するとしても、0.76 ppmの大きな高磁場化学シフトの変化を示し、その磁場環境が[ＴｃＯ]3+核の錯体形成により著しく改変されていたことを示す。
【０１０３】
概して、これら観察結果は、ＵＢＩ 29‐41中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位がペプチドのＮ末端側に位置し、残基Ｔ1、Ｇ2、Ｒ3及びＡ4を含むことを示唆する。残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4は、[ＴｃＯ]3+核の錯体形成により失われるアミド基窒素により[ＴｃＯ]3+核に配位する可能性がある。
【０１０４】
２．３ ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）由来の、短く効果的な [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチドの配列。
上記の、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体のＮＭＲ分析と関連する、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びその類似体の[ＴｃＯ]3+キレート化能に関する結果により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐41のＮ末端の位置にキレート化部位を配置できた。このため、本発明者らは、最小配列ＴＧＲＡ（配列番号１４）を合成し、プロトコル２に従って、その本来の[ＴｃＯ]3+キレート化能を評価した。このペプチド配列について測定した標識化率は１１％であった（表IV）。この結果は、プロトコル２の実験条件において、ＴＧＲＡペプチドの小分画が[ＴｃＯ]3+核をキレート化するとしても、ＵＢＩ 29‐41中のＴｃＯキレート化のその他重要な決定因子が、ＴＧＲＡにおいて失われていることを示す。
【０１０５】
元のペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）と比較したこの結果により、本発明者らは、一連のペプチドを合成し、この配列中の[ＴｃＯ]3+キレート化効率の決定因子を詳細に調査した。これらペプチドの配列及びそれらの標識化率を表IVに報告する。ＥＳＩ‐ＭＳ分析により、得られた錯体が、全ての場合において、3 H+が引き抜かれた[ＴｃＯ]3+のモノアダクトに相当することが示された。
【０１０６】
表IV：ＵＢＩ 29‐41フラグメント及びその類似体の99(m+g)Ｔｃ標識化生成物の特徴決定。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
a標識化率は、（１−ｆ）として算出し、ｆは、プロトコル２を用いた99(m+g)Ｔｃ標識化実験において、ＨＰＬＣにより定量化された、反応しなかったペプチドの分画である。ＳＤ：ＨＰＬＣピーク積分の不確定性を考慮し、本発明者らは、算出した標識化率について１０％未満の不確定性を見積もった。
【０１０９】
ペプチドＴＧＲＡＫ（Ｐ２）（配列番号１５）、ＴＧＲＡＫＲ（Ｐ３）（配列番号１６）及びＴＧＲＡＫＲＲ（Ｐ４）（配列番号１７）は、元の配列ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の、最初の５、６及び７Ｎ末端残基にそれぞれ相当する。Ｐ２、Ｐ３についてプロトコル２を用いて得られた[ＴｃＯ]3+標識化率は、それぞれ40％、67％であった。上記の観察結果は、Ｋ５とＲ６との２つの残基の存在が、ＴＧＲＡ配列（配列番号１４）と比較して標識化率の大きな増加を招くので、K5‐R6対が[ＴｃＯ]3+キレート化効率に重要な役割を果たすことをはっきりと示した。対照的に、ペプチドＰ３及びＰ４について得られた結果の比較は、残基Ｒ７が[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善しないことを示した。このことは、ペプチドＰ４及びＰ３について得られた標識化率と類似していた、残基Ｒ７がノルバリンで置き換えられたペプチドＰ５について測定された[ＴｃＯ]3+標識化率によって更に確認した。上記の結果は、ペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）において、効果的な[ＴｃＯ]3+キレート化の決定因子が、本来の配列のＮ末端ヘキサペプチド中に存在することを示す。このヘキサペプチド中の各位置の具体的な役割を更に調査するために、本発明者らは、第２の一連のより短いペプチドを合成し、それらの[ＴｃＯ]3+キレート化標識化率を評価した。
【０１１０】
上記に示したように、塩基性残基Ｋ5‐Ｒ6対は、[ＴｃＯ]3+キレート化効率に役割を有する。ペプチドＰ６を合成し、アルギニン残基による５位リジンの置換の影響を評価した。表IVに示されるように、Ｐ３と比較して約20％の、[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい増加を観察した。この観察結果は、それらが塩基性の特徴を共有しているにも拘らず、リジン及びアルギニンが、プロトコル２の条件下での[ＴｃＯ]3+キレート化効率の決定に異なる影響を有し得ることを示す。更に、ペプチドＰ７（ＴＧＲＡＡＲ）について、Ｐ６（ＴＧＲＡＲＲ）と比較して約60％の[ＴｃＯ]3+標識化率の劇的な減少を観察し、このことは、配列中のアルギニンの数及び／又はこれら塩基性残基の位置が標識化率に強い影響を有することを示唆する。
【０１１１】
より短い[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチドを得るために、本発明者らは、上記で同定された[ＴｃＯ]3+キレート化決定因子を組み込んだ幾つかのペプチドを合成した。これらは、[ＴｃＯ]3+キレート化官能基、すなわちＴ1のヒドロキシ官能基と、２位、３位及び４位残基の３つのＮＨアミド基と、少なくとも１対の塩基性残基の存在とを含む。これら全ての決定因子を有する最小配列がペプチドＰ８（ＴＧＲＲ）（配列番号２１）に相当する。Ｐ８について測定された標識化率は、しかしながら、Ｐ６について観察された率のたった半分である約40％だけであった。このことは、上記で同定された決定因子が存在するにも拘らず、その他の因子がＰ６において[ＴｃＯ]3+キレート化効率の役割を果たすことを示唆する。本発明者らは、したがって、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の最初の３つのＮ末端残基と４‐５位にアルギニン対とを有するペプチドＰ９（ＴＧＲＲＲ）を合成した。Ｐ９中の残基Ｒ3の存在が、Ｐ８（ＴＧＲＲ）と比較して約25％の著しい増加をもたらした。これにより、本発明者らは、ペプチドＰ１０を合成し、Ｒ3のグアニジニウムの特定の貢献があるかどうか、又はこの残基がＰ９においてキレート化モチーフとアルギニン対との間のスペーサの役割を果たすかどうかを評価した。ペプチドＰ１０（ＴＧＧＲＲ）についての[ＴｃＯ]3+標識化率は、ペプチドＰ９と比較して約20％著しく減少し、この配列中の残基Ｒ3の特定の役割を示唆した。更に、ペプチドＰ１０（ＴＧＧＲＲ）、Ｐ１１（ＴＧＲＡＲ）及びＰ２（ＴＧＲＡＫ）について得られた類似の標識化率である約50％は、隣接した位置又は１つの残基によって分離した位置のいずれかにある塩基性残基対が、テトラペプチド配列ＴＧＲＡ（ペプチドＰ１）と比較して[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい改善をもたらしたという前記結論に一致した。
【０１１２】
Ｐ９（ＴＧＲＲＲ）中のアルギニン残基の特定の役割を確認するために、本発明者らは、ペプチドＰ１２（ＴＧＫＫＫ）を合成した。Ｐ１２について測定した非常に低い[ＴｃＯ]3+標識化率は、プロトコル２の条件下でのＰ１２中の残基３〜５の側鎖中のアンモニウム基と比較して、Ｐ９中のグアニジニウム基の特定の貢献をはっきりと証明した。
【０１１３】
今回の研究で同定したペプチド配列の応用は、ペプチド及び蛋白質の標識化に関する。このような[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列は、蛋白質のＮ又はＣ末端の位置に組み込むことができる。したがって、上記に報告した、[ＴｃＯ]3+キレート化配列への遊離Ｎ又はＣ末端の影響を評価することが重要であった。このために、本発明者らは、遊離アミノ及びカルボキシ末端基をそれぞれ有するペプチドＰ１３及びＰ１４を合成した。Ｐ１３について測定した、Ｐ９と比較して約25％の[ＴｃＯ]3+標識化率の増加は、Ｐ１３中の遊離アミノ末端がキレート化効率を著しく改善することを証明した。このペプチドは、したがって、蛋白質又はペプチドのＮ末端の位置をタグ化するのに用いられる可能性があり、プロトコル２の条件下において、 [ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みをもたらし得る。Ｎ末端アセチル基の欠失の[ＴｃＯ]3+標識化率への類似の効果が、ＵＢＩ 29‐41において観察された（表I中のＨ‐ＵＢＩ（配列番号１３）対ＵＢＩ‐ＷＴ（配列番号１））。Ｐ１３と比較すればより効率的でないにしても、ペプチドＰ１４の著しい[ＴｃＯ]3+標識化は、蛋白質又はペプチドのＣ末端の位置をタグ化するのに、ＴＧＲＲＲ配列を用いることができることを示唆する。本発明者らはまた、Ｐ９のレトロインベルソ配列（ＲＲＲＧＴ）であるペプチドＰ１５を調査した。プロトコル２の条件下においてＰ１５について得られた[ＴｃＯ]3+標識化率は、この配列をＣ末端タグとして用いて、[ＴｃＯ]3+を蛋白質又はペプチドに組み込むこともできることを示唆した。
【０１１４】
上記の結果により、短く有効な[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列を規定することができた。報告した配列のうち、ＴＧＲＲＲ配列（ペプチドＰ１３）は最も有効であり、プロトコル２の条件下において、 [ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みをもたらした。ＴＧＲＲＲ配列中の遊離Ｎ末端基の存在が、Ｎアセチル基と比較して、[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善したという観察結果（Ｐ１３対Ｐ９）により、本発明者らは、Ｐ１３中の[ＴｃＯ]3+配位官能基を同定しようとした。最終的に、ペプチドＰ１３の遊離形態及び[ＴｃＯ]3+とのその錯体のＮＭＲ研究に着手した。一式の1Ｈ‐1Ｈ ＴＯＣＳＹ、1Ｈ‐1Ｈ ＲＯＥＳＹ及び1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験により、２つの形態において殆どの1Ｈ及び13Ｃ共鳴を帰属させることができた。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の場合に観察されたように、幾つかのＮＨ共鳴は、遊離ペプチドと比較したＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]において存在しなかった。これらは残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4に相当する。
【０１１５】
表V及びVIに報告する、遊離形態及び[ＴｃＯ]3+との錯体にあるＰ１３の1Ｈ及び13Ｃ化学シフトの比較は、[ＴｃＯ]3+キレート化官能基について幾つか指摘する。
【０１１６】
表V：HＴＧＲＲＲペプチド（Ｐ１３）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、298Ｋにて測定した。bn.d.：測定せず。
【０１１９】
表VI：ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体（Ｐ１３）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
a化学シフトはＴＳＰと比較した内部基準であり、298Ｋにて測定した。
【０１２２】
幾つかの13Ｃ共鳴は、Ｐ１３の遊離形態とその[ＴｃＯ]3+錯体との間の重大な化学シフトの変化を示す。これらは、12.7、14.1及び10.50 ppmそれぞれシフトした残基Ｔ1、Ｇ2及びＲ3のＣα共鳴に関する。更に、残基Ｔ1のＣβ共鳴は8.09 ppmシフトし、残基Ｒ4のＣβ共鳴は5.56 ppmシフトする。このような大きな13Ｃ化学シフトの変化はまた、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中の３つの炭素、すなわち、Ｔ1のＣβ炭素並びにＲ3及びＡ4のＣα炭素について観察され、これらシフトは、[ＴｃＯ]3+核の配位における隣接原子の直接的関与が原因であると推測した。
【０１２３】
これら13Ｃシフトが残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のＮＨ共鳴の不存在と関連するので、本発明者らは、Ｔ1のＯＨ基のこれら３つの窒素及び酸素が、[ＴｃＯ]3+核に配位する４つの原子であると結論付けた。ペプチドＰ１３において、５つの炭素が、遊離形態とその[ＴｃＯ]3+錯体との間で著しい化学シフトの変化を示したので、状況はより複雑に見える。この観察結果は、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）において描写した状況とは対照的に、５つの原子が[ＴｃＯ]3+核の配位に関与し得ることを示唆する。
【０１２４】
これら観察結果は、Ｔ1のヒドロキシ基の酸素が四角平面内又は四角平面の頂点の位置にあるＴｃの八面体配位と両立した。或いは、今回のデータは、ペプチドの４つの原子の２組が[ＴｃＯ]3+核のキレート化に参加し得る２つの構造間の平衡と両立した。ＮＭＲスペクトルにおける1Ｈ及び13Ｃ共鳴の単一の組の観察結果は、２つの構造がＮＭＲのタイムスケールで迅速に相互変換し得ることを暗示する。
【０１２５】
上記の結果から、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）Ｎ‐末端配列に由来するペプチド配列中の[ＴｃＯ]3+核のキレート化において役割を果たす幾つかの重要な要素を同定することができた。隣接する残基のアミド基の窒素原子と共にそのＯＨ基を介してキレート化に参加する残基スレオニンの存在に加えて、少なくとも１対のアルギニン残基の存在は、ペンタペプチド配列中の標識化率を著しく改善する。
【０１２６】
ペプチド又は蛋白質を標識化するためのＴＧＲＲＲ配列のインビボ応用に役立てるために、ＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]錯体は、99mＴｃの期間の１〜３倍の間安定でなければならない。本発明者らは、ペプチドＵＢＩ‐ＷＴ（配列番号１）及びＴＧＲＲＲ（ペプチドＰ１３；配列番号２６）の場合の[ＴｃＯ]3+錯体の安定性を評価した。最終的に、本発明者らは、システイン攻撃を行った。16μｇのＴｃＯ[ＵＢＩ‐ＷＴ]を、３、53及び333のモル比にそれぞれ対応する、１、15及び100 mMのシステイン溶液にｐＨ7.4にて加えた。これらサンプルを20時間310Ｋにてインキュベートした。混合物をＨＰＬＣ及びＬＣ‐ＭＳにより分析した。
【０１２７】
ＵＢＩ‐ＷＴの場合に、元の[ＴｃＯ]3+錯体の10％だけが100 mMのシステインの存在下において、20時間後に観察された。しかしながら、69％及び95％よりも多い元の錯体が、それぞれ15 mM及び1 mMのシステインの存在下において観察された。[ＴＧＲＲＲ]ＴｃＯの場合に、57％の元の錯体が、15 mMのシステインの存在下において、20時間310Ｋにてインキュベーション後に観察された。これら観察結果は、これら錯体が、インビボ調査に用いるのに十分に安定であったことを示唆する。
【０１２８】
蛋白質を[ＴｃＯ]3+で標識化するためのＴＧＲＲＲ配列の、分子イメージングの分野における有用性を立証するために、本発明者らは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインのようなセリンプロテアーゼの天然阻害剤であるアプロチニン（ＢＰＴＩ）を選択した。それはＴｒａｓｙｌｏｌ（Bayer, Germany）の名の下、商業的に入手可能である。99mＴｃ‐アプロチニンは、直腸の形状を可視化する目的（３８）及びアミロイドフィブリルをイメージ化させる目的（２０）で既に用いられている。フィブリン溶解性及び／又は好中球由来セリンプロテアーゼ活性のターゲティングを介して、血栓を可視化するのに有用であることも近年示唆されている（３９）。
【０１２９】
イメージング剤として99mＴｃアプロチニンを用いた研究の殆どは、直接的アプローチにより標識化した。この[ＴｃＯ]3+標識化は、ジスルフィドの還元を介して起こると認められている。しかしながら、トリプシンとの錯体にあるアプロチニンの３Ｄ構造の検証により、これらジスルフィド結合の１つ（14‐38）が、ターゲティングされるセリンプロテアーゼとの相互作用において重要な役割を果たす残基リジン15に隣接した位置に存在することが証明された（21）。更に、このジスルフィド結合は、その標的の１つであるトリプシンによる加水分解に対して保護を与えることが近年示されている（22）。したがって、（１）ジスルフィドを保存し、（２）それらの部位にて[ＴｃＯ]3+キレート化を回避するプロトコルを用いてＢＰＴＩを標識化することは非常に望ましい。
【０１３０】
本発明者らは、固相化学合成によって、本来の残基Ｍ５２がノルロイシンで置き換えられ、メチオニン酸化を回避した、ＢＰＴＩの類似体（ＢＰＴＩｖ、配列番号３２）を製造した。種々のペプチドを標識化するために今回の研究で用いたプロトコル２の応用を、ＢＰＴＩｖ（配列番号３２）に適用した。これらの条件において、ＴｃＯ[ＢＰＴＩｖ]錯体は形成されなかった。ＨＰＬＣにおいて観察され、ＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定されたピークは、錯体形成していないＢＰＴＩｖに合致した（表VII）。
【０１３１】
表VII：プロトコル２を用いたＢＰＴＩｖ（配列番号３２）及びＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖ（配列番号３３）のＴｃＯ標識化率。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
ＢＰＴＩのＮ末端配列が標的から約30Å（距離Ｒ１ Ｃα‐Ｋ１５ Ｃα、ＰＤＢコード２ＰＴＣ）離れた領域中に位置するので、本発明者らは、固相化学合成によって、今回の研究で発見したＴｃＯキレート化配列ＴＧＲＲＲをＢＰＴＩｖのＮ末端の位置に付加した、ＢＰＴＩｖ（配列番号３２）の類似体を製造した。更に、ＧＧスペーサを、ＴＧＲＲＲとＢＰＴＩｖの最初の残基との間に付加し、[ＴｃＯ]3+キレート化を妨害し得るコンホメーション制約の可能性を回避した。この構造体ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖを固相化学合成により製造し、ＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定した。本発明者らは、[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２をＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖに適用した。このサンプルのＨＰＬＣ分析は１つだけのピークを示し、ＥＳＩ‐ＭＳ分析により、生成物の質量が、ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖの質量に＋112 Daのアダクトに合致することを示した（表VII）。更に、モノアダクトの電子吸収スペクトルは、錯体形成していないＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖの吸収スペクトルにおいても、ＢＰＴＩｖにおいても観察されなかった、274 nmを中心とした大きな吸収を示した。上記の示唆のように、この吸収は、配位子‐金属電荷移動（ＬＭＣＴ）に相当し得る。これらの結果は、ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩの[ＴｃＯ]3+標識化率が、プロトコル２の条件下において95％よりも大きいことを示す。
【０１３４】
２．４ ソマトスタチン類似体ＲＣ‐１２１の99mＴｃ標識化へのＴＧＲＲＲペプチドの適用。
ターゲティング分子を標識化するHＴＧＲＲＲペプチド配列の能力及び診断イメージングへのその使用を更に証明するために、本発明者らは、ソマトスタチン受容体ＳＳＴ‐２及びＳＳＴ‐５の非常に強力なリガンドであるＲＣ‐１２１（42）を用いた研究に着手した。ＳＳＴ‐２は、多数のヒト腫瘍において発現するので重要である（43）。ここ数十年間で、放射線治療及び核イメージング用途のための、これら受容体の人工の高親和性リガンドを得るために、相当量の研究がなされてきた。ＲＣ‐１２１は、腫瘍学における原型のソマトスタチン類似体の環状オクタペプチド類似体、オクトレオチドである（42）。ＲＣ‐１２１は、残基Ｃ2とＣ7との間のジスルフィドを介して環化された配列DＦＣＹDＷＫＶＣＴNH2（配列番号４０）に合致する（図３ａ）。
【０１３５】
本発明者らは、HＴＧＲＲＲＧＧ配列（配列番号２６）をＮ末端の位置に付加することによってＲＣ‐１２１を改変し、ＧＧジペプチドをスペーサとして導入した（図３ｂ）。ＵＢＩ 29‐41由来の短いペプチドを研究する、上記と同一のＴｃＯ標識化条件を用いて、本発明者らは、ＬＣ‐ＭＳにより評価されたジスルフィドブリッジを保存しつつ、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）中へのＴｃＯ核の定量的な組込みを実現した（表VIII）。
【０１３６】
表VIII：ＲＣ‐１２１、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１及びそのＴｃＯ錯体のＡＲ２‐２Ｊ細胞及びソマトスタチン受容体への結合。
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
コントロール実験はまた、タグ化されていないＲＣ‐１２１が、これら標識化条件においてＴｃＯ錯体を形成できないことを示した。15 mMシステインの存在下において測定した、この錯体の安定性は、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体について観察されたものと類似していた。約70％及び60％の錯体が、４時間及び24時間310Kにてインキュベーション後もなお存在していた。
【０１３９】
ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体のソマトスタチン受容体との結合を、次いで特徴決定した。これらの実験は、ＲＣ‐１２１中のHＴＧＲＲＲＧＧ配列の挿入が、ＳＳＴ‐２受容体へのその結合能力を減少させないことを示した（表IX）。
【０１４０】
表IX：HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１及びＴｃＯとのその錯体のＬＣ‐ＭＳ分析。
【０１４１】
【表９】
【０１４２】
ＳＳＴ‐２についてのＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]のＫd（Ｋd／ＳＳＴ‐２：20 pM）は、ＲＣ‐１２１について測定したものより約５倍低かった。更に、本発明者らは、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]が、ＳＳＴ‐５についての約100からＳＳＴ‐４についての約5000までの範囲にある係数でＳＳＴ‐２受容体の選択的リガンドであることを示した（表IX）。
【０１４３】
ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体を、マウス異種移植腫瘍モデルにおけるイメージング剤として評価した。このモデルについて、本発明者らは、ＳＳＴ‐２ソマトスタチン受容体を発現することが知られているＡＲ４‐２Ｊ腫瘍細胞株を選択した。ＡＲ４‐２Ｊ細胞についてＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]のＫdは60 pMであった（表X）。
【０１４４】
ＡＲ４‐２Ｊ異種移植マウスの第１のグループに、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]を注入した。２つのコントロール実験も行った。ＡＲ４‐２Ｊ保有ヌードマウス（グループ２）に、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]及び標識化されていないＲＣ‐１２１化合物の125倍過剰量を注入した。ＡＲ４‐２Ｊ保有ヌードマウスの第３のグループに、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体をコントロール実験として注入した（グループ３）。注入４時間後に測定した、３つのグループにおける99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]の生体分布を表Xに示す。
【０１４５】
表X：注入４時間後のＡＲ４‐２Ｊ異種移植ヌードマウスにおける99mＴｃＯ標識化化合物の生体分布。測定した放射活性を、％ＩＤ／ｇ（組織のグラムで除した注入量のパーセント）で表す。各グループはマウス６体に相当する。
【０１４６】
【表１０】
【０１４７】
グループ１の場合に、殆どの器官について測定した％ＩＤ／ｇは、約１％ＩＤ／ｇ又はそれよりも低かった。予想通り、尿、腎臓及び肝臓は、最も大きな放射活性取込みに相当した。しかしながら、これらの区画とは別に、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ‐ＲＣ‐１２１]の最も大きな取込みは、腫瘍において観察された（％ＩＤ／ｇ＝5.3 ± 1.3）。125倍過剰量のＲＣ‐１２１の存在下において、最も大きな放射活性取込みは、尿及び腎臓においても観察され、より低い程度では副腎及び肝臓においても観察された。しかしながら、グループ２のマウスにおいて、腫瘍について測定した％ＩＤ／ｇは、グループ１において測定したもの（％ＩＤ／ｇ＝0.7 ± 0.2）よりも著しく低かった。
【０１４８】
これら観察結果は、125倍過剰量のＲＣ‐１２１、ナノモルのＳＳＴ‐２リガンドの存在が、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]腫瘍取込みを著しく減少させることを示す。ＡＲ４‐２Ｊ保有マウスにおけるＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]ペプチド錯体の生体分布に相当するコントロール実験（グループ３）は、腫瘍における著しい放射活性取込みを示さなかった。ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体のＡＲ４‐２Ｊ異種移植腫瘍をイメージ化させる能力は、それぞれ26.5及び53である腫瘍／筋肉比及び腫瘍／血液比によって特徴決定できる。グループ１と比較して著しくより低い腫瘍／筋肉比及び腫瘍／血液比が、グループ２（それぞれ７及び７）及び３（それぞれ2.6及び１）において観察された。全体的に、これらの結果は、ＡＲ４‐２ｊ腫瘍におけるＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]化合物の特異的で高い腫瘍取込みを示した。
【０１４９】
診断イメージングのための99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の能力を証明するために、本発明者らは、グループ１のマウスの全身断面を分析した（図４Ａ、Ｂ）。図４Ａ、Ｂは、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の生体分布から得られた結果に従って、最も大きな放射活性取込みが、腎臓及び肝臓のレベルに位置していることを示す。分析した断面の写真により、腫瘍の明確な位置決定が可能となり、この断面のβイメージングは、この領域中で標識化化合物の大きな取込みを示した。この断面と、グループ２（図４Ｃ、Ｄ）に属するマウスの断面との比較により、125倍過剰量のＲＣ‐１２１の存在下において放射活性取込みがないことを確認した。これらの結果は、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]化合物のＳＳＴ‐２発現腫瘍のイメージングの能力を証明し、HＴＧＲＲＲペプチドが、インビボ診断応用のために、実質的に全てのターゲティングペプチド及び蛋白質をテクネチウムで標識化する魅力的な方法を提供することを示唆する。
【０１５０】
３．結論
本発明者らの研究の最初の部分は、ＵＢＩ 29‐41と称される蛋白質ユビキチジンのトリデカマーフラグメントの[ＴｃＯ]3+キレート化部位の分析に関した。
【０１５１】
[ＴｃＯ]3+標識化ペプチドの分画を決定し、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に関与する残基及び化学的官能基を同定するための今回の研究では、本発明者らは、99Ｔｃ源として5.5 mMのＮＨ4ＴｃＯ4水溶液を用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコルを設計した。このことにより、100μＭの範囲内のペプチド濃度と比較して、わずかに過剰量のＴｃＯ4‐（1.5等価）で研究が可能となった。ＵＢＩ 29‐41及びその類似体について得られた標識化率は、ペプチドの約30％〜95％の範囲にあり、それらは、したがって、10％未満と推定される適度な正確性をもって定量化された。更に、この標識化プロトコルによって、十分な量の標識化ペプチドを生産し、幾つかの[ＴｃＯ]3+ペプチド錯体のＮＭＲ分析を行うことができた。
【０１５２】
標識化の効率に関して、本発明者らが開発した、ＵＢＩ 29‐41の種々の類似体についての結果は、アミノ酪酸による残基Ｔ1の置換え及び[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい減少が、[ＴｃＯ]3+核の配位にＴ1のヒドロキシ基が直接的に関係することを強く示唆した。その他の類似体はこのような劇的な減少を示さず、それらの標識化率は78〜93％の範囲であった。これは、ＵＢＩ 29‐41中の残基Ｒ3〜Ｒ13の化学官能基が、[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に参加しないようであると強く示唆する。この解釈は、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]のＮＭＲ分析の結果により確認した。
【０１５３】
この研究では、遊離状態にて観察された、残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド基プロトン共鳴が錯体中に存在しないという観察結果は、それらのアミド基が[ＴｃＯ]3+核の配位に関与することを示唆した。更に、残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のＣα及び残基Ｔ1のＣβの遊離ペプチド（10 ppmの範囲）と比較した、大きな13Ｃ低磁場化学シフトの変化により、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+核がＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中の残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド基窒素及びＴ1のヒドロキシ基酸素によって配位するという提案ができた。ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]中のＧ2のＨα１／Ｈα２共鳴の非等価性のようなその他のＮＭＲの証拠により、この解釈を立証した。錯体形成による残基Ｔ1及びＲ3のＨα共鳴の低磁場1Ｈ化学シフトの変化もＵＢＩ 29‐41において観察した。
【０１５４】
ＮＭＲにより研究された、錯体にあるペプチドＵＢＩ 29‐41がＮ‐アセチル化されていたことに注意しなければならない（ＵＢＩ‐ＷＴ、表I）。ＵＢＩ 29‐41の非アセチル化型（Ｈ‐ＵＢＩ）は、Ｎ‐アセチル化型と比較して、意外にも[ＴｃＯ3+]標識化率の著しい増加を示した。これは、Ｎ‐末端基がＨ‐ＵＢＩ中のＴｃＯ核のキレート化に直接的な役割を果たし得ることを示唆する。
【０１５５】
今回の研究により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐14中の、ペプチドのＮ末端部分（残基１−４）への[ＴｃＯ3+]配位部位を同定し、配位原子がＴ1のヒドロキシ基の酸素並びに残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド官能基の窒素であると同定できた。
【０１５６】
[ＴｃＯ]3+キレート化部位が、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の残基１〜４に相当するＮ末端部分に位置するという発見により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐41由来の最小[ＴｃＯ]3+キレート化配列を探索した。研究のこの部分の目的は２面であった：（１）ＵＢＩ 29‐41中の[ＴｃＯ]3+キレート化の決定因子を詳細に分析すること、及び（２）生体活性ペプチド又は蛋白質のＮ末端又はＣ末端側に組み込むことのできる、より短く有効な [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列を規定し、イメージング剤を設計すること。
【０１５７】
ＵＢＩ 29‐41のＮ末端テトラペプチド配列による[ＴｃＯ]3+のキレート化に関して得られた結果は、配位官能基以外の因子が[ＴｃＯ]3+標識化率の決定において役割を果たすことをはっきりと示した。これにより、本発明者らは、Ｎ末端の位置にスレオニンを有するテトラ、ペンタ及びヘキサペプチドのシリーズを合成した。ペンタペプチドＰ１３のＮＭＲ研究により、Ｎ末端スレオニンが[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に関与することが証明された。本発明者らは、したがって、本研究で合成された全てのペプチドが、Ｔ1のヒドロキシ基の酸素が常に存在するＮ末端配列を介して[ＴｃＯ]3+核をキレート化すると考える。この酸素は、これらペプチド中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位の位置を決定する、一種の推進力を構成し得る。ペプチドＰ１３の[ＴｃＯ]3+錯体について記録したＮＭＲデータが、ペプチドＰ９において同定した配位官能基に加えて、Ｎ末端基が[ＴｃＯ]3+核の配位に加担し得ることを強く示唆することに注意しなければならない。これは、ペプチドＰ１３の配列のＮ‐アセチル化型Ｐ９と比較して著しく増加する、ペプチドＰ１３について観察された[ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みを説明し得る。
【０１５８】
本発明者らは、Ｎ３Ｏキレート化配列に隣接する残基の存在が、プロトコル２において、ペプチドの[ＴｃＯ]3+標識化率に強い影響を有することを指摘した。特に、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+キレート化部位に隣接するアルギニン残基の役割を同定した。キレート化部位の近傍に位置するアルギニンの対が、プロトコル２の条件において、[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善することを証明した。アルギニン残基が、それらのグアニジニウム基を介して[ＴｃＯ]3+キレート化効率に役割を果たすことが示唆される。この関係において、ＴｃＯ4‐アニオンは、還元前に、キレート化部位の近傍に位置するアルギニンのグアニジニウム基と相互作用し得る。この解釈は、Ｐ１２と比較して（約60％）劇的に増加するペプチドＰ９の[ＴｃＯ]3+標識化率の比較と一貫し（表IV）、アルギニン残基が、それらのカチオン性の特徴を超えて特定の貢献を有し得ることを示唆する。今回のデータによって、ＴＧＲＲＲペプチドのセグメントＲ３〜Ｒ５が、[ＴｃＯ]3+標識化率を劇的に改善する正確なメカニズムを明確に説明できない。しかしながら、本発明者らは、アルギニンが、配位子交換アプローチにおいて用いられるコリガンドに類似の様式でＴｃＯ4‐を安定化する可能性を提唱することはできる。この提唱は、[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２が、ペルテクネテートオキシアニオンの同時還元及び得られた[ＴｃＯ]3+核の配位を暗示するという事実に一貫する。
【０１５９】
今回の研究で発見した最も有効なペンタペプチドは、ペンタペプチドであるペプチドＰ１３（ＴＧＲＲＲ；配列番号２６）である。ＴＧＲＲＲ配列（配列番号２６）での蛋白質の[ＴｃＯ]3+標識化の概念の証明として、本発明者らは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインのようなセリンプロテアーゼの天然阻害剤であるアプロチニンを考慮した。今回の研究において用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２のＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖへの適用は、[ＴｃＯ]3+核の定量的な組込みを示すが、同様な条件下でＢＰＴＩｖを用いると、[ＴｃＯ]3+標識化は観察されなかった。更に、これら実験は、本研究において用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコルが、３Ｄ構造の保存及び結果として蛋白質の結合能力に必須であるジスルフィドブリッジに影響しないことを証明した。この適用は、分子イメージングの分野において、興味ある蛋白質を標識化するためのプロトコル２と組み合わせたＴＧＲＲＲタグの価値を証明する。
【０１６０】
今回の報告に記載された配列に関して非常に魅力的な点は、それらが天然アミノ酸から構成されることである。したがって、それらの使用は、固相ペプチド合成により製造される蛋白質に限定されないが、組換え技術を介して大きいサイズの蛋白質に容易に組み込まれ得る。このようなペプチド配列は、ターゲティング分子のＮ末端又はＣ末端配列に、この領域がその受容体との相互作用に関与しないならば付加できる。
【０１６１】
本発明者らが知る限りにおいて、これは、記載された最初の有効なＮ３Ｏ [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列である。更に、Ｎ‐アセチル化型及びＮ末端遊離型配列を用いて、本発明者らのプロトコル２の条件下に得られた標識化率は、ＴＧＲＲＲタグの両方の型を用いて、ペプチド及び蛋白質を効率的に標識化できることを示す。更に、ＴＧＲＲＲ配列（Ｐ９）（配列番号２２）と類似の[ＴｃＯ]3+標識化率を示す逆配列ＡｃＲＲＲＧＴ（Ｐ１５）（配列番号３９）を用いて、ペプチド及び蛋白質のＣ末端側を標識化できる。このアプローチのセリンプロテアーゼ阻害剤ＢＰＴＩへの適用は、蛋白質のＮ末端の位置に付加したＴＧＲＲＲタグが、[ＴｃＯ]3+核の定量的な組込みをもたらすことを証明した。これらの結果は、固相化学合成及び組換え技術により生産される蛋白質の99mＴｃイメージング剤としての使用に関して、相当な展望を開く。
【０１６２】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、このペプチドタグを含む興味ある蛋白質に放射性核種を結合させるのに用いることができ、このようなタグ化蛋白質をイメージ化させるペプチドタグに関する。特に、本発明は、Ｔｃ又はＲｅ原子をキレート化するが、システイン残基を含まないペプチドタグ並びに該タグを組み込んだベクター及び存在する蛋白質に前記タグを結合させる化学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有効なイメージング剤を生産するための、抗体、蛋白質又はペプチドの放射能標識化は、適切な化合物の欠如により現在妨げられている、分子イメージングの分野において依然非常に重要な目標である。
【０００３】
抗原又は受容体を標的化する天然分子の本来の能力は、それら本来の親和性及び特異性のために、非常に特異的なイメージング用又は治療用分子を生み出すことができる。イメージング剤は、基本的に、このようなペプチド又は蛋白質から標識された分子をイメージングシステムで検出可能にする特性を有する元素での標識化により得ることができる。
【０００４】
開発された様々な方法のうち、99mＴｃでの放射能標識化は、非常に魅力的なアプローチとして長らく認識されてきた。99mＴｃは、テクネチウム‐９９の準安定核同位体であり、これはインビボ診断イメージングにほぼ理想的な特性を有する。それは半減期（約６ｈ）を有し、これはイメージング剤の製造を可能にしたり、診断研究を行ったりするには十分に長いが、患者を重大な照射量に曝露せずにミリキュリー量の投与を許容するには十分短い。
【０００５】
140 Kevの単色光子及びその８９％の同位体存在度は、γカメラ又はＳＰＥＣＴシステムを用いたイメージングの研究に理想的である。更に、99mＴｃは、元の放射性核種99Ｍｏと99mＴｃ放射性核種との間の一過的な平衡を利用して、99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータから容易に得ることができる。99Ｍｏと99mＴｃとの分離は、生理的食塩水溶液を用いたジェネレータからのペルテクネテートＴｃＯ4-の溶離によって容易に達成される。
【０００６】
Ｔｃ核は、次いで溶離したペルテクネテートの還元によって製造できる。Ｔｃの幾つかの酸化状態を生じることがあり、それを用いることができる。最も研究された核の１つは二原子Ｔｃ(V)核[ＴｃＯ]3+に一致し、より最近になって、ペプチド及び蛋白質を標識化するＴｃ(I)トリスカルボニル[Ｔｃ(ＣＯ)3]+の生産及び使用について多数の研究が報告された。
【０００７】
レニウムは、同様に有利な特性を有し、このことは、レニウムを、放射能標識化及びインビボ／インビトロイメージング及び治療用途に適する元素たらしめる。更に、Ｒｅ及びＴｃは非常に似た化学的性質を有し、Ｒｅが生産するのにより安価であり、その幾つかの同位体がＴｃよりも長い半減期を有するので、これはＲｅを幾つかの用途についてより良い放射性核種とし得る。
【０００８】
幾つかのストラテジーは、テクニチウム又はレニウムを用いて、ペプチド及び蛋白質を放射能標識化することを既に提案している：
‐第１の方法は、いわゆる直接的方法に相当し、これは興味ある分子中に存在するジスルフィドブリッジの還元及び生じたスルフヒドリル（sulfudryl）基へのＴｃ核のキレート化を含む（１）。この第１の方法は単純で行うのが容易に見えるが、幾つかの制限を有する（２）。第１は、蛋白質の構造へのキレート化の影響、したがって標的受容体への蛋白質の結合能力に対するキレート化の影響に関する。通常、ジスルフィドブリッジは蛋白質の正確なフォールディング／構造の形成及び維持に重要な役割を果たす。ジスルフィドブリッジを崩壊させることによって、得られた標識化蛋白質は、その標的への親和性を欠落し得る。更に、キレート化したＴｃ核は、興味ある蛋白質の結合領域と相互作用するか、又は該結合領域に位置し、その生物学的活性の部分的又は全体的な喪失をもたらし得る。
【０００９】
‐第２の間接的方法により、二官能性キレート化剤（ＢＦＣＡ）を用いて、Ｔｃ核で蛋白質及びペプチドを標識化することが提案されてきた。この方法は、リジン残基が最も頻繁に関与する化学選択的反応による、強力なＴｃ核配位子の蛋白質表面への化学的グラフト形成に基づいている。最も広く用いられる配位子の１つは、ＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）基である（３，４）。このような強力な配位子の存在が標識化率及び結果として形成されたＴｃ錯体の安定性を増加させるが、この方法の主な欠点は、蛋白質表面のＢＦＣＡの位置を制御できないことであり、よってこのことは、不均一な標識化分子の蓄積をもたらし得る。不均一な標識化分子のサブセットは、結合能力が低下されている可能性を有し、少なくとも定量的及び再現的研究を困難にさせ得る。
【００１０】
‐第３のアプローチは、前形成キレート（preformed chelate）と呼ばれ、抗体を標識化することを提案してきた（５，６）。しかしながら、このアプローチは、存在する任意のリジン残基と反応する前形成Ｔｃ‐キレート錯体の位置に対する制御不能性に関して、直接及び間接的方法と同様の制限に縛られる。
【００１１】
ペプチドタグ配列を用いたＴｃ又はＲｅでの蛋白質の部位特異的標識化は、上記の方法の代案として提唱されてきた。このアプローチは、興味ある蛋白質のＮ‐末端又はＣ‐末端の位置に、Ｔｃ／Ｒｅ核をキレート化できるペプチド配列を付加することからなる。幾つかのペプチド配列は、[ＴｃＯ]3+配位子として記載されている（７）。これらペプチドは、四配位座配位子と四角錐状のオキソ‐テクネチウム錯体を形成する。報告された天然アミノ酸含有ペプチドの大半は、そのチオレート基を介してキレート化に加わるシステイン残基を有する。
【００１２】
このタイプのペプチドタグの例は、Ｎ３Ｓキレート化モチーフを有するＧｌｙ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号２８）及びＬｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号２９）配列並びにＮ２Ｓ２モチーフを有するＣｙｓ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ（配列番号３０）である（８，９）。しかしながら、不対システインの存在が蛋白質のフォールディングプロセスを妨害することによって、改変蛋白質の生産収率を減少させるか、又はその最終的なコンホメーションを変更させ得ることは当該技術において公知である。不対システインはまた、貯蔵中にターゲティング分子の変更をもたらし得る。
【００１３】
蛋白質を生成するアミノ酸を含むがシステイン残基を含まない[ＴｃＯ]3+キレート化‐ペプチド配列は、したがって、優良な候補分子であるように見えるであろう。しかしながら、このようなペプチド配列は極端に珍しく、当該技術において、グリシン及びアラニン残基を含むペプチド配列だけが、Ｎ４モチーフ内の[ＴｃＯ]3+核をキレート化できることが示されている（１０，１１）。これらペプチドは、[ＴｃＯ]3+のsyn及びanti異性体の相互変換を示し、インビボ試験より前のこれら錯体についての安定性のデータは報告されていない。解離した[ＴｃＯ]3+錯体がバックグラウンドのより大きな非特異的シグナルを生じ、より低いSN比をもたらすので、安定性は放射能標識化試薬に必須の特性である。
更に、[ＡＧＧＧ]ＴｃＯ錯体（配列番号３１）が３０当量のシステインに対して完全に不安定であることが近年証明された（１２）。
【００１４】
近年、ジペプチド配列がＴｃＯ／ＲｅＯキレート化配列として提案されている（１３）。これらジペプチドは、それらがＴｃ／Ｒｅをキレート化する官能基を３つしか含まないという大きな欠点を有し、このことが錯体の安定性に対して影響し、インビボ応用のためのそれらの有用性が低下することが予測される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ペプチド化学又は分子生物学のいずれかによって蛋白質に組み込まれ得る、新規で有効な[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列の同定は、したがって、依然としてイメージング剤の開発のための重要な課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明の第１の観点によれば：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり；特にＸ1はスレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択され、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型
からなる群より選択されるペプチドタグの、Ｔｃ又はＲｅ放射性核種で興味ある蛋白質を放射能標識化するための使用が提供される。
【００１７】
本発明において、キレート化は、本発明により標識化されるペプチド又は蛋白質である二配位座又は多配位座配位子へのＴｃ／Ｒｅ核の結合を意味する。
【００１８】
本発明者らは、ペプチドＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）の[ＴｃＯ]3+標識化を詳細に調査した。このペプチドは、マウスのマクロファージから最初に単離された蛋白質ユビキチジンの２９〜４１位残基に対応するトリデカマーである（１４）。ＵＢＩ ２９‐４１は、５つのアルギニン残基及び１つのリジンを有する配列ＴＧＲＡＫＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号１）のカチオン性抗菌ペプチドである。
【００１９】
システイン残基の不在にも拘らず、ＵＢＩ ２９‐４１は、以前に直接的アプローチによって、イメージング剤としてのその使用を可能にする比放射能並びにインビトロ及びインビボでの安定性で標識化された（１５‐１７）。しかしながら、ＵＢＩ ２９‐４１中の[ＴｃＯ]3+核キレート化部位の明確な同定を可能にする実験データは、どの標識化研究からも報告されなかった。しかしながら、実験データがなくとも、半経験則的な予測に基づいて、ＵＢＩ ２９‐４１中のアルギニン７又はリジン５の側鎖残基を介して、ＴｃＯ核をキレート化できることが提唱されてきた（１８）。
【００２０】
本発明者らの発見は、[ＴｃＯ]3+核にリジン５及びアルギニン７側鎖の化学官能基を介して配位したというＦｅｒｒｏ‐Ｆｌｏｒｅｓらの提唱（１８）に対する反証を挙げる。この関係において、本発明者らは、残基Ｋ５のノルロイシン残基による置換え（ＵＢＩ‐Ａ３類似体、表I）及びＲ７のノルバリン残基による置換え（ＵＢＩ‐Ａ５類似体、表I）が、標識化率の如何なる減少ももたらさないことを示し、これらの残基が[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に関与しないことをはっきりと示している。
【００２１】
その代わりに、本発明者らは、ＵＢＩ ２９‐４１中の配列Ｔ1Ｇ2Ｒ3Ａ4に対応する最初の４残基Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4がキレート化に最も大きな影響を与えることを示した。特に、本発明者らは、天然のスレオニン残基（Ｘ1）の側鎖中に存在するＯＨ基が、放射性核種のキレート化において非常に重要な役割を果たすことを見出した。これらの発見を基礎に、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に用いることができ、ＵＢＩ ２９‐４１よりも小さいサイズであり、[ＴｃＯ]3+核に対する同等又はより優れた標識化率を有するペプチドタグ及び／又はＵＢＩ ２９‐４１と同等のサイズであるが[ＴｃＯ]3+核に対する著しく優れた標識化率を有するペプチドタグの組を開発した。
【００２２】
ペプチドタグは、興味ある蛋白質のＣ又はＮ末端への該タグの組込みを容易にするように、それぞれそのＮ又はＣ末端にリンカーを更に含んでいてもよい。蛋白質配列のＣ又はＮ末端への付加が、蛋白質の予測されず望ましくないコンホメーション及び／又は機能的変化をもたらし得ることは、当該技術において公知である。このような問題を多少なりとも解決するために、ペプチドリンカーを用いて、Ｃ又はＮ末端に位置する蛋白質の本来の機能的ドメインを新規な機能的ドメインに結合させることができる。このようなペプチドリンカーは、通常、天然又は新規のいずれかの機能的ドメインに影響を与えることが予測されない一連の幾つかのアミノ酸残基を含む。例としては、一連の６ヒスチジン残基又は２グリシン残基が含まれるが、種々の長さ及びアミノ酸組成のその他多くのリンカーが当該技術において公知である。
【００２３】
更に、ペプチドタグは、ＵＢＩ ２９‐４１の残基５〜１３に対応する更なるＵＢＩ ２９‐４１の一部を含んでいてもよく、この中の少なくとも１つの残基が、天然残基の側鎖を欠落する非天然又は天然アミノ酸残基で置き換えられるときに、ペプチドタグの放射性核種標識化を増大させることが本発明者らにより示されている。
【００２４】
これら放射能標識化蛋白質は、インビトロ及びインビボイメージング並びに放射線療法のような多様な目的のために用いられてもよい。
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ2はグリシンを含む。
【００２５】
特に、ペプチドタグは以下から選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００２６】
本発明者らはまた、ＣＯ‐ＮＨペプチド結合の代わりにＮＨ‐ＣＯ結合を含むペプチドである、本発明者らが開発したペプチドタグのレトロインベルソ型が類似の特性を有することを示した。更に、レトロインベルソペプチドは、Ｌ‐ペプチドよりも大いに蛋白質分解に耐性であり、それゆえインビトロ及びインビボイメージング試薬のためのより優良な候補分子である。このようなレトロインベルソペプチドは、標識化される蛋白質の末端に組み込むことができる。
【００２７】
特に、タグは、Ｎ末端残基上に遊離Ｎ末端を含む。
本発明者らは、遊離アミン基と共に、遊離Ｎ末端を有するペプチドタグが、遊離Ｎ末端を欠落するものよりも高いレベルの[ＴｃＯ]3+核キレート化を示すことを示した。
特に、ペプチドタグは、Ｃ末端残基上に遊離カルボキシレートを含む。
特に、Ｔｃ放射性核種は99mＴｃである。
特に、Ｒｅ放射性核種は186Ｒｅ又は188Ｒｅである。
【００２８】
本発明のこの観点によれば：
１）ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり；特に、Ｘ1は、スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型
からなる群より選択されるペプチドタグを、前記興味ある蛋白質に組み込む工程と、
２）工程１）で得られた生成物でＴｃ又はＲｅ放射性核種をキレート化する工程と
を含む興味ある蛋白質を放射能標識化する方法もまた提供される。
【００２９】
更に、本発明のこの第１の観点はまた、本発明のこの第１の観点に記載の１つ又はそれより多いペプチドタグをコードする、単離又は精製されたヌクレオチド分子に関する。
【００３０】
本発明の第２の観点によれば、本発明の第１の観点に記載のペプチドタグのコード配列と、前記ペプチドタグにインフレームで蛋白質コード配列が導入され、融合蛋白質を形成するように配置されたクローニングサイトと、標的細胞又は無細胞発現系において前記融合蛋白質を発現させるのに必要な転写因子とを含むことを特徴とするベクターが提供される。
【００３１】
ベクターは、他には発現ベクター又は発現構築物として知られ、一般に、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために用いられるプラスミドである。一旦ベクターが細胞内に入れば、遺伝子によりコードされる蛋白質は、細胞の転写及び翻訳機構により生産される。プラスミドは、エンハンサ及びプロモータ領域として作用する調節配列を含み、ベクターが有する遺伝子の効率的な転写をもたらすようにしばしば工学的に操作される。巧みに設計されたベクターの目標は、順次遺伝子産物に翻訳される安定的なメッセンジャーＲＮＡの大量生産である。
【００３２】
遺伝子産物の発現後、蛋白質の精製を要する場合があり、遺伝子産物を宿主細胞の蛋白質から精製できる。精製プロセスを簡素化するために、クローニングされた遺伝子は、連続ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ（multiple histidine(His) tag）又は任意のその他の適切な小さく検出可能なペプチド配列のようなタグを有していてもよい。
【００３３】
興味ある蛋白質のクローニングされたコード配列を、選択されたペプチドタグにインフレームであるように配置することは、標準的な分子生物学的手法に従って、特にJoseph Sambrook及びDavid Russellによる「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第３版）（ISBN 978-087969576-7）に従って行われ得る。
【００３４】
特に、本発明のこの観点によれば、ベクターは、少なくとも１つの真核及び／又は原核細胞において、ペプチドタグを含む蛋白質の発現を駆動できる。
或いは、本発明のこの観点によれば、ベクターは、少なくとも１つの細胞非含有発現系において、ペプチドタグを含む蛋白質の発現を駆動でき得る。
【００３５】
本発明の第３の観点によれば、ペプチドタグが液相ペプチド合成（４１）又は固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）（４０）により合成される本発明の第１の観点に記載のペプチドタグを合成する方法が提供される。
【００３６】
ペプチドは、１つのアミノ酸のカルボキシ基又はＣ末端を、別のアミノ酸のアミノ基又はＮ末端に結合させることにより合成される。意図しない反応の可能性が明瞭であるとき、保護基が通常必要となる。一般に、ペプチド合成方法は、液相又は固相で行われる。
【００３７】
ＳＰＰＳにおいて、不溶性であるが多孔性の小さな固体ビーズは、ペプチド鎖をその上に構築できる機能性ユニット（「リンカー」）で処理される。ペプチドは、切断試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合的に付着し続ける。ペプチドは、したがって、固相表面で「固定化され」、濾過プロセス中保持できるが、液相の合成試薬は洗い流される。
【００３８】
この方法は、カップリング‐脱保護の反復サイクルに基づいている。固相に付着したペプチドの遊離Ｎ末端アミンは、Ｎ末端が保護されたアミノ酸の単一ユニットに結合される。このユニットは次いで脱保護され、更なるアミノ酸が付着し得る新規なＮ末端アミンが露われる。
【００３９】
これらペプチド合成方法について多くの変化形が当該技術において存在し、これらは本発明の範囲内である。
本発明において、ペプチドタグとペプチドタグを含む蛋白質との両方を、更なる使用のために合成できる。
【００４０】
本発明の第４の観点によれば、前記蛋白質が液相又は固相合成により合成される本発明の第１の観点によるペプチドタグを含む蛋白質を合成する方法が提供される。
【００４１】
本発明の第５の観点によれば：
ａ）前記標的蛋白質の精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｂ）前記ペプチドタグの精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｃ）工程ａ）及び工程ｂ）の生成物をインキュベートし、ペプチドタグ‐標的蛋白質複合体を精製する工程と
を含む、本発明の第１の観点によるペプチドタグを標的蛋白質に化学的に結合させる方法が提供される。
【００４２】
液相ペプチド合成に類似の手法を用いて、ペプチドタグを興味ある蛋白質にインビトロで、ライゲーション又は架橋手法を用いることにより付着できる。当該技術においてはその他の結合手法が存在し、本発明の範囲内である。
【００４３】
本発明の第６の観点によれば：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号４２）と、
ここで、
‐Ｘaは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＫＶＡＫＱＥＫＫＫＫＫ（配列番号４３）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型と
からなる群より選択される単離又は精製されたペプチドタグが提供される。
【００４４】
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ1はスレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
特に、Ｘ2はグリシンである。
【００４５】
特に、ペプチドタグは以下から選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００４６】
本発明の第７の観点によれば、前記ペプチドタグが：
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号４２）と、
ここで、
‐Ｘaは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＫＶＡＫＱＥＫＫＫＫＫ（配列番号４３）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）以外のペプチド配列からなり、前記ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型と
からなる群より選択される、単離又は精製された、Ｔｃ核をキレート化するペプチドタグが提供される。
【００４７】
本発明者らは、本発明者らが開発したペプチドタグは、Ｔｃ核を安定的にキレート化できることを示した。
特に、キレート化したＴｃ核は、(ＴｃＯ)3+又は[Ｔｃ(ＣＯ)3]+、好ましくは(ＴｃＯ)3+である。
【００４８】
特に、Ｘ5はノルロイシンを含む。
特に、Ｘ1はスレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される。
特に、Ｘ2はグリシンである。
【００４９】
特に、ペプチドタグは以下からなる群より選択される：
(配列番号１４)；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）。
【００５０】
本発明の第８の観点によれば：
ａ）興味ある蛋白質を含む水溶液に
（i）塩基性ｐＨ条件下の還元剤の水溶液と、
（ii）テクネチウム酸（VII）の塩（ペルテクネテート塩）の水溶液と
を逐次的に加える工程と：
ｂ）１〜１０分間室温における、工程ａ）からの溶液をインキュベートする工程と
を含む、本発明のここまでの観点によるペプチドタグを含む興味ある蛋白質をＴｃ核で標識化する方法が提供される。
好ましくは、還元剤の水溶液は、ＳｎＣｌ2である。
好ましくは、前記ペルテクネテート塩は、ナトリウム、カリウム又はリチウム塩である。
【００５１】
本発明者らは、本発明者らが開発したキレート化ペプチドタグの１つを含む興味ある蛋白質が、幾つかのプロトコルを用いてＴｃ核で標識化できることを示した。本発明者らはまた、このような標識化された興味ある蛋白質が安定的に標識化されることを示した。
好ましくは、工程ａ）中、（iii）テクネチウム酸（VII）のアンモニウム塩（アンモニウムペルテクネテート又はＮＨ4ＴｃＯ4）の水溶液も加える。
【００５２】
本発明をより深く理解するために、そして如何にして本発明を実施できるかを示すために、例示だけの目的で、本発明に記載の特定の実施態様、方法及びプロセスを、添付の図面に関連付けて以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＵＢＩ ２９‐４１の直接的[ＴｃＯ]3+標識化： 99mＴｃ／99Ｍｏジェネレータからの(99m+g)Ｔｃ（Ａ）及び99mＴｃ／99Ｍｏジェネレータからの[ＮＨ499ＴｃＯ4]＋(99m+g)Ｔｃからの99gＴｃ（Ｂ）を用いたＵＶ吸収を実線で示し、放射活性を点線で示す。
【図２】遊離型（点線）及び[ＴｃＯ]3+との錯体（実線）にあるＵＢＩ ２９‐４１の220 nmでの吸収スペクトル。
【図３】ａ）ＲＣ‐１２１（配列番号４０）及びｂ）ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）の概略図。
【図４】１μｇのＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]（134 μＣｉ）（Ａ、Ｂ）の注射並びに１μｇのHＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（134 μＣｉ）及び125μｇのＲＣ‐１２１（Ｃ、Ｄ）の同時注射の４時間後のＡＲ４‐２Ｊ異種移植マウスの全身断面図。Ａ及びＣは断面の写真であり、Ｂ及びＤはβ‐イメージャ（BIOSPACE inc.）で作製された99mＴｃ（１５Ｋｅｖ）のβ‐放射の検出を表す。
【００５４】
本発明者らにより意図される特定の態様を、実施例によって以下に記載する。以下の記載において、非常に多数の詳細が、本発明の徹底的な理解を提供するために設定される。しかしながら、本発明がこれら特定の詳細に限定されずに行われ得ることは、当業者に明らかである。その他の場合において、周知の方法及び構造は、記載を不必要に不明瞭にしないように、記載していない。
【００５５】
定義
‐ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書中で一字コードに従って示し、これにおいて、例えばＱはＧｌｎ又はグルタミン残基を意味し、ＲはＡｒｇ又はアルギニン残基を意味し、ＤはＡｓｐ又はアスパラギン酸残基を意味する。
‐キレート化されたペプチドタグは、Ｔｃ又はＲｅ核をキレート化しており、それに化学的に結合されている短いペプチド配列を指称する。
【００５６】
‐Ｎ３Ｏキレート化配列は、３つの窒素原子及び１つの酸素原子を介して、ＴｃＯ核をキレート化する配列を指称する。同様に、Ｎ４キレート化配列は、４つの窒素原子を介してＴｃＯ核をキレート化する配列を指称する。
‐天然残基は、別の天然又は非天然アミノ酸によるその置換え前の明記されたペプチド配列中に存在するアミノ酸残基を指称する。
【００５７】
‐非天然／天然アミノ酸残基。天然アミノ酸残基は、様々な化学的手段により製造することもできるが、インビボで発見され、少なくとも１つの自然に発生する生物により生産されるものである。非天然アミノ酸残基はインビボで発生せず、様々な化学的手段によってのみ製造できる。
【００５８】
‐ペプチドリンカーは、天然の機能的ドメイン又は新規な機能的ドメインのいずれにも影響しないと予測される、一連の幾つかのアミノ酸残基を指称する。例として、一連の６ヒスチジン残基又は２グリシン残基を含むが、様々な長さ及びアミノ酸組成の多くのその他のリンカーが当該技術において公知である。
‐ペプチドタグは、Ｔｃ又はＲｅ核をキレート化できる短いペプチド配列を指称する。
【００５９】
‐Ｔｃ又はＲｅ核は、活性型に化学的に還元されているＴｃ又はＲｅ原子を指称する。Ｔｃ核の例として、Ｔｃ(V)二原子核[ＴｃＯ]3+又はＴｃ(I)トリスカルボニル[Ｔｃ(ＣＯ)3]+を含む。
‐ＴｃＯは、記載されたキレート化ペプチドタグ配列との錯体にあるときのＴｃ核の呼称であり得、ＴｃＯ[ペプチド]又はＴｃＯ‐ペプチドの形式にある。
【００６０】
‐側鎖は、種々の自然に発生するアミノ酸残基間で異なるアミノ酸の化学基を指称し、例えばグリシンにおいてＨ‐であり、アラニンにおいてＣＨ3‐である。別の残基の側鎖を欠落する天然又は非天然アミノ酸は、関連する側鎖が失われているものであり、例えばチロシンは、ＯＨ基を有する環状炭化水素からなる側鎖を含むが、類似のアミノ酸であるフェニルアラニンはＯＨ基を含まず、よって天然の（チロシン）残基の側鎖を欠落するアミノ酸としてチロシンを置き換えるのに用いることができる。
【００６１】
‐ＳＰＥＣＴは、γ線を用いた核医薬断層撮影イメージング手法である単色光子放射型コンピュータ断層撮影法を意味する。それは、γカメラを用いた従来の核医学平面イメージングに非常に類似している。しかしながら、それは３Ｄ情報を提供できる。この情報は、患者の横断面図を提供するが、必要に応じて自由にリフォーマット又は操作できる。
‐「syn／anti異性体」‐一般に用いられるジグザグ図において、置換基は、炭素鎖と同側、すなわちsyn配向又は反対側、すなわちanti配向にあり得る。
【実施例】
【００６２】
実施例１：材料及び方法
フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸（Nova Biochem, Laufelfingen, Switzerland）は、以下の側鎖保護基と共に用いた：Ｓｅｒ及びＴｈｒにtert‐ブチルエーテル；Ａｓｐ及びＧｌｕにtert‐ブチルエステル；Ａｒｇに2,2,5,7,8‐ペンタメチルクロマン‐6‐スルホニル；Ｃｙｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎにトリチル；並びにＬｙｓにtert‐ブチルオキシカルボニル。ペプチド合成のための溶剤及び試薬は、ＳＤＳ（Peypin, France）又はＦｌｕｋａ（St. Quentin Fallavier, France）からであった。
【００６３】
アンモニウムペルテクネテート（ＮＨ4ＴｃＯ4）は、National Oak Ridge Laboratory（USA）から購入し、開示される手順を用いて再酸化した（３７）。標識化実験において用いられる水溶液の濃度を、244 nmにおいて、純粋なペルテクネテートについて6220 M‐1 cm‐1の吸収係数を仮定し、電子吸収分光法を用いて測定した。
標識化反応混合物の分析は、Prostar 335フォトダイオードアレイ検出器（Varian, Les Ulis, France）とBerthold HERM LB500 γ‐検出器（Berthold, Thoiry, France）とを備えたVarian Prostar HPLCシステムを用いて行った。
【００６４】
１．１ ペプチド合成
設計されたペプチドを、自動ペプチド合成装置（モデル433A, Applied Biosystems, Foster City, USA）上での固相合成により、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）‐アミノ酸誘導体、Novasyn TGR（Nova Biochem, France）及びＮ‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）／Ｎ,Ｎ'‐ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCCI, Applied Biosystems）媒介結合を用いることによって得た。ペプチド合成を、１回当たり３０分のカップリング及び１０倍過剰量のＦｍｏｃ‐アミノ酸（1 mモル）を用いて0.10 mmolのスケールで行い、その後無水酢酸でキャップした。合成完了後、95％トリフルオロ酢酸、2.5％の水、2.5％のトリイソプロピルシランの混合物で室温にて、13‐マーペプチドについては２時間及びより短いペプチドについては３０分間処理することにより、側鎖保護基を同時に除去しながら、樹脂からペプチドを切断した。13‐マーについて、次いで樹脂を濾過し、メチル‐tert‐ブチルエーテル中で４℃にて遊離ペプチドを沈降させた。３回の遠心分離及びエーテルでの洗浄後、ペプチドを20％酢酸に溶解させ、凍結乾燥させた。より短いペプチドについて、溶媒を真空中で除去し、得られた黄色の油状物を20％酢酸に溶解させ、凍結乾燥させた。還元された（reduced）ペプチドを、溶離剤Ａ（水中の0.1％トリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（水中の0.09％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の非線形勾配を80分間にわたって、Supelco BioWide Pore C18カラム（10 × 250 mm）上で、4.5 mL／分の流速にて用いる、分取逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製した。ピークを分析的ＨＰＬＣで分析し、＞95％純粋な画分を集積し、凍結乾燥させた。
【００６５】
１．２ ペプチド配列分析
アミノ酸配列の分析は、ＡＢＩ モデル ４９２ Ｐｒｏｃｉｓｅ 蛋白質配列決定システム（Applied Biosystems）を用いて、自動エドマン分解により行った。
【００６６】
１．３ 標識化手順及びＨＰＬＣ分析
典型的な実験において、15 μlの580 μＭペプチド水溶液に、水中の1 mg／mlのＳｎＣｌ2溶液5 μlを加え、その後10 μlの0.1N NaOH溶液及び新しく調製したＮＨ4ＴｃＯ4の5.5 mM水溶液2.5 μlを加えた。反応混合物を室温にて５分間インキュベートした。水中の0.05％トリフルオロ酢酸中のカフェインの0.1 mg／ml溶液50 μlを加え、定量化標準として用いた。溶液を0.8 μlの1N HClで酸性化し、溶離剤Ａ（水中の0.05％トリフルオロ酢酸；最終ｐＨ 〜2.5）で120 μlに希釈した。この混合物をGrace Altima C8カラム（Grace Davison, Lokeren, Belgium）及び溶離剤Ａ中の溶離剤Ｂ（水中の0.045％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の最適化された非線形勾配を用いて分析した。
【００６７】
ＢＰＴＩ（配列番号３２）及びＴＧＲＲＲペプチドタグ（配列番号２２）とペプチドリンカーＧＧ（配列番号３６）とを含むその変化形ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩ（配列番号３３）の場合に、50 μgの蛋白質を[ＴｃＯ]3+標識化実験に用いたことを除き、プロトコル２（実施例２を参照）に記載のものと同様の条件を適用した。
【００６８】
各ペプチドについて、標識化率は、内部キャリブレーションを用いて算出する。第１の実験を上記条件下に行い、反応しなかったペプチドに対応するピークの面積を、内部基準カフェインに対応するピークのものに対して標準化し、比Ｒ1を得た。第２の実験を、ＴｃＯ4-を反応混合物に加えないことを除いて、同一の条件下に行った。反応しなかったペプチドに対応するピークを、カフェインのものに対して標準化し、比Ｒ2を得た。標識化率を（１−Ｒ1／Ｒ2）として算出した。
【００６９】
１．４ システイン攻撃（Cysteine challenge）
16 μgの凍結乾燥させたＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]（配列番号１）を含む溶液をＰＢＳ ｐＨ ７．４中のシステイン溶液32 μlに加えた。システイン溶液の３つの濃度を用いた：333、53及び３のシステイン：Ｔｃ‐ＵＢＩ‐ＷＴモル比にそれぞれ対応する100 mM、15 mM及び1 mM。サンプルを20時間310Ｋにてインキュベートし、その後ＨＰＬＣ及びＥＳＩ‐ＭＳ分析を行った。類似の実験をＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]（配列番号２２）錯体について行った。13 μｇの凍結乾燥させたＴＧＲＲＲ（配列番号２２）‐ＴｃＯ錯体を、50のＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]（配列番号２２）：システインのモル比に対応する、ＰＢＳ ｐＨ ７．４中の15 mMシステイン溶液64 μlに加えた。この溶液を20時間室温にてインキュベートし、ＨＰＬＣ分析を行った。
【００７０】
１．５ ＴｃＯ[ペプチド]錯体の大規模精製及び単離
水１ ml中の１ mgのＵＢＩ 29‐41（配列番号１）に、333 μlの１ mg／ml ＳｎＣｌ2水溶液、667 μlの0.1 N NaOH及び133 μlの新しく調製したアンモニウムペルテクネテート水溶液を加えた。反応混合物を５時間室温にてインキュベートした。それを９ mlの50 mM水性トリフルオロ酢酸アンモニウム溶液で希釈した後に、ＨＰＬＣに注入した。テクネチウム錯体を、4.6 × 150 mmのAltima C8カラム上で、40分間にわたる溶離剤Ａ（50 mMアンモニウムトリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（70％水性メタノール溶液中の50 mMアンモニウムトリフルオロ酢酸）の20％〜80％の線形勾配を用いて精製した。
【００７１】
１．６ 質量分析
ＬＣ‐ＭＳ分析を、ＥＳＩ‐イオントラップ質量分析器Ｅｓｑｕｉｒｅ ＨＣＴ（Bruker-Daltonics, Germany）とオンラインで連結したＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓで行った。溶離は、Ｇｒａｃｅ Ａｌｔｉｍａ Ｃ８カラム（Grace Davison, Lokeren, Belgium）上で、600 μＬ／分の流速にて、溶離剤Ａ（水中の0.05％トリフルオロ酢酸）中の溶離剤Ｂ（水中の0.045％トリフルオロ酢酸、90％アセトニトリル）の線形勾配で行った。分離システムを用いて、カラムからの溶離物の90％をＤＡＤ（ダイオード‐アレイ検出器）検出器に割り当て、ＵＶ吸収を測定した。
【００７２】
カラムからの溶離物の残り10％は、ＭＳ収集のためにＥＳＩ‐ＭＳに割り当てた。窒素を乾燥及び噴霧用ガスとし、ＥＳＩにより生じたイオンのトラップ及び冷却の効率化並びにフラグメント化プロセスのためにヘリウムガスをイオントラップに導入した。イオン化及び質量分析条件（キャピラリ高電圧、スキマ及びキャピラリ出口電圧並びにイオン移動パラメータ）を変化させ、化合物の検出に最適化した。
【００７３】
１．７ ＮＭＲ実験
ＵＢＩ‐29‐41ペプチド（配列番号１）及び精製したＴｃＯ錯体を、1.5 mMにて、600 μlの90％Ｈ2Ｏ／10％Ｄ2Ｏ中で調製した。ｐＨを両方のサンプルについて5.8に調整した。1Ｈ化学シフトを内部基準3‐(トリメチルシリル)[2,2,3,3,-2H4]プロピオネート（ＴＳＰ）を用いて測定した。
主鎖及び側鎖帰属実験を、295Ｋにて、ＵＢＩ‐29‐41（配列番号１）及びそのＴｃＯ錯体について、５ mmの三重共鳴凍結探針を備えたBruker DRX-700分光計で行った。
ＮＭＲ実験を行って、ＴＧＲＲＲ（配列番号２２）の側鎖及び主鎖共鳴を帰属させ、そのＴｃＯ錯体を、90％Ｈ2Ｏ／10％Ｄ2Ｏ及び100％Ｄ2Ｏ中に５ mm ＢＢＩ Ｚ 勾配探針を備えたBruker DRX-500に記録した。
【００７４】
1Ｈ‐1Ｈ及び1Ｈ‐13Ｃの２Ｄ実験を相次いで記録した。1Ｈ‐1Ｈ全相関分光法（ＴＯＣＳＹ）は、混合用ＤＩＰＳＩ２シークエンスでの80ミリ秒の混合時間を用いて記録し、勾配での３‐９‐１９パルスシークエンスでのウォーターサプレッションを用いて記録した。２Ｄオフ共鳴ＲＯＥＳＹスペクトル（ＴＲＯＥＳＹ）は、100ミリ秒のＲＯＥＳＹスピンロック時間を用いて記録した。
２Ｄ1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験は、感度が改善された同核種Ｈａｒｔｍａｎ‐Ｈａｈｎ混合用ＤＩＰＳＩ２シークエンスを用いて、double-INEPT移動による相関を用いて記録した。スペクトルをTopspin Brukerソフトウェアで処理し、プログラムＳＰＡＲＫＹで分析した。
【００７５】
１．８ ラット細胞培養
ソマトスタチン受容体サブタイプ２（ＳＳＴ‐２）を主に発現するラット膵カルチノーマＡＲ４‐２Ｊ細胞を用いて、99mTcO標識化ソマトスタチン類似体をインビボで評価した。細胞を組織培養皿（Falcon）中で、３７℃にて５％ＣＯ2及び95％加湿空気下に、１％Ｌ‐グルタミン、20％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ（１μｇ／ｍＬ）を補給した４．５ｇ／ｌグルコースを有するＤＭＥＭ培地中でインキュベートし、成長させた。継代培養は、トリプシン／ＥＤＴＡ（0,05％／0,02％ w/v）溶液を用いて行った。全ての製品をＳｉｇｍａ社（Saint-Quentin Fallavier; France）から購入した。100％のコンフルーエンスにて、培地を除去し、Versenバッファ（ＰＢＳ ＋ ５ mM EDTA）を用いて細胞を回収し、氷冷ホスフェートバッファで洗浄し、最後に1000ｇにて７分間（４℃）遠心分離した。ペレットを氷冷バッファ（10 mM MgCl2, 0,25% BSA, 50 mM HEPES pH 7.5, 1%プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社））中に懸濁し、細胞懸濁液を氷中に保存し、結合実験に用いた。
【００７６】
１．９ [125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチン結合アッセイ
ＡＲ４‐２Ｊ細胞について全ての結合実験を３７℃にて、10 mM MgCl2, 0,25% BSA, 50 mM HEPES pH 7.5, 1%プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社）中で行った。ＡＲ４‐２Ｊ細胞懸濁液の密度を結合アッセイ前に毎回確認し、提示された放射性リガンドが10％より多く特異的に結合しないよう（概しておよそ3000 cpm）に調整した。類似の実験を行って、ＳＳＴ‐２を発現するＡＲ４‐２Ｊ細胞懸濁液との[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンの平衡結合に対するＲＣ‐１２１（配列番号４０）、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）及びＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の濃度上昇の効果を測定した。概して、トレーサとしての0.5 nM [125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンは、15 μlの細胞懸濁液と共に、45分間100 μｌの最終アッセイ体積中でインキュベートした。非特異的結合は、５μＭのソマトスタチン‐28の存在下に測定した。インキュベーションを、氷冷洗浄バッファ（Ｔｒｉｓ 10 mM pH7.2）を加えて終了させ、0.5％ポリエチレンイミン中に予め浸漬させたWhatman GF/Cガラスファイバフィルタで迅速に濾過した。フィルタ活性をCobraγカウンタ中で測定した。各実験を少なくとも２回重複して行った。
【００７７】
１．１０ 結合データ分析
個々の実験（n≧2）からの競合結合曲線を、Kaleidagraph 4.0（Synergy Software, Reading, PA）を用いた非線形回帰分析により分析した。
非特異的結合の減算と標準化との後に、[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンで得られたデータを、Hill方程式を用いて分析し、ＩＣ50値を推定した。[125I]‐[Tyr1]‐ソマトスタチンの結合阻害におけるペプチドの親和性は、ｐＫiとして表され、Cheng‐Prussoff補正（ＳＳＴ‐２についてＫｄ＝１nM）を適用することによって、ＩＣ50値から算出した。
【００７８】
１．１１ マウスにおける生体分布及びイメージング研究
体重20ｇの雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスをCharles River Laboratories（L'Arbresle, France）から購入した。マウスは従来の動物施設で飼育され、食物及び飲料を自由に摂取できた。実験プロトコルは、動物実験についての地方倫理委員会によって認可されている。
【００７９】
滅菌ＰＢＳ中に新しく懸濁した、500〜600万のＡＲ４‐２Ｊ細胞をマウスに皮下移植した。接種から１３日後、触診可能な充実性腫瘍塊を示した。この時、150‐250μＣｉに相当する、約１μｇの99(m+g)ＴｃＯ‐標識化化合物をマウスの尾静脈に注入した。１時間、４時間又は２４時間後、マウスを麻酔中に放血して犠牲にした。興味ある器官、血液及び尿を回収し、重さを測った。放射活性をγカウンタで測定した。評価した化合物はＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]及びＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]であった。ブロックコントロール実験は、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体と、125倍過剰量の参照化合物ＲＣ‐１２１との同時注入により達成した。
【００８０】
１．１２ イメージング
全身断面分析：マウスの尾静脈に注射し、４時間後犠牲にした。イメージングについて、マウスを麻酔し、次いで、ＣＮＴ組織再分布を防ぐためにドライアイスとイソペンタンとの‐８０℃の混合物に浸漬した。マウンティングミディアム中で身体をブロッキングした後、スライシングミクロトーム（LEICA Microsystems, France）を用いて、組織断片（20 μm）を‐２０℃にて作製した。断片を室温にて２時間、シリカゲルの存在下に保持し、確実に完全乾燥させた。乾燥組織断片の放射活性の定量的測定及びイメージングは、β‐イメージャ（Bioscape Lab, Paris, France）を用いて行った。
【００８１】
実施例２ 結果
２．１ 99m+gＴｃ ＵＢＩ ２９‐４１の合成、放射能標識化及び特徴決定
２つの異なるプロトコルを用いて、ペプチドＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）を標識化し、その錯体を特徴決定した。99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータから溶離した、商業的に入手可能なペルテクネテート溶液を用いたＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）の直接的な標識化のために、プロトコル１は、Melendez-Alafortらにより報告されたものから適合させた（１９）。
【００８２】
プロトコル１において、即時調製した１ｍｇ／ｍｌのＳｎＣｌ2水溶液５μｌ、10μｌのＮａＯＨ 0.1 N溶液、2.4μｌの生理的食塩水中の100 nM 99(m+g)ＴｃＯ4-を、水中の１ｍｇ／ｍｌＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）水溶液15μｌに逐次的に加えた。ＵＢＩ ２９‐４１（配列番号１）、ＳｎＣｌ2、99(m+g)ＴｃＯ4-の最終濃度は、それぞれ270μＭ、840μＭ及び7.4μＭであった。溶液のｐＨは10.5であった。
【００８３】
反応物は、５分間室温にて放置した。得られた生成物を逆相ＨＰＬＣによって特徴決定した。ペプチドＵＢＩ２９‐４１（配列番号１）の標識化中に形成した錯体を特徴決定するための、本発明者らが好んだ方法はＥＳＩ‐ＭＳである。この手法に適合する酸性条件が錯体の脱配位を生じないことを確実にするために、ｐＨ2.5、5.5及び6.8の３つの溶離条件を用いた。これら３つの条件間で著しい差は見られなかった。
【００８４】
図１Ａは、ｐＨ2.5で溶離される標識化溶液の（220 nmにおける）ＵＶクロマトグラムとγ‐ラジオクロマトグラムとの重ね合わせを示す。γ‐ラジオクロマトグラムは、220 nmにて最も大きな吸収を示す主要な種よりも長い保持時間で溶離する生成物の存在を示す。しかしながら、プロトコル１で用いられる反応条件では、本発明者らは相当な量のＴｃ［ＵＢＩ 29‐41］（配列番号１）錯体を得ることができず、ＥＳＩ‐ＭＳによる生成物の特徴決定の妨げとなった。これは主に、99Ｍｏ／99mＴｃジェネレータにより導出されるＴｃ濃度の限界による。
【００８５】
標識化率を増加させ、Ｔｃ標識化実験の生成物を特徴決定するために、本発明者らは第２の標識化プロトコルであるプロトコル２を設計した。即時調製した１mg/ml SnCl2水溶液2.5μl、10μlのNaOH 0.1N溶液、生理的食塩水中の100 nM 99(m+g)ＴｃＯ4- 2.4μl及び[NH499gTcO4]の5.5 mM溶液2.4μlを、水中の１mg/mlＵＢＩ 29‐41（配列番号１）水溶液15μlに逐次的に加えた。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）、SnCl2及び99Tcの最終濃度は、それぞれ270μＭ、840μＭ及び407μＭであった。反応混合物を、５分室温にて放置した。
【００８６】
プロトコル２を用いたＴｃ標識化実験の生成物の特徴決定は、ＬＣ−陽イオンＥＳＩ−ＭＳ分析により達成した。図１Ｂに説明するように、ＨＰＬＣ ＵＶ及び放射性プロフィールは、同一の保持時間にて１つの最も豊富なピークを示した。この最も豊富なピークのＬＣ‐陽イオン‐ＥＳＩ‐ＭＳ特徴決定は、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]モノアダクト（1845.6 Daのm/z）の形成によく一致した。この質量は、1733.5 Da（ＵＢＩ 29‐41）＋115 Da（ＴｃＯ3+）−3 Da（3H+）に一致し得る。これは、実験誤差の範囲内で見られた質量に合致した。更に、モノアダクトの電子吸収スペクトルは、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の吸収スペクトルでは観察されない、274 nmを中心とした大きな吸収を示した（図２）。この吸収は、配位子‐金属電荷移動（ＬＭＣＴ）のバンド（ε＝8887 mol-1.l.cm-1）に一致し得る。
【００８７】
プロトコル２を用いたＵＢＩ 29‐41（配列番号１）のＴｃＯ標識化率は、材料及び方法に記載のカリブレーション手順を用いて測定した。これは、ＵＢＩ 29‐41について表Iに報告する、ＴｃＯ標識化率の正確な測定を可能にした。プロトコル２の実験条件において、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の標識化率が７９％であったことに注意しなければならない。
【００８８】
２．２ ＴｃＯ3+キレート化を担う側鎖の同定
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）中のＴｃＯ3+キレート化部位の位置を同定するために、本発明者らは、このペプチドの１１の類似体を合成した（表Ｉ）。これら類似体の各々は、本来の残基の官能基が除去されている非天然又は天然アミノ酸でのユビキチジンのこのフラグメント中に存在する１つの側鎖の置換えに相当する。アルギニン残基はノルバリン（Nva）残基で置き換え、スレオニン、グルタミン酸及びアスパラギン残基はアミノ酪酸（Abu）残基で置き換え、リジン及びメチオニン残基はノルロイシン（Nle）残基で置き換え、チロシンはフェニルアラニンで置き換えた。アラニン及びグリシン残基は置き換えなかった。
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の１１の類似体は、以下においてＵＢＩ‐Ａ１〜ＵＢＩ‐Ａ11と称される（表Ｉ）。
【００８９】
表１：ＵＢＩ 29‐41（ＵＢＩ‐ＷＴ）の類似体の99(m+g)Ｔｃ標識化生成物の特徴決定。
【表１】
【００９０】
a標識化率は、（１−Ｒ１／Ｒ２）として算出し、Ｒ１は、プロトコル２の条件下での99(m+g)Ｔｃ標識化実験において内部基準カフェインの比に対する、反応しなかったペプチドの比に合致し、Ｒ２は、ＴｃＯ4-を除くプロトコル２の条件下での内部基準カフェインの比に対する、反応しなかったペプチドの比に合致する。ＨＰＬＣピーク積分の不確定性を考慮し、本発明者らは、算出された標識化率について１０％未満の不確定性を見積もった。
【００９１】
プロトコル２を用いてこれら類似体を標識化し、生成物をＨＰＬＣ及びＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定した。１つの類似体だけが、元のペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）と比較して、標識化率の著しい変化を示した。類似体ＵＢＩ‐Ａ１は、アミノ酪酸残基によるT1の置換に相当する。この結果は、Ｔ１のＯＨ基がＴｃＯキレート化官能基の一部であり得ることを示唆する。類似体ＵＢＩ‐Ａ２はＵＢＩ 29‐41と類似の標識化率を示したので、Ｒ２がＴｃＯのキレート化に関与しないことを示唆する。類似体ＵＢＩ‐Ａ３〜ＵＢＩ‐Ａ11は、８４〜９５％の範囲内の[ＴｃＯ]3+標識化率を示した。これら観察結果は、これら種々の類似体において抑制される化学的官能基のいずれもが、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に直接的に関与しないことを示唆する。
【００９２】
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位及び配位官能基の正確な位置を決定するために、本発明者らは、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体及び遊離ペプチドを、1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲ分光法により、ｐＨ5.8の水溶液中で分析した。遊離ペプチド及びＴｃＯ‐ペプチド錯体において、１組の共鳴だけがＮＭＲ実験で観察されたので、１つのコンホメーションだけが溶液中に存在するか、又は１つのコンホメーションが圧倒的に多いことが示唆される。
【００９３】
ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]ペプチドの1Ｈ及び13Ｃの帰属を、表II及びIIIに報告する。
Ｔｃを含まないＵＢＩ 29‐41の場合に残基Ｒ7、Ｒ12及びＲ13並びにＴｃＯ‐ＵＢＩ 29‐41錯体の場合に残基Ｒ6、Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、1Ｈ及び13Ｃ共鳴の併発が原因で帰属できなかった。しかしながら、ＴＲＯＥＳＹとＴＯＣＳＹ実験とを組み合わせたＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験において、その他の残基の特徴的なパターンは、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体の場合にその他の残基全てのＮＨ、Ｈα、Ｈβ、Ｈγ、Ｈδ、Ｈε、Ｃα、Ｃβ、Ｃγ、Ｃδ及びＣε共鳴を明確に帰属させることを可能にした。
【００９４】
表II：ＵＢＩ 29‐41の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【００９５】
【表２】
【００９６】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、295Ｋにて測定した。Ｒ6、Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、シグナルの完全重複が原因で帰属されなかった。b1Ｈ化学シフトは、1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験における残りのＨＤＯシグナルとの共鳴の重複が原因で帰属できなかった。
【００９７】
表III：ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体（ＵＢＩ‐ＷＴ）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属。
【００９８】
【表３】
【００９９】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、295Ｋにて測定した。Ｒ7、Ｒ12及びＲ13の1Ｈ及び13Ｃ共鳴は、シグナルの完全重複が原因で帰属されなかった。
【０１００】
[ＴｃＯ]3+の配位部位の位置について情報を与え得る第１の観察結果は、ＴＯＣＳＹスペクトル及びＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験における、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]の残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミドプロトンと対応の側鎖プロトンとの間の相関の不存在に関する。これは、これら３つのプロトンがＴｃＯ核の形成により失われることを示唆する。
【０１０１】
２つのサンプルの1Ｈ及び13Ｃ化学シフトの比較は、その他の興味深い特徴を明らかにした。残基Ｒ3及びＡ4のＣα共鳴は、それぞれ10.72及び4.54 ppmの重要な低磁場シフトを示した。更に、残基Ｔ1のＣβ共鳴は、9.29 ppmの低磁場シフトを示した。遊離ペプチドとその[ＴｃＯ]3+錯体との間のその他重大な化学シフトの変化を観察した。残基Ｔ1のＨα共鳴は0.48 ppmのシフトを示したが、この残基のγＣＨ３は、ＴｃＯ錯体形成により0.376 ppmの高磁場シフトを示した。
【０１０２】
更に、２つのサンプルの1Ｈ共鳴は、遊離ペプチドにおけるＮＭＲタイムスケール中のコンホメーションの平均化が原因で重複したと思われる残基Ｇ2のＨα１及びＨα２プロトンの共鳴が、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体において約0.6 ppmの化学シフトの差を生じたことを示した。これは、[ＴｃＯ]3+核での錯体形成により、ペプチドがＧ2の領域中の規定された構造に適合し、２つのＨαプロトンについて異なる磁場環境をもたらすことを示唆する。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）とその[ＴｃＯ]3+錯体との間の1Ｈ化学シフトの変化に関する１つの更なる観察結果は、残基Ｋ5のＨＮ共鳴に関する。このＨＮプロトンがＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中になお存在するとしても、0.76 ppmの大きな高磁場化学シフトの変化を示し、その磁場環境が[ＴｃＯ]3+核の錯体形成により著しく改変されていたことを示す。
【０１０３】
概して、これら観察結果は、ＵＢＩ 29‐41中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位がペプチドのＮ末端側に位置し、残基Ｔ1、Ｇ2、Ｒ3及びＡ4を含むことを示唆する。残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4は、[ＴｃＯ]3+核の錯体形成により失われるアミド基窒素により[ＴｃＯ]3+核に配位する可能性がある。
【０１０４】
２．３ ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）由来の、短く効果的な [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチドの配列。
上記の、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体のＮＭＲ分析と関連する、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）及びその類似体の[ＴｃＯ]3+キレート化能に関する結果により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐41のＮ末端の位置にキレート化部位を配置できた。このため、本発明者らは、最小配列ＴＧＲＡ（配列番号１４）を合成し、プロトコル２に従って、その本来の[ＴｃＯ]3+キレート化能を評価した。このペプチド配列について測定した標識化率は１１％であった（表IV）。この結果は、プロトコル２の実験条件において、ＴＧＲＡペプチドの小分画が[ＴｃＯ]3+核をキレート化するとしても、ＵＢＩ 29‐41中のＴｃＯキレート化のその他重要な決定因子が、ＴＧＲＡにおいて失われていることを示す。
【０１０５】
元のペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）と比較したこの結果により、本発明者らは、一連のペプチドを合成し、この配列中の[ＴｃＯ]3+キレート化効率の決定因子を詳細に調査した。これらペプチドの配列及びそれらの標識化率を表IVに報告する。ＥＳＩ‐ＭＳ分析により、得られた錯体が、全ての場合において、3 H+が引き抜かれた[ＴｃＯ]3+のモノアダクトに相当することが示された。
【０１０６】
表IV：ＵＢＩ 29‐41フラグメント及びその類似体の99(m+g)Ｔｃ標識化生成物の特徴決定。
【０１０７】
【表４】
【０１０８】
a標識化率は、（１−ｆ）として算出し、ｆは、プロトコル２を用いた99(m+g)Ｔｃ標識化実験において、ＨＰＬＣにより定量化された、反応しなかったペプチドの分画である。ＳＤ：ＨＰＬＣピーク積分の不確定性を考慮し、本発明者らは、算出した標識化率について１０％未満の不確定性を見積もった。
【０１０９】
ペプチドＴＧＲＡＫ（Ｐ２）（配列番号１５）、ＴＧＲＡＫＲ（Ｐ３）（配列番号１６）及びＴＧＲＡＫＲＲ（Ｐ４）（配列番号１７）は、元の配列ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の、最初の５、６及び７Ｎ末端残基にそれぞれ相当する。Ｐ２、Ｐ３についてプロトコル２を用いて得られた[ＴｃＯ]3+標識化率は、それぞれ40％、67％であった。上記の観察結果は、Ｋ５とＲ６との２つの残基の存在が、ＴＧＲＡ配列（配列番号１４）と比較して標識化率の大きな増加を招くので、K5‐R6対が[ＴｃＯ]3+キレート化効率に重要な役割を果たすことをはっきりと示した。対照的に、ペプチドＰ３及びＰ４について得られた結果の比較は、残基Ｒ７が[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善しないことを示した。このことは、ペプチドＰ４及びＰ３について得られた標識化率と類似していた、残基Ｒ７がノルバリンで置き換えられたペプチドＰ５について測定された[ＴｃＯ]3+標識化率によって更に確認した。上記の結果は、ペプチドＵＢＩ 29‐41（配列番号１）において、効果的な[ＴｃＯ]3+キレート化の決定因子が、本来の配列のＮ末端ヘキサペプチド中に存在することを示す。このヘキサペプチド中の各位置の具体的な役割を更に調査するために、本発明者らは、第２の一連のより短いペプチドを合成し、それらの[ＴｃＯ]3+キレート化標識化率を評価した。
【０１１０】
上記に示したように、塩基性残基Ｋ5‐Ｒ6対は、[ＴｃＯ]3+キレート化効率に役割を有する。ペプチドＰ６を合成し、アルギニン残基による５位リジンの置換の影響を評価した。表IVに示されるように、Ｐ３と比較して約20％の、[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい増加を観察した。この観察結果は、それらが塩基性の特徴を共有しているにも拘らず、リジン及びアルギニンが、プロトコル２の条件下での[ＴｃＯ]3+キレート化効率の決定に異なる影響を有し得ることを示す。更に、ペプチドＰ７（ＴＧＲＡＡＲ）について、Ｐ６（ＴＧＲＡＲＲ）と比較して約60％の[ＴｃＯ]3+標識化率の劇的な減少を観察し、このことは、配列中のアルギニンの数及び／又はこれら塩基性残基の位置が標識化率に強い影響を有することを示唆する。
【０１１１】
より短い[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチドを得るために、本発明者らは、上記で同定された[ＴｃＯ]3+キレート化決定因子を組み込んだ幾つかのペプチドを合成した。これらは、[ＴｃＯ]3+キレート化官能基、すなわちＴ1のヒドロキシ官能基と、２位、３位及び４位残基の３つのＮＨアミド基と、少なくとも１対の塩基性残基の存在とを含む。これら全ての決定因子を有する最小配列がペプチドＰ８（ＴＧＲＲ）（配列番号２１）に相当する。Ｐ８について測定された標識化率は、しかしながら、Ｐ６について観察された率のたった半分である約40％だけであった。このことは、上記で同定された決定因子が存在するにも拘らず、その他の因子がＰ６において[ＴｃＯ]3+キレート化効率の役割を果たすことを示唆する。本発明者らは、したがって、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の最初の３つのＮ末端残基と４‐５位にアルギニン対とを有するペプチドＰ９（ＴＧＲＲＲ）を合成した。Ｐ９中の残基Ｒ3の存在が、Ｐ８（ＴＧＲＲ）と比較して約25％の著しい増加をもたらした。これにより、本発明者らは、ペプチドＰ１０を合成し、Ｒ3のグアニジニウムの特定の貢献があるかどうか、又はこの残基がＰ９においてキレート化モチーフとアルギニン対との間のスペーサの役割を果たすかどうかを評価した。ペプチドＰ１０（ＴＧＧＲＲ）についての[ＴｃＯ]3+標識化率は、ペプチドＰ９と比較して約20％著しく減少し、この配列中の残基Ｒ3の特定の役割を示唆した。更に、ペプチドＰ１０（ＴＧＧＲＲ）、Ｐ１１（ＴＧＲＡＲ）及びＰ２（ＴＧＲＡＫ）について得られた類似の標識化率である約50％は、隣接した位置又は１つの残基によって分離した位置のいずれかにある塩基性残基対が、テトラペプチド配列ＴＧＲＡ（ペプチドＰ１）と比較して[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい改善をもたらしたという前記結論に一致した。
【０１１２】
Ｐ９（ＴＧＲＲＲ）中のアルギニン残基の特定の役割を確認するために、本発明者らは、ペプチドＰ１２（ＴＧＫＫＫ）を合成した。Ｐ１２について測定した非常に低い[ＴｃＯ]3+標識化率は、プロトコル２の条件下でのＰ１２中の残基３〜５の側鎖中のアンモニウム基と比較して、Ｐ９中のグアニジニウム基の特定の貢献をはっきりと証明した。
【０１１３】
今回の研究で同定したペプチド配列の応用は、ペプチド及び蛋白質の標識化に関する。このような[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列は、蛋白質のＮ又はＣ末端の位置に組み込むことができる。したがって、上記に報告した、[ＴｃＯ]3+キレート化配列への遊離Ｎ又はＣ末端の影響を評価することが重要であった。このために、本発明者らは、遊離アミノ及びカルボキシ末端基をそれぞれ有するペプチドＰ１３及びＰ１４を合成した。Ｐ１３について測定した、Ｐ９と比較して約25％の[ＴｃＯ]3+標識化率の増加は、Ｐ１３中の遊離アミノ末端がキレート化効率を著しく改善することを証明した。このペプチドは、したがって、蛋白質又はペプチドのＮ末端の位置をタグ化するのに用いられる可能性があり、プロトコル２の条件下において、 [ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みをもたらし得る。Ｎ末端アセチル基の欠失の[ＴｃＯ]3+標識化率への類似の効果が、ＵＢＩ 29‐41において観察された（表I中のＨ‐ＵＢＩ（配列番号１３）対ＵＢＩ‐ＷＴ（配列番号１））。Ｐ１３と比較すればより効率的でないにしても、ペプチドＰ１４の著しい[ＴｃＯ]3+標識化は、蛋白質又はペプチドのＣ末端の位置をタグ化するのに、ＴＧＲＲＲ配列を用いることができることを示唆する。本発明者らはまた、Ｐ９のレトロインベルソ配列（ＲＲＲＧＴ）であるペプチドＰ１５を調査した。プロトコル２の条件下においてＰ１５について得られた[ＴｃＯ]3+標識化率は、この配列をＣ末端タグとして用いて、[ＴｃＯ]3+を蛋白質又はペプチドに組み込むこともできることを示唆した。
【０１１４】
上記の結果により、短く有効な[ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列を規定することができた。報告した配列のうち、ＴＧＲＲＲ配列（ペプチドＰ１３）は最も有効であり、プロトコル２の条件下において、 [ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みをもたらした。ＴＧＲＲＲ配列中の遊離Ｎ末端基の存在が、Ｎアセチル基と比較して、[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善したという観察結果（Ｐ１３対Ｐ９）により、本発明者らは、Ｐ１３中の[ＴｃＯ]3+配位官能基を同定しようとした。最終的に、ペプチドＰ１３の遊離形態及び[ＴｃＯ]3+とのその錯体のＮＭＲ研究に着手した。一式の1Ｈ‐1Ｈ ＴＯＣＳＹ、1Ｈ‐1Ｈ ＲＯＥＳＹ及び1Ｈ‐13Ｃ ＨＳＱＣ‐ＴＯＣＳＹ実験により、２つの形態において殆どの1Ｈ及び13Ｃ共鳴を帰属させることができた。ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の場合に観察されたように、幾つかのＮＨ共鳴は、遊離ペプチドと比較したＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]において存在しなかった。これらは残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4に相当する。
【０１１５】
表V及びVIに報告する、遊離形態及び[ＴｃＯ]3+との錯体にあるＰ１３の1Ｈ及び13Ｃ化学シフトの比較は、[ＴｃＯ]3+キレート化官能基について幾つか指摘する。
【０１１６】
表V：HＴＧＲＲＲペプチド（Ｐ１３）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
a化学シフトはＴＳＰと比較した参照であり、298Ｋにて測定した。bn.d.：測定せず。
【０１１９】
表VI：ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体（Ｐ１３）の1Ｈ及び13Ｃ（括弧内）ＮＭＲ化学シフトの帰属a。
【０１２０】
【表６】
【０１２１】
a化学シフトはＴＳＰと比較した内部基準であり、298Ｋにて測定した。
【０１２２】
幾つかの13Ｃ共鳴は、Ｐ１３の遊離形態とその[ＴｃＯ]3+錯体との間の重大な化学シフトの変化を示す。これらは、12.7、14.1及び10.50 ppmそれぞれシフトした残基Ｔ1、Ｇ2及びＲ3のＣα共鳴に関する。更に、残基Ｔ1のＣβ共鳴は8.09 ppmシフトし、残基Ｒ4のＣβ共鳴は5.56 ppmシフトする。このような大きな13Ｃ化学シフトの変化はまた、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中の３つの炭素、すなわち、Ｔ1のＣβ炭素並びにＲ3及びＡ4のＣα炭素について観察され、これらシフトは、[ＴｃＯ]3+核の配位における隣接原子の直接的関与が原因であると推測した。
【０１２３】
これら13Ｃシフトが残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のＮＨ共鳴の不存在と関連するので、本発明者らは、Ｔ1のＯＨ基のこれら３つの窒素及び酸素が、[ＴｃＯ]3+核に配位する４つの原子であると結論付けた。ペプチドＰ１３において、５つの炭素が、遊離形態とその[ＴｃＯ]3+錯体との間で著しい化学シフトの変化を示したので、状況はより複雑に見える。この観察結果は、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）において描写した状況とは対照的に、５つの原子が[ＴｃＯ]3+核の配位に関与し得ることを示唆する。
【０１２４】
これら観察結果は、Ｔ1のヒドロキシ基の酸素が四角平面内又は四角平面の頂点の位置にあるＴｃの八面体配位と両立した。或いは、今回のデータは、ペプチドの４つの原子の２組が[ＴｃＯ]3+核のキレート化に参加し得る２つの構造間の平衡と両立した。ＮＭＲスペクトルにおける1Ｈ及び13Ｃ共鳴の単一の組の観察結果は、２つの構造がＮＭＲのタイムスケールで迅速に相互変換し得ることを暗示する。
【０１２５】
上記の結果から、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）Ｎ‐末端配列に由来するペプチド配列中の[ＴｃＯ]3+核のキレート化において役割を果たす幾つかの重要な要素を同定することができた。隣接する残基のアミド基の窒素原子と共にそのＯＨ基を介してキレート化に参加する残基スレオニンの存在に加えて、少なくとも１対のアルギニン残基の存在は、ペンタペプチド配列中の標識化率を著しく改善する。
【０１２６】
ペプチド又は蛋白質を標識化するためのＴＧＲＲＲ配列のインビボ応用に役立てるために、ＴｃＯ[ＴＧＲＲＲ]錯体は、99mＴｃの期間の１〜３倍の間安定でなければならない。本発明者らは、ペプチドＵＢＩ‐ＷＴ（配列番号１）及びＴＧＲＲＲ（ペプチドＰ１３；配列番号２６）の場合の[ＴｃＯ]3+錯体の安定性を評価した。最終的に、本発明者らは、システイン攻撃を行った。16μｇのＴｃＯ[ＵＢＩ‐ＷＴ]を、３、53及び333のモル比にそれぞれ対応する、１、15及び100 mMのシステイン溶液にｐＨ7.4にて加えた。これらサンプルを20時間310Ｋにてインキュベートした。混合物をＨＰＬＣ及びＬＣ‐ＭＳにより分析した。
【０１２７】
ＵＢＩ‐ＷＴの場合に、元の[ＴｃＯ]3+錯体の10％だけが100 mMのシステインの存在下において、20時間後に観察された。しかしながら、69％及び95％よりも多い元の錯体が、それぞれ15 mM及び1 mMのシステインの存在下において観察された。[ＴＧＲＲＲ]ＴｃＯの場合に、57％の元の錯体が、15 mMのシステインの存在下において、20時間310Ｋにてインキュベーション後に観察された。これら観察結果は、これら錯体が、インビボ調査に用いるのに十分に安定であったことを示唆する。
【０１２８】
蛋白質を[ＴｃＯ]3+で標識化するためのＴＧＲＲＲ配列の、分子イメージングの分野における有用性を立証するために、本発明者らは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインのようなセリンプロテアーゼの天然阻害剤であるアプロチニン（ＢＰＴＩ）を選択した。それはＴｒａｓｙｌｏｌ（Bayer, Germany）の名の下、商業的に入手可能である。99mＴｃ‐アプロチニンは、直腸の形状を可視化する目的（３８）及びアミロイドフィブリルをイメージ化させる目的（２０）で既に用いられている。フィブリン溶解性及び／又は好中球由来セリンプロテアーゼ活性のターゲティングを介して、血栓を可視化するのに有用であることも近年示唆されている（３９）。
【０１２９】
イメージング剤として99mＴｃアプロチニンを用いた研究の殆どは、直接的アプローチにより標識化した。この[ＴｃＯ]3+標識化は、ジスルフィドの還元を介して起こると認められている。しかしながら、トリプシンとの錯体にあるアプロチニンの３Ｄ構造の検証により、これらジスルフィド結合の１つ（14‐38）が、ターゲティングされるセリンプロテアーゼとの相互作用において重要な役割を果たす残基リジン15に隣接した位置に存在することが証明された（21）。更に、このジスルフィド結合は、その標的の１つであるトリプシンによる加水分解に対して保護を与えることが近年示されている（22）。したがって、（１）ジスルフィドを保存し、（２）それらの部位にて[ＴｃＯ]3+キレート化を回避するプロトコルを用いてＢＰＴＩを標識化することは非常に望ましい。
【０１３０】
本発明者らは、固相化学合成によって、本来の残基Ｍ５２がノルロイシンで置き換えられ、メチオニン酸化を回避した、ＢＰＴＩの類似体（ＢＰＴＩｖ、配列番号３２）を製造した。種々のペプチドを標識化するために今回の研究で用いたプロトコル２の応用を、ＢＰＴＩｖ（配列番号３２）に適用した。これらの条件において、ＴｃＯ[ＢＰＴＩｖ]錯体は形成されなかった。ＨＰＬＣにおいて観察され、ＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定されたピークは、錯体形成していないＢＰＴＩｖに合致した（表VII）。
【０１３１】
表VII：プロトコル２を用いたＢＰＴＩｖ（配列番号３２）及びＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖ（配列番号３３）のＴｃＯ標識化率。
【０１３２】
【表７】
【０１３３】
ＢＰＴＩのＮ末端配列が標的から約30Å（距離Ｒ１ Ｃα‐Ｋ１５ Ｃα、ＰＤＢコード２ＰＴＣ）離れた領域中に位置するので、本発明者らは、固相化学合成によって、今回の研究で発見したＴｃＯキレート化配列ＴＧＲＲＲをＢＰＴＩｖのＮ末端の位置に付加した、ＢＰＴＩｖ（配列番号３２）の類似体を製造した。更に、ＧＧスペーサを、ＴＧＲＲＲとＢＰＴＩｖの最初の残基との間に付加し、[ＴｃＯ]3+キレート化を妨害し得るコンホメーション制約の可能性を回避した。この構造体ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖを固相化学合成により製造し、ＥＳＩ‐ＭＳにより特徴決定した。本発明者らは、[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２をＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖに適用した。このサンプルのＨＰＬＣ分析は１つだけのピークを示し、ＥＳＩ‐ＭＳ分析により、生成物の質量が、ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖの質量に＋112 Daのアダクトに合致することを示した（表VII）。更に、モノアダクトの電子吸収スペクトルは、錯体形成していないＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖの吸収スペクトルにおいても、ＢＰＴＩｖにおいても観察されなかった、274 nmを中心とした大きな吸収を示した。上記の示唆のように、この吸収は、配位子‐金属電荷移動（ＬＭＣＴ）に相当し得る。これらの結果は、ＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩの[ＴｃＯ]3+標識化率が、プロトコル２の条件下において95％よりも大きいことを示す。
【０１３４】
２．４ ソマトスタチン類似体ＲＣ‐１２１の99mＴｃ標識化へのＴＧＲＲＲペプチドの適用。
ターゲティング分子を標識化するHＴＧＲＲＲペプチド配列の能力及び診断イメージングへのその使用を更に証明するために、本発明者らは、ソマトスタチン受容体ＳＳＴ‐２及びＳＳＴ‐５の非常に強力なリガンドであるＲＣ‐１２１（42）を用いた研究に着手した。ＳＳＴ‐２は、多数のヒト腫瘍において発現するので重要である（43）。ここ数十年間で、放射線治療及び核イメージング用途のための、これら受容体の人工の高親和性リガンドを得るために、相当量の研究がなされてきた。ＲＣ‐１２１は、腫瘍学における原型のソマトスタチン類似体の環状オクタペプチド類似体、オクトレオチドである（42）。ＲＣ‐１２１は、残基Ｃ2とＣ7との間のジスルフィドを介して環化された配列DＦＣＹDＷＫＶＣＴNH2（配列番号４０）に合致する（図３ａ）。
【０１３５】
本発明者らは、HＴＧＲＲＲＧＧ配列（配列番号２６）をＮ末端の位置に付加することによってＲＣ‐１２１を改変し、ＧＧジペプチドをスペーサとして導入した（図３ｂ）。ＵＢＩ 29‐41由来の短いペプチドを研究する、上記と同一のＴｃＯ標識化条件を用いて、本発明者らは、ＬＣ‐ＭＳにより評価されたジスルフィドブリッジを保存しつつ、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１（配列番号４１）中へのＴｃＯ核の定量的な組込みを実現した（表VIII）。
【０１３６】
表VIII：ＲＣ‐１２１、HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１及びそのＴｃＯ錯体のＡＲ２‐２Ｊ細胞及びソマトスタチン受容体への結合。
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
コントロール実験はまた、タグ化されていないＲＣ‐１２１が、これら標識化条件においてＴｃＯ錯体を形成できないことを示した。15 mMシステインの存在下において測定した、この錯体の安定性は、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体について観察されたものと類似していた。約70％及び60％の錯体が、４時間及び24時間310Kにてインキュベーション後もなお存在していた。
【０１３９】
ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体のソマトスタチン受容体との結合を、次いで特徴決定した。これらの実験は、ＲＣ‐１２１中のHＴＧＲＲＲＧＧ配列の挿入が、ＳＳＴ‐２受容体へのその結合能力を減少させないことを示した（表IX）。
【０１４０】
表IX：HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１及びＴｃＯとのその錯体のＬＣ‐ＭＳ分析。
【０１４１】
【表９】
【０１４２】
ＳＳＴ‐２についてのＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]のＫd（Ｋd／ＳＳＴ‐２：20 pM）は、ＲＣ‐１２１について測定したものより約５倍低かった。更に、本発明者らは、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]が、ＳＳＴ‐５についての約100からＳＳＴ‐４についての約5000までの範囲にある係数でＳＳＴ‐２受容体の選択的リガンドであることを示した（表IX）。
【０１４３】
ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体を、マウス異種移植腫瘍モデルにおけるイメージング剤として評価した。このモデルについて、本発明者らは、ＳＳＴ‐２ソマトスタチン受容体を発現することが知られているＡＲ４‐２Ｊ腫瘍細胞株を選択した。ＡＲ４‐２Ｊ細胞についてＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]のＫdは60 pMであった（表X）。
【０１４４】
ＡＲ４‐２Ｊ異種移植マウスの第１のグループに、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]を注入した。２つのコントロール実験も行った。ＡＲ４‐２Ｊ保有ヌードマウス（グループ２）に、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]及び標識化されていないＲＣ‐１２１化合物の125倍過剰量を注入した。ＡＲ４‐２Ｊ保有ヌードマウスの第３のグループに、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]錯体をコントロール実験として注入した（グループ３）。注入４時間後に測定した、３つのグループにおける99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]の生体分布を表Xに示す。
【０１４５】
表X：注入４時間後のＡＲ４‐２Ｊ異種移植ヌードマウスにおける99mＴｃＯ標識化化合物の生体分布。測定した放射活性を、％ＩＤ／ｇ（組織のグラムで除した注入量のパーセント）で表す。各グループはマウス６体に相当する。
【０１４６】
【表１０】
【０１４７】
グループ１の場合に、殆どの器官について測定した％ＩＤ／ｇは、約１％ＩＤ／ｇ又はそれよりも低かった。予想通り、尿、腎臓及び肝臓は、最も大きな放射活性取込みに相当した。しかしながら、これらの区画とは別に、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ‐ＲＣ‐１２１]の最も大きな取込みは、腫瘍において観察された（％ＩＤ／ｇ＝5.3 ± 1.3）。125倍過剰量のＲＣ‐１２１の存在下において、最も大きな放射活性取込みは、尿及び腎臓においても観察され、より低い程度では副腎及び肝臓においても観察された。しかしながら、グループ２のマウスにおいて、腫瘍について測定した％ＩＤ／ｇは、グループ１において測定したもの（％ＩＤ／ｇ＝0.7 ± 0.2）よりも著しく低かった。
【０１４８】
これら観察結果は、125倍過剰量のＲＣ‐１２１、ナノモルのＳＳＴ‐２リガンドの存在が、ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]腫瘍取込みを著しく減少させることを示す。ＡＲ４‐２Ｊ保有マウスにおけるＴｃＯ[HＴＧＲＲＲ]ペプチド錯体の生体分布に相当するコントロール実験（グループ３）は、腫瘍における著しい放射活性取込みを示さなかった。ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]錯体のＡＲ４‐２Ｊ異種移植腫瘍をイメージ化させる能力は、それぞれ26.5及び53である腫瘍／筋肉比及び腫瘍／血液比によって特徴決定できる。グループ１と比較して著しくより低い腫瘍／筋肉比及び腫瘍／血液比が、グループ２（それぞれ７及び７）及び３（それぞれ2.6及び１）において観察された。全体的に、これらの結果は、ＡＲ４‐２ｊ腫瘍におけるＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]化合物の特異的で高い腫瘍取込みを示した。
【０１４９】
診断イメージングのための99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の能力を証明するために、本発明者らは、グループ１のマウスの全身断面を分析した（図４Ａ、Ｂ）。図４Ａ、Ｂは、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]の生体分布から得られた結果に従って、最も大きな放射活性取込みが、腎臓及び肝臓のレベルに位置していることを示す。分析した断面の写真により、腫瘍の明確な位置決定が可能となり、この断面のβイメージングは、この領域中で標識化化合物の大きな取込みを示した。この断面と、グループ２（図４Ｃ、Ｄ）に属するマウスの断面との比較により、125倍過剰量のＲＣ‐１２１の存在下において放射活性取込みがないことを確認した。これらの結果は、99(m+g)ＴｃＯ[HＴＧＲＲＲＧＧ‐ＲＣ‐１２１]化合物のＳＳＴ‐２発現腫瘍のイメージングの能力を証明し、HＴＧＲＲＲペプチドが、インビボ診断応用のために、実質的に全てのターゲティングペプチド及び蛋白質をテクネチウムで標識化する魅力的な方法を提供することを示唆する。
【０１５０】
３．結論
本発明者らの研究の最初の部分は、ＵＢＩ 29‐41と称される蛋白質ユビキチジンのトリデカマーフラグメントの[ＴｃＯ]3+キレート化部位の分析に関した。
【０１５１】
[ＴｃＯ]3+標識化ペプチドの分画を決定し、[ＴｃＯ]3+核のキレート化に関与する残基及び化学的官能基を同定するための今回の研究では、本発明者らは、99Ｔｃ源として5.5 mMのＮＨ4ＴｃＯ4水溶液を用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコルを設計した。このことにより、100μＭの範囲内のペプチド濃度と比較して、わずかに過剰量のＴｃＯ4‐（1.5等価）で研究が可能となった。ＵＢＩ 29‐41及びその類似体について得られた標識化率は、ペプチドの約30％〜95％の範囲にあり、それらは、したがって、10％未満と推定される適度な正確性をもって定量化された。更に、この標識化プロトコルによって、十分な量の標識化ペプチドを生産し、幾つかの[ＴｃＯ]3+ペプチド錯体のＮＭＲ分析を行うことができた。
【０１５２】
標識化の効率に関して、本発明者らが開発した、ＵＢＩ 29‐41の種々の類似体についての結果は、アミノ酪酸による残基Ｔ1の置換え及び[ＴｃＯ]3+標識化率の著しい減少が、[ＴｃＯ]3+核の配位にＴ1のヒドロキシ基が直接的に関係することを強く示唆した。その他の類似体はこのような劇的な減少を示さず、それらの標識化率は78〜93％の範囲であった。これは、ＵＢＩ 29‐41中の残基Ｒ3〜Ｒ13の化学官能基が、[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に参加しないようであると強く示唆する。この解釈は、ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]のＮＭＲ分析の結果により確認した。
【０１５３】
この研究では、遊離状態にて観察された、残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド基プロトン共鳴が錯体中に存在しないという観察結果は、それらのアミド基が[ＴｃＯ]3+核の配位に関与することを示唆した。更に、残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のＣα及び残基Ｔ1のＣβの遊離ペプチド（10 ppmの範囲）と比較した、大きな13Ｃ低磁場化学シフトの変化により、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+核がＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]錯体中の残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド基窒素及びＴ1のヒドロキシ基酸素によって配位するという提案ができた。ＴｃＯ[ＵＢＩ 29‐41]中のＧ2のＨα１／Ｈα２共鳴の非等価性のようなその他のＮＭＲの証拠により、この解釈を立証した。錯体形成による残基Ｔ1及びＲ3のＨα共鳴の低磁場1Ｈ化学シフトの変化もＵＢＩ 29‐41において観察した。
【０１５４】
ＮＭＲにより研究された、錯体にあるペプチドＵＢＩ 29‐41がＮ‐アセチル化されていたことに注意しなければならない（ＵＢＩ‐ＷＴ、表I）。ＵＢＩ 29‐41の非アセチル化型（Ｈ‐ＵＢＩ）は、Ｎ‐アセチル化型と比較して、意外にも[ＴｃＯ3+]標識化率の著しい増加を示した。これは、Ｎ‐末端基がＨ‐ＵＢＩ中のＴｃＯ核のキレート化に直接的な役割を果たし得ることを示唆する。
【０１５５】
今回の研究により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐14中の、ペプチドのＮ末端部分（残基１−４）への[ＴｃＯ3+]配位部位を同定し、配位原子がＴ1のヒドロキシ基の酸素並びに残基Ｇ2、Ｒ3及びＡ4のアミド官能基の窒素であると同定できた。
【０１５６】
[ＴｃＯ]3+キレート化部位が、ＵＢＩ 29‐41（配列番号１）の残基１〜４に相当するＮ末端部分に位置するという発見により、本発明者らは、ＵＢＩ 29‐41由来の最小[ＴｃＯ]3+キレート化配列を探索した。研究のこの部分の目的は２面であった：（１）ＵＢＩ 29‐41中の[ＴｃＯ]3+キレート化の決定因子を詳細に分析すること、及び（２）生体活性ペプチド又は蛋白質のＮ末端又はＣ末端側に組み込むことのできる、より短く有効な [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列を規定し、イメージング剤を設計すること。
【０１５７】
ＵＢＩ 29‐41のＮ末端テトラペプチド配列による[ＴｃＯ]3+のキレート化に関して得られた結果は、配位官能基以外の因子が[ＴｃＯ]3+標識化率の決定において役割を果たすことをはっきりと示した。これにより、本発明者らは、Ｎ末端の位置にスレオニンを有するテトラ、ペンタ及びヘキサペプチドのシリーズを合成した。ペンタペプチドＰ１３のＮＭＲ研究により、Ｎ末端スレオニンが[ＴｃＯ]3+核の配位に直接的に関与することが証明された。本発明者らは、したがって、本研究で合成された全てのペプチドが、Ｔ1のヒドロキシ基の酸素が常に存在するＮ末端配列を介して[ＴｃＯ]3+核をキレート化すると考える。この酸素は、これらペプチド中の[ＴｃＯ]3+キレート化部位の位置を決定する、一種の推進力を構成し得る。ペプチドＰ１３の[ＴｃＯ]3+錯体について記録したＮＭＲデータが、ペプチドＰ９において同定した配位官能基に加えて、Ｎ末端基が[ＴｃＯ]3+核の配位に加担し得ることを強く示唆することに注意しなければならない。これは、ペプチドＰ１３の配列のＮ‐アセチル化型Ｐ９と比較して著しく増加する、ペプチドＰ１３について観察された[ＴｃＯ]3+核の殆ど定量的な組込みを説明し得る。
【０１５８】
本発明者らは、Ｎ３Ｏキレート化配列に隣接する残基の存在が、プロトコル２において、ペプチドの[ＴｃＯ]3+標識化率に強い影響を有することを指摘した。特に、本発明者らは、[ＴｃＯ]3+キレート化部位に隣接するアルギニン残基の役割を同定した。キレート化部位の近傍に位置するアルギニンの対が、プロトコル２の条件において、[ＴｃＯ]3+標識化率を著しく改善することを証明した。アルギニン残基が、それらのグアニジニウム基を介して[ＴｃＯ]3+キレート化効率に役割を果たすことが示唆される。この関係において、ＴｃＯ4‐アニオンは、還元前に、キレート化部位の近傍に位置するアルギニンのグアニジニウム基と相互作用し得る。この解釈は、Ｐ１２と比較して（約60％）劇的に増加するペプチドＰ９の[ＴｃＯ]3+標識化率の比較と一貫し（表IV）、アルギニン残基が、それらのカチオン性の特徴を超えて特定の貢献を有し得ることを示唆する。今回のデータによって、ＴＧＲＲＲペプチドのセグメントＲ３〜Ｒ５が、[ＴｃＯ]3+標識化率を劇的に改善する正確なメカニズムを明確に説明できない。しかしながら、本発明者らは、アルギニンが、配位子交換アプローチにおいて用いられるコリガンドに類似の様式でＴｃＯ4‐を安定化する可能性を提唱することはできる。この提唱は、[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２が、ペルテクネテートオキシアニオンの同時還元及び得られた[ＴｃＯ]3+核の配位を暗示するという事実に一貫する。
【０１５９】
今回の研究で発見した最も有効なペンタペプチドは、ペンタペプチドであるペプチドＰ１３（ＴＧＲＲＲ；配列番号２６）である。ＴＧＲＲＲ配列（配列番号２６）での蛋白質の[ＴｃＯ]3+標識化の概念の証明として、本発明者らは、トリプシン、キモトリプシン、プラスミン及びカリクレインのようなセリンプロテアーゼの天然阻害剤であるアプロチニンを考慮した。今回の研究において用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコル２のＴＧＲＲＲＧＧ‐ＢＰＴＩｖへの適用は、[ＴｃＯ]3+核の定量的な組込みを示すが、同様な条件下でＢＰＴＩｖを用いると、[ＴｃＯ]3+標識化は観察されなかった。更に、これら実験は、本研究において用いた[ＴｃＯ]3+標識化プロトコルが、３Ｄ構造の保存及び結果として蛋白質の結合能力に必須であるジスルフィドブリッジに影響しないことを証明した。この適用は、分子イメージングの分野において、興味ある蛋白質を標識化するためのプロトコル２と組み合わせたＴＧＲＲＲタグの価値を証明する。
【０１６０】
今回の報告に記載された配列に関して非常に魅力的な点は、それらが天然アミノ酸から構成されることである。したがって、それらの使用は、固相ペプチド合成により製造される蛋白質に限定されないが、組換え技術を介して大きいサイズの蛋白質に容易に組み込まれ得る。このようなペプチド配列は、ターゲティング分子のＮ末端又はＣ末端配列に、この領域がその受容体との相互作用に関与しないならば付加できる。
【０１６１】
本発明者らが知る限りにおいて、これは、記載された最初の有効なＮ３Ｏ [ＴｃＯ]3+キレート化ペプチド配列である。更に、Ｎ‐アセチル化型及びＮ末端遊離型配列を用いて、本発明者らのプロトコル２の条件下に得られた標識化率は、ＴＧＲＲＲタグの両方の型を用いて、ペプチド及び蛋白質を効率的に標識化できることを示す。更に、ＴＧＲＲＲ配列（Ｐ９）（配列番号２２）と類似の[ＴｃＯ]3+標識化率を示す逆配列ＡｃＲＲＲＧＴ（Ｐ１５）（配列番号３９）を用いて、ペプチド及び蛋白質のＣ末端側を標識化できる。このアプローチのセリンプロテアーゼ阻害剤ＢＰＴＩへの適用は、蛋白質のＮ末端の位置に付加したＴＧＲＲＲタグが、[ＴｃＯ]3+核の定量的な組込みをもたらすことを証明した。これらの結果は、固相化学合成及び組換え技術により生産される蛋白質の99mＴｃイメージング剤としての使用に関して、相当な展望を開く。
【０１６２】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型；
からなる群より選択される、興味ある蛋白質をＴｃ又はＲｅ放射性核種で放射能標識化するためのペプチドタグの使用。
【請求項２】
Ｘ5が、ノルロイシンを含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘ1が、スレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｘ2が、グリシンからなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ペプチドタグが：
（配列番号１４）；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）；（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）
からなる群より選択される請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドタグが、遊離Ｎ末端をＮ末端残基上に含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチドタグが、遊離カルボキシレートをＣ末端残基上に含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｔｃ放射性核種が、99mＴｃである請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｒｅ放射性核種が、186Ｒｅ又は188Ｒｅである請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に規定されるペプチドタグのコード配列と、前記ペプチドタグにインフレームで蛋白質コード配列が導入され、融合蛋白質を形成するように配置されたクローニングサイトと、標的細胞又は無細胞発現系において前記融合蛋白質を発現するのに必要な転写因子とを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
前記蛋白質が、液相合成又は固相合成によって合成される、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを含む蛋白質を合成する方法。
【請求項１２】
ａ）前記標的蛋白質の精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｂ）前記ペプチドタグの精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｃ）工程ａ）及び工程ｂ）の生成物をインキュベートし、ペプチドタグ‐標的蛋白質複合体を精製する工程と
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを標的蛋白質に化学的に結合させる方法。
【請求項１３】
ａ）前記興味ある蛋白質を含む水溶液に
（i）塩基性ｐＨ条件下の還元剤の水溶液と、
（ii）テクネチウム酸（VII）の塩（ペルテクネテート塩）の水溶液と
を逐次的に加える工程と、
ｂ）１〜１０分間室温にて、工程ａ）からの溶液をインキュベートする工程と
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを含む興味ある蛋白質をＴｃ核で標識化する方法。
【請求項１４】
工程ａ）中、（iii）ＮＨ4ＴｃＯ4の水溶液も加える請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
ａ）ＸaＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＸbＸc（配列番号３７）、
ここで、
‐Ｘa又はＸcは、存在するとき、少なくとも２つのアミノ酸を含み、ペプチドタグを興味ある蛋白質に結合させ、
‐Ｘbは、存在するとき、ペプチド配列ＲＲＭＱＹＮＲＲ（配列番号３８）を含み、前記残基の少なくとも１つは、置き換えられる本来の残基中に存在する少なくとも１つの側鎖が存在しない非天然又は天然アミノ酸で置き換えられ、
‐Ｘ1は、その側鎖にＯＨ基を含む任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ2は、システインを除く任意のアミノ酸からなり、
‐Ｘ3は、アルギニン、グリシン、リジンからなる群より選択されるアミノ酸からなり、
‐Ｘ4は、アラニン、グリシン、リジン又はアルギニンのいずれかである少なくとも１つのアミノ酸からなり、
‐Ｘ5は、システインを除く少なくとも１つのアミノ酸を含む；
ｂ）群ａ）に記載のペプチドタグのレトロインベルソ型；
からなる群より選択される、興味ある蛋白質をＴｃ又はＲｅ放射性核種で放射能標識化するためのペプチドタグの使用。
【請求項２】
Ｘ5が、ノルロイシンを含む請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘ1が、スレオニン、セリン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸を含む群より選択される請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ｘ2が、グリシンからなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
ペプチドタグが：
（配列番号１４）；（配列番号１５）；（配列番号１６）；（配列番号１７）；（配列番号１８）；（配列番号１９）；（配列番号２０）；（配列番号２１）；（配列番号２２）；（配列番号２３）；（配列番号２４）；（配列番号２５）；（配列番号２６）；（配列番号２７）；（配列番号３４）；（配列番号３９）；（配列番号２）；（配列番号３）；（配列番号４）；（配列番号５）；（配列番号６）；（配列番号７）；（配列番号８）；（配列番号９）；（配列番号１０）；（配列番号１１）；（配列番号１２）；（配列番号１３）
からなる群より選択される請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ペプチドタグが、遊離Ｎ末端をＮ末端残基上に含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ペプチドタグが、遊離カルボキシレートをＣ末端残基上に含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記Ｔｃ放射性核種が、99mＴｃである請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記Ｒｅ放射性核種が、186Ｒｅ又は188Ｒｅである請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に規定されるペプチドタグのコード配列と、前記ペプチドタグにインフレームで蛋白質コード配列が導入され、融合蛋白質を形成するように配置されたクローニングサイトと、標的細胞又は無細胞発現系において前記融合蛋白質を発現するのに必要な転写因子とを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１１】
前記蛋白質が、液相合成又は固相合成によって合成される、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを含む蛋白質を合成する方法。
【請求項１２】
ａ）前記標的蛋白質の精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｂ）前記ペプチドタグの精製サンプルを活性化剤で活性化する工程と、
ｃ）工程ａ）及び工程ｂ）の生成物をインキュベートし、ペプチドタグ‐標的蛋白質複合体を精製する工程と
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを標的蛋白質に化学的に結合させる方法。
【請求項１３】
ａ）前記興味ある蛋白質を含む水溶液に
（i）塩基性ｐＨ条件下の還元剤の水溶液と、
（ii）テクネチウム酸（VII）の塩（ペルテクネテート塩）の水溶液と
を逐次的に加える工程と、
ｂ）１〜１０分間室温にて、工程ａ）からの溶液をインキュベートする工程と
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に規定されるペプチドタグを含む興味ある蛋白質をＴｃ核で標識化する方法。
【請求項１４】
工程ａ）中、（iii）ＮＨ4ＴｃＯ4の水溶液も加える請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５１３９８０（Ｐ２０１２−５１３９８０Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２９２１（Ｐ２０１１−５４２９２１）
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７９７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６６５４
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１０１２０３３３）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【住所又は居所原語表記】２５， ｒｕｅ Ｌｅｂｌａｎｃ， Ｂａｔｉｍｅｎｔ Ｌｅ Ｐｏｎａｎｔ Ｄ ， ７５０１５ ＰＡＲＩＳ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２８日（２００９．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７９７１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７６６５４
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（５１０１２０３３３）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＭＭＩＳＳＡＲＩＡＴ Ａ Ｌ’ＥＮＥＲＧＩＥ ＡＴＯＭＩＱＵＥ ＥＴ ＡＵＸ ＥＮＥＲＧＩＥＳ ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥＳ
【住所又は居所原語表記】２５， ｒｕｅ Ｌｅｂｌａｎｃ， Ｂａｔｉｍｅｎｔ Ｌｅ Ｐｏｎａｎｔ Ｄ ， ７５０１５ ＰＡＲＩＳ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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